JPH0424556A - Il―6レセプターを利用したヒトil―6の化学的測定法及びそのためのキット - Google Patents
Il―6レセプターを利用したヒトil―6の化学的測定法及びそのためのキットInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
キットに関するものである。
略す)は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の増
殖分化に関与しているタンパク質である。さらにI L
−6の異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子である
可能性が報告されている(厚木、74. pl、 19
89年参照)。
的濃度を知ることは、各種疾患の新しい診断マーカーと
して期待されている。I L−6の生物活性測定法とし
ては、1100f/dのI L−6が測定可能な高感度
のものが報告されている(T。
、 IL p95L 1988年参照)、シかしながら
この方法は、多数の検体を迅速、かつ簡単に測定するこ
とができないという欠点を有する。一方、これまで報告
されたIL−6の免疫化学的測定法では、組換え体(リ
コンビナント)IL−6を各種動物に免疫して得た抗体
を用いている。従って、血液中のI L−6がα2−マ
クログロブリンと結合して存在しているという報告(i
Jatsudaら、J、I鵬a+nuno1.、142
. p14B)にあるようにリコンビナントI L−6
と異なる形状で存在すると予想される生体試料中のIL
−6の濃度を高い精度で測定できない危険性がある。
−6レセプターと結合する性質を有する限り、いかなる
形状のI L−6にも適用できるI L−6の化学的測
定法、及びその方法に使用するためのキットを提供しよ
うとするものである。
、I L−6レセプターを用いることにより、リコンビ
ナントI L−6を動物に免疫して得た抗体を用いずに
、数百pg/−の濃度のヒトIL6を測定することがで
きるという新しい知見を得、これに基いて本発明を完成
した。
体支持体を標識されたヒトI L−6及び分析検体と接
触せしめ、そして該ヒト■L−6レセプターを介して固
体支持体に結合した標識されたヒトIL−6の量又は固
体支持体に結合しなかった標識されたIL−6の量を測
定し、この測定値に基いて検体中のIL−6の存否又は
量を決定することを特徴とする検体中のIL−6の検出
又は測定方法を提供する。
固体支持体を分析検体と接触せしめることにより該分析
検体中のヒトIL−6を該I L−6レセプターを介し
て固体支持体に結合せしめ、そして固体支持体に結合し
たIL−6を測定することを特徴とするヒトIL−6の
検出又は測定方法を提供する。
であって、ヒトI L−6レセプターを固定した固体支
持体及び標識されたヒトIL−6を含むことを特徴とす
るキットを提供する。
トであって、ヒトIL−6レセプターを固定した固体支
持体及び抗ヒト I L−6抗体を含むことを特徴とす
るキットを提供する。
ば関節液等中に含まれるIL−6の生理的濃度、ヒト細
胞を培養したときの培養上清中のIL−61度を正確か
つ迅速に測定することを目的としている。
6レセプターと、I L−6との特異的結合反応を用い
る種々の方法が含まれる。その第一の態様においては、
固体支持体に固定されたIL6レセプターに、標識され
たIL−6と分析検体中のIL−6とを競争的に結合せ
しめ、固体支持体にI L−6レセプターを介して結合
した標識化IL−6の量又は結合しないで反応溶液中に
残った標識化IL−6の量を測定し、この測定値に基い
て検体中のIL−6の量(又は濃度)を決定する。第二
の態様によれば、固体支持体に固定されたIL−6レセ
プターに分析検体中のI L−6を結合せしめ、この結
合したIL−6の量を常法により測定する。
固体支持体に固定する。この固体支持体としては、マイ
クロタイタープレート、各種のビーズ状の例えばポリス
チレン、ポリプロピレン等のプラスチック製、金属セラ
ミックス等の無機物質製等の免疫測定法において常用さ
れている支持体を用いることができる。IL−6レセプ
ターの固体支持体への固定に際しては、I L−6レセ
プターを直接固定してもよいし、I L−6レセプター
と結合する物質、例えばIL−6レセプターに対する抗
体をまず固定し、それからI L−6レセプターを結合
させてもよい。IL−6レセプターやI L−6レセプ
ターに対する抗体の固定は常法に従って行うことができ
る。例えば、PBS溶液にこれらの蛋白質を例えば2
Ar/dの濃度で溶解し、プレートのウェルに1001
11ずつ加え、−晩装置しておけばよい。
6レセプターに、分析検体と標識されたI L−6とを
一定の割合で混合したものを接触せしめる。IL−6の
標識としては、 Its l 、 353等が例示でき
る0分析検体中のI L−6と標識されたI L−6は
競争的にIL−6レセプターに結合するので、IL−6
レセプターに結合した標識化IL−6の量又は結合しな
かった標識化IL−6の量を測定することにより、分析
検体中のIL−61度を測定するのが本発明の特徴であ
る。上記標識IL−6の測定方法としては、l!SI標
識I L−6の場合は、一定時間のI L−6と!L6
レセプターの結合反応後に支持体を通常の溶液で洗浄し
、支持体の放射能をγカウンターで測定することが例示
できる。″′S標識IL−6の場合も同様に測定するこ
とができる。
た固体支持体を分析検体と共にインキュベートし、検体
中に存在するf L−6を固体支持体上のIL−6レセ
プターに結合させる。次に固体支持体に結合したIL−
6の量を常法に従って測定する。この測定は種々の方法
により行うことができる。例えばIL−6に対するウサ
ギ由来抗体を、固体支持体に結合したIL−6に結合せ
しめ、次に、ウサギイムノグロブリンに対するヒツジ由
来抗体であって標識されているものを、固体支持体に結
合したウサギ由来抗体IL−6抗体と結合せしめる。ヒ
ツジ由来抗体を標識する物質としては、例えばアルカリ
ホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、β−D
−ガラクトシダーゼ等の酵素、ビチオン等を用いること
ができ、これらの標識の検出のためには標識の種類に応
じて既知の検出方法を用いることができる。これらの標
識物質をその検出方法としては、例えば免疫測定法にお
いて知られている任意の手段を用いることができる。
に結合し、IL−6のシグナル伝達に関与する細胞膜上
のタンパク質である。本発明に適当なIL−6レセプタ
ーは、ヒト由来の細胞等がら生化学的方法で精製しても
よいし、遺伝子工学的に製作することもできる。該タン
パク質は、IL6との結合に寄与するアミノ酸配列部分
以外のアミノ酸配列部分が置換、欠損、挿入により変化
を受けたものであってもよい。このようなIL−6レセ
プターとして、細胞膜から離脱した可溶性IL−6レセ
プター、すなわちI L、−6レセプタ一細胞外部分が
例示できる。なお、I L−6レセプターについては特
願平1−9774号明細書にそのアミノ酸−次構造、D
NA等が詳細に開示されており、さらにその具体的な製
造方法ついても特願平! −271862号明細書に詳
細に開示されている。
当な方法でIL−6が固定された固体支持体及び標識さ
れたIL−6を含む。このキットはさらに検体稀釈用緩
衝液等を含むことができる。
な方法でIL−6が固定された固体支持体及びウサギ、
ラット等の動物由来の抗I L−6抗体を含む。このキ
ットはさらに、該動物抗体に対する第二の抗体であって
標識されたものを含むことができる。しかしながらこの
第二抗体はユニバーサルな標識抗体として別途入手する
ことが容易であるから、キットに含める必要はない。こ
のキットにさらに、検体の稀釈用等の緩衝液、標識を検
出するための試薬等を含むことができる。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
液に懸濁されたSPAビーズ(アマ−ジャム)500■
に、マウス由来抗ヒトIL−6レセプター・モノクロー
ナル抗体であるMTlB(Y、旧ra taら、J、I
smunol、、 143. p2900.1989年
参照)を2゜n加え、2℃で一晩回転させた。翌日、P
BSで洗浄して未結合のMTlBを除去した後、ビーズ
を1゜dのPBSに懸濁した。次に、20JPgの可溶
性IL−6レセプター(平成1年特願第271865号
参照)を加え、2°Cで4時間放置した。続いて、アッ
セイ用の緩衝液(PBSlo、1%BSA)でビーズを
洗い、未結合の可溶性I L−6レセプターを除去した
後、10戚の同緩衝液に懸濁した。501I!の”’1
4L−6(30000cpm)、50IJ1の濃度既知
のIL−6?V液、10011!の上記の処理をしたビ
ーズ、100#のアッセイ用緩衝液を混合し、そして”
5I−IL−6結合によりSPAビーズより生じた光を
β−シンチレーションカウンターで測定した。
した”’I−IL−6が減少すること、すなわち、本方
法により検体中のI L−6濃度が測定できることを示
す。
6穴のマイクロタイタープレートに1ウエルあたり 1
004加え、1晩4°Cで放置した。洗浄後、1ooJ
llの1%BSAを加え、2時間室温で放置した。PB
Slo、05%Tween 20により洗浄後、IL−
6レセプターを分泌しているCHO細胞の培養上清を加
え、2時間室温で放置した。 PBSlo、05%T
ween20により洗浄後、50mの”’I−IL−6
(30000cpm)、及び50Jの濃度既知のIL−
6溶液を混合したものを各ウェルに加え、2時間室温で
放置した。
各ウェルの放射能をT〜カウンターで測定した。
トの残存放射能が減少すること、すなわち、本方法によ
り検体中のI L−6濃度が測定できることを示す。
イクロタイタープレートに1ウエルあたり100I加え
、1晩4°Cで放置した。PBSlo、05%Twee
n20により洗浄後、100J11の1%BSAを加え
、2時間室温で放置した。 PBSlo、05%Tw
een 20 ニより洗浄後、IL−6レセプターを分
泌しているCHO細胞の培養上清を加え、2時間室温で
放置した。PBSlo、05%Tween 20により
洗浄後、濃度既知のIL−6溶液を加え、2時間室温で
放置した。洗浄後、5賄/−のウサギ由来抗I L−6
ポリクロ一ナル抗体を1ウエルあたり 100!il加
え、2時間室温で放置した。PBSlo、05%Twe
en 20により洗浄後、1000倍稀釈したアルカリ
フォスフォターゼ結合ヒツジ由来抗ウサギイムノグロブ
リン抗体(コスモバイオ)をlウェルあたり100IJ
I加え、2時間室温で放置した。洗浄後、1■/#lj
!のアルカリフォスフォターゼ基質(コスモバイオ)を
1ウエルあたり100m加え、37℃で約30分間放置
した後、405r+n+の発色を測定した。
色すること、すなわち、本方法により検体中のIL−6
fi度が測定できることを示す。
活性を有する限り、すなわちI L−6レセプターと結
合する性質を有する限り、いかなる形状のIL−6をも
高感度で迅速に、しかも多検体を同時に測定することを
可能にした。この方法は、各疾患でのI L−6の生理
的濃度を調べたり、I L−6の疾患における役割を解
明したり、他の薬剤の効果を調べるのに有用である。さ
らにこの方法は、IL−6とIL−6レセブターの結合
を阻害する物質を、高感度で迅速に探索することに用い
ることも可能であり、I L−6の阻害剤開発にも有用
である。
法で測定したときにSPAビーズに結合した”’I−I
L−6i1を100として、大腸菌由来リコンビナン1
−IL−6を各種濃度で含む検体を同方法で測定したと
きのSPAビーズに結合した+251−IL−6量を示
す。 第2図は、IL−6を含まない検体を実施例2に示す方
法で測定したときにプレートに残存した”5I−IL−
6量を100として、大腸菌由来リコンビナン)IL−
6を各種濃度で含む検体を同方法で測定したときのプレ
ートに残存した”’I−IL−61を示す。 第3図は、大腸菌由来リコンビナントI L−6を各種
濃度で含む検体を実施例3に示す方法で測定したときの
、プレートの発色を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒトIL−6レセプターを固定した固体支持体を標
識されたヒトIL−6及び分析検体と接触せしめ、そし
て該ヒトIL−6レセプターを介して固体支持体に結合
した標識されたヒトIL−6の量又は固体支持体に結合
しなかった標識されたIL−6の量を測定し、この測定
値に基いて検体中のIL−6の存否又は量を決定するこ
とを特徴とする検体中のIL−6の検出又は測定方法。 2、ヒトIL−6レセプターを固定した固体支持体を分
析検体と接触せしめることにより該分析検体中のヒトI
L−6を該IL−6レセプターを介して固体支持体に結
合せしめ、そして固体支持体に結合したIL−6を測定
することを特徴とするヒトIL−6の検出又は測定法。 3、固体支持体に結合したIL−6の測定を抗IL−6
抗体を用いて行うことを特徴とする請求項2に記載の方
法。 4、請求項1に記載の方法を実施するためのキットであ
って、ヒトIL−6レセプターを固定した固体支持体及
び標識されたヒトIL−6を含むことを特徴とするキッ
ト。 5、請求項2又は3に記載の方法を実施するためのキッ
トであって、ヒトIL−6レセプターを固定した固体支
持体及び抗ヒトIL−6抗体を含むことを特徴とするキ
ット。
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JP3045172B2 JP3045172B2 (ja) | 2000-05-29 |
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JP2128150A Expired - Lifetime JP3045172B2 (ja) | 1990-05-19 | 1990-05-19 | Il―6レセプターを利用したヒトil―6の化学的測定法及びそのためのキット |
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JP (1) | JP3045172B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1306963C (zh) * | 1994-10-21 | 2007-03-28 | 岸本忠三 | 用于治疗il-6产生所致疾病的药物组合物 |
-
1990
- 1990-05-19 JP JP2128150A patent/JP3045172B2/ja not_active Expired - Lifetime
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CN1306963C (zh) * | 1994-10-21 | 2007-03-28 | 岸本忠三 | 用于治疗il-6产生所致疾病的药物组合物 |
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