KR100839606B1

KR100839606B1 - 표고버섯 분말 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유하는 생체 산화 예방용 식품 조성물

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Publication number: KR100839606B1
Application number: KR1020070020927A
Authority: KR
Inventors: 함승시; 김수현; 유수정; 오현택; 최현진; 함승우
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 함승우
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2008-06-19

Abstract

본 발명은 건강기능성 식품 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표고버섯 분말 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 식품 조성물 및 상기 건강기능성 식품 조성물로부터 제조된 천연 조미료에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 조미료는 항산화, 항돌연변이, 항암활성이 뛰어나므로, 다양한 종류의 식품, 특히 천연 조미료의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

건강기능성 식품 조성물, 표고버섯, 다시마

Description

표고버섯 분말 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유하는 생체 산화 예방용 식품 조성물{Antioxidant Foods Composite Comprising Powder of Lentinus edodes and of Kelp as Effective Components}

도 1은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA100에 MNNG(0.4 ㎍/플레이트)에 대한 표고버섯(Lentinus edodes)의 70% 에탄올 추출물의 항돌연변이원성 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾은 플레이트 3개 당 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

도 2는 살모넬라 티피무리움 TA98 및 TA100에 4NQO(0.15 ㎍/플레이트)에 대한 표고버섯의 70% 에탄올 추출물의 항돌연변이원성 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾은 플레이트 3개 당 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

도 3은 살모넬라 티피무리움 TA100에 MNNG(0.4 ㎍/플레이트)에 대한 다시마(Laminaria japonica)의 70% 에탄올 추출물의 항돌연변이원성 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾은 플레이트 3개 당 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

도 4는 살모넬라 티피무리움 TA98 및 TA100에 4NQO(0.15 ㎍/플레이트)에 대한 다시마의 70% 에탄올 추출물의 항돌연변이원성 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾은 플레이트 3개 당 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

도 5는 표고버섯의 70% 에탄올 추출물의 인간 암세포에 대한 억제 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾수치는 평균 ± SD(표준편차)이다(n=3)),

: 인간 폐암세포(Lung carcinama)(A549),

: 인간 유방암세포(Breast adenocarcinoma)(MCF-7),

: 인간 간암세포(Hepatocellar carcinoma)(Hep3B),

: 인간 자궁암세포(Cervical adenocarcinoma)(HeLa),

: 인간 위암세포(Gastric carcinoma)(AGS),

: 인간 신장 정상세포(Transformed primary embryonal kidney)(293),

도 6은 다시마의 70% 에탄올 추출물의 인간 암세포에 대한 억제 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾수치는 평균 ± SD(표준편차)이다(n=3)),

: 인간 폐암세포(Lung carcinama)(A549),

: 인간 유방암세포(Breast adenocarcinoma)(MCF-7),

: 인간 간암세포(Hepatocellar carcinoma)(Hep3B),

: 인간 자궁암세포(Cervical adenocarcinoma)(HeLa),

: 인간 위암세포(Gastric carcinoma)(AGS),

: 인간 신장 정상세포(Transformed primary embryonal kidney)(293),

도 7은 살모넬라 티피무리움 TA100에 MNNG(0.4 ㎍/플레이트)에 의한 돌연변 이원성(mutagenicity)에 표고버섯 70% 에탄올 추출물을 사용한 천연 조미료의 각 분획의 억제 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾각 수치는 3 플레이트의 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

: 에탄올 추출물,

: 헥산 분획,

: 클로로포름 분획,

: 에틸아세테이트 분획,

: 부탄올 분획,

: 수용성 분획,

도 8은 살모넬라 티피무리움 TA98 및 TA100에 4NQO(0.15 ㎍/플레이트)에 의한 돌연변이원성에 표고버섯을 사용한 천연 조미료의 70% 에탄올 추출물 및 각 분획의 억제 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾각 수치는 3 플레이트의 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

: 에탄올 추출물,

: 헥산 분획,

: 클로로포름 분획,

: 에틸아세테이트 분획,

: 부탄올 분획,

: 수용성 분획,

도 9는 인간 신장 정상세포(Transformed primary embryonal kidney)(293)에 표고버섯를 사용한 70% 에탄올 추출물 및 천연 조미료 각 분획의 억제 효과를 나타낸 그래프이고(이때, ¹⁾수치는 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다),

: 에탄올 추출물,

: 헥산 분획,

: 클로로포름 분획,

: 에틸아세테이트 분획,

: 부탄올 분획,

: 수용성 분획,

도 10은 사코마-180 세포를 갖고 있는 Balb/c 마우스를 갖는 종양의 형태를 나타낸 사진이다.

(a) 대조군,

(b) 부탄올 분획 50 ㎎/㎏, I.P.

(c) 부탄올 분획 100 ㎎/㎏, I.P.

본 발명은 건강기능성 식품 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표고버섯 분말 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 식품 조성물 및 상기 건강기능성 식품 조성물로부터 제조된 천연 조미료에 관한 것이다.

최근 생활수준이 향상되고 더불어 건강과 웰빙(well-being)에 대한 관심이 급속히 높아짐에 따라 음식문화 또한 크게 변화되고 있다. 이에 따라, 자연식품이나 건강식품, 기능성 식품 등 보다 건강지향적인 식품을 찾고자 하는 노력이 크게 증가하였고, 다수의 사람들이 이와 같은 식습관으로 변화하게 되었다. 이러한 점에서, 버섯은 식품의 3차적 기능인 영양적 특성, 기호적 특성 및 생체조절 특성을 모두 갖춘 식품 재료로 나날이 기호도와 소비량이 증가하고 있으며, 생산량 또한 증가하고 있는 추세이다.

버섯은 담자균류에 속하는 균식물로서 탄수화물, 단백질, 지질, 무기질 및 비타민 등의 영양소를 골고루 함유하고 있을 뿐만 아니라 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어 왔으며 자연식품, 저칼로리식품 및 무공해식품으로도 인정되는 식품이다. 우리나라에서 식용으로 이용하고 있는 버섯류 중 대표적인 표고버섯(Lentinus edodes)은 활엽수에 기생하는 담자균류 느타릿과 잔버섯속 혹은 표고속으로 분류되는 버섯으로 특유한 향과 맛을 띠어 기호성이 높은 식품소재이다. 또한, 열량이 높고 단백질과 비타민의 함량이 많기 때문에 세계 여러 나라 사람들이 많이 이용되고 있으며 식품으로서의 이용될 뿐만 아니라 강장, 이뇨, 고혈압, 신장염, 신경쇠약, 불면증, 천식, 위궤양 등의 치료에 효능이 있으며 더욱 각종 미네랄과 식이섬유를 포함하여 저칼로리성 건강식품으로도 각광을 받고 있다.

현재 표고버섯에 대한 기능성 검색은 자궁경부암 동물세포에서 표고버섯의 생체내(In Vivo) 및 시험관내(In Vitro) 항암효과, 표고버섯 급여에 의한 SHR 흰쥐의 혈압 및 혈청 지질 수준에 미치는 영향 및 표고버섯 추출물의 항균효과, 표고버섯 균사체의 생산과 당뇨 유발 흰쥐에 대한 혈당 강하 효과 등 많은 연구가 되어 있다(자궁경부암동물세포에서 표고버섯의 in vitro 및 in vivo 항암효과 -Apoptosis에 의한 종양세포주의 성장억제-. 박정민, 이성현, 김정옥, 박홍주, 박재복, 신정임. 한국식품과학회지, 2004년 제36권 제1호, 141~146; 표고버섯과 급여가 SHR 흰쥐의 혈압 및 혈청 지질 수준에 미치는 영향. 이성현 , 박홍주, 조소영, 정현진. 한국영양학회지, 2004년 제37권 제7호 509~514; 표고버섯(Lentinus edodes)추출물의 항균활성. 김용두, 김경제, 조덕봉. 한국식품저장유통학회지, 2003년 제10권 제1호 89~93; 표고버섯 균사체의 생산과 당뇨 유발 흰쥐에 대한 혈당강하 효과. 양병근, 김동현, 송치현. 한국균학회지, 2002년 제30권 제2호 131~135.). 또한, 표고버섯이 함유된 간장의 발효 중 품질특성, 표고버섯 함유 버섯의 어묵의 물성 특성, 표고버섯 가루를 함유한 식빵의 제품 개발에 관한 연구 등 가공에 관한 연구도 많이 되어 있다(표고버섯이 함유된 간장의 발효 중 품질특성. 장덕규, 우강융, 이승철. 한국응용생명화학회지, 2003년 제46권 제3호 220~224; 표고버섯 함유 어묵의 물성 특성. 손미희, 김소영, 하정욱, 이승철. 한국식품영양과학회지, 2003년 제32권 제6호 859~863; 표고버섯가루를 활용한 식빵의 제품개발에 관한 연구. 노삼현. 한국조리학회지, 2000년 제6권 제3호 281~289). 그러나, 표고버섯은 수분함량이 높고 조직이 연하여 신선한 상태를 유지하기 어렵고, 주생산 시기가 한정되어 있어 생산된 표고버섯의 대부분은 열풍 또는 천일건조 방법에 의해 건조된 후 저장 유통되고 있지만 상품가치를 지속시키기에는 미흡한 점이 많아 저장방법의 개선이 요구되고 있다. 따라서, 이러한 표고버섯들을 이용한 잼, 편, 묵, 소스 및 조미료 등 기호성이 우수한 기능성 식품을 지속적으로 개발해야 할 필요성이 대두되고 있다.

최근 조미료 시장은 가공식품 및 외식산업의 발전과 소비자들의 기호가 다양하기 때문에 글루탐산소다 및 핵산계 조미료만으로는 미각의 다양화를 꾀하거나 독특한 풍미를 낼 수 없으며, 또한 합성조미료는 안정성에 대한 문제로 인해 천연조 미료를 이용하려는 사람들이 증가하고 있는 실정이다.

한편, 다시마는 학명이 라미나라아 론기시마(Laminaria longissima)인 갈조류에 속하는 다시마과의 한 속으로서 2~3년생인 해조이다. 다시마는 육상식물에 비하여 비타민 및 미네랄, 특히 마그네슘, 칼슘, 요오드 및 철 등의 함량이 높고, 해조류를 구성하고 있는 후코이단(fucoidan; 해초류에 포함된 수용성 식이섬유), 알지네이트(alginate) 등의 생리활성이 강한 다당류를 많이 포함하고 있어 기능성 소재나 건강식품으로 많이 이용되고 있다.

우리나라의 암으로 인한 사망자수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명 가운데 25.5%(남자 사망자의 29.6%, 여자 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망이 사망원인의 1위를 차지하고 있다. 이는 우리나라 인구 10만 명당 약 131명이 암으로 사망한다는 의미이다. 암세포는 빠르게 증식하고 분열하는 특징이 있으므로 항암제는 빠른 성장을 하는 세포를 죽이도록 만들어 졌다. 그러나, 일부 정상세포 또한 암세포와 같이 빠르게 증식하기 때문에 항암제 투여시 암세포보다는 덜하지만 정상세포도 손상을 받게 된다. 정상 세포 중에서도 빨리 분열 증식하는 세포, 즉 골수에서 형성된 혈액세포, 구강을 포함한 위장관의 상피세포, 머리카락 세포 그리고 정자, 난자를 만들어내는 생식세포 등이 영향을 받게 된다. 따라서, 항암화학요법 후에 빈혈이 오고, 백혈구 및 혈소판 수가 감소하여, 입안이 헐고 오심, 구토, 설사 등이 올 수 있으며 머리카락이 빠지면 생식기능에 장애를 가져오는 등의 부작용이 있다.

이상과 같이 현재 발암의 예방 관점으로부터 특히 식품성분에 의한 촉진(promotion)의 억제가 주목받고 있으며, 또한 식용 또는 약용식물의 항발암 촉진 효과의 평가나 활성물질에 대한 연구가 이루어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 기호성이 우수하면서도 항암성, 항산화성이 우수한 기능성 식품을 제조하고자 노력하여 표고버섯 및 다시마 분말을 첨가하여 제조한 천연 조미료를 개발하였고, 생리활성을 살펴보기 위한 수소전자공여능을 이용한 항산화능, 인간암세포주를 이용한 항암활성, 에임스 시험(Ames test)를 이용한 항돌연변이원성 및 고형암 성장 억제 실험을 통하여 상기 표고버섯 및 다시마 분말이 기능성 식품으로서 널리 활용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 표고버섯 및 다시마 분말의 유효성분으로 이루어진 항산화, 항돌연변이, 항암활성이 우수한 건강기능성 식품 조성물, 특히 천연 조미료를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표고버섯 분말 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건강기능성 식품 조성물로부터 제조된 천연 조미료를을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표고버섯 분말 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 분말은 에탄올, 부탄올, 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물로 이루어진 군중에서 선택된 것을 추출용매로 사용하여 추출한 후, 추출용매를 휘발시켜 제조한 분말인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 표고버섯 분말 및 다시마 분말에 지미베이스를 추가적으로 함유하는 것이 바람직하며, 이때 상기 성분은 표고버섯 분말 10~30 중량%, 다시마 분말 1~10 중량% 및 지미베이스 60~85 중량%인 것이 보다 바람직하고, 표고버섯 분말 20 중량%, 다시마 분말 2.2 중량% 및 지미베이스 77.8 중량% 인 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명의 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 지미베이스는 정제염, 야채베이스 및 이스트엑기스 분말로 구성되는 것이 바람직하고, 정제염 53.38 중량%, 야채베이스 25.71 중량% 및 이스트엑기스 분말 20.91 중량%로 구성되는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 건강기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 야채베이스는 양파, 마늘, 말토덱스트린 및 정제수로 구성되는 것이 바람직하고, 양파 35.71 중량 %, 마늘 21.43 중량%, 말토덱스트린 15.72 중량% 및 정제수 27.14 중량%로 구성되는 것이 보다 바람직하다.

본 발명자들은 먼저 표고버섯 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유한 천연 조미료를 제조하였다. 구체적으로, 표고버섯 분말, 다시마 분말, 지미베이스로 이루어진 성분함량의 천연 조미료를 제조하였고, 이때, 지미베이스는 복합조미식품으로서, 정제염, 야채베이스 및 이스트엑기스 분말로 이루어진다. 또한, 야채베이스 역시 복합조미식품으로서, 양파, 마늘, 말토덱스트린 및 정제수로 배합된다.

본 발명자들은 표고버섯 및 다시마 분말의 추출물의 건강기능성 식품으로서의 가능성을 테스트 하였다.

먼저, 표고버섯 및 다시마 분말의 에탄올 추출물에 대한 항산화 능력을 테스하였다. 항산화 활성은 α,α-디페닐-β-피크릴하이드라질(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl; DPPHㆍ)을 이용하여 측정하였는데, 표고버섯 분말의 에탄올 추출물 및 다시마 분말의 에탄올 추출물 모두 항산화 능력을 나타낸다(표 1 참조).

또한, 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물의 돌연변이원성 테스트를 실시하였는데, S. typhimurium TA98과 TA100 균주에 대한 에임스 테스트를 수행한 결과, 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물은 돌연변이원성을 나타내지 않는다(표 2 및 표 3 참조). 또한, 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물의 항돌연변이원성을 검토하기 위하여, MNNG와 4NQO를 사용하여 각각의 농도에 따른 항돌연변이원성을 검토하였다. 그 결과, 표고버섯의 에탄올 추출물의 MNNG 및 4NQO에 대한 변이원성 억제를 나타낸다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 다시마 에탄올 추출물의 MNNG 및 4NQO에 대한 변이원성 억제를 나타낸다(도 3 및 도 4 참조).

본 발명자들은 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물의 시험관내 항암 효과를 SRB 분석을 통하여 테스트하였다. 그 결과, 인간 폐암세포(A549), 인간 유방암세포(MCF-7), 인간 간암세포(Hep3B), 인간 자궁암세포(HeLa), 인간 위암세포(AGS) 및 인간 신장 정상세포 (293)에 대하여 표고버섯 및 다시마 에탄올 추출물은 여러 종류의 인간 암세포에 대한 성장 억제 효과를 나타낸다(도 5 및 도 6 참조).

본 발명자들은 다양한 표고버섯 분말 첨가 조미료 추출물 및 분획물에 대한 테스트를 수행하였는데, 항산화성 테스트 결과 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물이 높은 항산화 값을 나타낸다(표 4 참조).

또한, 돌연변이원성을 테스트한 에임스 테스트에서 his⁺ 복귀돌연변이 콜로니수는 증감이 없어서 표고버섯을 이용한 천연 조미료의 에탄올 추출물 자체는 돌연변이원성이 없다(표 5 참조). 또한, 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물과 분획물의 항돌연변이원성을 검토한 결과, 핵산, 에틸아세테이트 분획물 및 에탄올 추출물에서 강한 억제율을 나타내고, 클로로포름과 물 분획물에서도 비교적 높은 돌연변이 저해 효과를 나타내며, 시료 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 변이원성 역제 효과를 나타낸다(도 8 참조).

표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물 및 분획물들에 대한 시험관 내 항암 테스트를 위하여여 SRB 분석을 행한 결과, 인간 암세포 성장 억제 효과를 나타낸 반면 정상세포에 대해서 독성효과를 나타내지 않는다(도 6 및 도 9 참조). 또한, 본 발명자들은 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 추출물이 고형암의 성장저해 효과가 있는지를 확인한 결과, 종양세포를 이식한 대조군에 비하여 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 부탄올 분획물은 유의적인 감소효과를 나타낸다(도 10 참조).

따라서, 본 발명은 항암효과가 뛰어난 표고버섯과 무기질, 비타민, 섬유질을 다량 함유하고 있는 다시마를 이용한 건강기능성 식품은 인류의 건강 증진에 큰 효과가 있을 것이다. 즉, 본 발명자들이 제조한 천연 조미료는 표고버섯 및 다시마의 유효성분들의 상승작용에 의해 항산화, 항돌연변이, 항암활성을 보이는 것이라고 사료된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 > 표고버섯 및 다시마 분말을 유효성분으로 함유한 천연 조미료의 제조

본 발명자들은 표고버섯 및 다시마는 강원도 고성군 베다니식품으로부터 제공받아 실험에 사용하였다.

구체적으로, 표고버섯 분말 20%, 다시마 분말 2.2%, 지미베이스 77.8%로 이루어진 성분함량의 천연 조미료를 제조하였다.

상기 지미베이스는 복합조미식품으로서, 원재료 및 배합비율은 정제염 53.38%, 야채베이스 25.71% 및 이스트엑기스 분말 20.91%로 이루어져 있다. 구체적으로, 지미베이스는 각 원료를 자체 검수실에서 검수 확인된 각 원료를 계량하여 준비하였다. 그리고, 상기 원료를 상기 배합비율에 준하여 리본믹셔에서 혼합 후 20분간 균질시킴으로써 혼합균질 시켰다. 혼합 후에는 지정된 메쉬체로 사별함으로써 크기별로 분류하고, 최종 품질검사를 한 후 일정한 단위로 사별하여 포장함으로써 검수 및 포장을 행하였다. 그 결과, 제조된 지미베이스는 특유의 맛과 풍미를 가지고 있는 연한색의 분말상의 성상을 나타내고, 조미식품 및 스프 등의 조미용으로 적당량 사용가능하다. 상기 지미베이스를 250 g에서 1 ㎏ 단위로 포장하였으며, 제조일로부터 18 개월 동안 유통가능하다.

또한, 상기 이용된 야채베이스 역시 복합조미식품으로서, 원재료 및 배합비율은 양파 35.71%, 마늘 21.43%, 말토덱스트린 15.72% 및 정제수 27.14%로 배합되어져 있다. 구체적으로, 상기 야채베이스의 제조는 먼저, 각 원료를 품질 검사를 한 후 준비함으로써 원료를 선별하고, 각 원료를 계량 준비하였다. 그 후, 스팀 추출탱크에서 양파, 마늘을 쵸핑하여 정제수와 같이 투입하여 100℃에서 1시간 추 출함으로써 가열추출 하였다. 다시 상기 추출액을 표준 MESH망을 이용하여 여과한 후 진공농축기에서 덱스티린을 투입하고 용해한 다음 BRIX 40∼45까지 진공농축하였다. 그리고 나서, 이것을 일정조건에 따라 건조하는 분무건조를 수행한 후, 최종 품질검사를 한 후 일정한 단위롤 사별하여 포장함으로써 검수 및 포장을 수행하였다. 그 결과, 제조된 야채베이스는 제품 특유의 풍미가 있는 연백색의 분말상의 성상을 나타내고, 조미식품 및 스프 등의 조미용으로 적당량 사용가능하다. 상기 야채베이스를 250 g에서 1 ㎏ 단위로 포장하였으며, 제조일로부터 18 개월 동안 유통가능하다.

< 시험예 > 에탄올 추출물의 건강 기능성 테스트

본 발명에 사용한 유기용매, DPPH, 에탄올, 4NQO, MNNG 등은 일본 和光藥品회사 제품을 사용하였다. 테스트에 사용하는 살모네랄 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA98, TA100 두 균주는 미국 캘리포니아 대학의 에임스(Ames) 교수로부터 분양받아 사용하였다. 암 세포주인 A549(인간 폐암세포), AGS(인간 위암세포), MCF-7(인간 유방암세포), HeLa(인간 자궁암세포), Hep3B(인간간암세포), 293(인간 정상신세포) 세포들은 모두 한국세포은행으로부터 구입하여 사용하였다. 기타 추출용 시약 등은 일급시약을 사용하였다. 또한, 각 테스의 통계처리는 각 처리군 간의 통계적 유의성을 검증하기 위하여 SPSS 검증을 실시하였으며, 유의성이 발견 된 경우 던칸 테스트(Duncan`s new muliple range test)로 p<0.05 수준에서 검증하였다.

< 시험예 1 > 표고버섯 및 다시마 분말 추출물

< 1-1 > 항산화성 테스트

본 발명자들은 표고버섯 및 다시마 분말의 에탄올 추출물에 대한 항산화 능력을 테스하였다.

항산화 활성의 측정방법은 불포화지방산 라디칼의 모델로서 안정한 유리 라디칼인 α,α-디페닐-β-피크릴하이드라질(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl; DPPHㆍ)을 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 상기 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계로 측정함으로써 이루어진다. 상기 방법은 시료의 항산화 활성을 간접적으로 측정하지만, 조작이 간편하고 단시간에 측정이 가능하여 많은 종류의 시료에 대한 항산화 활성의 검색 등의 용도로 널리 이용되고 있는 방법이다.

구체적으로, DPPH 용액(0.4 mM)은 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, C₁₈H₂N, FW 394.3, 0℃ 이하에 보존)(일본 和光藥品회사 제품) 80 ㎎을 500 ㎖의 에탄올(일본 和光藥品회사 제품)에 용해시킨 후 여과지(Toyo No. 5A)로 여과하여 제조하여 사용하였다. 상기 용액은 불안정하므로, 측정 전에 즉시 제조하여 사용할 때까지 냉암소에 보관하여야 하였다. 제조한 DPPH 용액 0.8 ㎖에 에탄올 적당량(3~4 ㎖)을 가하고 10초 동안 강하게 진탕하여 분광광도계의 흡광도 값이 0.95 ~ 0.99가 되도록 에탄올 양을 조정하였다. 그 후에 시료 용액 0.2 ㎖를 취하여 앞에서 조절한 적정량의 에탄올과 DPPH 용액 0.8 ㎖를 가하여 10초 동안 강하게 진탕한 후, 10분 동안 방치하고 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 용액 대신에 같은 양의 에탄올을 가하여 진탕하고 방치하여 즉시에 흡광도를 측정하였다.

항산화 활성은 표고버섯 및 다시마 분말의 에탄올 추출물의 수소전자공여능 RC₅₀(Restriction concent ratio)으로, 산화를 50% 억제시키는데 요구되는 시료의 농도로써 표시하였다. 그 결과, 하기 표 1에 기재한 바와 같이 표고버섯 분말의 에탄올 추출물의 경우는 산화를 50% 억제시키는데 요구되는 시료의 농도가 165.4 ㎍을 나타내었으며, 다시마 분말의 에탄올 추출물의 경우에는 176.8 ㎍을 나타내었다.

표고버섯(Lentinus edodes) 및 다시마(Laminaria japonica)의 70% 에탄올 추출물의 전자공여능(Electron donating ability; EDA)

시료	RC₅₀ ¹⁾(㎍)
표고버섯(Lentinus edodes)	165.4
다시마(Laminaria japonica)	176.8
BHT(Dibutyl hydroxy toluene)	16.8

¹⁾ 30분 후 DPPH 50% 감소에 필요한 양

< 1-2 > 돌연변이원성 및 항돌연변이원성 테스트

본 발명자들은 에임스(Ames) 등의 방법에 따라 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물의 돌연변이원성 및 항돌연변이원성 테스트를 실시하였다.

< 1-2-1 > 돌연변이원성 테스트

본 발명자들이 S. typhimurium TA98과 TA100을 이용한 에임스 테스트를 수행한 결과, 음성대조군의 복귀 돌연변이 콜로니 수는 TA98이 19 ± 1, TA100은 182 ± 4였다. 한편, 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물을 50, 100, 150 및 200 ㎍/플레이트의 여러 농도를 첨가하여 시험한 결과 콜로니 수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 콜로니 수의 큰 변화를 나타내지 않았다. 따라서, 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물은 돌연변이원성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(표 2 및 표 3).

살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA98 및 TA100에 표고버섯(Lentinus edodes) 70% 에탄올 추출물의 돌연변이원성

투여량(㎍/플레이트)	His⁺복귀돌연변이/플레이트
투여량(㎍/플레이트)	TA98	TA100
자연발생	19 ± 1	182 ± 4
50	18 ± 2	174 ± 6
100	20 ± 2	187 ± 3
150	20 ± 3	175 ± 9
200	19 ± 1	177 ± 7

살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA98 및 TA100에 다시마(Laminaria japonica) 70% 에탄올 추출물의 돌연변이원성

투여량(㎍/플레이트)	His⁺복귀돌연변이/플레이트
투여량(㎍/플레이트)	TA98	TA100
자연발생	19 ± 1	182 ± 4
50	19 ± 1	179 ± 3
100	17 ± 1	170 ± 2
150	19 ± 2	175 ± 3
200	20 ± 3	169 ± 4

< 1-2-2 > 항돌연변이원성 테스트

본 발명자들은 항돌연변이원성을 검토하기 위하여, 에임스 테스트에서 양성반응을 나타내며 직접변이원 물질로 알려진 MNNG와 4NQO를 사용하여 각각의 농도에 따른 항돌연변이원성을 검토하였다. 이때, 테스트에 이용되는 변이원 물질은 MNNG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)(일본 和光藥品회사 제품) 및 4NQO(4-nitroquinoline-1-oxide)(일본 和光藥品회사 제품)이다.

구체적으로, 건열멸균시킨 뚜껑달린 시험관(glass cap tube)에 시료 추출물을 각각 50 ㎕씩 첨가하고, 이어서 변이원 물질을 각각 50 ㎕씩 첨가하였다. 여기에 전배양시킨 균액을 100 ㎕씩 주입한 후에 0.2 M 소듐포스페이트 완충액을 가하여 최종부피가 700 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이성 유무를 판정하였다. 시료 추출물과 변이원물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이 활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.

MNNG는 직접 돌연변이원으로 체내에서 알킬라케이션(alkylacation)을 생성하여 DNA 염기의 친핵성 부위(nucleophilic site)를 공격하여 알킬화(alklation)을 일으킨다. 이러한 알킬화 결과로 DNA 절단, 염색체 이상, 돌연변이 등을 야기시키는 것으로 알려져 있다. 표고버섯의 에탄올 추출물의 MNNG에 대한 변이원성 억제결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 사용된 MNNG(0.4 ㎍/플레이트)의 경우 S. typhimurium TA100 균주에서 농도 증가에 따라 농도 의존적으로 높은 변이원성 억제효과를 나타내었다. 시료농도 200 ㎍/플레이트에서 83.8%의 높은 억제효과를 나타내었다. 한편, 4NQO(0.15 ㎍/플레이트)에 대한 실험 결과 S. typhimurium TA98과 S. typhimurium TA100 균주에서 각각 시료농도 200 ㎍/플레이트에서 73.3% 및 78.2%의 억제율을 보였다(도 2). 또한, 다시마 에탄올 추출물의 MNNG에 대한 변이원성 실험 결과 S. typhimurium TA100 균주에서 시료농도 50, 100, 150 및 200 ㎍/플레이트에서 각각 14.1, 42.6, 61.7 및 77.6%의 억제효과를 나타내었다(도 3). 또한, 4NQO에 대한 실험결과 S. typhimurium TA98과 S. typhimurium TA100 균주에서 각각 농도증가에 따라 농도 의존적으로 변이원성 억제효과가 나타남을 확인 할 수 있었다(도. 4). 이와 같이 표고버섯 및 다시마 에탄올 추출물은 시료 증가에 따라 S. typhimurium TA98과 TA100 균주 모두에서 각 변이원에 대한 돌연변이억제효과가 증가하였다.

< 1-3 > 시험관내( in vitro ) 항암효과 테스트

본 발명자들은 표고버섯과 다시마 분말의 에탄올 추출물의 시험관내 항암 효과를 SRB 분석을 통하여 테스트하였다.

SRB 분석(sulforhodamine B assay)은 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 방법이다. 구체적으로, 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum)과 각각의 암세포들 인간 폐암세포(A549), 인간 유방암세포(MCF-7), 인간 간암세포(Hep3B), 인간 자궁암세포(HeLa), 인간 위암세포(AGS) 및 인간 신장 정상세포 (293)(모두 한국세포은행으로부터 구입)을 함유하는 RPMI 1640이나 DMEM 배지를 100 ℓ씩 각 웰에 첨가하여 하루동안 배양(37℃, 5% CO₂)시킨 후, PBS에 녹인 추출물들을 각각 0.25, 0.5, 0.75 및 1 ㎎/㎖씩 첨가하여 다시 48시간 배양시켰다. 그 후, 상등액을 흡입기(aspirator)로 조심스럽게 제거하고, 4℃의 차가운 10% TCA 용액을 50 ℓ씩 첨가하여 세포들을 웰 바닥에 고정시켰다. 한시간 동안 4℃에서 배양시킨 후, TCA와 배지들을 제거하기 위하여 증류수로 다섯번 정도 세척하였다. 플레이트를 건조시키고 여기에 1% 아세트산에 용해시킨 0.4% SRB를 첨가해서 30분 동안 염색시킨 후, 결합되지 않은 SRB 염색액을 제거하기 위해 1% 아세트산 용액으로 네번 세척하였다. 건조기에서 건조된 플레이트를 10 mM 트리스(Tris) 완충액 100 ㎕로 염색제를 충분히 녹인 후, 540 ㎚에서 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표고버섯 및 다시마 에탄올 추출물은 여러 종류의 인간 암세포에 대한 성장 억제 효과를 나타내었다. 구체적으로, 표고버섯 에탄올 추출물의 경우 시료 1 ㎎/㎖ 첨가시에 AGS 세포에서 88.7%의 가장 높은 암세포 억제 효과를 나타내었고, A549, MCF-7, Hep3B 및 HeLa 세포에서 각각 81.0, 62.9, 44.7 및 78.8%의 억제 효과를 나타내었다. 암세포에 대한 높은 활성과 비교하여 인간 정상 신장 세포 293에 대한 실험결과 시료농도 1 ㎎/㎖의 첨가시 40% 이하의 낮은 생육 억제율을 나타내었다(도 5).

한편, 다시마 에탄올 추출물의 경우, A549 세포에 시료 0.25, 0.5, 0.75 및 1 ㎎/㎖ 첨가시 각각 18.5, 38.2, 63.9 및 79.3%의 억제효과를 나타내었으며, MCF-7, Hep3B, HeLa 및 AGS 세포에서 각각 43.5, 55.2, 58.6 및 70.2%의 성장 억제효과를 나타내었다. 인간 정상 신장 세포 293에 대한 실험결과 1 ㎎/㎖의 첨가 시 30% 이하의 낮은 억제율을 나타낸 것으로 보아 암세포에 대한 높은 억제효과에 비해 정상세포에 대해서 비교적 낮은 독성효과를 가짐을 알 수 있었다(도 6).

< 시험예 2 > 표고버섯 분말 첨가 조미료 추출물 및 분획물

< 2-1 > 항산화성 테스트

항산화성 테스트 방법은 시험예 1-1과 동일하다. 다만, 본 시험예에서는 표고버섯 분말이 첨가된 조미료 추출물 및 분획물에 대한 항산화성을 테스트하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, DPPH 라디칼은 반응계에서 전자를 공여 받으면 고유의 청남색이 엷어지는 특성이 있으므로, 색차를 비색정량하면 시료가 가지는 전자공여능력을 측정할 수 있다. 비록 화학적으로 유도되는 라디칼이지만 리포옥시게나제(lipoxygenase)로 촉매되는 지질 산화반응계에서 측정된 항산화 활성과도 잘 부합되는 간편하고 신뢰성이 높은 항산화 활성 측정 방법으로 이용되고 있다(8메밀 발아중 물리화학적 특성과 무기질 함량의 변화. 손흥수, 이명헌, 오성기, 권태봉, 최원균. 한국식품영양학회지, 1994년 제7권 제4호 267~273.). 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 항산화 활성을 측정한 결과, 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물의 경우 각각 155 및 158.5 ㎍을 나타내어 278.5 ㎍의 RC₅₀ 값을 나타낸 에탄올 추출물보다 높은 항산화 값을 나타내었다(표 4).

시험예 1-1에서 표고버섯 및 다시마 분말 에탄올 추출물의 수소전자공여능 RC₅₀(Restriction concent ratio)은 각각 165.4 ㎍ 및 176.8 ㎍을 나타내었으며, 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물의 경우 각각 155 및 158.5 ㎍을 나타내어 278.5 ㎍의 RC₅₀ 값을 나타낸 에탄올 추출물보다 높은 항산화 값을 나타내었다.

표고버섯(Lentinus edodes)을 사용한 천연 조미료의 70% 에탄올 추출물 및 각 분획의 DPPH 라디칼 스캐빈징(scavenging) 활성

시료	RC₅₀ ¹⁾ (㎍)
70% 에탄올 추출물	278.5
헥산 분획	263.9
클로로포름 분획	270.9
에틸아세테이트 분획	155.0
부탄올 분획	158.5
수용성 분획	358.9
α-토코페롤	14.7
BHA(Butylated hydroxyanisole)	12.4

¹⁾30분 후 DPPH 50% 감소에 필요한 양

< 2-2 > 돌연변이원성 및 항돌연변이원성 테스트

< 2-2-1 > 에임스 테스트(Ames test)를 이용한 돌연변이원성 테스트

돌연변이원성 테스트 방법은 시험예 1-2-1과 동일하다. S. typhimurium TA98과 TA100을 이용한 에임스 테스트를 행한 결과, 음성 대조군의 복귀 돌연변이 콜로니 수는 TA98이 26 ± 4, TA100은 172 ± 6이었다. 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물을 50, 100, 150 및 200 ㎍/플레이트로 시료의 농도를 증가시켜 테스트 해본 결과 농도 증가에 따른 his⁺ 복귀돌연변이 콜로니수는 증감이 없었다. 이것은 본 테스트에 사용한 표고버섯을 이용한 천연 조미료의 에탄올 추출물 자체는 돌연변이원성이 없음이 확인되었다(표 5).

시험예 1-2-1에서 표고버섯과 다시마 에탄올 추출물을 50, 100, 150 및 200 ㎍/플레이트의 여러 농도를 첨가하여 시험한 결과 콜로니 수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 큰 변화를 나타내지 않았으므로, 표고버섯과 다시마 에탄올 추출물은 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 확인되었다. 또한, 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물도 시료 증가에 따른 his⁺ 복귀돌연변이 콜로니 수의 증감이 없는 것으로 보아 역시 돌연변이원성이 없는 것으로 확인되었다.

살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) TA98 및 TA100에 표고버섯(Lentinus edodes)을 사용한 천연 조미료의 70% 에탄올 추출물의 돌연변이원성

투여량(㎍/플레이트)	His⁺복귀돌연변이/플레이트 ¹⁾
투여량(㎍/플레이트)	TA98	TA100
자연발생	26 ± 4	172 ± 6
50	26 ± 5	141 ± 2
100	25 ± 2	142 ± 5
150	21 ± 4	158 ± 9
200	20 ± 1	138 ± 3

¹⁾각 수치는 3 플레이트의 평균 ± SD(표준편차)를 나타낸다

< 2-2-2 > 에임스 테스트(Ames test)를 이용한 항돌연변이원성 테스트

항돌연변이원성 테스트 방법은 시험예 1-2-2와 동일하다. 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물과 분획물의 항돌연변이원성을 검토하기 위하여, 먼저 세포내의 DNA에 직접적으로 손상을 주어 돌연변이를 유발하는 직접돌연변이물질인 MNNG와 4NQO를 이용하여 항돌연변이원성 효과를 조사하였다. MNNG(0.4 ㎍/플레이트)의 경우 S. typhimurium TA100 균주에 대한 테스트 결과 도 7에서와 같이 시료농도 200 ㎍/플레이트에서 핵산, 에틸아세테이트 분획물 및 에탄올 추출물에서 76~84%의 강한 억제율을 나타내었다. 그리고, 클로로포름과 물 분획물에서도 각각 69% 및 65%의 비교적 높은 돌연변이 저해 효과를 나타내었으며, 시료 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 변이원성 역제 효과를 나타내었다. 한편, 직접변이원인 4NQO(0.15 ㎍/플레이트)에 대한 억제 효과를 측정한 결과 농도 의존적으로 억제활성을 나타내었으며, S. typhimurium TA98 균주의 경우 시료농도 50, 100, 150 및 200 ㎍/플레이트e에서 에틸아세테이트 분획물이 각각 29.1, 42.0, 61.7 및 81.8%로 다른 분획물에 비하여 높은 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 같은 농도에서 물 분획물의 경우 59.1% 가장 낮은 억제 효과를 보였으나, 야생버섯 중의 하나인 그물버섯 및 밀버섯 메탄올 추출물보다 높은 억제효과를 나타내었다. S. typhimurium TA100 균주의 경우 시료 최고 농도인 200 ㎍/플레이트에서 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물에서 각각 84% 그리고 82.1%의 억제효과를 나타내서 61.6% 및 66.8%의 억제율을 보인 클로로포름 및 물 분획물보다 높은 억제효과를 나타내었다(도 8).

시험예 1-2-2에서 표고버섯과 다시마 에탄올 추출물은 직접변이원 물질로 알려진 MNNG와 4NQO를 사용하여 항돌연변이원성을 실험한 결과 시료농도 200 ㎍/플레이트에 대하여 S. typhimurium TA98과 S. typhimurium TA100 균주에서 모두 70% 이상의 억제율을 보였다. 또한, 표고버섯을 첨가한 천연 조미료 추출물 및 분획물에서도 시료 농도 증가에 따라 농도 의존적으로 높은 변이원성을 보였는데 특히 핵산, 에틸아세테이트 및 부탄올층에서 S. typhimurium TA100 균주에 대해서 84.4%, 84% 및 82.1%의 높은 억제율을 나타내었다.

< 2-3 > 시험관내( in vitro ) 항암효과 테스트

시험관내 항암효과 테스트 방법은 시험예 1-3과 동일하다. 돌연변이 억제 활성을 가진 물질들 중에는 종종 암세포의 성장을 저해하는 효과가 존재하는 것은 여러 연구에서 보고되고 있다. 따라서, 본 테스트에서는 각종 암세포에 대한 세포독성을 규명하기 위해 암세포로 A549, MCF-7, Hep3B, HeLa 및 AGS를 이용하여 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물 및 분획물들에 대하여 SRB 분석을 행하였다. 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 에탄올 추출물 및 분획물의 인간 암세포 성장 억제 효과를 검토한 결과를 도 6에 나타내었다. 자궁암 세포인 HeLa에 대해서 추출물 및 분획물의 시료 최고 농도 1 ㎎/㎖의 경우 62∼85%의 높은 암세포 저해활성을 보였으며, 시료농도가 증가할수록 억제 효과 또한 증가하는 경향을 보였다. 인간 간암 세포인 Hep3B에서는 부탄올 분획물에서 시료 최고 농도 1 ㎎/㎖ 첨가시 72.7%로 높은 억제효과를 나타내었으며, 인간 유방암 세포인 MCF-7에서는 핵산, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물에서 각각 83.3, 84.9 및 79.7%의 암세포 성장 억제 효과를 나타내어 51.6%의 억제율을 나타낸 물 분획물보다 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 인간 위암 세포인 AGS의 경우 시료 최고 농도 1 ㎎/㎖에서 핵산과 에틸아세테이트 분획물이 각각 75.8 및 71.5%의 암세포 성장 억제 효과를 나타냈으며, 폐암세포인 A549에서는 시료농도가 증가할수록 세포증식 억제효과를 보였으나, 핵산 분획물 1 ㎎/㎖에서만 69.7%의 저해능을 보였고 나머지 시료에서 56% 이하의 비교적 낮은 저해활성을 보였다. 암세포에 대해서 대부분 높은 활성을 토대로 인간 정상 신장 세포 293에 대한 시료농도에 따른 세포독성 효과를 나타낸 결과 1 ㎎/㎖의 시료를 첨가시 40% 이하의 낮은 생육 억제율을 보였다(도 9). 이는 암세포에 대한 높은 억제효과에 비해 정상세포에 대해서 비교적 낮은 독성효과를 가짐을 나타낸다.

시험예 1-3에서 표고버섯 에탄올 추출물의 경우 시료 1 ㎎/㎖ 첨가 시 AGS, A549, MCF-7, Hep3B 및 HeLa 세포에서 각각 88.7%, 81%, 62.9%, 44.7% 및 78.8%의 암세포 성장 억제효과를 나타내었다. 다시마 에탄올 추출물의 경우 같은 농도에서 70.2%, 79.3%, 43.5%, 55.2% 및 58.6%의 억제효과를 나타내었다. 표고버섯을 첨가한 천연 조미료 에탄올 추출물은 MCF-7 및 HeLa 세포에서 각각 81.3% 및 83.3%의 억제율을 나타내었고 에틸아세테이트 분획물는 84.9% 및 85.1%를 나타내어 다른 암세포주에 비해서 비교적 높은 암세포 성장 억제율을 보였다.

< 2-4 > 사코마(Sarcoma)-180을 이용한 생채내( in vivo ) 고형암 억제효과 테스트

본 발명자들은 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 추출물이 고형암의 성장저해 효과가 있는지를 확인하였다.

본 테스트에 사용된 실험동물은 25g 전후의 체중을 갖는 웅성 Balb/c 마우스를 구입하여 일주일간 적응시켜, 각각의 실험군당 5마리를 사용하였다. 동물사육실 실험조건은 온도 21~26℃, 습도 45~55%로 유지하였으며, 조명은 오전 9시에 자동 점등, 오후 9시에 자동 소등하여 12시간 간격으로 조명을 조절하였다. 사료는 삼양유지사료(주)의 마우스용 배합사료(조단백질 22.1%, 조지방 3.5%, 조섬유 5.0%, 회분 8.0%, 칼슘 0.6%, 인 0.4%)를 사용하며, 물은 증류수를 공급하고 마우스가 사료와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.

본 발명자들은 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 추출물의 생체내 항암 효과를 사코마-180을 이용하여 테스트하였는데, 사코마-180 종양세포는 Balb/c 마우스의 복강 내에 7~10일 간격으로 계대배양하여 보존하면서 사용하였다. 즉, 실험동물의 복강 내에서 7~10일간 배양된 사코마-180 세포를 복수와 함께 취하고 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)와 함께 원심분리(1,200 rpm, 10 min)하여 종양세포를 분리하였다. 분리된 세포를 다시 PBS에 부유시켜 재차 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1.0 × 10⁶ 세포/㎖가 되도록 종양세포 부유액을 만들어 1 ㎖씩 복강주사하여 이식 보존하면서 테스트에 사용하였다. 고형암 성장저지 실험은 브로우드(Brouard) 등의 방법으로 실험하였다. 즉, 각 군당 5마리의 마우스의 왼쪽 서해부에 사코마-180 종양세포 부유액 0.2 ㎖(6.0 × 10⁶ 세포/마우스)씩을 피하 이식하고, 24시간 후부터 20일간 매일 1회씩 시료 용액을 복강으로 투여하였다. 종양세포 이식 26∼30일째 되는 날 치사시켜 생성된 고형암을 적출하고, 그 무게를 적출한 후 대조군의 종양무게와 처리군의 종양무게의 차이에서 대조군 종양무게의 비로 종양 성장 저지 백분율(Tumor growth ratio, I.R. : %)을 계산하였다.

사코마-180 세포를 이용한 고형암 성장저지 억제 효과를 살펴본 결과, 종양세포를 이식한 대조군은 4.70 ± 0.64 g을 나타내었고, 표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료의 부탄올 분획물의 농도를 100 ㎎/㎏으로 처리하였을 경우 고형암의 무게는 2.68 ± 0.46 g으로 대조군과 비교시 유의적인 감소효과를 나타내었다(p<0.05). 또한, 같은 농도에서 에탄올 추출물, 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물 분획물에서의 종양 무게는 각각 3.68, 3.26, 4.05, 2.96 및 4.25 g이었으며, 추출물과 분획물은 농도 의존적으로 고형암 성장 저지효과를 나타내었다(도 10).

인간 암세포에 대한 표고버섯(Lentinus edodes)을 사용한 천연 조미료의 70% 에탄올 추출물 및 각 분획물의 성장억제 효과

표고버섯(L. edodes)	투여량 (㎎/㎖)	성장 억제(%)
표고버섯(L. edodes)	투여량 (㎎/㎖)	A549	MCF-7	Hep3B	HeLa	AGS
70% 에탄올	0.25	3.0± 1.8¹⁾	4.3± 3.4	9.1± 3.8	27.2± 6.7	4.6± 2.3
	0.50	12.0± 2.3	21.6± 2.9	19.4± 1.8	51.4± 4.7	10.4± 2.9
	0.75	23.7± 3.7	50.7± 3.1	50.3± 1.9	68.7± 2.7	38.4± 1.6
	1.00	36.7± 1.3	81.3± 1.2	61.0± 4.1	83.3± 0.4	58.9± 3.9
헥산	0.25	19.7± 2.8	21.9± 3.1	9.7± 0.5	18.4± 2.7	36.5± 3.2
	0.50	33.0± 2.6	57.2± 0.5	29.4± 1.8	39.7± 1.5	55.0± 3.8
	0.75	56.2± 2.4	72.4± 5.1	57.3± 1.4	68.5± 2.0	56.2± 2.4
	1.00	69.7± 2.8	83.2± 2.9	66.5± 2.5	79.8± 1.6	75.8± 0.3
클로로포름	0.25	7.1± 2.4	23.2± 2.2	2.5± 3.1	12.8± 2.0	15.3± 1.5
	0.50	17.8± 2.0	43.1± 2.9	13.5± 3.1	21.1± 3.2	35.7± 5.5
	0.75	31.1± 1.8	55.0± 0.3	41.6± 3.1	40.4± 1.5	57.1± 4.8
	1.00	38.9± 1.0	63.5± 0.9	54.1± 3.9	66.7± 2.0	67.6± 1.2
에틸아세테이트	0.25	8.2± 4.3	23.8± 0.4	8.8± 2.6	38.5± 4.4	35.5± 0.8
	0.50	19.9± 2.7	51.8± 2.9	18.2± 1.5	53.0± 3.0	50.5± 2.3
	0.75	41.7± 2.6	71.5± 2.3	41.8± 4.0	77.3± 2.2	59.1± 2.0
	1.00	56.7± 0.3	84.9± 0.7	64.6± 0.6	85.1± 2.4	71.5± 1.2
부탄올	0.25	22.5± 5.0	12.6± 1.0	24.5± 3.4	36.5± 2.6	20.6± 4.3
	0.50	36.7± 1.0	39.0± 0.2	41.1± 1.0	62.3± 2.4	37.6± 3.8
	0.75	41.2± 0.5	63.5± 0.4	67.1± 0.5	75.3± 1.2	54.0± 4.3
	1.00	46.4± 2.3	79.7± 4.1	72.7± 0.8	82.2± 0.3	64.0± 1.7
수용성	0.25	8.6± 4.4	10.6± 0.4	12.7± 3.6	17.4± 4.3	7.2± 2.1
	0.50	19.0± 0.4	30.6± 0.9	34.3± 1.7	36.7± 2.7	14.2± 4.4
	0.75	27.5± 0.9	37.9± 4.1	42.6± 2.9	46.5± 2.8	27.5± 0.9
	1.00	30.9± 3.4	51.6± 0.6	58.4± 2.0	62.3± 3.8	29.0± 1.2

¹⁾수치는 평균 ± SD이다(n=3).

사코마-180 세포를 갖는 Balb/c 마우스의 종양 내에 표고버섯(Lentinus edodes)을 사용한 천연 조미료의 에탄올 추출물 및 각 분획의 항종양 활성

그룹	투여량 ㎎/㎏ 체중	종양 무게 (Mean ± S.D.)¹⁾	성장저해율(%)
대조군	-	4.70± 0.64^a
에탄올 추출물	50	3.71± 0.42^c	20.97± 8.96
헥산 분획	50	3.83± 0.29^bc	18.38± 6.31
클로로포름 분획	50	4.37± 0.34^a	6.89± 7.40
에틸아세테이트 분획	50	3.16± 0.34^d	32.59± 7.38
부탄올 분획	50	2.82± 0.25^d	39.91± 5.41
수용성 분획	50	4.30± 0.29^ab	8.46± 6.22
에탄올 추출물	100	3.68± 0.59^bc	21.70± 12.76
헥산 분획	100	3.26± 0.47^cd	30.46± 10.16
클로로포름 분획	100	4.05± 0.35^ab	13.70± 7.55
에틸아세테이트 분획	100	2.96± 0.82^cd	36.85± 17.56
부탄올 분획	100	2.68± 0.46^d	42.80± 9.88
수용성 분획	100	4.25± 0.36^ab	9.53± 7.73

모든 그룹에게 상업적 먹이를 제공하였다. 대조군에는 PBS(phosphate buffered solution)를 주입하였고, 나머지 그룹에게는 이식 이후에 24시간 마다 20일 동안 하루에 한번씩 각 식사때마다 에탄올 추출물(50 ㎎/㎏/day, 100 ㎎/㎏/day)을 주입하였다.

¹⁾ 수치는 6마리의 마우스의 평균 ± SD이다.

^a-d)다른 문자로 표시된 평균은 던칸 테스트(Duncan's multiple range test)에 의해 유효한 차이남을 나타낸다(p<0.05).

표고버섯 분말을 첨가한 천연 조미료 부탄올 분획물의 농도를 100 ㎎/㎏으로 처리하였을 경우 고형암의 무게는 2.68 ± 0.46 g으로 대조군과 비교시 유의적인 감소효과를 보였으며 42.8%의 고형암 성장 억제율을 나타내었다.

본 발명자들은 표고버섯이 함유한 다당체 성분인 β-1,3 글루칸이 직접 종양세포에 작용하여 항암 효과를 나타내는 것보다는 간접적으로 체내 면역체계의 기능을 활성화시켜 간접적으로 항암효과를 나타내며 그 방어기전으로는 체내의 보체계(complement system) 활성화 및 대식세포(macrophage)의 활성화, 인터페론 생성의 촉진 등과 같은 면역 활성기전에 기인하여 항암효과를 나타낸다고 판단하고 있다. 또한, 다시마는 갈조류의 대표적인 종으로 다양한 무기질, 비타민 및 섬유질 성분을 함유하고 있는 알칼리성 식품이다. 따라서, 본 발명의 상기 결과는 항암효과가 뛰어난 표고버섯과 무기질, 비타민, 섬유질을 다량 함유하고 있는 다시마를 이용한 건강기능성 식품으로서 인류의 건강 증진에 큰 효과가 있을 것이라 기대된다. 즉, 본 발명자들은 상기에서 천연조미료의 표고버섯 및 다시마의 함유량을 20% 및 2.2%로서 표고버섯 및 다시마 에탄올 추출물과 같은 양을 테스트하였을 때, 비슷한 항산화, 항돌연변이, 항암활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들이 제조한 천연 조미료는 표고버섯 및 다시마의 유효성분들의 상승작용에 의해 항산화, 항돌연변이, 항암활성을 보이는 것이라고 사료된다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물 및 천연 조미료는 뛰어난 항산화, 항돌연변이, 항암활성을 보이므로 다양한 종류의 식품, 특히 천연 조미료의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

표고버섯 분말 20 중량%;

다시마 분말 2.2 중량%; 및,

지미베이스 77.8 중량%;로 구성되는데,

이때, 상기 지미베이스는 정제염 53.38 중량%, 야채베이스 25.71 중량% 및 이스트엑기스 분말 20.91 중량%로 조성되고,

이때, 상기 야채베이스는 양파 35.71 중량%, 마늘 21.43 중량%, 말토덱스트린 15.72 중량% 및 정제수 27.14 중량%로 구성되는 것을 특징으로 하는 생체 산화 예방용 식품 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 분말은,

에탄올, 부탄올, 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물로 이루어진 군중에서 선택된 것을 추출용매로 사용하여 추출한 후, 추출용매를 휘발시켜 제조한 분말인 것을 특징으로 하는 생체 산화 예방용 식품 조성물.
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