KR20040029984A - Ｃｄ26을 발현하는 세포와 연관된 질환의 치료제로사용되는 항-ｃｄ26 단클론항체 - Google Patents

Ｃｄ26을 발현하는 세포와 연관된 질환의 치료제로사용되는 항-ｃｄ26 단클론항체 Download PDF

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Abstract

CD26 발현과 연관된 암과 면역 질환을 예방하고 치료하는 항-CD26 항체를 투여하는 단계로 구성되는 치료 방법을 제시한다. 본원에서는 다양한 종류의 항-CD26 항체 및 투여 양식을 기술한다.

Description

ＣＤ26을 발현하는 세포와 연관된 질환의 치료제로 사용되는 항-ＣＤ26 단클론항체{ANTI-CD26 MONOCLONAL ANTIBODIES AS THERAPY FOR DISEASES ASSOCIATED WITH CELLS EXPRESSING CD26}
암은 서방 국가에서 심장 질환에 뒤이은 2번째 사망 원인이다. 현재, 미국인 3명중 1명에서 암이 발병하고 5명중 1명이 암으로 사망하는 것으로 추정된다. 암을 치료하는데 효과적인 방법은 거의 없다. 암 치료에 가장 일반적으로 선택되는 방법은 수술, 방사선요법, 화학요법이다. 전형적으로, 외과적 방법은 암의 진단(외과적 생검) 및 치료(암적 생장을 제거하는 수술)에 이용된다. 하지만, 암이 전이되고 확산되면 수술은 예후가 좋지 않기 때문에, 대안적 방법이 필요하다. 방사선요법과 화학요법은 다른 형태의 암 치료방법이다. 하지만, 방사선요법과 화학요법은 전신 요법으로 정상 세포에도 영향을 주기 때문에 많은 부작용과 연관한다. 현재 이용되고 있는 암 요법의 부작용에는 피부 자극, 삼키기 어려움, 입마름, 메스꺼움, 설사, 탈모, 피로, 출혈 등이 있다. 따라서, 암 요법에는 극복해야 할 많은 과제가 여전히 남아있다.
치료제로 특정 항체를 이용하는 치료법과 같은 표적-지향된 요법은 비-표적화된 요법, 예를 들면 약물의 경구나 정맥내 투여를 통한 전신 화학요법 또는 방사선요법에 비하여 이점을 제공한다. 2가지 유형의 항체-기초한 요법이 있다. 좀더 일반적인 유형은 종양 항원(즉, 종양과 암세포에서는 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않는 단백질)을 동정하고 이런 종양 항원을 지향하는 항체, 바람직하게는 단클론항체를 개발하는 것이다. 이후, 임의의 치료제, 예를 들면 화학치료제, 방사선핵종, 변형된 독소 등을 항체에 공액시켜 치료제가 종양을 표적하는 치료를 달성할 수 있다. 다른 유형의 항체-기초한 요법은 표적으로 하는 종양/암세포에 대하여 자체적으로 치료 특성을 보유하는 항체를 제공하는 것이다. 두 번째 유형의 항체-기초한 요법의 부가된 이점은 치료 항체에 다른 치료제를 추가로 공액하여 좀더 효과적인 치료를 달성할 수 있다는 것이다.
항체-지향된 요법, 특히 단클론항체(mAb)를 이용한 요법의 주요 이점은 증가된 용량의 치료제를 종양에 전달하면서도 정상 조직에서 치료제의 부작용을 좀더 줄일 수 있는 능력이다. 암 요법을 위한 여러 항체의 동정에도 불구하고, 다양한 종류의 암에 치료를 제공하는 신규하고 좀더 효과적인 치료 항체를 동정하는 것은 여전히 필요하다.
다양한 면역-관련된 기능과 연관된 막 단백질, CD26은 여러 인체 암, 특히 진행된 단계에 있고 불량한 환자 예후와 연관된 암의 표면에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 가령, 폐 선암종은 CD26의 효소 활성에 파지티브한 반면, 다른 조직학적 유형의 폐 암종은 CD26 활성에 네거티브하다(Asade et al., 1993); CD26 발현은 분화된 갑상선 암종에는 높게 나타나고 양성 갑상선 질환에는 부재한다(Tanaka et al., 1995); 높은 수준의 CD26 단백질과 mRNA 발현은 B-만성 림프성 백혈병 세포에서 발견된다(Bauvois et al., 1999); CD26 발현은 공격성 T-세포 악성 종양, 예를 들면 T-세포 림프아세포성 림프종/급성 림프아세포성 백혈병(LBL/ALL), T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종에서 높게 나타난다. 이들 암 종류는 현재의 치료 양식에 내성을 보이기 때문에 치료하기 어렵다. 이런 이유로, 이런 공격성 질환을 치료하고 예방하는데 유용한 요법을 발견하는 것이 시급히 요구된다.
본원의 요약
본원 발명은 항-CD26 항체의 성장 저해 특성을 확인함으로써 선행 기술의 결함을 극복한다. 따라서, 본원 발명은 항-CD26 항체 조성물을 이용하여 표면에 CD26 단백질을 발현하는 암을 치료하는 방법을 제시한다. 본원 발명의 항-CD26 항체-기초한 요법에는 다클론항체, 단클론항체(mAb), 항체 단편, 인화 mAB, 나신 항체를 비롯한 공액되지 않은 항체의 사용이 포함된다. 약물, 다른 표적화된 항체, 독소, 효소 저해물질, 방사성핵종, 중성자-포착제(예, 붕소 아덴드), 화학약품 및 다른 생물학적 작용제에 공액된 항체의 사용 역시 제시한다.
따라서, 일부 구체예에서 본원은 CD26을 발현하는 암으로 고생하는 환자를치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항-CD26 항체를 포함하는 제약학적 제형을 환자에 투여하는 단계로 구성되고, 상기 항-CD26 항체는 CD26에 결합하고 세포 사이클 진행을 억제하여 세포 성장을 저해한다.
본원 발명의 방법으로 T-세포암, B-세포암, 혈액암, 갑상선암, T-세포 림프종, 폐 선암종, 갑상선 암종, 흑색종, B-세포 림프종, 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 고환암, 자궁암, 뇌암, 림프암, 피부암, 골암, 직장암 또는 육종이 포함되지만 이들에 국한되지 않은 다양한 암과 종양의 치료를 계획한다.
좀더 특이적인 구체예에서, T-세포암은 림프아세포성 림프종, 급성 림프아세포성 백혈병, T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 혈관중심성 T-세포 림프종, HTLV-관련된 T-세포 백혈병 또는 성인 T-세포 백혈병과 같은 T-세포 림프종이다. 다른 특이적인 구체예에서, B-세포암은 B-세포 만성 림프성 백혈병 또는 B-세포 림프종이다.
본원 발명은 또한 병용 요법을 계획하는데, 여기서 2가지 이상 치료 섭생은 치료 효능을 향상시키기 위하여 동시에 이용된다. 따라서, 항-CD26 항체 치료와 더불어, 환자는 제 2 작용제 치료를 받을 수 있는데, 여기서 제 2 작용제는 치료 폴리펩티드, 치료 폴리펩티드를 인코드하는 핵산, 화학치료제, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 활성화제 방사선치료제 또는 생물학적 반응 변화인자이다.
제 2 작용제는 항-CD26 항체와 동시에 투여될 수 있다. 대안으로, 제 2 작용제는 항-CD26 항체와 상이한 시점에 투여될 수 있다. 따라서, 제 2 작용제는 항-CD26 항체 치료 전후에 투여될 수 있다.
항-CD26 항체의 여러 투여 루트를 계획하는데, 여기에는 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 종양내, 근육내, 피하, 지주막하, 관절내, 경구, 피부, 비강, 협측, 직장 또는 질 투여가 포함된다.
1㎍/㎏ 내지 1 g/㎏의 용량 범위로 투여되는 항-CD26 항체가 치료에 효과적이다. 따라서, 1㎍/㎏ 내지 5㎍/㎏, 5㎍/㎏ 내지 10㎍/㎏, 10㎍/㎏ 내지 20㎍/㎏, 20㎍/㎏ 내지 30㎍/㎏, 30㎍/㎏ 내지 40㎍/㎏, 40㎍/㎏ 내지 50㎍/㎏, 50㎍/㎏ 내지 60㎍/㎏, 70㎍/㎏ 내지 80㎍/㎏, 90㎍/㎏ 내지 100㎍/㎏, 100㎍/㎏ 내지 200㎍/㎏, 200㎍/㎏ 내지 300㎍/㎏, 300㎍/㎏ 내지 400㎍/㎏, 400㎍/㎏ 내지 500㎍/㎏, 500㎍/㎏ 내지 600㎍/㎏, 600㎍/㎏ 내지 700㎍/㎏, 700㎍/㎏ 내지 800㎍/㎏, 900㎍/㎏ 내지 1mg/㎏, 1mg/㎏ 내지 10mg/㎏, 10mg/㎏ 내지 20mg/㎏, 20mg/㎏ 내지 30mg/㎏, 30mg/㎏ 내지 40mg/㎏, 40mg/㎏ 내지 50mg/㎏, 50mg/㎏ 내지 60mg/㎏, 70mg/㎏ 내지 80mg/㎏, 90mg/㎏ 내지 100mg/㎏, 100mg/㎏ 내지 200mg/㎏, 200mg/㎏ 내지 300mg/㎏, 300mg/㎏ 내지 400mg/㎏, 400mg/㎏ 내지 500mg/㎏, 500mg/㎏ 내지 600mg/㎏, 600mg/㎏ 내지 700mg/㎏, 700mg/㎏ 내지 800mg/㎏, 또는 900mg/㎏ 내지 1g/㎏ 용량 범위를 계획한다. 중간 범위, 예를 들면 1㎍/㎏, 2㎍/㎏, 3㎍/㎏, 4㎍/㎏, 5㎍/㎏ 등을 이용할 수도 있다. 정확한 투여 방법과 투여 용량은 연령, 질병, 성별, 전신 상태(performance status) 등과 같은 인자를 고려하여 환자의 개별 요구에 따라 치료 시점에서 결정되고 조정되는데, 이런 조정은 숙련된 의사에의해 실시된다. 이런 이유로, 본원 발명은 전술한 용량에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 항-CD26 항체는 단클론항체이다. 특정한 구체예에서, 항-CD26 단클론항체는 American Type Culture Collection(ATCC)에 수탁된 하이브리도마 HB 10297로부터 분비되는 1F7 단클론항체이다. 상기 1F7 항체 및 이를 만드는 방법은 미국 특허 5,120,642에서 상세히 기술한다.
다른 특정한 구체예에서, 항-CD26 단클론항체는 5F8 단클론항체이다. 일부 다른 유용한 mAb에는 10F8A, 12E3B, 14D10, 2F9, 4G8, 11H9, 18H3A, 9C11, 16D4B가 포함된다. 하지만, 본원 발명은 CD26 단백질의 에피토프에 특이적인 임의의 다른 단클론항체를 계획하며, 전술한 실례에 국한되지 않는다. 이에 더하여, 이들 단클론항체는 단편으로 투여되거나, 또는 사람 환자에서 면역원성을 감소시키기 위하여 인화될 수 있다.
다른 구체예에서, 본원 발명은 다클론 항-CD26 항체의 사용을 계획한다.
본원 발명의 항체는 자연 발생 CD26 단백질/폴리펩티드/펩티드, 정제된 CD26 단백질/폴리펩티드/펩티드, 부분적으로 정제된 CD26 단백질/폴리펩티드/펩티드, 재조합 생산된 CD26 단백질/폴리펩티드/펩티드 또는 CD26 융합단백질/폴리펩티드/펩티드를 대상으로 하여 만들어진다.
또 다른 구체예에서, 항-CD26 항체는 다른 작용제, 예를 들면 화학치료제, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 영상제, 독소, 생물작용제, 효소 저해물질 또는 2차 항체에 추가로 공액된다. 일부 특정한 구체예에서, 효소 저해물질은 아데노신 디아미나제 저해물질 또는 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ 저해물질이다. 다른특정한 구체예에서, 화학치료제는 시토신 아라비노시드, 플루오르우라실, 메토트렉세이트 또는 아미노프테린; 안트라사이클린; 미토마이신 C; 빈카 알칼로이드; 데메콜신; 에토포시드; 미트라마이신; 또는 알킬화제, 예를 들면 클로람부실이나 멜팔란 등이다.
또 다른 특정한 구체예에서, 독소는 식물-, 진균- 또는 박테리아-유래된 독소, 예를 들면 A 사슬 독소, 리보솜 불활화 단백질, α-사크린, 아스페르길린, 레스티릭토신, 리보뉴클레아제, 디프테리아 독소 또는 슈도모나스(Pseudomnas) 엑소톡소 등이다. 항-CD26 항체에 공액되는 방사성핵종과 영상제는 후술한다. 다른 특정한 구체예에서는 다른 생물학적 작용제, 예를 들면 케모킨, 사이토킨, 레티놀산과 이의 유도체, 인터페론, 성장 인자를 계획한다.
본원 발명은 또한, 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항-CD26 항체를 포함하는 조성물을 병든 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
이에 더하여, 본원 발명은 종양 괴사를 유도하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항-CD26 항체를 포함하는 조성물을 병든 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
일부 구체예에서, 본원 발명은 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 암 세포에서 CD26 발현을 유도하고 항-CD26 항체를 포함하는 제약학적 제형을 환자에 투여하는 단계로 구성되고, 항-CD26 항체는 CD26에 결합하여 세포 사이클 진행을 억제하거나, 성장 저해, 세포 사멸 또는 종양 퇴행을 유도한다. 세포에서 CD26 발현의 유도는 상기 세포와 생물학적 인자, 예를 들면 사이토킨, 케모킨, 성장 인자, 레티노이드, 인터페론, 인터루킨, 포르볼(phorbol)에스테르, 면역계를 활성화시키는 작용제, 화학치료제, 항체 또는 항원을 접촉시켜 달성할 수 있다. 대안으로, 세포에서 CD26 발현의 유도는 세포를 화학작용제와 접촉시켜 달성할 수 있다. 세포에서 CD26의 발현을 유도하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원 발명은 또한, CD26을 발현하는 세포에서 p21의 발현을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 세포와 항-CD26 항체를 접촉시키는 단계로 구성된다. 한 구체예에서, CD26을 발현하는 세포는 암세포이다. 특정한 구체예에서, 암세포는 혈액암 세포, T-세포암 세포, B-세포암 세포, 갑상선암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 결장암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포, 간암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 자궁암 세포, 뇌암 세포, 림프암 세포, 피부암 세포, 골암 세포, 직장암 세포 또는 육종 세포, T-세포 림프종 세포, 폐 선암종 세포, 갑상선 암종 세포, 흑색종 세포, B-세포 만성 림프성 백혈병 세포 또는 B-세포 림프종 세포이다. T-세포암은 T-세포 림프종과 같은 공격성 T-세포암이다. 다른 특정한 구체예에서, T-세포 림프종은 림프아세포성 림프종, 급성 림프아세포성 백혈병, T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 혈관중심성 T-세포 림프종, HTLV-관련된 T-세포 백혈병 또는 성인 T-세포 백혈병이다.
다른 구체예에서, CD26-발현 세포는 CD26-트랜스펙션된 Jurkat 세포주나 사람 T-세포, 예를 들면 사람 T-세포 클론 또는 활성화된 T-세포나 활성화된 T-세포 클론이다. 또 다른 구체예에서, CD26 발현 세포는 활성화된 면역 세포이다. 이런세포는 과다활성화된 면역 세포, 예를 들면 활성화된 T-세포; 자가면역 질환과 활성화된 면역계를 수반하는 질환의 발병에 일정한 역할을 하는 활성화된 T-세포; 자가 항원을 인식하는 활성화된 T-세포; 동종이식편을 인식하는 활성화된 T-세포; 숙주 조직을 인식하는 공여자의 활성화된 T-세포; CD26을 발현하고 자가 항원을 인식하는 활성화된 면역 세포; 동종이식편; 자가면역 질환과 활성화된 면역계를 수반하는 질환의 발병에 일정한 역할을 하고 CD26을 발현하는 활성화된 면역 세포; 숙주 조직을 인식하는 공여자의 활성화된 면역 세포 등이다.
일부 구체예에서, 항-CD26 항체는 단클론항체이다. 특정한 구체예에서, 항-CD26 단클론항체(mAb)는 American Type Culture Collection(ATCC)에 수탁된 하이브리도마 HB 10297로부터 분비된다. 상기 mAb는 1F7 항체라고 한다. 다른 특정한 구체예에서, 항-CD26 단클론항체(mAb)는 5F8 항체이다. 일부 다른 유용한 mAb에는 10F8A, 12E3B, 14D10, 2F9, 4G8, 11H9, 18H3A, 9C11, 16D4B가 포함된다. 더 나아가, 이들 단클론항체는 면역원성을 줄이기 위하여 인화될 수 있다.
다른 구체예에서, 항-CD26 항체는 다클론항체이다. 본원의 또 다른 구체예에서, 항-CD26 항체는 다른 작용제, 예를 들면 화학치료제, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 영상제, 독소, 생물작용제, 효소 저해물질 또는 2차 항체에 추가로 공액된다. 특정한 구체예에서, 효소 저해물질은 아데노신 디아미나제 저해물질 또는 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ 저해물질이다.
본원 발명은 또한, CD26을 발현하는 세포와 항-CD26 항체를 접촉시켜 세포 성장을 저해하는 방법을 제시한다. 상기 방법의 일부 구체예에서, CD26을 발현하는 세포는 암세포이다. 특정한 구체예에서, 암세포는 혈액암 세포, T-세포암 세포, B-세포암 세포, 갑상선암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 결장암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포, 간암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 자궁암 세포, 뇌암 세포, 림프암 세포, 피부암 세포, 골암 세포, 직장암 세포 또는 육종 세포이다. 좀더 특정한 구체예에서, 암세포는 T-세포 림프종 세포, 폐 선암종 세포, 갑상선 암종 세포, 흑색종 세포, B-세포 만성 림프성 백혈병 세포 또는 B-세포 림프종 세포이다.
다른 특정한 구체예에서, T-세포암은 예후가 불량한 T-세포암인데, 이의 전형적인 예는 림프아세포성 림프종, 급성 림프아세포성 백혈병, T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 혈관중심성 T-세포 림프종, HTLV-관련된 T-세포 백혈병 또는 성인 T-세포 백혈병과 같은 T-세포 림프종이다.
상기 방법의 한 측면에서, 저해된 세포 성장은 전이성 세포 성장이다. 상기 방법의 다른 측면에서, 세포 성장의 저해는 세포 성장을 억제하는 단계로 구성된다.
다른 구체예에서, CD26-발현 세포는 CD26-트랜스펙션된 Jurkat 세포주나 사람 T-세포, 예를 들면 사람 T-세포 클론 또는 활성화된 T-세포나 활성화된 T-세포 클론이다. 또 다른 구체예에서, CD26 발현 세포는 활성화된 면역 세포이다. 이런 세포는 과다활성화된 면역 세포, 예를 들면 활성화된 T-세포; 자가면역 질환과 활성화된 면역계를 수반하는 질환의 발병에 일정한 역할을 하는 활성화된 T-세포; 자가 항원을 인식하는 활성화된 T-세포; 동종이식편을 인식하는 활성화된 T-세포; 숙주 조직을 인식하는 공여자의 활성화된 T-세포; CD26을 발현하고 자가 항원을 인식하는 활성화된 면역 세포; 동종이식편; 자가면역 질환과 활성화된 면역계를 수반하는 질환의 발병에 일정한 역할을 하고 CD26을 발현하는 활성화된 면역 세포; 숙주 조직을 인식하는 공여자의 활성화된 면역 세포 등이다. 따라서, 상기 방법은 과다활성 면역 세포와 연관된 면역계 질환, 예를 들면 자가면역 질환, 장기 이식, 이식편 대 숙주 질환 등의 치료에 유용하다. 여기에는 에디슨병, 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 베체트병, 만성 피로 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 당뇨병, 근막 통증 증후군, 굿파스츄어 증후군, 그레이브스병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 낭창, 메니에르 다발성 경화증, 중증근무력증, 심상성 천포창, 담도성 간경변증, 건선, 류마티스 관절염, 류마티스열, 유사 육종증, 경피증, 혈관염, 백반증, 웨게너 육아종증이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본원 발명은 또한, CD26을 발현하는 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항-CD26 항체를 포함하는 조성물과 상기 세포를 접촉시키는 단계로 구성된다.
본원의 상세한 설명에서 단수는 하나이상을 의미한다. 특허 청구범위에서 "포함하는"과 병행하여 사용되는 단수는 하나이상을 의미한다.
본원 발명의 다른 목적, 특징, 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 분명하다. 하지만, 이런 상세한 설명과 특정 실시예는 본원 발명의 바람직한 구체예를 단순히 설명하는 것으로, 본원 발명의 기술적 사상과 목적을 벗어나지 범위내에서다양한 개변이 가능하다.
본원은 2001 5월 11일에 출원된 미국 특허 출원 60/290,531에 우선권을 주장한다.
본원 발명은 암, 면역학, 면역요법의 분야에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 암과 면역 질환을 예방하고 치료하기 위한 단클론, 인화, 다클론 항-CD26 항체를 비롯한 항-CD26 항체의 치료 용도에 관한다. 다양한 투여 양식과 용량을 기술한다.
다음의 도면은 본원 명세서의 일부이며 본원 발명의 특정 측면을 좀더 구체적으로 설명한다. 본원에 제시된 특정 구체예의 상세한 설명과 함께 이들 도면을 참고하면 본원 발명을 좀더 완전하게 이해할 수 있다.
도 1A와 1B:Karpas 299의 표현형적 특성. (도 1A) 세포는 유세포 분석법으로 CD26, CD3, CD2 발현을 평가하였다. 특정 표면 마커를 발현하는 세포의 비율을 표시한다. (도 1B) 항-CD26 mAb 1F7(1㎍/㎖)과 함께 37℃에서 하룻밤 배양한 이후, Karpas 299 세포는 CD26 발현을 평가하고 1F7과의 하룻밤 배양이전의 CD26 발현과 비교하였다. a=네거티브 대조, b=항-CD26 처리이전, c=항-CD26 처리이후
도 2A와 2B:세포 성장에 대한 가용성 항-CD26 mAb의 저해 효과.Karpas 299 세포(도 2A)와 H9 세포(도 2B)는 가용성 CD26 mAb 1F7, 항-CD26 mAb 5F8 또는 아이소타입 대조 mAb를 함유하는 배지에서 배양하고, MTT 흡수 분석법을 실시하였다. 데이터는 각 세포주에 대한 3회 실험의 평균이다. 세포독성 지수(조절 %) = 1 - 처리된 세포의 OD X 100 - 세포 배양 배지 단독에서 배양된 세포의 OD.
도 3A와 3B:SCID 생쥐에서 종양 형성이후 Karpas 299 세포에 대한 CD26 표면 발현. (도 3A) SCID 생쥐에 종양 주사에 앞서 CD26 표면 발현. 1 × 106종양 세포는 SCID 생쥐에 i.p. 주사하고, 종양 덩어리는 촉진가능한 종양이 발생한 이후에 수거하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 만들고 유세포 분석법으로 CD26 표면발현을 측정하였다(a=네거티브 대조, b=CD26). (도 3B) SCID 생쥐로부터 수거된 종양 덩어리의 단일 세포 현탁액에서 CD26 표면 발현. 1 × 106종양 세포는 SCID 생쥐에 i.p. 주사하고, 종양 덩어리는 촉진가능한 종양이 발생한 이후에 수거하였다. 이후, 단일 세포 현탁액을 만들고 유세포 분석법으로 CD26 표면 발현을 측정하였다(a=네거티브 대조, b=CD26).
도 4A와 4B:1F7 처리이후 Karpas 299-보유 SCID 생쥐의 강화된 생존. (도 4A) SCID 생쥐에 생쥐당 1 × 106karpas 299 세포를 i.p. 접종하고 1일후, 염수 단독, 아이소타입 대조 Ab(5 ㎍/주사 또는 10 ㎍/주사), 1F7(5 ㎍/주사 또는 10 ㎍/주사)은 격일로 총 10회 i.p. 주사하였다. arm 1: 염수 단독(n=13); arm 2: 아이소타입 대조 Ab(5 ㎍/주사, n=10); arm 3: 아이소타입 대조 Ab(10 ㎍/주사, n=5); arm 4: 항-CD26 mAb 1F7(10 ㎍/주사, n=10); arm 5: 항-CD26 mAb 1F7(5 ㎍/주사, n=14). (도 4B) SCID 생쥐에 생쥐당 3 × 106karpas 299 세포를 i.p. 접종하고 1일후, 염수 단독, 아이소타입 대조 Ab(20 ㎍/주사), 1F7(5 ㎍/주사, 10 ㎍/주사 또는 20 ㎍/주사)은 격일로 총 10회 i.p. 주사하였다. arm 1: 염수 단독(n=5); arm 2: 아이소타입 대조 Ab(20 ㎍/주사, n=5); arm 3: 1F7(5 ㎍/주사, n=5); arm 4: 1F7(10 ㎍/주사, n=5); arm 5: 1F7(20 ㎍/주사, n=5).
도 5:종양 세포 s.c. 접종과 항체 s.c. 처리이후 SCID 생쥐에서 최초 종양 출현. SCID 생쥐는 염수 단독, 100 ㎍ 1F7 또는 아이소타입 대조 Ab에서 배양된 1× 106Karpas 299 종양 세포를 s.c. 주사하였다. 후속으로, 종양 세포 접종후 1일에 SCID 생쥐에 0.1 ㎖ 무균 염수에 넣은 염수, 아이소타입 대조 Ab(20 ㎍/주사) 또는 1F7(20 ㎍/주사)을 격일로 최초 s.c. 종양 주사 부위에 총 10회 s.c. 주사하였다. 가시적인 종양의 최초 출현 일자를 기록하여 치료 효과를 평가하였다. arm -1: 염수 단독(n=10); arm 2: 아이소타입 대조 Ab(n=10); arm 3: 항-CD26 mAb 1F7(n=10).
도 6A, 6b, 6C: CD26트랜스펙션된 Jurkat T-세포를 항-CD26 mAb 1F7로 처리하면 G1/S에서 세포 사이클 진행이 억제되었다. J.C26/DP+는 Nocodazole(Noc)의 존재하에 배지 단독, 아이소타입 대조 mAb 4B4(Iso) 또는 1F7과 함께 배양하였다. 세포 배양, 염색, 세포 사이클 분석은 재료와 방법에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. G0/G1(FIG. 6A), G2/M(FIG. 6B), S(FIG. 6C) 세포의 측정을 도시한다. 막대는 독립적으로 실시된 3회 실험의 G0/G1, G2/M, S 세포의 백분율 평균값±표준 오차를 나타낸다. 별표는 J.C26/DP-와 Jwt에서 유의한 차이(p<0.05)를 보이는 시료를 표시한다.
도 7:항-CD26 mAb 1F7 처리이후 강화된 p21 발현. Nocodazole의 존재하에 1F7과 함께 배양한 이후 G0/G1 % 증가의 시간 과정 분석. 세포 사이클 분석은 재료와 방법에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. G0/G1에서 백분율 증가는 mAb와 비-mAb 처리된 세포간 G0/G1 % 크기에서 차이이다. 막대는 독립적으로 실시된 3회 실험의 G0/G1 % 증가의 평균값±표준 오차를 나타낸다. 별표는 J.C26/DP-와 Jwt에서유의한 차이(p<0.05)를 보이는 시료를 표시한다.
도 8:ERK의 인산화는 항-CD26 mAb 1F7 처리이후 강화된 p21 Cip1 발현을 결과하였다. J.C26/DP는 MEK 키나아제 저해물질 PD98059와 U0126과 함께 배양한 이후, Nocodazole의 존부하에 배지 단독, 아이소타입 대조 mAb 4B4(Iso) 또는 1F7과 함께 배양하였다. 6-시간 배양후, 세포 사이클 분석은 재료와 방법에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. 데이터는 독립적으로 실시된 3회 실험의 평균을 나타낸다. G0/G1 진행억제에 대한 PD98059와 U0126의 효과는 J.C26- 또는 Jwt에서 관찰되지 않았다.
도 9:P21 Cipl 발현의 강화로 사람 T-세포 클론에서 항-CD26 mAb 1F7에 의한 세포 증식의 저해. 사람 T 클론은 항-CD3 mAb(OKT3)와 PMA에 의한 자극의 존부하에 배지, 또는 지정된 농도로 항-CD26 mAbs 1F7이나 5F8 혹은 아이소타입 대조 mAb 4B4(Iso)를 함유하는 배지에 배양하였다. 0.2*105세포를 배양하고 [3H]-티미딘으로 펄스하였다. [3H]-티미딘 통합은 삼중 시료의 평균 cpm±표준 오차로 표시하였다.
본원 발명은 암의 예방과 치료를 위하여 항-CD26 항체를 이용하는 치료 방법을 제시한다. 가용성 항-CD26 mAb, 예를 들면 1F7 또는 5F8의 결합은 시험관내와 생체내 연구에서 세포, 특히 Karpas 299 세포, 사람 CD30+ 역형성 대세포 T-세포 림프종 세포주, Jurkat 세포의 성장을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 항-CD26 단백질은de novo단백질 합성에 의존하는 증가된 p21(세포 사이클 단백질) 발현과 연관된 G1/S 체크 포인트에서 성장 억제를 결과한다. 더 나아가, 본 발명자들은 SCID 생쥐 종양 모델을 이용하여 항-CD26 항체 치료가 종양 보유 생쥐의 생존을 현저하게 향상시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 본원 발명은 CD26을 발현하는 인체 암의 치료에 항-CD26 항체를 사용하는 항암 요법을 제시한다.
CD26의 발현은 현재의 치료 양식에 내성을 보이는 여러 인체 암, 예를 들면 공격성 T-세포 악성종양에서 입증되었다. 따라서, 본원 발명은 종양 성장을 저해하는 항-CD26 항체를 사용하여 이런 암을 치료하는 방법을 제시한다. 여러 종류의 항-CD26 항체가 치료 섭생에 유용한 것으로 생각되는데, 여기에는 다클론항체, 단클론항체(예, mAb 1F7과 mAb 5F8), 인화 항체, 항체 공액체 등이 포함된다.
CD26 단백질이 다양한 기능적 측면에 관여하는 것으로 알려져 있긴 하지만, 항-CD26 항체의 결합이후 p21 발현의 증가는 CD26 및 암에서 세포 사이클의 조절물질 사이의 기능적 연관을 처음으로 확인한다.
이에 더하여, 본 발명자들은 가용성 항-CD26 단클론항체의 결합이 CD26-트랜스펙션된 Jurkat 세포와 사람 T-세포 클론에서 G1/S 진행억제를 유도한다는 것을 확인하였다. CD26은 휴면 CD4+ 기억 T-세포의 하위군에서 발현되고 이런 발현은 T-세포 활성화 직후에 강화되는 것으로 알려져 있다. 이에 더하여, CD26은 후기 T-세포 클론의 상승된 항원 감수성에 직접적으로 기여한다. 과다활성 면역 질환, 예를 들면 이식편-대-숙주 질환(GVDH)과 자가면역 질환은 과다활성화된 T-세포를 필요로 한다. 따라서, CD26을 발현하는 암에 대항하는 보호 요법을 제공하는 계획이외에 본 발명자들은 에디슨병, 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 베체트병, 만성 피로 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 당뇨병, 근막 통증 증후군, 굿파스츄어 증후군, 그레이브스병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 낭창, 메니에르 다발성 경화증, 중증근무력증, 심상성 천포창, 담도성 간경변증, 건선, 류마티스 관절염, 류마티스열, 유사 육종증, 경피증, 혈관염, 백반증, 웨게너 육아종증 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 자가면역 질환, 장기 이식, 이식편 대 숙주 질환을 비롯한 과다활성 면역 질환의 치료에 항-CD26 항체의 치료 용도를 계획한다. 현재 미국에서만 연간 1-2천만명이 자가면역질환을 진단받고 있다. 이런 이유로, 면역 관련된 질환에 대한 항-CD26 항체 치료는 격별한 발전이다.
A. CD26과 항-CD26 항체
CD26은 상피 세포와 백혈구 하위군을 비롯한 다수의 조직에서 발현되고 다양한 기능적 특성을 갖는 110-kd 표면 당단백질이다(Morimoto and Schlossman, 1998; von Bonin et al., 1998). CD26 단백질은 세포외 도메인에서 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV) 활성을 보유하는 막-결합된 엑토펩티다제로서, 끝에서 두 번째 위치에 L-플로린이나 L-알라닌을 갖는 폴리펩티드로부터 아미노-말단 디펩티드를 절단할 수 있다.
과거 십년간의 연구에서 CD26은 기본적인 사람 T-세포 생리에서 복수의 기능을 갖는 분자로 밝혀졌다. 가령, CD26은 T-세포와 단핵구 기능에 관여하는 특정 케모틴을 절단한다(Oravecz et al., 1997; Proost et al., 1998). 다른 연구에서 CD26은 ADA 표면 발현을 조절하는 아데노신 디아미나제(ADA) 결합 단백질로 동정되었다. CD26/ADA 복합체는 국소 아데노신의 촉매성 제거에 핵심적인 역할을 하고 면역계 기능을 조절하는 것으로 생각된다(Dang et al., 1996; Kameoka et al., 1993; Morrison et al., 1993).
간, 장, 신장에서 구성적으로 발현되긴 하지만, CD26 발현 수준은 T-세포에서 엄격하게 조절되고 이의 밀도는 T-세포 활성화이후에 현저하게 강화된다. 휴면 T-세포에서, CD26은 CD4+ 기억 T-세포의 하위군에서 발현되고 이런 CD4+CD26 풍부한 T-세포 개체군은 리콜 항원(recall antigen)에 최대로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, CD26 자체가 특정 실험 조건하에 T-세포의 신호 전달 과정에 관여한다. 고정된 단클론항체(mAb)로 CD26과 CD3의 가교-결합은 T-세포 활성화와 IL-2 생산을 유도할 수 있다. 게다가, T-세포의 항-CD26 항체 치료는 내재화(internalization)를 통하여 CD26의 표면 발현에서 감소를 유도하고, T-세포에서 CD26의 이런 항체-유도된 조절은 항-CD3이나 항-CD2 자극에 대한 강화된 증식성 반응을 결과한다. 항-CD26 mAb, 1F7에 의한 CD26 분자의 결찰이 신호 분자, 예를 들면 CD3제타와 p561ck의 티로신 인산화를 유도하긴 하지만, 가용성 항-CD26 mAb와 DPPIV 저해물질은 특정 경우에 T-세포 성장과 기능을 억제한다.
이에 더하여, 다양한 자극에 의한 T-세포의 활성화는 CD26 표면 발현을 증가시키고, 따라서 CD26은 T-세포 활성화 마커로 사용된다(Fox et al., 1984; Morimoto et al., 1989). 또한, CD26은 T-세포 활성화의 CD3과 CD2 경로에 관여하는 공동-자극 표면 분자이다.
CD26은 면역조절에 관여할 뿐만 아니라 특정 인체 암의 발병에도 일정한 역할을 하는 것으로 생각된다. 대부분의 폐 선암종은 DPPIV-파지티브인 반면, 다른 조직학적 유형의 폐 암종은 DPPIV-네거티브이다(Asada et al., 1993). 이에 더하여, CD26 발현은 분화된 갑상선 암종에서는 높지만 양성 갑상선 질환에서는 부재한다(Tanaka et al., 1995). 흑색종 발생에도 일정한 역할을 하는 것으로 보이는데, 그 이유는 멜라닌세포의 악성 전환에서 이의 발현이 상실되기 때문이다(Morrison et al., 1993; Wesley et al., 1999). 높은 수준의 CD26 단백질 발현과 mRNA 전사체는 정상적인 휴면 B-세포와 비교하여 B-만성 림프성 백혈병 세포와 활성화된 B-세포에서 발견된다(Bauvois et al., 1999). 한편, T-세포 악성종양에서 CD26 발현은 공격성 병리학적 존재, 예를 들면 T-세포 림프아세포성 림프종/급성 림프아세포성 백혈병(LBL/ALL)과 T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종에 국한되는 것으로 보이는데, 균상 식육종과 같은 무활동 질환에서 일부 탐지된다. 흥미롭게도, T-세포 LBL/ALL 하위군에서, CD26 발현은 불량한 예후 환자의 독립적 마커이다(Carbone et al., 1995; Carbone et al., 1994).
CD26에 대한 다수의 항체가 만들어졌는데, 여기에는 표준 하이브리도마 기술(Morimoto et al., 1989; Torimoto et al., 1992; U.S. Patent 5,120,642; DeMeester et al., 1994; Dong et al., 1998)에 의해 개발된 1F7, Ta1, 5F8, 10F8A, 12E3B, 14D10, 2F9, 4G8, 11H9, 18H3A, 9C11, 16D4B, TA5.9와 같은 단클론항체가 포함된다.
CD26의 다양한 역할에 상응하는 CD26 항체는 다형태성 세포 기능을 매개한다. 가령, 특정 mAb와 가교결합된 CD26은 막통 단백질 티로신 포스파타제인 CD45와의 물리적 결합으로 T-세포 활성화의 대체 경로를 활성화시킬 수 있다(Dang et al., 1990a; Dang et al., 1990b; Dang et al., 1990c; Dang et al., 1991; Fleischer, 1987; Hegen et al., 1997; Dang et al., 1990d; Torimoto et al., 1991). 하지만 다른 연구에서는 가용성 항-CD27 mAb와 DPPIV 저해물질이 특정 경우에 T-세포 성장과 기능을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Dang et al.; 1996; Kahne et al., 1998; Kubota et al., 1992; Mattern et al., 1993). 이들 연구는 CD26이 면역조절 분자로서의 역할뿐만 아니라 공격성 T-세포 혈액학적 악성종양을 비롯한 특정 신생물의 발생에 잠재적으로 기능할 수 있음을 암시한다(Carbone et al., 1995; Carbone et al.; 1994).
Dong 등은 13가지 항-CD26 항체를 CD26 결실 변이체의 결실 분석, 면역블랏팅, 직접적인 결합 분석에 기초하여 CD26 단백질의 1-247, 248-358, 359-449, 450-577, 359-653 아미노산 잔기에 위치하는 5가지 상이한 에피토프 군으로 나누었다. 이 연구에서, Dong 등(1998)은 서로 다른 항-CD26 mAb에 특이적인 별개의 에피토프가 CD26의 상이한 기능적 도메인과 연관한다는 것을 발견하였다. 가령, 이들 군중 두 영역, 248-358과 359-449 아미노산 영역에 대한 mAb가 CD26의 조절을 유도하고 T-세포 증식에 공동-자극 효과를 보이긴 하지만, 359-449 아미노산 영역에 대한 항체중 하나만 ADA 결합과도 연관하였다. 이는 서로 다른 항-CD26 항체에서 나타나는 일부 상이한 기능적 효과의 원인을 설명한다.
따라서, CD26과 이의 항체는 다양한 범위의 기능을 갖는 복합 분자이다. 본원 발명은 CD26이 종양 발생에 상당한 역할을 하며 CD26에 대한 항체가 표면에CD26을 보유하는 암세포의 성장을 억제하고 저해한다는 것을 명료하게 입증한다.
이에 더하여, 선행 문헌에서 활성화 신호를 매개하는 CD26 능력이 기능적 CD3/TcR 복합체에 의해 좌우된다고 보고하였지만(von Bonin et al., 1998; Dang et al., 1990d), 본 발명자들은 기능적 CD3/TcR 복합체의 부재하에 T-세포 생물학적 반응의 변화를 유도하는 신호를 CD26이 전달할 수 있음을 보인다. 정상 T-세포에서, CD26의 연동(engagement)은 CD26과 CD45의 물리적 결합을 통하여 부분적으로 매개되는 T-세포에 신호 전달에 관여하는 단백질의 증가된 인산화를 결과한다(Hegen et al., 1997; Torimoto et al., 1991). 현재, 본 발명자들은 세포 사이클을 유도하는 CD26 연동에 관련된 기전을 조사하고 있다. CD26 발현이후 G1 진행억제가 흑색종 세포에서 관찰되긴 했지만(Wesley et al., 1999), 본 발명자들은 CD26-매개된 G1/S 진행억제 및 변화된 p21 발현 사이의 기능적 연관을 입증하였다.
B. p21
진핵 세포에서, 세포 사이클 진행은 사이클린-의존성 키나아제(CDK)로 알려진 일군의 관련된 효소에 의해 G1/S 체크 포인트에서 조절되는데, 상기 키나아제는 사이클린(cyclin)이라고 하는 조절 아단위와의 물리적 결합에 의해 파지티브하게 조절된다(yang and Kornbluth, 1999). 하지만, CDK-사이클린 복합체의 효소 활성은 CDK 저해물질이라고 하는 일단의 단백질에 의해 네거티브하게 조절된다. 이들 CDK 저해물질중의 하나는 물리적 결합을 통하여 다중 사이클린-CDK 복합체를 차단하는 p21(WAF1, Cipl SDI1)이다(E1-Deiry et al., 1993; Xiong et al., 1993). 이에 더하여, p21은 증식성 세포 핵 항원(PCNA)과의 직접적인 상호작용을 통하여, DNA 복제를 저해할 수 있다(Waga et al., 1994). 세포 손상, 혈청 인자, 포르볼(phorbol) 에스테르를 비롯한 다양한 자극이 p21 발현을 유도할 수 있는데, p21 유도는 자극에 따라 p53-의존성 또는 p53-독립성으로 나타난다(E1-Diery et al.; 1993; E1-Diery et al.; 1994; Datto et al., 1995).
p53 종양 억제 유전자의 하향 표적으로서 p21은 악성 전환에 간접적으로 관여한다. DNA 손상에 대한 반응으로 p53의 유도는 G1 체크 포인트 억제를 유도하는데, 이 시점에서 DNA 복구는 S 단계에서 DNA 복제에 앞서 달성된다. p21은 시험관내에서 증식성 세포 핵 항원(PCNA) 의존성 DNA 복제를 저해하지만 DNA 복구를 저해하지는 않는데, 이는 p53에 대한 하향 주효체로서 추정 역할과 일치한다.
미국 특허 6,218,372에서는 종양 형성에서 p21의 역할 및 생체내에서 악성 표현형을 반전시키는 능력을 기술한다. p21 발현은 종양과 협착 억제 효과를 유도할 만큼 충분하고, 세포 분화와 연관된 유전자, 예를 들면 유착 분자의 발현에 영향을 주는 NF-κB에 의한 전사 활성화를 촉진한다.
본원 발명은 항-CD26 항체의 투여가 세포 성장 저해 및 p21의 발현에서 상응하는 증가를 유도한다는 것을 입증한다.
C. 면역 질환에서 역할
면역 조절에서 CD26 기능이 충분히 연구되긴 했지만 임상적 환경에서 이의 역할이 아직 명확하게 정의되지는 않고 있는데, 몇몇 가용한 데이터에 따르면 이는 특정 인체 질환의 발생에 관여하는 것으로 생각된다. CD26은 류마티스 관절염, 그레이브스병, 다발성 경화증을 비롯한 특정 자가면역 질환에서 T-세포 활성화와 림포카인 합성의 조절물질로 기능하는데(Hafler et al., 1985; Mizokami et al., 1996; Eguchi et al., 1989; Gerli et al., 1996), 이는 CD26이 T세포 활성화의 마커이며 이런 과정에서 기능적인 역할을 한다는 발견과 일치한다. 이들 자가면역 질환을 갖는 환자에서 순환하는 T 림프구는 CD26 표면 발현을 높은 수준으로 발현하고, 여러 경우에 발현된 CD26의 수준은 질병 활성과 상관한다(Hafler et al., 1985; Mizokami et al., 1996; Eguchi et al., 1989; Gerli et al., 1996). 게다가, 류마티스 관절염 환자에서 CD26 발현의 항체-유도된 조절은 말초혈 T-세포에서 강화된 IL-2와 감마-IFN 합성 및 감소된 감마-IFN 생산을 유도하지만, 활액 T-세포에서 IL-2 생산에는 영향을 주지 않는다(Gerli et al., 1996). 이에 더하여, 생체내에서 CD26/DPPIV 효소 활성의 저해는 쥐 수용자에서 심장 동종이식편 생존을 연장시키는데, 이는 생체내에서 동종항원-매개된 면역 조절 및 동종이식편 거부반응의 기전에서 CD26의 역할을 암시한다(Korom et al., 1997).
선행 연구에서 효과량의 항-CD26 단클론항체 치료가 중증도 독성없이 환자에서 내약성인 것으로 밝혀졌다. 파일럿 연구에서 Bacigalupo 등(1985)은 중증 저항성 이식편-대-숙주 질환을 앓는 8명의 환자를 사람 CD26을 인식하는 뮤린 항-CD26 단클론항체로 치료하였다(De Meester et al., 1993). 순환하는 CD26+ T-세포수의 감소와 함께, 질병의 심각도가 눈에 띄게 개선되었다. 2명이 완전 반응하였고 2명은 부분적으로 반응하였으며, 8명의 환자중 5명이 치료이후 적어도 1년간 생존하였다. 중요하게는, 항-CD26 단클론항체 치료는 수용가능한 부작용으로 내약성이었는데, 이는 항-CD26 단클론항체를 이용한 앞으로의 요법이 부작용을 줄이면서 실시될 수 있다는 것을 암시한다.
본 발명자들은 가용성 항-CD26 단클론항체의 결합이 CD26-트랜스펙션된 Jurkat 세포주와 사람 T-세포 클론에서 G1/S 진행억제를 유도한다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 면역 질환, 이식편-대-숙주 질환, 장기 이식을 비롯한 활성화된 면역계 질환을 수반하는 임상적 환경에서 항-CD26 항체 치료의 치료요법적 이용을 계획하는데, 여기서 과다활성된 면역 세포에 세포 사이클 진행억제를 유도할 수 있다.
항-CD26 항체는 이식편-대-숙주 질환을 치료하는데 다른 치료 양식과 병용될 수 있다. 부가적으로, 서로 다른 단계나 심각도의 이식편-대-숙주 질환을 앓는 환자가 항-CD26 치료요법에 선택될 수 있다. 이런 요법에서, 일부 구체예에서는 이런 질환을 치료하는데 항-CD26 항체 단독을 사용하고, 다른 구체예에서는 적절히 변형된 항-CD26 항체, 예를 들면 이식편-대-숙주 질환을 유발하는 특정 활성화된 T-세포 또는 다른 면역 세포를 표적하는 작용제에 공액된 항-CD26 항체를 사용한다. 이런 질환을 치료하기 위하여 항-CD26 항체와 공액될 수 있는 작용제에는 다른 특정 항체, 성장 인자, 케모킨, 사이토킨, 독소, 또는 이들 주효체 세포에서 특정 표적을 인식하는 작용제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 공액이외에, 항-CD26 mAb는 질병을 유발하는 주효체 세포를 표적하는 작용제와 병용될 수 있다. 항-CD26 항체는 이들 질병에서 다른 제약학적/임상적 작용제, 예를 들면 이런 질병이나 항-CD26 치료 섭생으로 인한 잠재적 감염을 최소화시키기 위하여 선별된 항생제/항진균제/항바이러스제와 병용될 수도 있다. 이에 더하여, 항-CD26 단클론항체에 의해 인식되는 특정 에피토프는 CD26-신호전달과 결합에 차별적인 효과를 주는 것으로 밝혀졌다.
D. 항체
a. 항체 생산
본원 발명은 항-CD26 항체에 대한 치료 용도를 제시한다. 본원의 일부 구체예에서 1F7과 5F8 단클론항체를 기술하지만, CD26 항원에 대한 다른 단클론항체와 다클론항체 역시 본원 발명에 따른 예방과 치료 방법에 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원 발명은 임의의 특정 항-CD26 항체에 국한되지 않으며, CD26 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 특이적인 임의의 항체가 사용될 수 있다. 또한, 본원 발명은 항-CD26의 생물학적 기능성 등가물의 이용을 계획한다. 본원에서 "CD26 단백질/펩티드/폴리펩티드" 또는 "CD26 항원"은 자연적으로 생성되거나, 정제되거나, 부분적으로 정제되거나 또는 재조합 DNA 방법으로 생산되었는지에 상관없이 CD26 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 의미한다.
생물학적 기능성 등가물은 유사하거나 개선된 특성을 보유하면서 이런 분자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질의 구조가 변형될 수 있는 분자이다. 본원에서, 이런 분자는 CD26 항원 또는 CD26 항체이다. 생물학적 기능성 등가물에는 "야생형"이나 표준 단백질을 인코드하는 능력을 유지하면서 동시에 별개의 서열을 보유하도록 조작된 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 이는 유전자 코드의 축중, 다시 말하면 동일한 아미노산을 인코드하는 다중 코돈의 존재로 달성될 수 있다. 이런 등가물을 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
항체를 만들고 특성화하는 수단은 당분야에 공지되어 있다(참고: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)
(i) 다클론항체
간단히 말하면, 다클론 항체는 동물을 본원 발명에 따른 면역원성 조성물(본원에서 CD26 항원)로 면역시키고 면역된 동물로부터 항혈청을 수거하여 얻는다.
항-혈청 생산에는 다양한 동물종이 이용될 수 있다. 전형적으로, 항-혈청 생산에 이용되는 동물은 토끼, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니 피그 또는 염소이다. 상대적으로 큰 혈액 부피로 인하여, 토끼가 다클론항체 생산에 가장 적합하다.
당분야에 공지된 바와 같이, 제시된 조성물은 면역원성이 상이할 수 있다. 따라서, 숙주 면역계를 조장하는 것이 필요한데, 이는 펩티드나 폴리펩티드 면역원을 담체에 결합시켜 달성할 수 있다. 적합한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 소 혈청 알부민(BSA)이다. 다른 단백질, 예를 들면 난알부민, 생쥐 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 저해물질 역시 담체로 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 담체 단백질에 공액시키는 수단은 당분야에 공지되어 있는데, 여기에는 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 카보디이미드, 비스-바이아조(biazo)화된 벤지딘이 포함된다. 다른 이중기능성 또는 유도화 작용제, 예를 들면 말레이미도벤조일 설포숙시니미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 공액), N-하이드록시숙시니미드(리신 잔기를 통한공액), 글리타르알데하이드, 무수숙신산, SOCl2, 또는 R1N=C=NR(R과 R1은 서로 다른 알킬기) 역시 가교에 사용될 수 있다.
당분야에 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 면역 반응의 비-특이적인 촉진물질(어쥬번트)을 이용하여 강화시킬 수 있다. 적합한 어쥬번트에는 완전 프레운드 어쥬번트[사멸된 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 함유하는 면역 반응의 비-특이적 촉진물질], 불완전 프레운드 어쥬번트, 수산화알루미늄 어쥬번트가 포함된다.
다클론항체에 사용되는 면역원 조성물의 함량은 면역원의 특성 및 면역에 이용되는 동물에 좌우된다. 면역원을 투여하는데 다양한 루트(피하, 근육내, 피내, 정맥내, 복강내)가 이용될 수 있다. 다클론항체의 생산은 면역화이후 다양한 시점에서, 면역된 동물의 혈액을 표본 추출하여 모니터할 수 있다.
2차 효능 촉진주사를 제공할 수도 있다. 촉진과 적정(titration)의 과정은 적절한 역가가 달성될 때까지 반복한다. 원하는 수준의 면역원성이 달성되면, 면역된 동물은 채혈하고 혈청을 분리하고 저장하거나, 또는 동물은 mAb를 만드는데 이용할 수 있다.
토끼 다클론항체의 생산에서, 동물은 귀 정맥을 통하여 또는 대안으로 심장 천자로 채혈할 수 있다. 확보된 혈액은 응고시키고, 이후 원심분리하여 전체 세포와 응혈로부터 혈청 구성요소를 분리한다. 혈청은 다양한 목적으로 이용될 수 있고, 원하는 항체 단편은 공지된 방법, 예를 들면 고체 매트릭스나 단백질 A에 결합된 다른 항체나 펩티드를 이용한 친화성 크로마토그래피 및 후속으로 항원(펩티드) 친화성 칼럼으로 정제할 수 있다.
(ii) 단클론항체
"단클론항체"는 CD26 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린의 상동성 개체군을 의미한다. 인지하는 바와 같이, CD26 단백질은 하나이상의 항원 결정부위를 보유할 수 있다. 본원의 항체는 이들 결정부위중 하나이상을 지향할 수 있다.
단클론 항체(MAb)는 공지된 기술, 예를 들면 U.S. 특허 4,196,265에서 예시된 기술로 용이하게 만들 수 있다. 전형적으로, 이런 기술은 선별된 면역원 조성물, 예를 들면 정제되거나 부분적으로 정제된 CD26 항원 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 동물을 면역하는 단계를 포함한다. 면역화 조성물은 항체 생산 세포를 효과적으로 촉진하는데 효과적인 방식으로 투여된다.
단클론 항체(MAb)를 만드는 방법은 다클론 항체를 만드는 경우와 동일한 방식으로 출발한다. 생쥐 및 쥐와 같은 설치류가 바람직한 동물이긴 하지만, 토끼, 양, 염소, 원숭이 세포 역시 이용될 수 있다. 쥐의 이용이 다소간 이점을 제공하긴 하지만(Goding, 1986) 생쥐가 좀더 바람직한데, 특히 BALB/c 생쥐는 가장 널리 이용되고 좀더 높은 비율의 안정적인 융합을 제공하기 때문에 가장 선호된다.
동물은 전술한 바와 같이 항원을 주사한다. 항원은 필요한 경우에 담체 분자, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌에 공액될 수 있다. 항원은 어쥬번트, 예를 들면 프레운드 완전 어쥬번트 또는 프레운드 불완전 어쥬번트와 전형적으로 혼합될수 있다. 동일 항원의 효능촉진 주사는 대략 2주 간격으로 진행된다.
면역화이후, 항체를 생산할 수 있는 잠재력을 가진 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)가 mAb 생성 프로토콜에 따라 선별된다. 이들 세포는 생검된 비장이나 림프절로부터 구할 수 있다. 비장 세포와 말초혈 세포가 바람직한데, 그 이유는 이들 세포가 분화하는 형질모구 단계에 위치하는 항체-생산 세포의 풍부한 공급원이기 때문이다.
종종, 여러 동물을 면역하여 가장 높은 항체 역가를 보인 동물의 비장을 떼어내고, 비장을 시린지로 균일화시켜 비장 림프구를 수득한다. 전형적으로, 면역된 생쥐의 비장은 대략 5 × 107내지 2 × 108개의 림프구를 보유한다.
이후, 면역된 동물로부터 유래된 항체-생산 B 림프구는 면역된 동물과 동일한 종의 영속된 골수종 세포와 융합시킨다. 하이브리도마-생산 융합 과정에 사용하기 적합한 골수종 세포주는 비-항체-생산이고 높은 융합 효율을 보이며 원하는 융합 세포(하이브리도마)의 성장만을 지속시키는 특정 선택 배지에서는 성장할 수 없는 효소 결핍을 가진다.
당업자에게 공지된 다양한 골수종 세포중 하나를 이용할 수 있다(Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp.75-83, 1984). 가령, 면역된 동물이 생쥐이면, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG1.7, S194/5XX0 Bul이 이용될 수 있다; 쥐의 경우에는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210이 이용될 수 있다; 사람 세포 융합의 경우에는 U-266,GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6이 이용될 수 있다.
적절한 뮤린 골수종 세포는 NS-1 골수종 세포주(P3-NS-1-Ag4-1)인데, 이는 세포주 저장 번호 GM3573으로 NIGMS Human Genetic Mutant-cell Repository에서 입수가능하다. 이용될 수 있는 다른 생쥐 골수종 세포주는 8-아자구아닌-저항성 생쥐 뮤린 골수종 SP2/0 비-생산자 세포주이다.
항체-생산 비장이나 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 만드는 방법은 2:1 비율로 체세포와 골수종 세포를 혼합하는 단계로 구성되는데, 상기 비율은 세포막의 융합을 촉진하는 작용제(화학적 또는 전기적)의 존재하에 대략 20:1에서 1:1까지 변할 수 있다. 센다이 바이러스를 이용한 융합 방법은 Kohler와 Milstein(1975; 1975)에서 기술하고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들면 37%(v/v) PEG를 이용한 융합 방법은 Gefter et al.(1997)에서 기술한다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 이용 역시 적합하다(Goding pp. 71-74, 1986).
융합 과정에서 하이브리드는 낮은 빈도, 대략 1 × 10-6내지 1 ×10-8로 생성된다. 하지만, 이는 문제가 되지 않는데, 그 이유는 생존한 융합 하이브리드가 선택 배지에서 배양으로 융합된 모세포(특히, 무제한으로 분화하는 융합된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문이다. 일반적으로, 선택 배지는 조직 배양 배지에 뉴클레오티드의de novo합성을 차단하는 작용제를 함유하는 배지이다. 전형적인 작용제는 아미노프테린, 메토트렉세이트, 아자세린이다. 아미노프테린과 메토트렉세이트는 퓨린과 피리미딘 모두의de novo합성을 차단하고, 반면 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린이나 메토트렉세이트가 사용되면, 배지는 뉴클레오티드의 공급원으로 히폭산트린과 티민딘으로 보충된다(히폭산트린-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지). 아자세린이 사용되면, 배지는 히폭산트린으로 보충된다.
바람직한 선택 배지는 HAT이다. 뉴클레오티드 회수 경로를 가동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 회수 경로의 핵심 효소, 예를 들면 히폭산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)가 결핍되어 생존할 수 없다. B-세포는 이런 경로를 가동시킬 수 있지만 배양액에서 수명이 제한되고 일반적으로 2주이내에 사멸한다. 이런 이유로, 골수종과 B-세포로부터 형성된 하이브리드 세포만 이런 선택 배지에서 생존할 수 있다.
이런 배양으로 하이브리도마 개체군이 제공되는데, 여기에서 특정 하이브리도마가 선택된다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 마이크로역가 평판에서 단일-클론 희석으로 세포를 배양하고, 이후 개별 클론 상층액(대략 2 내지 3주후)에서 원하는 반응성을 분석하여 실시한다. 이런 분석, 예를 들면 방사면역 분석, 효소 면역 분석, 세포독성 분석, 플라크 분석, 점 면역결합 분석 등은 민감하고 단순하며 신속해야 한다.
이후, 선별된 하이브리도마는 연속 희석하고 개별 항체-생산 세포주로 클론하는데, 이들 클론은 무한히 증식하고 mAb를 생산할 수 있다. 이들 세포주는 2가지 기본적인 방법으로 mAb 생산에 이용될 수 있다.
하이브리도마 시료는 최초 융합을 위한 체세포와 골수종 세포를 제공하는데 이용된 조직적합성 동물(예, 동계 생쥐)에 주사(주로 복강)될 수 있다. 선택적으로, 동물은 주사에 앞서 탄화수소, 특히 프리스탄(테트라메틸펜다데칸)과 같은 오일을 먹인다. 주사된 동물에는 융합된 세포 하이브리드에 의해 생산된 특이적인 mAb를 분비하는 종양이 발생한다. 이후, 동물로부터 체액, 예를 들면 혈청과 복수를 뽑아 높은 농도의 mAb를 제공할 수 있다.
개별 세포주는 시험관내에서도 배양할 수 있는데, 여기서 mAb는 배양 배지에 자연적으로 분비되고 이로부터 높은 농도로 수득될 수 있다.
이런 수단으로 생성된 mAb는 원하는 경우에 여과, 원심분리, 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들면 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피로 추가로 정제할 수 있다. 본원 발명에 따른 mAb의 단편은 펩신이나 파파인과 같은 효소로 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 절단을 비롯한 여러 방법으로, 정제된 mAb로부터 얻을 수 있다. 대안으로, 본원 발명의 mAb 단편은 자동화 펩티드 합성장치를 이용하여 합성할 수 있다.
단클론항체를 만드는데 분자 클로닝 방식이 이용될 수도 있다. 여기서, 조합성 면역글로불린 파게미드 라이브러리는 면역된 동물의 비장으로부터 분리된 RNA로부터 만들고, 적합한 항체를 발현하는 파게미드(phagemide)는 항원을 발현하는 세포와 대조 세포, 예를 들면 정상-대-종양(normal-versus-tumor) 세포를 이용한 패닝(panning)으로 선택한다. 전통적인 하이브리도마 기술에 대비하여 이런 방식의 이점은 대략 104배의 항체가 단일 라운드에 생산되고 심사될 수 있으며, H와 L 사슬 조합에 의해 새로운 특이성이 발생하여 적합한 항체를 발견하는 기회가 더욱증가한다는 점이다.
CD26 항원에 대한 항체는 이런 표준 기술을 이용하여 이미 만들어졌다. 가령, 미국 특허 5,120,642에서는 1F7 mAb의 생성 및 이의 특성화를 기술한다. CD4+ 림프구 개체군에서 보조인자-유도 세포와 억제인자-유도 세포의 구별을 보조하기 위하여 개발된 mAb 1F7은 새로운 영장류 밤원숭이(Aotus trivirgatus)로부터 유래된 촉진된 T-세포주로 Balb/c J 생쥐를 면역하여 개발된 하이브리드 세포주로부터 생산되었다. 간단히 말하면, Balb/c J 생쥐는 표준 하이브리도마 과정에 따라 밤원숭이(Aotus trivirgatus)로부터 유래된 PHA-자극된 T-세포주 세포로 면역하였다. 생쥐 비장세포는 수거하고 골수종 세포주 NS-1과 융합시켰다. 세포 개체군은 HAT 배지에 배양하여 클론용 하이브리도마 세포를 얻었다. 사람 T-세포와 반응하는 항체를 보유하는 하이브리도마 배양액을 선택하였다. 사람 T-세포와 반응하는 mAb를 보유하는 하이브리도마 배양액의 클로닝과 재클로닝은 피더(feeder) 세포의 존재하에 제한 희석 방법으로 실시하였다. 이후, 악성 복수를 발생시키고 분석에 사용하였다. mAb의 아이소타입은 플루레신-표지된 염소 항-생쥐 IgG의 염색 및 생쥐 Ig의 다른 아강(subclass)에 대한 플루레신-표지된 항체의 염색 실패로 생쥐 아이소타입 IgG1인지 확인하였다. 항-1F7 mAb를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양액은 1989년 11월 21일에 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852에 ATCC No. HB 10297 수탁번호로 기탁되었다.
CD26에 대한 다른 mAb는 본 발명자들에 의해 표준 하이브리도마 기술로 만들어졌는데, 여기에는 10F8A, 12E3B, 14D10, 2F9, 4G8, 11H9, 18H3A, 9C11, 16D4B가포함된다(Dong et al., 1998). 또 다른 항-CD26 mAb는 5F8이다(Morimoto et al., 1989; Torimoto et al., 1992).
(iii) 인화 항체
인화 항체는 원래의 항원 특이성을 유지하면서, 유전자 조작 기술로 불변 영역 및/또는 가변 영역 골격 서열이 사람 서열로 치환된 동물 기원의 항체이다. 이런 항체는 공여자와 수용자의 변형되지 않은 경쇄나 키메라 경쇄 등과 결합된 인화 중쇄를 보유한다. 일반적으로, 이런 항체는 사람 항원에 특이성을 갖는 설치류 항체, 예를 들면 본원 발명의 뮤린 Ab로부터 유래되고, 생체내 치료 용도로 사용된다. 이런 전략은 외래 항체에 대한 숙주 반응을 감소시키고 사람 주효체 기능의 선택을 가능하게 한다. 인화 면역글로불린을 생산하는 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 가령, 미국 특허 5,693,762에서는 하나이상의 상보성 결정부위(CDR)를 보유하는 인화 면역글로불린을 생산하는 방법 및 이를 함유하는 조성물을 개시한다. "CDR"은 항체의 상보성 결정부위 아미노산 서열로 정의된다. CDR은 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 초가변 영역에 포함된다. CDR은 항체가 항원이나 에피토프에 결합할 수 있는 접촉 잔기를 제공한다. 본원 발명에서 관심있는 CDR은 공여자 항체 가변 중쇄와 경쇄 서열로부터 유래되고, 여기에는 자연 발생 CDR의 기능적 단편과 유사체가 포함되는데, 이들 단편과 유사체 역시 공여자 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및/또는 중화 능력을 공유하거나 유지한다. 접촉 항체에 결합된 인화 면역글로불린은 사람에서 실질적으로 비-면역원성이고 항원, 예를 들면 단백질 또는 에피토프를 보유하는 다른 화합물에 대하여 공여자 면역글로불린과 실질적으로동일한 친화성을 유지한다.
일반적으로, 인화 항체는 사람아닌 공급원으로부터 도입된 하나이상의 아미노산 잔기를 보유한다. 이들 사람아닌 아미노산 잔기는 전형적으로"수입(import)"가변 도메인으로부터 획득되는"수입"잔기라고 한다. 인화 항체는 항원-인식된 부위 또는 상보성 결정 초가변 영역(CDR)이 사람아닌 기원의 산물이고 가변 도메인의 모든 골격 영역(FR)이 사람 유전자의 산물인 항체이다.
인화는 Winter 등의 방법에 따라 설치류 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 치환하여 실시할 수 있다(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988). 따라서, 이런 "인화"항체는 키메라 항체인데, 여기서 완전한 사람 가변 도메인은 사람아닌 종의 상응하는 서열로 치환된다. 실제로, 인화 항체는 일부 CDR 잔기와 일부 골격 영역(FR) 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위의 잔기로 치환되는 사람 항체이다.
본원 발명에 유용한 항체의 생산을 교시하는 다른 미국 특허는 조합 방식을 이용하여 키메라 항체의 생산을 기술하는 U.S. 특허 5,565,332; 재조합 면역글로불린 제조를 기술하는 U.S. 특허 4,816,567; 항체-치료제 공액체를 기술하는 U.S. 특허 4,867,973 등이다.
U.S. 특허 5,565,332에서는 항체, 또는 모 항체와 동일한 결합 특이성을 보유하지만 인화 특성이 증가된 항체를 생산하는 방법을 기술한다. 인화 항체는 U.S. 특허 5,565,332에서 밝힌 방법으로 파아지 전시 기술을 이용한 사슬 섞음(chain shuffling)으로 수득할 수 있다. 사람 항체 역시 B-세포를 EBV로 형질전환시키고 Hoon et al., (1993)에서처럼 분비세포의 후속 클로닝으로 생산될 수 있다.
항체는 항원에 대한 높은 친화성의 보유 및 다른 긍정적인 생물학적 특성을 갖도록 인화시키는 것이 중요하다. 이런 목적을 달성하기 위하여, 적절한 방법에 따라 인화 항체는 모 서열과 인화 서열의 3차원 모델을 이용한 모 서열 및 다양한 개념적 인화 산물의 분석 과정으로 얻는다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 가용하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 가용하다. 이들 전시를 검사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능 역할의 분석, 다시 말하면 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석이 가능하다. 이런 방식으로, FR 잔기를 선별하고 공통 서열 및 수입 서열과 결합시키며 원하는 항체 특성, 예를 들면 표적 항원에 대한 증가된 특이성을 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 직접적으로 실질적인 영향을 줄 수 있다.
(iv) 사람 항체
사람 mAb는 하이브리도마 방법으로 만들 수 있다. 사람 mAb 생산을 위한 사람 골수종과 생쥐-사람 이종골수종 세포주는 예로써 Kozbor(1984) 및 Brodeur et al.(1987)에서 기술한다.
내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 면역화직후 사람 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 외래유전자도입 동물(예, 생쥐)을 만드는 것이 가능하다. 가령,키메라와 생식세포 변이 생쥐에서 항체 중쇄 접합부위(JH)의 동형접합성 결실이 내생적 항체 생산을 완전히 저해하는 것으로 보고되었다. 이런 생식세포주 변이 생쥐에서 사람 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 공격직후에 사람 항체의 생산을 결과한다(Jakobovits et al., 1993).
대안으로, 파지 전시 기술(McCafferty et al., 1990)을 이용하여 비면역된 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 사람 항체와 항체 단편을 생산할 수 있다. 이런 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬유성 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이저나 마이너 외피 단백질로 인-프레임 클론되고 파지 입자의 표면에 기능성 항체 단편으로 전시된다.
또한, 섬유성 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA를 보유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선별은 이들 특성을 보이는 항체를 인코드하는 유전자의 선별을 결과한다. 따라서, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 전시는 다양한 형태로 실시될 수 있다(Johnson et al., 1993). V-유전자 분절의 여러 공급원이 파지 전시에 사용될 수 있다. Clakson 등(1991)은 면역된 생쥐의 비장으로부터 유래된 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 분리하였다. 비면역된 사람 공여자로부터 V 유전자 레퍼토리가 작제될 수 있고, 다양한 항원 어레이(자가-항원 포함)에 대한 항체는 Marks et al.(1991) 또는 Griffith et al.(1993)에서 밝힌 기술에 따라 분리할 수 있다.
자연적인 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다(체세포 과돌연변이). 도입된 이런 변화중 일부는 높은 친화성을 공여하고, 높은-친화성 표면 면역글로불린을 전시하는 B-세포는 후속 항원 공격동안 우선적으로 복제되고 분화된다. 이런 자연적인 과정은 "사슬 섞음"(Marks et al., 1992)으로 알려진 기술을 이용하여 모방할 수 있다. 이 방법에서, 파지 전시로 수득된"1차" 사람 항체의 친화성은 비면역된 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리로 중쇄와 경쇄 V 영역을 순차적으로 치환함으로써 향상될 수 있다. 이런 기술은 nM 범위에서 친화성을 갖는 항체와 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. 대형 파지 항체 레퍼토리를 만드는 전략은 Waterhouse et al.(1993)에서 기술하고, 이런 대형 파지 라이브러리로부터 직접적으로 높은 친화성 사람 항체의 분리는 Griffith et al.(1993)에서 보고한다. 유전자 섞음은 설치류 항체로부터 사람 항체를 유도하는 데에도 이용될 수 있는데, 여기서 사람 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화성과 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"이라고 하는 상기 방법에 따라, 파지 전시 기술로 수득된 설치류항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 사람 V 도메인 유전자로 치환하여 설치류-사람 키메라를 만든다. 항원에서 선별은 기능적 항원-결합 부위를 복구할 수 있는 사람 변이의 분리를 결과한다, 다시 말하면 에피토프는 파트너 선택을 지배한다(각인한다). 이런 과정을 반복하여 나머지 설치류 V 도메인을 치환하면, 사람 항체가 수득된다(PCT 특허 출원 WO 93/06213). CDR 이식(grafting)에 의한 설치류 항체의 전통적인 인화와 달리, 이 기술은 설치류 기원의 골격이나 CDR 잔기가 없는 완전한 사람 항체를 제공한다.
(v) 이중특이 항체(bispecific antibody)
이중특이 항체는 적어도 2개의 서로 다른 항원에 결합 특이성을 갖는 단클론, 바람직하게는 사람이나 인화 항체이다. 본원의 경우에, 결합 특이성중 하나는 CD26 항원을 지향하고, 다른 특이성은 임의의 다른 항원, 바람직하게는 다른 수용체나 수용체 아단위를 지향한다. 가령, CD26 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이 항체는 본원 발명의 범주에 속한다. 이중특이 항체를 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
전통적으로, 이중특이 항체의 재조합 생산은 2가지 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하는데, 여기서 2개의 중쇄는 서로 다른 특이성을 갖는다(Millstein and Cuello, 1983). 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 배분으로 인해, 이들 하이브리도마(quadromas)는 10가지의 서로 다른 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하는데, 이들중 하나만 정확한 이중특이 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계로 실시되는 정확한 분자의 정제는 상당히 부담스럽고, 산물 수율이 낮다. 유사한 과정은 WO 93/08829와 Traunecker et al.(1991)에서 개시한다.
상이하고 좀더 바람직한 방식에 따라, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합된다. 적절하게는, 융합은 힌지, CH2, CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 진행된다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 보유하는 첫 번째 중쇄 불변 영역(CH1)을 보유하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 원하는 경우 면역글로불린 경쇄를 인코드하는 DNA는 별개의발현 벡터에 삽입하고 적절한 숙주 미생물에 공동트랜스펙션시킨다. 이는 동등하지 않은 비율의 3가지 폴리펩티드 사슬이 작제에 이용될 때 최적 수율이 달성되는 구체예에서 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 우수한 탄력성을 제공한다. 하지만, 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬이 동등비율로 발현될 때 높은 비율이 달성되는 경우 또는 비율에 특정한 유의성이 없는 경우에는 2개 또는 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것도 가능하다. 이런 방식의 바람직한 구체예에서, 이중특이 항체는 한쪽 팔에 제 1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제 2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이런 비대칭적 구조는 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이 화합물의 분리를 용이하게 하는데, 그 이유는 이중특이 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 분리가 용이하기 때문이다. 이중특이 항체를 만드는 것과 관련된 좀더 자세한 내용은 Suresh et al.(1986)을 참조한다.
(vi) 이형공액체 항체(heteroconjugate antibody)
이형공액체 항체 역시 본원 발명의 범주에 속한다. 이형공액체 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이런 항체는 예로써 원치않는 세포에 면역계 세포를 표적하거나(U.S. Patent 4,676,980) 또는 HIV 감염의 치료에 제안되었다(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). 이형공액체 항체는 임의의 통상적인 가교-결합 방법으로 만들 수 있다. 적합한 가교-결합제는 당분야에 공지되어 있으며, U.S. 특허 4,676,980에서 다수의 가교-결합 기술과 함께 개시한다.
b. 교차-반응성 항체와 에피토프
본원 발명에는 본원에 개시된 항체와 동일한 항원 및/또는 에피토프, 다시 말하면 CD26 항원에 결합하는 다른 항-CD26 항체-기초한 조성물, 예를 들면 항체 공액체와 면역독신이 포함된다. 이런 항체는 다클론형이나 단클론형일 수 있는데, 이중 단클론형이 선호된다.
본원 발명의 항체와 실질적으로 동일한 방식으로 암 항원이나 에피토프, 예를 들면 CD26 항원이나 이의 에피토프에 결합하는 항체의 동정은 상당히 단순한 작업이다. 이는 항체 조성물을 평가할 수 있는 다양한 면역학적 스크리닝 분석법중 하나를 이용하여 결정할 수 있다.
가령, 검사 항체가 상이한 동물로부터 수득되거나 상이한 아이소타입인 경우에 단순한 경쟁 분석이 이용될 수 있는데, 여기서 대조와 검사 항체는 사전혼합하고, 이후 항원 조성물에 적용한다. "항원 조성물"은 본원에서 밝힌 바와 같이 CD26 또는 관련된 암 항원을 보유하는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, ELISA와 웨스턴 블랏팅에 기초한 프로토콜이 이런 단순한 경쟁 연구에 적합하다.
이런 구체예에서, 대조 항체는 다양한 함량(1:1, 1:10, 1:100)의 검사 항체와 일정 기간동안 사전-혼합하고, 이후 항원 조성물, 예를 들면 ELISA 플레이트의 항원-코팅된 벽 또는 막에 흡수된 항원(점 블랏과 웨스턴 블랏에서처럼)에 적용한다. 종이나 아이소타입 2차 항체를 이용하여, 결합된 대조 항체만 탐지할 수 있는데, 이런 결합은 동일한 에피토프/항원을 인식하는 검사 항체의 존재로 인해 감소된다.
대조 항체, 예를 들면 항-CD 항체 및 임의의 검사 항체 사이의 항체 경쟁 분석을 실시하는 경우에, 후속 동정을 가능하게 하는 탐지가능한 라벨, 예를 들면 비오틴 또는 효소, 방사성 혹은 형광 라벨로 대조를 먼저 표지할 수 있다. 이런 경우에, 표지된 대조 항체를 검사 항체와 함께 다양한 비율(예, 1:1, 1:10, 1:100)로 배양하고 적당한 시간이후에, 표지된 대조 항체의 반응성을 분석하고 잠재적으로 경쟁하는 검사 항체가 배양에 포함되지 않았던 대조값과 이를 비교한다.
분석은 항체 혼성화에 기초한 면역학적 분석중 한가지이고, 대조 항체는 라벨을 탐지하는 수단으로, 예를 들면 비오틴화된 항체의 경우에 스트렙타비딘을 이용하거나, 효소 라벨과 연관된 색소생성 기질을 이용하거나 또는 방상성이나 형광 라벨을 단순히 탐지함으로써 탐지될 수 있다. 대조 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 결합에 효과적으로 경쟁할 수 있고, 따라서 대조 항체 결합을 현저하게 감소시키는데, 이는 결합된 라벨의 감소로 입증된다.
임의 검사 항체의 부재하에 표지된 대조 항체의 반응성은 높은 대조값이다. 낮은 대조값은 표지된 항체를 동일 종류의 표지되지 않은 항체와 함께 배양하여 경쟁이 진행되고 표지된 항체의 결합이 감소하는 경우에 얻어진다. 검사 항체의 존재하에 표지된 항체 반응성에서 현저한 감소는 동일 에피토프를 인식하는 검사 항체, 다시 말하면 표지된 항체와 "교차-반응"하는 검사 항체를 나타낸다. 현저한 감소는 연장가능하다, 다시 말하면 결합에서 감소가 지속적으로 관찰된다.
c. 항체 공액체
다른 작용제, 예를 들면 치료요법제, 탐지가능한 라벨, 세포독성제, 화학약품, 독소, 효소 저해물질, 제약학적 작용제 등에 결합된 CD26 항체를 포함하는 항체 공액체는 본원 발명의 다른 측면을 형성한다. 진단적 항체 공액체는 다양한 면역분석과 같은 시험관내 진단 및 영상 기술과 같은 생체내 진단 모두에 사용될 수 있다.
특정 항체 공액체에는 일차적으로 시험관내 용도로 계획된 항체 공액체가 포함되는데, 여기서 항체는 색소생성(chromogenic) 기질과의 접촉직후 유색 산물을 발생시키는 2차 결합 리간드 또는 효소(효소 태그)에 결합된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼린 포스파타제, (양고추냉이)수소 과산화효소, 글루코오스 옥시다제이다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘이나 스트렙타비딘 화합물이다. 이런 라벨의 사용은 당업자에게 공지되어 있으며 예로써 U.S. 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 4,366,241에서 기술한다.
기능적으로 실용되는 다른 항체 공액체에는 항체가 효소 저해물질, 예를 들면 아데노신 디아미나제 저해물질 또는 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ 저해물질에 공액된 항체 공액체가 포함된다.
(i) 방사성표지된 항체 공액체
뇌암, 갑상선암, 유방암, 위암, 결장암, 췌장암, 신장암, 난소암, 폐암, 전립선암, 간암, 폐암 또는 개별적인 전이의 영상을 제공하는 생체내 진단제로 항체-기초한 분자를 이용하는 경우에, 자기 공명 영상, X-레이 영상, 컴퓨터 방출 단층 촬영 등과 같은 기술이 이용될 수 있다. 본원 발명의 항체-영상 구조물에 사용되는 항체 부분은 일반적으로 암 마커, 예를 들면 CD26 항원에 결합하고, 영상제는 영상진단직후에 탐지가능한 작용제, 예를 들면 상자성, 방사성 또는 형광 작용제이다.
많은 적합한 영상제 및 항체에 이들을 부착하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(참고: U.S. Patent 5,021,236과 4,472,509). 특정 부착 방법은 예로써 항체에 부착된 DTPA와 같은 유기 킬레이트화제를 이용한 금속 킬레이트 복합체의 사용을 필요로 한다(U.S. Patent 4,472,509). mAb는 결합제, 예를 들면 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트의 존재하에 효소와도 반응할 수 있다. 플루레신 마커와의 공액체는 이들 결합제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응으로 얻는다.
상자성 이온의 경우에, 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나듐(Ⅱ), 테르븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ), 에르븀(Ⅲ)을 예로 들 수 있는데, 가돌리늄이 특히 바람직하다.
X-레이 영상진단과 같은 다른 환경에 유용한 이온에는 란타늄(Ⅲ), 금(Ⅲ), 납(Ⅱ), 특히 비스무트(Ⅲ)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
치료 및/또는 진단 용도의 방사성 동위원소의 경우에, 아스타틴211,14탄소,51크롬,36염소,57코발트,58코발트, 구리67,152Eu, 갈륨67,3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111,59철,32인, 레늄186, 레늄188,75셀레늄,35황,테크니슘99m, 이트륨90을 예로 들 수 있다.125I는 특정 구체예에서 사용이 바람직하고, 테크니슘99m과 인듐111역시 낮은 에너지 및 긴 범위 탐지에 적합성으로 인해 선호된다.
본원 발명의 방사성표지된 mAb는 당분야에 공지된 방법에 따라 만들 수 있다. 가령, mAb는 나트륨이나 요오드화칼슘 및 화학적 산화제, 예를 들면 하이포아염소산나트륨 또는 효소적 산화제, 예를 들면 락토과산화효소와 접촉시켜 요오드화시킬 수 있다. 본원 발명에 따른 mAb는 리간드 교환 과정, 예를 들면 2주석 용액으로 퍼테크네이트(pertechnate)를 환원시키고 환원된 테크네튬을 Sephadex 칼럼에 킬레이트화시키고 항체를 상기 칼럼에 적용하여, 또는 직접적인 라벨링 기술, 예를 들면 퍼테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼슘 프탈레이트 용액과 같은 완충액, 항체를 배양함으로써 테크네튬-99m으로 표지할 수 있다.
금속 이온으로 존재하는 방사성동위원소를 항체에 결합시키는데 종종 사용되는 중간 기능성 작용기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)과 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
형광 라벨에는 로다민, 플루레신 이소티오시아네이트, 레노그라핀이 포함된다.
(ii) 면역독소
본원 발명은 암 마커, 예를 들면 CD26 항원에 결합하는 항체가 세포독성제에연결된 면역독소를 제시한다. 면역독소 기술은 상당히 진보되었고 당업자에게 공지되어 있다. 면역독소는 항체 구성요소가 세포를 죽이거나 또는 이의 성장이나 세포 분열을 억제하는 능력을 가진 다른 작용제, 특히 세포독성이나 항세포 작용제에 연결된다.
본원에서 "독소"와 "독소 부분"은 이런 죽임이나 억제 특성을 갖는 세포독성이나 항세포 작용제를 의미한다. 따라서, 독소는 항체에 공액되고 세포에 활성 형태로 전달될 수 있는 약리학적 작용제인데, 여기서 이들은 현저한 유독한 효과를 발휘한다.
일반적으로, 면역독소의 제조는 당분야에 공지되어 있다(참조: U.S. Patent 4,340,535). 전형적으로, IgG 기초한 면역독소는 Fab' 대응물보다 좀더 우수한 결합 능력 및 좀더 느린 혈액 제거율을 보이는 반면, Fab' 단편-기초한 면역독소는 IgG 기초한 면역독소와 비교하여 좀더 우수한 조직 침투 능력을 보인다.
전형적인 항세포 작용제에는 화학치료제, 방사성동위원소, 세포독소가 포함된다. 화학치료제의 예는 스테로이드와 같은 호르몬; 시토신 아라비노시드, 플루오르우라실, 메토트렉세이트 또는 아미노프테린과 같은 항대사물질; 안트라사이클린; 미토마이신 C; 빈카 알칼로이드; 데메콜신; 에토포시드; 미트라마이신; 또는 클로람부실이나 멜팔란과 같은 알킬화제이다.
바람직한 면역독소는 식물-, 진균- 또는 박테리아-유래된 독소, 예를 들면 A 사슬 독소, 리보솜 불활화 단백질, α-사크린, 아스페르길린, 레스티릭토신, 리보뉴클레아제, 디프테리아 독소 또는 슈도모나스(Pseudomnas) 엑소톡소 등이다. 독소-항체 구조물의 사용 및 항체에 이의 부착은 면역독소 분야에 공지되어 있다. 물론, 다양한 독소의 혼합물 역시 항체 분자에 결합될 수 있고, 따라서 가변적인 또는 강화된 세포독성을 도모할 수 있다.
항체에 부착되는 한가지 유형의 독소는 리신인데, 탈글리코실화된 리신 A 사슬이 특히 선호된다. 본원에서 "리신"은 자연 공급원으로부터 및 재조합 수단으로 만들어진 리신을 의미한다. 리신 분자의 다양한'재조합'또는'유전자 조작된'형태는 당업자에게 공지되어 있으며 본원 발명에 따라 사용될 수 있다.
탈글리코실화된 리신 A 사슬(dgA)은 최대 효과, 긴 반감기, 임상적 등급과 규모로 경제적인 제조 가능성으로 인하여 선호된다. Nagarase(Sigma)에 의해 30개 N-말단 아미노산이 제거된 절두된 리신 A 사슬 역시 사용될 수 있다.
항체에 하나이상 독소 부분의 연결 또는 결합은 다양한 기전, 예를 들면 공유 결합, 친화성 결합, 삽입(inercalation), 배위 결합, 착화과정으로 달성할 수 있다. 바람직한 결합 방법은 예로써 화학적 가교-결합체, 자연 펩티드 또는 이황화 결합을 이용한 공유 결합을 수반하는 결합 방법이다.
공유 결합은 기존 측쇄의 직접적인 응축 또는 외부 가교 분자의 통합으로 달성할 수 있다. 많은 2가와 다가 작용제가 단백질 분자를 다른 단백질, 펩티드 또는 아민 작용기에 결합시키는데 유용하다. 결합제의 예는 카보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데하이드, 디아조벤젠, 헥사메틸렌 디아민이다. 이런 리스트는 당분야에 공지된 다양한 결합제 전체가 아닌 일반적으로 사용되는 결합제의 전형일 뿐이다.
바람직한 구체예에서, 항체를 먼저 유도하고, 이후 독소 구성요소를 이런 유도된 산물에 부착시킬 수 있다. 본원에서 "유도한다(derivatize)"는 적절한 가교-결합제로 항체 기질을 화학적으로 변형한다는 것을 의미한다. 이런 방식으로 사용되는 가교-결합제의 예는 이황화-결합 보유 링커 SPDP(N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)와 SMPT(4-숙시니미딜-옥시카르보닐-α-메틸-α(2-피리딜디티오)톨루엔) 등이다.
독소 부분이 표적-세포에 진입한 이후에 항체로부터 방출될 수 있어야 하기 때문에, 생물학적으로 방출가능한 결합은 임상적 활성 면역독소의 구현에 특히 중요하다.
시스테인과 같은 아미노산에 포함되거나 개별 단백질 구조로 도입된 설피드릴기 사이의 직적접인 이황화 결합 형성 및 가용하거나 계획된 링커 부분을 이용한 이황화 결합을 비롯한 다양한 종류의 결합 구조물이 공지되어 있다.
다양한 종류의 이황화-결합 보유 링커가 공지되어 있으며 이들은 독소 부분을 항체에 공액하는데 성공적으로 사용될 수 있는데, 특정 링커, 예를 들면 입체적으로 감춰진 이황화 결합 링커는 생체내에서 안정성이 높고 작용 부위에서 결합이전에 독소 부분의 방출을 예방하기 때문에 선호된다. 특히 바람직한 가교-결합제는 SMPT이지만, SATA, SPDP, 2-이미노티올란과 같은 다른 링커 역시 사용될 수 있다.
일단 공액이 완결되면, 공액체를 정제하여 공액되지 않은 A 사슬이나 항체와 같은 오염물질을 제거하는 것이 중요하다. 증가된 독성 가능성으로 인하여 공액되지 않은 A 사슬을 제거하는 것이 중요하다. 게다가, 공액된 화학종과 공액되지 않은 화학종 사이에서 항원에 대한 경쟁 가능성을 피하기 위하여 공액되지 않은 항체를 제거하는 것이 중요하다. 어떤 경우든, 다양한 정제 기술이 임상적으로 유용할 만큼 충분한 순도의 공액체를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
일반적으로, 가장 바람직한 기술은 Blue-Sepharose의 사용을 겔 여과 또는 겔 침투 단계와 통합하는 것이다. Blue-Sepharose는 Cibacron Blue 3GA와 아가로즈로 구성되는 칼럼 매트릭스인데, 면역공액체의 정제에 유용한 것으로 밝혀졌다. Blue-Sepharose의 사용은 이온 교환 특성을 A 사슬 결합과 통합시켜, 공액되지 않은 결합으로부터 공액된 결합의 효과적인 분리를 제공한다. Blue-Sepharose는 공액체 제형으로부터 유리(공액되지 않은) 항체의 제거가 가능한다. 유리(공액되지 않은) 독소(예, dgA)를 제거하기 위하여, 통상적인 겔 여과 과정 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 분자 배제 크로마토그래피 단계를 이용할 수 있다.
충분히 정제된 공액체를 만든 이후에, 이를 장관외 투여되는 제약학적 조성물로 만들 수 있다. 이는 최종 정제 단계동안 적절한 제약학적 조성물을 함유하는 매체를 이용하여 달성할 수 있다. 이런 제제는 부형제, 안정제 등과 함께 제약학적 완충액을 전형적으로 함유한다. 제약학적으로 수용가능한 조성물은 무균이고 비-면역원성이며 비-발열성이다. 이런 제조의 자세한 내용은 당분야에 공지되어 있으며 본원에서 구체적으로 기술한다. 엔도톡신 오염은 안전한 수준, 예를 들면 0.5 ng/㎎ 단백질 미만으로 최소로 유지시켜야 한다.
일반적으로, 본원 발명에 따른 적합한 제약학적 조성물은 제약학적으로 수용가능한 희석제나 부형제, 예를 들면 무균 수용액과 대략 10 내지 100 ㎎의 소요 공액체를 혼합하여 공액체의 측면에서 대략 0.25 내지 2.5 ㎎/㎖의 최종 농도를 보유한다.
전술한 바와 같이, 본원 발명의 암 마커 항체는 하나이상의 화학치료제, 예를 들면 항-종양제, 사이토킨, 항대사물질, 알킬화제, 호르몬, 핵산 등에 연결될 수 있고, 따라서 이들은 항체 공액체를 이용하여 CD26 항원 발현 암 세포를 표적할 수 있다. 비-항체 공액된 대응물과 비교하여 항체-공액된 작용제의 이점은 항체에 의해 제공된 상승된 선택성이다.
항체에 공액될 수 있는 화학치료제와 약리학적 작용제를 분석하는 경우에, 항체에 성공적으로 공액되고 약리학적으로 작용하는 것으로 확인된 작용제를 특히 고려해 볼 수 있다. 현재 사용되고 있는 전형적인 항신생물제는 독소루비신, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴 등이다. 게다가, 다른 작용제, 예를 들면 네오카르지노스타틴, 마크로마이신, 트레니몬, α-아마니틴의 부착 역시 기술되었다. 조직으로 특이적인 전달을 위하여 항체에 제약학적 작용제를 부착하는 기술이 확립되어 있다는 점에서, 본원에 제시된 적합한 작용제의 리스트는 단순히 전형적인 실례일 뿐이다.
따라서, 항체의 아미노산이나 탄수화물 작용기에 결합이나 가교-결합에 가용한 일차나 이차 아민, 하이드라지드나 하이드라진, 카르복실 알코올, 포스페이트 또는 알킬화기를 갖는 임의의 약리학적 작용제를 항체에 공액하는 것이 가능하다. 단백질 구조의 경우에, 이는 면역독소에서 전술한 바와 같은 가교-결합제로 용이하게 달성된다. 부착 역시 약물과 항체 사이의 산 불안정성 아실 하이드라존이나cis아코니틸 결합으로, 또는 약물의 γ-카르복실기와 항체의 아미노산 사이에 L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala과 같은 펩티드 스페이서를 이용하여 달성할 수 있다.
E. 면역학적 탐지
a. 면역분석
항-CD26 치료 항체는 암의 탐지 및 분석과 관련된 다양한 진단과 예후에도 유용하다. 한 구체예에서, 본원 발명은 생물학적 구성요소를 결합시키거나 정제하거나 동정하거나 제거하거나 정량하거나 또는 전반적으로 탐지하는 면역탐지 방법을 계획한다. 따라서, 예로써 본원 발명의 항-CD26 항체 요법을 면역탐지와 병행하여, CD26 발현 암세포의 수치 감소로 반영되는 치료 효능의 예지 또는 진단을 달성할 수 있다.
다수의 유용한 면역탐지 방법의 단계는 선행 과학문헌, 예를 들면 Nakamura et al. (1987)에서 기술되었다. 가장 단순하고 직접적인 의미에서 면역분석은 결합분석이다. 바람직한 면역분석은 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 면역비드 포착 분석이다. 조직 절편을 이용한 면역조직화학적 탐지 역시 특히 유용하다. 하지만, 탐지는 이런 기술에 국한되지 않으며, 웨스턴 블랏팅, 점 블랏팅, FACS 분석 등도 본원에서 이용될 수 있다.
일반적으로, 면역결합 방법은 단백질, 펩티드 또는 항체를 보유한 것으로 의심되는 시료를 수득하고, 면역복합체의 형성에 효과적인 조건하에 이 시료를 본원 발명에 따른 항체, 단백질 또는 펩티드와 접촉시키는 단계로 구성된다.
본원 발명의 면역결합 방법에는 시료에서 반응성 구성요소를 탐지하거나 이의 함량을 정량하는 방법이 포함되는데, 이런 방법은 결합 과정동안 형성된 임의 면역 복합체를 탐지하거나 정량하는 단계로 구성된다. 본원에서는 CD26 항원 또는 관련된 암 마커 단백질, 펩티드 혹은 상응하는 항체를 보유한 것으로 의심되는 시료를 수득하고, 이 시료를 항체 또는 인코드된 단백질이나 펩티드와 접촉시키며, 특정 조건하에 형성된 면역 복합체를 탐지하거나 이의 함량을 정량한다.
항원 탐지의 측면에서, 생물학적 분석 시료는 암-특이적 항원, 예를 들면 유방, 위, 결장, 췌장, 신장, 난소, 폐, 전립선, 간, 폐, 림프절 또는 골수 조직 절편이나 시료의 T-세포암, 흑색종, 교모세포종, 암종과 같은 CD26 항원을 보유한 것으로 의심되는 임의의 시료; 균일화된 조직 추출물; 분리된 세포; 세포막 조직 표본; 상기 단백질-보유 조성물중 한가지의 분리되거나 정제된 형태; 또는 혈액, 림프액, 정액, 소변을 비롯한 암 조직과 접촉하는 임의의 생물학적 유체이다.
면역복합체(1차 면역복합체)의 형성이 가능한 조건하에 충분한 시간동안 선택된 생물학적 시료를 단백질, 펩티드 또는 항체와 접촉시키는 단계는 조성물을 시료에 단순히 첨가하고 항체가 CD26 항원과 같은 임의의 항원과 면역 복합체를 형성할 수 있을 만큼 충분히 긴 시간동안 혼합물을 배양하여 달성한다. 이후, 시료-항체 조성물, 예를 들면 조직 절편, ELISA 플레이트, 점 블랏 또는 웨스턴 블랏은 전체적으로 세척하여 비-특이적으로 결합한 임의의 항체 종을 제거하고 1차 면역 복합체내에 특이적으로 결합된 항체만 탐지될 수 있도록 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 탐지는 당분야에 공지되어 있으며 다양한 방식의 활용으로 달성할 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 라벨이나 마커, 예를 들면 당분야에서 표준으로 사용되는 방사성, 형광, 생물학적 또는 효소 태그나 라벨의 탐지에 기초한다. 이런 라벨의 사용과 관련된 참고문헌은 U.S. Patent 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149, 4,366,241 등이다. 물론, 당분야에 공지된 바와 같이 2차 항체 또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 장치를 사용하여 추가적인 이점을 발견할 수 있다.
탐지에 사용되는 인코드된 단백질이나 펩티드 또는 상응하는 항체는 자체적으로 탐지가능한 라벨에 결합될 수 있는데, 여기서 이런 라벨을 탐지하여 조성물에서 1차 면역 복합체의 함량을 측정할 수 있다.
대안으로, 1차 면역 복합체내에 결합된 처음 첨가된 구성요소는 인코드된 단백질이나 펩티드 또는 상응하는 항체에 결합 친화성을 갖는 2차 결합 리간드로 탐지할 수 있다. 이런 경우에, 2차 결합 리간드는 탐지가능한 라벨에 결합될 수 있다. 종종 2차 결합 리간드는 자체가 항체인데, 따라서 "2차"항체가 된다. 1차 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성이 가능한 조건하에 충분한 시간동안, 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 이후, 2차 면역 복합체는 전체적으로 세척하여 비-특이적으로 결합한 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하고 2차 면역 복합체내에 남아있는 라벨을 탐지한다.
추가적인 방법에는 2단계 방식에 의한 1차 면역 복합체의 탐지가 포함된다. 인코드된 단백질이나 펩티드 또는 상응하는 항체에 결합 친화성을 갖는 2차 결합 리간드, 예를 들면 항체를 사용하여, 전술한 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성한다. 세척이후, 2차 면역 복합체는 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성이 가능한 조건하에 충분한 시간동안, 2차 항체에 결합 친화성을 갖는 3차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 3차 리간드 또는 항체는 탐지가능한 라벨에 결합시켜, 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 탐지를 가능하게 한다. 이런 시스템은 원하는 경우에, 신호 증폭을 제공할 수 있다.
본원 발명의 면역탐지 방법은 암의 진단에 분명한 실용성을 갖는다. 본원에서, 인코드된 단백질이나 펩티드 또는 상응하는 항체를 보유한 것으로 의심되는 생물학적 또는 임상적 시료가 사용된다. 하지만, 이들 구체예는 비-임상적 시료에 대한 용도, 예를 들면 항원이나 항체 시료의 적정, 하이브리도마의 선별 등에도 활용될 수 있다.
(i) ELISA
앞서 밝힌 바와 같이, ELISA와 같은 면역탐지 기술은 임상 시료에서 CD26 존재의 탐지와 병행함으로써 항-CD26 항체 치료의 필요성을 결정할 수 있다. 대안으로, 암 세포가 CD26을 발현하도록 유도하여 본원에 제시된 치료를 가능하게 하는 구체예에서 이런 기술을 이용할 수 있다.
한 전형적인 ELISA에서, 본원 발명의 인코드된 단백질에 결합하는 항체는 단백질 친화성을 보이는 선택된 표면, 예를 들면 폴리스티렌 마이크로역가 평판의 벽에 고정시킨다. 이후, CD26 항원과 같은 암 질환 마커 항원을 보유하는 것으로 의심되는 검사 조성물, 예를 들면 임상 시료를 웰에 첨가한다. 결합 및 비-특이적으로 결합한 면역복합체를 제거하는 세척이후, 결합된 항원을 탐지할 수 있다.
탐지는 표적 단백질에 특이적이고 탐지가능한 라벨이 결합된 2차 항원의 첨가로 달성한다. 이런 유형의 ELISA는 "샌드위치 ELISA"라고 한다. 탐지는 2차 항원의 첨가 및 이후 2차 항원에 결합 친화성을 갖고 탐지가능한 라벨에 결합된 3차 항원의 첨가로 달성할 수도 있다.
다른 전형적인 ELISA에서, CD26 항원을 보유하는 것으로 의심되는 시료는 벽 표면에 고정시키고, 이후 본원 발명의 항체와 접촉시킨다. 결합 및 비-특이적으로 결합한 면역복합체를 제거하는 세척이후, 결합된 항체를 탐지한다. 최초 항체가 탐지가능한 라벨에 결합하면, 면역복합체를 직접 탐지할 수 있다. 면역 복합체는 1차 항체에 결합 친화성을 갖고 탐지가능한 라벨에 결합된 2차 항원을 사용하여 탐지할 수도 있다.
CD26 항원과 같은 단백질이나 펩티드가 고정되는 다른 ELISA에서는 탐지에 항체 경쟁을 이용한다. 이런 ELISA에서, 표지된 항체는 웰에 첨가되고 CD26 항원에 결합하며 라벨에 의해 탐지된다. 이후, 미지의 시료에서 마커 항원의 함량은 코팅된 웰과의 배양이전에 또는 배양동안, 시료를 표지된 항체와 혼합하여 측정한다. 시료에서 마커 항원의 존재는 웰과의 결합에 가용한 항체의 함량을 감소시키고, 따라서 궁극적인 신호를 감소시키는 역할을 한다. 이는 미지의 시료에서 항원을 탐지하는데 적합한데, 여기서 표지되지 않은 항체 역시 항원-코팅된 벽에 결합하여 표지된 항체에 결합할 수 있는 항원의 함량을 감소시킨다.
이용된 형태에 상관없이, ELISA는 일정한 특징, 예를 들면 코팅, 배양이나 결합, 비-특이적으로 결합한 화학종을 제거하는 세척, 결합된 면역복합체 탐지를공통적으로 보유한다. 이들은 다음과 같이 기술된다:
플레이트를 항원이나 항체로 코팅하는 경우에, 일반적으로 하룻밤동안 또는 특정한 시간동안 플레이트의 벽을 항원이나 항체의 용액과 함께 배양한다. 이후, 플레이트의 벽은 세척하여 불완전하게 흡수된 물질을 제거한다. 그 다음, 웰의 나머지 가용한 표면은 검사 항혈청과 관련하여 항원 측면에서 중성인 비-특이적 단백질로 "코팅"한다. 여기에는 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 분유 용액이 포함된다. 코팅은 고정면(immobilizing surface)에서 비-특이적 흡수 부위를 차단하고, 따라서 표면에 항혈청의 비-특이적 결합으로 인한 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 과정보다는 2차나 3차 탐지 수단을 이용하는 것이 좀더 일반적이다. 따라서, 웰에 단백질이나 항체의 결합, 배경을 줄이기 위한 비-반응성 물질로 코팅 및 결합하지 않은 물질을 제거하는 세척단계 이후, 고정면은 면역복합체(항원/항체) 형성에 효과적인 조건하에 대조 인체 암 및/또는 임상적 혹은 생물학적 검사 시료로 코팅한다. 그 다음, 면역복합체의 탐지는 표지된 2차 결합 리간드나 항체, 또는 2차 결합 리간드나 항체 및 표지된 3차 결합 리간드나 항체를 요구한다.
"면역복합체(항원/항체) 형성에 효과적인 조건하에"는 이런 조건에 BSA, 소 감마 글로불린(BGG), 인산완충액(PBS)/Tween과 같은 용액으로 항원과 항체를 희석하는 단계가 포함된다는 것을 의미한다. 이들 첨가된 작용제는 비-특이적 배경의 감소를 보조한다.
또한,"적합한"조건은 효과적인 결합을 가능하게 하는 충분한 온도와 기간동안 배양이 진행된다는 것을 의미한다. 전형적으로, 배양 단계는 25℃ 내지 27℃ 온도에서 대략 1시간에서 2시간 내지 4시간동안, 또는 대략 4℃에서 하룻밤동안 진행된다.
ELISA에서 모든 배양단계이후, 접촉면은 세척하여 비-복합된 물질을 제거한다. 바람직한 세척 과정에는 PBS/Tween 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척이 포함된다. 검사 시료 및 최초 결합된 물질 사이에서 특정 면역복합체의 형성 및 후속 세척이후, 소량 면역복합체의 발생도 확인할 수 있다.
탐지 수단을 제공하기 위하여, 2차나 3차 항체는 탐지를 가능하게 하는 라벨을 보유한다. 적절하게는, 이는 적절한 색소생성 기질과의 배양 직후에 발색 현상을 보이는 효소이다. 따라서, 추가적인 면역복합 형성의 진전에 적합한 조건(PBS-Tween과 같은 PBS-함유 용액에서 실온에 2시간 배양)하에 충분한 시간동안 1차나 2차 면역복합체를 우레아제, 글루코오스 옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 수소 과산화효소-공액된 항체와 접촉시키고 배양한다.
표지된 항체와의 배양 및 결합되지 않은 물질을 제거하는 후속 세척이후, 라벨 함량은 예로써 요소와 브로모크레솔 퍼플, 또는 과산화효소가 효소 라벨인 경우에 2,2'-아지도-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산[ABTS]과 H2O2와 같은 색소색성 기질과의 배양으로 정량한다. 이후, 정량은 예로써 가시광선 스펙트럼 분광광도계를 이용하여 발색의 정도를 측정하여 달성한다.
다른 구체예에서, 용액상 경쟁 ELISA 역시 이용된다. 용액상 ELISA는 비드,예를 들면 자성 비드에 CD26 항원의 부착을 수반한다. 이후, 비드는 사람과 동물 기원의 혈청과 함께 배양한다. 특정 상호작용이 진행될 만큼 충분한 배양 기간이후, 비드는 세척한다. 이후, 항체의 특정 종류는 항체 지표 공액체로 탐지한다. 비드는 세척하고 분류한다. 이 복합체는 적절한 장치(공액 부분에 따라 형광, 전계발광, 분광광도)에서 판독한다. 따라서, 항체 결합의 수준을 정량할 수 있는데, 이는 존재하는 신호의 총합과 직접적으로 관련된다.
(ii) 면역조직화학
항-CD26 항체는 면역조직화학(1HC)에 의한 연구로부터 유래된 신선동결되고 포르말린-고정되며 파라핀-포매된 조직 블록과 병용될 수 있다. 가령, 각 조직 블록은 50 ㎎의 잔여"미분(pulverized)"종양으로 구성된다. 이들 특정 시료로부터 조직 블록을 만드는 방법은 예로써 유방에서 다양한 예후 인자의 선행 IHC 연구에서 성공적으로 이용되었으며 당업자에게 공지되어 있다(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간단히 말하면, 동결-절편은 작은 플라스틱 캡슐에 담긴 인산완충액(PBS)에서 실온에 50 ng 동결된"미분"종양을 재수화시키고; 원심분리로 입자를 펠렛하고; 점성 포매 배지(OCT)에 이들을 재현탁시키고; 플라스틱 캡슐을 자르고; 조직의 동결 실린더를 떼어내고; 동결절편박절기(cryostat microtome chuck)에서 조직 실린더를 확보하고; 평균적으로 대략 500개의 현저하게 완전한 종양 세포를 보유하는 25-50개의 연속 절편을 잘라낸다.
영속-절편은 플라스틱 microfuge 튜브에서 50 ㎎ 시료를 재수화시키고; 펠렛하고; 10% 포르말린에서 4시간 고정동안 재현탁시키고; 세척 및 펠렛하고; 따뜻한 2.5% 아가에서 재현탁시키고; 펠렛하고; 얼음물에서 냉각시켜 아가를 경화시키고; 튜브로부터 조직/아가 블록을 떼어내고; 블록을 여과하고 이를 파라핀에 포매시키고; 최대 50개의 연속 영속 절편을 잘라내는 유사한 방법으로 만들 수 있다.
(iii) FACS 분석
형광 활성화된 세포 분류, 유세포 분석법 또는 유세포 마이크로분석법은 개별 세포에서 CD26 항원과 같은 항원의 존재를 자세히 조사하는 수단을 제공한다. 상기 방법에서는 액체 배지에서 표지된 세포를 활성화시키고 이의 여기 방출을 탐지할 수 있는 장치를 이용한다.
FACS는 살아있거나 고정된 세포에 대한 신속하고 신뢰할 수 있으며 정량적인 다중파라미터 분석을 유일하게 제공할 수 있다. 일반적으로, 세포는 생검, 혈액에서 단일 세포 현탁액 또는 배양액으로 얻는다. FACS 분석은 일정한 시간에 다수의 암 항원을 분석해야 하는 경우에, 예를 들면 병 진행동안 항원 프로필을 추적하는 경우에 가장 적합하다.
(iv) 생체내 영상
본원 발명은 항체 공액체를 사용하여 암을 생체내 영상하는 방법을 제시한다. "생체내 영상"은 동물이나 사람 개체의 체내에 위치한 암 세포에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 또는 이의 단편의 탐지가 가능한 비-침입성 방법을 의미한다.
일반적으로, 영상 방법은 탐지가능하게 표지된 암-특이적 항체 또는 이의 단편(제약학적으로 효과적인 담체에서), 예를 들면 항-CD26 항체의 영상-효과량을 동물이나 개체에 투여하고, 이후 암성 조직에 대한 표지된 항체의 결합을 탐지하는 단계로 구성된다. 적절하게는, 탐지가능한 라벨은 비-침입성 방법으로 탐지되는 스핀-표지된 분자 또는 방사성동위원소이다.
"영상 효과량"은 투여된 이후에 암 조직에 항체나 단편 결합의 탐지를 가능하게 하는 탐지가능하게 표지된 항체 또는 이의 단편의 일정량을 의미한다. 항체-마커 공액체의 효과량은 환자의 조직내에 존재하는 반응성 항원과 충분한 시간동안 접촉시키고, 이후 탐지가능한 마커를 동정하는 탐지 장치에 환자를 노출시킨다.
따라서, 영상용 항체 공액체 또는 구조물은 자기 공명 영상, x-레이 영상, 컴퓨터 방출 단층 촬영 등을 통하여 종양의 영상을 제공할 수 있다. 자기 공명 영상("MRI")에 특히 유용한 원소에는 핵 자성 스핀-공명 동위원소157Gd,55Mn,162Dy,52Cr,56Fe가 포함되는데, 이들 중에서 가돌리늄이 선호된다. 감마 신틸레이션 카메라나 탐지기로 탐지될 수 있는 방사성 물질, 예를 들면 테크니슘99m또는 인듐111역시 사용될 수 있다. 본원 발명에 사용하기 적합한 금속 이온의 다른 실례는123I,131I,131I,97Ru,67Cu,67Ga,125I,68Ga,72As,89Zr,201T1이다.
생체내 진단을 위한 방사성핵종을 선택하는데 있어 고려해야 하는 인자는 방사성핵종의 반감기가 표적에 의한 최대 흡수의 시점에서 탐지될 수 있을 만큼 길면서도 숙주에 대한 유해 방사선이 최소화될 만큼 짧아야 한다는 점이다. 이상적으로, 생체내 영상에 사용되는 방사성핵종은 분진(particulate emission)이 없지만, 통상적인 감마 카메라에 의해 쉽게 탐지되는 140-2000 keV 범위에서 다량의 광자를 생산한다.
방사성핵종은 중간 작용기를 이용하여 직접적으로 또는 간접적으로 항체에 결합할 수 있다. 금속 이온으로 존재하는 방사성동위원소를 항체에 결합시키는데 자주 사용되는 중간 작용기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)과 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
표지된 항체의 투여는 국소적 또는 전신적 투여이고 정맥내, 동맥내, 척수액 경류 등으로 달성된다. 투여는 검사중인 신체 부위에 따라 피내 또는 강내로 달성된다. 표지된 항체나 이의 단편이 병든 조직(본원에서 암 조직)에 결합할 수 있을 만큼 충분한 시간, 예를 들면 30분 내지 48시간이 경과한 이후에, 개체의 검사 부위를 영상 기술로 진찰한다. MRI, SPECT, 2차원 신틸레이션 영상, 다른 최근에 만들어진 영상 기술 역시 이용될 수 있다.
결합된 방사성동위원소의 분포 및 시간의 추이에 따른 증가나 감소를 모니터하고 기록한다. 임상적으로 정상인 개체의 연구로부터 얻은 데이터와 상기 결과를 비교하여, 병든 조직의 존재와 정도를 결정할 수 있다.
정확한 영상 프로토콜은 환자에 특이적인 인자, 검사중인 신체 부위, 투여 방법, 사용된 라벨 종류 등에 따라 달라진다. 하지만, 특정 과정의 결정은 당업자에게 일상의 과정이다. 영상 구체예의 용량이 환자의 연령과 체중에 좌우되긴 하지만, 환자당 대략 0.1 내지 20 ㎎, 바람직하게는 대략 1.0 내지 2.0 ㎎의 항체-공액체 1회 분량이 유용하다.
F. 병용 요법
본원 발명에 따른 항-CD26 항체 치료의 효능을 증가시키기 위하여, 병용 요법을 계획한다. 따라서, 항-CD26 항체 기초한 요법에 더하여 제 2 치료제가 사용될 수 있다. 제 2 치료제는 화학치료제, 방사선치료제, 유전자치료제, 단백질/펩티드/폴리펩티드 치료제, 다른 면역치료제 등이다. 이런 작용제는 당분야에 공지되어 있다.
본원 발명으로 치료될 수 있은 암은 B-세포 만성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, 림프아세포성 림프종, 급성 림프아세포성 백혈병, T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 혈관중심성 T-세포 림프종, HTLV-관련된 T-세포 백혈병 또는 성인 T-세포 백혈병, 혈액암, 골수성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 골수아세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프아세포성 백혈병, 모발상 세포 백혈병을 비롯한 혈액학적 악성종양이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 치료될 수 있는 고형 세포 종양과 암은 뇌(교모세포종, 속질모세포종, 성상세포종, 희돌기아교세포종, 뇌질피복세포종), 폐, 간, 비장, 신장, 림프절, 소장, 췌장, 결장, 위, 유방, 뼈, 내분비선, 자궁내막, 전립선, 고환, 흉선, 난소, 피부, 두경부, 식도의 종양 등이다.
"효과량"은 암 세포의 성장을 감소, 저해 또는 소멸시키거나, 세포 성장을 억제하거나, 아폽토시스를 유도하거나, 전이를 저해하거나, 종양 괴사를 유도하거나, 세포를 죽이거나 또는 세포에서 세포독성을 유도하는 작용제의 일정량으로 정의된다.
제 2 치료제의 투여는 수분에서 수일 내지 수주의 간격으로 항-CD26 항체를 선행하거나 후행한다. 제 2 치료제와 항-CD26 항체가 함께 투여되는 구체예에서, 각 전달 시간 사이에 현저한 시간이 경과하지 않도록 담보한다. 이런 경우에, 서로간에 대략 12-24시간, 바람직하게는 6-12시간 이내로 양 성분을 환자에 투여한다. 하지만, 일부 상황에서는 치료 기간을 현저하게 늘리는 것이 바람직할 수 있는데, 이런 경우에는 개별 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과하게 된다.
완전 암 치료를 달성하기 위하여 제 2 치료제와 항-CD26 항체중 적어도 하나는 투여되어야 한다. 다양한 조합이 가능한데, 제 2 치료제는"A"이고 항-CD26 항체는"B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
다른 조합 역시 가능하다. 각 작용제의 정확한 용량과 섭생은 당업자에 의해 적절히 변경될 수 있다.
하기는 암 치료에 효과적인 일부 다른 작용제의 설명이다.
a) 방사성치료제
방사성치료제와 인자에는 DNA 손상을 유도하는 방사선과 파동, 예를 들면γ-선, X-선, UV-선, 극초단파, 전자파, 방사성동위원소 등이 포함된다. 치료는 전술한 형태의 발광(radiation)을 국소적 종양 부위에 조사하여 달성할 수 있다. 이들 인자들 모두 DNA, DNA 전구물질, DNA의 복제와 복구, 크로모좀의 조립과 유지에 광범위한 손상을 입힐 가능성이 매우 높다.
X-선의 선량 범위는 장기간(3 내지 4주)동안 50 내지 200 뢴트겐의 일일 분량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 분량이다. 방사성동위원소의 선량 범위는 상당히 변화되고, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도와 유형, 신생물 세포에 의한 흡수에 의해 좌우된다.
b) 수술
대략 60%의 암 환자는 특정 유형의 수술을 받게 되는데, 여기에는 예방적, 진단적, 치료적, 증세 완화적 수술이 포함된다. 치료적 수술은 다른 요법, 예를 들면 본원 발명에 따른 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법, 유전자요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 병용될 수 있는 암 치료이다.
치료적 수술에는 암 조직의 일부 또는 전부를 물리적으로 제거하거나, 절개하거나 또는 파괴하는 절제술이 포함된다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 의미한다. 종양 절제술 이외에, 수술에 의한 치료에는 레이저 수술, 냉동 외과술, 전기수술, 현미경 조절 수술(Mohs 수술)이 포함된다. 본원 발명은 표재성 암, 전암, 또는 정상 조직 잔량의 제거와도 병용될 수 있다.
모든 암 세포, 조직 또는 종양의 부분적인 절개 직후에, 체내에 구멍이 생길 수 있다. 치료는 상기 부위에 추가적인 항암 약물의 관류, 직접 주사 또는 국소적도포로 달성할 수 있다. 이런 치료는 예로써, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일마다, 매 1, 2, 3, 4, 5주마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월마다 반복할 수 있다. 이들 치료에서 용량이 변할 수도 있다.
c) 화학치료제
DNA를 파괴하는 작용제는 화학치료제이다. 가령, 이들은 DNA에 직접 가교-결합하는 작용제, DNA에 삽입되는 작용제, 핵산 합성에 영향을 주어 크로모좀과 유사분열 이상을 유발하는 작용제일 수 있다. 핵산, 특히 DNA에 직접 가교-결합하는 작용제의 예는 시스플라틴 및 다른 DNA 알킬화제이다. DNA를 파괴하는 작용제에는 DNA 복제, 유사분열, 크로모좀 분리를 간섭하는 화합물이 포함된다.
화학치료제의 일부 예는 독소루비신, 다우노루비신, 미토마이신(무타마이신 및/또는 미토마이신-C), 액티노마이신 D(닥티노마이신), 블레오마이신, 필리코마이신과 같은 항생 화학치료제; 탁솔, 빈크리스틴, 빈브라스틴과 같은 식물 알칼로이드; 시스플라틴, VP16, 종양 괴사인자와 같은 기타 작용제; 카르무스틴, 멜팔란(알케란; L-페닐알라닌 겨자, 페닐알라닌 겨자, L-PAM 또는 L-사르콜리신은 질소 겨자의 페닐알라닌 유도체이다), 사이클로포스파미드, 클로로람부실, 부설판(밀레란), 로무스틴과 같은 알킬화제; 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 캄토테신, 이포스파미드, 니트로스우레아, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 젬시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 전이효소 저해물질, 트랜스플라티늄, 5-플루오르우라실, 메토트렉세이트, 테마졸로미드(DTIC의 수용성 형태)와 같은 다른 작용제; 이들의 유사체나 유도성변이체 등이다.
d) 다른 면역요법
다른 면역치료제가 항-CD26 항체와 병용될 수 있다. 일반적으로, 면역치료는 암 세포를 표적으로 하고 이를 파괴하는 면역 주효체 세포와 분자의 사용에 기초한다. 다른 면역 주효체는 예로써, 종양 세포 표면에서 일부 다른 마커에 특이적인 항체이다. 이런 2차 항체는 자체적으로 치료의 주효체 역할을 하거나 또는 세포 사멸을 실제로 실행하는 다른 세포를 동원할 수 있다. 또한, 이런 2차 항체는 약물이나 독소(화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 공액되어 표적화 작용제 역할만을 할 수도 있다. 대안으로, 주효체는 종양 세포 표적과 직간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 보유하는 림프구일 수도 있다. 다양한 주효체 세포에는 세포독성 T 세포와 NK 세포가 포함된다. 면역요법은 항-CD26 항체-기초한 요법과 함께 병용되는 요법의 일부로서 이용될 수 있다.
병용 요법의 전체적인 방식은 하기에 논한다. 한 측면에서, 면역요법은 종양 세포를 표적하는데 이용될 수 있다. 많은 종양 마커가 존재하는데, 이들은 본원 발명에서 표적화에 적합하다. 일반적인 종양 마커에는 태아성 암 항원, 전립선 특이적 항원, 요로 종양 관련된 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체,erbB, p155가 포함된다. 대안적 면역 자극 분자 역시 존재한다: IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN과 같은 사이토킨; MIP-1, MCP-1, IL-8과 같은 케모킨; FLT3 리간드와 같은 성장 인자. 본원 발명의 항-CD26 항체-기초한 요법과 함께, 단백질로서 면역 촉진 분자를 결합시키거나 또는 유전자 전달을 이용하면 항-종양 효과가 강화된다.
(i) 수동 면역요법
암의 수동 면역요법에는 다양한 방식이 존재한다. 이들은 다음과 같이 넓게 분류될 수 있다: 항체 단독의 주사; 독소나 화학치료제에 결합된 항체의 주사; 방사성동위원소에 결합된 항체의 주사; 항-이디오타입 항체의 주사; 골수에서 종양 세포의 정화(purging).
(ii) 능동 면역요법
능동 면역요법에서, 항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질; 자가 또는 동종 종양세포 조성물; 또는"백신"은 일반적으로, 개별적인 박테리아 어쥬번트와 함께 투여된다(Ravindranath & Morton, 1991; Morton et al., 1993).
(iii) 적응 면역요법
적응 면역요법에서, 환자의 순환 림프구, 또는 종양 침윤된 림프구는 시험관내에서 분리되고, IL-2와 같은 림포카인에 의해 활성화되거나 종양 괴사 유전자에 의해 형질도입되며, 재투여된다(Rosenberg 35 al., 1999; 1989). 이를 달성하기 위하여, 본원에서 밝힌 어쥬번트-혼합된 항원성 펩티드 조성물과 함께, 활성화된 림프구의 면역학적 효과량이 동물이나 사람 환자에 투여된다. 활성화된 림프구로는 혈액이나 종양 시료로부터 분리되고 시험관내에서 활성화된(즉"확장된") 환자의 자체 세포가 가장 바람직하다.
e) 유전자 요법
또 다른 구체예에서, 본원에서 밝힌 항-CD26 항체 요법과 유전자요법의 병행을 계획한다. 다양한 핵산 및 핵산에 의해 인코드되는 단백질이 본원 발명에 포함되는데, 이들중 일부를 하기에 기술한다. 표 1에서는 본원 발명과 병행되는 유전자요법에서 표적화될 수 있는 다양한 유전자를 제시한다.
표 1
f) 다른 작용제
치료 효능을 개선하기 위한 다른 작용제가 본원 발명과 병용될 수 있다. 화학요법과 병행되는 요법의 한가지 형태는 고온치료법(hyperthermia)인데, 이는 환자의 조직이 고온(최대 106℉)에 노출되는 과정이다. 외부와 내부 가열 장치가 국소, 국부 또는 전신 고온치료법의 적용에 이용된다. 국소 고온치료법에서는 작은 부위, 예를 들면 종양에 열을 적용한다. 열은 신체외부의 장치로부터 종양을 표적으로 하는 고주파 파동으로 외부에서 발생될 수 있다. 내부 열은 가는 열선, 온수로 채워진 중공튜브(hollow tube), 이식된 극초단파 안테나, 또는 고주파 전극을 비롯한 무균 프로브를 필요로 한다.
환자의 장기나 손발은 국부 요법으로 가열하는데, 이는 자석과 같이 높은 에너지를 생산하는 장치를 이용하여 달성한다. 대안으로, 환자의 혈액 일부를 뽑아 가열하고, 이후 내적으로 가열된 부위에 관류시킨다. 전신 가열은 암이 몸 전체에 퍼진 경우에 실행될 수 있다. 온수 블랭킷, 초농(hot wax), 유도 코일, 열 쳄버가 이런 목적으로 이용될 수 있다.
호르몬요법 역시 본원 발명과 병행될 수 있다. 호르몬은 특정 호르몬, 예를 들면 테스토스테론이나 에스트로겐의 수준을 낮추거나 또는 이들 호르몬의 효과를 차단하기 위하여 특정 암, 예를 들면 유방암, 전립선암, 난소암, 경부암의 치료에 사용될 수 있는데, 이는 전이 위험을 감소시킨다.
G. 제약학적 조성물
항-CD26 항체 또는 항체 공액체의 효과량을 함유하는 제약학적 조성물은 제약학적으로 수용가능한 담체나 배지에 용해 또는 분산시켜 치료 및/또는 진단 조성물을 만들고, 이후 본원 발명의 방법에 따라 투여할 수 있다.
본원 발명의 치료 항체는 환자 투여용으로 표준 제약학적 담체에 담아 만들 수 있다. 여기에는 염수, 인산완충액 및 다른 수성 담체가 포함되고, 리포좀, 중합성 미포 및 다른 서방 전달 장치가 당분야에 공지되어 있다.
"제약학적으로 또는 약리학적으로 수용가능한 염"은 동물이나 사람에 투여되면 부작용, 알레르기 반응 또는 다른 원치않는 반응을 유발하지 않는 분자 성분(entity) 및/또는 조성물을 의미한다. 본원에서 "제약학적으로 수용가능한 담체"에는 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항박테리아와 항균 작용제, 등장성과 흡수 지연 작용제 등이 포함된다. 제약학적 활성 물질에 이런 매체와 작용제의 이용은 당분야에 공지된 것이다. 임의의 통상적인 매체 또는 작용제는 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물에 이용될 수 있다. 보충 활성 성분 역시 조성물에 혼합될 수 있다.
활성 화합물은 장관외 투여용 제형, 예를 들면 정맥내, 관절내, 수막강내, 근육내, 피하, 병변내 또는 복강내 루트를 통한 주사 제형으로 만들 수 있다. 활성 구성요소나 성분으로 암 마커 항체, 공액체, 저해물질 또는 다른 작용제를 함유하는 수성 조성물의 제조는 본원 발명의 개시에 비추어 당업자에게 자명하다. 전형적으로, 이런 조성물은 액체 용액이나 현탁액의 주사제로 제조될 수 있다; 주사에 앞서 액체를 첨가하여 용액이나 현탁액을 제조하는데 적합한 고체 형태로 만들 수도 있다; 이들 제형은 에멀젼화될 수도 있다.
주사에 적합한 제약학적 형태에는 무균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩 기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 함유하는 제형; 무균 주사용액이나 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말이 포함된다. 모든 경우에, 무균이고 용이하게 주사가능한 정도까지 액체 상태이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건하에 안정해야 하고 미생물, 예를 들면 박테리아와 진균의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다.
유리(free) 염기인 활성 화합물 또는 제약학적으로 수용가능한 염의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에 녹여 제조할 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일에 녹여 제조할 수 있다. 정상적인 저장 및 사용의 조건에서, 이들 제형은 미생물의 성장을 예방하는 방부제를 함유한다.
또한, 중성 또는 염 형태의 조성물을 제조할 수 있다. 제약학적으로 수용가능한 염에는 무기산, 예를 들면 염산 혹은 황산, 또는 유기산, 예를 들면 아세트산, 옥살산, 주석산, 만델산 등으로 생성되는 산 첨가염(단백질의 유리 아미노기로 생성됨)이 포함된다. 유리 카르복실기로 생성된 염은 무기염기, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철 및 유기 염기, 예를 들면 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수도 있다.
담체는 용매 또는 예로써 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 분산 매체; 이들의 적절한 혼합물; 식물성 오일일 수 있다. 적절한 유동성은 레시틴과 같은 코팅의 사용으로, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기의 유지로, 계면활성제의 이용으로 유지할 수 있다.미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아 및 항균 작용제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 치메로잘 등으로 달성할 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 함유하는 것이 바람직하다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수 지연 작용제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.
무균 주사가능 용액은 전술한 다양한 다른 성분을 함유하는 적합한 용매에 소요 함량으로 활성 화합물을 혼합하고, 이후 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산액 매체 및 전술한 다른 성분을 함유하는 무균 운반체에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼합하여 제조한다. 무균 주사가능 용액의 제조용 무균 분말의 경우에, 적합한 제조 방법은 사전에 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 산출하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
국소 주사용의 고도로 농축된 용액의 제조를 계획한다. 이와 관련하여, 용매로서 DMSO의 사용이 바람직한데, 그 이유는 침투가 매우 신속하고 작은 종양 부위에 고도로 농축된 활성 작용제를 전달할 수 있기 때문이다.
제조된 용액은 약형에 부합되는 방식 및 진단이나 치료에 효과적인 함량으로 투여된다. 수용액으로 장관외 투여하는 경우, 용액은 필요한 경우에 적절히 완충하는데, 액체 희석액은 먼저 충분한 염수나 글루코오스로 등장성(isotonic)이 되게 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하, 복강내 투여에 특히 적합하다. 다른 구체예에서, 직접 종양내 주사를 계획한다. 대안으로, 임의의 절절한전달 운반체를 이용하여 종양에 치료 화합물을 주입하거나 재관류할 수 있다. 종양에 관하여 국소 또는 국부 투여를 계획한다. 최종적으로, 전신 투여를 실시할 수 있다. 적절한 경우, 예를 들면 종양을 절제하고 종양 종괴(tumor bed)를 처리하여 잔류성 현미경적 질환을 제거하는 경우에, 연속 투여를 적용할 수도 있다. 시린지 또는 카테터삽입(catherization)을 통한 전달 역시 계획한다.
이와 관련하여, 사용될 수 있는 무균 수용성 매체는 본원 발명의 개시 내용에 비추어 당업자에게 자명하다. 가령, 1회 분량은 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해시키거나, 1000㎖ 피하주입 액체에 첨가하거나 또는 지정된 주입 부위에 주사할 수 있다("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 치료되거나 진단되는 개체의 상태에 따라 용량은 약간 변화시킨다. 어떤 경우든, 투여를 담당하는 사람이 개별 개체에 적합한 분량을 결정한다.
H. 투여 루트
투여 루트는 병소의 위치와 성격에 따라 자연적으로 변하는데, 여기에는 예로써, 피내, 수막강내, 관절내, 경피(transdermal), 장관외, 정맥내, 동맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경피(percutaneous), 기관지내, 복강내, 종양내, 관류, 장 세척, 직접 주사, 국소 도포, 경구 투여와 제제가 포함된다. 종양내 주사 또는 종양 맥관구조로의 주사는 분리성 고형 접촉가능 종양에 특이적으로 계획된다. 국소, 국부 또는 전신 투여 역시 적합할 수 있다. 외과적 개입의 경우에, 본원 발명은 잔류성 또는 전이성 질환을 치료하기 위하여 수술에 앞서, 수술 시점에 및/또는 수술이후에 이용될 수 있다. 가령, 절제된 종양 종괴(tumor bed)에 항-CD26 항체를함유하는 조성물을 주사하거나 관류할 수 있다. 관류는 예로써 수술 부위에 이식된 카테터를 남겨둠으로써 절제이후에도 지속할 수 있다. 주기적인 수술후 치료 역시 기대된다.
적절한 경우, 예를 들면 종양을 절제하고 종양 종괴를 처리하여 잔류성 현미경적 질환을 제거하는 경우에, 연속 투여를 적용할 수도 있다. 이런 연속 관류는 치료 시작이후 대략 1-2시간에서 대략 2-6시간, 대략 6-12시간, 대략 12-24시간, 대략 1-2일, 대략 1-2주 이상까지 실시될 수 있다. 일반적으로, 연속 관류를 통한 치료 조성물의 용량은 단일이나 다중 주사에 의해 제공된 용량과 대등하며, 관류가 진행되는 기간동안 조정된다. 특히 흑색종과 육종의 치료에서 본원 발명의 조성물을 투여하는데 손발 관류(limb perfusion)의 이용을 추가로 계획한다.
치료 섭생은 종양 유형, 종양 위치, 병의 진행, 환자의 건강과 연령에 따라 변화될 수 있다. 명확하게, 특정 유형의 종양은 좀더 공격적인 치료를 필요로 하지만, 이와 동시에 일부 환자는 부담스러운 프로토콜을 견뎌내지 못할 수 있다. 임상의는 치료 조성물의 공지된 효능과 독성에 기초하여 이런 결정을 하는데 가장 적합하다.
일부 구체예에서, 항-CD26 항체를 함유하는 리포좀 조성물을 계획한다. 제약학적 작용제의 리포좀 캡슐화(encapsulation)는 통상적인 약물 전달 시스템과 비교하여 반감기를 연장시킨다. 좀더 많은 양이 안전하게 포장될 수 있기 때문에, 이는 용량-집중(dose-intensity) 작용제가 세포에 전달될 수 있도록 한다.
"리포좀"은 캡슐화된 지질 이중층의 발생으로 생성되는 다양한 단일과 다중층 지질 운반체를 포함하는 포괄적 용어이다. 본원 발명에 따른 리포좀을 제조하는데 인지질이 사용되는데, 이들은 순 양전하(net positive charge) 혹은 순 음전하(net negative charge)를 보유하거나 또는 중성이다. 디세틸 포스페이트는 리포좀에 음전하를 공여하는데 사용될 수 있고, 스테아릴아민은 리포좀에 양전하를 공여하는데 사용될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 및 내부의 수성 매체로 특성화된다. 다중층 리포좀은 수성 매체에 의해 분리되는 다중 지질층을 보유한다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 부유될 때 자발적으로 생성된다. 지질 구성요소는 밀폐된 구조의 생성에 앞서 자가-재정렬이 진행되고, 지질 이중층 사이에 물과 분해된 용매를 포획한다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 양이온 지질-핵산 복합체, 예를 들면 리포펙타민-핵산 복합체를 또한 계획한다.
다음의 실시예는 본원의 적절한 구체예를 설명한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이들 실시예에 개시된 기술은 본 발명자에 의해 개발된 당분야에 효과적인 기술을 대표하고, 따라서 바람직한 실행 모델로 간주될 수 있다. 하지만, 본원 발명의 개시내용에 비추어, 특정 구체예에서 본원 발명의 기술적 사상과 목적을 벗어나지 않는 다양한 개변이 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 1
항-CD26 단클론항체의 시험관내와 생체내 항종양 효과
재료와 방법
동물. 3-4주된 암컷 C.B-17 SCID 생쥐는 Taconic Farms, Inc로부터 구하였고마이크로분리 우리에 사육하였으며, 사료, 식수, 깔짚은 사용에 앞서 가압멸균하였다.
세포. 사람 CD30+ 역형성 대세포 T-세포 림프종 세포주 Karpas 299는 표면 마커 CD4, CD5, HLA-DR, CD30을 보유하고 t(2;5) 전좌 및 재배열된 T-세포 수용체 베타-사슬 유전자가 존재하는 CD30+ 역형성 대세포 T-세포 림프종 진단을 받은 25세 백인 남성의 말초혈 모세포로부터 확립되었다(Fischer et al., 1988; Tian et al. 1995). 세포는 10% FCS, 페니실린(100 unit/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖)(GIBCO BRL, Rockville, MD)으로 보충된 RPMI 1640으로 구성되는 배양 배지에서 37℃에서 배양하였다.
항체. 사용된 항-CD26 단클론항체(mAb)는 1F7과 5F8인데, 이들은 사람 CD26을 인식하는 뮤린 항체이며 기존 문헌(Morimoto et al., 1989; Dang et al., 1990b; Torimoto et al., 1992)에서 기술되었다. 사용된 대조 mAb는 Karpas 299 세포주에서 발현되지 않는 CD45 RA 에피토프를 인식하는 아이소타입 대조 생쥐 IgG1이며 기존 문헌(Morimoto et al., 1989)에서 밝힌 바와 같이 발생시켰다. 항-CD3과 항-CD2 mAb는 Coulter로부터 구입하였다. 웨스턴 블랏팅 연구를 위한 항-p21과 항-p27은 Tranduction Laboratories로부터 구입하였다; 항-p53은 Calbiochem으로부터 구입하였다; 항-cdk2, 항-cdk4, 항-사이클린 D는 Upstate Biotechnology로부터 구입하였다; 항-사이클린 E와 항-PCNA는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다; 항-액틴은 Sigma로부터 구입하였다.
시약. 테트라졸륨 염 MTT(3,(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐테트라졸륨브롬화물)(Sigma)는 실온에서 무균 PBS에 5 ㎎/㎖ 농도로 용해시키고, 상기 용액은 여과로 추가로 멸균하고 암실에서 4℃에 저장하였다. 추출 완충액은 다음과 같이 만들었다: 20% w/v SDS는 각각 50%의 N,N-디메틸 포름아마이드(DMF)(Sigma)와 증류수의 용액에서 37℃에 용해시켰다; pH는 1M HCl을 첨가하여 4.7로 조정하였다. 사이클로헥시미드 CHX(Sigma)는 20 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.
생체내 연구
모든 생쥐는 숙주 고유 킬러 세포 활성을 제거하고 종양 생착(engraftment)을 촉진하기 위하여 종양 이식 1일전에 0.2 ㎖ 항-아실로 GM1 다클론 항혈청 25%(v/v)(Wako, Richmond, VA)로 복강내 사전처리하였다(Tian et al., 1995). 이후 생존 연구를 위하여, 종양 세포를 i.p 주사하였다. 종양 접종 1일후, SCID 생쥐는 0.1 ㎖ 무균 염수에 넣은 염수, 아이소타입 대조 Ab 또는 항-CD26 mAb IF7을 지정된 용량과 일정으로 i.p 주사하였다. 이후, 종양-보유 생쥐는 종양 발생과 진행을 모니터하고, 죽어가는 생쥐는 안락사시키고 종양 확인을 위하여 부검하였다. 이에 더하여, 최대 크기가 2 ㎝인 가시적이거나 촉진가능한 종양을 가진 생쥐 역시 안락사시키고 부검하여 동물의 고통을 최소화시켰다. 조직병리학적 분석을 위하여 일부 동물에서 장기를 수거하였다. 일부 연구에서, SCID 생쥐는 종양 세포를 s.c. 주사하고, 종양 크기가 0.5 ㎝의 최대 크기에 도달한 이후 염수 또는 1F7(주사당 5 ㎍)을 격일로 총 7회 종양내 s.c. 주사하였다. 이후, 생쥐는 안락사시키고, 조직병리학적 분석을 위하여 주사 부위에서 종양 덩어리를 수거하였다.
다른 연구에서, SCID 생쥐는 염수 단독, 100 ㎍ 1F7 또는 아이소타입 대조Ab에서 배양된 1×106Karpas 299 종양 세포를 s.c. 주사하였다. 종양 접종 1일후, SCID 생쥐는 최초 s.c. 종양 주사 부위에 0.1 ㎖ 무균 염수에 넣은 염수, 아이소타입 대조 Ab(20 ㎍/주사) 또는 1F7(20 ㎍/주사)을 격일로 총 10회 s.c. 주사하였다. 치료 효과를 평가하기 위하여 가시적 종양이 처음 나타난 일자를 자세히 기록하였다.
시험관내 연구
MTT 분석. 세포 성장 분석은 기존 문헌(Hansen et al., 1989)에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. 세포는 배양 배지 단독 또는 배양 배지 + 본원 발명의 항체의 존재하에 100 ㎕(50,000 세포/웰)의 총 부피로 마이크로평판에 배양하였다. 37℃에서 48시간 배양후, 25 ㎕ MTT를 1 ㎎/㎖ 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 이후, 마이크로평판은 37℃에서 2시간동안 배양하고, 후속으로 100 ㎕ 추출 완충액을 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤동안 배양후, 570 nm에서 OD 측정을 실시하였다. 보고된 수치는 삼중 웰의 평균을 나타내는데, 평균의 표준 오차는 15% 미만이었다.
면역형광. 모든 과정은 4 ℃에서 실시하고 유세포 분석법(FACScan, Becton Dickinson)은 기존 문헌(Dang et al., 1990d)에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. 세포는 적절한 항체로 염색하고 PBS로, 이후 염소 항-생쥐 IgG FITC로 2회 세척하였다. 네거티브 대조는 2차 항체 단독으로 염색하였다. 일부 연구에서, SCID 생쥐는 전술한 바와 같이 종양 세포를 i.p(1×106세포/생쥐) 접종하였다. 종양이 촉진가능하면, 동물은 안락사시키고 종양 덩어리를 수거하였다. 이후, 종양 덩어리로부터 단일 세포 현탁액을 분리하고 유세포 분석을 실시하였다.
세포 사이클 분석. 세포는 배지 단독에서 또는 5 ㎍/㎖ 농도로 항체의 존재하에 37℃에서 배양하였다. 세포는 적절한 시간 간격으로 수거하고 PBS로 2회 세척하며 10 ㎍/㎖ 프로피듐 요오드, 0.5% Tween-20, 0.1% RNase를 함유하는 PBS에서 실온에 30분동안 재현탁시켰다. 이후, 시료는 DNA 함량을 분석(FACScan, Becton Dickinson)하였다. 세포 파편과 고정 인공물은 버리고, Go/G1, S, G2/M 개체군은 CellQuest와 ModFit LT 프로그램으로 정량하였다.
SDS-PAGE와 면역블랏팅. 37℃에서 배양후, 세포는 웰로부터 수거하고 PBS로 세척하며 1% Brij 97, 5mM EDTA, 0.02M HEPES pH 7.3, 0.15M NaCl, 1mM PMSF, 0.5mM NaF, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 0.2mM 소디움 오르토바나데이트로 구성되는 용해 완충액에 용해시켰다. 얼음에서 15분동안 배양한 이후, 원심분리로 핵을 제거하고 상층액을 수거한다. 20% 글리세롤, 4.6% SDS, 0.125M Tris, pH 6.8, 0.1% Bromophenol Blue로 구성되는 2X 시료 완충액을 적량의 상층액에 첨가하였다. 단백질 시료는 mini-Protean Ⅱ 시스템(Bio-Rad Hercules, CA)을 이용하여 표준 조건하에 20% 겔에서 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 면역블랏팅을 위하여, 단백질은 니트로셀룰로오스(Immobilon-P, Millipore)로 이전시켰다. TBS에 넣은 0.1% Tween 20과 5% 소 혈청 알부민으로 구성되는 차단 용액(blocking solution)에서 4℃에 하룻밤동안 차단후, 막은 차단 용액에 희석된 적절한 1차 항체로 실온에서 1시간동안 블랏시켰다. 이후, 막은 차단 용액으로 세척하고 차단 용액에 희석된 적절한 2차 항체를 실온에서 1시간동안 적용하였다. 2차 항체는 염소 항-생쥐 또는 염소 항-토끼 HRP 공액체(Dako)이었다. 그 다음, 막은 차단 용액으로 세척하고, 단백질을 화학발광으로 후속 탐지하였다(Amersham Pharmacia Biotech).
결과
Karpas 299 림프종 세포주에서 CD26 발현. CD30+ 역형성 대세포 T-세포 림프종 세포주 Karpas 299에서 CD26의 발현은 SCID 생쥐에 종양 이식에 앞서 유세포 분석법으로 평가하였다. 도 1A에 도시된 바와 같이, Karpas 299 세포에서 CD26은 표면에서 높게 발현되는 반면, CD3과 CD2 표면 발현은 탐지되지 않는다. 이에 더하여, 1F7과 함께 하룻밤동안 배양하면 CD26 표면 발현이 감소하는데(도 1B), 이는 정상적인 T-세포에서 CD26 표면 발현의 항-CD26 매개된 조절과 관련하여 기존에 보고된 조사결과(Dang et al., 1990d)와 일맥상통한다.
G1/S 체크 포인트에서 세포 성장의 CD26-매개된 저해. Karpas 299 세포와 H9 세포의 성장에 대한 가용성 항-CD26 항체 결합의 효과는 시험관내 연구에서 조사하였다. 도 2A와 2B에 도시된 바와 같이, 1F7의 첨가는 MTT 감소에 의한 측정에서 감소된 세포 성장을 유발하였다. 5F8 단클론항체 역시 세포 성장에 현저한 저해 효과를 발휘하지만, 1F7과 비교하여 더 높은 농도로 사용되었다. 항-CD26 mAb는 검사된 농도에서 CD26-네거티브 세포주에 성장 저해 효과를 보이지 않았다. 세포 성장에 대한 1F7 저해 효과의 추가적인 증거는 세포 사이클 분석을 통하여 얻었다. 표 2에 도시된 바와 같이, 1F7의 결합은 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행의 강화된 억제를 결과하고 궁극적으로 감소된 세포 대사와 세포 성장을 유도하는데, 이는 MTT 흡수의 감소로 탐지되었다.
표 2G1/S에서 항-CD26-매개된 세포 사이클 진행억제
%Go/G1 %S %G2/M
배지 대조 Ab 1F7 배지 대조 Ab 1F7 배지 대조 Ab 1F7
Day 1 26.71 25.04 36.04 47.81 47.52 35.98 25.48 27.44 27.98
Day 2 56.55 53.81 73.52 24.71 25.96 14.04 18.74 20.23 12.44
Karpas 299 세포는 배지 또는 항체(2 ㎍/㎖)와 함께 37℃에서 배양하였다. 세포는 지정된 시간 간격으로 수거하고 세포 사이클 분석을 실시하였다. 데이터는 독립된 3회 연구의 평균이다.
CD26-매개된 세포 사이클 진행억제이후 p21 발현의 강화. G1/S 체크 포인트에서 사이클린-의존성 키나아제 저해물질에 의해 수행되는 내적 역할의 검토에서, 항-CD26 항체 결합이후 p21, p27, p16의 발현을 조사하였다. 항-CD26 처리이후 강화된 p21 발현은 배지 단독 또는 아이소타입 대조 mAb 혹은 1F7(2 ㎍/㎖)을 함유하는 배지와 함께 37℃에서 하룻밤동안 배양된 Karpas 299 세포에서 나타나는데, 이후 세포는 수거하고 SDS-PAGE와 면역블랏팅 연구를 실시하였다. 다른 실험에서, Karpas 299 세포는 다양한 시간 간격으로 1F2(2 ㎍/㎖) 또는 배지 단독으로 처리하고 p21 발현을 탐지하였다. p27 발현은 항-CD26 mAb 결합에 의해 영향을 받지 않으며 p16 발현은 배지 단독에서 또는 항-CD26 mAb와 대조 항체의 존재하에 배양된 세포에서 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다. 다른 한편, p21 발현은 CD26 결찰이후 강화되었다. 대조 조건하에 배양과 비교하여, 항-1F7 처리는 p21의 증가된 발현을 결과하였다. 항-p21 mAb로 웨스턴 블랏팅하면 21 kd 위치에서 이동하는 예상 밴드가 출현하였다. 특정 조건하에, p21 발현의 유도는 p53에 의존하는 것으로 알려져 있다(El-Deiry et al., 1993; El-Deiry et al., 1994). Karpas 299 세포주에서, 대조와 비교하여 항-CD26-처리된 세포에서 p53 발현의 변화는 관찰되지 않았다. 하지만, p53의 기능적 지위는 아직 확인되지 않고 있다.
p21은 사이클린 및 CDK와 복합체를 형성하여 G1/S에서 T-세포 사이클 진행을 저해하는 것으로 알려져 있다. 항-CD26 항체 결합이 p21 발현을 강화시키긴 하지만, 사이클린/CDK/p21 복합체내에 존재하는 사이클린 D, 사이클린 E, cdk2, cdk4의 단백질 수준은 변하지 않는다. 이에 더하여, PCNA 단백질 수준은 항-CD26 처리에 영향을 받지 않았다. CD26+ H9 세포주에 항-CD26 결합이후 유사한 데이터가 획득되었다. 또한, 1F7 처리 3시간이내에 강화된 p21 발현이 탐지되고 이의 수준이 지속된 항체 처리동안 상승하는 것으로 밝혀졌다.
강화된 p21 발현은 de novo 단백질 합성에 의존한다. 항-CD26 결합이후 p21 발현 강화가 증가된 단백질 합성에 의존하는 지를 확인하기 위하여, 단백질 합성 저해물질 사이클로헥시미드(CHX)의 존부하에 p21 발현을 조사하였다. p21 발현은 1F7로 처리된 세포에서는 관찰되지만 1F7과 CHX로 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, CD26 결찰이후 p21의 발현은de novo단백질 합성에 의존한다.
생체내 종양 모델에서 Karpas 299를 보유하는 SCID 생쥐에서 1F7의 항-종양 효과. Karpas 299 성장에 대한 항-CD26 mAb 1F7의 효과 역시 SCID 종양 생쥐 모델에서 조사하였다. 이를 위하여, 1 ×106Karpas 299 세포를 SCID 생쥐에 i.p. 주사하여 종양을 발생시켰다. 후속으로, 종양은 떼어내고 단일 세포 현탁액을 확립하였다. 이런 생체 모델에서 종양 형성의 과정은 CD26 표면 발현에 영향을 주지 않았다. 가령, 도 3A와 3B에 도시된 바와 같이, SCID 생쥐로 종양 이식이후 CD26 발현은 종양 이식전의 수준과 유사하였다. 복강내 덩어리의 조직 절편의 사후 조직병리학적 분석에서 CD26의 존재가 확인되었다.
이후, SCID 생쥐는 Karpas 299 세포(1x106세포/생쥐)를 i.p 주사하고, 종양 접종 1일후 지정된 용량의 염수, 아이소타입 대조 Ab 또는 1F7을 격일로 총 10회 i.p. 주사하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 5 ㎍/주사로 1F7 처리된 생쥐는 염수(p<0.0001) 또는 5 ㎍/주사로 아이소타입 대조 Ab(p<0.001)로 처리된 생쥐와 비교하여 통계학적으로 유의한 생존 이점을 보였다. 유사하게, 10 ㎍/주사로 1F7 처리된 생쥐의 생존 이점은 염수(p<0.0001) 또는 10 ㎍/주사로 아이소타입 대조 Ab(p<0.001)로 처리된 생쥐와 비교하여 통계학적으로 유의하였다. 상기 데이터에서 5 ㎍/주사와 10 ㎍/주사의 1F7 용량간 통계학적으로 유의한 생존 차이는 나타나지 않았다(p=0.7).
좀도 높은 용량의 종양 세포(3×106세포/생쥐)를 i.p. 주사하고 염수 단독, 아이소타입 대조 Ab(20 ㎍/주사), 또는 5 ㎍/주사(p,0.05), 10 ㎍/주사(p<0.05) 혹은 20 ㎍/주사(p<0.01) 용량의 1F7을 격일로 총 10회 i.p. 주사한 생쥐는 좀더 낮은 용량의 종양 세포를 초기에 주사한 생쥐보다 통계학적으로 유의한 생존 이점을 보이지 않았다. 20 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐는 20 ㎍/주사(p<0.01) 용량의 아이소타입 대조 Ab로 처리된 생쥐보다 통계학적으로 유의한 생존 이점을 보였다.
서로 다른 용량의 1F7로 처리된 생쥐를 비교하면, 20 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐는 5 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐보다 통계학적으로 유의한 생존 이점을 보였다(p<0.01). 또한, 10 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐보다 20 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐에서 생존이 좀더 높게 나타났다(p=0.2). 유사하게, 5 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐보다 10 ㎍/주사 용량의 1F7로 처리된 생쥐에서 생존이 좀더 높게 나타났다(p=0.09)(도 4B). 이들 데이터는 항체 처리의 효능이 종양의 상대적 함량에 좌우된다는 것을 암시한다.
조직 절편의 사후 조직병리학적 분석에서, 대조 조건하에 처리된 종양-보유 생쥐는 국소 부위뿐만 아니라 원심 장기에도 종양 침윤이 발생하였다. 반면, 1F7-처리된 생쥐에서는 이들 부위에서 종양이 나타나지 않았다. 따라서, 항-CD26 항체는 전이성 종양 성장도 예방한다.
또한, SCID 생쥐 모델에서 1F7의 항종양 효과를 측정하였다. 이를 위하여, SCID 생쥐는 1×106Karpas 299 세포를 s.c. 접종하였다. 가시적인 종양 덩어리가 발생한 이후, 생쥐는 염수 단독 또는 1F7(5 ㎍/주사)을 격일로 총 7회 종양내 주사하였다. 조직병리학적 분석에서, 1F7 처리는 종양 괴사를 유도하는 것으로 밝혀졌는데, 대부분의 종양에서 응집성 괴사가 진행되었다. 대조적으로, 염수 처리에서는 종양 세포에서 상당한 종양 덩어리가 발견되었다. 5 ㎍/주사로 아이소타입 대조 Ab로 처리하면 염수 처리에서와 유사한 결과가 유도되었고, 대부분의 종양 세포가 종양 덩어리에서 생육하는 것으로 발견되었다.
또한, 종양 세포의 s.c. 주사 및 염수, 1F7 또는 아이소타입 대조 Ab로 s.c. 처리이후 Karpas 299 종양의 최초 출현에 필요한 시간을 측정하였다. 이런 연구를 위하여, SCID 생쥐는 염수 단독, 100 ㎍ 1F7 또는 100 ㎍ 아이소타입 대조 Ab에서 배양된 1×106Karpas 299 세포를 s.c. 주사하였다. 종양 접종 1일후, SCID 생쥐는 최초 s.c. 종양 주사 부위에 0.1 ㎖ 무균 염수에 넣은 염수, 아이소타입 대조 Ab(20 ㎍/주사) 또는 1F7(20 ㎍/주사)을 격일로 총 10회 s.c. 주사하였다. 치료 효과를 평가하기 위하여 가시적 종양이 처음 나타난 일자를 자세히 기록하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 서로 다른 조건으로 처리된 생쥐간 가시적인 종양 발생에서 속도 차이는 통계학적으로 유의하였다. 1F7로 처리된 군은 종양 발생의 속도가 아이소타입 대조 Ab 또는 염수 단독으로 처리된 군(각각, p<0.001과 p<0.001)보다 느리고, 연구 기간동안 1F7-처리된 대부분의 생쥐에서 종양은 존재하지 않았다.
실시예 2
항-CD26 mAb 1F7은 T 림프구 증식을 저해하고 강화된 p21 Cip1 발현과 연관된 G1/S에서 세포 사이클 진행을 억제한다.
방법
세포의 준비와 배양. 사람 T-세포 클론은 기존 문헌(Sugita et al., 1992)에서 밝힌 방법에 따라 사람 말초혈 림프구의 시험관내 자극으로 확립하였다. 사람 Jurkat T-세포주는 ATCC로부터 구하였다. Jurkat 세포주는 다음과 같다: 1) 야생형 CD26-트랜스펙션된 Jurkat 세포주(J. C26/DP+); 2) 630 위치에서 추정 촉매성 세린 잔기에 알라닌을 보유하는 변이 CD26으로 트랜스펙션되어 변이 CD26-파지티브/DPPIV-네거티브 Jurkat 형질감염체(transfectant)를 결과하는 Jurkat 세포주(J.C26/DP-); 3) 비-트랜스펙션된 모 Jurkat 세포(Jwt)(Tanaka et al., 1992; Tanaka et al., 1993). Jurkat 형질감염체는 10% FCS, 페니실린(100 unit/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖)(Life Technologies Inc.), G418(500㎍/㎖)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 보충된 RPMI 1640(Life Technologies Inc., Grand Island, NY)으로 구성되는 배양 배지에서 1x106/㎖ 농도로 37℃에서 배양하였다. 비-트랜스펙션된 모 Jurkat 세포는 G418없는 동일한 배양 배지에서 유지시켰다. 건강한 성인 지원자로부터 수집된 사람 말초혈 단핵구 세포(PBMC)는 Ficoll/Paque(Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ)에서 원심분리로 분리하였다. 고도로 정제된 T-세포 개체군을 얻기 위하여, PBMC는 E 로제트-파지티브 개체군으로 분리하고 >95% 순도로 FITC-표지된 항-CD3 mAb(BD PharMingen, San Diego, CA)를 이용한 유세포 분석법(FACScaliburTM, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. Tokyo, Japan)에 의한 측정에서 휴면 T-세포로 사용하였다. T-세포 클론은 IL-2(10ng/㎖; Pepro Tech EC Ltd., London U.K.)를 함유하는 배양 배지에 유지시키고 조사(30GY)된 동종 PBMC(1.0*105/㎖)(Sugita et al., 1992)로 매2-3주마다 재자극하였다. 세포의 생존능은 트립탄 블루(Sigma-Aldrich) 염료 배제 방법으로 검사하였다.
항체와 시약. 항-CD26 mAb, 1F7과 5F8, 아이소타입 대조 mAb 4B4(CD29 mAb)는 기존 문헌(Morimoto et al., 1989; Torimoto et al., 1992; Morimoto et al., 1985)에서 기술되었다. 항-CD3 mAb(OKT3) 역시 기준 문헌(Kung et al., 1979)에 기술되었다. 다음의 항체와 시약: FITC 표지된 항-브로모디옥시우리딘(BrdU), 항-p21Cipl, 항-p27Kipl, 항-p53, 항-사이클린 D1, 항-CDK4, 항-CDK-6, 항-ERK, 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)는 BD PharMingen으로부터 구입하였다. 생쥐 단클론 항-포스포티로신 4G10과 항-β-액틴은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, 항-인산화된 ERK는 Santa Cruz(Delaware Avenue, CA)로부터 구입하였다. 세포 자극 및 신호 전달의 저해에 사용되는 시약의 공급원과 작업 농도는 다음과 같다: OKT3(0.05 ㎍/㎖), PMA(10 ng/㎖; Sigma-Aldrich), Nocodazole(DMSO에서 500 ng/㎖ 내지 1 ㎎/㎖ 원액; Sigma-Aldrich), PD98059(DMSO에서 10μM 내지 10 mM 원액; BIOMOL, Plymouth Meeting, PA), U0126(DMSO에서 10μM 내지 10 mM 원액; Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA). 세포는 mAb와의 배양 30분전에 각 저해물질로 처리하였다.
유세포 분석. 모든 4℃에서 실시하고 유세포 분석법(FACScan, Becton Dickinson)은 표준 CELLQuestTM포착/분석 소프트웨어(Becton-Dickinson)를 이용하여 FACSCaliburTM(Nippon Becton-Dickinson)로 실시하였다. 세포는 적절한 항체로 염색하고 FCM 분석에 앞서 차가운 PBS로 2회 세척하였다.
세포 사이클 분석. 세포(1×106/웰)는 배지 단독에서, 또는 Nocodazole과 함께 혹은 Nocodazole 없이 지정된 농도의 1F7, 5F8 또는 아이소타입 대조 mAb(4B4)의 존재하에 37℃에서 배양하였다. 저해물질을 이용한 실험에서 1×106세포는 항-CD26 mAb와의 배양에 앞서, 지정된 농도의 다양한 저해물질과 함께 37℃에서 30분동안 배양하였다. 세포는 적절한 시간 간격으로 10 μM 농도의 BrdU로 37℃에서 30분동안 펄스하였다. 이후, 세포는 수거하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포의 고정, 투과화, FITC 표지된 항-BrdU과 7-AAD에 의한 면역염색은 BrdU Flow Cytometry Kit의 BD PharMingen 사용 매뉴얼에 따라 실시하였다. 이후, 시료는 제조후 1시간이내에 FACSCaliburTM로 분석하였다. 세포 파편과 고정 인공물을 버린 이후 BrdU vs. 7-AAD 점 플랏에 적용된 영역 게이트에 의해, FCM 분석에서 세포 사이클의 G0/G1, G2/M, S 단계에 위치하는 세포 하위군의 구별이 가능하였다. G0/G1, S, G2/M 개체군은 CELLQuestTM프로그램(Becton-Dickinson)으로 정량하였다.
세포 용해질의 준비와 웨스턴 블랏 분석. 37℃에서 배양후, 세포는 웰로부터 수거하고 PBS로 세척하며 1% NP-40, 0.5% 소디움 디옥시콜레이트, 0.1% SDS, 5mM EDTA, 10mM Tris-HCl(pH 7.4), 0.15M NaCl, 1mM PMSF, 0.5mM NaF, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 0.02mM Na3VO4로 구성되는 RIPA 용해 완충액에서 용해시켰다. 포스포티로신 단백질을 탐지하기 위하여, 배양후 세포는 5mM EDTA, 10mM NaF, 10mM Na-피로포스페이트, 0.4mM Na3VO4를 함유하는 차가운 PBS로 세척하였다. 세포는 원심분리하고, 이후 용해 완충액(1% NP-40, 0.5% 소디움 디옥시콜레이트, 5mM EDTA, 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.15M NaCl, 1mM PMSF, 10mM 요오드아세트아마이드, 10mM NaF, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 0.4mM Na3VO4)에 용해시켰다. 원심분리에 의한 침전의 제거후, 세포 용해질은 mini-Protean Ⅱ 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 환원 조건하에 적절한 농축 겔에서 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 면역블랏팅을 위하여, 단백질은 25mM Tris, 192mM 글리신, 20% 메탄올에서 중플루오르화폴리비닐리덴 막(Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA)으로 이전하고, 막은 PBS에서 실온에 1시간동안 5% 탈지유를 함유하는 0.05% Tween 20으로 차단하였다. 특이적인 항원은 상응하는 mAb, 이후 HRP-고액된 항-생쥐 Ig(Amersham Pharmacia)으로 탐침하였다. 웨스턴 블랏은 강화된 화학발광 기술(NEN, Boston, MA)로 가시화시켰다.
시험관내 세포 증식 분석. 세포 증식은 [3H]-티미딘 통합(ICN Radiochemicals Irvine, CA)을 이용하여 측정하였다. 각 실험의 모든 증식 분석은 삼중으로 실시하였다. 각 마이크로평판 웰에서 0.2×106세포는 배지 단독의 존재하에, 또는 OKT3과 PMA으로 자극하거나 이런 자극없이 1F7(1㎍/㎖)의 존재하에 37℃에서 배양하였다. 72시간 배양한 이후, 세포는 최종 8시간의 배양동안 [3H]-티미딘(1μCi/웰)으로 펄스하였다. 이후, 세포는 유리필터(Wallac, Turk, Finland)에수집하고, 액체 신틸레이션 계산기(Wallac)로 계수하였다. [3H]-티미딘 흡수는 삼중 시료의 평균 cpm으로 표시하였다.
통계. 스튜던트 t-검증을 이용하여 대조와 시료간 차이가 유의한지를 측정하였다(p<0.05이면 유의하다).
결과
항-CD26 mAb 처리는 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행을 저해한다. DPPIV 활성 도메인을 보유한 CD26의 cDNA로 트랜스펙션된 Jurkat 세포(J.C26/DP+) 및 DPPIV 활성 도메인이 없는 CD26의 cDNA로 트랜스펙션된 Jurkat 세포(J.C26/DP-)의 세포 사이클에 대한 가용성 항-CD26 항체의 효과를 조사하였다(21, 22). 세포 사이클 상태를 분석하기 위하여, BrdU로 세포를 펄스한 이후 FITC 표지된-BrdU와 7-AAD의 2색 염색으로 FCM을 실시하였다. 세포 사이클 효과를 좀더 효과적으로 가시화시키기 위하여, 세포는 Nocodazole로 처리하였는데, 이는 세포가 G0/G1 단계에서 진행이 억제되지 않으면 M1 단계에서 세포를 억제한다. 트립탄 블루 염료 배제 방법으로 확인된 세포 생존능은 Nocodazole의 존부하에 >95%를 유지하였다. 도 6A에 도시된 바와 같이, J.C26/DP+에 항-CD26 mAb 1F7의 첨가는 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행을 차단하였다. 주목할 점은 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제가 J.C26/DP- 또는 모 Jurkat(Jwt)(FIG. 6A)에서는 관찰되지 않았다는 사실이다. 도 6B에서, Nocodazole에 의한 G2/M 누적은 1F7 비-처리된 J.C26/DP+에서는 관찰되지만 1F7 처리된 J.C26/DP+에서는 관찰되지 않았다. Nocodazole에 의한 이런 G2/M 누적 효과는 1F7의 존부하에 J.C26/DP-와 Jwt에서도 관찰되었다(FIG. 6B). 반면, S 단계는 1F7 처리에 영향을 받지 않았다(FIG. 6C). 이런 조사결과는 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행의 효과가 CD26 분자에 내재된 DPPIV의 효소 활성에 의존한다는 것을 암시한다.
항-CD26 mAb 처리이후 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제와 연관된 p21의 강화. 1F7에 대한 Jurkat 세포의 세포 반응의 FCM 분석에 의한 면밀한 검사에서 J.C26/DP+는 1F7과의 배양 6시간후에 G1 진행억제에서 대략 25% 증가를 보이는 것으로 밝혀졌다(FIG. 7). 1F7 처리후 12시와 24시에, J.C26/DP+는 초기의 G0/G1 진행억제를 점진적으로 상실하였다. 흥미롭게도, J.C26/DP-에서는 세포 사이클 진행억제가 관찰되지 않았다. 이들 조사결과는 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행에 대한 효과가 DPPIV의 효소 활성에 의존한다는 것을 다시 한번 암시한다. 1F7의 효과는 0.1-10.0 ㎍/㎖ 농도에서 용량-의존하였다. 하지만, 1F7로부터 별개의 CD26 에피토프를 인식하는 다른 항-CD26 mAb 5F8은 1F7에서 관찰되는 효과를 보이지 않았다(Torimoto et al., 1992).
세포 사이클 진행억제가 CDKI의 증가 및/또는 사이클린이나 CDK의 감소를 동반할 수 있기 때문에, 1F7 결합이후 다양한 세포 사이클 조절 단백질의 발현을 조사하였다. 대조 조건(배지 단독 또는 아이소타입 대합된 대조 mAb인 4B4 처리)하에 배양과 비교하여, 1F7로 J.C26/DP+의 처리는 상기 단백질의 상대적 수준의 웨스턴 블랏팅 분석에 의해 드러난 p21Cipl의 상승된 발현을 유도하였다.
웨스턴 블랏팅을 위하여, J.C26/DP+와 J.C26/DP-는 1F7과 함께 배양하였다. 이후, 세포는 지정된 배양 기간에 수거하고, p21Cipl발현은 적절한 mAb를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 평가하였다. 세포 추출물의 동등한 적하(loading)는 항-β-액틴 mAb를 이용하여 확증하였다. 배지 단독이나 4B4에서는 p21Cipl발현에 대한 효과가 관찰되지 않았다. 1F7로 J.C26/DP-의 처리는 p21Cipl의 상승된 발현을 유도하지 못하였다. 강화된 p21Cipl발현은 1F7 처리후 6시간이내에 탐지되었고, 이후 점진적으로 감소하였는데, 이는 도 6A에 도시된 세포 사이클 분석과 양립한다.
게다가, J.C26/DP+와 J.C26/DP-는 배지 단독, 아이소타입 대조 mAb 4B4(Iso) 또는 1F7과 함께 6시간동안 배양하였다. 이후, 세포는 수거하고, p21Cipl, p27Kipl, p53, 사이클린 D1 CDK4, CD6의 발현은 적절한 mAb를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 평가하였다. 세포 추출물의 동등한 적하(loading)는 항-β-액틴 mAb를 이용하여 확증하였다. p21Cipl와는 대조적으로, G1-조절 사이클린 복합체와 연관된 사이클린 D1, CDK4, CDK6, p27Kipl, p53의 발현은 1F7 처리 6시간후에도 변하지 않았다.
주목할 점은 이들 단백질의 발현이 1F7과의 배양후 0-24시간에도 변하지 않았다는 점이다. 이들 결과는 1F7 자극이 CD26의 DPPIV 효소 활성을 통하여 p21Cipl의 상향조질 및 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제를 유도한다는 것을 암시한다.
MEK-ERK 경로는 G1/S 체크 포인트에서 1F7-매개된 세포 사이클 진행억제에 중요한 역할을 한다. CD26 분자는 막 지질 묶음(raft)에도 존재하고 1F7에 의한 CD26의 결찰은 묶음으로 CD26 분자의 동원을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Ishii et al., 2001). 지질 묶음에서 T-세포 수용체(TCR)는 다른 신호 분자와도 상호작용하고(Janes et al., 1999; Cheukuri et al., 2001), 따라서 신호 분자의 증가된 티로신 인산화를 유도한다. CD26은 핵심 세포 구조와의 물리적, 기능적 연관을 통하여 필수적인 T-세포 신호전달 현상에 관여한다(Morimoto and Schlossman, 1998; von Bonin et al., 1998; De Meester et al., 1999). 다른 연구에서, T 세포와 다른 세포 계통에서 Raf-MEK-ERK 경로의 과다활성은 핵심 세포 사이클 조절물질의 발현에서 변형 및 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제를 유도하는 것으로 확인되었다(Boussiotis et al., 1997; Sewing et al., 1997; Chen et al., 1999). 이런 이유로, T 세포에서 CD26과 관련된 신호전달 분자의 티로신 인산화는 p21Cipl의 발현 측면에서 조사하였다. J.C26/DP+, J.C26/DP-, Jwt는 다양한 시간, 다시 말하면 0, 5, 10분동안 1F7과 함께 배양하였다. 이후, 세포는 수거하고 5-20% 농도구배 SDS-PAGE에서 분리하며, 티로신 인산화의 상태는 항-포스포티로신 mAb 4G10(pY)을 이용한 웨스턴 블랏팅으로 평가하였다. 세포 추출물의 동등한 적하(loading)는 항-β-액틴 mAb를 이용하여 확증하였다. J.C26/DP+의 1F7 처리는 배양 시작후 5 내지 10분에 대략 40 kDa의 분자량을 갖는 단백질의 티로신 인산화를 유도하였다. 하지만, J.C26/DP-와 Jwt에서는 1F7 처리이후 티로신 인산화의 유도가 전혀 관찰되지 않았다. 이들 변화는 아이소타입 대합된 대조 mAb 4B4를 이용한 실험에서도 관찰되지 않았다.
40 kDa 인산화된 단백질을 특성화하기 위하여 ERK의 인산화 상태를 조사하였는데, 그 이유는 기존 문헌(Chen et al., 1999)에서 Raf-MEK-ERK 경로가 항-CD3 mAb-매개된 G1 진행억제를 매개한다고 밝혔기 때문이다. ERK 단백질은 1F7로 J.C26/DP+의 처리이후 인산화되는 것으로 밝혀졌다. 이 실험을 위하여, J.C26/DP+는 다양한 시간, 다시 말하면 0, 5, 10분동안 배지 단독, 아이소타입 대조 mAb 4B4(Iso) 또는 1F7과 함께 배양하였다. 세포 용해질은 항-포스포-ERK로 블랏하고 항-ERK mAb로 재탐침하였다. J.C26- 또는 Jwt를 이용한 실험에서 차이는 관찰되지 않았다.
이들 결과를 검증하기 위하여, p21Cipl발현에 대한 MEK-ERK 경로를 저해하는 효과를 검사하였다. 세포는 MEK-특이적 저해물질 PD98059의 존부하에 6시간동안 1F7로 처리하였다. ERK의 인산화와 연관된 p21Cipl의 강화된 발현은 MEK 저해물질의 존재에 의해 분명하게 저해되었다. 주목할 점은 겔 레인의 동등한 적하가 ERK를 인식하는 항체로 웨스턴 블랏을 탐침함으로써 확증되었다는 점이다. 이들 결과는 1F7 처리이후 p21Cipl의 유도가 MEK-ERK 경로를 통하여 매개된다는 것을 암시한다.
1F7로 처리이후 T-세포의 세포 사이클 조절에서 MEK-ERK 경로의 역할을 좀더 구체적으로 확인하기 위하여, MEK-특이적 저해물질 PD98059와 U0126의 존부하에 FCM에 의한 세포 사이클 분석을 실시하였다. 1F7-처리된 J.C26/DP+에서 G0/G1 진행억제는 MEK 특이적 저해물질의 존재에 의해 교란되지만(도 8) J.C26/DP-와 Jwt에서는 이런 현상이 관찰되지 않는데, 이는 p21Cipl발현과 관련된 결과와 일맥상통한다. 이들 조사결과는 항-CD26 처리가 MEK-ERK 경로를 활성화시킴으로써 T-세포에서 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제를 유도하고 CDKI p21Cipl의 강화된 발현을 결과한다는 것을 암시한다.
항-CD26 mAb 1F7 처리는 T-세포 클론의 증식을 저해한다. p21Cipl의 상향조절은 T-세포 증식동안 및 자가면역의 경향이 있는 BXSB의 CD4+ 기억 T-세포에서 기술되었다(Nourse et al., 1994; Sabzevari et al., 1997). 게다가, p21Cipl-결핍 생쥐는 CD4+ 기억 T-세포가 비정상인 양으로 축적되었고 핵 항원에 대한 내성이 상실되었다(Sabzevari et al., 1997). 이들 조사결과에 비추어, 사람 말초 T-세포의 증식에 대한 1F7-매개된 p21Cipl강화의 생물학적 효과를 정의하기 위하여, PBMC로부터 유래된 사람 T-세포 클론의 증식에 대한 가용성 항-CD26 항체 결합의 효과를 조사하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 사람 T-세포 클론에 1F7의 첨가는 [3H]-티미딘 흡수에 의한 분석에서 세포 증식의 감소를 유도하였다. 주목할 점은 항-CD26 mAb 5F8(Morimoto et al., 1992; Dong et al., 1998), 또는 아이소타입 대조 항체 4B4로 처리이후 저해 효과가 존재하지 않았다는 사실이다. Jurkat 형질감염체를 이용한 실험에서 전술한 결과와 유사하게, 1F7로 처리이후 T-세포 클론에서 p21Cipl발현역시 강화되었다(도 4B). 또한, 강화된 p21Cipl발현의 1F7 효과는 다소 낮은 수준으로 PHA 자극된 T-세포에서는 관찰되지만, 휴면 T-세포에서는 관찰되지 않았다. 이 실험을 위하여, T-세포 클론, 10-일 PHA 자극된 T-세포, 새로 분리된 T-세포는 배지 단독 또는 1F7과 함께 72시간동안 배양하였다. 이후, p21Cipl을 인식하는 mAb로 웨스턴 블랏팅을 위하여 세포 용해질을 준비하였다. 세포 추출물의 동등한 적하(loading)는 β-액틴을 인식하는 mAb를 이용하여 확증하였다. 이들 결과는 T-세포 클론 및 PHA 자극된 T-세포와 같은 활성화된 T-세포에서 1F7 처리에 의한 p21Cipl유도를 통하여 T-세포 증식이 저해된다는 것을 암시한다.
본 발명자들은 항-CD26 mAb 1F7 결합이 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제를 유도하고 CD26의 연동이 세포 사이클 조절 단백질 p21Cipl의 강화된 발현을 통하여 CD26 Jurkat 형질감염체에서 G1 진행억제를 유도한다는 것을 확인하였다. 이런 효과는 MEK-ERK 경로의 활성화로 매개되었다. CD26 Jurkat 형질감염체에 더하여, 증식 및 p21Cipl발현 강화의 저해 역시 사람 PBMC로부터 유래된 T-세포 클론과 PHA 자극된 T-세포에서 관찰되었다.
클래스 Ⅱ HMC-국한된 사람 CD4+ 세포 클론의 항원 특이성은 자극이후 시간의 추이에 따라 점진적으로 증가한다. 이는 배양에서 적은 항원의 요구와 T-세포 활성화를 위한 항원-제시 세포(APC)당 펩티드-MHC 복합체의 감소된 수치 및 클래스 Ⅱ MHC 봉쇄로 확인된다(Lehaman et al., 1989). 항원 특이성에서 증가는 CD26,LFA-1, VLA-1의 세포-표면 발현을 수반하는 반면, TCR 및 일련의 다른 T-세포 표면 분자의 발현은 변화되지 않는 것으로 확인되었다(Falcioni et al., 1996). 또한, 본원 발명에서는 후기-기억 T-세포 표현형이 생체내에서 활성화된 T-세포에서 발생한다는 것을 입증하였다. 게다가, MHC 차단과 함께 적절한 mAb를 사용한 CD26 mAb 처리는 활성화된 기억 T-세포의 증식을 저해하는데 기여하는 것으로 확인되었다(Falcioni et al., 1996). 게다가, 항-CD26 mAb에 의한 T-세포 증식의 저해 효과의 분자 기전은 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제 및 MEK-ERK의 활성화에 의해 p21Cipl유도를 경유하는 것으로 밝혀졌다.
이에 더하여, CD26 분자는 막 지질 묶음에 존재하고, 따라서 CD26과 항-CD26 mAb의 가교-결합은 CD26 분자의 지질 묶음으로의 응집을 유도한다. 궁극적으로, 이런 과정은 신호 분자, 예를 들면 Cbl, ZAP-70, ERK, p56Lck, CD3-제타의 티로신 인산화를 통하여 T-세포의 활성화를 결과한다(Ishii et al., 2001). 또한, TCR은 다양한 표면과 세포질 어댑터 단백질의 지질 묶음으로의 동원을 통하여 신호전달 효과를 발휘한다(Janes et al., 1999; Cheukuri et al., 2001). TCR 신호전달의 네거티브 저해물질인 Rap1, Raf, Cbl-b는 지질 묶음에 응집하는 것으로 밝혀졌다(Boussiotis et al., 1997; Sewing et al., 1997; Leo and Schraven, 2001). 이런 현상과 관련하여, Raf-MEK-ERK 신호전달의 상승된 강도가 p21Cipl의 발현 증가와 연관된 G1/S 체크 포인트에서 세포 사이클 진행억제를 유도할 수 있다.한편, 고용량의 항-CD3 mAb는 Raf-MEK-ERK 경로를 활성화시키고 T세포에서 p21Cipl발현을 유도하며 p27Kipl발현의 하향조절을 하지 못하게 함으로써 세포 사이클 진행억제를 유도하였다(Sewing et al., 1997; Chen et al., 1999).
누적된 증거는 DPPIV 효소 활성이 CD26-매개된 T-세포 공동자극 및 T-세포 면역 반응에 필수적인 역할을 한다는 것을 암시한다(Morimoto and Schlossman, 1998; von Bonin et al., 1998; De Meester et al., 1999). 본원 발명에서는 DPPIV 효소 활성이 항-CD26 mAb 1F7로 T-세포를 처리한 이후 p21Cipl의 유도에 일정한 역할을 한다고 제시한다. CD26/DPPIV는 N-말단에서 선별된 케모킨을 절단함으로써 다양한 세포 기능을 조절하고 이들의 생물학적 기능을 변화시키는 것으로 보고되었다(De Meester et al., 1999; Oravecz et al., 1997; Proost et al., 1998). 세린 프로테아제로서 특정 생물학적 인자를 절단하는 능력에 비추어, CD26의 DPPIV 효소 활성은 T-세포에서 관련된 생물학적 인자의 절단을 통하여 ERK의 인산화 및 p21Cipl의 유도를 조절하는 것으로 보인다. p21Cipl의 발현을 조절하는 CD26/DPPIV-연관된 인자를 동정하는 실험을 계획한다.
1F7이 5F8보다 강력하다는 조사결과는 CD26의 선별된 에피토프의 연동이 mAb 처리이후 세포 사이클 진행억제를 조절하고 세포 증식을 저해하며 p21Cipl발현을 유도하는데 중요한 인자라는 것을 입증한다. 그 외에 주목할 점은 1F7이 강한 공동-유사분열 능력을 갖는 반면 5F8은 이런 활성을 갖지 않는다는 점이다(Dong et al.,1998). 따라서, CD26 분자에서 1F7과 5F8에 의해 인식되는 에피토프는 별개의 기능적 효과를 나타낸다.
활성화된 기억 T-세포는 높은 수준의 CD26을 발현하는데, 후기-기억 T-세포의 이런 표현형은 생체내와 시험관내에서 상승된 항원 감수성과 연관한다(Falcioni et al., 1996). 생체내 연구에서 다수의 CD26+ T-세포가 다발성 경화증과 류마티스 관절염 환자의 염증 조직에서 발견되는 것으로 드러났는데(Mizokami et al., 1996; Eguchi et al., 1989; Hafler et al., 1985), 이는 CD26+ T-세포가 주효체 T-세포로 기능한다는 것을 암시한다. 따라서, CD26은 면역요법제로 효과적이다. 실제로, 항-CD26 치료는 동종 골수 이식이후 스테로이드-저항성 급성 GVHD의 발병률을 감소시키는데 효과적인 것으로 보고되었는데(Bacigalupo et al., 1985; De Meester et al., 1993), 이런 임상적 결과에 관여하는 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않고 있다. 본 데이터는 CD26을 통해 활성화된 T-세포의 세포 사이클 조절이 세포 증식을 저해함으로써 급성 GVHD를 조절하는데 효과적이라는 것을 암시한다. p21 유전자의 트랜스펙션이 림프구 증식의 사이클로스포린 A-매개된 저해를 강화시킨다는 관찰결과(Ashwani et al., 2000)를 종합하면, 항-CD26 mAb 요법은 면역억제를 유도하는 대안적 전략, 다시 말하면 통상적인 작용제에서 현재 나타나고 있는 부작용보다 훨씬 적은 독성의 전략을 제공한다.
실시예 3
임상 시험
본 섹션은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 항-CD26 항체를 이용한 항암요법을 위한 사람 치료 프로토콜의 개발에 관계한다. 여기에서는 암 관련된 치료만 기술하지만, 본 실시예는 자가면역과 같은 면역 질환의 치료, GVHD, 장기 이식 거부 반응의 예방에도 적용가능하다.
환자 치료와 모니터링을 비롯한 임상 실험 실시에서 다양한 요소는 본 개시에 비추어 당업자에게 자명하다. 다음의 정보는 단독으로, 또는 임상 시험에서 암 요법에 일상적으로 이용되는 다른 부속 치료와 함께 항-CD26 항체 기초한 요법을 확립하는데 사용되는 전반적 가이드라인으로 제시한다.
임상 I기의 후보는 모든 통상적인 치료에 실패한 환자이다. 초기에는 대략 100명의 환자가 치료받게 된다. 이들의 연령은 16 내지 90(평균 65)세이다. 성별, 인종 또는 민족에 대한 선입견없이 환자를 치료하고 시료를 수득한다. 이런 환자 개체군에서 대략 41%는 여성, 6%는 흑인, 13%는 라틴 아메리카인, 3%는 다른 소수 민족이다. 이런 평가는 지난 5년동안 MD Anderson Cancer Center에서 진찰받은 환자에 기초한다.
최적으로는, 환자는 적절한 골수 기능(>1,000 ㎣의 말초 절대 과립구 개수 및 100,000/㎣의 혈소판 개수로 정의)(골수에 종양 침투로 인해 감소하지 않는다면), 적절한 간 기능(빌리루빈 ≤1.5 mg/dl, SGOT /SGPT< 정상의 4X 상한선), 적절한 신장 기능(크레아틴≤1.5 mg/dl)을 보인다.
연구 시료는 기존에 승인된 연구 계획 및 프로토콜하에 말초혈이나 골수로부터 수득한다. 연구 재료중 일부는 환자 치료의 일부로 채취된 견본으로부터 얻는다.
전술한 항-CD26 항체는 시험적으로 주 1회 환자에 국부적으로 또는 전신적으로 투여한다. 전형적인 치료 과정은 7 내지 21일 기간동안 대략 6회 투여로 구성된다. 임상의에 의한 선정후 섭생은 3주마다 또는 좀더 적은 빈도(매월, 격월, 연 4회 등)로 6회 투여를 지속한다. 물론, 이들은 전형적인 치료 기간이며, 다른 많은 시간-과정도 가능하다.
투여 양식은 근육내 주사 및/또는 종양 맥관구조, 기관지내, 척수강내, 내시경, 피하, 경피로 주사를 비롯한 국소 투여일 수 있다. 투여 양식은 정맥내, 동맥내, 복강내 및/또는 구강 투여를 비롯한 전신 투여일 수 있다.
항-CD26 항체는 1 ㎍/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위의 용량으로 정맥내 투여되는데, 정확한 용량은 후속 검사에 좌우된다. 일부 구체예에서, 항체는 리포좀 제형으로 또는 다른 인공 담체를 통하여 잠재적으로 투여된다. 항체는 CD26 발현 종양 세포와 마주친 직후에 활성화되는 불활성 성분으로 투여될 수도 있다. 가령, 항체의 리포좀 제형은 0.01 내지 100 ㎎/㎡/day의 용량으로 정맥내 투여된다. 물론, 당업자가 인지하는 바와 같이 이들 용량이 유용한 가이드라인을 제공하긴 하지만, 용량은 연령, 질병, 성별, 전신 상태(performance status) 등과 같은 개별적인 환자 인자를 고려하여 환자의 개별 요구에 따라 치료 시점에서 숙련된 의사에 의해 결정되고 조정된다. 이는 투여 방법, 투여 루트 등에도 적용된다.
질병 과정을 모니터하고 암세포 사멸을 평가하기 위하여, 환자는 매월 적절한 검사로 진찰한다. 약물의 효능을 평가하기 위하여, 의사는 암/종양의 유형에 따라 모니터할 파리미터를 결정하고 예로써 컴퓨터 단층(CT) 스캔, PET 스캔, 갈륨스캔, 세포 표면과 혈청에서 CD26 항언의 존재 탐지, 일부 경우에 다른 종양 마커, 예를 들면 전립선암에서 PSA(전립선 특이적 항원), 생식 종양(germ tumor)에서 HCG, 결장암에서 CEA, 난소암에서 CA125, 림프종에서 LDH와 B2 마이크로글로불린 등의 추가적인 탐지로 종양 덩어리 감소를 모니터한다. 환자의 진행 및 치료의 효능을 모니터하는데 이용되는 검사는 다음과 같다: 신체 검사, X-레이, 혈액 연구, 골수 연구, 다른 임상적 실험 방법. 임상 1기에 제공되는 용량은 1단계 임상 시험 기준에 따라 단계적으로 확대된다, 다시 말하면 용량은 최적 내약성 범위에 도달할 때까지 단계적으로 확대된다.
임상 반응은 수용가능한 단위로 정의될 수 있다. 가령, 완전 반응은 암세포의 완전한 소멸로 정의될 수 있고, 반면 부분 반응은 암세포 또는 종양 덩어리의 50% 감소로 정의될 수 있다.
전형적인 치료 과정은 당업자에게 공지된 방식으로 치료되는 개별 환자와 질병에 따라 달라진다. 가령, T-세포 림프종 환자는 4주 사이클로 치료될 수 있다. 치료 기간은 유사하게 변할 수 있는데, 환자에서 부작용이 관찰되지 않으면 치료 기간이 잠재적으로 좀더 길어지고 환자가 반응하지 않거나 견딜 수 없는 독성으로 고생하면 치료 기간은 좀더 짧아진다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본원 발명의 개시내용에 비추어, 과도한 실험이 실행될 수 있다. 본원 발명의 조성물과 방법이 바람직한 구체예의 측면에서 기술되었긴 하지만, 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법에서 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 다양한 개변이 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명하다. 좀더 구체적으로, 화학적으로ㆍ생리학적으로 관련된 특정 약물은 본원에서 밝힌 약물로 치환하여 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다. 당업자에게 자명한 이런 모든 치환과 개변은 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 본원 발명의 기술적 사상과 범주에 속한다.
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다음의 참고문헌은 본원에 순전히 참고로 한다.
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Claims (44)

  1. CD26을 발현하는 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 항-CD26 항체를 포함하는 제약학적 제형을 환자에 투여하는 단계로 구성되고, 상기 항-CD26 항체는 CD26에 결합하고 세포 사이클 진행을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 세포 사이클 억제를 탐지하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 항-CD26 항체는 다클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 항체는 재조합 생산된 CD26 단백질, CD26 융합단백질, 정제된 CD26 단백질, 부분적으로 정제된 CD26 단백질 또는 자연 발생 CD26 단백질을 대상으로 하여 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 항-CD26 항체는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 1F7, 5F8, 10F8A, 12E3B, 14D10, 2F9, 4G8, 11H9, 18H3A, 9C11 또는 16D4B인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 1F7인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 5F8인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 American Type Culture Collection(ATCC)에 수탁된 하이브리도마 HB 10297로부터 분비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 단클론항체는 인화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 항-CD26 항체는 공액되지 않은 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 항-CD26 항체는 화학치료제, 방사성핵종, 영상제, 독소, 생물학적 작용제, 효소 저해물질 또는 2차 항체에 공액되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 효소 저해물질은 아데노신 디아미나제 저해물질 또는 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ 저해물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 암은 T-세포암, B-세포암, 혈액암, 갑상선암, T-세포 림프종, 폐 선암종, 갑상선 암종, 흑색종, B-세포 림프종, 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 고환암, 자궁암, 뇌암, 림프암, 피부암, 골암, 직장암 또는 육종인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, T-세포암은 T-세포 림프종, 림프아세포성 림프종, 급성 림프아세포성 백혈병, T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 혈관중심성 T-세포 림프종, HTLV-관련된 T-세포 백혈병 또는 성인 T-세포 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, B-세포암은 B-세포 만성 림프성 백혈병 또는 B-세포 림프종인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 제 2 작용제로 환자를 치료하는 단계가 추가로 포함되고, 제 2 작용제는 치료 폴리펩티드, 치료 폴리펩티드를 인코드하는 핵산, 화학치료제, 면역치료제, 방사선치료제, 사이토킨, 케모킨, 활성화제 또는 생물학적 반응 변화인자인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 제 2 작용제는 항-CD26 항체와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 제 2 작용제는 항-CD26 항체와 상이한 시점에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 암은 환자에서 종양 형성으로 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 투여는 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 종양내, 근육내, 피하, 지주막하, 관절내, 경구, 피부, 비강, 협측, 직장 또는 질 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 암 세포에서 CD26 발현을 유도하고 항-CD26 항체를 포함하는 제약학적 제형을 환자에 투여하는 단계로 구성되고, 항-CD26 항체는 CD26에 결합하고 세포 사이클 진행을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 암 세포에서 CD26 발현의 유도는 상기 세포와 생물학적 인자를 접촉시켜 달성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 생물학적 인자는 사이토킨, 케모킨, 레티노이드, 인터페론, 화학치료제, 항체 또는 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 암 세포에서 CD26 발현의 유도는 세포를 화학작용제와 접촉시켜 달성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. CD26을 발현하는 암으로 고생하는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 항-CD26 항체를 포함하는 제약학적 제형을 환자에 투여하는 단계로 구성되고, 상기 항-CD26 항체는 CD26에 결합하고 암을 포함하는 세포의 성장을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 세포 성장의 저해를 탐지하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 종양 퇴행을 유도하는 방법에 있어서, 항-CD26 항체를 포함하는 조성물을 병든 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 종양 괴사를 유도하는 방법에 있어서, 항-CD26 항체를 포함하는 조성물을 병든 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. CD26+ 세포에서 p21 발현을 증가시키는 방법에 있어서, 세포와 항-CD26 항체를 접촉시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, CD26+ 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 암세포는 혈액암 세포, T-세포암 세포, B-세포암 세포, 갑상선암 세포, 유방암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 결장암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포, 간암 세포, 위암 세포, 고환암 세포, 자궁암 세포, 뇌암 세포, 림프암 세포, 피부암 세포, 골암 세포, 직장암 세포 또는 육종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, 암세포는 T-세포 림프종 세포, 폐 선암종 세포, 갑상선 암종 세포, 흑색종 세포, B-세포 만성 림프성 백혈병 세포 또는 B-세포 림프종 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, T-세포 림프종은 림프아세포성 림프종, 급성 림프아세포성 백혈병, T-세포 CD30+ 역형성 대세포 림프종, 말초 T-세포 림프종, T-세포 만성 림프성 백혈병, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 혈관중심성 T-세포 림프종, HTLV-관련된 T-세포 백혈병 또는 성인 T-세포 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 30 항에 있어서, 항-CD26 항체는 다클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 30 항에 있어서, 항-CD26 항체는 단클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 American Type Culture Collection(ATCC)에 수탁된 하이브리도마 HB 10297로부터 분비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 1F7, 5F8, 10F8A, 12E3B, 14D10, 2F9, 4G8, 11H9, 18H3A, 9C11 또는 16D4B인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 1F7인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 36 항에 있어서, 항-CD26 단클론항체는 5F8인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 36 항에 있어서, 단클론항체는 인화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 30 항에 있어서, 항-CD26 항체는 공액되지 않은 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 30 항에 있어서, 항-CD26 항체는 화학치료제, 방사성핵종, 영상제, 독소, 생물학적 작용제, 효소 저해물질 또는 2차 항체에 공액되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 효소 저해물질은 아데노신 디아미나제 저해물질 또는 디펩티딜 펩티다제 Ⅳ 저해물질인 것을 특징으로 하는 방법.
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