KR20040096260A

KR20040096260A - 암예방 및 항암성 죽염된장

Info

Publication number: KR20040096260A
Application number: KR1020030029139A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 박만석; 정근옥; 황경미
Original assignee: 학교법인 영광학원
Priority date: 2003-05-07
Filing date: 2003-05-07
Publication date: 2004-11-16

Abstract

본 발명은 암예방 및 항암성 죽염된장에 관한 것으로 메주 33중량부, 천일염과 KCl을 5:5의 중량비율로 혼합한 후 대나무속에 다져 넣어 입구는 진흙으로 봉한 후 1000~1700℃에서 1회 구워서 제조된 죽염 12중량부 및 물 55중량부를 혼합하여 숙성시킴으로써 제조되는 죽염된장은 돌연변이를 억제하고 소핵유발을 억제할뿐만 아니라 종양전이를 억제함으로써 암예방 및 항암성이 뛰어난 효과가 있다.

Description

암예방 및 항암성 죽염된장{Doenjang using Bamboo salts which prevents cancer and has anti-cancer activity}

본 발명은 기능성 죽염된장에 관한 것으로 더욱 상세하게는 암예방 및 항암성의 효과가 뛰어난 기능성 죽염된장에 관한 것이다.

된장은 예로부터 계승되어 온 우리나라의 대표적인 대두발효식품으로서, 예부터 우리나라의 대표적인 조미식품으로 우리 식생활에 단백질 공급원으로서 전통적인 부식이다.

돌연변이 유발 저해제를 찾는 것은 항암제를 발견하는 데 유용하며 많은 돌연변이 저해제들은 short-term assays 특히 Ames 실험계 사용에 의해 많이 발견되었는데, 돌연변이와 발암의 식이 저해제들은 둘 다 사람의 암방지를 위해 유용하게 여겨진다. 식품에 존재하는 발암물질 및 돌연변이 유발성 물질의 유형에는 첫째 천연식품 자체에 존재하는 물질, 둘째 식품의 저장, 가공 및 조리에 의하여 생성되는 물질, 셋째 살충제, 농약 또는 식품 첨가물 등으로 나눌 수 있다(Sugimura T, et al.,Cancer Res(suppl.)1983; 43: 2415). 그러나 식품 중에는 이들 발암물질 및 돌연변이 유발성 물질뿐만 아니라 항돌연변이 물질과 항암효과가 있는 물질도 상당량 존재한다(Renner HW.Mutat Res1990; 244: 185).

박 등(한국영양식량학회지 1990; 19: 156)은 재래식 된장에 Aflatoxin B₁에 의해 유도되는 돌연변이성을 억제하는 효과가 있음을 밝혔으며, 재래식 된장은 생콩이나 삶은 콩보다 훨씬 항돌연변이 활성이 크고, 일본된장(miso)을 비롯한 다른 콩발효제품보다 항돌연변이 활성이 높았다고 했다. 이는 콩만으로 만들어진 재래식 된장의 경우 여러 종류의 미생물, 곰팡이류와 세균류가 발효에 관여하고, 그 발효기간이 길기 때문에 항돌연변이성이 가장 높은 것으로 나타났으며, 계속적인 분석, 동정 결과 항돌연변이 물질로 불포화지방산 및 genistein이 유력한 물질로 추출, 동정하게 되었다(임선영. 부산대학교 대학원, 석사학위논문 1994.).

한편, 장류의 고유한 맛은 소금에서 오는 짠맛, 단백질의 가수분해 산물인아미노산에서 오는 구수한 맛은 된장의 풍미면에서 여러 성분보다 중요시 하는 성분의 하나이다.

소금은 거의 모든 식품의 조리에 사용되어 저장성과 풍미에 영향을 주거나 식탁염으로 사용되어 가장 일상적으로 섭취되고 있는 조미료이다. 소금의 종류는 다양한데 KS 규격에 따라 정제염의 규격을 원용하면 소금은 크게 천일염과 정제염으로 나누어지고 정제염은 기계염과 가공염으로 분류되고 있다. 천일염은 서해안의 해수를 모아 태양열과 바람에 의해 수분을 증발시켜 염의 결정을 얻은 것이다. 최근에는 해수오염과 쓴맛이 있는 간수를 제거한 천일염(생소금)이 나오는 데 이것은 서해안의 천일염을 분쇄한 후 물세척을 하여 불순물과 간수를 제거한 후 원심분리한 것을 말한다. 이에 비해 고도로 정제된 기계염은 바닷물을 끌여 들여 이온교환막을 이용하여 염화나트륨만을 추출한 소금(시약용 NaCl 및 한주소금)으로 기계적인 대량생산을 한다. 최근에 시중에 나와 있는 가공염은 가열공정을 거쳐 가공하는 방법이 공통적인데 천일염을 세라믹 반응로에서 800℃ 이상 고온으로 2번 구워 불순물과 간수, 유해성분을 제거한 것(구운소금)과 이보다 높은 온도인 1300℃이상 고온에서 3번 구운(생금)것이 있다. 죽염은 우리나라의 사찰 등지에서 제조되어 오던 것으로 천일염을 대나무 속에 다져 넣고 대나무 입구는 진흙을 반죽하여 봉한 후 가마에서 8번 1000 ~ 1300℃로 가열한 후 9번째 송진가루를 장작 위에 뿌려 1300 ~ 1700℃로 가열하면 소금이 용융되었다가 식으면서 죽염 결정이 된다.

상기와 같은 소금은 생리적으로 산과 알칼리의 균형을 이루며 신경과 근육의 흥분성을 유지시키는 중요한 무기질중 하나이다. 그러나 짠음식 및 염장된 식품의다량 섭취가 위암 및 뇌졸중 발생의 원인이 될 수 있다고 알려져 있을 뿐만 아니라 소금은 암발생을 돕는 역할을 한다고 알려져 있다. NaCl의 발암을 돕는 역할에 대한 기작은 먼저 NaCl이 침투성이 큰 계면활성제로 작용해 발암물질의 매개체가 되어 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine; MNNG)과 같은 발암물질이 점막안으로 침투해 들어 가는 것을 높여 표적세포에 유효농도로 증가시키는 작용을 한다는 것이다. 그리고 NaCl은 세포증식(cell proliferation)에 관여한다는 것으로 세포증식설로 추측되는 기작은 첫째, NaCl의 세포독성에 의해 세포증식이 촉진된다는 것으로 고농도의 NaCl은 위의 표면점막세포를 균일하게 파괴시켜 위점막에 계속적인 손상을 주어 세포를 증식시킨다. 둘째, 소금이 위점막에서 지질과산화에 영향을 끼쳐 세포증식에 관여한다는 것이다. 2 ~ 4% NaCl 첨가 식이를 5주 행한 결과 위의 분문부에서 지질과산화가 증가함에 따라 점막세포가 증식되었으며 Takahashi 등은 NaCl이 표적세포(target tissue)에서 지질과산화를 유도하여 위점막과 뇨에서 NaCl의 농도가 증가함에 따라 말론디알데하이드(malondialdehyde;MDA)가 증가되었다고 보고하였다. 그리고 셋째로 소금이 ODC(ornithine decarboxylase)활성을 증가시킨다는 것인데, 고농도의 NaCl은 위장점막의 ODC 활성을 증가시켜 결과적으로 DNA 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

한편, 식품 속에서 NaCl의 산화촉진효과는 소금을 염장하지 않은 고기에 첨가할 경우 지질산화를 촉진하여 향미와 색의 손실을 유발시킨다. 그러나 Rhee 등의 보고에 의하면 NaCl을 KCl로 대체할 경우 염(Salts)에 의한 지질산화가 촉진되는것을 감소시켰다. 또한 NaCl과 MgCl₂는 생고기와 조리된 시료를 모두 산패시켰으나 KCl은 생고기에서만 산패를 증가시켰다. 그러므로 KCl로 NaCl을 대체하는 것은 시료의 산패를 감소시키는데 가장 효과적이라고 하였다. Watts와 Peng는 NaCl, MgCl₂, Na₂NO₃, NaCH₃COO, K₂NO₃가 동결 중에 가열하지 않은 돼지고기에 산패를 촉진시키는 효과가 있으나 KCl은 그러한 효과가 없었으며 Zipser 등도 KCl이 산패진행을 다소 저해한다고 보고하였다. 따라서 소금중 NaCl이 가장 강한 과산화 촉진작용을 하며 KCl의 그러한 효과가 적은 것으로 나타나 있다.

Jacobs는 DMH(1,2-dimethylhydrazine)에 의해 흰쥐 소장의 종양을 유도시켰을 때 KCl(0.5%) 보충급수로 인해서 종양생성을 40%에서 KCl을 함께 처리시 5% 로 유의적(p<0.05)으로 감소시켰으며 K 보충급수의 농도는 혈액검사에서 전혀 독성을 나타내지 않았다고 하였다. 이와같이 K는 항암효과를 나타낸다.

이에 본 발명자는 죽염을 이용하여 제조된 죽염된장의 항암성이 뛰어남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 암예방 효과가 뛰어나고 항암성이 있는 기능성 죽염된장을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 본 발명의 목적은 구운 회수가 다른 여러 종류의 죽염을 이용하여 죽염된장을 제조하고, 상기 제조된 죽염된장들의 메탄올 추출물을 각각 Ames test, MTT assay 및 동물 실험을 통하여 항돌연변이성, 항소핵유발성 및 항전이성을 확인함으로써 달성되었다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 1회 구운 죽염을 첨가한 된장과 천일염을 첨가한 된장 500mg/kg씩을 MMC 1mg/kg과 병행하여 마우스에 투여했을 때 소핵유발 억제능을 나타내는 그래프이다.

도 2는 1회 구운 죽염을 첨가한 된장과 천일염을 첨가한 된장 1000mg/kg씩을 MMC 1mg/kg과 병행하여 마우스에 투여했을 때 소핵유발 억제능을 나타내는 그래프이다

도 3은 고전이성 종양세포인 colon 26-M3.1 carcinoma의 피하주사에 의해 생산된 전이된 폐종양의 모습을 보여주는 사진이다.

본발명은 구운 회수가 다른 여러 종류의 죽염을 이용하여 죽염된장을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 제조한 죽염된장들의 메탄올 추출물을 각각 Ames test, MTT assay 및 동물 실험을 통하여 항돌연변이성, 항소핵유발성 및 항전이성을 확인하여 가장 우수한 항암 기능성 죽염된장의 조건을 확립하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 죽염은 천일염만을 단독으로 사용하거나 천일염의 일부를 KCl로 대체하여 혼합한 후 사용하였다.

KCl을 혼합하는 경우 그 비율은 3:7 내지 5:5(KCl:천일염)의 중량비율로 혼합하였다. KCl의 비율이 상기 범위 이상(즉, 50%이상)이면 심장질환에 해로운 영향을 주고 상기 범위 이하일 경우(즉, 30% 이하)에는 항암 효과가 떨어지는 단점이 있다.

단독의 천일염과 상기와 같이 혼합한 KCl 및 천일염의 혼합물은 대나무에 넣고 진흙으로 봉한 후 소나무 장작불로 1000~1700℃로 가열하여 구워내는데 단독의 천일염의 경우는 1회 또는 9회 굽고 혼합물의 경우에는 1회 굽는다. KCl과 천일염의 혼합물의 경우 1회만 구워도 원하는 항암효과를 충분히 내기 때문에 9회까지 구울 필요가 없다. 천일염 단독을 사용하는 경우에도 1회만 구워도 항암 효과를 나타내지만 9회 구워 제조한 죽염이 약간 더 강한 항암 효과를 나타낼뿐만 아니라 시중에 일반적으로 나오는 죽염이 9회 구운 죽염이므로 이를 구하는 것이 더 쉬우므로1회 구운 죽염이나 9회 구운 죽염 모두 바람직하다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명을 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 죽염 된장의 제조

1) 죽염의 제조

죽염은 원료로 천일염만 사용하거나 천일염의 일부를 KCl로 대체하여 제조하였다. 이 때 천일염의 일부를 KCl로 대체할 때 그 비율은 3:7 내지 5:5의 중량비율로 하였으며 상기 단독의 천일염 및 천일염과 KCl의 혼합물은 대나무속에 다져 넣고 대나무 입구는 진흙을 반죽하여 봉한 후 가마에서 1300℃로 가열하여 구워낸다. 단독의 천일염의 경우 1회 또는 9회 구웠고 혼합물은 1회 구웠다.

2) 죽염된장의 제조

된장 제조시 콩알메주(알알이식품)을 사용하였고, 메주와 소금, 물의 비율을 33, 12, 55로 하였다. 소금은 1회 구운 죽염, 9회 구운 죽염, 천일염:KCl을 3:7 내지 5:5로 혼합하여 1회 구운 죽염(고려죽염), 천일염((주)우일염업), 한주소금((주)한주) 등을 사용하였다.

3) 메탄올추출물의 조제

동결건조한 시료를 마쇄하여 시료에 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 후 여과하여 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축하여 메탄올 추출물(methanol extract)을 얻었다. 이들 추출물들은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 희석하여 실험에 사용하였다.

실험예 1: 죽염된장의 Ames 돌연변이 유발 억제 효과 조사

1) 균주

살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) LT-2의 히스티딘 영양요구성인 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA100은 미국 캘리포니아 대학의 B.N. Ames 박사로 부터 제공 받아 실험에 사용하였다. 그리고 이들 실험균주들은 새로운 frozen permanent가 준비되었을 때나 매 실험직전 히스티딘 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이,uvrB 돌연변이, R factor 등의 유전형질을 확인하여 사용하였다.

2) 돌연변이 유발원/발암원

간접 돌연변이원인 aflatoxin B₁(AFB₁)은 미국 시그마(Sigma)사에서 구입하여 사용하였으며, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여서 실험에 사용하였다. 직접돌연변이원인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)는 미국 알드리히(Aldrich)사로부터 구입하여 증류수에 녹여 실험에 사용하였다.

3) S9 혼합물 조제

간접돌연변이원을 활성화시키기 위하여 Maron과 Ames의 방법에 따라 간의 마이크로좀 효소화합물인 S9 혼합물을 조제하였다. 약 200g의 웅성 스프라그 다우리 래트의 간 효소활성을 위하여 폴리클로리네이트 바이페닐(polychlorinated biphenyl; PCB) 혼합물인 Aroclor 1254를 옥수수유 1mL당 200㎎의 농도로 희석하여 1회 복강 주사하고(500㎎/㎏) 5일후에 간을 적출하였다. 4℃ 무균상태에서 적출한간을 0.15M KCl로 수 회 세척하고 간 무게의 3배량의 0.15M KCl 용액을 가하여 호모지나이저(Potter-Elvehiem apparatus, USA)에서 균질화하였다. 이것을 9000×g에서 10분간 원심분리하여 상등액인 S9 분획을 얻었으며 크리오관에 1∼2mL씩 분주하여 드라이 아이스에서 급속 동결한 후 -70℃ 딥 프리저(deep freezer)에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 이 S9 분획(10%)을 MgCl-KCl 염(2%), 1M 글루코스-6-포스페이트(0.5%), 1M NADP(4%), 0.2M 인산 완충액(pH 7.4) 및 멸균수와 혼합하여 S9 혼합물을 조제하였다.

4) 항돌연변이 실험

(1) 독성실험 및 돌연변이성 실험

시료의 균주에 대한 독성과 돌연변이성 유무를 살펴보기 위해서 멸균된 캡 테스트 튜브(cap test tube)에 탑 아가(top agar) 2mL를 분주한 후 균주 100㎕와 희석된 시료 100㎕를 첨가하여 가볍게 섞은 후 독성실험의 경우 영양 아가 플레이트(nutrient agar plate)에 돌연변이성 실험의 경우 미니멀 아가 플레이트(minimal agar plate)에 분주, 고화시켜서 37℃에서 24시간 혹은 48시간 배양시킨 다음, 그 독성 및 돌연변이성 유무를 판정하였다.

(2) 실험방법

본 발명에서 주로 이용하였던 프리인규베이션 테스트(preincubation test)는 S9 믹스(mix) 0.5mL(간접돌연변이인 경우), 하룻밤 배양된 균주(1∼2×10⁹cells/mL) 0.1mL, 희석된 시료(50㎕)와 돌연변이 유발물질(50㎕)을 아이스배쓰(ice bath)에 담긴 캡 튜브(cap tube)에 넣고 가볍게 섞은 후 37℃에서 30분간 예비배양하였다. 45℃의 탑 아가 2mL씩을 각 튜브에 붓고 3초간 섞어 미니멀 글루코스 아가 플레이트에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 숫자를 계수하였다. 한편 실험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험(dose response 및 독성실험)을 통하여 결정하였다(도 1).

돌연변이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 하기 식에 의해 계산하였다.

억제 비율(Inhibition rate)(%) = 100×[(ab)/(ac)]

여기서 a는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이수, b는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이의 수이며, c는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연 복귀돌연변이의 수이다.

그 결과 콩알메주에 소금의 종류를 달리하여 제조한 된장 메탄올 추출물의 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA 100 균주의 AFB₁에 대한 항돌연변이 효과를 표 1 에 나타내었다. 0.625mg/플레이트 첨가농도에서 한주소금 된장은 AFB₁에 대해 30%의 항돌연변이 효과를 나타낸 반면, 9회 구운 죽염 된장은 53%, KCl 및 천일염의 혼합물(5:5)을 1회 구운 죽염으로 제조한 된장은 55%의 항돌연변이 효과를 나타내었다.

소금의 종류를 달리하여 제조된 된장 메탄올 추출물의 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA 100 균주의 AFB₁에 대한 항돌연변이 효과

시료	돌연변이/플레이트
	0.625mg/플레이트	1.25mg/플레이트
자발적 돌연변이	145± 16	145± 16
AFB₁(대조구)	988± 35^a	988± 35^a
BS1-TD¹⁾	615±20^c(44)⁶⁾	381±1^c(72)
BS9-TD²⁾	542±19^d(53)	385±19^c(72)
KB1-TD³⁾	528±33^d(55)	355±22^c(75)
CS-TD⁴⁾	636±23^c(42)	429±24^b(66)
PS-TD⁵⁾	732±48^b(30)	429±24^b(66)
BS1-TD¹⁾: 1회 구운 죽염을 사용하여 제조된 전통된장BS9-TD²⁾: 9회 구운 죽염을 사용하여 제조된 전통된장KB1-TD³⁾: KCl 및 천일염의 혼합물(5:5)을 1회 구워 제조한 죽염을 사용하여 제조된 전통된장CS-TD⁴⁾: 천일염을 사용하여 제조된 전통된장PS-TD⁵⁾: 정제염을 사용하여 제조된 전통된장⁶⁾: 괄호 안의 값은 억제비율(%)이다.a~d : 같은 컬럼내 각기 다른 문자는 던컨 다중검정법에 의해 유의적 차이가 있음을 나타낸다(p＜0.05).

실험예 2: 죽염된장의 시험관내 항암효과 조사

1) 세포배양

세포배양을 위해 RPMI 1640, 우태아 혈청(FBS), 0.05% 트립신-0.02% EDTA 그리고 100units/mL 페니실린-스트렙토마이신은 GIBCO사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 CO₂배양기(Forma, model MCO96, Japan)를 사용하였다.

(2) 실험에 사용된 세포주

가. 암세포

AGS 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell), HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon adenocarcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다.

나. 세포 배양

AGS, HT-29 세포는 100units/mL의 페니실린-스트렙토마이신과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2∼3회 리피딩(refeeding)하고 6∼7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6∼7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양시 각각의 패새지 넘버(passage number)를 기록하였고 패새지 넘버가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.

2) MTT assay

배양된 암세포를 96 웰 플레이트에 웰당 1×10⁴cells/mL가 되도록 시딩(seeding)하고 시료를 농도별로 첨가한 다음, 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 72시간 후 3-(4,5-디메틸티아조-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide](MTT) 20㎕를 첨가하고 4시간 동안 더 배양한 후 생성된 포마잔 결정을 DMSO에 녹여 540nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2).

3) 암세포 증식억제 효과 실험

암세포 배양과 동일한 방법으로 배양하였으며 AGS, HT-29 세포는 원심분리한후 집적된 암세포를 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 24 웰 플레이트에 2×10⁴cells/mL의 농도로 시딩하여 하룻밤 배양하였고, 암세포가 플레이트에 부착되었음을 확인한 후, 10% FBS가 있는 배지에 시료를 첨가하여 이틀에 한번씩 배양액을 교체하면서 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 부착세포는 배양 6일 후에 증식된 세포를 0.05% 트립신-0.02% EDTA 효소로 분리하여 각 세포수를 헤모사이토미터(hemocytometer)로 측정하여 대조군과 비교하여 암세포 증식 억제효과를 관찰하였다(도 2).

그 결과, 소금의 종류를 달리하여 제조한 5종류의 된장 메탄올추출물의 AGS 인체 위암세포와 HT-29 인체 결장암 세포에 대한in vitro항암 활성을 검토하였다. AGS 인체 위암세포를 이용하여 MTT assay를 행한 결과를 표 2에 나타내었다. 한주소금과 천일염을 이용하여 제조한 된장은 200㎍/assay에서 75∼79%의 위암세포 증식억제효과를 보였고, KCl+1회 구운죽염 된장은 92%, 9회구운 죽염된장은 99%의 높은 위암세포 성장억제효과를 보였다(표 2). HT-29 인체 결장암 세포를 이용한 실험에서도 200㎍/assay에서 천일염과 한주소금을 사용한 된장시료의 암세포 증식 억제효과가 40∼42%, KCl 및 천일염을 5:5로 혼합하여 1회 구워 제조한 죽염을 사용한 된장은 61%, 9회구운 죽염된장이 87%로 각 시료들간에 큰 차이를 보였다(표 3).

MTT assay에서 AGS 인체 위암세포에 대한 다양한 종류의 재래식 죽염된장 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과

시료	OD₅₄₀
시료	100㎍/assay	200㎍/assay
대조구	0.750±0.002^a	0.748±0.005^a
BS1-TD¹⁾	0.524±0.005^c(45)⁶⁾	0.318±0.005^d(88)
BS9-TD²⁾	0.464±0.012^d(56)	0.273±0.002^e(99)
KB1-TD³⁾	0.511±0.007^c(46)	0.286±0.001^e(92)
CS-TD⁴⁾	0.583±0.006^b(36)	0.369±0.012^c(79)
PS-TD⁵⁾	0.588±0.009^b(39)	0.392±0.010^b(75)
1-5) : 표 1 참조6) : 억제 비율(%) =대조구의 OD ₅₄₀ - 시료의 OD ₅₄₀ × 100대조구의 OD₅₄₀a~d : 같은 컬럼내 각기 다른 문자는 던컨 다중검정법에 의해 유의적 차이가 있음을 나타낸다(p＜0.05).

MTT assay에서 HT-29 인체 결장암세포에 대한 다양한 종류의 재래식 죽염된장 메탄올 추출물의 항돌연변이 효과

시료	OD₅₄₀
시료	100㎍/assay	200㎍/assay
대조구	0.538±0.022^b	0.612±0.008^a
BS1-TD¹⁾	0.261±0.022^c(51)⁶⁾	0.334±0.023^b(45)
BS9-TD²⁾	0.317±0.003^b(41)	0.106±0.039^d(87)
KB1-TD³⁾	0.320±0.009^b(41)	0.237±0.058^c(61)
CS-TD⁴⁾	0.324±0.005^b(40)	0.378±0.016^a(40)
PS-TD⁵⁾	0.390±0.008^d(28)	0.355±0.009^a(42)
1-5) : 표 1 참조6) : 억제 비율(%) =대조구의 OD ₅₄₀ - 시료의 OD ₅₄₀ × 100대조구의 OD₅₄₀a~d : 같은 컬럼내 각기 다른 문자는 던컨 다중검정법에 의해 유의적 차이가 있음을 나타낸다(p＜0.05).

실험예 3: 말초혈의 망상적혈구를 이용한 생체 내 소핵실험

1) 실험동물

본 실험에 사용한 동물은 6-7주령의 웅성 ICR계 마우스(한국화학연구소, 대전)로, 체중이 35g 전후의 것을 사용하였으며, 사료는 표준사료로 사육하였다. 사육시 물과 사료는 충분한 양를 공급하였고, 동물실험실은 온도 22±1℃, 습도 55±5%를 유지하였으며, 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하였다.

2) 시료의 조제 및 투여

양성대조군인 mitomycin C(MMC, 0.1㎎/㎖)는 미국 Sigma사에서 구입하여 생리식염수에 용해시켜 0.1mL/10g body weight가 되도록 복강주사하였다. 시료는 멸균된 증류수를 사용하여 조제하였으며, 마우스 ㎏당 500, 1000㎎을 경구로 투여하였다.

3) Acridine orange-coated slide의 제작

70℃에서 미리 가열시킨 슬라이드 글래스(slide glass)의 중앙에 증류수에 1mg/mL의 농도로 녹인 아크리딘 오랜지(acridine orange) 용액 10㎕를 떨어뜨린 후 유리막대로 균일하게 도말하여 건조시킨 후 밀봉하여 사용할 때까지 상온에서 보관하였다.

4) 표본 제작 및 관찰

MMC 투여 48시간 후에 마우스의 꼬리혈관으로부터 혈액 5㎕를 취하여 아크리딘 오랜지-코팅된 슬라이드(acridine orange-coated slide)에 떨어뜨린 후 커버 글래스(cover glass)로 덮은 다음, 2시간 동안 4℃에 방치하여 세포와 아크리딘 오랜지가 충분히 반응하게 하였다.

슬라이드는 형광현미경(Olympus, model U-ULH, Japan)으로 40×10배에서 관찰하였으며 망상적혈구는 Ⅰ형에서 Ⅲ형까지 2000개를 계수하고, 그 중 소핵을 지니는 망상적혈구를 계수하여 소핵유발빈도를 결정하였다.

죽염된장의 생체 내 암예방 효과를 살펴보기 위하여 1회 구운 죽염 된장과 천일염된장의 500mg/kg, 1000mg/kg의 각 용량을 MMC 1mg/kg 용량과 병행투여하였다. 병행투여를 MMC 투여의 3시간 전투여, 동시투여, 그리고 3시간 후 투여로 하였다. 도 3은 각 시료를 500mg/kg 투여한 군으로, 천일염 된장에 비해 1회 구운 죽염 된장의 투여군이 MMC의 복강투여의 3시간전, 동시투여, 3시간 후에 경구투여시 현저한 소핵유발 억제능을 나타내었다. 도 4는 각 시료를 1000mg/kg 투여한 군으로, 천일염 된장의 경우도 대조구에 비해 높은 소핵유발 억제능을 보였지만 1회 구운 죽염 된장 투여군은 MMC의 소핵유발능을 상당히 높게 억제함을 볼 수 있다. 또한 1회 구운 죽염 된장은 MMC의 복강투여의 3시간전에 시료를 투여했을 때 그 억제능이 가장 높았고, 3시간 후에 경구투여했을 때도 현저한 소핵유발 억제능을 나타내었다. 이 결과로 볼 때 1회 구운 죽염 된장은 유전자가 발암물질에 의해 공격받기 전에 화학적 반응이나 효소적 반응을 유도하여 발암원을 불활성화시키는 탈돌연변이원(desmutagen)으로 작용할 뿐만 아니라, 유전자가 발암물질에 의해 손상을 받은 후에도 돌연변이가 고정되는 것을 억제하는 생체-항돌연변이원(bio-antimutagen)으로 작용하여 암예방효과와 항암효과를 동시에 가지는 것으로 보인다.

실험예 4: 실험동물 종양전이(Experimental tumor metastasis) 실험

1) 실험동물

본 실험에 사용한 동물은 6주령의 female Balb/c mouse(한국화학연구소, 대전)로, 체중이 35g 전후의 것을 사용하였으며, 사료는 표준사료로 사육하였다. 사육시 물과 사료는 충분한 양를 공급하였고, 동물실험실은 온도 22±1℃, 습도 55±5%를 유지하였으며, 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하였다.

(2) 종양전이억제 실험

종양전이억제효과를 살펴보기 위하여 폐(lung)에 대하여 전이력을 획득한 고전이성 종양세포주인 colon 26-M3.1 carcinoma(한동대학, 윤택준박사)를 100units/mL의 페니실린-스트렙토마이신과 7.5%의 FBS가 함유된 EME배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2∼3회 리피딩(refeeding)하고 6~7일 만에 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 PBS를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 100㎕(2.5×10⁴/mL)를 Balb/c 마우스의 꼬리에 정맥주사하였다. 각 군은 5마리로 하였으며, 된장메탄올추출물은 종양세포접종 2일전에 피하주사하였다. 전이된 종양의 판정은 종양접종 14일 후에 마우스를 희생시켜 종양의 표적기관인 폐를 적출한 다음, Bouin's 용액(saturated picric acid : formalin : acetic acid = 15 ; 5 : 1, v/v/v)에서 전이된 종양을 고정시킨 후, 종양의 군집수를 세었고, 김치에 의한 종양전이억제효과는 종양만 접종한 대조군과 비교함으로서 측정하였다.

Colon 26-M3.1 carcinoma를 이용한 종양전이의 예방적 효과에 대한 실험결과에서 한주소금, 천일염을 사용한 된장 투여군은 0.5mg/mous를 피하주사했을 때 31,40%의 종양전이억제효과를 보였다(표 4, 도 3). KCl 및 천일염의 5:5 혼합물을 1회 구워 제조한 죽염을 사용한 된장이나 9회 구운 죽염된장은 같은 농도에서 95, 97%로 종양 전이를 억제하는 효과를 보였다.

처리	폐전이 번호(억제, %)
	주입량(mg/마우스)
	0.5	1.0
	평균±SD	범위	평균±SD	범위
대조구	87±13	68~98
BS1-TD¹⁾	22±9^a(75)	12~29	13±2^ab(85)	11~14
BS9-TD²⁾	3±1^bc(97)	2~5	2±2^ab(98)	0~6
KB1-TD³⁾	4±6^cd(95)	0~15	2±3^e(98)	0~8
CS-TD⁴⁾	52±8^d(40)	45~61	32±4^e(63)	29~37
PS-TD⁵⁾	60±17^f(31)	45~78	37±7^f(57)	29~42
1-5) : 표 1 참조a~d : 같은 컬럼내 각기 다른 문자는 던컨 다중검정법에 의해 유의적 차이가 있음을 나타낸다(p＜0.05).

이상, 상기 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 죽염을 첨가하여 제조된 재래식 된장은 암예방 효과가 뛰어나고 항암성이 우수하므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

메주 33중량부, 죽염 12중량부 및 물 55중량부를 혼합하여 숙성시킴으로써 제조되는 암예방 및 항암성 된장.
제 1항에 있어서, 상기 죽염은 천일염을 대나무속에 다져 넣어 입구는 진흙으로 봉한 후 1000~1700℃에서 1회 또는 9회 구워서 제조된 죽염임을 특징으로 하는 암예방 및 항암성 된장.
제 1항에 있어서, 상기 죽염은 KCl과 천일염을 3:7 내지 5:5의 중량비율로 혼합한 후 대나무속에 다져 넣어 입구는 진흙으로 봉한 후 1000~1700℃에서 1회 구워서 제조된 죽염임을 특징으로 하는 암예방 및 항암성 된장.