KR100599392B1

KR100599392B1 - 겨우살이를 첨가한 항암기능성 저염 김치

Info

Publication number: KR100599392B1
Application number: KR1020030033933A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 길정하; 최선미
Original assignee: 주식회사 효원메디푸드
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2006-07-10
Also published as: KR20040103986A

Abstract

본 발명은 암예방 및 항암기능성 겨우살이 첨가 김치에 관한 것이다.

절인배추 100 중량부에 고춧가루 2.5 중량부, 마늘 2.8 중량부, 생강 0.6 중량부, 무 11.0 중량부, 설탕 1.0 중량부, 파 2.0 중량부, 갓 7.5 중량부, 산초 0.1 중량부, 배 2.8 중량부, 버섯과 다시마를 우려낸 물 5.0 중량부, 겨우살이 0.01~0.2 중량부로 조성되며, 최종염도가 2.2%인 배추김치는 탁월한 암예방 및 항암 효과를 가질 뿐만 아니라 관능적인 면에서도 매우 우수하다.

겨우살이, 김치, 항암, 암예방

Description

겨우살이를 첨가한 항암기능성 저염 김치 {Lower salted kimchi containing mistletoe for protecting cancer}

도 1은 대조군 김치 및 겨우살이 첨가김치를 투여한 경우 간의 글루타치온 함량변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 겨우살이를 첨가한 암예방 및 항암기능성 김치의 제조방법에 관한 것이다.

김치는 배추 등의 주재료와 고춧가루, 마늘, 파, 생강 등의 부재료로 제조된 우리나라 고유의 저장 발효식품으로 한국인의 식생활에서 큰 비중을 차지하고 있다. 김치는 재료, 온도, 발효용기, 식염농도, 발효조건에 의해 맛, 품질, 저장성, 기능성에 영향을 끼칠 수 있다. 김치는 주재료가 채소이므로 채소가 갖는 비타민과 무기질의 조절영양소로서의 역할 및 식이섬유소의 공급원 그리고 발효과정에서 생성된 맛, 기능성물질, 젖산균 및 유기산에 의해 체내에서 중요하게 작용한다. 즉, 채소는 조절영양소 및 비타민 C, 베타 카로틴(β-carotene), 플라보노이드

(flavonoid), 클로로필(chlorophyll) 등이 풍부하며 발효과정에서 생성되는 여러 젖산균 등에 의하여 항산화작용, 항노화작용, 피부노화방지, 혈전응고방지, 면역기능증진, 항돌연변이성, 항암성 등의 기능성을 가지고 있으며 섬유소가 많아서 변비예방, 정장작용, 다이어트의 효과가 있다고 알려져 있다 [참조: 박건영 : 김치의 영양학적 평가와 항돌연변이 및 항암효과. 한국영양식량학회지 24: 169-182 (1995), 박건영, 최홍식 : 김치와 니트로소아민. 한국영양식량학회지, 21: 109-116 (1992), 박건영, 조은주, 이숙희 : 부재료 첨가 배추김치의 항돌연변이 및 항암성 증진효과. 한국식품영양과학회지 27: 625-632 (1998)].

겨우살이(mistletoe, Viscum album)는 여러 종류의 나무를 숙주로 하여 생장하는 반기생식물로서 세계 전역에 30속 1500 종의 식물이 있는 것으로 알려져 있다. 여러 종류의 겨우살이중에 현재 약재로 사용되고 있는 겨우살이는 Viscum 속의 겨우살이로서 주로 유럽지역에서 서식되는 Viscum album loranthaeceae이다. 유럽의 loranthaeceae과에 속하는 겨우살이는 오래전부터 민간요법으로서 고혈압, 동맥경화증, 암 등에 대하여 효과가 있는 신비의 약제로 사용하다가, 1921년부터 항암활성을 인정받아 종양에 대한 치료 및 그 보조제로 사용하고 있다. 따라서 겨우살이의 생물학적 활성에 대한 연구는 주로 유럽에서 유럽지역에 서식하는 겨우살이에 대하여 수행되어 왔다 [참조; Bloksma, N., Dijk, H.V., Korest, P. and Willers, J.M : Cellular and humoral adjuvant activity of Mistletoe extract. Immunobiol. 156: 309-319 (1979)].

유럽지역에 서식하는 겨우살이는 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하는 면역증강 효과가 있는 것이 인정되었고 동물 및 인간에 대한 임상 실험결과 종양세포에 대하여 직접, 간접적으로 대응하는 마크로파지(macrophage) 및 자연살해세포의 활성을 증가시킴으로서 종양세포의 성장을 억제하고 암환자의 생존율을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고되었다. 이러한 효과는 겨우살이의 면역증강 작용 및 종양세포에 대한 직접적인 세포독성효과가 관여하는 것으로 알려져 있으며 대표적인 활성물질로는 렉틴(lectin) 성분들로서 당쇄부분의 특이성 및 분자량에 대한 렉틴 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 3종류로 구별하고 있으며 주로 렉틴 Ⅰ에 대한 면역학적, 생화학적 연구가 진행되고 있다 [참조: Mueller, E.A. and Anderer, F.A. : Chemical specificity of cell/tumor cell bridging by a Viscum album rhamnogalacturonan enhancing cytotoxicity of human NK cells. Immunopharmac. 19: 67-77 (1990), Beuth, J., Ko, H.L., Gabius, H.J., Gurrichter, H., Oette, K. and Pulverer, G. : Behavior of lymphocyte subsets and expression of activation markers in response of immunotheraphy with galactoside-specific lectin from mistletoe in breast cancer patients. Clin. Investig. 70: 658-661 (1992), Beuth, J. : Clinical relevance of immunoactive mistletoe lectin-1. Anti-Cancer Drugs 8 (Suppl.1): s53-s55 (1997)].

한편, 유럽산 겨우살이와 구별되는 한국산 겨우살이 역시 민간 및 한방에서 요통, 고혈압, 유산방지, 치통에 대한 약재로 사용하여 왔으며 한국산 겨우살이에 대한 과학적인 연구로서는 최초의 논문에서 Khwaja 등 [참조: Khwaja T.A., Dias C.B., Pentecost S. : Recent studies on the antitumor activities of mistletoe(Viscum album) and its alkaloids. Oncology 43:suppl. 1: 42-50 (1986)]은 한국산 겨우살이의 항종양효과 및 활성성분에 대하여 보고하였다. 이들에 의하면 한국산 겨우살이의 항종양효과는 유럽산의 경우와는 다르게 렉틴에 의한 것이 아니라 강한 독성의 알칼로이드에 의한 세포독성효과에 의한 것으로 보고하여 유럽산 겨우살이와 한국산 겨우살이의 항종양활성 성분 및 기작을 구별하였다. 그러나 윤 [참조: 윤택준 한국산 겨우살이로부터 분리 정제된 렉틴의 생물학적 활성 및 그 특성에 관한 연구. 1998; 건국대학교 박사학위논문] 의 연구에서 한국산 겨우살이 역시 마크로파지를 직접 활성화시켜서 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor- α, TNF-α)와 인터류킨-1(interleukin-1, IL-1)을 유도하며 이들 사이토킨(cytokine)들을 유도하는 활성성분은 암모늄 설페이트(ammonium sulphate)에 의해 침전되는 단백질 성분인 것으로 밝혔으며 렉틴(lectin)을 분리하였다.

본 발명에서는 에임스 테스트, MTT법, 육종 180 세포를 이용한 항암실험, 종양전이 억제실험 등에 의하여 검증되는 항암 효과뿐만 아니라, 관능실험에 의하여 검증되는 우수한 품질을 가진 겨우살이 첨가김치를 제공하고자 한다.

따라서 본 발명의 목적은 항암 효과뿐만 아니라 관능적인 면에서도 우수한 겨우살이 첨가김치를 제공하는 것이다.

본 발명의 기술적 과제는 절인배추 100 중량부에 고춧가루 2.5 중량부, 마늘 2.8 중량부, 생강 0.6 중량부, 무 11.0 중량부, 설탕 1.0 중량부, 파 2.0 중량부, 갓 7.5 중량부, 산초 0.1 중량부, 배 2.8 중량부, 버섯과 다시마를 우려낸 물 5.0 중량부, 겨우살이 0.01~0.2 중량부로 조성되며, 최종염도가 2.2%인 배추김치를 제조하고, 에임스 테스트, MTT법, 육종 180 세포를 이용한 항암실험, 종양전이 억제실험 등에 의하여 상기 김치의 우수한 항암효과를 확인하고, 관능실험에 의하여 상기 김치의 우수한 품질을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 절인배추 100 중량부에 고춧가루 2.5 중량부, 마늘 2.8 중량부, 생강 0.6 중량부, 무 11.0 중량부, 설탕 1.0 중량부, 파 2.0 중량부, 갓 7.5 중량부, 산초 0.1 중량부, 배 2.8 중량부, 버섯과 다시마를 우려낸 물 5.0 중량부, 겨우살이 0.05 중량부로 조성되며, 최종염도가 2.2%인 배추김치를 제조하는 단계; 에임스 테스트, MTT법, 육종 180 세포를 이용한 항암실험, 종양전이 억제실험 등을 통하여 상기 김치의 항암효과를 검증하는 단계; 및 관능실험을 통하여 상기 김치의 종합적인 품질을 평가하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

겨우살이를 김치의 재료로서 첨가하는 경우, 김치의 발효진행, 관능적인 특성에 영향을 미치므로, 이와같은 변수에 기능성 등을 종합적으로 고려하여 최적의 첨가량을 산출하는 점이 핵심이다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 구성의 곤란성을 다각도로 검토하고, 겨우살이 추출물이 효과를 내는 농도(10㎎/mouse)를 감안한 끝에, 겨우살이를 0.01~0.2 중량부 첨가하는 것이 가장 적절한 것으로 결정하였다.

따라서 이하의 실험예에서는, 겨우살이를 0.05, 0.1, 0.2 중량부 첨가한 김치를 제조하고, 각각에 대한 항암실험 및 관능실험을 실시함으로써 최적의 겨우살이 첨가량을 산출한다.

김치의 재료가 되는 배추는 가락 신1호, 젓갈은 청정멸치액젓(주)대상, 고춧가루는 영양농협청결고춧가루 가공공장에서 구입하여 사용하였다. 무, 파, 마늘, 생강, 갓은 부산 부전시장에서 구입하였다. 소금은 NaCl: KCl=7:3비율로 혼합하여 1번 구운 소금을 사용하였고 겨우살이물추출물(제품명 : 미슬로씨)은 주식회사 미슬바이오텍(경북, 포항)에서 구입하였다.

10% 염용액을 만들어 배추를 각각 10시간 염절임한 후 씻어서 김치를 제조하였다. 5℃에서 발효시키면서 적숙기의 김치(pH 4.2-4.3)가 되었을 때 동결건조한 후 시료를 마쇄하여 분말로 조제하고 분말시료에 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 2회 반복하여 여과한 후 회전식 진공 농축기로 농축하여 메탄올 추출물(methanol extract)을 얻었다. 이들 추출물들은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 희석하여 이하의 실험에 사용하였다.

이하의 실험예에서 대조군 김치라 함은 기존에 항암효과가 있는 것으로 공지된 조성으로 제조된 김치를 말한다. 대조군 김치 및 겨우살이 첨가김치의 조성은 표 1에 나타내었다.

재료	대조군 김치 (기존의 항암김치) (단위: 중량부)	겨우살이 첨가 항암김치 (단위: 중량부)
절인 유기배추 고춧가루 마늘 생강 무 설탕 파 갓 산초 배 버섯을 끓인 다시마물 겨우살이	100 2.5 2.8 0.6 11.0 1.0 2.0 7.5 0.1 2.8 5.0 -	100 2.5 2.8 0.6 11.0 1.0 2.0 7.5 0.1 2.8 5.0 0.01~0.2
최종염도	2.2%	2.2%

실험예 1 : 겨우살이 첨가김치의 항돌연변이 효과

대조군 김치 및 겨우살이를 첨가한 김치를 메탄올 추출하여 돌연변이원 AFB₁과 NNNG에 대한 항돌연변이 효과를 에임스 테스트(Ames test)를 통하여 알아보았다.

돌연변이 유발물질로 아플라톡신 B₁(aflatoxin B₁, AFB₁)을 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA)에서 구입하여 DMSO에 녹여 사용하였고 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)는 미국 알드리치(Aldrich)사로부터 구입하여 증류수에 녹여 실험에 사용하였다. 사용 균주로는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) TA100 로 미국 캘리포니아 대학 에임스(B. N. Ames) 박사로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 그리고 이 실험균주는 매 실험직전 히스티딘(histidine) 요구성, rfa(deep rough) 돌연변이, uvrB 돌연변이, R facto 등의 유전형질을 확인하여 사용하였다. 돌연변이원을 활성화시키기 위하여 마론(Maron)과 에임스(Ames)의 방법에 따라 간의 마이크로소말(microsomal) 효소 화합물인 S9 혼합물(S9 mixture)를 조제하였다. 본 실험에서 주로 이용하였던 프리인큐베이션 테스트(preincubation test)는 S9 mix 0.5 ml, 하룻밤 배양된 균주(1~2x10⁹ cell/ml) 0.1 ml, 희석된 시료(50 ㎕)와 돌연변이 유발 물질(50 ㎕)을 얼음욕조(ice bath)에 담긴 캡 튜브(cap tube)에 넣고 가볍게 교반(vortex)한 후 37℃에서 30분간 배양하였다. 45℃의 탑 한천(top agar) 2 ml씩을 각 튜브에 붓고 3초간 교반한 후 최소 글루코오스 한천 평판 (minimal glucose agar plate)에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이(Revertants) 숫자를 계수하였다. 한편, 실험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험(dose response 및 독성실험)을 통하여 결정하였다.

AFB₁에 대한 실험 결과, 1.25㎍/plate의 낮은 농도에서보다 2.5㎍/plate의 높은 농도에서 김치의 항돌연변이 효과가 높았다. 2.5㎍/plate농도로 했을 때 대조군 김치(기존의 항암김치)는 55%의 항돌연변이 효과를 보인 반면, 겨우살이를 첨가한 항암김치는 더 높은 항돌연변이 효과를 보였다. 겨우살이 0.05 중량부 첨가 항암김치는 항돌연변이효과가 67%, 겨우살이 0.1 중량부 첨가 항암김치는 70%, 겨우살이 0.2 중량부 첨가 항암김치는 75%로 농도가 증가함에 따라 항돌연변이 효과도 유의적으로 증가하였다. 이 실험으로 김치에 겨우살이의 첨가는 항돌연변이 효과를 월등히 증대시킴을 알 수 있다. (표 2 참조)

처리	복귀돌연변이/플레이트 (㎍/plate)
처리	1.25	2.5
Spontaneous Control(AFB₁)	98±4 1357±44^a
대조군 김치	796±19^b (44)	662±33^b (55)
겨우살이 0.05 중량부 첨가김치	659±11^b (55)	511±37^bc (67)
겨우살이 0.1 중량부 첨가김치	619±30^b (59)	475±21^bc (70)
겨우살이 0.2 중량부 첨가김치	497±26^b (68)	412±10^c (75)
괄호는 저해율(%)을 나타낸다. a~f로 표시된 것은 처리평균간에 Duncan's multiple test에 의한 유의적 차이가 있음(p<0.05)을 나타낸다.

위암의 원인물질 중 하나인 MNNG에 대한 항돌연변이 효과는 AFB₁에 대한 항돌연변이 효과와 비슷한 효과를 보였으나 AFB₁에 대한 항돌연변이 효과보다는 대체로 조금 낮은 항돌연변이 효과를 보였다. 1.25 ㎍/plate의 낮은 농도에서보다 2.5 ㎍/plate의 높은 농도에서 높은 항돌연변이 효과를 보였다. 2.5 ㎍/plate 농도에서 대조군 김치는 52%의 항돌연변이 효과를 보인 반면, 겨우살이의 첨가량이 증가함에 따라 항돌연변이 효과가 높았다. (표 3 참조)

처리	복귀돌연변이/플레이트 (㎍/plate)
처리	1.25	2.5
Spontaneous Control(AFB₁)	89±7 1349±52^a
대조군 김치	829±20^b (40)	680±25^b (52)
겨우살이 0.05 중량부 첨가김치	755±10^b (46)	586±14^bc (60)
겨우살이 0.1 중량부 첨가김치	703±9^b (51)	524±13^bc (65)
겨우살이 0.2 중량부 첨가김치	665±14^b (54)	483±11^c (68)
괄호는 저해율(%)을 나타낸다. a~f로 표시된 것은 처리평균간에 Duncan's multiple test에 의한 유의적 차이가 있음(p<0.05)을 나타낸다.

실험예 2 : 겨우살이 첨가김치의 항암효과

대조군 김치와 겨우살이를 0.05, 0.1, 0.2 중량부 첨가한 항암김치의 항암효과를 HT-29 인체 결장암세포와 AGS 인체위암세포를 이용하여 알아보았다.

세포배양을 위해 RPMI 1640, 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 0.05% 트립신-0.02% EDTA 그리고 100units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 GIBCO사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 CO₂ 인큐베이터(Forma, USA)를 사용하였다. HT-29 인체결장암세포(HT-29 human colon cancer cell)와 AGS 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS세포는 100units/㎖의 페니실린-스트렙토마이신과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 다시 영양공급(refeeding)하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6-7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 배양된 암세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 1x10⁴ cells/㎖가 되도록 하고(seeding) 시료를 농도별로 첨가한 다음, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 72시간 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT) 20㎕를 첨가하고 4시간 동안 더 배양한 후 생성된 포마즌(formazan) 결정을 DMSO에 녹여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, HT-29 인체 결장암세포에서의 항암효과를 보면 50 ㎍/assay의 낮은 농도의 김치에서보다 100㎍/assay의 높은 농도의 김치에서 항암효과가 높았다. 대조군 김치가 69%의 항암효과를 보인 반면 겨우살이를 첨가한 김치는 더욱 높은 항암효과를 나타내었고 농도에 따라서 92, 93, 96%의 증가를 보였으며 농도에 따른 항암효과의 차이는 크지 않았다. (표 4 참조)

처리	OD₅₄₀ (㎍/assay)
처리	50	100
Control	0.510±0.002^a
대조군 김치	0.262±0.007^b (48)	0.158±0.002^b (69)
겨우살이 0.05 중량부 첨가김치	0.055±0.003^c (89)	0.043±0.001^c (92)
겨우살이 0.1 중량부 첨가김치	0.050±0.001^c (90)	0.038±0.002^c (93)
겨우살이 0.2 중량부 첨가김치	0.032±0.002^d (94)	0.021±0.001^c (96)
괄호는 저해율(%)을 나타낸다. a~f로 표시된 것은 처리평균간에 Duncan's multiple test에 의한 유의적 차이가 있음(p<0.05)을 나타낸다.

AGS 인체위암세포에 대한 항암효과는 HT-29 인체 결장암세포에서의 항암효과보다 조금 높은 경향을 보였다. 100㎍/assay의 높은 농도에서 대조군 김치는 70%의 항암효과를 보였고 겨우살이를 첨가한 김치는 농도에 따른 차이가 없이 모두 97%의 높은 항암효과를 보였다. (표 5 참조)

처리	OD₅₄₀(㎍/assay)
처리	50	100
Control	0.533±0.005^a
대조군 김치	0.373±0.007^b (30)	0.161±0.011^b (70)
겨우살이 0.05 중량부 첨가김치	0.048±0.004^c (91)	0.017±0.002^c (97)
겨우살이 0.1 중량부 첨가김치	0.047±0.003^c (91)	0.017±0.001^c (97)
겨우살이 0.2 중량부 첨가김치	0.028±0.005^d (95)	0.017±0.004^c (97)
괄호는 저해율(%)을 나타낸다. a~f로 표시된 것은 처리평균간에 Duncan's multiple test에 의한 유의적 차이가 있음(p<0.05)을 나타낸다.

실험예 3 : 겨우살이 첨가김치의 pH 및 산도의 변화

신내가 강한 겨우살이를 첨가한 김치의 발효에 따른 pH 및 산도의 변화를 알아보았다.

담근 직후의 pH 변화를 보면 겨우살이를 첨가한 김치가 신내가 강하였지만 pH에서는 대조군 김치와 겨우살이를 첨가한 김치간에 pH의 차이는 없었다. 발효가 진행됨에 따라 대조군 김치의 발효속도보다 겨우살이를 첨가한 김치의 발효속도가 늦었으며 3주째의 pH를 보면 대조군 김치가 4.30인 것에 비하여 겨우살이 첨가김치의 pH는 낮았으며 첨가량에 따라 pH가 낮았고 겨우살이를 0.2 중량부 첨가한 김치의 pH는 4.34를 나타내었다. 3주째인 적숙기를 지나면서 겨우살이를 첨가한 김치는 더욱 천천히 발효가 진행되었으며 발효 5주 째에도 대조군 김치의 pH가 4.09인 것에 비해 겨우살이를 첨가한 김치는 pH가 높았으며 첨가량에 따라 각각 4.12, 4.15, 4.16을 나타내었다.

산도의 변화에서도 pH의 변화와 마찬가지로 처음에는 대조군 김치와 겨우살 이를 첨가한 김치간의 산도에는 변화가 없었지만 발효가 진행됨에 따라 겨우살이를 첨가한 김치의 산도가 대조군 김치의 산도보다 낮았으며 겨우살이의 농도가 높을수록 산도도 낮게 나타났다. pH의 변화와 마찬가지로 3주째를 보면 대조군 김치가 0.71%인데 비하여 겨우살이를 첨가한 김치의 산도는 0.68, 0.68, 0.65%로 낮았다. 겨우살이의 첨가로 인하여 김치의 발효속도가 늦어지며 이것은 겨우살이가 발효를 억제하는 효과가 있는 것을 나타낸다. 따라서, 겨우살이를 첨가하는 경우 김치의 저장성을 향상시킬 수 있다. (표 6 참조)

	발효기간 (week)	대조군 김치	겨우살이 0.05 중량부 첨가김치	겨우살이 0.1 중량부 첨가김치	겨우살이 0.2 중량부 첨가김치
pH	0	5.72	5.72	5.71	5.71
	1	5.31	5.31	5.32	5.32
	2	4.82	4.94	4.95	5.02
	3	4.30	4.31	4.31	4.34
	4	4.20	4.22	4.23	4.25
	5	4.09	4.12	4.15	4.16
산도(%)	0	0.31	0.31	0.31	0.32
	1	0.34	0.36	0.31	0.31
	2	0.54	0.50	0.48	0.45
	3	0.71	0.68	0.68	0.65
	4	0.78	0.75	0.73	0.72
	5	0.86	0.85	0.83	0.80

실험예 4 : 겨우살이 첨가김치의 관능검사

겨우살이를 첨가한 김치와 대조군 김치의 관능검사 결과를 보면 외관에서는 거의 차이가 없었고 신내에서는 겨우살이 자체가 신내가 강하였기에 관능검사에서도 대조군 김치의 5.2보다 겨우살이의 첨가농도에 따라 신내를 느끼는 정도가 점차 증가하여 겨우살이를 0.2% 첨가한 김치는 6.0으로 가장 강하게 신내를 느꼈다. 신맛도 신내와 마찬가지로 겨우살이 첨가 농도의 증가에 따라 신맛을 느끼는 정도도 증가하였다. 쓴맛은 대조군 김치가 신맛이 약해서 더 느끼는 것 같았다. 경도에서는 김치군들 간의 차이가 없었고 종합적인 평가에서는 겨우살이를 0.05 중량부 첨가한 김치가 6.5로 선호도가 가장 높았으며 대조군 김치가 6.2로 2번째였다. 겨우살이 자체가 신맛이 강하여 김치 제조시 처음에 넣었을 때는 신내가 강하게 느껴졌으나 발효가 진행됨에 따라 겨우살이의 신맛이 김치발효에 의한 신맛을 더 강하게 하지 않았으며 발효에 따라 나타나는 신맛과 조화를 이루어 더 맛있는 맛을 내었다. 그리고 겨우살이가 발효를 억제함으로써 맛있는 맛의 보존기간이 더 연장되었다. (표 7 참조)

	외관	신내	풋내 (green smell)	군덕내	신맛	쓴맛	군덕맛	경도	종합적 평가
대조군 김치	6.5	5.2	3.1	2.3	5.6	1.8	2.7	6.3	6.2
겨우살이 0.05 중량부 첨가김치	6.5	5.5	2.2	2.3	6.1	1.5	2.8	6.0	6.5
겨우살이 0.1 중량부 첨가김치	6.2	5.8	2.0	2.4	6.3	1.5	2.9	6.2	6.0
겨우살이 0.2 중량부 첨가김치	6.2	6.0	2.0	2.4	6.5	1.4	2.9	6.1	5.9
평가는 9점 만점이며, 1은 극히 나쁨(혹은 극히 약함) 9는 극히 좋음(혹은 극히 강함)을 나타낸다.

실험예 5 : 겨우살이 첨가김치의 육종-180 세포 (Sarcoma-180cell)를 이용한 항암실험

상기 실험예 1 내지 4의 결과를 토대로, 김치에 배합되는 최적의 겨우살이 첨가량을 0.05 중량부로 결정하였으며, 이하에서는 겨우살이를 0.05 중량부 첨가한 김치의 항암효과를 검증하기 위하여 대조군 김치(기존의 항암김치, 표 1 참조)와 비교하여 육종-180 세포(Sarcoma-180cell)를 이용한 항암실험을 실시하였다.

본 실험에 사용한 동물은 웅성 Balb/c 마우스(샘타코, 경기도 오산)로, 체중이 25g 전후의 것을 사용하였으며, 시료는 자유식으로 공급하였고 물은 제한없이 섭취하도록 하였다. 동물실험실은 온도 22±1℃ , 습도 55±5%를 유지하였으며, 12시간 간격으로 명암주기(light-dark cycle)를 유지하였다.

Balb/c 마우스의 복강내에 1주일 간격으로 계대배양하여 보존하고 있는 육종-180 세포를 실험용 종양세포로 사용하였다. 즉 실험동물의 복강내에서 1주일간 배양된 육종-180 세포를 복수와 함께 취하고 PBS(phosphate buffered saline)와 함께 원심분리(1,200 rpm, 10min)하여 종양세포를 분리하였다. 분리된 세포를 다시 PBS에 부유시켜 재차 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1.0x10⁶ cells/㎖가 되도록 종양세포 부유액을 만들어 1㎖씩을 복강주사하여 이식 보존하면서 실험에 사용하였다.

시료는 멸균된 PBS를 사용하여 조제하였으며 투여량은 마우스 ㎏당, 1㎎으로 하고, 대조군(Control)은 멸균 PBS만 투여하였다.

실험동물을 각 군당 6마리씩으로 하여 실험실에서 1주일 간격으로 계대 보관 중인 종양세포부유액 0.2㎖(6x10⁶ cells/mouse)씩을 실험동물의 왼쪽 서혜부(left groin)에 피하 이식한 후 24시간 후부터 20일간 매일 1회씩 김치의 메탄올 추출물을 PBS에 희석하여 복강으로 투여하였다. 종양세포 이식 26일째 되는 날 치사시켜 생성된 고형암을 적출하고 그 무게를 측정한 후 다음 식에 따라 종양 성장 저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.R.: %)을 계산하였다.

Cw － Tw

I.R. (%) = ----------- x 100

Cw

Cw : 대조군의 평균 종양무게

Tw : 처리군의 평균종양무게

그 결과, 김치를 투여하지 않은 대조군(control)의 고형암 무게는 4.06g인데 반해서, 겨우살이 첨가김치 추출물을 투여한 군에서는 2.38g, 1.48g으로, 유의적으로 고형암 무게가 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 대조군 김치 추출물을 투여한 군에서는 고형암 무게가 2.38g으로 저해율이 41%였으나, 발효되지 않은 0일 겨우살이 첨가김치는 2.12g으로 48%의 저해율을 보여 겨우살이 첨가에 따라 고형암 성장 저지 효과가 높았으며, 또한 발효된 적숙기 겨우살이 첨가김치는 1.48g으로 저해율이 64%로 가장 높은 항암효과를 나타냈다. 또한, 겨우살이 첨가김치에 포함된 농도 의 겨우살이만 투여한 군에서는 2.78g으로 32%의 항암성을 보였다. 이 결과에 따라 겨우살이 첨가김치는 겨우살이 추출물과 김치의 성분들이 발효가 진행됨에 따라 상승작용을 일으켜 더 높은 항암효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.(표 8 참조)

샘플	고형암 무게 (g)	저해율 (%)
육종 180 + PBS (Control)	4.06±0.26^a	-
대조군 김치	2.38±0.24^c	41
0일 겨우살이 첨가김치	2.12±0.30^d	48
적숙기 겨우살이 첨가김치	1.48±0.38^c	64
겨우살이	2.78±0.24^b	32
괄호는 저해율(%)을 나타낸다. a~f로 표시된 것은 처리평균간에 Duncan's multiple test에 의한 유의적 차이가 있음(p<0.05)을 나타낸다.

한편, 상기 S-180 세포를 주사한 후 겨우살이 첨가김치를 투여하고 글루타치온 및 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GSH) 함량을 측정하는 실험을 실시하였다.

글루타치온(Glutathione)은 세포의 방어 시스템(protective system)으로 설프히드릴 라디칼(sulfhydryl radical)을 가지고 있으며 친전자성 물질들과 활성산소 및 과산화지질을 대사작용에 있어서 무독화하는 과정에 이용된다. 또한 이것은 지질 과산화(lipid peroxidation)의 환원에 관여하는데 이는 글루타치온이 여러 활성증가물질과 결합(conjugation)을 이루어 글루타치온 S-트랜스퍼라아제

(glutathione S-transferase)와 같은 효소의 작용으로 뇨(urine)로 배설하도록 함으로서 체내의 독성물질들을 제거한다.

글루타치온 측정은 엘르만(Ellman)의 방법에 준하여 균질(homogenate)한 간조직 0.5ml에 4% 설포살리실릭 애씨드(sulfosalicylic acid)를 가하여 단백질을 제 거한 상등액에 디설파이드(disulfide) 시약(0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 8.0)에 5.5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid를 녹임) 2.7㎖를 가하여 20분 방치한 후 생성되는 청색을 412nm에서 측정하고 표준 곡선에 의하여 산정 하였으며, 단위는 조직 1g당 글루타치온 μ mole로 표시하였다.

그 결과, 대조군이 0.389인데 반해서 S-180 세포를 주사한 군은 0.318로 그 농도가 낮아졌으나, 김치 추출물을 투여한 군에서는 다시 그 함량이 높게 나타났다. 특히 적숙기 겨우살이 첨가김치군은 0.581로 0일 겨우살이 첨가김치가 0.447인데 반해 글루타치온의 함량이 높게 나타났다. (도 1 참조)

글루타치온 S-트랜스퍼라아제(Glutathione S-transferase)의 활성 측정은

Habig 등의 방법에 준하여 0.1M 인산칼륨 버퍼(potassium phosphate buffer, pH 6.5)중에 0.04M 환원된 글루타치온(reduced glutathione) 0.075㎖를 가한 후 효소액을 0.1㎖ 넣고 블랭크(blank)에는 20% 트리클로로아세틱 애씨드(trichloroacetic acid) 0.5㎖를 가해 600 x g에서 원심분리하여 단백질을 제거하고 시료는 25℃에서 5분간 반응시킨 후 블랭크(blank)와 시료 각각에 기질로써 0.12M 1-chloro-2,4-dinitrobenzene 0.025㎖ 가하여 25 에서 2분간 반응시킨 다음 시료에 20% 트리클로로아세틱 애씨드(trichloroacetic acid)를 가해 반응을 완결시킨 후 블랭크(blank)와 시료 각각을 원심분리하여 얻은 상등액을 340nm에서 흡광도를 측정한 다음 2,4-디니트로클로로벤젠(2,4-dinitrochlolrobenzene)의 몰(mole) 흡광계수 9.6mM-1cm-1을 이용하여 활성도를 산정하였다.

효소 활성의 단위(enzyme unit, EU)는 1분간 1mg 단백질(protein)이 생성한 2,4-디니트로벤젠-글루타치온(2,4-dinitrobenzene- glutathione)의 nmole수로 표시하였다.

그 결과, 마우스에 S-180 세포를 주사하고 PBS만 주사한 군에서는 253으로 낮은 활성을 보였으나, 대조군 김치를 투여한 군에서는 339, 발효가 되지 않은 0일 겨우살이 첨가 김치군은 436, 발효가 된 적숙기 겨우살이 첨가 김치군은 514로 가장 높은 GST활성을 나타내었으나, 겨우살이를 김치에 첨가된 농도로 실험한 군은 310으로 낮은 활성을 보여주었다. (도 2 참조)

실험예 6 : 겨우살이 첨가김치의 종양전이 억제실험

6주령의 암컷 balb/c 마우스(샘타코, 경기도 오산)로 체중이 20g 전후의 것을 사용하였으며 사료는 표준사료로 사육하였다. 사육시 물과 사료는 충분한 양을 공급하였고 동물실험실은 온도 22±1℃ , 습도 55±5%를 유지하였으며, 12시간 간격으로 명암주기(light-dark cycle)을 유지하였다.

종양전이 억제효과를 살펴보기 위하여 폐에 대하여 전이력을 획득한 고전이성 종양세포주인 결장(colon) 26-M3.1 암종(carcinoma)을 100 unit/ml의 페니실린 K-스트렙토마이신과 7.5%의 FBS가 함유된 EME배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 다시 영양공급(refeeding)하고 6-7일만에 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 PBS를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산 되도록 잘 혼합하여 100㎕(2.5x10⁴/ml)를 balb/c 마우스의 꼬리에 정맥주사하였다. 각 군은 5마리로 하였으며 대조군 김치, 겨우살이 첨가 김치, 겨우살이(김치에 첨가된 양)를 종양세포 접종 2일 후에 피하주사하였다.

전이된 종양의 판정은 종양접종 14일 후에 마우스를 희생시켜 종양의 표적기관인 폐를 적출한 다음 Bouin's 용액(saturated picric acid : formalin : acetic acid=15:5:1, v/v/v)에서 전이된 종양을 고정시킨 후 종양의 군집수를 계수하였고 대조군 김치, 겨우살이 첨가김치에 의한 종양전이억제효과는 종양만 접종한 대조군(control)과 비교함으로서 측정하였다

그 결과, 대조군의 37개의 종양갯수에 비해 대조군 김치, 겨우살이 첨가김치, 겨우살이는 각각의 농도에서 저해효과를 보였다. 0.25mg/mouse의 농도에서보다 1.25 mg/mouse의 고농도에서 뚜렷한 저해효과를 보였다. 1.25 mg/mouse의 농도에서 대조군 김치는 41%의 종양전이 억제효과를 보였으며 겨우살이를 첨가한 김치 중 발효하지 않은 0일의 것은 52%, 발효가 잘 되어 적숙기의 겨우살이 첨가김치는 59%의 높은 종양전이 억제효과를 보였다. 겨우살이를 첨가한 김치라도 발효가 잘 된 적숙기의 김치와 발효가 되지 않은 0일의 김치의 종양전이 억제효과는 유의적인 차를 나타내었다. 또한, 겨우살이 첨가김치에 포함된 농도의 겨우살이만 투여한 군에서는 1.25 mg/mouse의 농도에서 41%의 항암성을 보였다. 이 결과에 따라 겨우살이 첨가김치는 겨우살이 추출물과 김치의 성분들이 발효가 진행됨에 따라 상승작용을 일으켜 더 높은 항암효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. (표 9 참조)

처리	투여량 (mg/mouse)	폐로 전이된 개수 (저해율 %)
처리	투여량 (mg/mouse)	평균 ±표준편차	범위
Control	-	37.33±3.06^a	34~40
대조군 김치	0.25	26.67±4.16^b	22~30
대조군 김치	1.25	22.00±2.00^cd	20~24
0일 겨우살이 첨가김치	0.25	24.00±2.00^bc	22~26
0일 겨우살이 첨가김치	1.25	18.00±2.00^de	16~20
적숙기 겨우살이 첨가김치	0.25	18.33±0.58^de	18~19
적숙기 겨우살이 첨가김치	1.25	15.33±1.15^e	14~16
겨우살이	0.25	26.00±2.00^bc	24~28
겨우살이	1.25	22.00±2.00^cd	20~24
괄호는 저해율(%)을 나타낸다. a~f로 표시된 것은 처리평균간에 Duncan's multiple test에 의한 유의적 차이가 있음(p<0.05)을 나 타낸다.

본 발명은 암예방 및 항암기능성 겨우살이 첨가 김치에 관한 것이며, 절인배추 100 중량부에 고춧가루 2.5 중량부, 마늘 2.8 중량부, 생강 0.6 중량부, 무 11.0 중량부, 설탕 1.0 중량부, 파 2.0 중량부, 갓 7.5 중량부, 산초 0.1 중량부, 배 2.8 중량부, 버섯과 다시마를 우려낸 물 5.0 중량부, 겨우살이 0.01~0.2 중량부로 조성되며, 최종염도가 2.2%인 배추김치는 탁월한 항암 효과뿐만 아니라 우수한 관능적 특성을 가지므로 이는 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

절인배추 100 중량부에 고춧가루 2.5 중량부, 마늘 2.8 중량부, 생강 0.6 중량부, 무 11.0 중량부, 설탕 1.0 중량부, 파 2.0 중량부, 갓 7.5 중량부, 산초 0.1 중량부, 배 2.8 중량부, 버섯과 다시마를 우려낸 물 5.0 중량부로 조성되며, 최종염도가 2.2%인 항암기능성 김치에 있어서,

겨우살이 0.01~0.2 중량부를 추가로 포함함을 특징으로 하는 항암기능성 및 저장성이 증진된 배추김치.