KR20040063657A

KR20040063657A - 식물 병원성 바이러스에 의해 유도되는 양방향성프로모터를 공유하는 고추 유래의 신규한 방어유전자

Info

Publication number: KR20040063657A
Application number: KR1020030001152A
Authority: KR
Inventors: 백경희; 신령; 김민정
Original assignee: 학교법인고려중앙학원
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2004-07-14
Also published as: KR100489008B1

Abstract

본 발명은 식물 병원성 바이러스에 의해 특이적으로 유도되는 양방향성 프로모터를 갖는 고추 유래의 신규한 방어유전자에 관한 것으로, 본 발명은 식물 병원성 바이러스에 감염된 고추에서 병원균에 대한 방어반응으로 발현되는 방어유전자를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명의 고추 유래의 방어유전자는 바이러스를 포함하여 세균, 에틸렌 및 메틸 비올로겐에 의해 발현 유도되며, 양방향 프로모터를 가지며, 고추의 게놈 상에 싱글 카피로 존재한다.

Description

식물 병원성 바이러스에 의해 유도되는 양방향성 프로모터를 공유하는 고추 유래의 신규한 방어유전자{Novel defense genes sharing bidirectional promoter from hot pepper induced by plant pathogenic virus}

본 발명은 식물 병원성 바이러스에 의해 특이적으로 유도되는 고추 유래의 신규한 방어유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 식물 병원성 바이러스에 의해 특이적으로 유도되는 양방향성 프로모터를 갖는 고추 유래의 신규한 방어유전자에 관한 것이다.

식물은 병원균에 대해 스스로를 보호하기 위한 방어 메카니즘을 발달시켜왔다. 병원균 감염 시 식물의 일차 반응은 과민성 반응뿐만 아니라 리그닌의 축적 및 산화적 가교(oxidative cross-linking)를 통해 물리적 장벽을 세우기 위해 세포벽을 강화한다. 그 후, 식물은 다수의 유전자 발현을 증가시킴으로써 감염에 반응하며, 어떤 유전자는 질병에 대한 저항과 관련될 수도 있을 것이다. 이들 유전자에는 병원관련단백질 및 항미생물단백질을 코딩하는 것들이 포함되어 있다. 병원관련단백질의 발현은 병원균의 감염이나 환경 스트레스와 관련된 요인들에 의해 영향을 받는다. 동물 및 세균과 비교하여 식물 바이러스는 다세포성 숙주에 전신적으로 감염하기 위해서는 셀룰로오스를 포함하는 세포벽의 장벽을 통과해야 하는 독특한 문제에 직면한다. 유동성의 원형질막에서의 발아로 바이러스가 벽을 통과하지 못하며, 파지의 라이소자임과 유사한 세포벽 분해효소를 코딩함으로써 다른 세포벽과 대면하기 전에 세포 간 아포플라스틱 공간에 바이러스 자손이 위치하게 할 것이며, 만약 분해된다면, 그 세포를 죽일 것이고 결국 바이러스 감염이 전파되지 않도록 할 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 식물 바이러스는 독특한 종류의 이동 단백질(movement proteins, MPs)을 코딩하여 감염된 잎에서 세포벽을 통해 세포에서 세포로 국소적으로 이동하여 체관으로 바이러스가 들어가도록 하고, 체관부를 통해 먼 거리까지 이동하여 숙주의 전신을 감염시킬 것이다.

한편, 대부분의 진핵생물의 유전자는 수천개의 뉴클레오티드로 분리되며 일방향 프로모터에 의해 전사된다. 그러나, 포유동물에서 양방향성 프로모터 하에서 근처에 위치하여 다르게 전사되는 유전자가 몇몇 발견되었다. 식물에서는, Shwarz et al.(1981)가 옥수수의 엽록체 유전자의 양방향성 프로모터를 처음으로 보고한이래, 양방향성 프로모터를 갖는 몇몇 엽록체 유전자들이 보고되었다. 핵 내 유전자에서, 종자 특이 올레오신 유전자와 메티오닌 설폭사이드 리덕타아제 추정 유전자 간의 양방향성 프로모터가 보고되었다. 이외에, 지금까지 양방향성 프로모터에 대한 다른 보고는 없었다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물 병원성 바이러스에 감염된 고추잎에서 발현되는 방어유전자(CaTin1,Capsicum annuumTMV induced clone 1 및CaTin1-2)를 분리하고 그것의 염기서열과 구조적 특이성을 규명하며 또한 발현 패턴을 조사함으로써 바이러스 병원균에 대한 상기 방어 유전자의 특이한 방어적 역할을 규명하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 담배 모자이크 바이러스의 병원형을 고추잎에 감염시킨 후 감염된 고추잎에서 특이하게 유도되는 유전자 및 프로모터를 분리하고 상기 유전자의 구조 및 발현 패턴을 규명하고 상기 유전자가 바이러스 유도 외에 세균 및 다양한 자극에 의해 발현되는 지의 여부를 확인함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구체적인 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 담배 모자이크 바이러스에 감염된 고추잎에서 분리한CaTin1및CaTin1-2cDNA 클론의 게놈 구조 및 기관 특이적 발현을 나타낸 것이다.

도 2는 다양한 스트레스 하에서 고추잎에서의CaTin1-2의 발현 패턴을 나타낸 것이다.

도 3은CaTin1-2프로모터를 부분적으로 결실시킨 구성체들에서 TMV, 에틸렌 및 메틸 비올로겐 처리 시 GUS의 활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 담배 모자이크 바이러스의 병원형을 고추잎에 감염시키는 단계; 감염된 고추잎에서 특이하게 유도되는 유전자 및 프로모터를 분리하는 단계; 상기 유전자의 구조 및 발현 패턴을 규명하는 단계; 및, 상기 유전자의 바이러스 유도 외에 세균 및 다양한 자극에 의한 발현여부를 확인하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 통해 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 식물 병원형 바이러스에 감염된 고추잎의 제조

식물 병원형 바이러스에 의해 특이적으로 유도되는 고추의 방어유전자를 분리하기 위해, 담배 모자이크 바이러스 P₀병원성 타입에 저항성인 고추(Capsicum annuum L.) 부강품종(cultivar Bugang)을 사용하였다. 상기 고추를 25℃의 배양실이나 온실에서 16 h/8 h의 명암 광주기 사이클 하에서 재배하였다. 병원균 처리와 핵산 추출을 위해 두 달 동안 키운 고추의 건강하고 폭이 넓은 잎을 사용하였다.

바이러스 감염수액을 제조하기 위해, TMV-P₀가 감염된 담배잎(N. tabacum cv.Burley 21)을 CaCl₂가 포함된 페트리 디쉬에 놓은 후, 상기 감염된 담배잎에 5 mM EDTA (pH 7.4)를 포함한 0.25 M의 인산염 완충액을 넣고 마쇄하여 TMV-P₀를 포함하는 잎의 수액을 제조하였다.

병원균을 고추에 감염시키기 위해, 상기에서 얻은 바이러스를 포함한 수액을 4 또는 5개의 넓게 편 고추잎의 표면에 바르고 카보런덤(일본 하야시 케미칼사 제품)을 이용하여 문질러 주었다. 무처리 식물체들은 인산염 완충액과 카보런덤만을 가지고 문질러 주었다. 전신 반응을 관찰하기 위해, 아래쪽에 있는 잎 2개에 TMV-P₀수액을 처리한 후, 위쪽 잎을 0, 3, 6, 9, 15일째에 수확하였다.

실시예 2: 담배 모자이크 바이러스에 감염된 고추잎에서 TMV-유도성 방어유전자의 분리

고추에서 TMV-유도성 방어 유전자를 동정하기 위해, TMV-P₀처리 후 24시간 혹은 48시간 째에 과민성 반응을 나타냈던 고추 부강품종에서 추출한 poly(A)+ RNA로부터 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 TMV-P₀로 처리하거나 혹은 무처리한 군의 poly(A)+ RNA 중 어느 하나로부터 합성된 단일가닥의 cDNA 프로브를 사용하여 차등 스크리닝을 실시하였다. 생체 내에서 라이브러리에서 무작위로 선택된 잘린 파지미드 DNA를 이중 나일론 멤브레인에 고정시키고 각 프로브와 결합시키는 리버스 노던 슬랏-블랏 분석을 실시하였다.

Ausubel(1995)의 방법에 따라 고추잎에서 게놈 DNA를 분리하였다.

서던 블랏을 위해, 10 ㎍의 게놈 DNA를 50 유니트(unit)의 제한효소로 밤새도록 온침하였다. 0.8%의 아가로오스 젤에서 1 X TBE 완충용액을 사용하여 밤새도록 전기영동을 실시한 다음, 10 X SSC에 포함된 나이트란 플러스 멤브레인으로 옮겨 DNA 단편을 분리하였다.

노던 블랏 분석을 위해, Ausubel의 방법에 따라 두 달된 고추잎에서 총 RNA를 분리하였다. 15 ㎍의 총 RNA를 MOPS 완충액(pH 7.0)에 6%의 포름알데히드를 포함하는 1.0%의 아가로오스 젤에서 전기영동한 다음, 나이트란 플러스 멤브레인으로 옮겼다. RNA 분석은 서너 번 반복하였으며 각 샘플을 준비하기 위해 처리 당 2개의 고추를 선택하였다. 기관 특이적인 RNA 블랏 분석 시, 각 레인 당 15 ㎍ 대신40 ㎍의 RNA를 로딩하였다.

서던 및 노던 블랏 하이브리디제이션은³²P로 표지된 프로브를 사용하여 실시하였다. 이미 고추에서 분리한 760 bp의 cDNA 클론인CaPINII프로브(GeneBank Accession Number AF221097)와 697bp의 cDNA 클론인CaPR4프로브(GeneBank Accession Number AF244122)는 PCR을 통해 방사성표지하였다.PR-1프로브를 위해, 고추의 399 bp의PR-1cDNA(CaPR-1으로 명함)를 PCR로 증폭하였다. 2개의 프라이머, 5'-ATGGGACACTCTAATATTGCCT-3' 및 5'-AACCCTAGCACAACCAAGACG-3'는 데이터베이스의 서열에 기초하여 제작하였다(GenBank Accession Number AF053343). 차등 스크리닝을 위해 제작된 cDNA 라이브러리는PR-1유전자의 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 블랏 하이브리디제이션은 종래의 방법에 따라 실시하였다. 하이브리디제이션 후, 멤브레인을 2 X SCC 용액으로 실온에서 10분 동안 두 번, 0.1% SDS를 포함한 0.1 X SCC 용액으로 실온에서 10분 동안 그리고 65℃에서 5분 동안 세척하였다. 멤브레인을 건조시킨 다음, X-선 필름에 노출시키거나 혹은 BAS-2500 포스포이미저(후지 포토필름, 일본)로 직접 관찰하였다. 재 실험 시에는 필터를 0.1 X SSC, 0.2% SDS로 -80℃에서 20분동안 제거하였다.

도 1a 에 나타난 바와 같이, TMV에 감염된 고추에서 특이하게 유도되는 유전자 중 하나인 N6-11 유전자를 분리하였으며, 상기 클론을CaTin1( C apsicum a nnuum TMV induced clone1)이라 명명하였다. 상기 클론은 180개의 아미노산 서열로 된 단백질을 코딩하는 775 bp를 포함하였다.CaTin1유전자 특이 프라이머 1(5'-AGCCTGAAATAGAAGAAACGGAGATGGAGATGAGA-3')과 2(5'-GGAACCAGAATTGGTTACTCATGGCTACCTGAAC-3')를 사용하여, 클론테크(CLONTECH, Palo Alto, USA)의 제조방법에 따라, 게놈워커 라이브러리에서 어댑터가 결합되어 있는 게놈 DNA 단편으로부터 약 1.0 kb의CaTin1프로모터를 얻었다. 놀랍게도, 프로모터를 찾던 중,CaTin1의 전방에 다른 상동유전자인CaTin1-2와 마주보고 있음을 알았다.CaTin1-2는 158개의 아미노산을 가지고 있으며, 상기 아미노산 서열은CaTin1유전자와 85%의 상동성과 91.4%의 유사성을 나타냈다.CaTin1및CaTin1-2의 서열은 PLAT 도메인을 제외하고는 다른 알려진 유전자와 상동성을 갖지 않았다. 비록, 포유동물에서 리폭시게나아제, 트리아실글리세롤 리파아제 및 지단백 분해효소를 코딩하는 PLAT 도메인을 포함하는 유전자가 잘 알려져 있다 할 지라도, PLAT 도메인의 기능은 그다지 연구되지 않았다. 식물에서, PLAT 도메인은 Ca²⁺의존적인 방식으로 세포막과 직접적으로 상호작용한다고 알려져 있다.

상기 유전자들의 게놈 구조 및 기관 특이적 발현을 조사하기 위해, 고추의 게놈 DNA를 분리하고 제한효소인EcoRI(E),HindIII(H),XbaI(X),NcoI(N) 및SalI(S) 로 절단한 다음, 그 단편을 0.8%의 아가로오스 젤에서 분리하였다. 상기 젤을 나일론 멤브레인에 옮긴 다음, 매우 엄격한 조건 하에서(65℃)³²P로 표지된CaTin1(a),CaTin1과CaTin1-2의 프로모터 영역(b) 혹은CaTin1-2(c) cDNA 프로브와 결합시키고, 방사선 사진을 Fuji-BAS 2500 포스포이미저 분석기로 판독하여 그 결과를 도 1b에 나타내었다. 게놈 DNA 블랏 분석은 3번 실시하였다.

도 1b에 나타난 바와 같이, 프로모터 영역은 도 1a 처럼 2개의XbaI 과 1개의SalI 제한사이트를 갖는다. 엄격한 하이브리디제이션 조건 하에서(65℃),EcoRI,HindIII 및NcoI 제한효소는 같은 위치에서 단일 밴드를 생성하였고,XbaI 혹은SalI 제한효소는 각 특이 프로브와 결합시켰을 때 다른 크기의 밴드를 생성하였다. 이들 결과로부터CaTin1과CaTin1-2유전자는 고추의 게놈에서 싱글 카피를 가졌으며, 이는 다른 상동유전자는 고추의 게놈에 존재하지 않음을 뜻하는 것이다.

정상 상태에서 상기 유전자들의 기관 특이적 발현을 알아보기 위해, 고추의 열매, 잎, 뿌리 및 줄기에서 추출한 총 RNA로부터 RNA 블랏 분석을 실시하였고 그 결과를 도 1c에 나타내었다. 각 레인은 다음과 같다: RF, 붉은고추(익은고추); GF, 녹색고추(풋고추); F, 꽃; YL, 어린 잎; OL, 성숙 잎; R, 뿌리; S, 줄기. 로딩 컨트롤로써, 아래쪽에 에티디움 브로마이드로 염색한 rRNAs 밴드가 나타나 있다. 노던 블랏 분석은 3번 실시하였으며, 매번 유사한 결과를 얻었다.

도 1c에 나타난 바와 같이,CaTin1과CaTin1-2유전자는 단지 뿌리에서만 풍부하게 발현되었으며, 상기 유전자의 프로모터는 뿌리 특이 발현과 관련이 있으리라 사료되었다. 지금까지 뿌리에서 유전자 발현 조절에 대해 알려진 자료는 거의 없었다. 뿌리 특이 발현을 조절하는 시스-액팅 시퀀스는 규명된 바 없고, 단지 뿌리 특이 프로모터만이 소수 기재되어 있으며, 그것의 활성은 오히려 뿌리의 특정 부분들에 한정되어 있다. 뿌리 특이 발현 시 주로 관련된 시스-액팅 시퀀스로는 ocs-elements 와 as-1-elements 가 알려져 있다.

실시예 3: 담배 모자이크 바이러스 유도성 방어 유전자의 발현

담배 모자이크 바이러스에 의한CaTin1과CaTin1-2의 발현 패턴을 알아보기 위해, 고추의 부강품종에 TMV-P₀를 처리하여CaTin1과CaTin1-2의 발현 패턴을 조사하였다. TMV-P₀를 처리한 후 3 시간 간격으로 120 시간까지 잎에서 총 RNA를 추출하고, 포름알데히드-아가로오스 젤에서 RNA를 분리한 다음,³²P 로 표지된CaTin1및CaTin1-2전장 cDNA 프로브를 이용하여 블랏팅을 실시하였다. 로딩 컨트롤로써 rRNA 밴드를 사용하였고, 대조군으로써, 추출용액을 잎에 처리하여 무처리군으로 하였으며, 고추에서 분리한 다른PR유전자인CaPR1유전자를 양성대조군으로 사용하였다. 4회 반복실험하여 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 무처리 잎에서CaTin1-2전사체는 거의 검출되지 않았다.CaTin1-2전사체는 TMV-P₀처리 후 48 시간째에 축적되기 시작하여, 처리 후 72 시간까지 유지되었다. 그러나,CaTin1전사체는 24 시간부터 검출되기 시작하여 72 시간까지 유지하였다. TMV 처리 시 양성대조군으로써,CaPR1유전자의 발현 패턴을 조사하였다.CaPR1유전자는 처리 후 48 시간부터 관찰되기 시작하였다. 즉,CaTin1유전자의 발현은CaPR1유전자 보다 일찍 유도되나CaTin1-2의 발현 패턴은CaPR1의 발현 패턴과 유사하였다.

CaTin1-2유전자가 전 조직에서 유도되는 지를 조사하기 위해, 하단쪽 고추잎 2장에 TMV-P₀수액을 처리하고, 처리 후 0, 3, 6, 9, 15일째에 원거리에 있는TMV-P₀수액을 처리하지 않은 상단쪽의 잎을 수확한 다음 총 RNA를 추출하였다. 포름알데히드-아가로오스 젤에서 RNA를 분리한 다음, 32P로 표지된CaTin1-2전장 cDNA 프로브를 사용하여 노던 블랏팅을 실시하였다.CaPR1유전자를 양성대조군으로 하였다. 3회 반복 실험하였으며, 매번 유사한 결과를 얻었다.

도 2b에 나타난 바와 같이,CaTin1-2유전자에 해당하는 전사체는 3일째에 원거리에 있는 무처리 잎에서 축적하기 시작하였다.CaTin2유전자의 전신 유도 시간은 양성대조군인CaPR1유전자보다 빨랐으나CaTin1과는 유사하였다(미도시됨).

비교예 1: 다른 병원균 감염에 의한 CaTin2 의 발현

식물에서 TMV-P₀유도성CaTin1-2유전자가 다른 병원균에 대한 방어에도 관여하는 지를 조사하기 위해, 병원균인 크산토모나스 캠페스트리스 페소바 베시카토리아(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria, Xcv)를 2종류의 어얼리 칼원더 고추품종의 잎에 처리하였다.

민감한 고추품종인 어얼리 칼원더(Early Calwonder, ECW;bs1/bs1,bs2/bs2,bs3/bs3)는bs2유전자를 포함하는 반면, 동질유전자 계열인 어얼리 칼원더-20R(Early Calwonder-20R, ECW-20R;bs1/bs1,Bs2/Bs2,bs3/bs3)는 비병원성 유전자인avrBs2을 포함하는Xcv균주에 대해 내성을 갖는 우성형질(Bs2)을 포함하고 있다.Xcv는 효모 추출물, 덱스트로오스 및 칼슘 카보네이트를 포함하는 배지에서배양하였고, 세포 현탁액(1 X 10⁸cells/mL)을 고추잎에 침투시킨 다음, 상기 잎에서 RNA를 추출한 다음CaTin1-2특이 프로브를 사용하여 RNA 블랏 분석을 하였다.

도 2c에 나타난 바와 같이,CaTin1-2유전자의 전사체는 저항성 품종(ECW-20R)에만 축적되었다. 또한,CaPR1은Xcv처리 시 과민성 반응 특이적인 전형적인 발현 패턴을 나타냈다. 따라서,CaTin1-2는 바이러스-식물뿐만 아니라 세균-식물 간의 저항성 반응에서도 과민성 특이 유도를 나타내었다.

비교예 2: 다양한 자극 하에서 바이러스 유도성 방어 유전자의 발현

CaTin1-2가 다른 자극 하에서도 유도되는 지를 알아보기 위해, 다양한 유도체를 식물에 처리하였다. 다양한 비생물적 유도체를 처리한 고추 잎을 수확하여 일정 시간대에서 RNA를 분리하였다.

비교실험예 1: 살리실산 처리에 의한 CaTin1-2 의 발현

고추잎에 5 mM의 살리실산 용액을 분무한 후,CaTin1-2의 전사체를 조사하였다. 다른 대조군 식물에도 유사한 방법으로 증류수를 수시로 처리하였다. 처리 후, 지정 시간대에 잎을 수확하고 액체질소로 재빨리 냉동한 다음 -80℃에 보관하였다.

살리실산(Salicylic acid, SA)은 병원균의 공격에 대해 식물의 방어반응을 활성화시키는 신호전달계의 중요한 구성성분이다.

도 2d에 나타난 바와 같이,CaTin1-2유전자의 발현은CaPR1전사체 유도와는 달리 유도되지 않았다.

비교실험예 2: 에틸렌 처리에 의한 CaTin1-2 의 발현

에틸렌 처리 실험을 위해, 고추를 50 ㎕/L의 에틸렌 가스로 포화시킨 배양실에 지정된 시간 주기 동안 놓아두고 일정 시간대에서 고추잎을 수확하였다. 에틸렌의 농도는 가스 크로마토그래피에서 확인하였다. 대조군 실험은 에틸렌이 없는 동일한 배양실에서 실시하였다.

도 2d에 나타난 바와 같이,CaTin1-2유전자는 에틸렌 처리 후 2 시간째에 발현이 증가되기 시작하여 8 시간까지 유지되다 그 후 감소하였다.

비교실험예 3: 메틸 자스몬산 처리에 의한 CaTin1-2 의 발현

상기 비교실험예 1의 살리실산 처리와 같은 방법으로 고추잎에 10 M의 메틸 자스몬산(MeJA) 용액을 분무하였다. 다른 대조군 식물에도 유사한 방법으로 증류수를 수시로 처리하였다. 처리 후, 지정 시간대에 잎을 수확하고 액체질소로 재빨리 냉동한 다음 -80℃에 보관하였다. 양성대조군으로CaPR1유전자를 사용하였다. 3회 반복 실시하여 그 결과를 도 2d에 나타내었다.

도 2d에 나타난 바와 같이,CaTin1-2유전자는 메틸 자스몬산 처리 시 유도되지 않았다

비교실험예 4: ABA, NaCl 혹은 메틸 비올로겐 처리에 의한 CaTin1-2 의 발현

5 M의 ABA, 400 mM의 NaCl 혹은 0.5 mM의 메틸 비올로겐을 뿌리를 제거한 고추식물에 처리하였다.

도 2e에 나타난 바와 같이,CaTin1-2전사체는 염화나트륨 처리 시 약간 유도되었고 메틸 비올로겐에 의해서는 의의있게 유도되었으며, ABA 처리 시CaTin1-2는 발현되지 않았다.

메틸 비올로겐은 H₂O₂의 유도체로써,CaTin1-2유전자의 발현 시 중요한 유도체이다. 몇몇 연구들에서, 질병 저항에 있어서 살리실산의 중요성은 이미 확인되었다. 메틸 자스몬산 및 에틸렌은 스트레스 관련 신호전달경로에 관련된 식물 호르몬이다.CaTin1-2는 살리실산과 메틸 자스몬산에 의해서는 유도되지 않으나, 에틸렌에 의해서만 유도되었다. 이전 보고에서, 과민성 반응의 유도는 신호물질인 살리실산을 필요로 한다고 알려져 있으나, 최근 보고에서는 과민성 반응동안 생기는 중가 활성 산소물(reactive oxygen intermediates (ROI))이 과민성 반응을 매개하는 신호로 작용함이 설득력 있게 나타나고 있다.CaTin1전사체는 ROI를 발생시키는 MV에 의해 유도될 수 있기 때문에CaTin1-2의 전신 발현은 ROI와 관련될 것이다.CaTin1-2의 발현 패턴은 TMV 감염 시 보다 늦게 발현된다는 점을 제외하고는CaTin1과 매우 유사하였다. 이러한 거의 동일한 발현 패턴은 이들 두 유전자의 프로모터 공유성을 설명하는 것이다.

PR유전자의 프로모터를 분석한 결과, GCC-박스로 보고된 11개의 에틸렌 반응 요소 즉, TAAGAGCCGCC를 동정하였다. 상기 요소는 식물에서PR유전자의 에틸렌반응 조절에 필수적인 것으로 나타났다. 그러나, GCC-박스는 과일 성숙과 같은 다른 에틸렌 반응과 관련된 에틸렌 조절 유전자의 프로모터에서는 발견된 적이 없다. 유인제 반응(elicitor responsive) (T)TGAC(C) 요소, W-박스는 파아슬리의PR1-1및PR1-2프로모터에서 제일 먼저 확인되었으며, 1개의 WRKY 전사인자는 W-박스와 결합되어 있다고 알려져 있다. 다른 WRKY 전사인자, TDBA12는 또한 W1-박스를 인지하며, 식물 숙주세포에서 병원 유도 신호 전달 경로에서 한 구성원으로써 작용하며 식물방어유전자의 발현을 조절하는 것으로 보인다.

실시예 4: TMV-유도성 방어유전자의 전사개시사이트의 위치 측정

CaTin1-2유전자의 정확한 전사개시사이트를 측정하기 위해,CaTin1-2cDNA 의 센스 가닥에 상보적인 5'-GTTTCCTGCATTAGTTTCCCACCA-3'의 5'-말단에 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 [γ-³²P] ATP로 방사성표지하였다. 대략 100 pmol의 표지된 프라이머를 에틸렌 혹은 메틸 비올로겐 처리 후 4시간째에 잎조직에서 분리한 10 ㎍의 총 RNA와 결합시켰다. 역전사 후, 반응 산물을 6%의 변성시킨 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동한 다음, 방사성사진으로 판독하였다. 프라이머 신장실험을 통해,CaTin1-2의 전사개시사이트를 확인하였고, 동시에 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여CaTin1-2의 해당 영역의 DNA 시퀀싱을 실시하였다.

도 3a에 나타난 바와 같이,CaTin1-2전사개시사이트는CaTin1-2의 상동유전자인CaTin1의 전사개시사이트로부터 955 bp에 위치하고 있다.CaTin1-2의 프로모터에는 4개의 에틸렌에 민감한 GCC-박스, 2개의 근반응요소 (RSEs) 및 W1-박스와 결합한 WRKY 전사인자를 유도하는 유인제가 있다 (도 3b). 4개의 GCC-박스 중, 단지 1개의 박스 만이 안티센스 방향이고, 다른 것들은 센스 방향이다. 또한, TATA-박스를 갖고있다 (미도시됨).

CaTin1-2의 전사조절에 관련된 다른 시퀀스를 알아보기 위해, 우리는CaTin1-2의 프로모터 전체가 결실되어 있고 GUS 코딩유전자가 연결되어 있는 세트를 제작하였다. 상기 세트 중 p+a4Tin1 및 p+a95Tin1 은CaTin1-2프로모터 전체를 포함하고 있으며, p-981Tin1 은CaTin1의 프로모터 전체를 포함하고 있다(도 3b).CaTin1-2유전자는 TMV 처리와 에틸렌에 의해 유도되므로CaTin1-2프로모터가 결실된 구조물을 포함한 형질전환체 식물에서 TMV 및 에틸렌 처리 후 GUS 활성을 조사하였다. 각 분석을 위해, 112.5 ㎕의 4-메틸언벨리페릴 -D-글루쿠로나이드(4-methylunbelliferyl-D-glucuronide, MUG)용액을 마이크로튜브에 넣고 37℃의 수조에서 5분간 미리 항온처리하였다. 그 후, 75 ㎕의 GUS/LUC 완충액(0.1 M KPO₄, pH 7.8, 2 mM Na₂EDTA, 2 mM DTT 및 5% 글리세롤)에 포함된 세포 추출물을 첨가하고 37℃에서 항온처리하였다. 30분 혹은 60분 후, 각 분석 튜브에서 50 ㎕의 앨리쿼트를 얻고 1 M의 종결용액(0.2 M Na₂CO₃)을 포함한 시험관으로 옮겼다. 455 nm의 방출파장 하에서 종결된 반응을 측정하여 반응과정을 정량적으로 평가하였다. 각 세트의 번호는CaTin1전사개시사이트와의 거리를 나타낸다. 다이아몬드형은 GCC-박스를, 동그라미는 W1-박스를, 삼각형은 근반응요소(RSEs)를 나타낸다. 각 세트 당, 10개의 형질전환 세포주를 조사하였으며, GUS 활성(pmol methylumbelliferone/min/mg protein)의 평균값은 5회 실험결과로부터 얻었고, p-GUS 구조물의 활성(1.00으로 고정)과 비교하여 각 세트의 활성으로 계산하였다.

도 3b에 나타난 바와 같이,CaTin1-2프로모터가 결실된 형질전환체 식물에 TMV를 처리하였을 때, 그들이 W1-박스를 포함할 때 프로모터가 없는 GUS 구조물(p-GUS)과 비교하여 높은 GUS 활성을 가졌으며, 반대방향 프로모터인 p-981Tin1 에 대해서는 비슷한 활성을 가졌다. 비록CaTin1및CaTin1-2의 발현 패턴과 발현시간이 매우 유사하다 할 지라도, TMV 감염 시CaTin1의 발현이CaTin1-2보다 빨랐으며(도 2a), 이는 W1-박스의 영향 정도에 따라 결정되는 것 같다.

또한, GCC-박스를 갖지 않을 경우, GUS 활성은 거의 나타나지 않았으며, GCC-박스 1 개 만 있는 경우에는 낮은 GUS 활성을 가진다. 그러나, 3개 이상의 GCC-박스를 갖는 경우, 보다 높은 GUS 활성을 가진다. 따라서, 에틸렌 반응 시 결실에 대한 GUS의 활성은 GCC-박스에 달려있다.

메틸 비올로겐 반응의 경우, 지금까지 메틸 비올로겐 반응요소가 알려져 있지는 않았지만,CaTin1-2및CaTin1의 프로모터(전장)는 다른 결실 세트에 비해 매우 높은 GUS 활성을 나타냈다.

GUS 활성에 대한 히스토케미스트리 염색 결과,CaTin1-2프로모터의 GUS 활성은 뿌리의 전 부분에서 나타나는 것은 아니고,CaTin1의 활성분포와 같이 주로 상단 분열조직에서 나타났다(미도시됨).

일반적으로, 인간과 동물계에서, DNA 손상과 관련된 효소를 코딩하는 유전자, 에너지 대사와 관련된 단백질 및 생존동안 중요하고 긴급한 상황과 관련된 단백질인 히스톤은 양방향성 프로모터를 갖는다. 따라서, 양방향성의 프로모터 시퀀스를 공유하는CaTin1-2과CaTin1는 고추에서 병원균의 감염과 같은 긴급 상황에서 조절될 것으로 사료된다.

이상 상기 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 식물 병원 바이러스에 감염된 고추에서 병원균에 대한 방어반응으로 발현되는 방어유전자를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명의 고추 유래의 방어유전자는 바이러스를 포함하여 세균, 에틸렌 및 메틸 비올로겐에 의해 발현 유도되며, 양방향 프로모터를 가지며, 고추의 게놈 상에 싱글 카피로 존재한다. 또한, 본 발명의 고추 유래의 방어 유전자는 병원균에 대한 방어반응으로 발현되므로 이를 유효성분으로 포함하는 항바이러스제 및 항균제를 제조할 수 있으므로 기능성제품제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> Korea University Foundation <120> A novel defense genes sharing bidirectional promoter from hot pepper induced by plant pathogenic virus <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 804 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> CDS <222> (90)..(626) <400> 1 ggcacgagaa agcattagct ttttttcctc gcattttttc tagagaaaga aacaacgttt 60 aactagactg aaagagagtt caggtagcc atg agt aac caa ttc tgg ttc cgt 113 Met Ser Asn Gln Phe Trp Phe Arg 1 5 ctc act atc att ctc atc tcc atc tcc gtt tct tct att tca ggc tct 161 Leu Thr Ile Ile Leu Ile Ser Ile Ser Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser 10 15 20 gaa cta aat tgt gta tac tca gtt tac gtt cag act ggg caa ttt ttt 209 Glu Leu Asn Cys Val Tyr Ser Val Tyr Val Gln Thr Gly Gln Phe Phe 25 30 35 40 ggg gct gga act gac tca aaa att act ttg agt ctt tac gat gcc gat 257 Gly Ala Gly Thr Asp Ser Lys Ile Thr Leu Ser Leu Tyr Asp Ala Asp 45 50 55 gga tat gga ctt aga atc aag agc cta gag gcg tgg ggt ggg ctt atg 305 Gly Tyr Gly Leu Arg Ile Lys Ser Leu Glu Ala Trp Gly Gly Leu Met 60 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Glu Gln Leu Ser Thr Tyr Asp Pro Gln Ser Tyr His Val Val 165 170 175 Asp Val Leu <210> 3 <211> 641 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> CDS <222> (67)..(540) <400> 3 ttctagtctg cgttgtttat ttttatatat ttttcatttt gcacttgctg atttggtggg 60 aaacta atg cag gaa aca aat aat tgt atc tac aca gct tat gtc cga 108 Met Gln Glu Thr Asn Asn Cys Ile Tyr Thr Ala Tyr Val Arg 1 5 10 act ggg cca ttc gac gag gat gca act gac tca aaa atc acc tta act 156 Thr Gly Pro Phe Asp Glu Asp Ala Thr Asp Ser Lys Ile Thr Leu Thr 15 20 25 30 ctg tat gat gcg aat ggt cat gga att aga atc aac aac cta gta gct 204 Leu Tyr Asp Ala Asn Gly His Gly Ile Arg Ile Asn Asn Leu Val Ala 35 40 45 tgg ggt ggg ctt atg ggc aaa ggt tac aac tac ttt gaa agg gaa aac 252 Trp Gly Gly Leu Met Gly Lys Gly Tyr Asn Tyr Phe Glu Arg Glu Asn 50 55 60 ttg gat atg ttc agt ggg aag ggc ccc tgt ttg aat ggg acc ata tgc 300 Leu Asp Met Phe Ser Gly Lys Gly Pro Cys Leu Asn Gly Thr Ile Cys 65 70 75 aaa atg gtc ttg gct tct gat ggt aca ggc cga aac cat gaa tgg 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His Gly Ile Arg Ile Asn Asn Leu Val Ala Trp Gly 35 40 45 Gly Leu Met Gly Lys Gly Tyr Asn Tyr Phe Glu Arg Glu Asn Leu Asp 50 55 60 Met Phe Ser Gly Lys Gly Pro Cys Leu Asn Gly Thr Ile Cys Lys Met 65 70 75 80 Val Leu Ala Ser Asp Gly Thr Gly Arg Asn His Glu Trp Phe Cys Asn 85 90 95 Tyr Val Glu Val Thr Ser Thr Gly Ala His Lys Arg Cys Ser Gln Gln 100 105 110 Leu Phe Thr Val Asp Gln Trp Leu Ser Thr Asn Arg Ser Pro Tyr Gln 115 120 125 Leu Ser Ala Thr Arg Asn Asn Cys Arg Arg Met Ser Asp Glu Gln Gln 130 135 140 Pro Leu Tyr Asp Ser Glu Ser Asn His Val Val Asp Val Ile 145 150 155 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for amplification of CaTin1 <400> 5 agcctgaaat agaagaaacg gagatggaga tgaga 35 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for amplification of CaTin1 <400> 6 ggaaccagaa ttggttactc atggctacct gaac 34

Claims

서열목록의 서열 1에 기재된 염기서열로 표시되며, 양방향성 프로모터를 포함하며 고추(Capsicum annuum L.)의 게놈 내에 싱글 카피로 존재하며, 식물 병원성 바이러스에 의해 특이적으로 발현됨을 특징으로 하는 고추 유래의 신규한 방어 유전자.
제 1항에 있어서, 상기 양방향성 프로모터는 2개의 TATA 박스, 4개의 GCC-박스, 근반응요소(root responsive element) 및 W1 박스를 포함함을 특징으로 하는 고추 유래의 신규한 방어 유전자.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 에틸렌 또는 메틸 비올로겐에 의해 발현 유도됨을 특징으로 하는 고추 유래의 신규한 방어 유전자.
서열목록의 서열 3에 기재된 염기서열로 표시되며, 제 1항 기재의 방어유전자의 양방향성 프로모터를 공유하며, 고추(Capsicum annuum L.)의 게놈 내에 싱글 카피로 존재하며, 식물 병원성 바이러스에 의해 특이적으로 발현됨을 특징으로 하는 고추 유래의 신규한 방어 유전자.
제 4항에 있어서, 상기 유전자는 에틸렌 또는 메틸 비올로겐에 의해 발현 유도됨을 특징으로 하는 고추 유래의 신규한 방어 유전자.