KR20040081122A - 에피머 비타민 ｄ 유사체의 선택적 효소 에스테르화 반응및 가용매분해 반응과 상기 에피머의 분리 방법 - Google Patents

에피머 비타민 ｄ 유사체의 선택적 효소 에스테르화 반응및 가용매분해 반응과 상기 에피머의 분리 방법 Download PDF

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Abstract

유리 또는 에스테르화된 OH 기가 있는 C-24에서 입체형성 중심을 갖는 비타민 D 유사체의 에피머를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하거나 또는 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법이 제공된다. 이 방법은, 예컨대 비타민 D 유사체의 혼합된 에피머 분리에 사용될 수 있다.

Description

에피머 비타민 Ｄ 유사체의 선택적 효소 에스테르화 반응 및 가용매분해 반응과 상기 에피머의 분리 방법{SELECTIVE ENZYMATIC ESTERIFICATION AND SOLVOLYSIS OF EPIMERIC VITAMIN D ANALOG AND SEPARATION OF THE EPIMERS}
비타민 D3의 호르몬 활성 대사물질 형태인 1α,25-디히드록시비타민 D3(1,25-(OH)2D3)가 발견된 이래로, 저 칼슘혈증 효과를 갖는 활성 화합물을 얻기 위해서 여러 유사체가 제조된 바 있다. 비타민 D 측쇄의 변형에 많은 노력을 기울여 왔다. 1α 히드록실기는 호르몬 활성에 필수이지만, C-25 히드록실기는 C-24 히드록실기로 치환할 수 있다. 예컨대, MC 903 (화학식 I) 또는 1,24-(OH)2D3(화학식II) 참조.
비타민 D 유사체의 제조시, 생물학적 활성의 완전한 발현을 위해서는 C-24에서의 히드록실기에 대한 특정 입체화학이 필요하다. 현행 방법론 하에서는, 3가지 방법중 하나의 방법으로 필요한 입체화학을 도입한다:
(i) 크로마토그래피를 통한 C-24 히드록실 에피머의 부분입제이성질체 혼합물의 분리(예컨대, Calverley, Tetrahedron 4609-4619, 1987 참조);
(ii) 상응하는 C-24 케톤의 입체선택적 환원(예컨대, 미국 특허 제6262283호 참조), 또는
(iii) 광학활성(enantiopure) 히드록실 보유 측쇄의 비타민 D 골격에의 부착(예컨대, Calverley, Synlett 157-159, 1990 참조).
입체선택적 합성은 다단계로 실시되고 비용이 높기 때문에 정률 증가를 위해 바람직하지 않은 공정이다. 에피머 혼합물의 크로마토그래피 분리가 가장 널리 실시되고 있다. 크로마토그래피 분리는, 2개의 C-24 히드록실 에피머의 흡착제에 대한 친화도가 크게 다르지 않고, 따라서 하나의 크로마토그래피 단계로 효과적으로 분리하기에는 체류 시간이 너무 비슷하다는 점 때문에 어렵다. 본 발명은 크로마토그래피 분리의 효능을 크게 개선시키는 수단을 제공한다.
본 발명은 비타민 D 유사체의 C-24에서의 에피머 및 이의 에스테르를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법 및 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 선택적 효소 에스테르화 단계 또는 선택적 효소 가용매분해 단계를 포함하는 비타민 D 유사체의 혼합 에피머를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2002년 1월 10일에 출원된 미국 가명세서 출원 60/348,082호와 2002년 1월 18일에 출원된 60/349,977호를 우선권으로 주장한다.
발명의 개요
일 측면에서, 본 발명은 유기 용매, 특히 헥산 또는 디이소프로필 에테르 중 C-24 위치에 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 C-24 에피머와 에스테르화제, 구체적으로 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 비닐 아세테이트 또는 비닐 부티레이트의 용액을 제공하는 단계, 및 상기 용액을 리파제, 특히 알칼리제너스 종(Alcaligenes sp.) 또는 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는 입체형성(stereogenic) C-24 위치에 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 혼합물 중 하나의 에피머의 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법에 관한 것으로서, 특히 상기 혼합된 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물이다.
상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴기이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유기 용매(예, 헥산) 중 혼합된 C-24 에피머와 에스테르화제(예, 아세틸 클로라이드 또는 비닐 아세테이트)의 용액을 제공하는 단계, 및 상기 용액을 리파제, 특히 알칼리제너스 종 또는 슈도모나스 종 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는, [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물을 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법에 관한 것으로서, 특히 선택적으로 에스테르화된 C-24 OH 에피머는 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유기 용매(예, 헥산) 중 혼합된 C-24 에피머와 에스테르화제(예, 아세틸 클로라이드 또는 비닐 아세테이트)의 용액을 제공하는 단계, 및 상기 용액을 리파제, 특히 알칼리제너스 종 또는 슈도모나스 종 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는, [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물을 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법에 관한 것으로서, 특히 선택적으로 에스테르화된 C-24 OH 에피머는 [1α,3β,5E,7Z,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 헥산 및 디이소프로필 에테르로부터 선택된 유기 용매 중 C-24 위치에 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 C-24 에피머와, 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 비닐 아세테이트 및 비닐 부티레이트로부터 선택된 에스테르화제의 용액을 제공하는 단계, 및 상기 용액을 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제로부터 선택된 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 입체형성 C-24 위치에 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 혼합물 중 하나의 에피머의 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법에 관한 것으로서, 상기 혼합된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물이다.
상기 식에서, R1및 R2는 수소 또는 t-부틸디메틸실록시이고, R3은 시클로프로필 또는 이소프로필 기이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 C-24 위치에 히드록실기를 갖고 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 비타민 D 유사체의 C-24 히드록실기를 효소에 의해 에스테르화하는 방법에 관한 것으로서, 탄소 원자 수가 최대 12개인 직쇄 또는 분지쇄 알칸 또는 디알킬 에테르인 유기 용매 중 C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체와, 아실 할라이드, 산 무수물 및 C2-6의 저급 알킬 카르복실산의 비닐 에스테르로 구성된 군에서 선택된 에스테르화제의 용액을 제공하는 단계; 및 상기 용액을 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제로부터 선택된 리파제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 리파제는 유리 상태이거나 고정되어 있을 수 있다.
상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유기 용매, 특히 헥산 또는 디이소프로필 에테르 중 C-24에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합되고 에스테르화된 C-24 에피머와 가용매분해제, 특히 물 또는 저급 알킬 알콜의 용액을 제공하는 단계, 및 상기 용액을 리파제, 특히 알칼리제너스 종 리파제 또는 슈도모나스 종 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는, C-24 입체형성 위치에서 에스테르화된 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에스테르화된 C-24 에피머의 혼합물 중 하나의 에피머의 에스테르화된 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법에 관한 것으로서, 특히 혼합된 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 에스테르화된 C-24 에피머의 혼합물이다. 이 리파제를 고정할 수 있으나, 반드시 그렇게 해야 하는 것은 아니다.
상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
또 다른 구체예에서, [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24 에스테르의 에피머 혼합물의 혼합된 C-24 에피머를, 특히 물 또는 저급 알킬 알콜을 이용하여 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법에 관한 것으로서, 특히 선택적으로 가용매분해된 에스테르화된 C-24 OH 에피머는 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 에스테르이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24 에스테르의 에피머 혼합물의 혼합된 C-24 에피머를, 특히 물 또는 저급 알킬 알콜을 이용하여 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법에 관한 것으로서, 특히 선택적으로 가용매분해된 에스테르화된 C-24 OH 에피머는 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 에스테르이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 24번 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체를 24번 위치에서 효소에 의해 선택적으로 에스테르화하는 단계를 포함하는 부분입체이성질체적으로 순수한 비타민 D 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 C-24 입체형성 중심에서 에스테르화된 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머의 혼합물 중 하나의 에피머의 C-24 에스테르를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 단계를 포함하는 부분입체이성질체적으로 순수한 비타민 D 유사체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 선택적 효소 에스테르화 단계 및 선택적 효소 가용매분해 단계로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법에 의해 C-24 입체형성 중심에서 OH 기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 에피머를 크로마토그래피에 의해 분리하여, 칼시포트리엔, 즉 (5Z,7E,22E,24S)-24-시클로프로필-9,10-세코콜라-5,7,10(19),22-테트라엔-1α-3β-24-트리올을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 선택적 효소 가용매분해 단계가 선택되는 경우에는 양 에피머의 C-24에서의 OH기가 먼저 에스테르화되고, 선택적 에스테르화 단계가 선택되는 경우에는 비닐 아세테이트가 에스테르화제이며, 선택적 에스테르화 단계 또는 선택적 가용매분해 단계는 고정되거나 유리된 알칼리제너스 종 리파제 또는 슈도모나스 종 리파제로 실시한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같이 하나의 에피머의 C-24에서의 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 단계, 및 에스테르화되지 않은 에피머로부터 에스테르화된 에피머를 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계를 포함하는, 24번 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 에피머를 분리하는 방법에 관한 것으로서, C-24는 에피머 중심이고, 특히 혼합된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물이다.
상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
이 방법은, C-24 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물 또는 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 경우에 특히 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 양 에피머의 C-24 히드록실기를 에스테르화하는 단계, 에피머 중 하나로 형성된 C-24 에스테르를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 단계, 및 선택적으로 가용매분해된 에피머를 가용매분해되지 않은 에피머로부터 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계를 포함하는, C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 C-24 에피머를 분리하는 방법에 관한 것으로서, C-24가 에피머 중심이다. 이 방법은, 혼합된 C-24 에피머가 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물인 경우에 특히 적용가능하다.
상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
본 발명의 상세한 설명
본 명세서에서 사용된 비타민 D 유사체란, A 고리의 고리밖 이중 결합이 상이한 위치에 있고/또는 17번 탄소에서 D 고리에 결합된 측쇄의 구조가 다른 화합물, 특히 측쇄가 C-24에서의 시클로프로필 또는 이소프로필 기를 갖는 변형체(유사체)를 비롯하여 비타민 D3 및 비타민 D2 기본 구조 및 이의 변형을 갖는 임의의 화합물을 의미한다.
비타민 D는 스테로이드류이기 때문에, 가능한 범위로 모 화합물, 즉 콜레스테롤의 고리 명칭 및 번호매김 체계를 유지한다. 본 발명의 대상인 대표적인 비타민 D 유도체는 하기에 예시되어 있다(화학식 I 및 II)
에피머는, 본 발명의 비타민 D 유사체와 같이, 복수의 입체형성 중심을 갖는 분자 내 복수의 4면체 입체형성 중심 중 오직 하나에서만 반대 구조(R 또는 S)를 갖는 부분입체이성질체로서 알려져 있다. 본 발명의 실시에 유용한 비타민 D 유사체의 에피머는 C-24에서의 구조에 대하여 부분입체이성질체이다.
예를 들어, 거울상이성질체쌍의 에피머 중심으로서 C-24를 지정한 것은, 쌍의 다른 입체형성 중심에서의 구조는 동일하다는 것을 내포하는 것이다.
C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 및 에피머 혼합물과 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 언급한 것이 없으면, "선택적 효소 에스테르화" 및 "선택적으로 효소에 의해 에스테르화된"이란 하나의 에피머의 24번 위치에서의 히드록실기가 다른 에피머의 24번 위치에서의 히드록실기의 에스테르화를 실질적으로 배제시키는 효소의 도움 하에 에스테르화제로 에스테르화된다는 것을 의미한다. 실질적인 배제란, 에스테르화된 모둔 분자를 기준으로 하나의 에피머 약 80 몰% 이상과 다른 에피머 약 20 몰% 이하가 에스테르화된다는 것을 의미한다(즉, 부분입체이성질체 비율 80:20). 부분입체이성질체의 비율은 바람직하게는 90:10 이상, 가장 바람직하게는 95:5 이상이다. 당업자는 목적하는 부분입체이성질체 비율을 실현하기 위해 하기 논의되는 이용가능한 방법들을 최적화할 수 있을 것이다.
C-24 위치에서 에스테르기(예, 아세테이트)를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 및 에피머 혼합물과 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 언급한 것이 없으면, "선택적 효소 가용매분해" 및 "선택적으로 효소에 의해 가용매분해된"이란 하나의 에피머의 24번 위치에서의 에스테르기가 다른 에피머의 24번 위치에서의 에스테르기의 가용매분해를 실질적으로 배제시키면서 가용매분해된다는 것을 의미한다. 실질적인 배제란, 가용매분해된 모둔 분자를 기준으로 하나의 에피머 약 80 몰% 이상과 다른 에피머 약 20 몰% 이하가 가용매분해된다는 것을 의미한다(즉, 부분입체이성질체 비율 80:20). 부분입체이성질체의 비율은 바람직하게는 90:10 이상, 가장 바람직하게는 95:5 이상이다. 당업자는 목적하는 부분입체이성질체 비율을 실현하기 위해 하기 논의되는 이용가능한 방법들을 최적화할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된 저급 알킬은, 탄소 원자 수가 1∼10개인 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 의미하며, 이러한 저급 알킬기는 환형 또는 비환형일 수 있다. 이소프로필기 및 시클로프로필기는 저급 알킬기의 예이다.
본 명세서에서 사용된 아릴은 6∼12개의 탄소 원자를 갖는 치환된 또는 비치환된 방향족기이다. 페닐기는 아릴기의 일례이다.
본 발명에서 가용매분해 반응은 가용매분해제, 바람직하게는 극성 양성자성 용매로 실시한다. 바람직한 극성 양성자성 용매는 물 및 저급 지방족 알콜이다.
"효소" 및 "효소에 의한"이란 효소에 의해 각 반응을 실시한다는 것을 의미한다. 바람직한 효소는 리파제이다. 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제가 본 발명의 실시에 사용하기 위한 바람직한 리파제이다. 효소를 고정(부동화)하거나 유리시킬 수 있다. 효소 부동화 절차는 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 히드록실기의 에스테르화는 아실화와 같은 의미이며, 알콜성 히드록실기의 수소를 아실기(예, RC(O)-)로 치환하는 당업계에 공지된 임의의 반응을 의미한다.
본 발명의 분리 방법은 선택적 효소 에스테르화 단계 또는 선택적 효소 가용매분해 단계, 그리고 바람직한 구체예에서 크로마토그래피 단계를 이용한다. 선택적 효소 에스테르화 단계는, C-24 위치에서 이소프로필기(II) 또는 시클로프로필기(I)를 갖는 화합물이 본 방법의 대상 화합물인 경우에 바람직하다.
본 발명자들은 C-24의 에피머 중심에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 C-24 에피머의 혼합물을 효소, 바람직하게는 리파제의 존재 하에 24번 위치에서 선택적으로 에스테르화하여, 하나의 에피머의 C-24 에스테르와 에스테르화되지 않은 에피머의 본래의 C-24 알콜의 혼합물을 생성할 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 하기 반응식 I에 예시되어 있다. 에피머가 선택적으로 에스테르화되는 것이 본발명에 중요한 것은 아니다.
본 발명자들은 효소, 바람직하게는 리파제의 존재 하에 비타민 D 유사체의 C-24 에스테르의 에피머 혼합물을 선택적으로 가용매분해시켜 하나의 에피머의 C-24 에스테르와 다른 C-24 알콜 에피머의 혼합물을 생성할 수 있다는 것도 발견하였다. 이것은 하기 반응식 II에 예시되어 있다. 반응식 II에서는 아세틸 클로라이드를 이용하여 예시하였으나, 다른 에스테르화제도 동등하게 유용하다. 에피머를 선택적으로 가용매분해시키는 것이 본 발명의 실시에 중요한 것은 아니다. 본 발명자들은 비타민 D 유사체의 A 고리 상의 히드록실기를 동시에 에스테르화시키지 않고, 비타민 D 유사체의 C-24 위치에서 에스테르를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 예컨대 비타민 D 유도체의 A 고리 상에 OH기를 보호하지 않은 채 본 발명의 방법을 실시할 수 있다.
본 발명의 실시에 필수적인 것은 아니지만, 비타민 D 유사체의 A 고리 상의 히드록실기를 보호하는 것이 편리할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이 히드록실기를 보호하는 임의의 방법을 필요에 따라 사용할 수 있다. t-부틸디메틸실릴기는 본 발명의 실시에 사용할 수 있는 히드록실 보호기의 예이다.
일 구체예에서, 본 발명은 비타민 D 유사체의 선택적 효소 에스테르화 반응을 제공한다. 선택적 효소 에스테르화 반응에서, C-24 OH 에피머의 혼합물로 구성된 비타민 D 유사체(예, 화학식 III 또는 IX) 및 에스테르화(아실화)제(A)를 유기 용매(S1)에 용해시켜 용액을 제공한 다음 효소(E), 바람직하게는 리파제와 접촉시킨다. 적절한 용매(S1)의 예로는 최대 약 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄 알칸, 예컨대 헥산 및 디알킬 에테르(예, 디이소프로필 에테르) 등이 있다. 알킬 및 알케닐 에스테르는 적절한 에스테르화제의 예이다. 비닐 아세테이트는 바람직한 에스테르화제이다. 일정 시간(t) 동안 지정된 온도(T)에서 효소(E)와 용액을 접촉시킨다(예, 교반한다). 효소 활성을 파괴하지 않는 임의의 온도를 사용할 수 있다. 약 20∼약 40℃의 온도가 바람직하다. 당업자는 반응의 진행에 따른 반응 시간을 조정하는 방법을 알 것이다. 에스테르화 반응의 진행 후에, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 실시할 수 있다. 헥산 중 0.5% 아밀 알콜을 이동상으로서 사용한 Merck-Hitachi 모델 6200 A가 사용하기 적절하다. 당업자는 하기 개시된 바와 같은 예비(preparative) 크로마토그래피법으로부터 적절한 분석법을 알 수 있다. 본 발명의 모든 구체예에 동일한 분석법을 사용할 수 있다. 바람직하지 않은 에피머 중 충분량이 에스테르화되어 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상의 C-24 알콜의 부분입체이성질체 과량이 형성되면 에스테르화 반응을 중단한다.
이 지점에서, 당업자들에게 공지된 적절한 방법, 예컨대 2가지만 언급하자면 여과 또는 원심분리로 효소를 분리(제거)한 다음, 여과물을 농축한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 에스테르화된 비타민 D 유사체의 선택적 효소 가용매분해 반응을 제공한다. 선택적 효소 가용매반응의 예로는 선택적 효소 알콜첨가분해반응이 있으며, 이 경우 그 단계를 선택적 효소 에스테르 교환 반응이라고 할 수 있다. C-24 OH 에피머의 혼합물로 구성된 비타민 D 유사체(예, 화학식 III)를, 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대 아실 할라이드, 산 무수물 또는 활성 에스테르(예, 비닐 알카노에이트)를 사용하여 C-24 에피머 에스테르의 혼합물로 에스테르화할 수 있다. 에피머 에스테르의 혼합물을, 가용매분해제, 특히 저급 알킬 알콜(R-OH) 또는 물을 함유하는 유기 용매(S1), 특히 상기한 바와 같은 저급 알칸 또는 디알킬 에테르에 용해시켜 용액을 제공한 다음, 이를 효소(E), 바람직하게는 리파제와 접촉시킨다. 일정 시간(t) 동안 지정된 온도(T)에서 접촉(예, 혼합)시키고, 가용매분해 반응의 진행 후에, HPLC를 실시한다. 선택적 효소 에스테르화에 유용한 용매, 가용매분해제, 온도 및 시간이 이러한 본 발명의 구체예에서도 유용하다. C-24 알콜 에피머의 충분량이 약 80% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 과량으로 필요한 부분입체이성질체로 선택적으로 형성되면 반응을 중단한다. 이 구체예에서, 에스테르 교환 반응에 의해 형성되는 C-24 OH 에피머는 목적하는(추구하는) 에피머가 아닌 것이 바람직하다.
이 지점에서, 여과(또는 원심분리와 같은 다른 적절한 수단)으로 효소를 제거하고 여과물을 농축시킨다.
또 다른 구체예에서, 물로 선택적 효소 가수분해를 실시한다. 이 경우, 그 단계를 선택적 효소 가수분해라고 할 수 있다. C-24 OH 에피머의 혼합물로 구성된 비타민 D 유사체(예, 화학식 III)를 표준 방법(예, 아실 할라이드, 산 무수물 또는활성 에스테르(예, 비닐 알카노에이트) 등을 사용하는 방법)으로 C-24 에피머 에스테르의 혼합물로 에스테르화시킨다. 이러한 에피머 에스테르의 혼합물을, 물 및 리파제와 같은 효소(E)를 포함하는 유기 용매(S1)에 용해시킨다. 그 다음 지정 온도(T)에서 일정 시간(t) 혼합물을 교반하고, 가수분해 반응 후에 HPLC를 실시한다. C-24 알콜 에피머의 충분량이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상의 과량으로 필요한 부분입체이성질체로 선택적으로 형성되면 반응을 중단한다. 이 구체예에서, 형성된 C-24 알콜은 목적하지 않는 에피머의 C-24 알콜이고, 가수분해되지 않은 에스테르는 목적하는 C-24 OH 에피머의 에스테르인 것이 바람직하다.
이 지점에서, 당업자에게 공지된 적절한 방법, 2가지만 예를 들자면 여과 또는 원심분리로 효소를 제거한다. 여과물을 농축한다.
이제는 C-24 알콜과 C-24 에스테르의 극성차가 휠씬 크기 때문에, 선택적으로 에스테르화되거나 또는 선택적으로 가용매분해된 에피머의 용출 시간이 잘 분리되어, 예컨대 후술하는 바와 같은 컬럼 크로마토그래피에 의해 단일 경로로 혼합물을 완전히 분리할 수 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 선택적 효소 에스테르화 및 선택적 효소 가용매분해로부터 선택된 단계를 포함하는, C-24 입체형성 중심에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 C-24 에피머를 분리하는 방법을 제공한다.
별도의 에피머를 얻기 위해서, 선택적 효소 에스테르화 또는 선택적 효소 가용매분해로부터 얻은 농축물을 하기 개시된 바와 같이 크로마토그래피 컬럼에 넣고, 적절한 용매 또는 용매 혼합물(S2)로 용출시켜 반응식 I에 개시된 바와 같이C-24 에스테르(IV)로부터 C-24 알콜(V)을 분리하고, 유사하게 화학식 X로부터 화학식 XI을 분리한다. 반응식 1에서, C-24에서 형성된 에스테르는 아세테이트이지만, 다른 에스테르, 예컨대 부티레이트도 동등하게 유용하다. 또 다른 구체예에서, C-24 알콜을 C-24 에스테르, 바람직하게는 목적하는 에피머의 에스테르로부터 분리한다(반응식 II). 반응식 II에서, 에스테르화제는 아실 클로라이드이지만, 다른 에스테르화제, 예컨대 산 무수물도 동등하게 유용하다.
분리된 에스테르를 당업계에 공지된 방법에 의해 목적하는 알콜로 전환시켜, 에피머 혼합물로부터 입체화학적으로 거의 순수한 C-24 히드록시 에피머를 얻을 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법으로 어떤 에피머도 산출할 수 있기 때문에, 어떤 에피머를 필요로 하는 가는 문제가 되지 않는다.
본 발명의 몇가지 구체예의 실시에 있어서 일부 반응 매개변수에 대해 선택할 수 있는 값의 예가 하기에 요약되어 있다.
매개변수 적절한 유형 또는 조건 설명
기질 화학식 III의 화합물의 혼합물 65:35(화학식 VIII의 화합물과 화학식 V의 화합물의 혼합물) 혼합물 중 화학식 VIII의 화합물 임의량
기질 농도 25∼50%(w/v) 1∼80%
기타 기질 화학식 IX의 화합물
효소 슈도모나스 종 또는 알칼리제너스 종 유래의 리파제 미생물, 포유류 또는 식물 기원의 리파제
효소 형태 미정제 또는 부동화됨
아실화제 비닐 아세테이트/비닐 부티레이트/비닐 프로피오네이트 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 에틸페닐 아세테이트, 2,2,2-트리플루오로에틸 부티레이트
아실화제의 양 비닐 아세테이트 A/III 2∼3 몰비 사용된 용매일 수 있음
용매 헥산 헥산, 디이소프로필 에테르, 톨루엔, 디클로로메탄, 테트라클로로메탄, 아세톤, 메틸 이소부틸 케톤
크로마토그래피를 위한 용매 혼합물 헥산 중 3% 에틸 아세테이트 헥산 중 3∼10% 에틸 아세테이트
반응 시간 2∼3 시간 1∼24 시간
반응 온도 25∼35℃ 10∼60℃
크로마토그래피 단계를 위해, C-24 알콜 및 C-24 에스테르의 혼합물을 분리할 수 있는 용출제 및 정지상(팩킹)의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 그러한 조합은 당업자가 일반적인 실험으로 쉽게 결정할 수 있다. 바람직한 정지상의 예는 처리된 실리카이다.
본 발명의 선택적으로 에스테르화된 또는 선택적으로 가용매분해된 비타민 D유사체의 분리에 유용한 컬럼 크로마토그래피는 약품 화학 분야의 전문가들에게 공지되어 있다. 이 방법에서는 분리하고자 하는 샘플이 들어있는 정지상(예, 처리된 실리카)으로 충전된 컬럼을 사용한다. 그 다음 적절한 용출제로 샘플을 용출시킨다. 용출은 등용매, 즉 소위 말하는 계획 용매일 수 있으며, 용출제의 조성은 규칙적으로(예, 1차 함수로) 또는 불규칙적으로(예, 단계적으로) 변화시킬 수 있다. 크로마토그래피 분야에 공지된 전처리된 실리카 겔은 적절한 정지상이다. 헥산 중 5%(v/v) 에틸 아세테이트와 니트(neat) 에틸 아세테이트를 차례로 이용한 용출은 바람직하게 분리하는 용출 프로그램 중 하나이다. 당업자는 일반적인 방법 개발을 통해 기타 적절한 용출제를 추정할 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 더욱 완전하게 이해될 것이다.
실시예 1
선택적 효소 에스테르화 반응
헥산(60 ㎖) 중 화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 에피머 알콜 혼합물(20 g, 31.2 mmol)과 비닐 아세테이트(5.8 ㎖, 62.4 mmol)의 교반된 용액에 알칼리제너스 종의 리파제 0.56 g을 첨가하였다. 혼합물을 25 ±3℃에서 3 시간 동안 교반한 다음, HPLC 분석으로 에피머 C-24(R)의 아세테이트로의 거의 완전한 전환을 확인하였다. 남아 있는 비에스테르화된 C-24(S) 알콜은 >99% 부분입체이성질체 과량(HPLC에 의해 확인)이었다. 용액을 여과하고 농축 건조하였다. 잔류물을, 전처리된 실리카 겔 상에서 헥산 중 5% 에틸 아세테이트 및 에틸 아세테이트를 차례로 사용하여 크로마토그래피하여 화학식 IV의 C-24 아세테이트 화합물(11 g) 및 화학식 V의 C-24 알콜 화합물(7.4 g)을 얻었다.
생성물의 순도 프로파일은 다음과 같다.
화합물 순도 프로파일 기구 및 방법
IV V VIII Merck-Hitachi
IV 93.1 0.2 - 모델: L-6200A 인텔리전트 펌프. 이동상 : 헥산 중 0.5% 아밀 알콜
V 0.5 89.0 1.6
실시예 2
선택적 효소 에스테르화 반응
알칼리제너스 종 리파제 0.5 g을 공급자가 추천한 공지된 절차에 따라 Eupergit C(독일 롬) 4 g 상에 고정하였다. 화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 에피머 알콜 혼합물(65:35 이성질체 비율) 0.3 g(0.47 mmol), 비닐 아세테이트 0.43 ㎖(4.7 mmol) 및 헥산 3.57 ㎖를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 부동화된 효소 400 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 35℃에서 교반한 다음, HPLC 분석으로 30% 화학식 IV의 화합물, 35% 화학식 VIII의 화합물 및 35% 미처리된 화학식 V의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 3
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 알콜의 혼합된 C-24 에피머 (65:35 이성질체 비율) 100 ㎎(0.16 mmol), 비닐 아세테이트 0.044 ㎖(0.47 mmol) 및 디이소프로필 에테르 1.5 ㎖를 함유하는 병에 알칼리제너스 종 리파제 10 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 65% 화학식 IV의 화합물과 35% 화학식 V의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 4
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 알콜의 혼합된 C-24 에피머 (65:35 이성질체 비율) 100 ㎎(0.16 mmol), 비닐 아세테이트 0.044 ㎖(0.47 mmol) 및 사염화탄소 1.5 ㎖를 함유하는 병에 알칼리제너스 종 리파제 10 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 65% 화학식 IV의 화합물과 35% 화학식 V의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 5
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 알콜의 혼합된 C-24 에피머 (65:35 이성질체 비율) 100 ㎎(0.16 mmol), 비닐 아세테이트 0.140 ㎖(1.6 mmol) 및 헥산 0.36 ㎖를 함유하는 병에 슈도모나스 종 리파제 50 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 65% 화학식 IV의 화합물과 35% 화학식 V의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 6
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 알콜의 혼합된 C-24 에피머 (65:35 이성질체 비율) 5 g(7.8 mmol), 비닐 부티레이트 1.26 ㎖(15.6 mmol) 및 헥산 8.7 ㎖를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 알칼리제너스 종 리파제 250 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 65% C-24 부타노에이트(예, 화학식 IV의 부타노에이트 유사체)와 35% 화학식 V의 화합물의 존재를 확인하였다. 전처리된 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 부틸 에스테르로부터 알콜을 분리하였다.
실시예 7
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 알콜의 C-24 에피머 혼합물 (65:35 이성질체 비율) 300 ㎎(0.468 mmol) 및 에틸 아세테이트 4 ㎖를 함유하는 둥근 바닥 플라스크에 알칼리제너스 종 리파제 50 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 24 시간 동안 35℃에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 45% 화학식 IV의 화합물, 20% 화학식 VIII의 화합물 및 35%의 화학식 V의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 8
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 VIII[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필] 10 g(15.6 mmol), 비닐 아세테이트 2.9 ㎖(31.3 mmol) 및 헥산 17.1 ㎖를 포함하는 둥근 바닥 플라스크에 알칼리제너스 종 리파제 800 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 99% 화학식 IV의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 9
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 IX[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 에피머 알콜 혼합물 (65:35 이성질체 비율) 1 g(1.56 mmol), 비닐 아세테이트 0.44 ㎖(4.68 mmol) 및 헥산 2.9 ㎖를 포함하는 병에 알칼리제너스 종 리파제 250 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 65% 화학식 X의 화합물과 35% 화학식 XI의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 10
선택적 효소 에스테르화 반응
화학식 IX[R1=R2=H, R3=시클로프로필]의 C-24 에피머 알콜 혼합물(50:50 이성질체 비율) 25 ㎎(0.06 mmol), 비닐 아세테이트 0.044 ㎖(0.48 mmol), 아세톤 0.5 ㎖, 디이소프로필 에테르 2 ㎖를 포함하는 병에, 알칼리제너스 종 리파제 50 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 50% 화학식 X의 화합물과 50% 화학식 XI의 화합물의 존재를 확인하였다. C-24 히드록시 위치에서만 아세틸화가 일어남을 H-NMR로 확인하였다.
실시예 11
선택적 가용매분해 반응
피리딘 8 ㎖ 중에 용해된 화학식 III[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 에피머 알콜 혼합물(65:35 이성질체 비율) 2 g(3.2 mmol)을 포함하는 둥근 바닥 플라스크에, 5℃의 온도를 유지하면서 아세트산 무수물(0.4 ㎖, 4.2 mmol)을 적가하였다. 온도를 45℃로 올리고 24 시간 동안 반응시켰다. 혼합물을 10 ㎖ 헥산으로 추출하고, 유기상을 증발시켰다. 혼합물 VI 아세테이트 1.7 g을 얻었다. 혼합물 VI (65:35 이성질체 비율) 100 ㎎(0.15 mmol), 에탄올 0.041 ㎖(0.45 mmol) 및 헥산 2 ㎖를 함유하는 병에, 알칼리제너스 종 리파제 200 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 72 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 65% 화학식 VIII의 화합물과 35% 화학식 VII의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 12
선택적 가용매분해 반응
화학식 VI[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 C-24 에피머 아세테이트 혼합물 (65:35 이성질체 비율) 100 ㎎ (0.15 mmol), H2O 5 ㎖ 및 헥산 1.5 ㎖을 포함하는 병에 알칼리제너스 종 리파제 250 ㎎을 첨가하였다. 혼합물을 260 시간 동안 실온에서 교반한 다음, HPLC 분석하여 32% 화학식 VII의 화합물과 62% 화학식 VIII의 화합물의 존재를 확인하였다.
실시예 13
칼시포트리엔(MC903) 제조
광화학 반응기에 포함되어 있고 5∼8℃로 냉각된 화학식 V[R1=R2=t-부틸디메틸실릴, R3=시클로프로필]의 알콜 (15.3 g, 24 mmol), 9-아세틸안트라센 (1.6 g, 7.2 mmol) 및 톨루엔 중 트리에틸아민(120 ㎖ 중 350 ㎕) 용액에 고압 자외선 램프로부터 나오는 빛을 조사하였다(∼45분). 반응 혼합물을 증발기로 옮겼다. 반응기를 2 ×100 ㎖ 톨루엔으로 세척하고 세척물을 증발기에 첨가하였다. 혼합물을 진공 하에 증발 건조시켜 화학식 XI의 미정제 알콜 15.3 g을 얻었다.
알콜 XI를 THF(450 ㎖) 중에 용해시키고 테트라부틸암모늄 플루오라이드(45 ㎖, 45 mmol)를 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 대기 하에서 2 시간 동안 40℃에서 가열하고 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(1200 ㎖)에 용해시키고 용액을 2% 중탄산나트륨 용액(2 ×150 ㎖) 및 염수(1 ×250 ㎖)로 차례로 세척하였다. 용액을 Na2SO4상에서 건조하고 증발 건조시켰다. 헥산 중 에틸 아세테이트의 혼합물로 용출시킨 실리카 겔(1200 g) 상에서 잔류물을 크로마토그래피하였다. (TLC로 검사하여) 적절한 분획을 수거하고 증발시켜 발포성 물질 7 g을 얻었다.
생성물 3 g을 아세톤 및 메틸 포르메이트로부터 차례로 결정화하여 1.3 g의 칼시포트리엔을 얻었다.

Claims (53)

  1. 입체형성(stereogenic) C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 혼합물 중 하나의 에피머의 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법으로서,
    a) 유기 용매 중 C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 C-24 에피머와 에스테르화제의 용액을 제공하는 단계, 및
    b) 상기 용액을 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 혼합된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머 혼합물인 것인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
  3. 제2항에 있어서, R1및 R2가 모두 H인 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 리파제가 알칼리제너스 종(Alcaligenes sp.) 리파제인 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 리파제가 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) 리파제인 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 리파제가 고정되어 있는 것인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 리파제가 유리되어 있는 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 혼합된 C-24 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 선택적으로 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔인 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 혼합된 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 선택적으로 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔인 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 에스테르화제가 아실 할라이드, 산 무수물 및 C2-6의 저급 알킬 카르복실산의 비닐 에스테르로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 에스테르화제가 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 비닐 아세테이트 및 비닐 부티레이트로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제2항에 있어서, 유기 용매가 최대 C12의 직쇄 또는 분지쇄 알칸, 디알킬 에테르 또는 알킬 카르복실산의 알킬 에스테르인 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 용매가 헥산, 에틸 아세테이트 또는 디이소프로필 에테르인 것인 방법.
  16. 입체형성 C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 혼합물 중 하나의 에피머의 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 방법으로서,
    a) 헥산, 에틸 아세테이트 및 디이소프로필 에테르로부터 선택된 유기 용매 중 C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 C-24 에피머와, 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 비닐 아세테이트 및 비닐 부티레이트로부터 선택된 에스테르화제의 용액을 제공하는 단계, 및
    b) 상기 용액을 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제로부터 선택된 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    혼합된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 수소 또는 t-부틸디메틸실릴이고, R3은 시클로프로필 또는 이소프로필 기이다.
  17. C-24 위치에서 히드록실기를 갖고 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터선택된 비타민 D 유사체의 C-24 히드록실기를 효소에 의해 에스테르화하는 방법으로서,
    a) 최대 C12의 직쇄 또는 분지쇄 알칸, 알킬 카르복실산의 알킬 에스테르 또는 디알킬 에테르인 유기 용매 중 C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체와, 아실 할라이드, 산 무수물 및 C2-6의 저급 알킬 카르복실산의 비닐 에스테르로 구성된 군에서 선택된 에스테르화제의 용액을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 용액을 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제로부터 선택된 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
  18. 제17항에 있어서, 에스테르화제가 아세틸 클로라이드, 아세트산 무수물, 비닐 아세테이트 및 비닐 부티레이트로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 용매가 헥산, 에틸 아세테이트 또는 디이소프로필 에테르인 것인 방법.
  20. C-24 입체형성 위치에서 에스테르화된 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에스테르화된 C-24 에피머의 혼합물 중 하나의 에피머의 에스테르화된 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법으로서,
    a) 유기 용매 중 C-24에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합되고 에스테르화된 C-24 에피머와 가용매분해제의 용액을 제공하는 단계, 및
    b) 용액을 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 혼합되어 있는 에스테르화된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물의 혼합된 에피머의 에스테르인 것인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
  22. 제21항에 있어서, R1및 R2가 모두 H인 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 리파제가 알칼리제너스 종 리파제인 것인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 리파제가 슈도모나스 종 리파제인 것인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 리파제가 고정되어 있는 것인 방법.
  26. 제21항에 있어서, 리파제가 유리되어 있는 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 혼합되어 있는 에스테르화된 C-24 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24 에스테르의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 선택적으로 가용매분해되는 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 에스테르인 것인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 혼합되어 있는 에스테르화된 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24 에스테르의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 선택적으로 가용매분해되는 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔인 것인 방법.
  31. 제21항에 있어서, 가용매분해제가 물인 것인 방법.
  32. 제21항에 있어서, 가용매분해제가 알콜인 것인 방법.
  33. 제21항에 있어서, 용매가 최대 C12의 직쇄 또는 분지쇄 알칸, 알킬 카르복실산의 알킬 에스테르 또는 디알킬 에테르인 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 용매가 헥산, 에틸 아세테이트 또는 디이소프로필 에테르인 것인 방법.
  35. C-24 입체형성 위치에서 에스테르화된 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에스테르화된 C-24 에피머의 혼합물 중 하나의 에피머의 에스테르화된 C-24 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 방법으로서,
    a) 헥산, 디이소프로필 에테르 및 에틸 아세테이트로부터 선택된 유기 용매 중 C-24에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합되어 있는 에스테르화된 C-24 에피머와, 물 또는 알킬 알콜인 가용매분해제의 용액을 제공하는 단계, 및
    b) 상기 용액을 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제로부터 선택된 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    혼합되어 있는 에스테르화된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물의 혼합된 에피머의 에스테르인 것인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 t-부틸실릴기이며, R3은 시클로프로필 또는 이소프로필 기이다.
  36. C-24 입체형성 위치에서 에스테르화된 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의에피머의 에스테르화된 C-24 히드록실기를 효소에 의해 가용매분해시키는 방법으로서,
    a) C-24에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에스테르화된 C-24 에피머와 가용매분해제의 용액을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 용액을 알칼리제너스 종 리파제 및 슈도모나스 종 리파제로부터 선택된 리파제와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    에스테르화된 C-24 에피머는 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물의 C-24 에스테르인 것인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기이며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
  37. 제36항에 있어서, 가용매분해제가 물 또는 저급 알킬 알콜인 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 용매가 헥산, 디이소프로필 에테르 또는 에틸 아세테이트인 것인 방법.
  39. 부분입체이성질체적으로 순수한 비타민 D 유사체를 제조하는 방법에 있어서, 24번 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체를 24번 위치에서 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 부분입체이성질체적으로 순수한 비타민 D 유사체를 제조하는 방법에 있어서, C-24 입체형성 중심에서 에스테르화된 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 에피머 혼합물 중 하나의 에피머의 C-24 에스테르를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 단계를 포함하는 방법.
  41. 칼시포트리엔, 즉 (5Z,7E,22E,24S)-24-시클로프로필-9,10-세코콜라-5,7,10(19),22-테트라엔-1α-3β-24-트리올을 제조하는 방법에 있어서, 선택적 효소 에스테르화 단계 및 선택적 효소 가용매분해 단계로부터 선택된 단계를 포함하는 방법으로 C-24 입체형성 중심에서 OH 기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 에피머를 크로마토그래피에 의해 분리하고,
    선택적 효소 가용매분해 단계가 선택되는 경우에는, 양 에피머의 C-24에서의 OH 기가 먼저 에스테르화되고,
    선택적 에스테르화 단계가 선택되는 경우에는, 비닐 아세테이트가 에스테르화제이며,
    선택적 에스테르화 단계 또는 선택적 가용매분해 단계를 알칼리제너스 종 리파제 또는 슈도모나스 종 리파제로 실시하는 방법.
  42. 24번 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 에피머를 분리하는 방법으로서, C-24가 에피머 중심이고, 상기 방법은
    a) 하나의 에피머의 C-24에서의 히드록실기를 선택적으로 효소에 의해 에스테르화하는 단계, 및
    b) 에스테르화되지 않은 에피머로부터 에스테르화된 에피머를 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 혼합된 C-24 에피머가 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물인 것인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
  44. 제43항에 있어서, 혼합된 C-24 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 선택적으로 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔인 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 혼합된 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 선택적으로 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔인 것인 방법.
  48. C-24 위치에서 히드록실기를 갖는 비타민 D 유사체의 혼합된 C-24 에피머를 분리하는 방법으로서, C-24가 에피머 중심이고, 상기 방법은
    a) 양 에피머의 C-24 히드록실기를 에스테르화하는 단계,
    b) 에피머 중 하나로 형성시킨 C-24 에스테르를 선택적으로 효소에 의해 가용매분해시키는 단계, 및
    c) 선택적으로 가용매분해된 에피머를 가용매분해되지 않은 에피머로부터 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 혼합된 C-24 에피머가 하기 화학식 III 또는 IX의 화합물로부터 선택된 화합물의 C-24 에피머의 혼합물인 것인 방법:
    상기 식에서, R1및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 수소 또는 히드록시 보호기를 나타내며, R3은 저급 알킬, 시클로알킬 또는 아릴 기이다.
  50. 제49항에 있어서, 혼합된 C-24 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 선택적으로 가용매분해되는 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5E,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 에스테르인것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 혼합된 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R,S)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 C-24에서의 에피머 혼합물인 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 선택적으로 가용매분해되는 에스테르화된 C-24 OH 에피머가 [1α,3β,5Z,7E,20R]-1,3-비스(t-부틸디메틸실록시)-20-(3'-시클로프로필-3'(R)-히드록시-1'-프로페닐)-9,10-세코프레그나-5,7,10(19)-트리엔의 에스테르인 것인 방법.
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