KR20040065994A - 올리고뉴클레오티드의 정제 방법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 정제 방법 Download PDF

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KR20040065994A
KR20040065994A KR10-2003-7015921A KR20037015921A KR20040065994A KR 20040065994 A KR20040065994 A KR 20040065994A KR 20037015921 A KR20037015921 A KR 20037015921A KR 20040065994 A KR20040065994 A KR 20040065994A
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맥스 엔. 무어
존 찰스 아더
켄트 밴수이
안토니 엔. 스코짜리
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아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
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Abstract

올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고 올리고뉴클레오티드를 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것에 의한 정제된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.

Description

올리고뉴클레오티드의 정제 방법{PROCESSES OF PURIFYING OLIGONUCLEOTIDES}
올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체는 분자생물학 분야의 다양한 방법에서 프로브(probe), 프라이머(primer), 링커(linker), 어댑터(adapter) 및 유전자 단편으로서 개발되고 사용되었다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 치료, 진단 및 연구 분야에서 중요한 역할을 한다.
다세포 유기체의 대부분의 질병 상태를 포함하는, 몸 상태의 대부분은 단백질에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 직접적으로 또는 그의 효소적 또는 기타 기능을 통해 작용하는 그러한 단백질은 동물 및 인간에 있어서 다수 질병에 대한 중요한 역할을 하며 조절 기능을 한다. 질병 치료를 목적으로 하는 고전적인 방법은 일반적으로 질병 유발 또는 질병 강화 기능을 완화하고자 하는 노력에 있어서는 상기 단백질들과의 상호 작용에 집중되어 있다. 보다 새로운 치료적 접근에서는, 상기 단백질의 실제 생산의 조절이 요구되고 있다. 단백질 생산을 방해함으로써, 부작용을 최소화하면서 최대 치료 효과를 달성할 수 있다. 그러므로 상기 치료적 접근의 일반적인 목적은 바람직하지 않은 단백질 형성을 유도하는 유전자 발현을 방해하거나 조절하는 것이다.
특정한 유전자 발현을 저해하는 하나의 방법은 올리고뉴클레오티드, 특히 특정한 표적 메신저 RNA(mRNA) 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다. 몇몇 올리고뉴클레오티드가 근래에 상기 용도를 위한 임상 시험을 거쳤다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 현재 항바이러스제로서 사용되는 것을 포함하여, 다양한 질병 상태에 대한 인간 임상 시험에서 안티센스제(antisense agent)로서 사용되고 있다. 기타 작용 메커니즘도 또한 제안되었다. 예를 들면, 전사 조절 도중에 전사 인자가 이중 사슬 DNA와 상호 반응한다. 올리고뉴클레오티드는 전사 인자의 작용을 조절하기 위한 전사 인자의 경합 저해제로서 작용할 수 있다. 최근은 몇몇 보고는 상기 상호작용을 기술하는데(비엘린스카, 에이.(Bielinska, A.) 등의 문헌 [Science, 1990, 250, 997-1000]; 및 우, 에이취.(Wu, H.) 등의 문헌 [Gene, 1990, 89, 203-209]을 참고한다), 상기 문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체는 단백질의 간접 및 직접 조절제로서 사용되는 것에 더하여 또한 진단 시험에서 사용되는 것으로 발견되었다. 상기 진단 시험은, 예를 들면 생물학적 유체, 조직, 본래 세포 또는 분리된 세포 성분을 사용하여 수행될 수 있다. 유전자 발현 저해에 관련하여, 진단 적용처는 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 핵산의 상보적 사슬에 하이브리다이제이션되는 성능을 이용한다. 하이브리다이제이션은 올리고머 화합물의 와트손-크리크(Watson-Crick) 형 및(또는) 후그스틴(Hoogsteen) 형 염기 쌍을 통한 RNA 또는 DNA로의 서열 특이적 수소 결합이다. 상기 염기 쌍의 염기들은 서로 상보적인 것으로 언급된다.
올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체는 또한 연구 시약으로서 널리 사용되고 있다. 이들은 다수의 기타 생물학적 분자의 기능과 기타 생물학적 분자 제조를 이해하는데 유용하다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체의 PCR 반응에서의 프라이머로서의 용도는 상업적 공업으로 확장되었다. PCR은 상업적 및 연구 실험의 근간이 되었으며, PCR의 적용처도 확대되었다. 예를 들면, 현재 PCR 기술의 법의학, 고생물학, 진화 연구 및 유전 상담의 분야에서의 용도가 발견되었다. 상업화는 PCR을 적용하는 분자생물학 비숙련인을 보조하는 키트의 개발을 유도했다. 천연 및 합성 모두의 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 상기 PCR 기술에서 프라이머로서 사용된다.
올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체는 또한 기타 실험 방법에서도 사용된다. 이러한 용도의 몇몇이 일반적인 실험 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed., 제이. 샘브룩(J. Sambrook) 등 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; 및 문헌 [Current Protocols In Molecular Biology, 에프. 엠. 오스벨(F. M. Ausubel) 등 편집, Current Publication, 1993]에 기술되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 상기 용도는 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체 및 올리고머 화합물과의 스크리닝 발현 라이브러리, DNA 서열화, 폴리머라제 사슬 반응에 의한 DNA의시험관내 증폭 및 클로닝된 DNA의 부위 특이적 돌연변이 유발을 포함한다. 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 상기한 바와 같다]의 Book2를 참고한다. 또한 문헌 ["DNA-Protein interactions and The Polymerase Chain Reaction", Vol. 2 of Current Protocols In Molecular Biology, 상기한 바와 같다]을 참고하는데; 상기 문헌들은 각각 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
적용처의 범위가 광범위하기 때문에, 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체는 원하는 용도에 맞는 성질이 제공되도록 맞춰진다. 그러므로 올리고 화합물에 다수의 화학적 변형을 도입해서, 진단에 있어서 연구 시약 및 치료제로서의 유용성을 증대시켰다. 상기 변형은 표적 사슬로의 결합성이 증가되도록, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드-표적 복합물의 확인을 보조하도록, 세포 침투성이 상승되도록, 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체의 구조 또는 활성을 분해하거나 방해하는 뉴클레아제 및 기타 효소에 대해 안정화되도록, 일단 서열 특이적으로 표적에 결합된 것이 파괴되는 방식(상황 종결)이 제공되도록, 올리고뉴클레오티드의 약물동력학적 성질이 개선되도록, 그리고 올리고뉴클레오티드의 흡수 및 세포 분포가 조절되도록 하는 것을 포함하며, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
천연 올리고뉴클레오티드의 변형은, 예를 들면 비동위체 표지, 예를 들면 플루오레세인, 비오틴, 디곡시제닌, 알칼리성 포스파타제 또는 기타 리포터 분자로 표지하는 것을 포함한다. 기타 변형은 리보스 포스페이트 주쇄를 생성 유사체의 뉴클레아제 안정성이 상승되도록 만드는 것이다. 그러한 변형의 예는 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합 및 2'-O-메틸 리보스당 단위의 혼입을 포함하는데, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 친유성 분자와 접합되도록 변형될 수 있다. 친유성 접합물이 존재하면 올리고뉴클레오티의 세포 투과가 개선되고, 따라서 세포 중 올리고뉴클레오티드의 분포가 개선되는 것으로 증명되었다. 또한, 친유성 분자와 접합된 올리고뉴클레오티드는 세포 배양 연구에서 어떠한 이입제도 필요로하지 않으면서 올리고뉴클레오티드의 자유스러운 흡수를 증진할 수 있다. 접합 올리고뉴클레오티드는 또한 포스포디에스테르 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 단백질 결합을 개선할 수 있다. 이들 화합물의 진단 및 치료 용도의 성공으로 인해, 개선된 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 현재 요구되고 있다.
화학적 문헌은 뉴클레오시드를 인 함유 공유 결합을 통해 커플링시켜서 한정된 서열의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 다수 방법을 개시한다. 그 중 가장 주목받는 방법은 포스포르아미다이트 기술인데(예를 들면, 보케이지, 에스.엘.(Beaucage, S.L.)의 문헌 [Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach]; 아이어, 알.피.(Iyer, R.P.)의 문헌 [Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2331]을 참고하며, 각 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다), 여기에서 자유 히드록실기를 갖는 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드가 보호된 시아노에틸 포스포르아미다이트 단량체와 약산 존재하에 반응되어 포스파이트-연결 구조를 형성한다. 포스파이트 결합의 산화 후에 시아노에틸기가 가수분해되어 원하는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합이 형성된다.
아실아미노에틸기가 특정 포스페이트 디에스테르에 대한 보호기로서 작용하는 성능은 지오드루(Ziodrou) 및 슈미르(Schmir)에 의해 최초로 관찰되었다. 지오드루 등의 문헌 [J. Amer. Chem. Soc., 85, 3258, 1963]은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 이 방법의 변형은 올리고뉴클레오티드 이량체의 고체 상 합성, 및 종래의 포스포르아미다이트에 대한 대체물로서의 옥사포스포리딘 뉴클레오시드 빌딩 블록을 갖는 올리고머까지 확장되었다. 아이어 등의 문헌 [Tetrahedron Lett., 39, 2491-2494, 1998]; 1996년 12월 12일에 공개된 PCT 국제 공개 제 WO/9639413 호가 각각 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 포스페이트 보호기로서 N-트리플루오로아세틸-아미노알칸올을 사용하는 유사한 방법이 또한 윌크(Wilk) 등의 문헌 [J. Org. Chem., 62, 6712-6713, 1997]에 보고되었으며; 이 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 이 탈보호는 N-트리플루오로아세틸기를 제거한 후에 아미노알킬 포스포트리에스테르를 아자시클란으로 고리화하는 것을 포함하는 메커니즘에 의해 지배되며, 이것은 포스포디에스테르기의 분리를 수반한다.
고체 상 기술은 올리고뉴클레오티드 합성 기술에서 중요한 역할을 계속하고 있다. 전형적으로 대부분의 3'-뉴클레오시드는 히드록실 또는 아미노 잔기로 작용기화된 고체 지지체에 고정된다. 이어서 추가 뉴클레오시드가 단계적으로 첨가되어서 도입되는 뉴클레오시드의 3'-작용기와 지지체 결합 뉴클레오시드의 5'-히드록실기 사이에 원하는 결합이 형성된다. 이러한 단계적 조립에 있어서 절대적인 것은 적절한 인 보호기의 현명한 선택이다. 그러한 보호기는 성장하는 올리고머의 뉴클레오시드 염기 부분의 인 부분을 고체 지지체로부터 분해되는 시간까지 차폐하는 역할을 한다.
분해 후에, 보통 정제된 올리고뉴클레오티드 생성물을 얻기 위해 특정 경우에는 올리고뉴클레오티드에 탈보호, 침전 및 분리와 같은 처리 및 가공을 한다. 침전은 용액 중 올리고뉴클레오티드 생성물을 안티-용매로 처리해서 현탁액 중에 응집 고체를 형성하는 방법이다. 그 다음에 고체 생성물은 액체 상으로부터 분리한다. 올리고뉴클레오티드의 침전 및 건조를 위한 확립된 방법은 잘 문서화되어 있다. 예를 들면 올리고뉴클레오티드를 마니아티스(Maniatis)의 문헌 [Techniques in Molecular Biology]에 기술된 기술에 따라서 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 정제하는 하나의 기술은, 예를 들면 역상 HPLC에 의해 분리된 DMT-존재 온길이 분획을 합하고, -20℃에서 다량의 에탄올 중에 침전시키고, 연속 유동 고속 원심분리(15K)에 의해 분리한 다음 물에 재구성하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 수용액을 pH 3.3 내지 4.1의 범위로 산성화해서 4,4'-디메톡시트리틸 에테르 보호기를 제거한다. 반응이 완결된 후에 용액을 3M 소듐 아세테이트로 희석한 다음, -20℃에서 에탄올 중에서 침전시키고, 고속 원심분리에 의해 분리하고 물에 재구성한다. 올리고뉴클레오티드 수용액을 1N 소듐 히드록사이드로 pH 7.0-7.4로 조정하고, -20℃에서 에탄올 중에서 침전시키며, 연속 유동 고속 원심분리에 의해 분리한 다음 물에 재구성한다. 최종 재구성 수성 올리고뉴클레이티드를 56시간 건조 사이클을 사용하는 동결 건조에 의해 건조시킨다.
그러나, 상기 정제 방법은 일반적으로 비교적 작은 배치의 올리고뉴클레오티드만을 가공할 수 있는 고가의 고속 원심분리기 사용을 필요로한다. 게다가, 상기 방법은 다량의 용매를 -20℃로 냉각시킬 필요가 있다.
상기한 내용에 비추어, 올리고뉴클레오티드의 개선된 정제 방법이 계속 요구되고 있다. 특히, 고수율의 정제된 올리고뉴클레오티드를 신속하고 효율적으로 제조하는 방법이 요구되고 있다. 이 방법은 바람직하게는 주위 온도에서 수행될 수 있다. 게다가, 이 방법은 바람직하게는 비용 효율적인 분리 기술을 사용하여 용액으로부터 정제된 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 올리고뉴클레오티드를 정제하고 정제된 올리고뉴클레오티드 생성물을 고수율로 제조하는 신규 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 응집시키고 생성 응집물을 분리하는 신규 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 주위 온도에서 수행될 수 있으며 비용 효율적인 물리적 기술을 사용하여 응집물을 분리할 수 있다. 본 발명은 또한 소규모 및 대규모 조작을 위한 비용 효율적 하류 가공 기술에 관한 것이다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 올리고뉴클레오티드를 응집제 및 침전 증진제와 반응시키고; 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 분리된 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 정제 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에 있어서, 응집제는 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로필 알콜 또는 변성 에탄올이다. 특정 실시태양에 있어서, 침전 증진제는 염, 예컨대 소듐 염(Na+), 리튬 염(Li+), 암모늄 염(NH4 +), 포타슘 염(K+), 마그네슘 염(Mg+), 세슘 염(Cs+) 또는 아연 염(Zn+)을포함한다. 예를 들면, 침전 증진제는 소듐 아세테이트(NaOAc) 또는 소듐 히드록사이드(NaOH)일 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 용액 중에 존재하는 보호된 올리고뉴클레오티드이다. 보호기는 트리메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 9-페닐크산텐-9-일 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일을 포함하는데, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 용액 중에 약 550 OD/mL 이상, 약 600 OD/mL 이상, 또는 약 650 OD/mL 이상의 농도로 존재한다.
본 발명의 기타 실시태양에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 용액 중에 존재하는 탈보호 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 용액 중에 약 2250 OD/mL 이상, 약 2500 OD/mL 내지 약 7500 OD/mL, 또는 약 4500 OD/mL 내지 약 6500 OD/mL의 농도로 존재한다.
비록 올리고뉴클레오티드를 광범위한 반응 온도에서 응집제로 처리할 수 있긴 하지만, 올리고뉴클레오티드를 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도, 보다 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 20℃의 온도에서 상기 응집제로 처리한다.
특정 실시태양에 있어서는, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 응집제로 처리하기전에 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 침전 증진제로 처리한다. 또는 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 침전 증진제로 처리하기전에 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 응집제로 처리하거나, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 침전 증진제 및 상기 응집제의 혼합물로 처리할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 용액 중에 존재할 수 있다. 용액 중에 존재할 때, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 약 1부의 용액 대 약 1.5부 이상, 보다 바람직하게는 약 2부 내지 약 4부, 보다 더 바람직하게는 약 2.5부 내지 약 4.5부의 응집제의 부피비로 응집제로 처리된다.
특정 실시태양에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 상기 용액으로부터 고속 또는 저속 원심분리에 의해 분리한다. 또는 올리고뉴클레오티드를 상기 용액으로부터 중력 침강 또는 여과에 의해 분리할 수 있다.
바람직한 실시태양에 있어서, 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 5'-보호 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 용액을 응집제로 처리하고, 올리고뉴클레오티드를 분리한 다음, 분리된 올리고뉴클레오티드 응집물을 용해시켜서 제 2 용액을 형성함으로써 정제된 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 제 2 용액을 탈보호제로 처리하여 5'-보호기를 제거하고, 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 응집제 및 침전 증진제로 처리하고, 분리하고 용해시켜서 제 3 용액을 형성한다. 제 3 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 제 3 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하여 제 3 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성하고, 이것을 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
대안의 실시태양에 있어서는, 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고, 분리하며, 분리된 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 용해시켜서 제 2 용액을 형성해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 제 2 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 제조한다.
제 1 용액은 5'-보호 올리고뉴클레오티드를 포함하는 HPLC 용출액을 산성화해서 제조할 수 있는데, 여기에서 용출액은 분해되고 염기 탈보호된 5'-보호 올리고뉴클레오티드의 HPLC 정제에 의해 제조된다.
기타 실시태양에 있어서, 생성된 정제된 올리고뉴클레오티드의 순도는 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상이다. 특정 실시태양에 있어서, 제 1 용액은 조 올리고뉴클레오티드의 고압 액체 크로마토그래피로부터 얻은 용출액이며, 여기에서 고압 액체 크로마토그래피는 역상 매질 또는 강 음이온 수지로 충전된 컬럼을 사용하여 수행된다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 신규 정제 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 용액으로부터 침전시키고 물리적 방법을 사용하여 분리시키는 올리고뉴클레오티드의 신규 정제 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 고체 상 합성 반응식이다.
도 2는 도 1에 기술된 합성 반응식에 사용될 수 있는 포스포르아미다이트의 예를 제공한다.
도 3은 지지체 결합 분자의 디메톡시트리틸 탈보호 후에 지지체 결합 분자가 활성화된 2'-데옥시 또는 2'-메톡시에틸 변형 포르포르아미다이트 단량체와 반응되는 축합 반응을 도시한다.
도 4는 포스파이트 트리에스테르 및 1-H-테트라졸의 등가물을 제조하는 지지체 결합 분자의 5'-히드록실기와 테트라졸간의 반응을 도시한다.
도 5는 반응 컬럼에 아세토니트릴:3-피콜린의 1:1 혼합물 중 페닐아세틸 디술피드(PADS)의 0.2M 용액을 전달해서 상응하는 포스포로티오에이트 트리에스테르를 형성하는 포스파이트 트리에스테르의 황화 반응을 도시한다.
도 6은 임의의 미반응 5'-히드록실기를 아세토니트릴 중 아세트산 무수물 및 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합물을 전달해서 아세틸화하는 캡핑 단계를 도시한다. 도 6은 또한 지지체를 여과에 의해 제거하며 에탄올 및 물의 혼합물로 세척하는 최종 단계를 도시한다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는 충분한 조건에서 올리고뉴클레오티드를 1종 이상의 응집제 및 1종 이상의 침전 증진제와 반응시키는 올리고뉴클레오티드의 정제 방법에 관한 것이다. 그 다음에 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 분리된 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 주로 크기 및 질량 때문에, 올리고뉴클레오티드가 응집물 형태일 때 올리고뉴클레오티드의 분리가 촉진된다. 예를 들면, 응집된 올리고뉴클레오티드의 크기가 클수록 용이하게 여과에 의해 분리된다. 또한, 응집물이 무거울수록 원심분리 또는 침강 절차 도중에 중력의 영향을 더 받게 된다.
사용되는 응집제, 사용되는 침전 증진제, 용매 온도, 용매 대 올리고뉴클레오티드의 비, 성분 첨가 순서, 올리고뉴클레오티드 농도 및(또는) 용매 유형과 같은 반응 조건을 변화시키면, 올리고뉴클레오티드가 효과적으로 그리고 효율적으로응집되며 이어서 분리되어서, 정제된 물질이 형성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 고속 원심분리기, 냉장기 및 냉동기를 사용하지 않고 수행될 수 있어서 제조 시간을 줄이고 비용을 절감할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 종래의 정제 방법에 대한 비용 효율적인 대안을 제공한다. 또한, 본 발명에 따라서 반응 조건을 최적화하면, 극도로 높은 수율로 정제된 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "올리고뉴클레오티드"는 인 함유 결합, 예컨대 포스파이트, 포스포디에스테르, 포르포로티오에이트 및(또는) 포스포로디티오에이트 결합에 의해 연결된 단량체 서브단위를 다수 포함하는 화합물을 포함하며, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 이용해서 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 부여할 수 있다. 그러므로 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오티드, 그의 유사체 및 합성 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오시드"는 비-인 결합 부분을 갖는 2개 이상의 뉴클레오시드 서브단위를 포함하는 올리고머 또는 중합체를 포함한다. 올리고뉴클레오시드는 글리코실 결합을 통해 리보푸라노스 부분이 헤테로시클릭 염기 부분에 부착된 단량체 서브단위 또는 뉴클레오시드를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드를 연결하면 키메라 올리고머 화합물을 얻을 수 있다. 천연 포스포디에스테르 연결기에 더하여, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및 올리고머 키메라 화합물(올리고머 화합물)을 제조하는데 사용될 수 있는 인 함유 및 인 비함유 연결기는 제한적이지 않게 다음을 포함한다:
인 함유 결합:
포스포로디티오에이트(-O-P(S)(S)-O-);
포스포로티오에이트(-O-P(S)(O)-O-);
포스포르아미데이트(-O-P(O)(NJ)-O-);
포스포네이트(-O-P(J)(O)-O-);
포스포트리에스테르(-O-P(OJ)(O)-O-);
포포스포르아미데이트(-O-P(O)(NJ)-S-);
티오노알킬포스포네이트(-O-P(S)(J)-O-);
티오노알킬포스포트리에스테르(-O-P(O)(OJ)-S-);
보라노포스페이트(-R5-P(O)(O)-J-);
인 비함유 결합:
티오디에스테르(-O-C(O)-S-);
티오노카르바메이트(-O-C(O)(NJ)-S);
실록산(-O-Si(J)2-O-);
카르바메이트(-O-C(O))-NH- 및 -NH-C(O)-O-);
술파메이트(-O-S(O)(O)-N- 및 -N-S(O)(O)-N-;
모르폴리노 술파미드(-O-S(O)(N(포르폴리노)-);
술폰아미드(-O-SO2-NH-);
술피드(-CH2-S-CH2-);
술포네이트(-O-SO2-CH2-);
N,N'-디메틸히드라진(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-);
티오포름아세탈(-S-CH2-O-);
포름아세탈(-O-CH2-O-);
티오케탈(-S-C(J)2-O-); 및
케탈(-O-C(J)2-O-);
아민(-NH-CH2-CH2-);
히드록실아민(-CH2-N(J)-O-);
히드록실이민(-CH=N-O-); 및
히드라지닐(-CH2-N(H)-N(H)-).
"J"는 보통 수소 또는 알킬기인, 그러나 한 유형의 결합에서 또 하나의 것으로 변화되는 보다 복잡한 기일 수 있는 치환기를 나타낸다.
천연 발생 결합의 1개 이상의 -O-P(O)2-O- 원자의 변형 또는 치환을 포함하는 상기 결합기에 더하여, 결합기는 5'-메틸렌기와 천연 발생 결합의 1개 이상의 원자의 변형을 포함할 수 있다. 이런 유형의 결합은 제한없이 다음을 포함한다:
아미드(-CH2-CH2-N(H)-C(O)) 및 -CH2-O-N=CH; 및
알킬포스포러스(-C(J)2-P-(=O)(OJ)-C(J)2-C(J)2-).
여기에서, J는 상기한 바와 같다.
상기한 대체 뉴클레오시드간 결합의 합성 반응식은; 제 WO 91/08213 호; 제 WO 90/15065 호; 제 WO 91/15500 호; 제 WO 92/20822 호; 제 WO 92/20823 호; 제 WO 91/15500 호; 제 WO 89/12060 호; 제 EP 216860 호; 제 US 92/04294 호; 제 US90/03138 호; 제 US 91/06855 호; 제 US 92/03385 호; 제 US 91/03680 호; 미국 특허 제 07/990,848 호; 07/892,902 호; 제 07/806,710 호; 제 07/763,130 호; 제 07/690,786 호; 제 5,466,677 호; 제 5,034,506 호; 제 5,124,047 호; 제 5,278,302 호; 제 5,321,131 호; 제 5,519,126 호; 제 4,469,863 호; 제 5,455,223 호; 제 5,214,134 호; 제 5,470,967 호; 제 5,434,257 호; 스터착, 이. 피.(Stirchak, E.P.) 등의 문헌 [Nucleic Acids Res., 1989, 17, 6129-6141]; 휴위트, 제이.엠.(Hewitt, J.M.) 등의 문헌 [1992, 11, 1661-1666]; 수드, 에이.(Sood, A.) 등의 문헌 [J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9000-9001]; 바수르, 제이. 제이.(Vaseur, J.J.) 등의 문헌 [J. Amer. Chem. Soc. 1992, 114, 4006-4007]; 무시치, 비.(Musichi, B.) 등의 문헌 [J. Org. Chem., 1990, 55, 4231-4233]; 레이놀즈, 알. 씨.(Reynolds, R. C.) 등의 문헌 [J. Org. Chem., 1992, 57, 2983-2986]; 메르테스, 엠.피.(Mertes, M.P.) 등의 문헌 [J. Med. Chem., 1969, 12, 154-157]; 문갈, 더블유.에스.(Mungall, W.S) 등의 문헌 [J. Org. Chem., 1977, 42, 703-706]; 스터착, 이.피. 등의 문헌 [J. Org. Chem., 1987, 52, 4202-4206]; 쿨, 제이.엠.(Coull, J.M.) 등의 문헌 [Tet. Lett., 1987, 28, 745]; 및 왕, 에이치.(Wang, H.) 등의 문헌 [Tet. Lett., 1991, 32, 7385-7388]에 개시되어 있으며; 상기 문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
기타 변형이 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 포스페이트기에서 일어날 수 있다. 대표적인 변형은 국제 공제 제 WO 91/10671 호(1991년 7월 25일 공개), 제 WO 92/02258 호(1992년 2월 20일 공개), 제 WO 92/03568 호(1992년 3월 5일 공개) 및미국 특허 제 5,138,045 호, 제 5,218,105 호, 제 5,223,618 호, 제 5,359,044 호, 제 5,378,825 호, 제 5,386,023 호, 제 5,457,191 호, 제 5,459,255 호, 제 5,489,677 호, 제 5,506,351 호, 제 5,541,307 호, 제 5,543,507 호, 제 5,571,902 호, 제 5,578,718 호, 제 5,587,361 호, 제 5,587,469 호에 개시되어 있으며, 모두 본 출원의 양수인에게 양도되었다. 상기 문헌 각각이 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드 유사체"는 천연 발생(즉 "천연") 및 비천연 발생 합성 부분을, 예를 들면 변형 당 및(또는) 뉴클레오베이스 부분을 포함하는 뉴클레오시드 서브단위를 모두 포함할 수 있는 화합물을 의미한다. 상기 올리고뉴클레오티드 유사체는 전형적으로 천연 또는 합성 야생형 올리고뉴클레오티드와 구조적으로는 구별되지만, 기능적으로 상호교환된다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드 유사체는, 예를 들면 표적으로 하이브리다이제이션(hybridization)되어서 원하는 RNA 또는 DNA 사슬의 구조 및(또는) 기능을 효율적으로 모방하는 기능을 하는 상기 모든 구조를 포함한다. 용어 "합성 올리고뉴클레오시드"는 변형 뉴클레오시드를 지칭한다. 대표적인 변형은 뉴클레오시드의 헤테로시클릭 염기 부분이 변형되어 비천연 뉴클레오베이스를 형성하는 것, 뉴클레오시드의 당 부분의 변형, 및(또는) 뉴클레오시드간 결합의 변형을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오베이스는 퓨린 염기 아데닌 및 구아닌과 피리미딘 염기 티민, 시토신 및 우라실을 포함한다. "변형"또는 "비천연" 뉴클레오베이스는 기타 합성 및 천연 뉴클레오베이스, 예컨대 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌과 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 기타 뉴클레오베이스는 미국 특허 제 3,687,808 호에 개시되어 있는 것들, 문헌 [Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, 크로슈비츠, 제이.아이.(Kroschwitz, J.I.) 편집, John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 잉글리쉬(Englisch) 등의 문헌 [Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들 및 상흐비, 와이.에스.(Sanghvi, Y.S.)의 문헌 [Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, 크룩, 에스.티.(Crooke, S.T.) 및 레블루, 비.(Lebleu, B.) 편집, CRC Press, 1992]에 개시된 것들을 포함하며; 상기 문헌들 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
특정 헤테로시클릭 염기 부분은 특히 올리고머 화합물의 상보 표적으로의 결합 친화성을 상승시키는데 있어서 유용하다. 이들은 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 N-6 치환 퓨린을 포함하는데, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환기는 핵산 사슬 안정성을 0.6-1.2℃ 상승시키는 것으로 증명되었기 때문에(상기 문헌 page 276-278) 현재 바람직한 염기 치환기이며, 특히 2'-메톡시에틸기와 같은 선택된 2'-당변형과 결합될 때 바람직하다.
헤테로시클릭 염기 부분(변형된 뉴클레오베이스)의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제 3,687,808 호; 제 4,845,205 호; 제 5,130,302 호; 제 5,134,066 호; 제 5,175,273 호; 제 5,367,066 호; 제 5,432,272 호; 제 5,457,187 호; 제 5,459,255 호; 제 5,484,908 호; 제 5,502,177 호; 제 5,525,711 호; 제 5,552,540 호; 제 5,587,469 호; 제 5,594,121 호; 제 5,596,091 호; 제 5,614,617 호; 제 5,681,941 호; 및 제 5,808,027 호를 포함하여, 이들 중 몇몇은 공동으로 소유되며, 상기 문헌 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "2'-치환기"는 선택된 당 부분에 2'-위치에서 부착된 기를 지칭한다. 그러나 치환기는 당 부분의 기타 위치에(예를 들면, 3'- 및(또는) 5'-위치에), 선택된 헤테로시클릭 염기 부분 또는 헤테로시클릭 염기 및 당 부분 모두에 대안적으로 또는 추가적으로 부착될 수 있다.
치환기의 대표적인 예는 수소, 히드록실, C1-C20알킬, C2-C20알케닐, C2-C20알키닐, C5-C20아릴, O-알킬, O-알케닐, O-알키닐, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸, S-알킬, S-알케닐, S-알키닐, NH-알킬, NH-알케닐, NH-알키닐, N-디알킬, O-아릴, S-아릴, NH-아릴, O-아르알킬, S-아르알킬, NH-아르알킬, N-프탈이미도, 할로겐(특히, 플루오로), 아미노, 티올, 케토, 카르복실, 니트로, 니트로소, 니트릴, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 이미다졸, 아지도, 히드라지노, 히드록실아미노, 이소시아네이토, 술폭시드, 술폰, 술피드, 디술피드, 실릴, 아릴, 헤테로시클릴, 카르보시클릴, 인터칼레이터(intercalator), 리포터(reporter) 기, 공액물, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리알킬렌 글리콜, 및 화학식 (O-알킬)m(여기에서, m은 1 내지 약 10이다)의 폴리에테르를 포함한다. 이들 폴리에테르 중에서 바람직한 것은 선형 및 환형 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 (PEG) 함유기, 예컨대 크라운 에테르 및 오우치(Ouchi) 등(문헌 [Drug Design and Discovery 1992, 9, 93]), 라바시오(Ravasio) 등(문헌 [J. Org. Chem. 1991, 56, 4329]) 및 델가르도(Delgardo) 등의 문헌([Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249])에 의해 개시된 것들이며, 상기 문헌들 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 다른 당 변형이 쿡, 피.디.(Cook, P.D.)의 문헌 [Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585-607]에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 플루오로, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬 이미다졸, O-알킬아미노알킬 및 알킬아미노 치환이 미국 특허 제 6,166,197 호에 기술되어 있으며, 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
올리고머 화합물은 다수의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는데, 여기에서 바람직한 뉴클레오시드간 결합은 3',5'-결합이다. 그러나 대안으로 2',5'-결합이 사용될 수 있다(1998년 7월 14일에 출원된 미국 특허 출원 제 09/115,043 호에 기술되어 있다). 2',5'-결합은 한 뉴클레이티드 서브단위의 당 부분의 2'-위치를 인접한 뉴클레오티드 서브단위의 당 부분의 5'-위치와 공유결합시키는 것이다.
본 명세서에서 기술되는 올리고뉴클레오티드는 비대칭 중심을 가질 수 있다. 특별한 언급이 없다면, 모든 키랄, 입체이성질 및 라세미 형태가 본 발명에 포함된다. 기하 이성질체도 본 명세서에 기술된 화합물에 존재할 수 있으며, 모든 상기 안정한 이성질체가 본 발명에 포함된다. 비대칭 치환 탄소 원자를 포함하는 화합물이 광학적으로 활성이거나 라세미 형태로 또는 합성에 의해 분리될 수 있다.
중간체 또는 최종 화합물에서 발견되는 원자의 모든 동위원소도 포함된다. 동위원소는 동일한 원자 번호이지만 질량수가 다른 원자를 포함한다. 예를 들면, 제한없이 수소의 동위원소는 3중 수소 및 중수소를 포함한다.
특정한 대표적인 변형 올리고머 화합물은 하기 치환기 중 하나를 갖는 1개 이상의 뉴클레오시드를 포함한다: C1내지 C20저급 알킬, 치환 저급 알킬, 알킬아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환 실릴, RNA 분해기, 리포터기, 인터칼레이터, 올리고머 화합물의 약물동력학적 성질을 개선하기 위한 기, 또는 올리고머 화합물의 약역학적 성질을 개선하기 위한 기 및 기타 유사한 성질을 갖는 치환기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지되어 있음](마틴(Martin) 등의 문헌 [Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486]), 즉 알콕시알콕시기를 포함한다. 보다 바람직한 변형은 2-DMAOE로도 공지되어 있는 2'-디메틸아미노에톡시, 즉 O(CH2)2ON(CH3)2기이다. 대표적인 아미노옥시 치환기는 1999년 6월 25일에 출원된 공동 소유의 명칭"Aminooxy-Functionalized Oligomers"의 미국 출원 제 09/344,260 호; 및 1999년 8월 9일에 출원된 명칭"Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same"의 미국 특허 제 09/370,541 호에 기술되어 있으며; 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
기타 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 뉴클레오시드 및 올리고머의 기타 위치에서도 이루어질 수 있는데, 특히 3'말단 뉴클레오시드의 당의 3'-위치에서 또는 2',5'-연결 올리고머와 같은 2'-위치로부터의 결합을 갖는 뉴클레오시드의 3'-위치에서 그리고 5'-말단 뉴클레오시드의 5'-위치에서이다. 올리고머는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 부분과 같은 당 유사물을 가질 수 있다. 상기 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제 4,981,957 호; 제 5,118,800 호; 제 5,319,080 호; 제 5,359,044 호; 제 5,393,878 호; 제 5,446,137 호; 제 5,466,786 호; 제 5,514,785 호; 제 5,519,134 호; 제 5,567,811 호; 제 5,576,427 호; 제 5,591,722 호; 제 5,597,909 호; 제 5,610,300 호; 제 5,627,053 호; 제 5,639,873 호; 제 5,646,265 호; 제 5,658,873 호; 제 5,670,633 호; 및 제 5,700,920 호를 포함하고, 이것으로 제한되는 것은 아니며, 이들 중 몇몇은 공동 소유이고, 상기 문헌 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 인용되며, 공동 소유의 1995년 6월 5일에 출원된 미국 특허 출원 제 08/468,037 호도 또한 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
본 발명에 따른 올리고머 화합물은 진단, 치료 분야에서 그리고 연구 시약 및 키트로서 사용될 수 있다. 이들은 제약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물 중에 사용될 수 있다. 이들은 또한 단백질의 원하지 않는 생산을 특징으로 하는 질병에 걸린 유기체를 치료하는데 사용될 수 있다. 이 유기체를 원하지 않는 단백질을 암호화하는 핵산의 사슬과 특이적으로 하이브리다이제이션될 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 접촉시켜야 한다. 이런 형태의 치료는 단세포 원핵 및 진핵 유기체로부터 다세포 진핵 유기체까지를 포함하는 다양한 유기체에서 수행될 수 있다. DNA-RNA 전사 또는 RNA-단백질 변역을 그의 유전적, 대사적 또는 세포 조절의 기초적인 부분으로 이용하는 임의의 유기체는 본 발명에 따른 치료 및(또는) 예방 치료의 영향을 받기 쉽다. 유사하게 분화된 유기체, 예컨대 세균, 효모, 원생동물, 조류, 모든 식물 및 온혈 동물을 포함하는 모든 고등 동물 형태가 치료될 수 있다. 또한 다세포 진핵 유기체의 각각의 세포도 치료될 수 있는데, 이들이 그의 세포 활성의 필수 부분으로서 DNA-RNA 전사 및 RNA-단백질 번역을 모두 포함하기 때문이다. 게다가 진핵 세포의 대부분의 세포소기관(예를 들면, 미토콘드리아 및 엽록체)도 또한 전사 및 번역 메커니즘을 포함한다. 그러므로 단세포, 세포군락 또는 세포소기관도 치료 또는 진단 올리고뉴클레오티드로 치료될 수 있는 유기체의 정의에 포함된다.
본 명세서에서 청구되는 합성 방법의 반응은 유기합성 분야의 숙련인에게 용이하게 이해될 수 있는 적합한 용매 중에서 수행되는데, 적합한 용매는 반응이 수행되는 온도, 즉 용매의 동결점 내지 용매의 비점의 범위일 수 있는 온도에서 출발물질(반응물), 중간체 또는 생성물과 실질적으로 반응되지 않는 임의의 용매이다. 주어진 반응은 1종의 용매 또는 1종 이상의 용매 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 특정 반응 단계에 따라서, 특정 반응 단계에 대한 적합한 용매를 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고머를 제조하는 방법은 용액상 및 고체 상 화학을 모두 포함한다. 대표적인 용액상 기술은 미국 특허 제 5,210,264 호에 기술되어 있는데, 이것은 본 발명의 양수인에게 양도되었으며, 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다. 대표적인 고체 상 기술은 표준 포스포르아미다이트 화학을 이용하는 DNA 및 RNA 합성에 전형적으로 사용되는 것들이다(예를 들면, 문헌 [Protocols For Oligonucleotides And Analogs, 아그로월, 에스.(Agrawal, S.) 편집, Humana Press, Totowa, NJ, 1993]을 참고하며, 이것은 참고문헌으로 본 명세서에 인용된다).
본 발명에 따른 고체 지지체는 고체 상 방법에 사용하기 적합한 것으로 일반적으로 알려져 있는 것들, 예를 들면 조절 기공 유리(CPG), 옥살릴 조절 기공 유리(예를 들면, 아룰(Alul) 등의 문헌 [Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527]을 참고하며, 이것은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다), TentaGel 지지체--아미노폴리에틸렌글리콜 유래 지지체(예를 들면, 라이트(Wright) 등의 문헌 [Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373]을 참고하며, 이것은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다) 및 Poros--폴리스티렌/디비닐벤젠의 공중합체를 포함한다.
하나의 특정한 합성 경로를 사용할 때, 고체 상 합성은 활성화 포스페이트 화합물로서 포스포르아미다이트를 이용한다. 이 기술에서, 포스포르아미다이트 단량체는 성장하는 올리고머 사슬의 자유 히드록실과 반응되어 중간체 포스파이트 화합물이 생성되며, 이것은 이어서 표준 방법을 사용해서 Pv상태로 산화된다. 이 기술은 보통 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 결합을 포함하는 몇몇 유형 결합의 합성에 사용된다.
전형적으로, 그러한 방법에서의 제 1 단계는 당업계에 공지된 표준 방법 및 절차를 사용하여 제 1 단량체 또는 보다 고급의 서브단위를 고체 지지체에 부착시키는 것이다. 고체 지지체는 고체 상 합성 방법에서 고체 상으로 작용할 수 있는 물질, 예컨대 카루더스(Caruthers)의 미국 특허 제 4,415,732호; 제 4,458,066 호; 제 4,500,707 호; 제 4,668,777 호; 제 4,973,679 호; 및 제 5,132,418 호; 및 코스터(Koster)의 미국 특허 제 4,725,677 호 및 제 Re. 34,069 호에 기술되어 있는 것들이다. 링커는 말단 뉴클레오티드 및 고체 지지체 사이에 선택적으로 위치한다. 링커는 당업계에 고체 상 합성 기술에서 최초 합성단위체 분자의 작용기(예를 들면, 히드록실기)에 고체 지지체를 연결하는 작용을 하는 짧은 분자로 알려져 있다. 적합한 링커는, 예를 들면 문헌 [Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, 에크스타인, 에프.(Ekstein, F.) 편집, IRL Press, N.Y., 1991, Chapter 1, page1-23]에 개시되어 있으며, 이것은 본 명세서에 참고문헌으로인용된다.
그 다음에 지지체 결합 단량체 또는 보다 고급의 합성단위체를 처리하여 자유 말단으로부터 보호기를 제거한다. 전형적으로 이것은 산에 의한 처리에 의해 수행된다. 고체 지지체 결합 단량체 또는 보다 고급의 올리고머를 그 다음에 개별적인 단량체 또는 보다 고급의 빌딩 블록(즉, 합성단위체)과 반응시켜서 포스파이트 또는 티오포스파이트 결합을 갖는 화합물을 형성한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 합성단위체는 무수 조건에서 활성화제, 예를 들면 1H-테트라졸, 5-(4-니트로페닐)-1H-테트라졸 또는 디이소프로필아미노 테트라졸리드 존재하에 반응된다.
본 발명은 보호 및 비보호 올리고뉴클레오티드에 의해 수행될 수 있다. "보호 올리고뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드의 잠재적 반응성기를 가역 화학 변형으로 변형시킨 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "보호기"는 본 명세서에서 트리메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 9-페닐크산텐-9-일 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 메시틸(2,4,6-트리메틸벤조일)에스테르, 벤조일 에스테르, t-부틸디페닐실릴 에테르, 트리페닐메틸(트리틸; Tr), S-t-부틸, S-p-부틸, S-p-니트로벤질 및 S-p-메톡시-벤질 및 프탈이미도기(예를 들면, 그린(Greene) 및 우트(Wut)의 문헌 [Protective Groups in Organic Synthesis, 2판, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참고한다)를 포함하는 것으로 사용되지만 이것으로 제한되는 것은 아니며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
올리고뉴클레오티드는 선택적으로 용액 중에 존재한다. 적합한 용매는 사용되는 반응 온도에서 시약, 중간체 또는 생성물과 실질적으로 반응하지 않는 임의의 용매를 포함하는 것으로 당업계 숙련인에게 잘 이해될 것이다. 임의의 다양한 용매가 사용될 수는 있지만, 용매는 바람직하게는 하기하는 바와 같이 응집제로서도 작용한다. 용액 중 올리고뉴클레오티드의 농도는 상당한 범위에서 변화될 수 있다. 예를 들면, 약 550 OD/mL 내지 약 4750 OD/mL 사이의 올리고뉴클레오티드 농도가 사용될 수 있다. 그러나 용액 중 올리고뉴클레오티드의 농도는 사용되는 용매 및 올리고뉴클레오티드의 성질을 포함하는 다양한 요인에 따를 수 있다. 특히, 용액 중 보호 올리고뉴클레오티드를 정제할 때, 용액 중에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 농도는 바람직하게는 550 OD/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 600 OD/mL 이상, 보다 더 바람직하게는 약 700 OD/mL 이상, 보다 더 바람직하게는 약 850 OD/mL 이상이다. 올리고뉴클레오티드가 용액 중에 존재하는 탈보호 올리고뉴클레오티드일 때, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 상기 용액 중에 약 2250 OD/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 2500 OD/mL 이상, 바람직하게는 약 3000OD/mL 이상, 보다 바람직하게는 약 4500 OD/mL 이상, 보다 더 바람직하게는 약 6500 OD/mL 이상, 보다 더 바람직하게는 약 7500 OD/mL 이상의 농도로 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "OD/mL"는 자외선(UV) 분광광도계를 사용하여 측정시 260nm 및 1cm 경로 길이에서의 흡광도를 지칭한다.
본 발명에 따른 용어 "응집제"는 올리고뉴클레오티드를 직접적으로 또는 올리고뉴클레오티드가 용액 중에 존재할 때 처리하는데 사용될 수 있으며 응집물 또는 고체를 형성하는 부분을 포함하는데, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기 적합한 응집제는 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로필 알콜 및 변성 알콜을 포함하는데, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드 응집물" 및 "응집물"은 물리적 방법에 의해 분리될 수 있는 크기와 질량을 갖는 올리고뉴클레오티드의 덩어리를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리하기 위한 물리적인 방법은 원심분리, 중력 침강 및 여과를 포함하는데, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "침전 증진제"는 침전에 이로운 형향을 미치는 화합물을 지칭한다. 한 실시태양에 있어서, 침전 증진제는 염을 포함한다. 침전 증진제로서 사용하기 적합한 염은 소듐 염(Na+), 리튬 염(Li+), 암모늄 염(NH4 +), 포타슘 염(K+), 마그네슘 염(Mg+), 세슘 염(Cs+) 및 아연 염(Zn+)을 포함한다. 유용한 소듐 염의 특정 예는 소듐 아세테이트(NaOAc) 또는 소듐 히드록사이드(NaOH)를 포함하는데, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 올리고뉴클레오티드를 응집제 및 침전 증진제와 반응시킨다. 형성된 정제된 올리고뉴클레오티드 생성물의 순도는 약 90％ 이상, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상이다. 생성된 올리고뉴클레오티드의 ％ 순도는 당업계 숙련인에게 공지된 기술, 예컨대 모세관 겔 전기영동 또는 질량 분광분석법을 사용하여 측정한다.
시약(즉, 올리고뉴클레오티드, 응집제, 침전 증진제 및(또는) 용매)의 온도, 시약의 첨가 순서, 올리고뉴클레오티드 농도 대 응집제 농도의 비는 각각 올리고뉴클레오티드 응집물의 형성이 최적화되도록 선택될 수 있다.
시약의 온도는 광범위하게 변화될 수 있다. 예를 들면, 1종 이상의 시약을 냉장시킬 수 있다. 그러나 시약이 주위 온도 또는 실온에서 사용될 때에도 본 발명에 의해 분리되는 올리고뉴클레오티드의 충분히 높은 수율이 달성될 수 있다. 따라서, 고가의 냉장기 사용 및 그와 관련된 시간 제약을 피하기 위해, 시약을 바람직하게 실온(바람직하게는 약 15℃ 내지 약 25℃, 보다 바람직하게는 약 18℃ 내지 약 20℃)에서 사용한다.
게다가, 시약이 혼합되는 순서가 변화될 수 있다. 특히 시약을 다음과 같이 혼합할 수 있다: (a) 올리고뉴클레오티드를 응집제로 처리하기전에 침전 증진제로 처리할 수 있다; (b) 올리고뉴클레오티드를 침전 증진제로 처리하기전에 응집제로 처리할 수 있다; (c) 올리고뉴클레오티드를 침전 증진제 및 응집제의 혼합물로 처리할 수 있다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드를 응집제로 처리하기전에 침전 증진제로 처리한다.
올리고뉴클레오티드 농도 대 응집제 농도의 비도 또한 변화될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드가 용액 중에 존재할 때, 올리고뉴클레오티드 용액 대 응집제의 부피비는 바람직하게는 1부 용액 대 약 1.5부 이상, 바람직하게는 약 2부 이상, 보다 더 바람직하게는 약 2.5부 이상의 응집제이다. 약 1:2.5를 초과하는 용액 대 응집제 비가 이용될 수는 있지만, 이 비는 바람직하게는 1부 용액 대 약 4.5부 미만의 응집제 및 보다 바람직하게는 약 4부 미만의 응집제로 유지되는데, 그 이상으로 응집제를 사용하면 비용때문에 얻어지는 이익의 의미가 없어진다.
일단 올리고뉴클레오티드 응집물이 형성되면, 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 분리된 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 응집물의 크기 및 질량으로 인해, 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리하기 위한 물리적인 방법이 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드를 고속 원심분리, 저속(예를 들면, 바람직하게는 분당 약 3000 회전 미만, 보다 바람직하게는 약 2500회전 미만) 원심분리, 중력 침강 및(또는) 여과에 의해 용액으로부터 분리할 수 있다.
사용되는 특정한 분리 방법은 반응 조건(예를 들면, 사용되는 응집제 및(또는) 올리고뉴클레오티드 용액 대 응집제 농도의 비)의 선택에 어느 정도 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 원심분리 또는 중력 침강이 사용될 때, 올리고뉴클레오티드를 바람직하게는 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 5부의 응집제의 부피비로 응집제로 처리한다. 보다 구체적으로 에탄올로 처리된 올리고뉴클레오티드를 분리하기 위해 원심분리가 사용될 때, 올리고뉴클레오티드 용액 대 응집제의 부피비는 바람직하게는 1부의 올리고뉴클레오티드 용액 대 약 2 내지 약 4부의 응집제이다. 유사하게, 1-프로판올, 이소프로필 알콜 및(또는) 변성 에탄올로 처리된 올리고뉴클레오티드를 분리하는데 원심분리가 사용될 때, 올리고뉴클레오티드 용액 대 응집제의 부피비는 바람직하게는 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 3부의 응집제이다. 에탄올로 처리된 올리고뉴클레오티드를 분리하는데 중력 침강이 사용될 때, 올리고뉴클레오티드 용액 대 응집제의 부피비는 바람직하게는 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 2 내지 약 4.5부의 응집제이다. 게다가, 중력 침강이 1-프로판올, 이소프로필알콜 및(또는) 변성 에탄올로 처리된 올리고뉴클레오티드에 사용될 때, 올리고뉴클레오티드 용액 대 응집제의 부피비는 바람직하게는 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 3부의 응집제이다.
본 발명의 방법이 올리고뉴클레오티드 제조 및(또는) 처리 방법의 일부분으로 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 방법을 다양한 전- 및(또는) 후-가공 단계와 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드를 응집제 및 침전 증진제와 반응시키기전에 보호, 탈보호 및(또는) 재구성할 수 있다. 게다가, 분리된 올리고뉴클레오티드를 추가 사용 전에 재구성할 수 있다. 또한 다중 침전 단계가 순서대로 이용될 수 있다는 것도 이해될 것이다.
본 명세서에서 언급된 상기 각각의 특허, 출원, 공고 및 기타 출판 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.
당업계 숙련인은 본 발명의 바람직한 실시태양이 다양하게 변화 및 변형될 수 있으며 상기 변화 및 변형이 본 발명의 취지를 벗어나지 않는다는 것을 이해할 것이다. 그러므로 첨부된 청구의 범위는 본 발명의 취지 및 범위에 속하는 상기 해당 변형을 모두 포함할 것이다.
본 발명 방법의 효능을 하기 실시예에서 설명한다. 특히, 본 실시예는 용매 온도, 용매 대 올리고뉴클레오티드의 비, 성분 첨가 순서, 올리고뉴클레오티드 농도 및 용매 유형을 포함하는 올리고뉴클레오티드 침전 성질에 영향을 미치는 요인을 변화시킬 때의 영향을 보여준다.
올리고뉴클레오티드의 침전에 사용되는 용매는 에탄올, 5％ 메탄올로 변성된 에탄올, 1-프로판올 및 이소프로판올(IPA)이었다. 3.0M NaOAc를 사용하여 DMT-결실 올리고뉴클레오티드의 침전 도중에 상 변화를 유도했다. 서열, 퓨린 대 피리미딘 비 및 화학적 변형이 변화되는 올리고뉴클레오티드를 사용해서 실시예를 수행했다. 사용되는 올리고뉴클레오티드를 표 1에 기재했다. 예를 들면 올리고뉴클레오티드 6<SEQ ID NO:6>(ISIS 104838)는 10-염기 2'-데옥시 갭을 포함하는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형 포스포로티오에이트이며, 또한 5-10-5 MOE 갭머(gapmer)로도 지칭된다. 올리고뉴클레오티드 6(ISIS 104838)을 제조하는데 사용되는 방법은 고체 상 유기 합성, 제조 역상 크로마토그래피 정제, 산성 탈보호, 고체-액체 분리 및 진공 건조를 약품 물질을 제조하기 위해 이용하는 다단계 방법이었다.
올리고뉴클레오티드 No. ISIS No. 서열
1 5132 TCCCGCCTGTGACATGCATT<SEQ. ID NO.1>
2 2302 GCCCAAGCTGGCATCCGTCA<SEQ. ID NO.2>
3 14803 GTGCTCATGGTGCACGGTC<SEQ. ID NO.3>
4 2503 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG<SEQ. ID NO.4>
5 3521 GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA<SEQ. ID NO.5>
6 104838 GCTGATTAGAGAGAGGTCCC<SEQ. ID NO.6>
7 107248 CTGAGTCTGTTTTCCATTCT<SEQ. ID NO.7>
8 113715 GCTCCTTCCACTGATCCTGC<SEQ. ID NO.8>
올리고뉴클레오티드 6(ISIS 104838)의 화학적 합성은 포스포르아미다이트 화학을 이용하며 한 말단이 고체 지지체 매트릭스에 공유적으로 결합된 연장되는 중합체에 활성화 단량체를 연속적으로 커플링하는 것을 포함한다. 고체 상 방법은 고체 지지체의 간단한 용매 세척에 의해 합성의 각 단계에서의 반응 생성물을 용이하게 정제할 수 있도록 했다. 20-mer의 합성은 중간체 올리고뉴클레오티드를 분리하지 않는 밀봉된 반응기 중에서 수행되었다. 화학 합성 방법은 특정 부피의 시약 및 용매를 고체 상 반응기로 그리고 고체 상 반응기로부터 전달했다. 컴퓨터로 조절되는 밸브 및 펌프가 시약 및 용매의 유동을 조절했다.
도 1은 3' 말단에서 5'말단으로 순차적으로 조립되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 지지체 결합 분자의 5'말단을 톨루엔 중 디클로로아세트산으로 탈보호하고(단계 1), 지지체 결합 분자를 도입되는 활성화 포스포르아미다이트 단량체와 축합하고(단계 2), 생성된 포스파이트 트리에스테르를 티오포스페이트 트리에스테르로 산화적으로 황화시키고(단계 3), 임의의 미반응 히드록실기를 아실화에 의해 캡핑하여 다음으로 도입되는 단량체와의 비순차적 커플링을 방지하는 것에 의해 올리고뉴클레오티드를 조립했다. 이러한 일련의 단계를 연속적인 커플링 반응(단계 5)을 위해 반복했다. O-시아노에틸보호기를 제거하고(단계 6) 그리고 그 다음에 올리고뉴클레오티드 6(ISIS 104838)을 고체 지지체로부터 엑소시클릭 아민 탈호보(단계 7)와 동시에 분해했다. 최종 가공은 제조 역상 HPLC(단계 8), 5'-O-4,4'-디메톡시트리틸 에테르의 산성 탈보호(단계 9), 생성물 분리(단계 10) 및 약품 물질의 진공 건조(단계 11)을 포함했다.
도 3 내지 6은 약품 물질을 합성하기 위해 적절한 포스포르아미다이트를 사용하여 합성 반응(단계 1-4)을 반복하는 제조 반응식을 설명한다. 이 방법에서 사용될 수 있는 포스포르아미다이트의 예를 도 2에 나타낸다.
도 3은 5'-O-디메톡시트리틸기가 먼저 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오시드로부터 제거된 다음에 이어서 2'-데옥시 또는 2'-메톡시에틸리보 뉴클레오티드 올리고머로부터, 화학 합성의 진행에 따라서, 10％ v/v의 톨루엔 중 디클로로아세트산(DCA)의 용액으로의 처리에 의해 제거되는 디메톡시트리틸 탈보호 단계(도 1의 단계 1)를 기술한다. 이것에 의해 부분적으로 보호된 지지체 결합 분자 및 비교적 안정한 카르보양이온을 얻었다. 과량의 산 및 분리된 디메톡시트리틸 카르보양이온을 아세토니트릴 세척에 의해 제거했다.
완전 사이클의 제 2 단계는 지지체 결합 분자의 새롭게 해방된 5'-히드록실과 활성화 2'-데옥시 또는 2'-메톡시에틸 변형 포르포르아미다이트 단량체 사이의 축합반응이었다(도 1의 단계 2). 포스포르아미다이트의 아세토니트릴 용액과 과량의 약산 1-H-테트라졸을 혼합해서 활성화를 자체적으로 달성했다. 형성된 테트라졸리드가 신속하게 지지체 결합 분자의 5'-히드록실기와 반응되어 포스파이트 트리에스테르 및 1-H-테트라졸의 등가물이 양적 수율에 근접하여 얻어졌다. 컬럼 반응기로부터 과량의 시약 및 부산물을 아세토니트릴 세척에 의해 제거했다.
도 4는 아세토니트릴:3-피콜린의 1:1 혼합물 중 페닐아세틸 디술피드(PADS)의 0.2M 용액을 반응 컬럼에 전달하는 것에 의한 포스파이트 트리에스테르의 황화반응을 설명한다. 이것에 의해 상응하는 포스포로티오에이트 트리에스테르가 형성되었다. 지지체 결합 물질을 아세토니트릴로 세척해서 과량의 시약 및 부산물을 제거했다.
도 5는 주어진 임의의 사이클 중 최종 반응을 기술하는데, 이것은 아세토니트릴 중 아세트산 무수물 및 피리딘/아세토니트릴 중 N-메틸이미다졸의 혼합물을공급해서 임의의 미반응 5'-히드록실기를 아세틸화하는 캡핑 단계였다. 생성된 5'-O-아세테이트는 합성의 나머지 기간 동안 최종 가암모니아분해 도중에 분해될 때까지 안정했다. 과량의 시약을 아세토니트릴 세척에 의해 제거했다.
5'-히드록실 탈보호, 커플링, 황화 반응 및 캡핑의 순차적 사이클이 19회 수행된 후에, 도 6은 올리고뉴클레오티드가 여전히 고체 지지체에 결합되어 있으면서, 아세토니트릴 중 트리에틸아민의 처리에 의해 뉴클레오티드간 결합으로부터 시아노에틸 보호기를 제거해서 포스포로티오에이트 디에스테르를 제조하는 것을 보여준다. 이것에 의해 염기 매개 β-제거 도중에 형성된 아크릴로니트릴이 제거되었다. 이들 조건하에서, 형성된 아크릴로니트릴은 존재하는 티미딘 잔기와 반응하지 않았으며 지지체 결합 물질로부터 간단히 세척되었다. 승온에서의 암모늄 히드록사이드로의 배양에 의해 분해 및 염기 탈보호를 완결했다. 지지체를 여과에 의해 제거하고 에탄올 및 물의 혼합물로 세척했다. 합한 여액 및 세척물을 농축하고, 조 5'-DMT 보호 올리고뉴클레오티드 6(ISID 104838)을 역상(RP) HPLC에 의해 정제했다.
정제된 올리고뉴클레이티드를 제조하는 한 방법에 있어서, 조, 5'-보호 생성물의 크로마토그래피 정제를 RP-HPLC에 의해 수행했다. RP-HPLC 단계는 불완전한 단량체 커플링(단계 2)의 결과로 형성된 DMT-결손 실패 서열을 제거했다. 이 방법은 보다 짧은 DMT-결손 실패 서열로부터 온길이의 DMT 존재 생성물을 분리하는데 있어서 효과적이었다. 이러한 효과는 온길이 DMT-존재 생성물 및 보다 짧은 DMT-결손 실패 서열에 의해 보여지는 소수성에서의 큰 차이로 인한 것이었다. RP-HPLC단계를 유동 특성, 효율, 내구성 및 고 하중 용량에 의해 선택된 Waters HC-C18HA "Bonda-Pak" 옥타데실실릴 실리카(37-55㎛, 125Å) 방사상 압축 컬럼을 사용하여 수행했다. 이 방사상 압축 컬럼을 Biotage Kiloprep 100 HPLC 시스템을 사용하여 물/메탄올/2.5M 소듐 아세테이트의 혼합물로 평형화시켰다.
출발 용매 혼합물 중 조 올리고뉴클레오티드 6(ISIS 104838)의 용액을 컬럼에 충전하고 컬럼을 소듐 아세테이트 완충액(pH 7.2) 중 메탄올의 증가되는 단계적 구배로 용출시켰다. 용출 프로파일을 연속 UV 흡수 분광광도분석법에 의해 모니터링했다. DMT-존재 생성물 피크를 분획으로 수집하고 분석했다. 특성에 부합하는 분획을 함께 합하고 ％-면적 온길이에 대해 분석했다. 주요 생성물을 포함하는 RP-HPLC 용출액을 침전 탱크로 옮기로 0.01M 소듐 아세테이트(pH 3)에 용해시켰다. 생성 용액의 pH를 측정하고 측정치를 기준으로 해서, 필요한 탈트리틸화 시간을 계산했다. 소정 시간 동안의 실온에서의 배양 후에, 탈트리틸화 올리고뉴클레오티드를 침전시키고 생성 침전물을 분리했다. 올리고뉴클레이티드 1-5, 7 및 8을 유사한 방법으로 제조했다.
정제된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 대안의 방법에서, 실온 에탄올의 필요한 양을 계산하고 침전 탱크에 이동하고 교반을 시작했다. 역상 HPLC 정제로부터의 트리틸 용출 물질을 침전 탱크 중 에탄올로 옮겼다. 이것은 올리고뉴클레이티드를 침전시켰으며 원하지 않는 HPLC 이동상 성분(예를 들면, 메탄올 및 염)은 원심분리 도중에 폐기 흐름으로 피막으로 형성되었다. 저속 원심분리를 약 3000RPM의 속도에서 시작하고 연동 펌프를 3000mL/분 이하의 유속에서 사용하여 침전된 올리고뉴클레오티드를 원심분리기로 펌프로 퍼내었다. 원심분리력 때문에, 액체가 걷혀지면서 폐기물 흐름으로 보내지고, 올리고뉴클레오티드가 보울의 표면에 부착되었다. 원심분리를 완결한 후에, 원심분리 보울 중의 침전된 올리고뉴클레오티드를 아르곤 기체 흐름을 사용하여 건조시켰다. 보울 중의 올리고뉴클레오티드에 계산된 양의 물을 첨가하고 물과 올리고뉴클레오티드 케익과의 접촉을 최대화하기 위해 원심분리 RPM을 조정해서 재구성했다. 탈트리틸화 반응을 위해 재구성 물질을 침전 탱크로 다시 옮겼다.
계산된 양의 산성화 용액인 0.01M NaOAc(pH=2.9 내지 3.1)를 올리고뉴클레오티드 용액을 포함하는 탱크에 첨가한 다음, 반응을 측정된 pH를 근거로 하여 계산된 시간 간격 동안 진행시켰다. 계산된 양의 3.0M NaOAc(pH=8.0)를 첨가해서 탈트리틸화 반응을 정지시켰다.
다음에, 계산된 양의 실온 에탄올을 첨가하는데, 이것에 의해 올리고뉴클레오티드는 침전되지만, 현재 분해된 5'-디메톡시트리틸기는 용액 중에 잔류하며, 이것은 폐기 흐름으로 향하게 된다. 원심분리를 약 3000RPM의 속도에서 수행했으며 유동 펌프를 3000mL/분 이하의 유속에서 사용하여 침전된 올리고뉴클레오티드를 원심분리기로 보냈다. 원심분리를 완결한 후에, 보울 중의 올리고뉴클레오티드에 계산된 양의 물을 첨가하고 물과 올리고뉴클레오티드 케익의 접촉이 최대화되도록 원심분리 RPM을 조정하면서 재구성했다.
재구성 물질을 적절한 크기의 용기로 이동시키는데, 여기에서 재구성 물질의 pH를 빙초산 및(또는) 1.0N NaOH로 7.2-7.5로 조정했다. 계산된 양의 3.0M NaOAc용액을 pH-조정 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가했다. 계산된 양의 실온 에탄올을 침전 탱크에 첨가했다. 탈트리틸화 용액/NaOAc 혼합물을 에탄올에 첨가했는데, 이것에 의해 올리고뉴클레오티드가 침전되고 pH-조정 단계 중에 형성된 염은 용액 중에 존재하게 되며, 이것은 폐기물 흐름을 향하게 된다.
원심분리를 약 3000RPM의 속도에서 시작하고 연동 펌프를 3000mL/분 이하의 유속에서 사용하여 침전된 올리고뉴클레오티드를 원심분리기로 펌프로 퍼내었다. 원심분리를 완결한 후에, 원심분리 보울 중의 침전된 올리고뉴클레오티드를 아르곤 기체 흐름을 사용하여 건조시켰다. 보울 중의 올리고뉴클레오티드에 계산된 양의 물을 첨가하고 물과 올리고뉴클레오티드 케익과의 접촉을 최대화하기 위해 원심분리 RPM을 조정해서 재구성했다. 재구성 물질을 적절한 용기에 여과 및 동결건조를 위해 이동시켰다.
올리고뉴클레오티드를 중력 침강, 원심분리 또는 여과에 의해 분리했다. 벤치 탑(Bench top) 중력 침강을 10mL 및 50mL 원추형 원심분리관을 사용하여 수행했다. 소규모, 스핀-시험관 실험을 10 및 25mL 원심분리관이 장착될 수 있는 SLA 3000 회전기가 장착된 Sorvall(등록상표) 고정각 회전기 원심분리기(이. 아이. 듀퐁 디 네무아 앤드 캄파니(E. I. DuPont de Nemours & Company)) 중에서 수행했다. 최대 용량 250g의 Carr Powerfuge Pilot를 사용해서 추가 데이터를 얻었다. 20kg 용량의 소규모 Robatel, Slab 320 침강 원심분리기를 사용하여 비례축소가능성을 입증했다. 진공 여과 실험을 10㎛ 또는 20㎛의 316 스테인리스 스틸 필터가 장착된 43mm, 100mm 및 213mm Buchner 깔때기 중에서 수행했다. 보다 큰 규모의 여과실험은 10㎛ 바닥 프릿이 장착된 Pharmacia 미세 라인 350 컬럼을 이용했다. 1/8 hp Gast 진공 펌프를 사용해서 여과 도중의 유동을 보조했다.
건조 실험을 다음 중 하나에서 수행했다: NAPCO 진공 오븐, Leybold 동결건조기, LabLine 오븐 또는 기체 주입구가 장착된 주문 설계 수-자켓 진공 필터. 건조된 분말을 기체 크로마토그래피에 의해 잔류 에탄올 함량에 대해 분석했다.
용액 중 올리고뉴클레오티드의 백분율은 자외선(UV) 분광광도계에 의해 측정했다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "OD"는 1cm 경로 길이를 사용하는 260nm에서의 흡광도를 지칭한다. 특정한 시험 변수에 따라서 액체 상 중에 잔류하는 현탁된 고체 또는 올리고뉴클레오티드의 백분율에 의해 강조된 요인의 효과를 평가했다. 용액 중에 적은 양의 생성물이 잔류하도록 하는 변수가 효과적인 것으로 생각되었다.
실시예 1: 용매 온도의 온길이, 디메톡시트리틸(DMT) 보호 분획의 침전에 대한 영향
3mL의 1263 OD/mL의 초기 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 No.2<SEQ. ID NO:2>(ISIS 2302)를 3배 부피의 차가운(-20℃) 또는 주위 온도(18-20℃)의 에탄올, 1-프로판올, 이소프로판올 또는 변성 에탄올(용매) 중으로 침전시켰다. 생성 혼합물을 잠깐 교반시킨 다음 1.5시간 동안 중력 침강시키거나 2,000RPM의 속도로 2분간 원심분리시켰다. 액체 상의 분액(1mL)을 자외선(UV) 분광광도계를 사용하여 액체 상 중 올리고뉴클레오티드 농도에 대해 분석했다. 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정했다. 차가운 그리고 주위온도 용매로 처리한 후의 중력 침강 및 저속 원심분리의 결과를 각각 표 2 및 3에 기재했다.
온도 용매 초기 농도(OD/mL) 액체 상 중 농도(OD/mL) 액체 상 중 ％ 올리고
-20℃ 에탄올 1263 60.6 4.8
주위 에탄올 1263 3.7 0.29
-20℃ 1-프로판올 1263 65.7 5.2
주위 1-프로판올 1263 3.9 0.31
-20℃ IPA 1263 61.2 4.9
주위 IPA 1263 3.2 0.25
-20℃ 변성 에탄올 1263 68.2 5.4
주위 변성 에탄올 1263 3.9 0.31
온도 용매 초기 농도(OD/mL) 액체 상 중농도(OD/mL) 액체 상 중 ％ 올리고
-20℃ 에탄올 2118 59.3 2.8
주위 에탄올 2118 4.7 0.22
-20℃ 1-프로판올 2118 69.9 3.3
주위 1-프로판올 2118 4.7 0.22
-20℃ IPA 2118 89 4.2
주위 IPA 2118 4.0 0.19
-20℃ 변성 에탄올 2118 93.2 4.4
주위 변성 에탄올 2118 5.5 0.26
표 2의 데이터는, 차가운 용매가 사용될 때 용액 상 중에 잔류하는 용해된 올리고뉴클레오티드는 총 4.8 내지 5.4％이었다는 것을 보여준다. 검사를 해보면, 차가운 용매로 처리된 올리고뉴클레오티드는 균일하게 분산된 미세한 침전물을 형성하는 것으로 관찰되었으며, 이것은 액체 상 중에 현탁된 상태로 잔류하여 1.5시간 후에도 용매로부터 침강되지 않았다. 대조적으로 주위 온도 용매는 신속하게 침강되는 큰 응집물을 즉시 형성하므로 액체 상은 투명한 채로 남아있었다. 주위온도 처리 올리고뉴클레오티드의 상청액 중 생성물 보유율은 시험되는 각 용매에 대해 0.25 내지 0.31％이었다.
표 3의 데이터도 유사하게 차가운 온도 침전에 의해 생성된 슬러리의 액체 상 중에 2.8％-4.8％의 현탁된 고체가 잔류하는 반면에, 주위 온도 알콜을 사용할 때는 0.3％ 미만의 생성물이 잔류했다는 것을 보여준다. 동일한 양의 올리고뉴클레오티드 No.4<SEQ. ID No.4>(ISIS 2503)를 차가운 온도 또는 주위 온도에서 침전시킨 다음 저속(2000RPM)에서 원심분리하거나 침강에 의해 분리시키는 유사한 실험에서 유사한 결과를 얻었다.
실시예 2: 용매 비의 DMT 보호 온길이 분획에 대한 영향
1785 OD/mL의 초기 농도를 갖는 DMT 보호 올리고뉴클레오티드 No.4<SEQ. ID No.4>(ISIS 2503)의 3mL 분액을 1-4.5배 부피의 주위 온도 에탄올 중에서 침전시켰다. 생성 혼합물을 1분간 잠깐 진탕한 다음 1.5시간 동안 침강시켰다. 침강 후에, 대략 1mL의 용액 상을 수집하고 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 농도 및 백분율(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정했다. 결과를 표 4에 기재했다.
올리고뉴클레오티드:용매 비 용매 초기 농도(OD/mL) 액체 상 중 농도(OD/mL) 액체 상 중 ％ 올리고
1:1 에탄올 1785 --- ---
1:1.5 에탄올 1785 --- ---
1:2 에탄올 1785 8.9 0.5
1:2.5 에탄올 1785 10.4 0.58
1:3 에탄올 1785 8.9 0.5
1:3.5 에탄올 1785 10.4 0.58
1:4 에탄올 1785 12.0 0.67
1:4.5 에탄올 1785 12.0 0.67
1:5 에탄올 1785 13.6 0.76
1:3 1-프로판올 1785 10.4 0.58
1:3 IPA 1785 8.9 0.5
1:3 변성 에탄올 1785 12.0 0.67
표 4의 데이터는 올리고뉴클레오티드 부피의 2.5배 내지 3.5배 부피의 에탄올에 대한 용액 상 올리고뉴클레오티드의 함량은 0.58％ 미만이었다는 것을 보여준다. 액체 상 중에 잔류하는 생성물이 약간 증가되는 것으로 관찰되었지만, 올리고뉴클레오티드 부피의 4배, 4.5배 및 5배 부피의 에탄올은 침전에 유의한 추가적인 영향을 미치지 않았다. 1-프로판올 및 IPA를 사용할 때 결과는 에탄올에 대해 관찰된 결과와 거의 동일했다. 변성 알콜에 의한 결과는 액체 상 중 올리고뉴클레오티드의 백분율이 약간 상승되었다는 것을 나타내었다. 또한 1 및 1.5배의 에탄올 부피는 완전한 침전을 유도하기에는 불충분한 반면에, 올리고뉴클레오티드 부피의 2배 부피의 에탄올은 즉시 침강되기 시작하는 큰 응집물을 생성시키는 것으로 관찰되었다. 그러나 응집물은 신속하게 젤라틴화되며 교반에 의해 재현탁될 수 없었다. 올리고뉴클레오티드 부피의 2.5배 내지 3.5배 부피에 의해 유도된 침전물 사이에 현저한 차이점은 관찰되지 않았다. 게다가, 침강 도중에 형성된 응집물은 약한 교반에 의해 용이하게 재현탁되었다.
슬러리를 Sorvall(등록상표) 원심분리기로 신속하게 옮기고 2000RPM에서 2분간 원심분리한 것을 제외하고는 상기 프로토콜을 반복했다. 원심분리 후에 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 양(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정하고 하기 표 5에 기재했다.
올리고뉴클레오티드:용매 비 용매 초기 농도(OD/mL) 액체 상 중농도(OD/mL) 액체 상 중 ％ 올리고
1:1 에탄올 1785 --- ---
1:1.5 에탄올 1785 --- ---
1:2 에탄올 1785 5.0 0.28
1:2.5 에탄올 1785 3.9 0.22
1:3 에탄올 1785 3.2 0.18
1:3.5 에탄올 1785 4.6 0.26
1:4 에탄올 1785 4.1 0.23
1:4.5 에탄올 1785 9.8 0.55
1:5 에탄올 1785 11.6 0.65
1:3 1-프로판올 1785 4.3 0.24
1:3 IPA 1785 3.6 0.20
1:3 변성 에탄올 1785 3.4 0.19
표 5의 데이터는 올리고뉴클레오티드 부피의 약 2.5배 부피의 과량으로 에탄올을 사용했을때 유의한 이득이 없었다는 것을 보여준다. 실제로 원심분리 후에, 올리고뉴클레오티드 부피의 약 4.5배 과량의 부피로 처리한 후의 용액 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드 양은 약간 증가되었다. 1-프로판올, IPA 및 변성 알콜을 사용할 때, 에탄올을 사용할 때에 비하여 결과가 약간 개선되었다.
실시예 3: DMT-보호 온길이 올리고뉴클레오티드 농도의 침전 및 여과에 대한 영향.
적은 부피의 DMT-보호 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 No. 2 및4<SEQ. ID. NO:2; SEQ. ID. NO:4>(ISIS 2302; ISIS 2503)의 제조로부터 얻고 다음과 같이 시험했다: 3mL의 올리고뉴클레오티드를 1분간 교반하면서 3배 부피의 주위 온도 에탄올 중에 침전시켰다. 슬러리의 성질을 육안 검사에 의해 측정하고 생성 슬러리를 5.5cm, Whatman No. 4 필터가 장착된 작은 Buchner 깔때기를 통해 진공여과했다. 슬러리에 그의 여과성에 대한 등급(A-D)을 부여했다. 제조된 슬러리가 필터에 잔류할 수 있다는 것을 인정하고, 적은 부피의 여액을 수집하고 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴크레오티드의 백분율(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정했다. 결과를 표 6에 기재했다.
SEQ. ID NO. ISIS # 초기 농도(OD/mL) 용매 침강물 성질 여과성* 액체 상 중 ％ 올리고
4 CA2503-007 G1 291 에탄올 점착성 A ---
4 CA2503-007 G2 344 에탄올 연질 A ---
4 CA2503-007 G4 365 에탄올 연질 A ---
4 CA2503-007 G6 392 에탄올 연질 A ---
4 CA2503-007 G7 426 에탄올 연질 A ---
4 CA2503-007 G9 689 에탄올 과립 C 0.3
2 CA2302-018 G10 706 에탄올 반-부서짐 D 0.2
2 CA2302-018 G11 573 에탄올 과립 B 0.5
2 CA2302-018 G12 733 에탄올 부서짐 B 0.3
2 CA2302-018 G13 888 에탄올 부서짐 D 0.2
2 CA2302-018 G14 384 에탄올 연질 A ---
2 CA2302-018 G15 620 에탄올 부서짐 C 0.4
2 CA2302-018 G17 561 에탄올 과립 B 0.5
2 CA2302-018 G13 888 1-프로판올 부서짐 D 0.3
4 CA2503-007 G9 689 IPA 반-부서짐 C 0.2
4 CA2503-007 G9 689 변성 에탄올 반-부서짐 C 0.3
*A=여과할 수 없었다. B=부분적으로 여과되었다. C=필터 위에 생성물이 잔류했다. D=우수한 유동 속도로 필터 위에 생성물이 잔류했다.
291, 344, 365, 384, 392 및 426 OD/mL의 DMT-보호 용출액 농도가 침전 도중에 큰 응집물을 생성시켰다. 그러나, 응집물은 여과가 불가능하도록 필터 막 표면을 가로질러서 연성 젤라틴 필름을 형성했다. 561, 573 및 689 OD/mL의 DMT-보호 용출액 농도는 침전시에 반경질 과립 응집물을 생성시켰으며, 이것은 보다 더 천천히 여과되었다. 용출액 농도가 706 OD/mL 이상으로 상승되면, 응집물은 건조하고 부서지기 쉽게 되었다. 여과 유속은 이들 부서지기 쉬운 응집물이 액체 상으로부터 용이하게 분리될 수 있다는 것을 나타내었다. 분석은 0.3％ 미만의 생성물이 여액 폐기물 중에 잔류한다는 것을 나타내었다. 주위 온도 1-프로판올, IPA 및 변성 에탄올을 사용하는 방법은 에탄올에 의해 얻어진 결과와 유사한 결과를 나타내었다.
실시예 4: 용매 온도의 온길이 DMT-결여 올리고뉴클레오티드 침전에 대한 영향.
탈트리틸화 온길이 올리고뉴클레오티드 No.1 및 2<SEQ. ID NO:1; SEQ. ID NO:2>(ISIS 5132 및 ISIS 2302)(25mL)를 3배 부피의 에탄올, 1-프로판올, IPA 및 변성 알콜 중에서 -20℃ 및 주위 온도(18-20℃)에서 침전시켰다. 생성 슬러리를 잠깐동안 교반하고 1.5시간 동안 침전시켰다. 침강 시간이 지난 후에 용액 상의 1mL 분액을 추출하고 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정했다. 결과를 표 7에 기재했다.
SEQ.ID NO. ISIS # 용매 온도 초기농도(OD/mL) 액체 상 중 농도(OD/mL) 액체 상 중％ 올리고
1 RA5132-013 에탄올 -20℃ 54,380 2,400 4.2
2 CA2302-018 에탄올 -20℃ 55,220 2,800 5.0
1 RA5132-013 에탄올 주위 54,380 178 0.32
2 CA2302-018 에탄올 주위 55,220 185 0.33
1 RA5132-013 1-프로판올 -20℃ 54,380 2,920 5.4
2 CA2302-018 1-프로판올 -20℃ 55,220 3,229 5.8
1 RA5132-013 1-프로판올 주위 54,380 165 0.3
2 CA2302-018 1-프로판올 주위 55,220 142 0.26
1 RA5132-013 IPA -20℃ 54,380 2,990 5.5
2 CA2302-018 IPA -20℃ 55,220 2,650 4.8
1 RA5132-013 IPA 주위 54,380 154 0.28
2 CA2302-018 IPA 주위 55,220 144 0.26
1 RA5132-013 변성 에탄올 -20℃ 54,380 2,770 5.1
2 CA2302-018 변성 에탄올 -20℃ 55,220 2,985 5.4
1 RA5132-013 변성 에탄올 주위 54,380 156 0.29
2 CA2302-018 변성 에탄올 주위 55,220 177 0.32
표 7의 데이터는 각각의 알콜이 사용되었을때 결과가 일정했다는 것을 보여준다. 차가운 온도 침전은 매우 미세한 균일하게 분산된 과립을 생성시키는데, 그 중 4.2-5.8％가 침강 후에 용액 상 중에 잔류했다. 그러나 주위 온도 침전은 신속하게 침강되는 큰 응집물을 즉시 형성했으며, 생성물의 0.26 내지 0.33％가 침강 시간 후에 용액 상 중에 잔류했다. 이것은 주위 온도 용매가 사용될 때 생성물 손실의 90％가 감소되는 것에 해당된다.
침전 후에, 관을 2000rpm에서 2분간 원심분리하는 것을 제외하고는 상기 프로토콜을 반복했다. 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정했다. 결과를 표 8에 기재했다.
SEQ.ID NO. ISIS # 용매 온도 초기농도(OD/mL) 액체 상 중농도(OD/mL) 액체 상 중％ 올리고
1 RA5132-013 에탄올 -20℃ 54,380 1,950 3.5
2 CA2302-018 에탄올 -20℃ 55,220 1,600 2.8
1 RA5132-013 에탄올 주위 54,380 140 0.25
2 CA2302-018 에탄올 주위 55,220 133 0.24
1 RA5132-018 1-프로판올 -20℃ 54,380 2,200 4.0
2 CA2302-018 1-프로판올 -20℃ 55,220 1,955 3.5
1 RA5132-013 1-프로판올 주위 54,380 122 0.22
2 CA2302-018 1-프로판올 주위 55,220 133 0.24
1 RA5132-013 IPA -20℃ 54,380 2,019 3.7
2 CA2302-018 IPA -20℃ 55,220 2,215 4.0
1 RA5132-013 IPA 주위 54,380 126 0.24
2 CA2302-018 IPA 주위 55,220 128 0.23
1 RA5132-013 변성 에탄올 -20℃ 54,380 2,010 3.6
2 CA2302-018 변성 에탄올 -20℃ 55,220 1,966 3.6
1 RA5132-013 변성 에탄올 주위 54,380 127 0.23
2 CA2302-018 변성 에탄올 주위 55,220 118 0.21
표 8의 데이터는 용매에 의해 -20℃에서 수행되는 침전이 액체 상 중에 2.8-4.0％의 올리고뉴클레오티드를 잔류시켰다는 것을 보여주었다. 침전이 주위 온도(18-21℃) 용매로 수행될 때, 생성물의 0.21-0.25％가 액체 상 중에 잔류했다.
실시예 5: 용매 비의 온길이 DMT-결여 올리고뉴클레오티드 침전에 대한 영향.
2종의 올리고뉴클레오티드 No.1 및 2<SEQ. ID NO:1; SEQ. ID NO:2>(ISIS 5132 및 ISIS 2302)(25mL)를 1 내지 5배 부피의 에탄올, 1-프로판올, IPA 또는 변성 에탄올 중에서 침전시키고, 25초간 보텍스하고 1.5시간 동안 침강시켰다. 침강 후에, 1mL의 샘플을 수집하고 액체 상 중에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 백분율을 측정했다. 결과를 표 9에 기재했다.
SEQ.ID NO. ISIS # 용매 올리고뉴클레오티드:용매 비 초기농도(OD/mL) 액체 상 중농도(OD/mL) 액체 상 중％ 올리고
1 RA5132-013 에탄올 1:1 54,380 NA ---
2 CA2302-018 에탄올 1:1 55,220 NA ---
1 RA5132-013 에탄올 1:1.5 54,380 NA ---
2 CA2302-018 에탄올 1:1.5 55,220 NA ---
1 RA5132-013 에탄올 1:2 54,380 420 0.77
2 CA2302-018 에탄올 1:2 55,220 380 0.69
1 RA5132-013 에탄올 1:2.5 54,380 155 0.28
2 CA2302-018 에탄올 1:2.5 55,220 220 0.39
1 RA5132-013 에탄올 1:3 54,380 166 0.31
2 CA2302-018 에탄올 1:3 55,220 176 0.32
1 RA5132-013 에탄올 1:3.5 54,380 182 0.34
2 CA2302-018 에탄올 1:3.5 55,220 188 0.34
1 RA5132-013 에탄올 1:4 54,380 199 0.36
2 CA2302-018 에탄올 1:4 55,220 215 0.39
1 RA5132-013 에탄올 1:4.5 54,380 200 0.38
2 CA2302-018 에탄올 1:4.5 55,220 218 0.39
1 RA5132-013 에탄올 1:5 54,380 288 0.53
2 CA2302-018 에탄올 1:5 55,220 312 0.57
1 CA2302-018 1-프로판올 1:3 55,220 177 0.32
2 RA5132-013 1-프로판올 1:3 54,380 163 0.3
1 CA2302-018 IPA 1:3 55,220 152 0.28
2 RA5132-013 IPA 1:3 54,380 162 0.3
1 CA2302-018 변성 에탄올 1:3 55,220 166 0.3
2 RA5132-013 변성 에탄올 1:3 54,380 171 0.31
1 및 1.5배 부피의 에탄올은 완전한 침전을 유도하는데 있어서 충분하지 않은 것으로 관찰되었다. 2배 부피가 신속하게 침강되어 원심분리 관의 바닥에 점착성의 코팅을 형성하는 큰 응집물을 생성시켰다. 올리고뉴클레오티드 부피의 2.5배, 3배 및 3.5배 부피에 의해 생성된 응집물에 있어서 관찰할 수 있을 정도의 차이는 없었다. 용액 상 중에 잔류하는 생성물은 약 0.39％ 미만인 것으로 측정되었다. 4배, 4.5배 및 5배 부피가 큰 응집물을 형성시키기는 했지만 침강 후에 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 양(약 0.39％ 초과)도 약간 상승되었다. 결론적으로, 올리고뉴클레오티드 부피의 약 2.5배를 초과하는 에탄올의 부피는 생성물 회수율을 개선하는 것으로 보이지는 않았다.
슬러리를 2000rpm에서 1분간 원심분리시키는 것을 제외하고는 상기 프로토콜을 반복했다. 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율을 측정하고 결과를 표 10에 기재했다.
SEQ.ID NO. ISIS # 용매 올리고뉴클레오티드:용매 비 초기농도(OD/mL) 액체 상 중농도(OD/mL) 액체 상 중％ 올리고
1 RA5132-013 에탄올 1:1 54,380 NA ---
2 CA2302-018 에탄올 1:1 55,220 NA ---
1 RA5132-013 에탄올 1:1.5 54,380 NA ---
2 CA2302-018 에탄올 1:1.5 55,220 NA ---
1 RA5132-013 에탄올 1:2 54,380 111 0.20
2 CA2302-018 에탄올 1:2 55,220 122 0.22
1 RA5132-013 에탄올 1:2.5 54,380 144 0.26
2 CA2302-018 에탄올 1:2.5 55,220 195 0.35
1 RA5132-013 에탄올 1:3 54,380 161 0.31
2 CA2302-018 에탄올 1:3 55,220 121 0.22
1 RA5132-013 에탄올 1:3.5 54,380 189 0.34
2 CA2302-018 에탄올 1:3.5 55,220 188 0.34
1 RA5132-013 에탄올 1:4 54,380 255 0.46
2 CA2302-018 에탄올 1:4 55,220 235 0.42
1 RA5132-013 에탄올 1:4.5 54,380 305 0.56
2 CA2302-018 에탄올 1:4.5 55,220 325 0.58
1 RA5132-013 에탄올 1:5 54,380 355 0.65
2 CA2302-018 에탄올 1:5 55,220 388 0.70
1 CA2302-018 1-프로판올 1:3 55,220 115 0.21
2 RA5132-013 1-프로판올 1:3 54,380 122 0.22
1 CA2302-018 IPA 1:3 55,220 119 0.21
2 RA5132-013 IPA 1:3 54,380 133 0.24
1 CA2302-018 변성 에탄올 1:3 55,220 126 0.23
2 RA5132-013 변성 에탄올 1:3 54,380 116 0.21
표 10의 데이터는 올리고뉴클레오티드 부피의 2.5배, 3배 및 3.5배 부피의 알콜이 침강 후에 관찰된 것와 유사한 결과를 야기한다는 것을 보여주었다. 특히 이들의 올리고뉴클레오티드 대 용매 비에서, 0.35％ 미만의 올리고뉴클렝티드가 액체 상 중에 잔류했다. 용매의 상대적 비율이 4배에서 5배로 상승될 때, 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율은 0.46에서 0.70％로 상승되었다. 그러나 올리고뉴클레오티드 부피의 2.5배-3.5배 부피를 사용하여 형성된 침전물은 약간 젤라틴성인 것으로 보였다.
실시예 6: 첨가 순서의 영향
3종의 침전 성분(예를 들면, 알콜, DMT-결여 올리고뉴클레오티드 및 소듐 아세테이트)의 첨가 순서를 변화시켰다. 생성 슬러리를 1.5시간 동안 침강시킨 다음 이 시점에서 액체 상 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율(액체 상 중 ％ 올리고)을 측정하기 위해 용액 상의 1mL의 샘플을 수집했다. 결과를 표 11에 기재했다.
방법 A 후에, 145㎛의 3.0M NaOAc를 25mL의 DMT-결여 올리고뉴클레오티드 No.1 또는 2<SEQ. ID NO:1; SEQ. ID NO:2>(ISIS 5132; ISIS 2302)에 첨가했는데 농도는 2750 OD/mL이었다. 생성 염/올리고뉴클레오티드 혼합물을 3배 부피의 에탄올, 1-프로판올, IPA 또는 변성 에탄올에 첨가하고 30초간 혼합했다. 생성 슬러리를 1.5시간 동안 침강시키고 용액 상의 1mL 샘플을 수집해서 액체 상 중 올리고뉴클레오티드의 농도(액체 상 중 ％ 올리고)를 측정했다. 큰 응집물이 형성되었으며 사용되는 임의의 알콜에 염/올리고뉴클레오티드 혼합물을 첨가하면 즉시 침강되기 시작했다. 표 11의 데이터는 침강 후에 액체 상 중에 약 0.35％ 미만의 올리고뉴클레오티드가 잔류한다는 것을 보여주었다.
방법 B는 145㎛의 NaOAc를 75mL의 에탄올, 1-프로판올, IPA 또는 변성 에탄올로 이동시킨 후에 2분간 혼합하는 것을 포함했다. 이 용액에, 25mL의 올리고뉴클레오티드 용액을 첨가하고 생성 슬러리를 30초간 혼합했다. 혼합물을 1.5시간동안 침강시키고 용액 상의 1mL 샘플을 수집해서 액체 상 중 올리고뉴클레오티드의 농도를 측정했다. 이 프로토콜에 의해 생성된 응집물은 작았으며 용액 상은 흐리게 남아있는 것으로 관찰되었다. 표 11의 데이터는 올리고뉴클레오티드의 6.5-9.2％가 용액 상 중에 잔류한다는 것을 보여준다.
방법 C 후에, 25mL의 올리고뉴클레오티드를 75mL의 에탄올로 옮기로 1분간 혼합했다. 이 혼합물에, 145㎛의 3.0M NaOAc를 첨가하고 생성 슬러리를 30초간 혼합했다. 슬러리를 침강시키고 전술한 바와 같이 샘플링했다. 이 프로토콜은 크고 작은 응집물의 혼합물을 형성했으며, 작은 응집물은 1.5시간 후에도 현탁된 채로 잔류했다. 용액 상의 샘플을 수집해서 액체 상 중 올리고뉴클레오티드의 농도를 측정했다. 용액 상은 생성물의 7.3 및 10.0％를 포함했다.
SEQ.ID NO. ISIS # 용매 첨가순서* 초기농도(OD/mL) 액체 상 중농도(OD/mL) 액체 상 중％ 올리고
1 RA5132-013 에탄올 A 54,380 188 0.35
2 CA2302-018 에탄올 A 55,220 166 0.3
1 RA5132-013 1-프로판올 A 54,380 174 0.32
2 CA2302-018 1-프로판올 A 55,220 192 0.35
1 RA5132-013 IPA A 54,380 153 0.28
2 CA2302-018 IPA A 55,220 140 0.25
1 RA5132-013 변성 에탄올 A 54,380 163 0.3
2 CA2302-018 변성 에탄올 A 55,220 166 0.3
1 RA5132-013 에탄올 B 54,380 3,555 6.5
2 CA2302-018 에탄올 B 55,220 4,789 8.8
1 RA5132-013 1-프로판올 B 54,380 3,899 7.2
2 CA2302-018 1-프로판올 B 55,220 2,777 5.0
1 RA5132-013 IPA B 54,380 5,010 9.2
2 CA2302-018 IPA B 55,220 4,661 8.4
1 RA5132-013 변성 에탄올 B 54,380 3,897 7.2
2 CA2302-018 변성 에탄올 B 55,220 3,775 6.9
1 RA5132-013 에탄올 C 54,380 5,521 10.0
2 CA2302-018 에탄올 C 55,220 5,630 10.0
1 RA5132-013 1-프로판올 C 54,380 4,878 8.9
2 CA2302-018 1-프로판올 C 55,220 5,218 9.4
1 RA5132-013 IPA C 54,380 3,945 7.3
2 CA2302-018 IPA C 55,220 4,231 7.7
1 RA5132-013 변성 에탄올 C 54,380 4,966 9.1
2 CA2302-018 변성 에탄올 C 55,220 4,555 8.2
*A=올리고를 NaOAc와 혼합한 후에 알콜에 가했다. B=알콜을 올리고와 혼합하고 NaOAc를 혼합물에 가했다; C=알콜을 NaOAc와 혼합하고 혼합물에 올리고뉴클레오티드를 가했다.
실시예 7: 온길이, DMT-결여 올리고뉴클레오티드 농도의 응집물 형성 및 여과에 대한 영향.
1000 OD/mL 내지 4750 OD/mL 범위 농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 동결건조 분말로서 형성된 올리고뉴클레오티드 No. 1 또는 5<SEQ. ID NO:1 또는 SEQ. ID NO: 5>(ISIS 5132 또는 ISIS 3521)를 사용하여 제조했다. 이들 원료 용액에 3.0M NaOAc를 첨가하고 생성 혼합물을 보텍스했다. 혼합물을 3배 부피의 에탄올에 침전시키고 생성 슬러리를 5.5cm Whatmann No. 4 필터가 장착된 Buchner 깔때기를 통해 진공 여과했다. 슬러리에 여과 용이성을 기준으로 하여 등급(A-D)을 부여했다. 여액 중에 잔류하는 올리고뉴클레오티드의 백분율(여액 중 ％ 올리고)을 여과 후에 측정했다. 여과 결과를 표 12에 기재했다.
SEQ.ID NO. ISIS # 초기농도(OD/mL) 여액 중 올리고뉴클레오티드의 농도(OD/mL) 여액 중 ％ 올리고 여과*
1 RA5132-013 1,000 --- --- A
2 CA2302-018 1,000 --- --- A
1 RA5132-013 1,250 --- --- A
2 CA2302-018 1,250 --- --- A
1 RA5132-013 1,500 --- --- A
2 CA2302-018 1,500 --- --- A
1 RA5132-013 1,750 --- --- A
2 CA2302-018 1,750 --- --- A
1 RA5132-013 2,000 --- --- A
2 CA2302-018 2,000 --- --- A
1 RA5132-013 2,250 2,200 3.5 B
2 CA2302-018 2,250 2,200 3.9 B
1 RA5132-013 2,500 822 1.3 B
2 CA2302-018 2,500 759 1.2 B
1 RA5132-013 2,750 456 0.6 C
2 CA2302-018 2,750 466 0.7 C
1 RA5132-013 3,000 166 0.2 D
2 CA2302-018 3,000 155 0.2 D
1 RA5132-013 3,250 177 0.2 D
2 CA2302-018 3,250 189 0.3 D
1 RA5132-013 3,500 186 0.2 D
2 CA2302-018 3,500 201 0.2 D
1 RA5132-013 3,750 215 0.2 D
2 CA2302-018 3,750 230 0.2 D
1 RA5132-013 4,000 244 0.2 D
2 CA2302-018 4,000 256 0.3 D
1 RA5132-013 4,250 326 0.3 D
2 CA2302-018 4,250 289 0.3 D
1 RA5132-013 4,500 333 0.3 D
2 CA2302-018 4,500 389 0.3 D
1 RA5132-013 4,750 829 0.69 B
2 CA2302-018 4,750 955 0.8 B
*A=여과할 수 없었다; B=부분적으로 여과되었다; C=생성물이 필터 위에 잔류했다; 및 D=생성물이 우수한 유동 속도로 필터 위에 잔류했다.
1000 내지 2000 OD/mL 범위의 올리고뉴클레오티드 농도가 큰 응집물을 형성했으며 이들이 젤라틴 층을 형성했다는 것이 관찰되었다. 그 결과, 이들을 여과할수 없었다. 2,250 OD/mL의 초기 농도의 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 여과할 수 있었으며 생성물의 3.5-3.9％가 액체 상 중에 잔류했다.
표 12의 데이터는 올리고뉴클레오티드의 초기 농도가 2500에서 2750 OD/mL로 상승되면, 여과 속도가 상당히 개선되고 액체 상 중에 잔류하는 생성물의 백분율이 0.6-1.3％로 저하되었다는 것을 보여준다. 3000 내지 4500 OD/mL 범위의 올리고뉴클레오티드 농도의 용액을 침전시켜서 최적 여과를 달성했다. 이들 농도의 용액을 여과하면 액체 상 중에 잔류하는 생성물의 양이 약 0.3％ 미만으로 저하되었다.
실시예 8: 실온 에탄올을 사용하는 FDA의 Good Manufacturing Practices Guidelines에 의해 제조되는 로트.
6종 로트의 올리고뉴클레오티드 No. 3-7<SEQ. ID NOS:3-7>(ISIS 14803, ISIS 2503, ISIS 3521, ISIS 104838 및 ISIS 107248)을 실온 에탄올 및 Carr 원심분리기를 사용하여 성공적으로 가공했다.
실시예 9: 소규모 저속 원심분리.
올리고뉴클레오티드 No.2 및 3<SEQ. ID NOS 2,3>(ISIS 2302, ISIS 14803)을 Robatel Slab 320 침강 원심분리기에서 2,500rpm에서 가공했다. 결과를 표 13에 기재했다. 전술한 프로토콜에 따라서 올리고뉴클레오티드를 제조했다.
SEQ. ID NO ISIS # 초기 OD 로드 침전의 # 침전 후 OD 로드 총 수율
2 2302 2,721,686 3 2,650,000 98.0％
3 RA 14803-006 342,814 3 312,500 91.2％
1 RA5132-013 9,375,000 1 9,365,625 99.9％
2 2302 Short-mer 27,500,000 2 27,431,250 99.75％
표 13의 데이터는 생산 규모에 대한 양호한 수율을 저속 원심분리에서 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 10: 소규모 여과 및 건조
50g 내지 2.5Kg 범위의 DMT-결여 올리고뉴클레오티드 용액을 사용하여 몇몇 시험을 수행했다. 방법은 다음과 같다: 1) 최종 DMT-결여 올리고뉴클레오티드를 재구성해서 120mg/mL 내지 150mg/mL를 형성했다; 2) 2％ 내지 4％ v/v 3.0M NaOAc 용액을 DMT-결여 올리고뉴클레오티드 용액에 교반하면서 첨가했다; 3) 생성 용액을 2.7-3.0배 부피의 주위 온도 에탄올에 약하게 교반하면서 첨가했다; 4) 슬러리를 진공 여과 장치로 옮기고 10 또는 20㎛ 316ss 필터를 통해 여과했다; 5) 케익을 오븐, 진공 건조, 진공 또는 여과 건조를 사용하여 건조시켰다. 표 14에 상세히 기재된 바와 같이, 생성 케이크 층 높이는 수 밀리미터에서 11센티미터로 다양했다. 수율 데이터는 생성물 손실이 0.18 내지 0.30％ 범위인 것을 나타내었다. 결과를 표 14에 기재한다.
SEQ. ID NO ISIS # 올리고뉴클레오티드의 g 필터 크기(미크론) 올리고뉴클레오티드 케이크 층 높이(cm) 용출 폐기물의 ％ 올리고
2 2302 178 10 7.0 0.19
2 2302 203 20 7.5 0.21
2 2302(사이드 분획) 47.5 10 4.0 0.26
2 2302(사이드 분획) 2,500 20 11.0 0.22
1 5132 250 10 8.9 0.30
1 5132 120 10 5.8 0.18
1 5132 180 20 6.2 0.24
3 14803 236 10 5.08 0.18
이들 실험 결과를 표 15에 기재했다. 침전 및 여과 단계를 전술한 프로토콜에 따라서 수행했다.
SEQ. ID NO ISIS # 올리고뉴클레오티드의 g 건조 방법 ％ 잔류 에탄올 올리고뉴클레오티드의 ％ 손실
2 2302 203 진공 오븐 0.32 0.2
2 2302 177 진공 트래이 0.56 0.0
1 5132 160 오븐 0.33 0.2
1 5132 120 진공 필터 0.3
진공 오븐 건조
큰 Buchner 깔때기 중에서 203g의 올리고뉴클레오티드 No.2<SEQ. ID NO:2>(ISIS 2302)를 수집한 후에, 케익 및 깔때기를 진공 오븐으로 옮겼다. 오븐을 30℃로 가열하고 25in/Hg 진공을 걸었다. 25시간 후에 건조 케익을 오븐에서 꺼낸 후에, #20 시프터 스크린을 통과시킨 후에, 혼합하고, 칭량하고, 잔류 에탄올 시험을 위해 샘플링했다. 최종 건조 케익의 에탄올 함량은 0.32％이었다. 건조 생성물의 중량은 202.6g이었으며, 0.2％ 미만의 생성물 손실을 나타낸다.
진공 트레이 건조
습윤 케익, 177g의 올리고뉴클레오티드 No. 2<SEQ. ID NO:2>(ISIS 2302)를 큰 Buchner 깔때기 중에 수집하고, 316ss 동결건조 트레이로 옮기고 신속하게 동결건조기 중에 위치시켰다. 쉘프를 30℃로 가열하고 진공을 100미크론으로 걸었다. 24시간의 건조 후에 생성물을 # 10스크린에 통과시키고 혼합하고 칭량했다. 최종건조 생성물의 에탄올 함량은 0.056％이었다. 건조 물질의 최종 중량은 178g이었으며 가공 도중에 생성물이 실질적으로 손실되지 않는다는 것을 나타내었다.
오븐 건조
160g의 올리고뉴클레오티드 No.1<SEQ. ID NO:1>(ISIS 5132) 모형 용액을 제조하고, 침전시키고, Buchner 깔때기 중에서 수집하고; 잔류하는 케익을 신속하게 55℃로 예열된 오븐으로 옮겼다. 케익을 12시간 동안 건조시킨 다음 #20시프터를 통해 통과시키고, 칭량하고, 혼합했다. 건조 생성물의 최종 중량은 159.6g인 것으로 측정되었으며 0.33％의 에탄올 함량을 가졌다. 이 방법에 의해 생성물의 대략 0.2％ 손실이 야기되었다.
필터 진공 건조
습윤 케익, 120g의 올리고뉴클레오티드 No.1<SEQ. ID NO:1>(ISIS 5132)를 진공 여과에 의해 특별하게 설계된 수-자켓 필터 장치에서 수집했다. 여과 후 즉시, 30℃의 물을 자켓을 통해 순환시키면서 아르곤을 케익을 정화했다. 아르곤으로 정화시키면서 15시간 건조시킨 후에, 케익을 번호 20 시프터를 통해 통과시키고 혼합하고 칭량했다. 생성물의 최종 중량은 119.5g이었다.
실시예 11: 올리고뉴클레오티드 특이적 변형
5'-디메톡시트리틸 양을 반으로 줄이기 위해 필요한 생성물 특이적 반응 시간(분)을 하기 서열에 대해 계산했는데, 여기에서 x=산성화 후의 pH이다:
2302: t1/2=0.0148*100.6773(x)
2503: t1/2=0.0031*100.9235(x)
3521: t1/2=0.0074*100.7195(x)
5132: t1/2=0.0147*100.7696(x)
14803: t1/2=0.0103*100.6554(x)
104838: t1/2=0.0072*100.8093(x)
107248: t1/2=0.0200*100.7516(x)
반감기 계산 결과(분)에 15를 곱한 수가 총 반응시간이었다. 5'-디메톡시트리틸 양을 반으로 감소시키는 것을 15회 반복하면 양은 0으로 검출되었다.

Claims (61)

  1. a) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 제공하고;
    b) 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 상기 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고;
    c) 상기 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함하는, 정제된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 용액이 탈보호 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 용액이 산성인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 용매 중 5'-보호 올리고뉴클레오티드를 5'-보호기 제거에 유효한 탈보호제로 처리해서 상기 용액을 제조하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 5'-보호기가 트리메톡시트리틸, 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 9-페닐크산텐-9-일 및 9-(p-메톡시페닐)크산텐-9-일로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 보호기가 디메톡시트리틸인 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 용액 중 상기 탈보호 올리고뉴클레오티드의 농도가 약 2250 OD/mL 이상인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 용액 중 상기 탈보호 올리고뉴클레오티드의 농도가 약 2250 OD/mL 내지 약 7500 OD/mL인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 용액 중 상기 탈보호 올리고뉴클레오티드의 농도가 약 4500 OD/mL 내지 약 6500 OD/mL인 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 분리된 탈보호 올리고뉴클레오티드를 물에 재구성해서 상기 용액을 제조하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 응집제가 알콜을 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 알콜이 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로필 알콜 및 변성 에탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 침전 증진제가 염을 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 염이 소듐 염, 리튬 염, 암모늄 염, 포타슘 염, 마그네슘 염, 세슘 염 및 아연 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 염이 소듐 아세테이트인 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 염이 소듐 히드록사이드인 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도에서 상기 응집제로 처리하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 약 18℃ 내지 약 20℃의 온도에서 상기 응집제로 처리하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 응집제로 처리하기전에 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 침전 증진제로 처리하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 침전 증진제로 처리하기전에 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 응집제로 처리하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 침전 증진제 및 상기 응집제의 혼합물로 처리하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 용액을 약 1부의 용액 대 약 1.5부 이상의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 용액을 약 1부의 용액 대 약 2부 내지 약 4부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 용액을 약 1부의 용액 대 약 2.5부 내지 약 4.5부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 응집물을 원심분리에 의해 분리하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 원심분리를 분당 약 3000 회전 미만의 속도에서 수행하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 원심분리를 분당 약 2500 회전 미만의 속도에서 수행하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 5부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 응집제가 에탄올이고 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 2 내지 약 4부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 응집제가 1-프로판올, 이소프로필 알콜 및 변성 에탄올로 구성된 군으로부터 선택되며 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 3부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 중력 침강에 의해 분리하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 5부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 응집제가 에탄올이고 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 2 내지 약 4.5부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  34. 제 27 항에 있어서, 상기 응집제가 에탄올이고 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 2 내지 3.5부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 응집제가 1-프로판올, 이소프로필 알콜 및 변성 에탄올로 구성된 군으로부터 선택되고 상기 올리고뉴클레오티드를 1부의 올리고뉴클레오티드 대 약 3부의 응집제의 부피비로 상기 응집제로 처리하는 방법.
  36. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 여과에 의해 분리하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 용액으로부터 상기 올리고뉴클레오티드를 분리한 후에 상기 용액 중에 잔류하는 상기 올리고뉴클레오티드의 양이 약 3.5％ 이하인 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 용액으로부터 상기 올리고뉴클레오티드를 분리한 후에 상기 용액 중에 잔류하는 상기 올리고뉴클레오티드의 양이 약 1.5％ 이하인 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 용액으로부터 상기 올리고뉴클레오티드를 분리한 후에 상기 용액 중에 잔류하는 상기 올리고뉴클레오티드의 양이 약 1％ 이하인 방법.
  40. a) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 제공하고;
    b) 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 상기 용액을 에탄올 및 소듐 염으로 처리하며, 여기에서 상기 에탄올은 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도이고;
    c) 상기 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함하는, 정제된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 소듐 염이 소듐 아세테이트 또는 소듐 히드록사이드인 방법.
  42. a) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 제공하고;
    b) 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 상기 용액을 침전 증진제로 처리한 후에 응집제로 처리하며;
    c) 상기 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단계를 포함하는, 정제된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 침전 증진제가 소듐 아세테이트인 방법.
  44. 제 42 항에 있어서, 상기 응집제가 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로필 알콜 및 변성 알콜로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 5'-보호 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 용액을 응집제로 처리하고;
    상기 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리하며;
    상기 분리된 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 용매 중에 용해시켜서 제 2 용액을 형성하고;
    상기 제 2 용액을 상기 5'-보호기 제거에 유효한 탈보호제로 처리하며;
    제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 상기 제 2 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고;
    상기 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리하며;
    상기 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 용매 중에 용해시켜 제 3 용액을 형성하고;
    제 3 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 상기 제 3 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하며;
    상기 제 3 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계를 포함하는, 정제된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 제 1 용액은 조 올리고뉴클레오티드의 크로마토그래피에서 얻은 용출액인 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 크로마토그래피가 고압 액체 크로마토그래피인 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 고압 액체 크로마토그래피를 역상 매질 또는 강 음이온 교환 수지가 충전된 컬럼을 사용하여 수행하는 방법.
  49. 제 45 항에 있어서, 상기 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물 또는 상기 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물의 상기 분리를 중력 침강 또는 원심분리에 의해 수행하는 방법.
  50. 제 45 항에 있어서, 상기 제 3 올리고뉴클레오티드 응집물의 상기 분리를 여과에 의해 수행하는 방법.
  51. 제 45 항에 있어서, 상기 정제된 올리고뉴클레오티드의 순도가 약 90％ 이상인 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 정제된 올리고뉴클레오티드의 순도가 약 98％ 이상 인 방법.
  53. 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제 1 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고;
    상기 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리하며;
    상기 분리된 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물을 용매 중에 용해시켜서 제 2 용액을 형성하고;
    제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 형성할 수 있는 충분한 조건에서 상기 제 2 용액을 응집제 및 침전 증진제로 처리하고;
    상기 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물을 분리해서 정제된 올리고뉴클레오티드를 얻는 단계를 포함하는, 정제된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 정제된 올리고뉴클레오티드의 순도가 약 90％이상인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 정제된 올리고뉴클레오티드의 순도가 약 98％ 이상인 방법.
  56. 제 53 항에 있어서, 상기 제 1 용액의 상기 올리고뉴클레오티드가 5'-탈보호올리고뉴클레오티드인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 5'-보호 올리고뉴클레오티드를 포함하는 HPLC의 용출액의 산성화에 의해 상기 제 1 용액을 제조하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 HPLC 용출액이 분해 및 염기 탈블록 5'-보호 올리고뉴클레오티드의 HPLC 정제로부터 형성되는 방법.
  59. 제 53 항에 있어서, 상기 제 1 올리고뉴클레오티드 응집물의 상기 분리를 중력 침강 또는 원심분리에 의해 수행하는 방법.
  60. 제 53 항에 있어서, 상기 제 2 올리고뉴클레오티드 응집물의 상기 분리를 여과에 의해 수행하는 방법.
  61. 제 49 항에 있어서, 상기 용매가 물인 방법.
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