KR20040065241A - Ｃｄ14+ 단핵세포로부터 수상돌기세포의 생체외 생성 - Google Patents
Ｃｄ14+ 단핵세포로부터 수상돌기세포의 생체외 생성 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수상돌기세포를 생성하기 위한 CD14+단핵세포의 이용에 관한 것이다.
본 발명은 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 혼합체, 즉, 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포 둘 다 미분화상태, 및/또는 분화되고 미성숙한 상태, 및/또는 성숙한 상태, 및/또는 서로 얽혀있는 상태인 세포의 혼합체의 적어도 하나를 분화를 통해 얻기 위한 말초순환혈로부터 분리한 CD14+단핵세포의 이용을 포함한다.
본 발명은 현탁액, 단일층 및 3차원 세포 및 조직 모델에서의 그들의 이용을 포함한다.
본 발명은 면역독성/면역저항의 평가, 화장료 및 약제학적 활성성분의 개발 및 세포 및 조직 치료방법의 개발 및 실시를 위한 연구 모델로서 이들 세포와 이들 모델의 이용을 포함한다.
Description
수상돌기세포(DC)는 면역계의 감시자로 고려되고 있는 항원전달세포(antigen-presenting cell)이다. 사실상 이들이 단층 타입이든지 혹은 말피기관 타입이든지 간에, 즉, 질, 외경부, 외음부, 항문 부분, 식도 및 입의 여러층의 상피를 포함하는 즉, 흉선, 체순환 및 2차 림프기관 및 피부 및 점막과 같은 말초조직에서 거의 어디에나 존재하고 있다. 생물체에는 매우 적은 수로 있다할 지라도, DC는 특이 면역 반응을 조절하고, 면역 반응의 특이성, 강도 및 근원에 대한 조절을 나타내는 중심에 있으며, 선천적 및 후천적 면역의 경계에 위치하고 있다. 면역 반응을 "점화" 하는 기능과는 별도로, DC는 또한 말초 저항의 유도에 중요한 역할을 담당하고 있다.
DC 전구체는 면역계 및 조혈세포와 같은 방식으로 CD34+혈구형성 전구체의분화로부터 유래한다. 그들은 분화하여 혈액을 통해 미성숙 DC의 형태로 남아있는 피부와 점막으로 전달된다. 생체내 위치에 따라 2가지 타입의 DC로 나뉜다:
첫째, 보다 높은 또는 보다 낮은 밀도(100∼1100/mm2)로 말피기관 타입의 상피(피부 및 점막)에 위치하는 랑게르한스세포(LC). 그들의 특이 마커는 랑게린(CD207)으로 전자적 규모로 관찰되는 기관 즉 버벡 과립(Birbeck's granules)의 형성에 관여하는 단백질이다. 랑게린과 CD1a 마커와는 별도로, LC는 CD4, β2-인터그린 및 부착물질인 LFA-3 및 ICAM-1과 같이 성숙기에서 다른 DC에서 발견되는 항원을 발현한다. 성숙 동안 내내 외항원(exoantigen)을 포획한 후 인접하는 림프절쪽으로 이동할 수 있는 능력때문에, LC는 접촉 피부염과 이식거부반응과 같은 수많은 병인에 관여한다.
둘째, 점막의 라미나 부분과 또한 진피에서 발견되는 세포간 수상돌기세포(IDC). 후자의 경우, 그들을 진피성 DC 또는 진피성 수상돌기세포라고 부른다. 이들 세포들은 버벡 과립이 없고 단핵세포/대식세포와 많은 유사성과 공통 마커를 공유하고 있다. 더욱이, IDC는 특이 마커, 렉틴 DC-SIGN을 발현하고 미성숙 DC의 것과 유사한 촉진능을 가지고 있다.
항원 포획 후, LC 및/또는 IDC는 림프절 쪽으로 이동한다. 이러한 이동은 LC 및/또는 IDC의 활성화, 케모카인 수용체와 부착물질의 발현의 변형(CCR6 수용체의 발현 상실과 CCR7의 발현 획득) 및 그들의 표현형과 기능적 특징의 변형과 관련된다. 예를 들어, LC의 경우, 버벡 과립이 파괴되면 형태가 무너진다. 림프의 신경절에서, T 림프구에 위치한 DC의 CD40 수용체와 그것의 리간드인 CD40-L간의 상호작용은 DC의 "얽혀있는 DC"로의 성숙을 유도하며, 항원 CD83과 보촉진(co-stimulation) 마커인 CD80 및 CD86의 막 발현과 HLA-DR과 같은 주요 조직적합성 복합체인 클래스 II 물질의 대량 막 이동을 일으킨다. 따라서 활성화된 성숙 DC는 TNFα와 IL-12의 생산자가 된다.
LC의 유익한 이용은 특히 피부 또는 인간의 점막 중 어느 하나에서 유래한 상피세포와 함께 그들을 시스템 또는 재건 피부 또는 재건 점막 모델과 융합시키는 데 있다(참조: publication by Regnier, JID 1997; patent EP 0 789 074 to L'OREAL; Sivard P. Peaux et muqueuses reconstruites(Reconstructed skin and mucous membranes),Nouv. Dermatol., 2001, 20, 520-523). 특히, 이는 동물 실험에 대한 다른 선택으로써 상기 방법들을 위한 생물학적 기초로써 제공할 수 있어 약제학적 및 화장료 산물과 같은 산물의 저항 및/또는 효능의 생체외 평가에 점차적으로 이용되어야 한다.
사실상, 산업적 규모 상 LC를 확실히 얻기 위한 두드러지게 이용가능한 공정이 없고, 언급된 모델의 결함때문에 이들의 이용은 현재는 제한적이며 또는 심지어 이용하지 않고 있는 실정이다.
로레알의 유럽특허 0 789 074는 피부 모델 또는 등가물 및 탯줄의 피에서 유래한 CD34+전구체의 이용에 관한 것이다. 피부는 표피가 제거된 진피 즉 살아있는 세포가 포함되어 있지 않은 죽은 진피인 기질에 침착되어 있기 때문에 사실상 피부등가물은 표피 등가물에서만 있다.
어쨋든, 진피가 살아있지 않기 때문에 IDC(또는 대식세포 또는 내피세포)는 결코 얻을 수 없다.
더욱이, 탯줄의 피로부터 얻기 때문에 CD34+세포 수는 제한적이다.
Geissmann(F. Geissmann, C. Prost, J-P. Monnet, M. Diy, N. Bruce and O. Hermine; 1998; j. Exp. Med., vol. 187, number 6, 961-966)의 공보에는 LC를 제공하기 위해 6일동안 현탁액에서 배양(GM-CSF, TGFβ1및 IL-4가 첨가되어 있음)할 뿐만 아니라 순환혈에서 유래된 CD14+단핵세포의 이용이 기재되어 있다.
상기 공개공보에 기재된 프로토콜에 따르면, 세포는 3차원 모델에서가 아니라 현탁액에서 배양된다. 또한, IDC 또는 다른 세포(대식세포, 내피세포) 중 어느 하나도 기재되어 있지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 하나의 세포 전구체로부터 생체외 생성을 위한 해결책, 피부와 점막의 수상돌기세포의 2개의 살아있는 군 즉, 랑게르한스세포(또는 LC) 및 세포간 수상돌기세포(또는 IDC)의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 인간 또는 동물의 순환혈 특히 말초순환혈에 존재하기 때문에 쉽게 얻을 수 있는 하나의 전구체의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 산업적 규모로 이용할 수 있도록 하기 위해 수적인면에서 세포의 생체외 생성을 가능케할 만큼 충분한 양으로 존재하는 하나의 전구체의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 바람직하게는 재생가능한 방식으로 특히 기증자의 기능면에서 변이가 없이 세포의 생체외 생성을 허용하는 하나의 전구체의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 세포의 빠른 생체외 생성(배양 7~8일에 LC를 얻을 수 있음)을 허용하는 하나의 전구체의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 생체내에 존재하는 것과 같은 표현형과 기능을 갖는 세포의 생체외 생성을 허용하는 하나의 전구체의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 분화/성숙의 대상 단계에 따라 즉, 미분화된 세포 단계 또는 분화되고 미성숙한 세포 단계 또는 성숙세포 단계 또는 얽혀있는 세포 단계에 따라 다르게 수상돌기세포 즉 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포의 생체외 생성을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 우선적으로 랑게르한스세포(또는 LC) 또는 우선적으로 세포간 수상돌기세포(또는 IDC) 중 어느 하나 또는 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 혼합체(또는 LC/IDC)의 적어도 하나의 세포 전구체로부터 생체외 생성을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 표현형 및/또는 기능적 특징이 서로 다른 LC 및/또는IDC의 부차집단의 생체외 생성을 포함하여 수상돌기세포 즉 랑게르한스세포(또는 LC) 및 세포간 수상돌기세포(또는 IDC)로부터 하나의 세포 전구체의 생체외 생성을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 치료에 있어서 이들 세포의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 항암세포치료와 같은 의약 또는 생의약적 적용, 예를 들어 면역반응을 촉진할 수 있는 DC의 주입, 예를 들어 면역이 결핍된 T 세포의 생성에 의한 면역적 저항 상황을 통한 자가면역질환 환자의 세포 치료, 면역계에 영향을 미치는 질환의 유전자 치료, 백신의 개발 및 생산을 위해 수상돌기세포 즉 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포의 생체외 생성을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 수상돌기세포 즉 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포의 생체외 생성, 및 피부 조직 또는 점막 모델을 포함하는 모델과 상기 세포들의 융합을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 완전 피부 또는 점막 모델 즉 상피와 결합기질 둘 다를 포함하는 모델에 융합될 때, 세포 환경 바람직하게는 섬유아세포와 상피세포 및 기질 환경으로 인해 랑게르한스세포로 분화하기 위해 상피에 위치할 수 있고, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포로 분화하기 위해 결합기질에 위치할 수 있고, 생체내 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포에 필적할만한 기능성을 얻을 수 있는 세포, 바람직하게는 미분화된 세포의 생체외 생성을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 활성성분과 같은 물질의 연구 및/또는 선별을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 내피세포 및 대식세포의 생체외 생성을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 면역능력이 있는 피부 또는 점막의 등가물을 얻기 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명과 관련된 다른 타입의 세포 및 조직의 물리적 병인을 연구하기 위한 모델/수단, 예를 들어 외용제의 면역독성 또는 알레르기성을 예상하기 위한 생체외 테스트를 실시할 목적으로 약학적 독성(pharmacotoxicological) 연구를 위한 모델/수단, 및 면역조절 특징을 갖는 물질을 연구하기 위한 모델/수단의 제공에 대한 신규한 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 치료에 있어서 이들 다양한 모델들의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 특히 활성성분의 면역촉진 또는 면역억제 활성의 연구 또는 상기 활성성분에 의한 면역저항의 평가 또는 유도를 목적으로 하는 모델의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상피 방어층의 물리적 병인, 피부 또는 점막의 자극, 생물체 예를 들어 바이러스, HIV 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미생물 및미세 항원의 공격, 광독성, 광보호, 활성성분, 특히 화장료 또는 약제학적 활성성분의 효과, 및 최종산물 특히 화장료 또는 약제학적 산물의 효과를 연구하고, 병원균에 의한 감염 메카니즘을 연구하기 위한 모델의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 병원균, 예를 들어 바이러스, HIV와 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미생물 및 미세 항원의 유무를 탐지하기 위한 모델의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 의약, 생의약 또는 화장품의 적용, 특히 생체외 또는 생체내 면역 또는 저항 반응을 조절, 다음의 환경적 공격, 특히 UV 조사 같은 물리적 타입 또는 화학적 또는 생물학적 타입을 조절하고, 특히 예방 또는 치료법을 목적으로 한 모델의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 조직 및 세포 공학 응용, 항암 세포치료 예를 들어 면역 반응을 촉진할 수 있는 DC의 주입과 같은 의약 또는 생의약적 응용, 면역저항 상황 예를 들어 면역능이 없는 T 세포의 생성을 통한 자가면역질환 환자에서의 세포치료, 면역계에 영향을 미치는 질환을 위한 유전자치료, 백신의 개발 및 생산을 위한 모델의 이용을 위한 해결책의 제공에 대한 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명은 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정, 배양 배지 및 면역독성/면역저항의 평가방법, 활성성분의 연구 및 선별방법, 피부와 점막의 물리적 병인 연구방법 및 세포 및/또는 조직 공학 및 치료방법에서 공정의 이용에 관한 것이다.
본 발명은 상기에 언급된 각각의 기술적 문제들을 안전하고, 믿을 수 있고재현 가능한 방식으로 최초로 해결하여 산업 및 상업 특히 화장품 및/또는 제약 및/또는 의약산업에 이용가능하다.
본 발명은 주로 살아있는 단일 전구체 즉 말초순환혈에 있는 CD14+단핵세포로부터 피부 및 점막의 수상돌기세포의 적어도 두 군 즉 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 생체외 생성에 관한 것이다.
본 발명의 전반에 걸쳐, "세포"란 특별한 지적이 없는 한 "살아있는 세포"를 의미한다.
본 발명에 따르면, "말초순환혈"은 특히 말초에 순환하는 혈관계를 가진 생물체 특히 동물과 인간, 바람직하게는 인간으로부터 채혈한 피를 의미하는 것이다.
본 발명에 따르면, "신선한 혈"는 개체로부터 채혈 후 24시간을 넘지 않은 상태에서 CD14+단핵세포의 추출이 실시되는 데 이 혈을 말하는 것이다.
따라서, 일특징에 따르면, 본 발명은 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 혼합체 즉, 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포 둘 다 미분화 상태, 및/또는 분화되고 미성숙한 상태, 및/또는 성숙한 상태, 및/또는 얽혀있는 상태의 세포 혼합체의 적어도 하나를 분화를 통해 얻기 위한 말초순환혈에서 분리한 CD14+단핵세포의 이용에 관한 것이다.
CD14+단핵세포를 이용함에 있어 유리한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 추출은 신선한 혈 즉, 개체에서 채혈 후 24시간을 넘지 않은, 바람직하게는 18시간을 넘지 않은, 바람직하게는 12시간을 넘지 않은, 바람직하게는 6시간을 넘지 않은, 보다 바람직하게는 채혈 후 즉시 5시간을 넘지 않은 상태의 혈에서 실시하였다.
CD14+단핵세포를 이용함에 있어 유리한 한 특징에 따르면, 분화는 LC 및/또는 IDC의 다른 부차집단의 첨가로 일어난다.
CD14+단핵세포를 이용함에 있어 유리한 한 특징에 따르면, 분화는 대식세포 타입 및/또는 내피세포 타입과 같은 미분화세포 및/또는 분화세포의 부차집단을 적어도 하나 첨가함으로써 일어난다.
CD14+단핵세포를 이용함에 있어 유리한 한 특징에 따르면, 분화는 적어도 2개의 사이토카인 GM-CSF 및 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1를 포함하는 배양배지에서 이들 CD14+단핵세포를 배양함으로써 일어난다.
CD14+단핵세포를 이용함에 있어 유리한 한 특징에 따르면, LC와 IDC 두 군간의 분포는 상기 배양 시 일정 시간동안 일정 농도의 사이토카인이 ⅓ 존재하느냐에 달려 있으며, 상기 사이토카인은 바람직하게는 사이토카인 IL-13이다.
다른 유리한 실시예에서, 배양은 LC로의 분화가 우세하도록 즉, LC의 형성이 우세하도록 하기 위해 약 2일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시된다.
다른 유리한 실시예에서, 배양은 IDC의 형성이 우세하도록 약 6일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시된다.
다른 유리한 실시예에서, 배양은 LC/IDC 두 군의 형성이 우세하도록 약 4일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시된다.
다른 유리한 특징에 따르면, LC와 IDC의 추가 분화 정도는 사이토카인 TNFα가 첨가된 상태에서 상기 배양을 실시함으로써 얻을 수 있다.
유리하게는, 배양은 일정 농도와 일정 시간동안 TNFα를 첨가한 상태에서 실시될 수 있다. 이들 세포들이 활성화된 성숙 수상돌기세포로 성숙되는 것을 피함과 동시에 미성숙 랑게르한스세포와 미성숙 세포간 수상돌기세포를 얻기 위해 배양시간은 약 18시간 미만이다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, TNFα가 첨가된 배양은 일정 농도로 일정 시간 동안 실시되며, 배양시간은 활성화된 성숙 수상돌기세포로의 성숙을 위해 약 20시간 이상이다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 사이토카인 GM-CSF의 농도는 0.1∼4000 IU/mL이며, 유리하게는 1∼2000 IU/mL이며, 보다 유리하게는 약 400 IU/mL이고, 사이토카인 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1의 농도는 0.01∼400 ng/mL이며, 유리하게는 1∼100 ng/mL이며, 보다 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 IL-13의 농도는 만약 상기 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.01∼400 ng/mL이며, 유리하게는 1∼100 ng/mL이며, 보다 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 TNFα의 농도는 만약 상기 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.1∼4000 IU/mL이며, 유리하게는 1∼1000 IU/mL이며, 보다 유리하게는 약 200 IU/mL이다.
CD14+단핵세포를 이용함에 있어 다른 유리한 특징에 따르면, 얻은 LC와 IDC는 생체내에서 발견되는 것들과 동일한 기능적 표현형을 가지고 있다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, 상기 LC와 IDC의 배양은 특히 적어도 상피세포와 스트로마세포를 포함하는 3차원 배양 환경에서 실시된다.
유리하게는, 이 추가 분화에 있어 한 특징에 따르면, 상피세포와 스트로마세포가 개별적으로 분리될 때, LC는 주로 상피세포 부분에 위치하고, IDC는 주로 스트로마세포 부분에 위치한다.
유리하게는, 이들 CD14+단핵세포를 이용함에 있어 한 특징에 따르면, 내피세포와 대식세포는 특히 그들이 3차원 환경에 처해 있을 때 배양에서 유래한 어떤 세포로부터 분화를 통해 얻는다.
유리하게는, CD14+단핵세포를 이용함에 있어 한 특징에 따르면, 완전 피부 또는 점막 모델 즉 상피와 결합기질 둘 다를 포함하는 모델에 융합될 때, 세포 환경 바람직하게는 섬유아세포와 상피세포 및 기질 환경으로 인해 랑게르한스세포로 분화하기 위해 상피에 위치할 수 있고, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포로 분화하기 위해 결합기질에 위치할 수 있고 생체내의 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포에 필적할만한 기능성을 얻을 수 있는 세포, 바람직하게는 미분화된 세포를 얻는다.
두번째 특징에 따르면, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 CD14+단핵세포의생체외 배양공정에 관한 것이다:
a) 종래기술에 따라 채취된 순환혈에서 CD14+단핵세포의 분리
b) LC와 IDC 두 군을 얻기에 충분한 시간 동안 몇몇 사이토카인을 포함하는 배양배지에서 분리된 CD14+단핵세포의 배양.
유리한 한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 생체외 배양공정에 있어서, 배양은 적어도 사이토카인 GM-CSF 및 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1이 첨가된 상태에서 실시된다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 생체외 배양공정에 있어서, 배양은 상기 배양 시 일정시간 동안 일정농도의 사이토카인이 ⅓ 있는 상태에서 실시되며, 상기 사이토카인은 바람직하게는 사이토카인 IL-13이다.
상기 유리한 특징에 따른 한 실시예에서, 배양은 LC로의 형성이 우세하도록 약 2일 동안 사이토카인 IL-13이 첨가된 상태에서 실시된다.
상기 유리한 특징에 따는 다른 실시예에서, 배양은 IDC의 형성이 우세하도록 약 6일 동안 사이토카인 IL-13이 첨가된 상태에서 실시된다.
상기 특징에 따른 다른 유리한 실시예에서, 배양은 LC/IDC 혼합체의 형성이 우세하도록 약 4일 동안 사이토카인 IL-13이 첨가된 상태에서 실시된다.
본 발명의 유리한 한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 생체외 생성 공정에 있어서, 배양은 사이토카인 TNFα를 첨가한 상태에서 실시된다.
상기 유리한 특징에 따른 한 실시예에서, TNFα이 첨가된 배양은 일정 농도로 일정시간 동안 실시되며, 배양시간은 활성화된 성숙 수상돌기세포로의 성숙을 피함과 동시에 세포들이 여전히 미성숙한 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포로 분화되도록 하기 위해 약 18시간 미만이다.
다른 유리한 특징에 따르면, TNFα이 첨가된 배양은 일정 농도로 일정시간 동안 실시되며, 배양시간은 활성화된 성숙 수상돌기세포로 성숙되도록 약 20시간 이상이다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 추출은 신선한 혈 즉, 바람직하게는 개체로부터 채혈 후 24시간을 넘지 않게, 바람직하게는 18시간을 넘지 않게, 바람직하게는 12시간을 넘지 않게, 바람직하게는 6시간을 넘지 않게 실시되며, 보다 바람직하게는 채혈 후 바로 그리고 5시간을 넘지 않게 즉시 추출된다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정에 있어서, 배양은 3차원 배양 환경 특히 적어도 상피세포와 스트로마세포가 있는 상태에서 실시된다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, 추가 분화 정도는 3차원 배양 환경 특히 적어도 개별적으로 분리된 상피세포와 스트로마세포를 포함하는 환경에서 상기 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 배양을 실시함으로써 얻는다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정에서 사이토카인을 첨가한 배양 후, 성숙의 상보적 촉진은 상기 세포의 표현형 및 기능적 성숙을 얻기에 충분한 시간동안 특히 CD40-리간드를 갖는 수상돌기세포의 상호작용에 의해, 또는 사이토카인 TNFα 또는 지다당류의 첨가로 인해 영향을 받는다.
본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정은 다양한 비율로 LC 및 IDC의 두 군과 3차원 배양 모델의 융합을 포함한다.
마지막 유리한 특징에 따른 다른 실시예에서, 3차원 배양 모델은 피부모델, 점막모델, 진피모델, 융모막모델, 표피모델 및 상피모델을 포함한다.
마지막 유리한 특징에 따른 다른 실시예에서, 3차원 배양 모델은 다음으로부터 선택되는 진피 또는 융모막 기질 지지체를 포함한다:
a) 스트로마세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 기반 젤,
b) 글리코스아미노글리칸 및/또는 선택적으로 키토산을 하나 이상을 포함할 콜라겐으로 된 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 융합가능한 스트로마세포, 특히 섬유아세포임(CNRS의 EP 0296078A1, 꼴레띠까의 WO 01/911821 및 WO 01/92322),
c) 하이알루론산(Hyalograft®3D-Fidia Advanced Biopolymer) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린(예를 들어, Vitrix®-Organogenesis)의 젤 또는 막,
d) 진피층으로 구성되는 진피 등가물(Michel M. et al; 1999;In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal, vol. 35, 318-326),
e) 표피가 제거된 죽은 진피,
f) 반투과성 합성막, 특히 반투과성 나이트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인 및 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜릭 애시드 멤브레인 또는 필름(Advanced Tissue Science의 Skin2TMmodel ZK1100, Dermagraft®및 Transcyte®과 같은 상품을 포함함)으로 구성된 군으로부터 선택되는 불활성 지지체, 상기 불활성 지지체는 가능한한 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함.
마지막 유리한 특징에 따른 다른 실시예에서, 사용된 3차원 배양 모델은 표면에 상피세포, 특히 각질형성세포가 침착되어 있는 상기에서 언급된 모델로 구성된다.
마지막 유리한 특징에 따른 실시예에서, 사용된 3차원 배양 모델은 보족세포 타입, 예를 들어 신경세포 및/또는 내피세포 및/또는 멜라닌세포 및/또는 림프구 및/또는 지방세포 및/또는 머리카락, 다른 신체의 털 및 피지선과 같은 피부 부속물이 적어도 하나 융합되어 있는 모델로 구성된다.
다른 실시예에서, 배양에서 유래한 어떤 세포들은 내피세포와 대식세포 특히 그들이 적어도 상피세포와 스트로마세포를 포함하는 3차원 환경에 있을 때 분화한다.
일반적으로 말해서, 본 발명은 상기에서 기재한 방식으로 또는 실시예를 포함한 다음의 설명 방식으로 CD14+단핵세포의 이용을 포함하는 배양 공정에 관한 것이다.
세번째 특징에 따르면, 본 발명은 적어도 2개의 사이토카인 즉 사이토카인 GM-CSF 및 사이토카인 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1이 첨가되어 있는 기초배양배지를 포함하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양배지에 관한 것이다.
유리하게는, 상기 2개의 사이토카인이 첨가된 배양배지는 또한 사이토카인 IL-13이 첨가되어 있으며, 바람직하게는 배양동안 일정 순간에 배양배지로 도입될 수 있도록 물리적으로 분리되어 있다.
세번째 특징에 따른 유리한 한 특징에 따르면, 상기 2개의 사이토카인이 첨가된 배양배지는 또한 사이토카인 TNFα가 첨가되어 있으며, 배양동안 일정 순간에 배양배지에 도입될 수 있도록 물리적으로 분리되어 있다.
세번째 특징에 따른 다른 유리한 특징에 따르면, 사이토카인 GM-CSF의 농도는 0.1∼4000 IU/mL이며, 유리하게는 1∼2000 IU/mL이며, 보다 유리하게는 약 400 IU/mL이고, 사이토카인 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1의 농도는 0.01∼400 ng/mL이며, 유리하게는 1∼100 ng/mL이며, 보다 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 IL-13의 농도는 만약 상기 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.01∼400 ng/mL이며, 유리하게는 1∼100 ng/mL이며, 보다 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 TNFα의 농도는 만약 상기 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.1∼4000 IU/mL이며, 유리하게는 1∼1000 IU/mL이며, 보다 유리하게는 약 200 IU/mL이다.
네번째 특징에 따르면, 본 발명은 CD14+단핵세포로부터 얻을 수 있고 특히 상기에 기재된 대로 이용함으로써 또는 상기 기재된 대로 배양 공정에 따라 또는 상기 기재에 따른 배양 배지의 이용에 의해 얻을 수 있는 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 혼합체-랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포는 미분화상태, 및/또는 분화되고 미성숙한 상태, 및/또는 성숙한 상태, 및/또는 얽혀있는 상태임-의 적어도 하나를 포함하는 세포체에 관한 것이다.
다섯번째 특징에 따르면, 본 발명은 수상돌기세포 즉, 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포의 생체외 생성을 위해, 항암세포치료 예를 들어 면역 반응을 촉진할 수 있는 DC의 주입과 같은 의약 또는 생의약적 응용, 면역능이 없는 T 세포의 생성으로 인한 면역 저항 상황을 통해 자가면역질환 환자의 세포 치료, 면역계에 영향을 미치는 질환의 유전자치료 및 백신의 개발과 생산을 위해 상기에 언급한 CD14+단핵세포의 이용으로부터 얻은 또는 상기에서 언급한 배양 공정에 의해, 또는 상기에서 언급한 배양 배지의 이용으로 얻은 LC 및 IDC의 혼합체의 이용에 관한 것이다.
여섯번째 특징에 따르면, 본 발명은 현탁액, 단일층 또는 3차원, 단세포 또는 다세포 연구 모델의 제조를 위해 상기에 언급한 CD14+단핵세포의 이용으로부터얻은 또는 상기에서 언급한 배양 공정에 의해, 또는 상기에서 언급한 배양 배지의 이용으로 얻은 LC 및 IDC의 혼합체의 이용에 관한 것이다.
다섯번째 특징에 따른 유리한 한 특징에 따르면, 연구 모델은 다음으로부터 선택된다:
a) 스트로마세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 기반 젤,
b) 글리코스아미노글리칸 및/또는 선택적으로 키토산을 하나 이상을 포함할 콜라겐으로 된 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 융합가능한 스트로마세포, 특히 섬유아세포임(CNRS의 EP 0296078A1, 꼴레띠까의 WO 01/911821 및 WO 01/92322),
c) 하이알루론산(Hyalograft®3D-Fidia Advanced Biopolymer) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린(예를 들어, Vitrix®-Organogenesis)의 젤 또는 막,
d) 진피층으로 구성되는 진피 등가물(Michel M. et al; 1999;In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal, vol. 35, 318-326),
e) 표피가 제거된 죽은 진피,
f) 반투과성 합성막, 특히 반투과성 나이트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인 및 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜릭 애시드 멤브레인 또는 필름(Advanced Tissue Science의 Skin2TMmodel ZK1100, Dermagraft®및 Transcyte®과 같은 상품을 포함함)으로 구성된 군으로부터 선택되는 불활성 지지체, 상기 불활성 지지체는 가능한한 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함.
유리한 한 특징에 따르면, 이 모델은 LC 또는 IDC 중 어느 하나, 또는 LC/IDC의 혼합체, 또는 LC/IDC/내피세포/대식세포의 혼합체, 또는 IDC/내피세포/대식세포의 혼합체를 주로 포함한다.
조직 모델은 주로 각질형성세포로 구성된 표피 모델, 주로 스트로마세포를 포함하는 결합기질 모델 즉, 피부의 경우 진피 및 점막의 경우 융모막, 주로 상피세포로 구성된 상피 모델, 표피와 진피로 구성된 피부 모델 또는 상피와 융모막으로 구성된 점막 모델일 수 있다.
계통에서 유래한 정상적인 건강세포, 질병세포 또는 세포는 이들 모델에 사용될 수 있다. 이들 세포들은 인간 또는 동물에서 유래할 수 있다.
상피세포, 색소세포, 신경세포 등등은 본 발명에 따라 생성된 세포에 부가적으로 상피부분에 도입될 수 있다.
스트로마세포(특히, 섬유아세포), T 림프구, 지방세포 및 피부 부속물(머리카락, 다른 신체부위의 털, 피지선)은 본 발명에 따라 생성된 세포에 부가적으로 결합기질에 도입될 수 있다.
일곱번째 특징에 따르면, 본 발명은 재건피부 또는 재건 점막의 완전 모델,또는 재건 진피 또는 재건 융모막 모델, 또는 재건 상피 모델 특히 상피 모델 또는 상기의 CD14+단핵세포부터 얻을 수 있은 적어도 하나의 LC/IDC의 혼합체를 포함하는 어떠한 현탁액, 단일층 또는 3차원, 단세포 또는 다세포 모델에 관한 것이다.
유리한 한 특징에 따르면, 재건조직 모델 또는 다른 모델은 다음으로부터 선택된다:
a) 스트로마세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 기반 젤,
b) 글리코스아미노글리칸 및/또는 선택적으로 키토산을 하나 이상을 포함할 콜라겐으로 된 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 융합가능한 스트로마세포, 특히 섬유아세포임(CNRS의 EP 0296078A1, 꼴레띠까의 WO 01/911821 및 WO 01/92322),
c) 하이알루론산(Hyalograft®3D-Fidia Advanced Biopolymer) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린(예를 들어, Vitrix®-Organogenesis)의 젤 또는 막,
d) 진피층으로 구성되는 진피 등가물(Michel M. et al; 1999;In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal,vol. 35, 318-326),
e) 표피가 제거된 죽은 진피,
f) 반투과성 합성막, 특히 반투과성 나이트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인 및 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜릭 애시드 멤브레인 또는 필름(Advanced Tissue Science의 Skin2TMmodel ZK1100, Dermagraft®및 Transcyte®과 같은 상품을 포함함)으로 구성된 군으로부터 선택되는 불활성 지지체, 상기 불활성 지지체는 가능한한 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함.
유리한 한 특징에 따르면, 이 모델은 주로 LC 또는 IDC 중 어느 하나, 또는 LC/IDC의 혼합체 또는 LC/IDC/내피세포/대식세포의 혼합체 또는 IDC/내피세포/대식세포의 혼합체를 포함한다.
유리하게는, 이 모델의 한 특징에 따르면, LC는 상피부분에 위치하며, IDC, 대식세포 및 내피세포의 경우 이들이 있다면 결합기질에 위치한다.
유리하게는, 본 발명은 구조를 제공하는 세포, 특히 스트로마세포, 특히 섬유아세포, 및/또는 상피세포 특히 각질형성세포, 및/또는 다른 세포 타입 특히 T-림프구, 및/또는 신경세포, 및/또는 색소세포 특히 멜라닌세포, 및/또는 면역반응을 제공하는 세포, 특히 LC, IDC 및/또는 대식세포, 혈관형성을 제공하는 세포, 지방세포뿐 아니라 특히 내피세포가 있는 상기에서 언급된 모델에 관한 것이다.
여덟번째 특징에 따르면, 본 발명은 활성성분의 연구 및/또는 선택용 모델로서 상기 LC와 IDC의 혼합체의 적어도 하나의 이용에 관한 것이다.
"활성성분"이란 산업, 특히 화장품산업, 제약산업, 피부제약산업, 식품산업, 농산물 산업 등등에서 잠정적으로 가치를 나타낼 수 있는 어떤 물질, 산물 또는 조성물을 의미한다.
본 발명의 아홉번째 특징은 활성성분의 면역촉진 또는 면역억제 활성의 연구 또는 상기 활성성분에 의한 면역 저항 평가 또는 유도를 목적으로 상기에서 언급된 모델의 이용에 관한 것이다.
열번째 특징에 따르면, 본 발명은 상피 방어층의 물리적 병인, 피부 또는 점막의 자극, 생물체, 예를 들어, 바이러스, HIV와 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미생물 및 미세 항원의 공격, 광독성, 광보호, 활성성분 특히 화장료 또는 약제학적 산물의 효과, 최종 산물 특히 화장료 또는 약제학적 산물의 효과를 연구하기 위한 목적으로, 그리고, 병원균에 의한 감염 메카니즘을 연구할 목적으로 상기에서 언급된 모델의 이용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HIV와 같은 리트로바이러스를 포함한 바이러스의 감염, 복제 및 전염 현상에 관련된 메카니즘을 연구하고, 치료방법(백신, 신약 등등을 포함)의 연구 및 개발을 위해 모델을 사용할 수 있는 효과가 있다.
열한번째 특징에 따르면, 본 발명은 병원균, 예를 들어, 바이러스, HIV와 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미생물 및 미세 항원의 존재 여부를 탐지하기 위한 상기 모델의 이용에 관한 것이다.
열두번째 특징에 따르면, 본 발명은 화장료, 의약 또는 생의약의 응용, 특히 생체외 또는 생체내 면역 또는 저항 반응을 조절하고, 다음의 환경적 공격, 특히 UV 조사 같은 물리적 타입, 또는 면역적 타입을 포함한 화학적 또는 생물학적 타입을 조절하기 위해, 예방 또는 치료법의 목적으로 상기의 연구 모델을 이용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 열세번째 특징에 따르면, 재건 조직, 재건 피부, 재건 점막 또는 연구 모델은 조직과 세포 공학 응용, 항암 세포 치료와 같은 의약 또는 생의약적 응용, 예를 들어 면역 반응을 촉진할 수 있는 DC의 주입, 면역능이 없는 T 세포의 생성으로 인한 면역 저항 상황을 통해 자가면역질환 환자의 세포 치료, 면역계에 영향을 미치는 질환의 유전자치료, 백신의 개발과 생산에 이용될 수 있다.
다른 특징에 따르면, 본 발명은 또한 CD14+단핵세포에서 얻은 세포의 혼합체를 적어도 하나 이용하여 특히 연구 모델을 이용할 수 있는 상기의 특징들 중 어느 하나에 영향을 미침으로써 입증된 활성을 갖고 있는 어떠한 잠정적 활성물질을 포함한다.
본 발명을 통해, 선택적 기증자의 혈액의 이용 가능성으로 인해 쉽게 접근할 수 있는 소스인 순환성 단핵세포가 사용된다.
게다가, CD14+단핵세포의 배양은 LC와 IDC를 둘 다 생성할 수 있어, 특히 피부 또는 점막에 적용하고자 하는 물질을 빠른 속도로 스크리닝하기에 적합한 배양 모델을 제공한다. 따라서, 이러한 배양 모델은 LC 및/또는 IDC를 동시에 이용할 수 있기 때문에 만족할만한 완전한 수단을 제공하는 것이다. 결과적으로, 동물 실험을 대체할만한 방법을 제시하고, 화장품 산업의 법령에 따라 유효한 윤리적 규정을 준수할 수 있게 한다.
또한, 본 발명은 생리적으로 인간의 정상피부 또는 정상점막과 매우 유사한"내피화된 면역능이 있는 재건 피부" 또는 "내피화된 면역능이 있는 재건 점막"의 단일 모델의 생체외 생성을 제공하면서 재건 피부 또는 재건 점막 모델과 공동으로 배양 모델을 이용할 수 있다. 이 모델은 상피 방어층의 물리적 병인, 피부 또는 점막의 자극, 생물체(예를 들어, 바이러스, HIV와 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미세 항원)의 공격, 광독성, 광보호 및 활성성분 특히 약제학적 및 화장료 활성성분의 효과 및 최종산물, 특히 화장료 및 약제학적 산물의 효과를 연구하기 위해 사용될 것이다.
본 발명은 생물체의 감염/방어 과정에 관여된 모든 현상을 고려할 수 있는 다른 기능성을 갖는 DC의 다른 군을 생성하는 효과가 있다.
더욱이, 현저하고 기대치않게, 재건 피부 또는 재건 점막 모델과 융합할 때, 말초순환혈에서 분리된 CD14+단핵세포로부터 생체외에서 생성된 세포는,
LC로 분화하기 위해 상피에 위치할 수 있고,
IDC, 내피세포 및 대식세포로 분화하기 위해 결합기질(진피 또는 융모막)에 위치할 수 있고,
생체내 LC, IDC, 내피세포 및 대식세포에 필적할만한 기능성을 얻을 수 있다.
본 발명은 산업 및 상업 분야, 특히 화장품 및/또는 제약산업에서 믿을 수 있고 재생가능한 이용을 통해 주요 기술적 개선점들을 가지고 있고, 주요한 임상적 연관성을 가질 수 있는 것으로 예상된다.
다음의 사용 프로토콜에 대한 요약을 통해 CD14+단핵세포 배양 공정을 더 잘 이해할 수 있을 것이다.
말초순환혈에서 CD14
+
단핵세포 추출 후, 다음의 프로토콜에 따라 세포 생성:
프로토콜 1:
GM-CSF, TGFβ1및 IL-13을 첨가한 현탁액에서 2일 동안 CD14+를 배양한 다음, GM-CSF 및 TGFβ1이 있는 상태에서 4일 더 배양 → D6: pre-LC(미분화되고 미성숙한 상태)
현탁액에 TNFα(<18h) 첨가 → 주로 LC가 있음(분화되고 미성숙한 상태)
프로토콜 2:
GM-CSF, TGFβ1및 IL-13을 첨가한 현탁액에서 6일 동안 CD14+를 배양 → D6: pre-IDC(미분화되고 미성숙한 상태)
현탁액에 TNFα(<18h) 첨가 → 주로 IDC가 있음(분화되고 미성숙한 상태)
프로토콜 3:
GM-CSF, TGFβ1및 IL-13을 첨가한 현탁액에서 4일 동안 CD14+를 배양한 다음, GM-CSF 및 TGFβ1이 있는 상태에서 2일 더 배양 → D6: pre-LC 및 pre-IDC(미분화되고 미성숙한 상태)
현탁액에 TNFα(<18h) 첨가 → 동량의 LC 및 IDC의 혼합(분화되고 미성숙한 상태)
프로토콜 4:
GM-CSF, TGFβ1및 IL-13을 첨가한 현탁액에서 6일 동안 CD14+를 배양한 다음, 2일, 4일 또는 6일 중 어느 하나 동안 배양 → D6: pre-LC 및 pre-IDC(미분화되고 미성숙한 상태)
현탁액에 TNFα(>20h) 첨가 → 활성화 세포(분화되고 성숙한 상태, 더이상 LC 또는 IDC 없음)
만약 프로토콜 1, 2 또는 3에 따라 얻은 세포가 3차원 배양 모델에 융합되면(바람직하게는 미분화된 세포기=pre-LC 및/또는 pre-IDC), 다음이 관찰된다:
- TNFα의 추가는 pre-LC 및 pre-IDC의 LC 및 IDC로의 분화에 필수적인 것은 아님.
- 대식세포 및 진피/융모막 내피세포는 LC 및 IDC와 더불어 동시에 얻음.
CD14
+
단핵세포의 분화/성숙 단계:
ㆍ CD14+단핵세포 → D6: pre-LC 및/또는 pre-IDC(=미분화되고 미성숙한 세포)
ㆍ TNFα의 추가(<18 시간) → LC 및/또는 IDC(=미분화되고미성숙한 세포)
ㆍ TNFα의 추가(>20 시간) → 더이상 LC 또는 IDC가 없는 성숙한 세포(=활성화된성숙세포)
ㆍ CD40-리간드(T 림프구에 존재함)를 LC 및/또는 IDC 또는 성숙세포에 첨가 →얽혀있는세포(=최종 성숙단계)
본 발명의 다른 유리한 목적과 특징들은 몇몇 실시예로써 언급하면서 다음의 설명으로부터 종래기술과 비교하여 명백하게 나타날 것이다. 따라서, 상기 입증 방식으로 인해 본 발명의 권리 범위를 어떤 식으로든 제한할 수는 없다.
실시예에서, 특별히 언급하지 않을 경우, 온도는 섭씨온도 또는 실온을 말하며, 압력은 대기압을 말하는 것이다.
실시예 1: 말초순환혈에서 CD14
+
단핵세포의 분리 공정
일인 이상의 인간 기증자로부터 정맥혈에서 말초순환혈을 채혈하여 헤파린-리튬 또는 시트레이트 포스페이트 덱스트란과 같은 일반적인 항응고제를 포함한 베큐테이너(vacutainer)나 플라스틱 백에 채취하였다.
유리하게는, CD14+단핵세포는 Geissmann 등의 프로토콜에 따라 다음의 방식으로 순환혈에서 분리될 수 있다(Geissmann et al. inJ. EXP. MED. vol. 187, no. 6, 16 March 1998, pages 961-966, published by The Rockefeller University Press):
Ficoll 구배 상에서 원리분리한 후, 순환혈의 단핵세포를 얻고 마그네틱 비드가 결합되어 있는 항체 칵테일(주로 항-CD3, 항-CD7, 항-CD19, 항-CD45RA, 항-IgE)을 이용하여 간접적으로 표지하였다.
자성을 가진 컬럼을 통과시킨 후, 자성적으로 표지되지 않은 단핵세포만 용출시켰다.
당업자에게 잘 알려져 있는 물리적 분리 공정, 특히 침전 또는 원심분리를 통해 용출물로부터 CD14+단핵세포를 얻고 이후 배양을 위해 그와 같이 용출하였다.
혈액 100 mL 당 약 150 밀리온 (±20 million)의 단핵세포를 용출하였고, 40 밀리온까지 CD14+단핵세포를 정제하였다. 사용된 배양조건에 따라(이하 실시예 참조), 12∼16 밀리온의 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포가 생성되었다.
실시예 2: 미분화되고 미성숙한 수상돌기세포를 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포를 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 밀리온/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
전반적으로 본 발명에서 배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 배양 4일째에 IL-13이 없는 같은 배양배지를 첨가하고 이틀 더 계속 배양하였다. 배양 6일째에 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포로의 분화 경로쪽으로 진행할 수 있는 미분화되고 미성숙한 수상돌기세포가 생성되었다:
생체외에서 생성된 약 30~50%의 수상돌기세포는 세포내 수준으로 랑게린(랑게르한스세포에 대한 특이 마커)을 발현하였으나, 성숙 마커인 CD83, DC-LAMP 및 CCR7은 발현하지 않았다.
생체외에서 생성된 약 30~50%의 수상돌기세포는 DC-SIGN(세포간 수상돌기세포에 대한 특이 마커)를 발현하였으나 성숙 마커인 CD83, DC-LAMP 및 CCR7은 발현하지 않았다.
실시예 3: 세포간 수상돌기세포(IDC)로의 분화 경로쪽으로 우선적으로 진행할 수 있는 미분화되고 미성숙한 수상돌기세포를 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포는 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 million/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
전반적으로 본 발명에서 배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 배양 6일째에 세포간 수상돌기세포로의 분화 경로쪽으로 우선적으로 진행할 수 있는 미분화되고 미성숙한 수상돌기세포가 생성되었다:
생체외에서 생성된 약 60~80%의 수상돌기세포는 세포간 수상돌기세포에 대한 특이 마커인 DC-SIGN을 발현하였다.
DC-SIGN+ 세포 군은 세포들이 CD68 마커를 강하게 발현하기 때문에 미성숙한 상태이다.
실시예 4: 랑게르한스세포로의 분화 경로쪽으로 우선적으로 진행할 수 있는 미분화되고 미성숙한 수상돌기세포를 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포는 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 million/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 기껏해야 배양 2일 전에, IL-13이 없는 같은 배양배지를 배양 6일까지 첨가하였다. 6일째에, 랑게르한스세포로의 분화 경로쪽으로 진행할 수 있는 미분화되고 미성숙한 수상돌기세포가 생성되었다:
생체외에서 생성된 약 60~80%의 수상돌기세포는 세포내 수준으로 랑게린과 MIP-3α의 특이 수용체인 CCR6을 발현하였다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 MIP-3α에 의해 강하게 화학적으로 끌리는데 이는 CCR6 수용체의 기능을 입증하는 것이다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 성숙 마커인 CD83, DC-LAMP 및 CCR7은 발현하지 않기 때문에 미성숙 상태이다.
실시예 5: 주로 세포간 수상돌기세포를 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포는 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1million/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
전반적으로 본 발명에서 배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 배양 6일 후, 주로 세포간 수상돌기세포를 제공하기 위해 18시간 미만 동안 200 IU/mL의 사이토카인 TNFα를 첨가하였다:
생체외에서 생성된 약 60~80%의 수상돌기세포는 막 수준으로 DC-SIGN을 발현하였다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 세포간 수상돌기세포의 특징 중 하나인 만노우즈 수용체를 발현하였다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 생체내 세포간 수상돌기세포와 같은 기능적 특징들을 가지고 있다.
실시예 6: 주로 랑게르한스세포를 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포는 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 million/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
전반적으로 본 발명에서 배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 기껏해야 배양 2일 전에, IL-13이 없는 같은 배양배지를 배양 6일까지 첨가하였다. 6일째에, 주로 세포간 랑게르한스세포를 제공하기 위해 기껏해야 18시간 동안 200 IU/mL의 사이토카인 TNFα를 첨가하였다:
생체외에서 생성된 약 60~80%의 수상돌기세포는 막 수준으로 랑게린(랑게르한스세포에 대한 특이 마커)을 발현하였으며 랑게르한스세포의 미세구조의 특이 마커인 버벡 과립(Birbeck's granules)을 나타냈다.
생체외에서 생성된 랑게르한스세포는 생체내 랑게르한스세포와 같은 기능을 가지고 있다. 그들은 MIN-3α에 의해 화학적으로 유인될 수 있거나 또는 IL-1β의 영향 하에서 또는 TNP 또는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산과 같은 강력한 알레르겐에 의한 감작 후 이동할 수 있다.
실시예 7: 동량의 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포 군을 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포는 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 million/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
본 발명 전반에 걸쳐, 배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 배양 4일째에 IL-13이 없는 같은 배양배지를 첨가하고 이틀 더 계속 배양하였다. 배양 6일째에 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포 두 군을 생성할 수 있기 위해, 기껏해야 18시간 동안 200 IU/mL의 사이토카인 TNFα를 첨가하였다:
생체외에서 생성된 약 30~50%의 수상돌기세포는 막 수준으로 랑게린을 발현하였다.
생체외에서 생성된 약 30~50%의 수상돌기세포는 막 수준으로 DC-SIGN를 발현하였다.
이중 표지 실험을 통해 생성된 수상돌기세포는 랑게린+ 또는 DC-SIGN 중 어느 하나임을 확인하였다.
실시예 8: 주로 활성화된 성숙 수상돌기세포를 제공하기 위한 분리된 CD14
+
단핵세포의 배양
상기 실시예 1에서 얻은 CD14+단핵세포는 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 million/mL의 비율로 37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 배양하였다.
본 발명 전반에 걸쳐, 배양배지는 처음에 사이토카인 즉, 10 ng/mL의 사이토카인 IL-13을 ⅓ 첨가하였다. 상기 배양은 사이토카인 IL-13의 배양시간에 상관없이 6일까지 실시되었다. 6일째에 활성화된 성숙 수상돌기세포를 생성하기 위해, 20시간 이상 동안 200 IU/mL의 사이토카인 TNFα를 첨가하였다:
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 MIP-3β의 특이 수용체인 성숙 마커 CD83, DC-LAMP 및 CCR7를 발현하였다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 MIP-3β에 의해 강하게 화학적 유인되었으며, 이는 CCR7 수용체의 기능을 입증하는 것이다.
실시예 9: 현탁액 단세포 이동 모델에서 주로 랑게르한스세포 군의 이용
세포 발생: 실시예 6 참조
생체외에서 생성된 랑게르한스세포의 어떤 종류의 공격, 예를 들어 미생물, 예를 들어 세균 타입의 미생물과 같은 생물체의 공격에 대한 이동능을 평가하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 기저막(MatrigelTM타입) 또는 보이덴 챔버를 모방한 기질로 덮혀 있거나 그렇지 않은 8~5 ㎛의 구멍이 있는 막으로 분리되는 2개의 구획으로 나뉜 이동 챔버를 사용하였다:
37℃에서 10분 동안 15 mg/mL 농도의 만난 100 ㎕으로 생체외에서 생성된 2.5×105개의 랑게르한스세포를 자극하였다.
세균 타입의 이러한 자극 후, 2%(v/v)의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)이 첨가된 RPMI 1640 배양배지 0.5 mL 당 2.5×105개의 랑게르한스세포를 이동 챔버의 윗쪽 구획에 접종하였다. 2%(v/v)의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)이 첨가된 RPMI 1640 배양배지 0.75 mL는 이미 이동 챔버의 아래쪽 구획에 침착되어 있었다.
37℃에서 한시간동안 이동 후, 이동 챔버의 아래쪽 구획 즉, 이동 챔버의 아래쪽 구획에 있는 배양배지로 이동된 랑게르한스세포를 얻었다.
이동된 랑게르한스세포는 현미경의 백색광 하에서 세포 수로 정량하였다.
결과는 이동 지수(migration index)로 나타내었다. 즉, 이동한 자극을 받은 세포 퍼센트를 자발적으로 이동한 세포의 퍼센트(음성대조군)로 나눈 값이다.
만나으로 자극한 후, 이동 지수는 1.6∼1.9였다. 즉, 생체외에서 생성되고 만난에 의해 자극을 받은 랑게르한스세포는 미처리 랑게르한스세포보다 1.6∼1.9배 더 이동하였다.
생체외에서 생성된 랑게르한스세포는 자극제의 영향 하에서 이동할 수 있는데, 이는 그들이 기능을 가지고 있고, 상기 테스트는 잠정적으로 공격제/알레르겐의 영향을 평가하기 위한 연구 모델로서의 이용 가능성을 제시하는 것이다.
실시예 10: 사이토카인 분비용 현탁액 단세포 모델에서 주로 세포간 수상돌기세포 군의 이용
세포 발생: 실시예 5 참조.
어떠한 공격, 예를 들어 화학물질, 특히 TNP 또는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산과 같은 알레르겐의 공격에 대해 생체외에서 생성되는 세포간 수상돌기세포에 의해 분비되는 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 12 또는 IL-12의 단백질 분비를 정량하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 ELISA(Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 타입의 분석을 이용할 수 있다:
37℃에서 10분 동안 5 mM 농도의 TNP 800㎕로 생체외에서 생성된 세포간 수상돌기세포 1 밀리온을 자극하였다.
자극 후, 세포간 수상돌기세포를 얻고 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 million/mL의 비율로 6-웰 플레이트에 접종하였다.
37℃에서 5%의 CO2를 포함하는 습한 상태에서 48시간 동안 배양한 후, 세포간 수상돌기세포를 포함한 배양 상등액을 수집하였다.
처음에 배양 상등액을 세포 잔해를 제거하기 위해 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 ELISA에 사용하였다. IL-12 ELISA 과정에 대해서는 제조업체(R&D System)에서 제공되는 설명서를 참조할 수 있을 것이다.
결과는 ng/1 million cells/mL의 IL-12의 농도로 나타냈다.
생체외에서 생성되고 TNP에 의해 자극을 받은 세포간 수상돌기세포는 2.1∼2.7 ng IL-12p75/1 million cells/mL 농도의 IL-12p75를 분비하는 반면, 미처리 세포간 수상돌기세포는 0.1 ng 미만 IL-12p75/1 million cells/mL 농도의 IL-12p75를 분비하였다.
생체외에서 생성된 세포간 수상돌기세포는 자극제의 영향 하에서 면역활성이있는 사이토카인의 분비를 증가시켰다. 이는 그들이 기능을 가지고 있고, 상기 테스트는 잠정적으로 공격제/알레르겐의 영향을 평가하기 위한 연구 모델로서의 이용가능성을 제시하는 것이다.
실시예 11: 항원 내재화를 위한 현탁액 이중세포층 모델에서 LC 및 IDC 두 군의 이용
세포 발생: 실시예 7 참조.
대체로 동량의 LC 및 IDC 사용의 장점은 생체내 조건에서 처럼 두가지 세포 타입과 상호작용 가능성에 있다. 생체외에서 생성된 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 내재화 경로를 연구하기 위해, 덱스트란을 사용하여 다음의 프로토콜에 따라 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 기술을 사용하였다:
생체외에서 생성된 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포를 포함하는 2×105개의 혼합체를 다음에 나열된 것들과 연속적으로 배양하였다:
2 ㎍/mL의 항-DC-SIGN 항체 5 ㎕와 4℃에서 30분 동안,
1 ㎍/mL의 플루오로크롬 트리컬러가 결합되어 있는 안티-마우스 고트 항체 10 ㎕와 4℃에서 30분 동안,
1/20으로 희석된 정상 마우스 혈청으로 블럭킹하고,
1 ㎍/mL의 파이코에리트린(phycoerythrin)이 결합되어 있는 항-랑게린 항체 2 ㎕와 4℃에서 30분 동안,
1%의 활성이 없는 우태아혈청이 첨가된 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 제조된 내재화 완충액 500 ㎕에서 FITC-덱스트란 1 mg/mL(테스트를 위해서는 37℃에서, 음성대조군에 대해서는 4℃에서, 15분 동안 반응시켰다).
FITC-덱스트란과의 반응 후, 플로우 사이토메트리로 세포를 분석하였다.
결과는 음성대조군과 비교하여 양성인 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 비율 즉, 덱스트란을 내재화시킨 세포의 퍼센트로 나타내었다.
50~70%의 랑게르한스세포(랑게린+)가 FITC-덱스트란을 내재화시켰고, 60~80%의 세포간 수상돌기세포(DC-SIGN+)가 FITC-덱스트란을 내재화시켰다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 항원을 내재화시킬 수 있으며, 이는 그들이 기능을 가지고 있고, 상기 테스트는 항원의 내재화 연구를 위한 모델로서의 이용가능서을 제시하는 것이다.
실시예 12: LC 및 IDC 둘 다의 성숙 경로를 연구하기 위한 현탁액 이중세포층 모델에서 LC 및 IDC 두 군의 이용
세포 발생: 실시예 7 참조.
6일째에 사이토카인 TNFα를 48시간 동안 200 IU/mL의 비율로 첨가하였다.
대체로 동량의 LC 및 IDC 사용의 장점은 생체내 조건에서 처럼 두가지 세포 타입과의 상호작용 가능성에 있다. 생체외에서 생성된 LC 및 IDC의 성숙 경로를 연구하기 위해, LC 및 IDC 둘다의 성숙 마커인 DC-LAMP의 세포질내 발현을 분석하였다. 이를 위해, 다음의 프로토콜에 따라 실험을 실시하였다:
생체외에서 생성된 LC 및 IDC를 포함하는 2×105개의 혼합체를 다음에 나열된 것들과 연속적으로 배양하였다:
항-DC-SIGN 항체(2 ㎍/mL) 5 ㎕ 또는 항-랑게린 항체(2 ㎍/mL) 10 ㎕ 중 어느 하나와 4℃에서 30분 동안,
1 ㎍/mL 농도의 플루오로크롬 FITC(Fluorescein IsoThioCyanate)가 결합되어 있는 안티 마우스 고트 항체 10㎕와 4℃에서 30분동안,
1/20 으로 희석한 정상 마우스 혈청으로 블럭킹하고,
1 ㎍/mL 농도의 플루오로크롬 PE(PhycoErythrin)이 결합되어 있는 항-DC-LAMP 항체 10 ㎕와 4℃에서 30분동안.
결과는 DC-LAMP 양성인 LC 퍼센트와 DC-LAMP 양성인 IDC 퍼센트로 나타내었다.
48시간 동안 TNFα와 배양한 후, 표현형 분석을 통해, IDC(DC-SIGN+)는 성숙 마커인 DC-LAMP를 발현하지 않는 반면, 50%의 랑게린+ LC 군은 DC-LAMP 양성이었다. 이들 결과는 성숙 과정이 피부 DC 부차집단 즉 LC 및 IDC 에서 뚜렷이 다르다는 것을 약술하는 것이다. 따라서, 피부 방어층을 뚫고 표면 진피부분에 들어갈 수 있는 활성성분(화장료 또는 약제학적 성분)은 피부의 DC 즉 상피의 LC 및 표면 진피의 IDC 둘 다의 다른 성숙 경로를 야기할 것이다. 그러한 접근은 잠정적 저항성과 국소적 응용 시 면역적 활성성분(화장료 또는 약제학적 성분)를 구별시킬 것이다.
실시예 13: 천연 T 림프구의 알레르기성 자극을 위한 현탁액 단세포 모델에서 활성화된 성숙 수상돌기세포의 이용
세포 발생: 실시예 8 참조.
생체외에서 생성된 성숙한 수상돌기세포가 얽혀있는 수상돌기세포의 기능을 얻을 수 있는 지, 즉 알레르기성 천연 T 림프구의 증식을 자극할 수 있는 지를 연구하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 혼합된 림프구 반응을 실시하였다:
생체외에서 생성된 성숙 수상돌기세포를 CD40-리간드가 도입된 섬유아세포와 함께 10:1(활성화된 수상돌기세포:CD40-리간드가 도입된 섬유아세포)의 비율로 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 5% CO2를 포함하는 습한 상태에서 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
활성화된 수상돌기세포를 수확하여 10%의 인간 AB 혈청이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 알레르기성 천연 T 림프구와 함께 3일 동안 배양하였다. 125∼8000 개의 활성화된 성숙 수상돌기세포를 105개의 천연 T 림프구와 함께 배양하였다.
림프구 혼합 배양 3일째에, 5μCi의 트리시에이티드 티미딘(3Thymidine) 20㎕를 18시간 동안 첨가하였다.
결과는 가로축에는 활성화된 수상돌기세포(125∼8000 세포) 수, 세로축에는 알레르기성 천연 T 림프구에 결합된 방사성 티미딘 cpm(counts per minute)을 표시된 그래프로 나타내었다.
CD40-리간드와 반응 후, 천연 T 림프구의 증식을 낮게 유도하는(3×103∼6×103cpm) 활성화된 수상돌기세포와 비교하여 생체외에서 생성된 활성화된 수상돌기세포는 천연 T 림프구의 증식(12×103∼16×103cmp)을 강하게 촉진하였다.
생체외에서 생성된 수상돌기세포는 얽혀있는 수상돌기세포의 기능을 얻을 수 있는 즉, 높은 촉진능을 얻을 수 있다. 이는 그들이 기능을 가지고 있고, 상기 테스트는 촉진능 연구를 위한 모델로서의 이용가능성을 제시하는 것이다.
실시예 14: 공동 배양 시 각질형성세포 및 LC의 단층 다세포 모델
세포 발생: 실시예 4 또는 6 참조.
1×105개의 각질형성세포를 Clonetics 배지(KGM-2 참조)를 포함한 6-웰 플레이트 타입의 배양 접시에 접종하여 각질형성세포의 컨플루언스(confluence) 상태까지 액침배양하였다. 컨플루언스 지점에서, 실시예 4 또는 6에 따라 생체외에서 생성된 1∼3×105개의 수상돌기세포를 첨가하였다. 배양은 10%의 활성이 없는 우태아혈청(decomplemented fetal calf)과 2개의 사이토카인 즉, 400 IU/mL의 사이토카인 GM-CSF 및 10 ng/mL의 사이토카인 TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 추가로3 내지 4일 동안 유지하였다.
실시예 15: 공동 배양에서 섬유아세포 및 세포간 수상돌기세포의 단일층 다세포 모델
세포 발생: 실시예 3 및 5 참조.
1×105개의 섬유아세포를 10% Hyclone II 우혈청, 1000 IU/mL의 페니실린, 최종 농도가 20 ㎍/mL인 젠타마이신이 첨가된 DMEM-Glutamax 배지를 포함한 6-웰 플레이트 타입의 배양 접시에 접종하여 섬유아세포의 컨플루언스(confluence) 상태까지 액침배양하였다. 컨플루언스 지점에서, 실시예 3 또는 5에 따라 생체외에서 생성된 1∼3×105개의 수상돌기세포를 첨가하였다. 배양은 추가로 3 내지 4일 동안 유지하였다.
실시예 16: 상피세포 및 랑게르한스세포를 포함하는 치주 점막의 재건 표피 또는 재건 상피의 3차원 다세포 모델
다음의 프로토콜에 따라 모델을 준비하였다:
1∼2×106개의 각질형성세포 또는 상피세포를 보이덴 챔버 타입(구멍크기가 0.4 ㎛인 막)의 인서트에 접종하였다. 배양 1일 후, 실시예 4에 따라 생체외에서 생성된 1∼3×105개의 수상돌기세포를 첨가하고, 10% Hyclone II 우혈청, 아스코르브산 2-인산염(최종농도: 1 mM), EGF(최종농도: 10 ng/mL), 하이드로코르티손(최종농도: 0.4 mg/mL), 우무린(최종농도: 0.12 IU/mL), 이수프렐(최종농도: 0.4 ㎍/mL), 트리아이오도티로닌(최종농도: 2×10-9M), 아데닌(최종농도: 24.3 ㎍/mL), 페니실린(최종농도: 100 IU/mL), 암포테리신 B(최종농도: 1 ㎍/mL) 및 젠타마이신(최종농도: 20 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM-Glutamax/Ham F-12 배양배지(3/1 v/v)에서 3 내지 8일 동안 계속 액침배양하였다.
그 후, 우혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우무린을 제외하고 액침배양에 사용된 것과 같은 배양배지에서 각질형성세포 배양물을 12 내지 18일 동안 air-liquid interface 에 놓아두었다.
그 후, 우혈청이 10%에서 1%로 줄어든 것을 제외하고는 액침배양에 사용된 것과 같은 배양배지에서 12 내지 18일 동안 상피세포 배양물을 액침배양하였다.
실시예 17: 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 재건 진피 또는 재건 치주융모막의 3차원 다세포 모셀
세포 발생: 실시예 3, 4, 5, 6, 또는 7 참조.
다음의 프로토콜에 따라 모델을 제조하였다:
10% Hyclone II 우혈청, 아스코르브산 2-인산염(최종농도: 1 mM), EGF 또는 상피생장인자(최종농도: 10 ng/mL), 페니실린(최종농도: 100 IU/mL), 암포테리신 B(최종농도: 1 ㎍/mL) 및 젠타마이신(최종농도: 20 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM-Glutamax배양배지에서 2×105개의 정상인간의 피부 또는 치주점막의 섬유아세포를 디페닐포스포릴아자이드와 교차결합되어 있는 콜라겐 기반 세포간질의 기질에 접종하였다. 배양 14일 후, 생체외에서 생성된 수상돌기세포 1∼3×105개를 결합기질 등가물에 접종하고 14일 더 배양하였다.
사용된 마커들은 세포간 수상돌기세포(DC-SIGN+), 대식세포(노보카스트라로부터 대식세포 마커: clone 3A5 -모노클로날 항체 NCL-MACRO) 및 내피세포(V-CAM+)를 나타낸다.
실시예 18: 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 재건 피부의 3차원 다세포 모델
세포 발생: 실시예 4 또는 6 참조.
다음의 프로토콜에 따라 모델을 제조하였다:
10% Hyclone II 우혈청, 아스코르브산 2-인산염(최종농도: 1 mM), EGF 또는 상피생장인자(최종농도: 10 ng/mL), 페니실린(최종농도: 100 IU/mL), 암포테리신 B(최종농도: 1 ㎍/mL) 및 젠타마이신(최종농도: 20 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM-Glutamax 배양배지에서 2×105개의 정상인간의 피부 섬유아세포를 콜라겐/글리코스아미노글리칸/키토산을 기반으로 한 진피 기질에 접종하여 14일 동안 배양하였다.
10% Hyclone II 우혈청, 아스코르브산 2-인산염(최종농도: 1 mM), EGF(최종농도: 10 ng/mL), 하이드로코르티손(최종농도: 0.4 mg/mL), 우무린(최종농도: 0.12IU/mL), 이수프렐(최종농도: 0.4 ㎍/mL), 트리아이오도티로닌(최종농도: 2×10-9M), 아데닌(최종농도: 24.3 ㎍/mL), 페니실린(최종농도: 100 IU/mL), 암포테리신 B(최종농도: 1 ㎍/mL) 및 젠타마이신(최종농도: 20 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM-Glutamax/Ham F-12 배양배지(3/1 v/v)에서 2×105개의 정상인간의 각질형성세포 및 생체외에서 생성된 1∼3×105개의 수상돌기세포를 7일 동안 액침배양하였다.
그 후, 우혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우무린을 제외하고 액침배양에 사용된 것과 같은 배양배지에서 배양물을 14일 동안 air-liquid interface 에 놓아두었다.
그 후, 배양물을 Tissue-Teck®과 같은 비결정형 레진으로 코딩하고, 액체질소로 동결하였다.
랑게린, DC-SIGN+, V-CAM 및 노보카스트라로부터 대식세포 마커: clone 3A5 -모노클로날 항체 NCL-MACRO에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 다른 세포 타입을 규명하기 위해 6㎛ 두께로 동결 시료를 절단하여 면역조직화학적 연구를 실시하였다.
사용된 마커들은 상피에서 랑게르한스세포(랑게린+), 진피에서 세포간 수상돌기세포(DC-SIGN+), 대식세포(노보카스트라로부터 대식세포 마커: clone 3A5 -모노클로날 항체 NCL-MACRO) 및 내피세포(V-CAM+)의 존재를 나타낸다.
실시예 19: 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 채색된 재건 피부의 3차원 다세포 모델
실시예 18의 프로토콜에 따라 모델을 제조하고, 10,000개의 멜라닌세포를 각질형성세포와 생체외에서 생성된 수상돌기세포와 더불어 함께 접종하였다.
실시예 18에 기재된 마커와 더불어, 멜라닌세포를 면역표지하고(MELAN-A), 면역조직화학적 연구를 실시하였다(DOPA 반응).
실시예 20: 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 재건피부의 3차원 다세포 모델
세포 발생: 실시예 3, 5 또는 7 참조.
실시예 18의 프로토콜에 따라 모델을 제조하였다.
사용된 마커들은 세포간 수상돌기세포(DC-SIGN+), 대식세포(노보카스트라로부터 대식세포 마커: clone 3A5 -모노클로날 항체 NCL-MACRO) 및 내피세포(V-CAM+)의 존재를 나타낸다.
실시예 21: 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 재건 질점막의 3차원 다세포 모델
세포 발생: 실시예 4 또는 6 참조.
다음의 변형을 제외하고는 실시예 18의 프로토콜에 따라 모델을 제조하였다: 각질형성세포는 질의 상피세포로 대체되고, 섬유아세포는 질점막에서 유래한 것이며, 배양은 전체적으로 배양배지에서 액침배양을 실시하였다.
그 후, 상피세포 배양은 우혈청이 10%에서 1%로 줄어든 것을 제외하고는 같은 배양배지에서 12 내지 18일 동안 액침배양하였다.
사용된 마커들은 상피에서 랑게르한스세포(랑게린+), 융모막에서 세포간 수상돌기세포(DC-SIGN+), 대식세포(노보카스트라로부터 대식세포 마커: clone 3A5 -모노클로날 항체 NCL-MACRO) 및 내피세포(V-CAM+)의 존재를 나타낸다.
실시예 22: 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 재건 질점막의 3차원 다세포 모델
세포 발생: 실시예 3, 5 또는 7 참조.
다음의 변형을 제외하고는 실시예 18의 프로토콜에 따라 모델을 제조하였다: 각질형성세포는 질의 상피세포로 대체되고, 섬유아세포는 질점막에서 유래하며, 배양은 전체적으로 배양배지에서 액침배양하였다. 그 후, 상피세포배양은 우혈청이 10%에서 1%로 줄어든 것을 제외하고는 액침배양에 사용된 배지와 같은 배양배지에서 12 내지 18일 동안 액침배양하였다.
사용된 마커는 융모막에서 세포간 수상돌기세포(DC-SIGN+), 대식세포(노보카스트라로부터 대식세포 마커: clone 3A5 -모노클로날 항체 NCL-MACRO) 및 내피세포(V-CAM+)의 존재를 나타낸다.
실시예 23: LC/상피 환경간의 상호작용을 연구하기 위한 실시예 16, 18, 19 또는 20에 기재된 모델 중 어느 하나의 이용
모델을 제조한 후, E-cadherin을 표지하였다.
부착물질 E-cadherin은 랑게르한스세포 및 상피세포에서 발현되었다. 이는 랑게르한스세포 및 이웃하는 상피세포 사이에 상기 단백질에 의한 이호성 타입(heterophilic type)의 상호작용 가능성을 나타내는 것이다.
실시예 24: UVB 조사의 영향을 연구하기 위한 실시예 16에 기재된 재건 상피모델의 이용
주로 상피에 침투하는 다양한 환경인자들 특히, UV 조사, 보다 정확하게는 UVB의 영향을 연구하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 면역조직화학적 연구를 이용하여 UVB 조사 후 재건 상피 모델에서 랑게르한스세포의 표현형적 프로파일 및 이동을 평가하였다:
배양 11일 후, 재건상피에 UVB 0.5 joule/cm2를 조사하고, 3일 동안 계속 배양하였다.
항-랑게린 모노클로날 항체를 이용하여 랑게르한스세포의 상피 고갈을 관찰하기 위한 면역조직화학적 연구를 실시하였다.
항-CD1a, 항-CCR6, 항-HLA-DR, 항-CD80, 항-CD83, 항-CD86, 항-CCR7 및 항-DC-LAMP의 모노클로날 항체를 이용하여 재건상피의 상피 부분에 있는 랑게르한스세포의 표현형적 변형을 탐지하였다.
UVB 조사 후, 상피에 남아있는 랑게르한스세포에서 보촉진물질(co-stimulation) CD86의 강도를 표지하였을 때 감소되는 것과 더불어 상피 부분의 랑게르한스세포 수는 50% 이상 감소됨을 관찰하였다.
실시예 25: UVA 조사의 영향을 연구하기 위한 실시예 20에 기재된 재건 피부모델의 이용
피부의 진피에 영향을 주는 다양한 환경인자, 특히 UV 조사, 보다 정확하게는 UVA 조사의 영향을 연구하기 위해, 다음의 프로토콜에 따른 면역조직화학적 연구에 의해 UVA 조사 후 재건 피부 모델에서 세포간 수상돌기세포의 표현형적 프로파일을 평가하였다:
배양 32일 후, 재건 피부 샘플에 UVA 10 joule/cm2를 조사하고, 3일 동안 계속 배양하였다.
면역조직화학적 연구를 통해 항-DC-SIGN, 항응고인자 XIIIa, 항-HLA-DR, 항-CD80, 항-CD83, 항-CD86, 항-CCR7 및 항-DC-LAMP의 모노클로날 항체를 이용하여 재건피부 샘플의 진피 부분에 있는 세포간 수상돌기세포의 표현형적 변형을 탐지할 수 있었다.
UVA 조사 후, 진피에 있는 세포간 수상돌기세포에서 HLA-DR 및 CD86의 강도를 표지하여 감소를 관찰하였다.
실시예 26: 활성성분의 영향 하에서 분비된 사이토카인의 프로파일을 연구하기 위한 실시예 18, 19 및 20 중 어느 하나에 기재된 재건 피부 모델의 이용
인간피부에 사용되는 활성성분의 친염증 또는 항염증 활성 가능성에 접근하고 잠정적으로 민감성 또는 알레르기능을 평가하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 ELISA를 이용하여 IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα, INFγ 등등의 친염증성 사이토카인과 IL-2, IL-10 등등의 면역억제 사이토카인의 분비를 정량하였다:
배양 32일 후, 레티놀 10S를 최종농도 0.05%가 되도록 배양배지에 7일에 걸쳐 첨가하였다.
사이토카인은 14일 동안 2 내지 3일마다 분석하였다.
레티놀 10S는 친염증성 사이토카인을 자극하는 것으로 관찰되었다.
실시예 27: 알레르기 반응을 조절할 수 있는 활성성분을 스크리닝하기 위한 실시예 16에 기재된 재건 상피 모델의 이용
알레르기 스트레스 유도 후 활성성분의 면역조절 효과는 다음의 프로토콜에 따라 연구하였다:
배양 12일째에, 보이덴 챔버의 위쪽 구획에 300 ㎕의 TNP(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid)를 37℃에서 30분에 걸쳐 5 mM의 농도로 첨가하였다.
자극 후, 배양배지를 테스트하는 활성성분을 다른 농도로 포함하고 있는 신선한 배지로 교체하고 2일 더 계속 배양하였다.
배양 14일 후, 보이덴 챔버(구멍크기가 8∼5 ㎛인 막으로 되어 있으며, 상기막은 MATRIGELTM으로 덮혀있거나 혹은 그렇지 않음)의 아래쪽 구획으로 이동한 랑게르한스세포 수는 광학현미경 하에서 카운팅하여 정량하였다. 배양배지를 원심분리한 다음, IL-12(R&D System)의 ELISA 및 단백질 분석(BCA)를 위해 상등액을 사용하였다. 결과는 IL-12의 농도(ng/㎍ 단백질)로 나타내었다.
이동 테스트와 IL-12 합성 실험 결과를 통해 테스트된 활성성분의 면역조절 프로파일을 세울 수 있었다.
실시예 28: 활성성분의 면역촉진 또는 면역억제 활성 또는 면역저항의 평가 및/또는 유도를 연구하기 위한 실시예 18, 19 및 21 중 어느 하나에 따라 얻은 재건 피부 또는 재건 점막 모델의 이용
활성성분의 면역 및/또는 저항 반응을 유도하는지 여부에 대한 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포의 역량을 평가하기 위해, 다음의 프로토콜에 따라 3차원 배양모델에서 면역조직화학적 연구를 통해 랑게르한스세포 및/또는 세포간 수상돌기세포의 표현형적 프로파일을 연구하였다:
배양 32일째에, 활성성분을 다른 농도로 배양배지에 첨가하고 7일동안 계속 배양하였다.
세포의 표현형적 프로파일은 항체 시리즈를 이용한 면역조직화학적 연구를 통해 분석하였다(실시예 18 및 24 참조).
실시예 29: 활성성분의 면역촉진 또는 면역억제 활성을 연구하고 또는 면역저항을 평가 및/또는 유도하기 위한 실시예 10에 따라 얻은 현탁액에서 주로 세포간 수상돌기세포를 포함하는 모델의 이용
다음의 프로토콜에 따라 연구하였다:
TNP로 자극한 후, 세포를 테스트되는 활성성분을 다른 농도로 포함하는 배양배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 종결되면, 항-CD1a, 항-CCR6, 항-HLA-DR, 항-CD80, 항-CD83, 항-CD86, 항-CCR7 및 항-DC-LAMP의 모노클로날 항체를 이용하여 플로우 사이토메트리에 따라 세포간 수상돌기세포의 표현형적 프로파일을 연구하였다.
세포의 표현형적 프로파일을 통해 테스트되는 활성성분의 면역조절 효과를 밝힐 수 있다.
실시예 30: HIV에 의한 감염을 연구하기 위한 실시예 21 또는 22에 기재된 재건 점막 모델 중 어느 하나의 이용
다음의 프로토콜에 따라 연구되었다:
배양 35일 후 재건점막에 55 ng p24/106농도의 바이러스 현탁액(monocytotrophic 균주인 HIV-1BaL)을 주사기로 직접 주입하거나 또는 침착하여 감염을 실시하였다. 37℃에서 오버나이트 동안 감염과정을 지속시킨 후 배양배지로 4회 세척하였다. 1주일 동안 계속 배양한 다음 다음의 분석을 실시하였다:
바이러스 복제는 ELISA(Coulter/Immunotech)에 의해 감염된 재건점막의 세포 상등액에서 단백질 p24의 생성을 측정함으로써 정량하였다.
감염된 재건점막의 조직 절편에서in situPCR 에 따라 DC의 감염을 측정하였다. 표지된 다이곡시게닌(digoxigenin) 또는 표지되지 않은 dNTP를 포함한 상태에서, gag 유전자의 특이 프라이머는 SK38 과 SK39이다. PCR 조건은 94℃에서 변성단계 및 95℃, 55℃, 72℃ 20 사이클 단계를 포함한다. PCR 후, 절편을 알칼라인 포스파타아제와 더불어 항-DIG 항체과 함께 배양하였다. 그 후, 절편은 메틸 그린으로 염색하였다.
in situPCR의 결과, 상피(랑게르한스세포) 및 진피(세포간 수상돌기세포)에서 감염된 세포가 관찰되었다.
이 모델은 바이러스의 감염, 복제 및 전염 메카니즘을 연구하고 치료방법(백신, 신약 등등을 포함)의 연구 및 개발을 위한 수단으로 이용될 수 있다.
실시예 31: 무혈청 배지를 이용한 수상돌기세포의 현탁액 제조-치료적 응용
CD14+배양 프로토콜은 실시예 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8과 동일하다. 그러나, 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 1640 배지는 STEMBIO(StembioA: 뉴 A 100 참조)로부터 특이 무혈청 배지로 대체된다.
그 후, 수상돌기세포는 민감성에 대한 표적으로서 그리고 세포 면역치료 시 치료수단(항원전달세포)로서 제공할 수 있다.
본 발명은 수상돌기세포를 생성하기 위한 말초순환혈로부터 분리한 CD14+단핵세포의 이용에 관한 것으로, 현탁액, 단일층 및 3차원 세포 및 조직 모델에 이용할 수 있다. 본 발명은 면역독성/면역저항의 평가, 화장료 및 약제학적 활성성분의 개발 및 세포 및 조직 치료방법의 개발 및 실시를 위한 연구 모델로서 이들 세포와 이들 모델을 이용할 수 있다.
본 발명은 상기에 언급된 각각의 기술적 문제들을 안전하고, 믿을 수 있고 재현 가능한 방식으로 최초로 해결하여 산업 및 상업 특히 화장품 및/또는 제약 및/또는 의약산업에 이용가능하다. 본 발명은 산업 및 상업 분야, 특히 화장품 및/또는 제약산업에서 믿을 수 있고 재생가능한 이용을 통해 주요 기술적 개선점들을 가지고 있고, 주요한 임상적 연관성을 가질 수 있는 것으로 예상된다.
Claims (57)
- 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포 둘 다 미분화상태, 및/또는 분화되고 미성숙한 상태, 및/또는 성숙한 상태, 및/또는 서로 얽혀있는 상태인 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 혼합체의 적어도 하나를 분화를 통해 얻기 위한 말초순환혈로부터 분리한 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 분화는 대식세포 타입 및/또는 내피세포 타입과 같은 미분화상태 및/또는 분화된 세포로 된 부차집단을 적어도 하나 추가로 포함함으로 일어남을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 분화는 2개의 사이토카인 GM-CSF 및 TGFβ중 적어도 하나, 바람직하게는 TGFβ1를 포함하는 배양배지에서 배양에 의해 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항, 2항 또는 3항에 있어서, 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포 군의 분포는 상기 배양 시 일정 시간동안 일정 농도의 사이토카인이 ⅓ 존재하는 가에 달려 있으며, 바람직하게는 상기 사이토카인은 사이토카인 IL-13임을 특징으로하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 랑게르한스세포로 쉽게 분화되도록 하기 위해 약 2일동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 세포간 수상돌기세포의 형성이 우세하도록 약 6일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 랑게르한스세포/세포간 수상돌기세포의 두 군의 형성이 우세하도록 약 4일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 추가 분화 정도는 사이토카인 TNFα을 첨가한 상기 배양으로부터 얻음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 8항에 있어서, 성숙한 활성화된 수상돌기세포로의 성숙을 피함과 동시에 여전히 미성숙한 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 분화를 위해, 상기 TNFα를 첨가한 배양은 일정 농도로 일정 시간동안 실시되며, 시간은 약 18시간 미만임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 8항에 있어서, 성숙한 활성화된 수상돌기세포로의 성숙을 위해 상기 TNFα를 첨가한 배양은 일정 농도로 일정 시간동안 실시되며, 시간은 약 20시간 이상임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 GM-CSF의 농도는 0.1∼4000 IU/mL이며, 유리하게는 약 400 IU/mL이고, 사이토카인 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1의 농도는 0.01∼400 ng/mL이며, 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 IL-13의 농도는 만약 상기 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.01∼400 ng/mL이며 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 TNFα의 농도는 만약 상기 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.1∼4000 IU/mL이며 유리하게는 약 200 IU/mL임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 전항들 중 어느 한 항에 있어서, CD14+단핵세포의 추출은 개체에서 채혈 후24시간을 넘지 않은 상태, 바람직하게는 18시간을 넘지 않은 상태, 바람직하게는 12시간을 넘지 않은 상태, 바람직하게는 6시간을 넘지 않은 상태의 신선한 혈에서 실시되며, 보다 바람직하게는 채혈 후 바로 즉시 그리고 5시간을 넘지 않은 상태에서 추출됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 생성되는 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포는 생체내에서 발견되는 것과 동일한 기능의 표현형을 가지고 있음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 랑게르한스세포 및 세포간 수상돌기세포의 배양은 특히 적어도 상피세포 및 스트로마세포를 포함하는 3차원 배양 환경에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상피세포와 스트로마세포는 별개로 분리되며, 랑게르한스세포는 주로 상피세포 부분에 위치하며 세포간 수상돌기세포는 주로 스트로마세포 부분에 위치함을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 내피세포와 대식세포는 배양에서, 특히 3차원 환경에 놓여 있을 때, 유래한 어떤 세포로부터 분화에 의해 얻음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 피부 또는 점막 모델 즉, 상피와 결합 기질을 둘 다 포함하는 모델에 융합될 때, 세포내 환경, 바람직하게는 섬유아세포와 상피세포, 및 기질 환경으로 인해, 랑게르한스세포로 분화하기 위해 상피에 위치할 수 있고, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포로 분화하기 위해 결합 기질에 위치할 수 있고, 그리고 생체내 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포, 대식세포 및 내피세포에 필적할만한 기능성을 얻을 수 있는 세포, 바람직하게는 미분화된 세포를 얻음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 용도.
- 다음을 포함하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정:a) 종래기술에 따라 미리 채취된 말초순환혈로부터 CD14+단핵세포의 추출, 및b) 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포 둘 다를 얻기 위해 충분한 시간 동안 몇몇 사이토카인을 포함한 배양배지에서 분리된 CD14+단핵세포의 배양.
- 제 18항에 있어서, 상기 배양은 사이토카인 GM-CSF 및 TGFβ 중 적어도 하나, 바람직하게는 TGFβ1가 있는 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 배양은 상기 배양 시 일정 시간동안 일정 농도의 사이토카인이 ⅓ 있는 상태에서 실시되며, 바람직하게는 상기 사이토카인은 사이토카인 IL-13임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 랑게르한스세포로의 분화가 우세하도록 약 2일 동안 사이토카인 IL-13이 첨가된 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 세포간 수상돌기세포의 형성이 우세하도록 약 6일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 랑게르한스세포/세포간 수상돌기세포의 혼합체의 형성이 우세하도록 약 6일 동안 사이토카인 IL-13을 첨가한 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 사이토카인 TNFα를 첨가한 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 24항에 있어서, 활성화된 성숙 수상돌기세포로의 성숙을 피함과 동시에 랑게르한스세포 및 여전히 미성숙한 세포간 수상돌기세포로의 분화를 위해, 상기 TNFα을 첨가한 배양은 일정 농도로 일정 시간동안 실시되며, 시간은 약 18시간 미만임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 24항에 있어서, 활성화된 성숙 수상돌기세포로의 성숙을 위해, 상기 TNFα를 첨가한 배양은 일정 농도로 일정 시간동안 실시되며, 상기 시간은 약 20시간 이상임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, CD14+단핵세포의 추출은 신선한 혈 즉, 바람직하게는 개체로부터 채혈 후 24시간을 넘지 않게, 바람직하게는 18시간을 넘지 않게, 바람직하게는 12시간을 넘지 않게, 바람직하게는 6시간을 넘지 않게 실시되며, 보다 바람직하게는 채혈 후 바로 그리고 5시간을 넘지 않게 즉시 추출됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 3차원 배양 환경, 특히 상피세포와 스트로마세포가 적어도 하나 있는 상태에서 실시됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 분화 정도는 특히 별개로 분리된 상피세포와 스트로마세포를 적어도 하나 포함하는 3차원 배양 환경에서 상기 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 배양을 실시함으로써 얻음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인을 첨가한 배양 후, 성숙화의 상보적인 촉진은 상기 세포의 표현형과 기능적 성숙을 얻기에 충분한 시간 동안 특히 CD40-리간드와 수상돌기세포의 상호작용에 의해 또는 사이토카인 TNFα 또는 지다당류의 첨가로 인해 일어남을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 혼합체가 다양한 비율로 3차원 배양 모델에 융합됨을 포함함을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 31항에 있어서, 3차원 배양 모델은 피부모델, 점막모델, 진피모델, 융모막모델, 표피모델 및 상피모델을 포함함을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 3차원 배양 모델은 바람직하게는 다음으로부터 선택되는 진피 또는 융모막의 기질 지지체를 포함함을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정:a) 스트로마세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 기반 젤;b) 글리코스아미노글리칸 및/또는 선택적으로 키토산을 하나 이상을 포함할 콜라겐으로 된 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 융합가능한 스트로마세포, 특히 섬유아세포임;c) 하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린의 젤 또는 막;d) 진피층으로 구성되는 진피 등가물;e) 표피가 제거된 죽은 진피; 및,f) 반투과성 합성막, 특히 반투과성 나이트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인 및 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜릭 애시드 멤브레인 또는 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 불활성 지지체, 상기 불활성 지지체는 가능한한 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함.
- 제 31항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 이용된 3차원 배양 모델은 표면에 상피세포 특히 각질형성세포가 침착되어 있는 상기 모델로 구성됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 31항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 이용된 3차원 배양 모델은 보족세포 타입, 예를 들어 신경세포 및/또는 내피세포 및/또는 멜라닌세포 및/또는 림프구 및/또는 지방세포 및/또는 머리카락, 다른 신체의 털 및 피지선과 같은 피부 부속물이 적어도 하나 융합되어 있는 모델로 구성됨을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 공정.
- 제 18항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 배양에서 유래한 어떤 세포들은 특히 상피세포 및 스트로마세포를 적어도 하나 포함하는 3차원 환경에 있을 때 내피세포와 대식세포로 분화함을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양공정.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 방식으로 CD14+단핵세포를 이용함을 포함하는 배양 공정.
- 적어도 2개의 사이토카인 즉 사이토카인 GM-CSF 및 사이토카인 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1이 첨가된 기초배양배지를 포함함을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 배지.
- 제 38항에 있어서, 상기 2개의 사이토카인이 첨가된 배양배지에는 사이토카인 IL-13이 첨가되어 있으며, 바람직하게는 배양동안 일정 순간에 배양배지에 도입될 수 있도록 물리적으로 분리되어 있음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 배지.
- 제 38항 또는 제 39항에 있어서, 상기 2개의 사이토카인이 첨가된 배양배지에는 또한 TNFα가 첨가되어 있으며, 바람직하게는 배양동안 일정 순간에 배양배지에 도입될 수 있도록 물리적으로 분리되어 있음을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 배지.
- 제 38항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 GM-CSF의 농도는 0.1∼4000 IU/mL이며 유리하게는 약 400 IU/mL이고, 사이토카인 TGFβ, 바람직하게는 TGFβ1의 농도는 0.01∼400 ng/mL이며 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 IL-13의 농도는 만약 이 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.01∼400 ng/mL이며 유리하게는 약 10 ng/mL이고, 사이토카인 TNFα의 농도는 만약 이 사이토카인이 배지 내에 있다면, 0.1∼400 IU/mL이며 유리하게는 약 200 IU/mL임을 특징으로 하는 CD14+단핵세포의 생체외 배양 배지.
- CD14+단핵세포로부터 얻을 수 있는, 특히 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 CD14+단핵세포로부터 얻을 수 있는, 또는 제 18항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 따른 배양 공정에 의해 얻을 수 있는, 또는 제 38항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지의 이용을 통해 얻을 수 있는 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 혼합체 즉, 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포 둘 다 미분화된 상태 및/또는 분화되고 미성숙한 상태 및/또는 성숙한 상태 및/또는 얽혀있는 상태로 있는 혼합체를 적어도 하나 포함하는 세포체.
- 현탁액, 단일층 또는 3차원, 단세포 또는 다세포 연구 모델을 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 CD14+단핵세포를 이용하여 얻을 수 있는, 또는 제 18항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 따른 배양 공정에 의해 얻을 수 있는, 또는 제 38항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지의 이용을 통해 얻을 수 있는, 또는 제 42항에서 언급된 것으로써 얻을 수 있는 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 혼합체의 용도.
- 제 43항에 있어서, 상기 연구 모델은 다음으로부터 선택되는 지지체를 포함함을 특징으로 하는 용도:a) 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 기반 젤;b) 글리코스아미노글리칸 및/또는 선택적으로 키토산을 하나 이상을 포함할 콜라겐으로 된 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 융합가능한 스트로마세포, 특히 섬유아세포임;c) 하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린의 젤 또는 막;d) 진피층으로 구성되는 진피 등가물;e) 표피가 제거된 죽은 진피; 및,f) 반투과성 합성막, 특히 반투과성 나이트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인 및 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜릭 애시드 멤브레인 또는 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 불활성 지지체, 상기 불활성 지지체는 가능한한 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함.
- 제 44항에 있어서, 상기 연구 모델은 주로 랑게르한스세포 또는 세포간 수상돌기세포, 또는 랑게르한스세포/세포간 수상돌기세포의 혼합체, 또는 랑게르한스세포/세포간 수상돌기세포/내피세포/대식세포의 혼합체, 또는 세포간 수상돌기세포/내피세포/대식세포의 혼합체 중 어느 하나를 포함함을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에서 또는 제 42항에서 언급된 것으로써 얻을 수 있는 혼합체를 적어도 하나 포함함을 특징으로 하는 재건 피부 또는 재건 점막, 또는 재건 진피 또는 재건 융모막의 완전 모델 또는 재건 상피모델 특히 표피모델 또는 다른 현탁액, 단일층 또는 3차원, 단세포 또는 다세포 모델.
- 제 46항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 지지체를 포함함을 특징으로 하는 모델:a) 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 기반 젤;b) 글리코스아미노글리칸 및/또는 선택적으로 키토산을 하나 이상을 포함할 콜라겐으로 된 다공성 기질, 상기 다공성 기질은 융합가능한 스트로마세포, 특히섬유아세포임;c) 하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린의 젤 또는 막;d) 진피층으로 구성되는 진피 등가물;e) 표피가 제거된 죽은 진피; 및,f) 반투과성 합성막, 특히 반투과성 나이트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 또는 스폰지, 반투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 테르프탈레이트(PET) 멤브레인, 반투과성 아노포어 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 또는 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인 및 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜릭 애시드 멤브레인 또는 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 불활성 지지체, 상기 불활성 지지체는 가능한한 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함함.
- 제 46항 또는 제 47항에 있어서, 주로 랑게르한스세포, 또는 세로간 수상돌기세포 또는 랑게르한스세포/세포간 수상돌기세포의 혼합체, 또는 랑게르한스세포/세포간 수상돌기세포/내피세포/대식세포의 혼합체, 또는 세포간 수상돌기세포/내피세포/대식세포의 혼합체 중 어느 하나를 포함함을 특징으로 하는 모델.
- 제 46항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, LC는 상피부분에 위치하고, IDC, 대식세포 및 내피세포는 결합기질에 위치함을 특징으로 하는 모델.
- 제 46항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 구조를 제공하는 세포는 특히 스트로마세포, 특히 섬유아세포, 및/또는 상피세포 특히 각질형성세포, 및/또는 다른 세포 타입 특히 T-림프구, 및/또는 신경세포, 및/또는 색소세포 특히 멜라닌세포, 및/또는 지방세포 및 면역반응을 제공하는 세포는 특히 랑게르한스세포, 세포간 수상돌기세포 및/또는 대식세포이며, 혈관형성을 제공하는 세포는 특히 내피세포임을 특징으로 하는 모델.
- 활성성분의 연구 및/또는 선별용 모델로서 제 1항 내지 제 37항 및 제 42항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 따라 얻음을 특징으로 하는 랑게르한스세포와 세포간 수상돌기세포의 혼합체의 용도.
- 활성성분의 면역촉진제 또는 면역억제제 활성을 연구하거나 또는 상기 활성성분에 의한 면역적 저항을 평가하거나 유도하기 위한 특히 제 43항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 따른 모델의 용도.
- 상피방어층의 물리적 병인, 피부 또는 점막의 자극, 생물체 예를 들어 바이러스, HIV와 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미생물, 미세 항원의 공격, 광독성(phototoxicity), 광보호(photoprotection), 활성성분 특히 화장료 또는 약제학적 활성성분의 효과 및 최종산물 특히 화장료 또는 약제학적 산물의 효과를 연구하고, 병원균에 의한 감염 메카니즘을 연구하기 위한 제 43항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 따른 모델의 용도.
- 병원균 예를 들어 바이러스, HIV와 같은 리트로바이러스, 세균, 곰팡이, 미생물 및 미세 항원의 존재 여부를 탐지하기 위한 제 43항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 따른 모델의 용도.
- 의약, 생의약 또는 화장품의 적용, 특히 생체외 또는 생체내 면역 또는 저항 반응, 다음의 환경적 공격 특히 UV 조사와 같은 물리적 타입, 또는 화학적 또는 생물학적 타입의 조절, 특히 예방 또는 치료법의 목적을 위한 제 43항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 기재된 모델의 용도.
- 조직 및 세포 공학 적용을 위한 제 43항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 기재된 모델의 용도.
- 항암세포치료와 같은 의약 또는 생의약의 적용, 예를 들어 면역반응을 촉진할 수 있는 DC의 주입, 면역적 저항 상황, 예를 들어 면역성이 결핍된 T 세포를 생성하여 자가면역질환 환자에서의 세포치료, 면역계에 영향을 미치는 질병에 대한 유전자치료, 및 백신의 개발 및 생산을 위한 제 42항에 따른 세포체의 용도.
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