KR20040068710A - 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한장수풍뎅이 동충하초를 포함하는 외부 물질이나 바이러스감염에 의해 발생되는 간 질병의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초를 포함하는 제제들의 간 손상 보호효과에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 간 손상을 주는 대표적으로 알려진 물질인 사염화탄소에 의한 간세포 손상이 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초에 의해 회복됨을 혈청 내 효소들 (ALT, AST)과 간세포내 지질과산화 수준 측정을 통해 확인하였다. 또한 이러한 간 손상 방어효과는 농도에 의존적으로 나타남을 조사하였다. 또한 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초의 간 회복 기작을 사이토크롬 P450의 효소들과 글루타치온 결손효과를 통해 조사한 결과로 먼저 마이크로좀내 P450 1A1/2 와 P450 2E1의 효소활성이 장길에 의해 농도 의존적으로 감소를 확인할 수 있었으며, 이는 사염화 탄소에 의한 이 생성이 감소하여 간 독성을 저해하며, 이에 의하여 글루타치온의 농도도 감소함을 알 수 있었다. 또한 사염화탄소에 의해 증가된 유해산소종의 생성을 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 동충하초가 감소시킴으로서 간 보호효과를 보임을 확인하였다. 이처럼 꽃무지 동충하초가 간세포내 지질과산화 현상을 억제하고, 간세포 손상을 유발하는 반응성 유해산소종의 발생을 억제시키며. 간대사에 관련 효소 (사이토크롬 P450)을 억제함으로서 간세포 독성, 간염, 간지질 과산화, 간경화 (섬유 증식) 등과 같은 질병의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 그 물질을 포함하는 제품들의 간 손상 보호효과에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초의 열수 또는 유기용매 추출물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하여 외부 물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 간 질병을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충 및 동충하초는 간에서 비롯되는 질병 즉, 간암, 간경화, 간염, 누적된 피로 등의 해소 등을 포함하여 월경불순, 시력감퇴, 백내장, 금창, 산후증, 악성종기, 구내염, 파상풍, 중풍 등의 성인병을 치료하는데 탁월한 효과가 있다고 동의보감(허준, 1596)에 보고되어 있으나, 예전부터 알려진 이러한 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초의 간 보호 효능에도 불구하고 현재까지 이에 대한 약리적 효능 및 작용기전에 대한 보고가 거의 없는 실정이다.
사염화탄소 (CCl4)는 간의 마이크로좀내 사이토크롬 P450에 의해서 트리클로로메틸 프리 레디칼을 생성함으로서 세포독성을 일으킨다고 보고되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1327-1331). 세포내의 각종 라디칼과 반응성 유해산소종은 간 보호효과를 하는 글루타치온과 결합함으로서 빠르게 글루타치온의 양이 줄어된다 (Drug Metab. Rev. 13 (1982) 539-553. Ther. 187 (1973) 185-194. Pharmacol. Exp. Ther. 187 (1973) 211-217.). 더불어 글루타치온과 결합하지 못한 각종 라디칼과 반응성 유해산소종은 세포 내 거대분자와 결합하게 되고, 세포막의 지질과산화를 일으키며, 또한 세포 내 칼슘의 조절을 방해하여 세포를 죽게하는 결과를 초래한다(Pharmacol. Exp. Ther. 187 (1973) 211-217; Metab. Rev. 24 (1992) 367-407; Drug Metab. Rev. 29 (1997) 59-77.).
본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초로부터 간경화나 간질병을 치료하기 위한 제제를 찾던 중 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초가 간 내 반응성 유해산소종의 생성을 감소시키고, 간내 사이토크롬 P50 효소들의 발현을 억제함으로서 간내 독성물질인 트리클로로메틸 프리 레디칼을 생성을 감소시킴으로써 사염화탄소에 의한 간독성을 억제함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 안전하고 독성이 없는 천연물인 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초를 활성성분으로 포함하여 외부 물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 간질병을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 장수풍뎅이 유충 (장유) 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 (장동) 추출물들이 간 손상 유발물질 (사염화탄소)에 의해 손상된 간의 보호효과를 처리 농도에 따라 나타낸 그래프다.
도 2는 간 손상물질에 의해 감소된 글루타치온 (Glutathion, GSH) 양 회복정도를 측정한 흡광도 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 사용되는 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 그 물질을 포함하는 추출물은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조된다. 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 추출물은 통상 열수 추출물 또는 유기용매 추출물을 들 수 있으며, 이러한 추출물들은 단독으로 또는 허용 가능한 생약재를 첨가하여 제조될 수 있다. 일반적으로 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 분말은 수분의 함량이 5% 이하가 되도록 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초를 동결 건조하고 이를 분쇄한 다음, 입자 크기가 0.6㎜ 이하인 것을 선별하여 사용된다. 열수추출물은 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 동결건조 분말에 약 5∼10 배의 물을 첨가하고 60∼80℃의 온도에서 4∼6시간동안 2회 추출하여 얻은 여과액을 그대로 사용하거나 허용 가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 사용한다. 유기용매 추출물은 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 분말에 약 3배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 2회 추출하여 얻어진 여과액을 감압 농축하여 사용한다. 유기 용매로는 에탄올이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 그 물질을 포함하는 추출물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분인 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 그 물질을 포함하는 추출물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클 (Vehicle), 부형제 또는 메디움 (Medium)으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 10 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
이하에서 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이로써 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 동결건조 분말의 제조
장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 분말은 수분의 함량이 5% 이하가 되도록 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초를 동결 건조하고 이를 분쇄한 다음, 입자 크기가 0.6㎜ 이하인 것을 선별하여 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 분말 0.2㎏에 증류수 2ℓ를 가하고 90∼95℃에서 5시간동안 2회 추출한 후 여과하고 이를 동결건조해서 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 추출물 100 g 얻었다.
실시예 2 : 실험 동물 및 처리
1. 시약
시약은 다음의 것을 구입하여 사용하였다.
사염화 탄소 (CCl4), 올리브유, 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 (ALT)와 아스파레이트 아미노 트렌스퍼라제 (AST) 키트, 치오바비토릭산(Thiobarbituric acid, TBA), 엘-에스코빅 산 (L-ascorbic acid), 크산틴 (Xanthin), 크산틴 옥시데이스 (Xanthin oxidase), 피러스 설페이트 (Ferrous sulfate), 하이드로젠 퍼옥사이드 (Hydrogen peroxide), 페닐메톡실설포닐 플로라이드와 글루타치온 (GSH)은 시그마사 (Sigma chemical co)에서 구입하였다.
2. 동물
시험동물은 생후 8주된 25∼30g의 실험용 마우스 (ICR mouse)를 사용하였고, 사료 (purina korea)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21∼24℃, 상대습도는 40∼80%로 유지하였다. 또한 12 시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다.
실시예 3 : 간 독성을 일으키는 물질에 대한 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초의 간보호 효과
1. 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 투여 및 화학물질들에 의한 간손상 유발
실험 동물 (ICR Mouse)에 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초를 10, 100, 200 mg/kg으로 녹여 3일 동안 경구 투여하였다.대조군은 생리 식염수만을 경구 투여하였다. 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 동결 건조분말을 전처리 한 후 사염화 탄소 (CCl4,18 mg/kg)를 복강투여하여 인위적인 간 손상을 유발시킨 다음, 18시간 지난 후에 생쥐를 에탄올로 마취 후 혈액과 간을 채취하였다.
2. 혈액 내 알라닌 아미노 트랜스퍼라제와 아스파레이트 아미노 트렌스퍼라제 활성도 측정
간 손상시 혈액으로 유리되어 나오는 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 와 아스파레이트 아미노 트렌스퍼라제 활성도 양을 라이만 플랭클린 (Reitman - Frankel) 방법에 준하여 측정하였다. 간략히 설명하면, 처리 후 18시간 후에 심장으로부터 채취한 혈청을 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응시켜 피루빅산(pyruvate)을 생성시킨 후, 발색액을 넣고, 20분 후 0.4 N-수산화 나트륨 (NaOH)을 섞어서 동정색의 발색이 되면 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 1과 같다.
이 표에서 알 수 있듯이 사염화 탄소에 의한 간 손상으로 간 세포에서 혈청으로 유리된 알라닌 아미노트랜스퍼라제 와 아스파레이트아미노 트렌스퍼라제 활성도를 측정한 결과 장수풍뎅이 유충 및 장수풍뎅이 동충하초 동결 건조분말을 전 처리한 군들은 사염화탄소를 전 처리한군에 비해 처리 농도에 의존적으로 활성이 감소하였다.
3. 간장의 지질과산화측정
사염화 탄소에 의하여 생성된 지질과산화에 대한 장수풍뎅이 유충 및 장수풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 동결 건조분말의 간 손상 방지효과를 확인하기 위해 간 100 mg을 10 ml의 완충액 (Tris-HCl)에 넣은 후 분쇄기 (homogenizer)로 부순 다음 과산화 지질의 분해 생성물인 말론디알데하이드 (malon- dialdehyde, MDA) 와 치오바비토릭산 (2-Thiobarbituric acid, TBA)을 100℃에서 20분간 가열 반응시켜 생긴 치오바비토릭산 색소를 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 표 2에 나타내었다.
위 표 2에서 알 수 있듯이, 산화 스트레스 (Oxidative stress)에 의한 간독성 방어 기작을 확인하기 위해 지질 과산화 (Lipid peroxidation; LPO) 수준을 측정한 결과는 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 동결 건조분말을 전처리 한 군들이 사염화 탄소를 처리한 군에 비해 농도 의존적으로 감소하였다.
실시예 4 : 간 손상물질에 의해 감소된 글루타치온 (Glutathion, GSH) 양 회복
적출한 간을 증류수로 씻은 후에 잠시 말렸다가 무게를 잰 다음 간의 일부분을 사용하여 글루타치온양을 측정하였다. 그 방법으로는 적출한 간 100 mg을 0.02M 이디티에이(EDTA)에 넣은 후 분쇄기 (Homogneizer)를 이용하여 조직을 부순다. 이 수용액을 12000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액 100㎕ 만 취한다. 이 상등액에 1.8 ml 포스페이트-이디티에이 (phospate -EDTA) 완충액과 프탈이알데하이드 (O-Phthaldiadehyde) 100㎕를 넣은 후 15분 후에 플로로메타 (Flourometer)로 412nm에서 흡광도를 측정한다.
그 결과는 도 2로 나타내었다.
도 2에서 알 수 있듯이, 장수풍뎅이 유충 (장유) 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 (장동) 동결 건조분말이 간 조직내에서 사염화탄소에 대한 해독작용으로 소실된 글루타치온 결손양을 회복시킴을 확인하기 위해 간 조직내 글루타치온(GSH) 양을 측정한 결과는 장수풍뎅이 유충 및 장수풍뎅이 동충하초를 전처리 한 군들이 사염화탄소을 처리한 군에 비해 농도 의존적으로 증가하였으며, 장수풍뎅이 유충 및 장수풍뎅이 동충하초 200 mg/kg 이상을 전 처리한 경우 대조군의 글루타치온양과 유사하게 측정되었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 사염화탄소에 의해 손상받은 간세포 손상이 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초에 의해 회복됨을 혈청 내 효소들 (ALT, AST)과 간세포 내 지질과산화 수준, 간 조직내 글루타치온 (GSH) 양, 그리고 간세포내의 간독성 유발에 관련된 반응성 유해산소종 (ROS) 측정을 통해 확인하였다. 또한 이러한 간손상 방어효과는 농도에 의존적으로 나타남을 조사하였다.
실시예 5 : 간독성 유발물질의 대사활성에 관련된 사이토크롬 P450 (cytochrome P450) 약물대사 효소활성도 변화 조사
1. 인비트로 (In vitro)실험을 위한 실험동물 처리
P450 효소를 증가시키기 위해서 3일간 P450 1A1/2 유도체인 메칠콜란스렌 (3-methycholanthrene)과 P450 2E1 유도체인 피리딘 (pyridine)을 먹였다. 4일째, 생쥐를 마취하에 희생시킨 후, 간을 적출하여 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
2. EROD와 PROD 활성도 측정
0.1 M 포타슘포스페이트 (Potassium Phosphate, pH 7.4)에 2 mg/ml의 소혈청 단백질(bovine serum albumin), 10㎛ 디코마롤 (Dicoumarol), NADPH 재생계 (degeneration system) (5 mM 글루코스-6 포스페이트, 5 unit/ml 글루코스-6-포스페이트 디하이드로제나), 10㎛ NADPH, 2.5㎛ 에톡실레졸루핀 (7-ethoxyresorufin)과 마이크로좀 (Microsome) 시료를 혼합한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후 형성된 레졸루핀 (resorufin)은 발광 (excitaion) 파장 550 nm, 방출 (emission) 파장 585 nm에서의 플로로센스를 측정했다. 마이크로좀 시료내의 단백질의 농도는 로리 등의 방법으로 결정했다 (Lowry 등.,1951). PROD 효소 활성도는 위의 EROD 측정과 동일하게 실시하였으며, 에톡실레졸루핀 대신 펜톡실레졸루핀 (7-Pentoxyresorufin)을 가하여 측정했다.
3. 아닐린 하이드록실레이제 (Aniline hydroxylase) 활성도 측정
P450 2E1과 관련이 있는 아닐린 하이드록실레이제 (aniline hydroxylase)의 측정은 기질로 아닐린을 사용하여 생성된 하이드로실 아닐린 (4-hydroxy aniline)의 양을 630 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량했다. 간단히 기술하면 아닐린 (5-20 mM)과 10 uM NADPH, NADPH 재생산 시스템 (regenerating system) 및 마이크로좀 시료를 0.1 M 포타슘포스페이트 완충액 (potassium phosphate buffer, pH 7.4)에 혼합한 후 37 ℃ 항온 수조 (shacking water incubator)에서 20 min동안 반응시킨 다음 20% TCA를 가하여 반응을 종결시켰고 5% 페놀과 2.5 N 수산화나트륨 (NaOH)을 가하여 혼합한 다음, 2.5 N 탄산나트륨 (Na2CO3)를 가하여 30분 동안 실온에서 방치하면서 발색시켰다. 630 nm에서 흡광도를 측정하고 하이드로실 아닐린 (4-hydroxyaniline) 검량선으로부터 활성도를 계산했다.
위의 표 3에서 알 수 있듯이, P450 1A1/2 및 P450 2E1에 각각 특이적인 EROD (ethoxyresorufin O-deethylase), AH (aniline hydroxylase), PROD(pentoxyresolufin O-dealkylase) 활성도는 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초의 처리농도에 비례하여 감소하였다.
이와 같이 본 발명의 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초는 사염화탄소와 같은 외부물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 간질병을 예방 및 치료하기 위한 생물학적 조절제로서 임상적으로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
상술한 바와 같이 추출물을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 외부 물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 간질병을 예방 및 치료제로서 유용하게 사용되어질 것이다.
장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 그 물질을 포함하는 간 질병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 생산하여 간 독성물질의 생성을 방지함으로서 간세포 독성, 간염, 간지질 과산화, 간경화 (섬유 증식) 등과 같은 질병의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (1)
- 장수풍뎅이 유충 및 장수 풍뎅이 유충을 기주로한 장수풍뎅이 동충하초 및 그 물질 추출물을 포함하는 외부 물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 간 질병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.열수 또는 유기용매 추출물을 제조하고 이에 허용가능한 생약재를 포함하는 청구항은 사실상 공지된 방법을 나타내는 것에 불과하고 위의 청구항으로 동일한 효과를 얻을 수 있다.
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2003
- 2003-01-27 KR KR1020030005220A patent/KR20040068710A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR200483488Y1 (ko) | 2016-11-10 | 2017-05-22 | 정주광 | 파지용 휴대폰 케이스 |
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