KR20040047698A

KR20040047698A - 변형된 ｃＤＮＡ 인자 Ⅷ 및 이의 유도체

Info

Publication number: KR20040047698A
Application number: KR1020030085152A
Authority: KR
Inventors: 하우저한스-페터; 바이메르토마스; 필립스마틴
Original assignee: 아벤티스 베링 게엠베하
Priority date: 2002-11-29
Filing date: 2003-11-27
Publication date: 2004-06-05
Also published as: CA2451584A1; AU2003264307A1; US20040197875A1; JP2004180682A; EP1424344A1

Abstract

A) 돼지의 인자 Ⅷ cDNA의 동일한 위치에 상응하는 코돈과 동일하지 않은 사람의 인자 Ⅷ cDNA의 하나 또는 여러 개의 코돈이,

·사람 서열이 중성 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 하전된 아미노산에 대한 서열을 함유하는 경우 돼지 서열에서 발견된 것과 동일한 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 중성 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 중성 아미노산에 대한 코돈 또는 상기와 반대 전하의 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 상기와 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입

하는 방식으로 상이한 코돈으로 치환되거나,

B) 혈우병 환자의 FⅧ cDNA에서 발견된 하전된 아미노산에 대한 하나 또는 여러 개의 코돈이 상기와 반대 전하의 아미노산에 대한 코돈으로 대체되어짐을 특징으로 하는,

야생형 인자 Ⅷ cDNA, 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 DNA 링커 절편에 의해 대체될 수 있는 인자 Ⅷ cDNA내에 돌연변이가 삽입된 변형된 사람의 인자 Ⅷ cDNA.

Description

변형된 ｃＤＮＡ 인자 Ⅷ 및 이의 유도체 {Modified cDNA factor Ⅷ and its derivatives}

본 발명은 향상된 안정성을 가진 생물학적으로 활성 있는 사람의 재조합 인자 Ⅷ 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 DNA 서열, 상기 DNA 서열을 함유하는재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포, 및 사람의 재조합 인자 Ⅷ 및 이의 유도체의 생산을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기의 변형된 DNA 서열을 포함하는 사람의 유전차 치료에서 사용하기 위한 전이 벡터에 관한 것이다.

전형적인 혈우병(hemophilia) 또는 혈우병 A는 유전된 출혈 장애의 가장 일반적인 것이다. 이는 혈액 응고 인자 Ⅷ의 X 염색체-연결된 결핍으로부터 초래되어서, 10,000명 당 한 명 및 두 명 사이의 확률로 거의 남성에게만 영향을 미친다. X-염색체 결함은 자신은 혈우병에 걸리지 않은 여성 보유자에 의해서 유전된다. 혈우병 A의 임상 발현은 비정상적인 출혈 경향이고 인자 Ⅷ 농축물을 사용한 치료가 도입되기 전에 중증 혈우병을 가진 사람에 대한 평균 수명이 20년 이하였다. 혈장으로부터 인자 Ⅷ의 농축물의 사용은 혈우병 환자에 대한 상황을 상당히 향상시켜 왔다. 평균 수명이 크게 증가하여서, 이들 대부분에게 대체로 보통 수명으로 살 가능성을 주었다. 그러나, 혈장 유래 농축물 및 이의 용도에 몇 가지 문제가 있고, 이중 가장 심각한 것은 바이러스의 전이이다. 지금까지, AIDS, B형 간염, 및 비 A형 비 B형 간염을 유발하는 바이러스는 심각하게 개체군들을 공격하여 왔다. 상이한 바이러스 불활성화 방법 및 신규한 고도로 정제된 인자 Ⅷ 농축물이 최근에 개발되고 있음에도 불구하고 부주의한 오염은 배제될 수 없다. 또한, 인자 Ⅷ 농축물은 사람의 혈장 원재료의 제한된 공급으로 인해 상당히 비싸다.

재조합 물질로부터 유래된 인자 Ⅷ 생성물은 A형 혈우병 치료를 위한 혈장 유래된 인자 Ⅷ 농축물의 사용과 관련된 문제의 상당량을 해결할 듯하다. 그러나,재조합 인자 Ⅷ의 개발은 예를 들어, 특히 전체 길이 분자를 고려하여, 상당한 고수율의 생산 수준에 도달하는 문제와 같은 상당한 어려움이 있다.

프로테아제 억제제의 존재하에 제조된 신선한 혈장에서, 인자 Ⅷ은 280 kDa 의 분자량을 가지고 각각 200 kDa 및 80 kDa의 두 개의 폴리펩티드 쇄로 구성된 것으로 나타난다[참고 자료 : Andersson, L.-O., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979-2983]. 이 쇄들은 금속 이온 가교에 의해서 서로 결합된다. 인자 Ⅷ 분자의 다소 단백질 가수분해적으로 분해된 형태는 시판용 농축물로부터 정제된 인자 Ⅷ 물질에서 활성 단편으로서 발견될 수 있다[참고 자료 : Andersson, L.-O., et al.ibid.; Andersson, L.-O., et al. (1985) EP 0 197 901]. 260 kDa부터 하향으로 170 kDa까지의 분자량을 가지는 인자 Ⅷ의 단편화된 형태는, 하나의 80 kDa 경쇄와 조합하여, 모든 변이체가 동일한 아미노 말단을 가지는, 180 kDa부터 하향으로 90 kDa까지 범위의 분자량을 가지는 하나의 중쇄로 구성된다. 중쇄의 아미노 말단 부위는 인자 Ⅷ cDNA의 뉴클레오티드 서열 정보로부터 추론될 수 있는 단일 쇄 인자 Ⅷ 폴리펩타이드의 말단과 동일하다[참고 자료 : Wood, W. I., et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G. A., et al. (1984) Nature 312, 337-342].

하나의 90 kDa 및 하나의 80 kDa 쇄로 구성된, 170 kDa의 분자량을 가지는 인자 Ⅷ의 최소의 활성 형태는, 더 큰 분자량 형태와 동일한 정도로 트롬빈으로 활성화될 수 있고, 따라서 불활성화된 형태를 나타낸다. 또한 이는 혈우병에 걸린 개에서 실험된 것과 같이생체 내에서완전히 생물학적 활성을 가지는 것으로 나타나고 있다[참고 자료 : Brinkhous, K. M., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752-8756]. 그러므로, 170 kDa 형태의 지혈 효과는 인자 Ⅷ의 더 큰 분자량에서와 동일하다.

아미노산 Arg-740 및 Glu-1649 사이에 위치한 인자 Ⅷ 폴리펩티드 쇄의 중간 정도로 과하게 당화된 부위는 완전한 생물학적 활성에 필수적으로 보이지 않는다는 사실은 몇몇 연구자들이 상기 부위를 제거한 재조합 인자 Ⅷ의 유도체를 생산하기 위한 시도를 유발하고 있다. 이는 전체적으로 또는 부분적으로 인자 Ⅷ의 중간 정도로 과하게 당화된 부위를 암호화하는 cDNA의 부분을 제거함으로써 성취되어 왔다.

예를 들어, 툴 제이 제이(J. J. Toole) 등은 아미노산 982부터 1562까지, 및 아미노산 760부터 1639까지 각각 결실된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현을 보고하였다[참고 자료 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 5939-5942]. 이튼 디 엘(D. L. Eaton) 등은 아미노산 797부터 1562까지 결실된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현을 보고하였다[참고 자료: Biochemistry (1986) 25, 8343-8347]. 카우프만 알 제이(R. J. Kaufman)는 아미노산 741부터 1646까지 결실된 인자 Ⅷ의 발현을 기술하였다[참고 자료 : PCT 출원서 WO 제87/04187호]. 사버 엔(N. Sarver) 등은 아미노산 747부터 1560까지 결실된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현을 보고하였다[참고 자료: DNA (1987) 6, 553-564]. 파섹 엠(M. Pasek)은 아미노산 745부터 1562까지, 및 아미노산 741부터 1648까지 각각 결실된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현을 보고하였다[참고 자료 : PCT 출원서 WO 제88/00831호]. 랭그너 케이 디(K. -D. Langner)는 아미노산 816부터 1598까지, 및 아미노산 741부터 1689까지 각각 결실된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현을 보고하였다[참고 자료 : Behring Inst. Mitt., (1988) No. 82, 16-25, EP 0 295 597]. 뮐린 피(P. Meulien) 등은 아미노산 868부터 1562까지, 및 아미노산 771부터 1666까지 각각 결실된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현을 보고하였다[참고 자료 : Protein Engineering (1988) 2(4), 301-306, EP 0 303 540]. 포유동물 세포에서 인자 Ⅷ cDNA의 상기 결실된 형태가 발현된 경우, 생산 수준은 완전한 길이의 인자 Ⅷ과 비교하여서 통상적으로 10배 정도 더 높다.

FⅧ은 A1- 내지 A3 도메인 사이에 비공유적 2가 금속 이온 결합을 통하여 연결된 중쇄(도메인 A1-A2-B) 및 경쇄(A3-C1-C2)의 이종이량체(heterodimer)로서 혈장으로 분비된다. 혈장에서, FⅧ은 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)에 결합됨으로써 안정화된다.

트롬빈에 의한 가수분해적 활성화시, FⅧ은 2개의 중쇄 단편(50 kDa 단편의 A1, 및 43 kDa 단편의 A2) 및 경쇄(73 kDa 단편의 A3-C1-C2)의 이종삼량체로 활성화된다. 그러므로 FⅧ의 활성 형태(FⅧa)는 트롬빈-절단된 A3-C1-C2 경쇄에 2가 금속 이온 결합을 통하여 연결된 A1-아단위 및 A1 도메인에 연결된 유리 A2 아단위로 구성된다. 이종삼량체로부터 유리 A2 아단위의 분리는 트롬빈 활성화 후 FⅧa 불활성화에서 속도 제한 단계가 될 수 있는 것으로 간주된다[참고 자료 : Fay, P. J. et al., J. Biol. Chem. 266: 8957 (1991), Fay PJ & Smudzin TM, J. Biol. Chem. 267: 13246-50 (1992)]. 혈장에서 FⅧa의 반감기는 단지 2.1 분이다[참고 자료 : Saenko et al., Vox Sang. 83: 89-96 (2002)]. FⅧa의 반감기를 연장하는것은, 상기 FⅧ 제제의 덜 빈번한 주입으로 또한 변형될 수 있는 더 오래 작용하는 FⅧa를 초래할 수 있다. Arg 336 및 Arg 562에서의 절단에 의하여 활성화된 단백질 C(APC)을 통한 FⅧa의 불활성화는 속도 제한 단계가 될 수 없다고 간주된다. A2 도메인에 A3 도메인을 공유적으로 부착시키고 APC 절단 위치를 돌연변이시킴으로써 불활성화에 내성이 되는 FⅧa를 만들어내는 시도가 행해져 왔다[참고 자료 : Pipe and Kaufman, PNAS, 94: 11851-11856]. 그러나 상기 FⅧa는 거의 완전한 불활성화 내성이 되므로 혈전 유발(thrombogenic)의 가능성을 가질 수 있다. 그러므로 본 발명의 목적은 불활성화를 완전히 차단하지 않고 A2 도메인이 안정화되는 FⅧa를 만들어내는 것이다.

FⅧ은 약 12시간의 FⅧ의 혈장 반감기에 기인하여 주당 약 3회 예방 치료를 받는 혈우병 환자에게 정맥 내로 투여된다. 그러므로 덜 빈번하게 투여되어야 하는 FⅧ 제제를 초래할 수 있는 연장된 혈장 반감기를 가진 FⅧ를 만드는 것은 상당히 바람직할 것이다. 본 발명은 A1/A3-C1-C2에 대한 A2의 증가된 결합을 나타내는 변형된 FⅧ 분자에 의해서 상기 문제에 대한 해결책을 제공한다.

도 1 : 사람 FⅧ 단백질 서열과 돼지 서열 비교 (수는 사람의 성숙형 FⅧ를 참조한다 ; 돼지 서열에서, 상이한 아미노산만이 나열된다 ; 동일한 아미노산은 "ㆍ"로 나타낸다)

도 2 : 돼지 FⅧ과 비교한 단백질에 근거한 사람 FⅧ의 돌연변이 (본 발명에 따라 가능한 모든 돌연변이를 포함하지는 않는다)

도 3 : A2 도메인의 증가된 분리를 초래하는 존재하는 사람 돌연변이 분석에 근거한 사람 FⅧ의 돌연변이 (본 발명에 따르는 가능한 모든 돌연변이를 포함하지는 않는다)

상기 변형의 특성은 사람의 A2 도메인의 분리는 돼지의 A2에 비해서 세 배 증진되었다고 공지된 것과 같이 사람의 FⅧ에 대하여 돼지의 FⅧ의 서열을 비교함으로써 확인되었다[참고 자료 : Lollar et al., J Biol. Chem., 267: 23652-23657 (1992)]. 서열 비교(도 1)는 여러 개의 상이점을 밝혔다. 상기 상이점의 하위 부류로는 상이하게 하전된 아미노산으로 구성된다. 사람의 FⅧ의 돌연변이체는 하기 지침에 따라서 작제되었다. 돼지 서열이 하전된 아미노산을 함유하는 반면에 사람 서열은 중성 아미노산을 함유하는 경우, 돼지 서열에서 발견된 것과 같이 동일한 전하를 가진 하전된 아미노산을 사람 서열내로 도입하였다. 돼지의 FⅧ이 중성의 아미노산을 함유하는 반면에 사람 서열은 하전된 아미노산을 함유하는 경우, 중성의 아미노산 또는 상기와 반대 전하의 아미노산이 도입되는데, 예를 들어, 사람의 FⅧ는 돼지의 FⅧ가 중성의 아미노산을 함유하는 위치에 산성 아미노산을 함유한다면, 또한 염기성 아미노산이 도입되었다. 돼지의 FⅧ가 하전된 아미노산을 함유하는 반면에 사람 서열이 하전된 아미노산을 함유하는 경우, 돼지의 아미노산에서 발견된 것과 같은 동일한 전하를 가진 아미노산이 사람 서열내로 도입되었다. 활성화된 형태의 3분 이상, 바람직하게 10분 이상, 더욱 바람직하게 30분 이상의 혈장 반감기를 가지는 개선된 FⅧ를 유도하는 상기 돌연변이에 대한 예는, 도 2에서 열거되었다.

개선된 FⅧ에 대한 다른 돌연변이는 천연적으로 발생하고 혈우병과 관계된 A2 도메인의 더 빠른 분리를 유도하는 사람의 FⅧ에서 돌연변이를 분석함으로써 추론되었다. 상기 돌연변이는 FⅧ 응고 활성을 측정하는 동안 일 단계 검정에 비교하여서 이 단계 검정 사이의 차이점을 초래하는 반면, 두 단계 검정에서 몇 분의 항온처리는 불안정한 A2 도메인의 분리를 허용하므로 두 단계 검정 결과는 일 단계검정보다 더 낮다[Saenko et al., Vox Sang., 83: 89-96 (2002)]. 상기 증가된 불안정성이 하전된 아미노산의 도입의 결과인 경우 아미노산은 반대 전하의 아미노산으로 돌연변이 되어야만 한다고 추정되었다. 활성화된 형태의 3분 이상, 바람직하게 10분 이상, 더욱 바람직하게 30분 이상의 혈장 반감기를 가지는 개선된 FⅧ를 유도하는 상기 돌연변이의 예는, 도 3에서 나열되었다.

돌연변이를 도입하는 것에 대한 근거로서, 바람직하게 사람의 인자 Ⅷ의 아미노산 1에서 740까지를 암호화하는 첫 번째 DNA 절편 및 사람의 인자 Ⅷ의 아미노산 1649에서 2332까지를 암호화하는 두 번째 DNA절편을 포함하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 사용한다. 상기 두 절편은 링커 DNA 절편에 의해서 서로 연결될 수 있지만, 본 발명은 또한 돌연변이를 전체 길이 FⅧ에 도입시키는 것을 내포한다.

그러므로 본 발명의 주제는

·사람 서열이 중성 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 돼지 서열에서 발견된 것과 동일한 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 중성 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 중성 아미노산에 대한 코돈 또는 상기와 반대 전하의 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내에 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은상기와 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입

하는 방식으로 상이한 코돈으로 치환되거나,

B) 혈우병 환자의 FⅧ cDNA에서 발견된 하전된 아미노산에 대한 하나 또는 여러 개의 코돈이 상기와 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈으로 대체되어짐을 특징으로 하는,

야생형 인자 Ⅷ cDNA, 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 DNA 링커 절편에 의해서 대체될 수 있는 인자 Ⅷ cDNA내에 돌연변이가 삽입된 변형된 사람의 인자 Ⅷ cDNA이다.

적절한 숙주세포에서 높은 수준으로 인자 Ⅷ 단백질의 생산은, 재조합 발현 벡터에 적절한 조절 성분과 함께 효율적인 전사 단위내로 상기 언급된 변형된 인자 Ⅷ DNA의 조립을 요구하는데, 상기 벡터는 당업자에게 공지된 방법에 따라서 이 콜라이에서 증식될 수 있다. 효율적인 전사 조절 성분은 천연적인 숙주로서 동물세포를 가지는 바이러스 또는 동물세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 원숭이 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마(polyoma) 바이러스, 사람의 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 또는 라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat)로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같은 동물 세포에서 상당히 구조적으로 전사된 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합이 사용될 수 있다. 인자 Ⅷ DNA로부터 전사된 mRNA의 안정된 높은 수준에 도달하기 위해서, 전사 단위는 3' - 말단 부위에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야만 한다. 바람직하게, 상기 서열은 원숭이 바이러스 40 초기 전사 부위, 토끼의 베타-글로빈 유전자, 또는 사람의 조직 플라스미노겐 활성화제 유전자로부터 유래된다.

이후에 인자 Ⅷ cDNA는 인자 Ⅷ 단백질의 발현을 위해서 적절한 숙주세포주의 게놈으로 통합된다. 바람직하게 상기 세포주는 정확한 폴딩, 이산화황 결합 형성, 아스파라긴(asparagine)-연결된 당화 및 다른 해독 후 변형뿐 아니라 배양 배지로의 분비까지도 보증하기 위해서 척추동물 기원의 동물세포주이어야 한다. 다른 해독 후 변형에 대한 예는 티로신 O-황산화(sulfation), 및 초기의 폴리펩티드 쇄의 단백질 가수분해적 프로세싱이다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 원숭이 COS-세포, 마우스의 L-세포, 마우스의 C127-세포, 햄스터의 BHK-21 세포, 사람의 태아 신장 293 세포, 및 바람직하게 CHO-세포이다.

인자 Ⅷ cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 몇몇의 상이한 방식으로 동물 세포주로 도입될 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스계의 벡터로부터 만들어질 수 있는데, 상기의 예는 배큘로바이러스(baculovirus), 백시니아(vaccinia) 바이러스, 아데노바이러스, 및 바람직하게 소의 파필로마(papilloma) 바이러스계의 벡터이다.

인자 Ⅷ DNA를 암호화하는 전사 단위는 또한, 재조합 DNA가 동물세포의 게놈으로 통합된 특이적 세포 클론의 분리를 촉진하기 위해서 상기 세포에 주요한 선별 가능한 표지로서 기능할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 동물세포로 도입될 수 있다. 주요한 선별 가능한 표지 유전자의 상기 형의 예는 제네티신(Geneticin)(G418)에 대한 내성을 주는 Tn5 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 히그로마이신(hygromycin)에 내성을 주는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 푸로마이신(puromycin)에 내성을 주는 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 상기 선별 가능한 표지를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인자 Ⅷ cDNA를 암호화하는 것과 같은 동일한 벡터상의 임의의 위치에 존재할 수 있거나, 별도의 벡터상에 암호화되어, 자주 상이한 전사 단위 사이에서 단단한 물리적 연결을 초래하면서, 동시적으로 도입되어 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있다.

인자 Ⅷ DNA와 함께 사용될 수 있는 선별 가능한 표지 유전자의 다른 형은 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase : dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위에 근거한다. 내인성 dhfr-활성이 결실된 세포, 바람직하게 CHO-세포(DUKX-B11, DG-44)로 상기 형의 유전자 도입 후, 이를 뉴클레오시드가 부족한 배지에서 성장하게 할 수 있다. 상기 배지의 예는 하이포잔틴(hypoxanthin), 티미딘, 및 글리신이 들어있지 않은 함스 F12(Ham's F12)이다. 상기 dhfr-유전자는 동일한 벡터상 또는 상이한 벡터상에 연결되어서, 상기 형의 CHO-세포로 인자 Ⅷ cDNA 전사 단위와 함께 도입될 수 있어서, 재조합 인자 Ⅷ 단백질을 생성하는 dhfr-양성 세포주를 만들 수 있다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트(methotrexate)의 존재하에 성장된다면, 메토트렉세이트에 내성있는 신규한 세포주가 나타날 것이다. 상기 세포주는 연결된 dhfr 및 인자 Ⅷ 전사 단위의 증폭된 수에 기인하여 증가된 속도로 재조합 인자 Ⅷ 단백질을 생산할 수 있다. 메토트렉세이트의 증가하는농도(1 내지 10000 nM)에서 상기 세포주를 증식시키는 경우, 매우 높은 속도로 인자 Ⅷ 단백질을 생산하는 신규한 세포주가 수득될 수 있다.

인자 Ⅷ 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁 배양액에서 또는 다양한 고체 지지체상에서, 대규모로 성장될 수 있다. 상기 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스상에 기초한 마이크로캐리어(microcarrier), 또는 공동 섬유 또는 다양한 세라믹 물질 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁 배양액 또는 마이크로캐리어에서 성장시키는 경우 상기 세포주의 배양은 장기간에 걸쳐서 조절된 배지의 연속 생산과 함께 수조 배양 또는 살수 배양중 하나로 수행될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따라서, 상기 세포주는 사람 혈장으로부터 분리될 수 있는 재조합 인자 Ⅷ의 생산을 위해서 산업 공정의 개발에 잘 부합된다.

상기 형의 CHO-세포의 배지에 축적되는 재조합 인자 Ⅷ 단백질은, 농축되고 세포 배양 배지에서 재조합 인자 Ⅷ 단백질 및 다른 물질사이의 크기, 전하, 소수성(hydrophobicity), 용해도, 특이적 친화력 등에서의 차이점을 이용한 방법을 포함하여, 다양한 생화학 및 크로마토그래피 방법에 의해서 정제될 수 있다.

상기 정제의 예는 고체 지지체상에 고정된 모노클로날 항체에 대한 재조합 인자 Ⅷ 단백질의 흡착이다. 탈착 후, 인자 Ⅷ 단백질은 상기 특성에 근거한 다양한 크로마토그래피 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.

본 발명에서 기술된 인자 Ⅷ 활성을 갖는 재조합 단백질은 치료용의 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 정제된 인자 Ⅷ 단백질은 약제학적 제제를 제공하기 위해서, 임의로, 약제학적 보조제가 부가될 수 있는 통상적인 생리학적으로 허용되는 수성 완충액에서 용해될 수 있다.

본 발명의 변형된 인자 Ⅷ DNA는 또한 사람 유전자 치료에 사용하기 위해 전이 벡터에 통합될 수 있다.

본 발명의 추가적 주제는

A) 돼지의 인자 Ⅷ의 동일한 위치에 상응하는 아미노산과 동일하지 않은 사람의 인자 Ⅷ의 하나 또는 여러 개의 아미노산이,

·사람 서열이 중성 아미노산을 함유하는 반면 돼지 서열은 하전된 아미노산을 함유하는 경우 돼지 서열에서 발견된 것과 동일한 전하를 가진 하전된 아미노산을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산을 함유하는 반면 돼지 서열은 중성 아미노산을 함유하는 경우 중성 아미노산 또는 상기와 반대 전하의 아미노산을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산을 함유하는 반면 돼지 서열은 상기와 반대 전하를 가진 아미노산을 함유하는 경우 반대 전하를 가진 아미노산은 사람 서열에 도입

하는 방식으로 상이한 아미노산으로 치환되거나,

B) 혈우병 환자의 FⅧ 아미노산 서열에서 발견된 하나 또는 여러 개의 하전된 아미노산이 상기와 반대 전하의 아미노산으로 대체되어짐을 특징으로 하는,

야생형 인자 Ⅷ, 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 링커에 의해 대체될 수 있는 FⅧ내에 돌연변이가 삽입된, 활성화된 형태의 개선된 혈장 반감기를 가지는 생물학적으로 활성인 변형된 재조합 사람의 인자 Ⅷ이다.

본 발명은 추가로 하기의 실시예에서 더욱 상세히 기술될 것이다. 본 발명의 특정한 양태는 첨부된 도면과 관련하여 기술될 것이다.

FⅧ 돌연변이체의 생성

FⅧ 돌연변이체의 생성을 위해서, FⅧ cDNA의 적절한 아절편(예를 들면, 아미노산 226 내지 978을 포함하는, Aval-Sacl은 후속적 서열분석의 노력을 감소하기 위해서 적절한 클로닝 벡터로 먼저 서브클론된다. 이후에 부위 지시된 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)은 시판용 돌연변이유발 키트(예를 들면, 퀵체인쥐 사이트디랙티드 뮤타제네시스(QuickChange SiteDirected Mutagenesis) 키트(스트라타진(Stratagene)사))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행된다. 돌연변이유발에 사용된 프라이머는 첨부된 서열목록 및 돌연변이된 염기가 굵은 글씨로 표기된 하기에서 나열된다.

돌연변이 : A284K

정방향 프라이머

5' GGAACCATCGCCAGAAGTCCTTGGAAATCTCGCC 3' (서열 번호 1)

역방향 프라이머

5' GGCGAGATTTCCAAGGACTTCTGGCGATGGTTCC 3' (서열 번호 2)

돌연변이 : D318G

정방향 프라이머

5' CCCACCAACATGGTGGCATGGAAGCTTATGTC 3' (서열 번호 3)

역방향 프라이머

5' GACATAAGCTTCCATGCCACCATGTTGGTGGG 3' (서열 번호 4)

돌연변이 : M337R

정방향 프라이머

5' CAGAGGAACCCCAACTACGACGTAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGAC 3'

(서열 번호 5)

역방향 프라이머

5' GTCTTCCGCTTCTTCATTATTTTTACGTCGTAGTTGGGGTTCCTCTG 3'

(서열 번호 6)

돌연변이 : N340D

정방향 프라이머

5' CCCAACTACGAATGAAAAATGATGAAGAAGCGGAAGACTATG 3' (서열 번호 7)

역방향 프라이머

5' CATAGTCTTCCGCTTCTTCATCATTTTTCATTCGTAGTTGGG 3' (서열 번호 8)

돌연변이 : D349N

정방향 프라이머

5' GAAGAAGCGGAAGACTATGATGATAATCTTACTGATTCTG 3' (서열 번호 9)

역방향 프라이머

5' CAGAATCAGTAAGATTATCATCATAGTCTTCCGCTTCTTC 3' (서열 번호 10)

돌연변이 : N364D

정방향 프라이머

5' GGTCAGGTTTGATGATGACGACTCTCCTTCCTTTATCC 3' (서열 번호 11)

역방향 프라이머

5' GGATAAAGGAAGGAGAGTCGTCATCATCAAACCTGACC 3' (서열 번호 12)

돌연변이 : D403S

정방향 프라이머

5' CCCTTAGTCCTCGCCCCCTCTGACAGAAGTTATAAAAG 3' (서열 번호 13)

역방향 프라이머

5' CTTTTATAACTTCTGTCAGAGGGGGCGAGGACTAAGGG 3' (서열 번호 14)

돌연변이 : E434V

정방향 프라이머

5' GTCCGATTTATGGCATACACAGATGTTACCTTTAAGACTCG 3' (서열 번호 15)

역방향 프라이머

5' CGAGTCTTAAAGGTAACATCTGTGTATGCCATAAATCGGAC 3' (서열 번호 16)

돌연변이 : E440K

정방향 프라이머

5' CCTTTAAGACTCGTAAAGCTATTCAGCATGAATCAGG 3' (서열 번호 17)

역방향 프라이머

5' CCTGATTCATGCTGAATAGCTTTACGAGTCTTAAAGG 3' (서열 번호 18)

돌연변이 : Q468K

정방향 프라이머

5' CACACTGTTGATTATATTTAAGAATAAAGCAAGCAGACCATATAAC 3' (서열 번호 19)

역방향 프라이머

5' GTTATATGGTCTGCTTGCTTTATTCTTAAATATAATCAACAGTGTG 3' (서열 번호 20)

돌연변이 : R484S

정방향 프라이머

5' CCCTCACGGAATCACTGATGTCTCTCCTTTGTATTCAAGG 3' (서열 번호 21)

역방향 프라이머

5' CCTTGAATACAAAGGAGAGACATCAGTGATTCCGTGAGGG 3' (서열 번호 22)

돌연변이 : R489G

정방향 프라이머

5' GATGTCCGTCCTTTGTATTCAGGGAGATTACCAAAAGG 3' (서열 번호 23)

역방향 프라이머

5' CCTTTTGGTAATCTCCCTGAATACAAAGGACGGACATC 3' (서열 번호 24)

돌연변이 : R583Q

정방향 프라이머

5' CTGTATTTGATGAGAACCAAAGCTGGTACCTCACAG 3' (서열 번호 25)

역방향 프라이머

5' CTGTGAGGTACCAGCTTTGGTTCTCATCAAATACAG 3' (서열 번호 26)

돌연변이 : A599D

정방향 프라이머

5' CTCCCCAATCCAGATGGAGTGCAGCTTGAG 3' (서열 번호 27)

역방향 프라이머

5' CTCAAGCTGCACTCCATCTGGATTGGGGAG 3' (서열 번호 28)

돌연변이 : E604Q

정방향 프라이머

5' CAGCTGGAGTGCAGCTTCAGGATCCAGAGTTC 3' (서열 번호 29)

역방향 프라이머

5' GAACTCTGGATCCTGAAGCTGCACTCCAGCTG 3' (서열 번호 30)

돌연변이 : G1948K

정방향 프라이머

5' CGATGGTATCTGCTCAGCATGAAGAGCAATGAAAACATCCATTCTATTC 3'

(서열 번호 31)

역방향 프라이머

5' GAATAGAATGGATGTTTTCATTGCTCTTCATGCTGAGCAGATACCATCG 3'

(서열 번호 32)

클론 분리 및 서열 확인 후 돌연변이체 아절편은 각각의 발현 벡터로 재삽입된다.

FⅧ 돌연변이체의 발현

FⅧ 돌연변이체 클론의 형질감염 및 돌연변이체 FⅧ 분자의 발현은 이전에 기술되고 당업자에게 공지된 것과 같이 행해졌다(예를 들면, Plantier JL et al. Thromb. Haemost. 86: 596-603 (2001)).

A1/A3-C1-C2에 대한 A2 아단위의 친화력 측정

A1/A3-C1-C2에 대한 A2 아단위의 증가된 친화력은 기능적 검정[참고 자료 : Fay PJ & Smudzin TM. J. Biol. Chem. 267: 13246-50 (1992); Lollar P et al. J. Biol. Chem. 267: 23652-57 (1992)]뿐 아니라 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)[참고 자료 : Persson E et al. Biochemistry 34: 12775-81 (1995)]을 이용한 물리적 검정에 의해 이전에 기술된 것과 같이 측정될 수 있다.

돼지의 인자 Ⅷ의 서열은 첨부된 서열 목록의 서열 번호 33에 제시되어 있고, 사람의 인자 Ⅷ의 서열은 서열 번호 34에 제시되어 있다.

하기의 서열 목록에서 서열 번호 1 내지 32는 특이적 돌연변이를 FⅧ에 도입하기 위해서 사용된 올리고뉴클레오티드를 기술한다. 서열 번호 33은 전체 길이의 돼지의 성숙형 FⅧ의 아미노산 서열이고, 서열 34는 완전한 길이의 사람의 성숙형 FⅧ의 아미노산 서열이다.

본 발명에 의해서, 돌연변이에 의한 재조합에 의해서 불활성화를 완전히 차단하지 않고 A2 도메인이 안정화되는 인자 Ⅷa를 생산할 수 있다. 본 발명에서는 또한 A1/A3-C1-C2에 대한 A2의 증가된 결합을 나타내는 변형된 FⅧ 분자가 연장된 혈장 반감기를 가지게 되어 혈우병 환자의 치료를 위해 기존 치료에 비해 덜 빈번하게 투여될 수 있는 효과가 있다.

Claims

A) 돼지의 인자 Ⅷ cDNA의 동일한 위치에 상응하는 코돈과 동일하지 않은 사람의 인자 Ⅷ cDNA의 하나 또는 여러 개의 코돈이,

·사람 서열이 중성 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 돼지 서열에서 발견된 것과 동일한 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 중성 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 중성 아미노산에 대한 코돈 또는 상기와 반대 전하의 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 반면 돼지 서열은 상기와 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 함유하는 경우 반대 전하를 가진 아미노산에 대한 코돈을 사람 서열내로 도입

하는 방식으로 상이한 코돈으로 치환되거나,

B) 혈우병 환자의 FⅧ cDNA에서 발견된 하전된 아미노산에 대한 하나 또는 여러 개의 코돈이 상기와 반대 전하의 아미노산에 대한 코돈으로 대체되어짐을 특징으로 하는,

야생형 인자 Ⅷ cDNA, 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 DNA 링커 절편에 의해서 대체될 수 있는 인자 Ⅷ cDNA내에 돌연변이가 삽입된 변형된 사람의 인자 Ⅷ cDNA.
적절한 숙주세포에서의 발현을 위한 전사 조절 성분을 부가로 수반하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 인자 Ⅷ cDNA를 함유하는 재조합 발현 벡터.
A) 돼지의 인자 Ⅷ의 동일한 위치에 상응하는 아미노산과 동일하지 않은 사람의 인자 Ⅷ의 하나 또는 여러 개의 아미노산이,

·사람 서열이 중성 아미노산을 함유하는 반면 돼지 서열은 하전된 아미노산을 함유하는 경우 돼지 서열에서 발견된 것과 동일한 전하를 가진 아미노산을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산을 함유하는 반면 돼지 서열은 중성 아미노산을 함유하는 경우 중성 아미노산 또는 상기와 반대 전하의 아미노산을 사람 서열내로 도입하거나;

·사람 서열이 하전된 아미노산을 함유하는 반면 돼지 서열은 상기와 반대 전하를 가진 아미노산을 함유하는 경우 반대 전하를 가진 아미노산을 사람 서열내로 도입

하는 방식으로 상이한 아미노산으로 치환되거나,

B) 혈우병 환자의 FⅧ 아미노산 서열에서 발견된 하나 또는 여러 개의 하전된 아미노산이 상기와 반대 전하의 아미노산으로 대체되어짐을 특징으로 하는,

야생형 인자 Ⅷ, 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 링커에 의해서 대체될 수 있는 인자 Ⅷ내에 돌연변이가 삽입된, 향상된 안정성을 가진 생물학적으로 활성인 변형된 재조합 사람의 인자 Ⅷ.
제3항에 있어서, 활성화된 형태의 혈장 반감기가 3분 이상이고, 바람직하게 10분 이상이고, 가장 바람직하게 30분 이상인, 생물학적으로 활성인 변형된 재조합 사람의 인자 Ⅷ.
제3항에 있어서, 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환으로 A2-도메인이 안정화된 것을 특징으로 하는, 변형된 사람의 인자 Ⅷ.
적절한 숙주세포주에 의해 발현되는 인자 Ⅷ 단백질을 크로마토그래피 방법에 의해서 정제하는 것을 특징으로 하는, 조절된 배지의 계속적인 생산과 함께 수조 세포 배양 또는 살수 세포 배양으로써 세포 현탁액내 또는 고체 지지체 상에서 제3항에 따른 변형된 사람의 인자 Ⅷ을 재조합적으로 생산하는 방법.
제6항에 있어서, 제1항 또는 제2항의 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 암호화하는 전사 단위가 게놈내로 당해 특이적 cDNA를 통합시키는 특이적 세포 클론의 분리를 촉진하기 위해서 우세한 선별 표지를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
게놈내로 통합된 제1항에 따른 인자 Ⅷ cDNA를 함유하는 척추 동물 기원의 동물 세포주임을 특징으로 하는, 제3항에 따른 인자 Ⅷ 단백질의 발현을 위한 숙주세포주.
제3항에 따른 생물학적으로 활성인 변형된 재조합 사람의 인자 Ⅷ을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
제1항에 따른 변형된 FⅧ cDNA를 함유하는 것을 특징으로 하는, A형 혈우병의 유전자 치료용 벡터.