KR20040028968A - 혈관형성 억제, 항 종양 및 전 세포사멸 활성을 갖는레티노이드 유도체 - Google Patents

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Abstract

변경된 혈관형성을 특징으로 하는 병리상태의 치료에 유용한 약제로서, 및 항종양제로서 화학식 I의 화합물(여기에서 R, R', R", A 및 D는 본문에 개시된 의미를 갖는다)을 개시한다.

Description

혈관형성 억제, 항 종양 및 전 세포사멸 활성을 갖는 레티노이드 유도체{RETINOID DERIVATIVES WITH ANTIANGIOGENIC, ANTITUMORAL AND PROAPOPTOTIC ACTIVITIES}
비타민 A 및 그의 생물학적으로 활성인 유도체, 망막 및 레티노산은 시력에 중요한 역할을 하며, 생식계통에 필요하고, 태아가 성장하는 동안 형태발생 인자로서 작용하며, 유기체의 성장을 기초로 광범위하게 다양한 세포 유형의 성장과 분화를 조절한다(M. Sporn, A. Roberts, D. Goodman, The Retinoids, Raven Press, New York 1994). 레티노산과 그의 유도체의 생물학적 작용은 2 개의 군, 즉 첫 번째로 RAR(레티노산 수용체)이라 명명되는 것과 두 번째로 RXR(레티노이드 X 수용체)이라 명명되는 것에 속하는 핵 수용체들과의 상호작용에 의해 매개된다(P. Chambon, FASEB J., 1996, 10, 940-54]. 각각의 군은 3 개의 상이한 유전자들에 의해 암호화되는 3 개의 서브유형들(α,β,γ)로 나뉜다.
모든 트랜스-레티노산(ATRA)은 RAR과 RXR에 결합하는 반면, 9-시스 RA는 오직 RXR에만 결합한다.
레티노이드는 천연 비타민 A 동족체든 합성 비타민 A 동족체든지 간에 세포 증식, 분화 및 세포사멸에 큰 영향을 발휘하며; 이러한 성질들은 종양 및 피부 병리학, 및 변경된 혈관형성과 연계된 병리학의 억제에 활용되고 있다.
성인에서 혈관형성은 통상적으로는 무 활동이나, 예를 들어 상처의 치유 또는 여성의 생식 주기 중의 자궁내막의 재건에서는 정상적인 기능을 나타낸다.
혈관형성 반응은 혈관 기능이 감소되고 조직 관류가 부적합한 경우 생리적으로 자극된다.
보다 일반적으로는, 생리적 조건 하에서 혈관형성은 예를 들어 동맥 폐쇄의 경우, 조직 덩어리 성장의 상황(예를 들어 근육 조직의 형성을 수반하는혈관신생); 및 산소 및 영양소 요구의 증가와 관련하여 증가된 노동 부하의 경우, 산소 및 영양소의 감소된 공급 또는 부적합한 관류에 반응하여 양의 피드백을 구성함이 주장될 수 있다.
국소 빈혈의 경우에, 동맥의 부분적 또는 완전한 폐쇄로 인해, 관류를 유지시키기 위해서 측부혈관의 발달이 필요하다.
1 차 종양의 성장은 종양 조직의 양호한 혈관화에 의해 촉진됨이 널리 공지되어 있다. 적합한 산소와 영양소의 공급은 종양 자체의 급속한 성장을 촉진한다.
혈관형성의 정도는 종양의 예후에 매우 부정적인 인자일 수 있음이 입증되었다(van Hinsbergh VW, Collen A, Koolwijk P; Ann. Oncol., 10 Suppl., 4:60-3, 1999; Buolamwini JK; Curr. Opin. Chem. Biol., 3(4):500-9, 1999 Aug.).
또한 종양 세포 생물학의 기초 단계는 전이 능력의 획득임이 공지되어 있다.
전이에 의해 주변 구조에의 유착을 상실할 수 있는 종양 세포는 혈액과 림프관을 침범하여 자신을 계속해서 재생시킬 수 있는 거리에서 다른 조직에 군락을 형성한다.
전이는 또한 질병의 임상적인 병력에서 중대한 사건이며, 암으로 인한 사망의 주요 원인이다. 상기는 종양 부위 또는 인접 영역의 혈관 조직의 존재와 밀접한 관련이 있으며 이에 의해 촉진된다.
주변 조직을 통한 종양 세포의 이동은 세포들을, 기존의 것이든지 혹은 혈관신생에 의해 형성된 것이든지 간에 종양 내 혈관에 도달할 수 있게 하며, 따라서혈류에 도달할 수 있게 한다(Ray JM., Stetler-Stevenson WG; Eur. Respir. J., 7(11):2062-72, 1994; Stetler-Stevenson WG, Liotta LA, Kleiner DE Jr.; FASEB J., 7(15):1434-41, 1993 Dec.).
종양의 혈관 부분에서 림프관과 혈관간의 연통의 존재는 종양 세포가 상기 두 맥관계를 이동할 수 있게 한다.
최근의 연구는 혈관형성과 관절염 질환간의 직접적인 상관관계를 입증하였다(Koch AE; Arthritis and Rheumatism 41:951-962, 1998). 특히, 관절 연골의 혈관신생은 판누스의 형성과 관절염의 진행에 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났다. 정상의 연골은 혈관을 갖지 않지만, 관절염 환자의 활액은 내피세포에 의해 생성된 혈관형성 자극 인자(EASF)를 함유한다.
상기 인자의 존재는 혈관신생 및 연골의 퇴화와 관련이 있다.
다른 질환들도 또한 비정상적인 혈관형성과 관련된다.
당뇨성 망막병증[Histol. Histopathol. 1999 Oct; 14(4):1287-94], 건선[Br J.Dermatol. 1999 Dec; 141(6):1054-60], 만성 염증 및 죽상경화증[Planta Med. 1998 Dec; 64(8):686-95]에서, 감염된 조직의 혈관신생은 촉진 인자인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 혈관신생의 억제가 상기 질병들의 억제와 치유에 기본적인 요소들 중 하나이다.
암의 치료에 유용하거나 또는 혈관형성 억제 활성을 갖는 레티노이드들이 이미 공지되어 있다.
신세대 레티노이드에 속하는 화합물인 CD437(Cancer Research, 2002; 62(8), 2430-6; Blood, 2000; 95, 2672-82; Leukemia, 1999, 13, 739-49; Cancer Letters, 1999, 137, 217-2)은 RARγ에 선택적이며, 세포 성장을 억제하고 유방 암종, 흑색종 및 경부 암종 세포 주(ATRA-내성인 것들 포함)에서 독립적인 수용체 결합 기전으로 세포사멸을 유도한다(WO9703682; J. Med. Chem. 1995, 38, 4993-5006). CD437 및 다른 유도체, 예를 들어 시스-TTNPB 유도체(테트라메틸-테트라하이드로-나프탈레닐-프로페닐 벤조에이트)는 모두 새로운 세포사멸 유도 인자의 개발에 선두주자로 작용한다.
동시에, 합성을 통해 수득된 일부 레티노이드들, 예를 들어 TAC-101[Clin. Cancer Res. 1999, 5, 2304-10] 또는 유도체, 예를 들어 RE-80, AM-580 또는 Am-80(Eur. J. Pharmacol. 1993, 249, 113-6]은 혈관형성 억제 성질을 나타내었다.
최근 수년간에 이루어진 진보에도 불구하고, 종양 질환 및 비정상적인 혈관형성을 특징으로 하는 질환의 치료를 위한 새로운 약물의 발견에 관한 약물학적 연구가 여전히 가장 전도 유망한 분야의 하나로서 많은 의학 전문가들에게 고려되고 있다.
실제로, 지금까지 종양 질환 및 비정상적인 혈관형성에 의해 야기된 질환을 차단하거나 방해할 수 있는 새로운 화합물에 대한 필요성이 강하게 인식되고 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 질환들에는 종양, 종양 전이, 만성 염증, 관절염 질환, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증 및 죽상경화증이 있다.
본 발명은 하기 화학식 I의, 항 종양성 혈관형성 억제, 전 세포사멸성 소염 활성을 갖는 레티노이드 유도체에 관한 것이다:
상기 식에서,
R은 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 아다만틸을 나타내고, 여기에서 CH 중 하나 이상이 C-할로겐 또는 C-알킬로 치환될 수 있고 CH2중 하나가 O, S, CH-할로겐, CH-아릴, CH-헤테로아릴, CH-아릴알킬, CH-헤테로아릴알킬, CH-아미노로 치환될 수 있으며;
R'는 OR"', OCOR"', CORIV를 나타내고;
R'-D는 O-(CH2)n-O를 나타내고, 이때 n은 1 내지 3이고;
D는 H, OH, O-알킬, (CH2)n-NH2, (CH2)n-NH-알킬, (CH2)n-OH를 나타내고, 이때 n은 1 내지 4이고;
R"는 테트라졸, SO3H, NHSO3H, CHO, COOH, COO-알킬, CONHOH, CONH-아릴, CONH-C6H4OH, CH2OR"'; PO3H2; CO-(CH2)n-아릴을 나타내고, 이때 n은 0 내지 4이고;
R"'는 H, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, SO3H, α 또는 β D- 및 L-글리코실을 나타내고;
RIV는 H, OH, OR"'를 나타내고;
[A]는 [C(RVRVI)-C(RVIIRVIII)]n, [C(RIX)=C(RX)]n, [C≡C]n을 나타내고, 이때 n은 0 내지 3이고;
RV, RVI, RVII, RVIII는 H, 알킬, 할로겐, OH, OR"', NO2, NH2, 아릴, -O-, -CH2-, CX2-(이때 X는 할로겐이다), -CH(R"')-를 나타내고;
RIX, RX는 H, OH, 할로겐, 알킬, 아릴, CN, NO2, COOR"'를 나타낸다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 화학식 I의 화합물이 항종양, 전 세포사멸 및 혈관형성 억제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은 결코 이전에 개시된 적이 없다.
따라서 화학식 I의 화합물은 본 발명의 목적이다.
본 발명의 추가의 목적은 화학식 I의 화합물 및 의학 분야에서의 그의 용도이다.
본 발명의 추가의 목적은 화학식 I의 화합물 및 그의 제조 방법이다.
본 발명의 추가의 목적은 유효 성분으로서 화학식 I의 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 희석제를 함유하는 약학 조성물이다.
본 발명의 추가의 목적은 변경된 혈관형성과 관련된 병리 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 화학식 I 화합물의 용도에 관한 것으로, 이때 상기 병리 상태는 관절염 병리상태, 종양, 전이, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증 질환 및 죽상경화증을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 추가의 목적은 종양 치료용 약제의 제조를 위한 화학식 I 화합물의 용도에 관한 것으로, 이때 항종양 활성은 세포독성 성질 및/또는 세포사멸 성질 및/또는 혈관형성 억제 성질을 가지며; 상기 종양은 육종, 암종, 암양종, 골 종양, 신경내분비 종양, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 단핵구 백혈병, 거핵구 백혈병, 급성 전골수구 백혈병 및 호지킨병을 포함하는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 추가의 목적은 종양 전이의 예방 및 치료에 유용한 약제의 제조를위한 화학식 I 화합물의 용도에 관한 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 1 차 종양의 성장은 종양 조직의 양호한 혈관화에 의해 촉진되며, 상기 혈관신생의 정도는 종양의 예후에서 매우 불리한 인자일 수 있다. 실제로 종양 부위의 산소 및 영양소의 적절한 공급은 종양 자체의 급속한 성장을 촉진시킨다.
종양 치료를 위해 의사가 이용할 수 있는 치료 수단으로 여전히 많은 환자들이 상기 질병으로 죽는 것을 막을 수 없음은 널리 알려져 있다. 대부분의 종양 환자들을 단일의 항암 약물에 의해서가 아니라 다수의 항암제들을 복합 사용하여 치료함이 또한 알려져 있다. 항암제들의 복합 투여 필요성은 상기 항암제들이 일부의 경우에 상이한 대사 수준에서 작용함으로써 종양의 완전한 경감을 촉진시키고, 동시에 다른 경우에는 환자들의 수명을 연장시키고/시키거나 치료된 환자들의 삶의 질을 개선시킨다는 점에서 유래한다.
지금까지 공지된 항종양 화합물들과 함께 사용되는 신규 화합물에 대한 필요성이 여전히 강하게 인식되고 있다.
본 발명에 따른 화합물을 하나 이상의 항암약물들과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 하나 이상의 화학식 I 화합물과 하나 이상의 공지된 항암약물들과의 복합약으로, 이때 상기 항종양 화합물은 알킬화제, 국소이성화효소 억제제, 항튜불린제, 중격 화합물, 대사길항물질, 천연 산물, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, 효소, 탁산, 세포분화성 화합물, 포스포티로신 키나제 억제제, 예를 들어 이레사 또는 글리벡, TRAIL(종양 괴사 인자-관련된세포사멸 유도성 리간드), DR4 또는 DR5 수용체(TRAIL의 부위)의 작용물질, 면역학적 항종양 요법용 화합물, 항종양 백신, 및 인터페론 α, β, γ로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 추가의 목적은 하나 이상의 화학식 I 화합물을 하나 이상의 공지된 항암 약물 및 하나 이상의 약물학적으로 허용 가능한 부형제 또는 비히클과 함께 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 추가의 목적은 종양 치료제의 제조를 위한, 하나 이상의 화학식 I 화합물과 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 용도이다.
본 발명의 추가의 목적은 화학식 I의 화합물이 항암 화합물의 공동보조제로서 존재함을 특징으로 하는, 종양 치료제의 제조를 위한 하나 이상의 화학식 I 화합물과 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 용도이다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시한다.
화학식 I의 화합물을 미야우라-스즈키(Miyaura-Suzuki) 반응(Chem. Rev. 1995, 95, 2457-83)으로 하기 화학식 II의 화합물과 4-포르밀보론산을 반응시켜 하기 화학식 III의 알데히드를 수득함으로써 제조하였다:
(상기 식에서,
R, R' 및 D는 화학식 I에서 개시한 의미를 갖고,
X는 할로겐을 나타낸다)
R, R' 및 D가 앞서 개시한 의미를 갖는 화학식 III의 화합물을 문헌에 개시된 널리 공지된 과정에 따라 반응시켜[예를 들어, 위티히(Org. Reactions, Vol.14), 와즈워스-호르너-엠몬스(Wadsworth-Horner-Emmons, Org. Reactions, Vol.25), 크노에브나겔(Knoevenagel, Org. Reactions, Vol.15), 헨리(Henry, Houben-Wely, Methoden der organischen Chemie, Vol.10/1, p. 250), 다르젠스(Darzens, Org. Reactions, Vol.5) 등에 의한 반응들], [A]가C(RVRVI)=C(RVIIRVIII)을 나타내고, RV, RVI, RVII, RVIII가 H, 알킬, 할로겐, OH, OR"', NO2, NH2, 아릴, -O-를 나타내거나, 또는 [A]가 C≡C를 나타내는 화학식 I의 화합물들을 수득한다.
한편으로, 화학식 I의 화합물을 미야우라-스즈키에 따른 반응(Chem. Rev. 1995, 95, 2457-83)을 통해 하기 화학식 IV의 보론산과 화학식 II의 화합물로부터 제조할 수 있다:
상기 식에서,
A 및 R"는 앞서 개시한 의미를 갖는다.
한편으로, [A]가 C(RVRVI)=C(RVIIRVIII) 또는 C≡C를 나타내는 화학식 I의 화합물을 공지된 방법, 예를 들어 헥크(Heck, Org. Reactions, Vol.27)의 반응을 통해 금속 또는 유기금속 촉매의 존재 하에서 알켄 또는 치환된 알킨과 함께 하기 화학식 V의 화합물로부터 출발하여 제조할 수 있다:
상기 식에서,
R, R' 및 D는 앞서 개시한 의미를 갖는다.
한편으로, [A]가 C(RVRVI)=C(RVIIRVIII) 또는 C≡C를 나타내는 화학식 I의 화합물을 예를 들어 문헌[Charpentier et al., J. Med. Chem. 1995, 38, 4993-5006]에 개시된 바와 같이 촉매로서 황산 또는 다른 산의 존재 하에서 알콜, 예를 들어 아다만탄-1-올, 1-메틸-1-사이클로헥사놀, 3급-부타놀 등과의 알킬화 반응을 통해 화학식 I의 화합물(이때 R 및 D는 H이고, R'는 앞서 개시한 의미를 갖는다)로부터 출발하여 제조할 수 있다. 유사한 반응과 적합한 알콜을 사용하여 화학식 I의 화합물(이때 D는 H이고, R 및 R'는 앞서 개시한 의미를 갖는다)로부터 출발하여 화학식 I의 화합물들을 제조할 수 있다.
[A]가 C(RVRVI)-C(RVIIRVIII)를 나타내고 RV, RVIII가 -CH2-를 나타내는 화학식 I의 화합물을 문헌에 공지된 사이클로프로판화 반응, 예를 들어 시몬스-스미스(Simmons-Smith)의 반응 및 예를 들어 문헌[J. Am. Chem. Soc. 1959,81, 4256] 또는 [J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 5813]에 개시된 바와 같은 유사한 반응을 통해 [A]가 C(RVRVI)=C(RVIIRVIII)를 나타내는 화학식 I의 화합물로부터, 또는 에틸 디아조아세테이트와의 반응에 의해 A가 CH=CH2이고 R"가 H인 화학식 I의 화합물로부터 제조할 수 있다. [A]가 C(RVRVI)-C(RVIIRVIII)를 나타내고 RV, RVIII가 -O-를 나타내는 화학식 I의 화합물을 문헌에 공지된 에폭시화 반응을 통해, 예를 들어 문헌[Yang and colleagues, J. Org. Chem. 1995, 60, 3887-9]에 개시된 바와 같이 디옥시란 또는 동족체를 사용하여 [A]가 C(RVRVI)=C(RVIIRVIII)를 나타내는 화학식 I의 화합물로부터 제조할 수 있다.
[A]가 C-C를 나타내는 화학식 I의 화합물을 공지된 이중 또는 삼중 결합에 대한 환원 반응, 예를 들어 접촉 수소화를 통해 [A]가 C(RVRVI)=C(RVIIRVIII) 또는 C=C를 나타내는 화학식 I의 화합물로부터 제조할 수 있다.
R"가 CONHOH를 나타내는 화학식 I의 화합물을 하이드록삼산의 합성에 대해 문헌에 공지된 과정을 통해, 예를 들어 O-벤질하이드록실아민 및 축합제와의 반응[De Luca et al. J. Org. Chem., 2001, 66, 2534]에 이은 접촉 수소화를 통해, 또는 O-트리메틸실릴하이드록실아민과의 반응에 이은 탈실릴화를 통해 R"가 COOH를 나타내는 화학식 I의 화합물로부터 출발하여 제조할 수 있다.
R"가 CONH아릴을 나타내는 화학식 I의 화합물을 아미드의 합성에 대해 문헌에 공지된 과정을 통해, 예를 들어 레티노산 아미드에 대해 문헌[Sangmam, et al.,Synth. Commun., 1998, 28, 2945-58]에 개시된 바와 같이, R"가 COOH를 나타내는 화학식 I의 화합물로부터 제조할 수 있다.
R"가 CH2OH를 나타내는 화학식 I의 화합물을 알콜의 합성, 예를 들어 LiAlH4에 의한 환원에 대해 문헌에 공지된 과정을 통해, R"가 COOH를 나타내는 화학식 I의 화합물로부터 또는 그의 에스테르 또는 유도체로부터 출발하여 제조할 수 있다.
실시예 1
4-(3-(1-아다만틸)-4-3급-부틸디메틸-실릴옥시페닐)벤즈알데히드의 제조
표제 화합물을 하기와 같이 보고된 합성 반응식 1에 따라 제조하였다.
4-3급-부틸디메틸실릴옥시-3-(1-아다만틸)-브로모벤젠[Charpentier et al. J. Med. Chem., 1995, 38, 4993-5006] 1.56 g(3.70 밀리몰)을 톨루엔 7.5 ㎖에 용해시켰다. Na2CO32M 수용액 3.7 ㎖, 테트라키스-트리페닐포스핀-팔라듐 0.128 g(0.11 밀리몰), 및 에탄올 1.73 ㎖ 중의 4-포르밀벤젠보론산 610 ㎎(4.07 밀리몰) 용액을 가하였다. 상기와 같이 수득된 용액을 질소 흐름 하에서 2 시간 동안 환류시켰다. 이어서 상기 용액을 냉각시키고, 에틸 아세테이트로 용해시키고, NaCl포화 용액으로 세척하였다.
상들을 분리시키고, 유기 상을 여과하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 다시 여과하고, 용매를 증발시키고 잔사를 용출제로서 헥산:에틸 아세테이트(3:1)를 사용하여 실리카겔(Merck) 상에서 플래시 크로마토그래피시켰다.
표제 화합물 1.09 g을 수득하였다.
융점: 158 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 0.37(6H, s, -Si(CH)3)2; 1.05(9H, s, -t-Bu); 1.78(6H, s, 6Ad.); 2.09(3H, s, 3Ad.); 2.15(6H, s, 6Ad.); 6.88(1H, d, 1Ar, J=8.54 Hz); 7.35(1H, dd, 1Ar, J=2.24 Hz, J=8.54 Hz); 7.51(1H, d, 1Ar, J=2.24 Hz); 7.70(2H, d, 2Ar, J=8.14 Hz); 7.90(2H, d, 2Ar, J=8.14 Hz); 10.01(1H, s, -CHO).
실시예 2
메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-3급-부틸디메틸-실릴옥시페닐)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기와 같이 보고된 합성 반응식 2에 따라 제조하였다.
4-(1-3급-부틸디메틸실릴옥시-2-(1-아다만틸)페닐))-벤즈알데히드 386 ㎎(0.864 밀리몰)을 클로로포름 4.5 ㎖에 용해시키고, 메틸 트리페닐포스포라닐리덴아세테이트 298 ㎎(0.864 밀리몰)을 가하고 상기와 같이 수득된 용액을 3 시간 동안 환류시켰다. 상기 용액을 냉각시키고, 용매를 증발시키고, 이어서 용출제로서 헥산:CH2Cl2(1:1)를 사용하여 실리카겔(Merck) 상에서 플래시 크로마토그래피시켰다. 표제 화합물 350 ㎎을 수득하였다.
융점: 148 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 0.36(6H, s, -Si(CH)3)2; 1.05(9H, s, -t-Bu); 1.77(6H, s, 6Ad.); 2.08(3H, s, 3Ad.); 2.15(6H, s, 6Ad.); 3.80(3H, s, -OCH3); 6.44(1H, d, -CH=, J=16.07 Hz); 6.86(1H, d, 1Ar, J=8.54 Hz); 7.30(1H, dd, 1Ar, J=2.24 Hz, J=8.54 Hz); 7.47(1H, d, 1Ar, J=2.24 Hz); 7.50-7.70(4H, m, 4Ar); 7.71(1H, d, CH=, J=16.07 Hz).
실시예 3
메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 3에 따라 제조하였다.
트리에틸아민 1.2 ㎖ 중의 2-(1-아다만틸)-4-(4-브로모페닐)페놀 1 g(2.6 밀리몰), 메틸 아크릴레이트 358 ㎎(4.16 밀리몰), 팔라듐 아세테이트 5.8 ㎎(0.02 밀리몰) 및 트리-(o-톨릴)-포스핀 30 ㎎(0.1 밀리몰)의 혼합물을 4 시간 동안 환류시켰다. 상기 트리에틸아민을 증발시키고, 2N HCl 및 에틸 아세테이트로 용해시키고, 유기 상들을 분리시키고, 물로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고 용매를 증발시켰다. 생성물 640 ㎎을 수득하였다.
융점: >240 ℃.
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.75(6H), 2.1(9H), 3.72(s, 3H, OCH3), 6.63(d, 1H, J=16 Hz), 6.85(dd, 1H, J=8.8, 1.8 Hz), 7.3-7.4(2H, 방향족), 7.55-7.85(5H), 9.55(s, 1H, OH).
실시예 4
E-4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐)신남산(ST 1926)의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 4에 따라 제조하였다.
LiOH.H2O 42 ㎎(1 밀리몰)을 THF(테트라하이드로푸란):H2O(1:1) 8.2 ㎖에 용해시키고, 메틸 E-(4-(3-(1-아다만틸)-4-3급-부틸디메틸실릴옥시페닐)신나메이트 100 ㎎(0.2 밀리몰)을 가하고 상기와 같이 수득된 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반 하에 유지시켰다. 상기 THF를 증발시키고, 2N HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, Na2SO4상에서 건조시켰다. 이어서 여과 및 증발시키고, 용출제로서 헥산:에틸 아세테이트(2:3), 이어서 (1:1)을 사용하여 실리카겔(Merck) 상에서 플래시 크로마토그래피시켰다. 생성물 55 ㎎을 수득하였다.
융점: >240 ℃. Rf=0.50(Merck 실리카겔 60F254, EtOAc)
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.74(6H, s, 6Ad.); 2.04(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 6.51(1H, d, -CH=, J=16.81 Hz); 6.85(1H, d, 1Ar, J=8.82 Hz); 7.30-7.40(2H, m, 2Ar); 7.55-7.63(3H, m, 2Ar+CH=); 7.70(2H, d, 2Ar, J=8.09 Hz); 9.54(1H, s, -OH); 12.34(1H, brs, -COOH).
MS(m/z): 374(M+, 100).
실시예 5
메틸 4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)프로피올레이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 5에 따라 제조하였다.
메틸 4-브로모페닐프로피올레이트 301 ㎎(1.26 밀리몰)을 톨루엔 2.5 ㎖에 용해시키고, 2M Na2CO3수용액 1.34 ㎖, 이어서 Pd-테트라키스트리페닐포스핀 43.7 ㎎ 및 최종적으로 3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐보론산 398 ㎎(1.39 밀리몰)을 가하고, 혼합물을 3 시간 동안 환류시켰다. 조 생성물을 에틸 에테르에 용해시키고, 유기 상을 포화된 NaCl 용액으로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 증발 건고시켜 조 생성물 570 ㎎을 수득하였더. 용출제로서 헥산:에틸 아세테이트(2:1)를 사용하여 실리카겔(Merck) 상에서 플래시 크로마토그래피시켜 순수한 생성물 15 ㎎을 수득하였다.
융점: 175 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 3.86(s, 3H, OCH3), 3.90(s, 3H, OCH3), 6.96(d, 1H, J=8.5), 7.43(dd, 1H, J=2.2, 8.5), 7.47(d, 1H, J=2.2), 7.55, 7.70(4H 방향족).
실시예 6
4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)프로피올산(ST 1879)의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 6에 따라 제조하였다.
메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)프로피올레이트 15 ㎎(0.0374 밀리몰)을 메탄올 중의 0.7N NaOH 2.14 ㎖에 용해시키고, 혼합물을 1 시간 동안 환류시켰다. 메탄올을 증발시키고, 물에 용해시키고, 6N HCl로 산성화시키고, 에틸 에테르로 추출하였다. Na2SO4상에서 건조시키고 용매를 증발시킨 후에, 잔사를 헥산으로 세척하고, 이로부터 여과 후에 생성물 10 ㎎을 수득하였다.
융점: 156 ℃. Rf= 0.41(Merck 실리카겔 60F254, EtOAc/MeOH 2/1)
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.70(s, 6H), 2.10(s, 9H), 3.85(s, 3H, OCH3), 7.05(d,1H, J=8.4, H-6'), 7.40(d, 1H, J=2, H-2'), 7.45-7.60(3H 방향족), 7.65(2H 방향족).
실시예 7
메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)신나밀 알콜의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 7에 따라 제조하였다.
테트라하이드로푸란(0.365 밀리몰) 중의 LiAlH41M 용액 375 ㎕를 무수 테트라하이드로푸란 5 ㎖에 가하였다. 빙 욕에서 냉각 시 메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)신나메이트(실시예 19 참조) 151 ㎎(0.375 밀리몰)을 가하고, 저온에서 1 시간 동안 교반하고, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 빙 욕에서 냉각시키고, 10% NH4Cl 수용액 5 ㎖을 가하고, 테트라하이드로푸란을 증발시키고 이어서 에틸 아세테이트로 용해시켰다. 유기 상을 분리시키고 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 증발시킴으로써 조 생성물 126 ㎎을 수득하고, 이를 용출제로서 염화 메틸렌:헥산(3:1)을 사용하고, 이어서 다시 헥산:에틸 아세테이트(28:72)를 사용하여실리카겔(Merck) 상에서 크로마토그래피시켜 생성물 11 ㎎을 수득하였다.
융점: 148 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 1.75(s, 6H), 2.15(9H), 3.90(s, 3H, OCH3), 4.38(dd, 2H, J=6, 1.6), 6.41(dt, 1H, J=6, 16, =CHCH2OH), 6.67(dd, 1H, J=1.6, 16, 아릴CH=), 6.96(d, 1H, J=8.3, H-6'), 7.42(dd, 1H, J=2.2, 8.3, H-5'), 7.45(m, 2H, H-2 e H-6), 7.48(d, 1H, J=2.2, H-3'), 7.55(m, 2H, H-3 e H-5).
MS m/z 374(M+).
실시예 8
메틸 E-4-(4-하이드록시페닐)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 8에 따라 제조하였다.
트리에틸아민 3.7 ㎖ 중의 4-(4-브로모페닐)페놀 2 g(8.03 밀리몰), 메틸 아크릴레이트 1.1 g(12.8 밀리몰), 팔라듐 아세테이트 18 ㎎(0.08 밀리몰) 및 트리-(o-톨릴)포스핀 94 ㎎(0.31 밀리몰)의 혼합물을 6 시간 동안 환류시켰다. 추가로 팔라듐 아세테이트 6 ㎎ 및 트리-(o-톨릴)포스핀 30 ㎎을 가하고 1 시간 동안 가열하고, 이어서 팔라듐 아세테이트 30 ㎎ 및 디 트리-(o-톨루일)포스핀 94 ㎎을 가하고 3.5 시간 동안 가열하였다. 이어서 상기 반응물을 6M HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트를 가하고, 침전물이 용해되는 시간 동안 교반하고, 상들을 분리시키고, 유기 상을 Na2SO4상에서 건조시키고 용매를 증발시켰다. 조 생성물(934 ㎎)을 헥산/에틸 에테르에 용해시킴으로써 정제하고 여과하여 표제 생성물 1.7 g을 수득하였다.
융점: 233-235 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 3.70(s, 3H, OCH3), 6.13(d, 1H, CH=, J=16), 6.82(d, 2H, H-3' e H-5'), 7.48, d, 2H, H-2' e H-6'), 7.6-7.75(5H).
실시예 9
메틸 E-4-(3-(1-메틸사이클로헥실)-4-하이드록시페닐)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 9에 따라 제조하였다.
메틸 E-4-(4-하이드록시페닐)신나메이트 150 ㎎(0.6 밀리몰) 및 1-메틸-1-사이클로헥사놀 68.5 ㎎을 CH2Cl21.2 ㎖에 용해시키고, 농 H2SO40.032 ㎖로 처리하고 혼합물을 하루 동안 환류시켰다. 물을 가하고 혼합물을 포화된 중탄산 나트륨 용액으로 중화시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트로 수 회 추출하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 생성된 조 물질을 용출제로서 헥산:에틸 아세테이트(9:1)를 사용하여 실리카겔(Merck) 상에서 플래시 크로마토그래피시켜 생성물 20 ㎎을 수득하였다.
1HNMR(아세톤-d6) δ: 1.43(3H, s, -CH3); 1.4-1.9(8H, m, 사이클로헥산); 2.3-2.45(2H, m, 사이클로헥산); 3.80(3H, s, -OCH3); 6.60(1H, d, CH=, J=16.18 Hz); 7.0(1H, d, 1Ar, J=8.2 Hz); 7.44(1H, dd, 1Ar, J=8.2 Hz, 2.2 Hz); 7.65(1H, d, 1Ar, J=2.2 Hz); 7.7-7.85(5H, m, 4Ar+CH=); 8.65(1H, s, -OH).
실시예 10
2-(1-아다만틸)-4-브로모-6-N-프탈이미도메틸)페놀의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 10에 따라 제조하였다.
디클로로메탄 7 ㎖ 중의 2-아다만틸-4-브로모페놀 500 ㎎(1.63 밀리몰) 용액에 N-하이드록시메틸프탈이미드 289 ㎎(1.63 밀리몰) 및 2 방울의 농 H2SO4를 가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 환류시키고, 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 용매를 증발시키고 용출제로서 헥산:에틸 아세테이트(80:20)를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피시켜 생성물 348 ㎎(46%)을 수득하였다.
융점: 253 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 1.78(6H, s, 6Ad.); 2.09(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 4.76(2H, s, -CH2-); 7.28(1H, d, 1Ar, J=2.94 Hz), 7.45(1H, d, 1Ar, J=2.94 Hz); 7.76(2H, dd, 2Ar, J=2.94 Hz, J=5.52 Hz); 7.88(2h, dd, 2Ar, J=2.94 Hz, J=5.52 Hz); 8.13(1H, s, -OH).
실시예 11
메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-5-(N-프탈이미도메틸)-4-하이드록시페닐)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 11에 따라 제조하였다.
2-(1-아다만틸)-4-브로모-6-N-프탈이미도메틸)페놀 100 ㎎을 디옥산 1.6 ㎖에 질소 흐름 하에서 현탁시키고; 보로(비스스피나콜레이트) 59.7 ㎎, 무수 칼륨 아세테이트 63 ㎎, 디클로로(디페닐포스핀페로센)팔라듐 5 ㎎ 및 메틸 4-브로모신나메이트 103 ㎎을 가하였다. 이를 2 시간 동안 환류시키고, 에틸 아세테이트에 재 현탁시키고, 2M HCl 1 ㎖로 산성화시키고, 유기 상을 포화된 NaCl 용액으로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 용매를 증발시키고 헥산:에틸 아세테이트(65:35)를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피시켜 생성물 32 ㎎(27%)을 수득하였다.
융점: 216 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 1.78(6H, s, 6Ad.); 2.09(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 3.83(3H, s, -OCH3); 4.90(2H, s, -CH2-); 6.44(1H, d, CH=, J=16.18 Hz); 7.45-7.90(11H, m, 10 Ar+CH=); 8.22(1H, s, -OH).
MS(m/z): 547(M+, 100); 400(30); 160(30).
실시예 12
E-4-(3-(1-아다만틸)-5-(N-프탈이미도메틸)-4-하이드록시페닐)신남산의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 12에 따라 제조하였다.
메틸 E-(4-(3-(1-아다만틸)-5-(N-프탈이미도메틸)-4-하이드록시페닐)신나메이트 30 ㎎을 아세트산과 37% 염산의 3:1 혼합물 1 ㎖에 가하고 혼합물을 30 시간 동안 환류시켰다. 아세트산을 증발시키고 이어서 물로 용해시키고, 고체 잔사를여과하고 물로 세척하였다. 생성물 24 ㎎을 수득하였다.
융점: 216 ℃.
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.73(6H, s, 6Ad.); 2.04(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 4.81(2H, s, -CH2-); 6.45(1H, d, -CH=, J=16.18 Hz); 7.07(1H, d, 1Ar, J=1.84 Hz); 7.30(1H, d, 1Ar, J=1.84 Hz); 7.46(2H, dd, 2Ar, J=8.82 Hz, J=1.84 Hz); 7.53(1H, d, -CH=, J=16.18 Hz); 7.64(2H, dd, 2Ar, J=8.82 Hz, J=1.84 Hz); 7.78-7.94(4H, m, 4Ar); 8.60(1H, s, -OH); 12.5(1H, brs, COOH).
MS(m/z): 533(M+, 100); 386(40); 160(60); 130(50).
실시예 13
E-4-(3-(1-아다만틸)-5-(아미노메틸)-4-하이드록시페닐)신남산의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 13에 따라 제조하였다.
E-(4-(3-(1-아다만틸)-5-(N-프탈이미도메틸)-4-하이드록시페닐)신남산 20 ㎎을 메탄올 0.15 ㎖에 현탁시키고, 히드라진 수화물 0.013 ㎖을 가하고 혼합물을 50 ℃에서 5 시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시키고, 물에 재 현탁시키고, 2M HCl로 산성화시키고 침전물을 진공 하에서 여과하였다. 조 생성물을 건조시키고, 테트라하이드로푸란으로 처리하여 프탈릴히드라지드를 용해시키고 여과하였다.
융점: 195 ℃.
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.73(6H, s, 6Ad.); 2.04(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 4.00(2H, s, -CH2-); 6.45(1H, d, -CH=, J=16.18 Hz); 7.07-8.00(5H, m, 5Ar).
실시예 14
4-(7-아다만틸-1-일-벤조(1,3)디옥솔-5-일)벤즈알데히드의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 14에 따라 제조하였다.
4-아다만틸-1-일-6-브로모-벤조(1,3)디옥솔 0.875 g(2.61 밀리몰)을 톨루엔 5.2 ㎖에 용해시키고 Na2CO32M 수용액 2.6 ㎖, 테트라키스-트리페닐포스핀-팔라듐 0.090 g(0.08 밀리몰) 및 에탄올 1.2 ㎖ 중의 4-포르밀벤젠보론산 0.430 g(2.87 밀리몰) 용액을 가하였다. 이를 질소 기류 하에서 7 시간 동안 환류시켰다. 이를 냉각시키고 에틸 아세테이트에 용해시키고 포화된 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 용매를 증발시켰다. 용출제로서 헥산:에틸 아세테이트(9:1)를 사용하여 실리카겔(Merck) 상에서 플래시 크로마토그래피시킨 후에, 생성물 0.66 g(70%)을 수득한다.
1HNMR(CDCl3) δ: 1.80(6H, s, 6Ad.); 2.09(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 6.02(2H, s, -CH2-); 7.01(1H, d, 1Ar, J=1.86 Hz); 7.04(1H, d, 1Ar, J=1.86 Hz); 7.68(2H, d, 2Ar, J=8.19 Hz); 7.92(2H, d, 2Ar, J=8.19 Hz); 10.02(1H, s, -CHO).
실시예 15
메틸 E-4-(7-아다만틸-1-일-벤조(1,3)디옥솔-5-일)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 15에 따라 제조하였다.
CHCl34.5 ㎖ 중의 4-(7-아다만탄-1-일-벤조(1,3)디옥실-5-일)벤즈알데히드 300 ㎎ 용액을 질소 하에서 메틸 트리페닐포스포라닐리덴아세테이트 278 ㎎으로 처리하고 5 시간 동안 환류시키고, 3 시간 후에 일리드(20%)를 추가로 가하였다. 이 시기의 끝에서 용매를 증발시키고, 잔사를 용출제로서 헥산:디클로로메탄(45:55)으로 실리카겔 상에서 크로마토그래피시켜 생성물 298 ㎎을 수득하였다.
융점: 205 ℃.
1HNMR(CDCl3) δ: 1.72(6H, s, 6Ad.); 2.06(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 3.80(3H, s, -OCH3); 5.97(2H, s, -CH2-); 6.44(1H, d, -CH=, J=16 Hz); 6.95(1H, d, 1Ar, J=1.86 Hz); 6.98(1H, d, 1Ar, J=1.86 Hz); 7.52-7.58(4H, m, 4Ar); 7.71(1H, d, -CH=, J=16 Hz).
실시예 16
E-4-(7-아다만탄-1-일-벤조(1,3)디옥솔-5-일)-신남산의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 16에 따라 제조하였다.
메틸 E-4-(7-아다만탄-1-일-벤조(1,3)디옥솔-5-일)-신나메이트 200 ㎎(0.48)을 THF/H2O(3:2) 25 ㎖ 중의 LIOH.H2O 용액에 현탁시키고 실온에서 밤새 교반하에 유지시켰다. THF를 증발시키고, 카복실레이트 현탁액을 헥산으로 세척하고, 이어서 2N HCl로 산성화시키고 빙욕에서 냉각시켰다. 여과 후에 생성물 150 ㎎(78%)을 수득하였다.
융점: >300 ℃. Rf= 0.59(Merck 실리카겔 60F254, EtOAc/헥산 9/1)
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.72(6H, s, 6Ad.); 2.01(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 6.01(2H, s, -CH2-); 6.52(1H, d, -CH=, J=16.81 Hz); 6.99(1H, d, 1Ar, J=1.84 Hz); 7.14(1H, d, 1Ar, J=1.84 Hz); 7.60(1H, d, -CH=, J=16.18 Hz); 7.62(2H, dd, 2Ar, J=8.46 Hz, 1.84 Hz); 7.68(2H, dd, 2Ar, J=8.46 Hz, 1.84 Hz).
실시예 17
메틸 2-[4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐)]사이클로프로판카복실레이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 17에 따라 제조하였다.
로듐 테트라아세테이트 이수화물 0.5 ㎎ 및 에틸 디아조아세테이트 36 ㎕를 디클로로메탄 2 ㎖ 중의, 위티히 반응을 통해 상응하는 알데히드로부터 제조된 (3-아다만탄-1-일-4'-비닐비페닐-4-옥시)3급-부틸디메틸실란 150 ㎎ 용액에 가하였다. 상기 반응물을 총 5 ㎎의 촉매와 10 ㎕의 에틸 디아조아세테이트를 첨가하면서 실온에서 5 일간 방치시켰다. 촉매를 셀라이트를 통해 여과하고, 황산 나트륨 상에서 건조시키고, 증발시키고, 헥산:에틸 아세테이트(65:35) 혼합물로 실리카겔 상에서 크로마토그래피시켰다.
2 개의 디아스테레오머 시스 및 트랜스의 혼합물 43 ㎎을 수득하였다.
1HNMR(CDCl3) δ: 0.45(6H, s, -Si(CH3); 0.95(3H, t, -CH3, J=7 Hz); 1.1(9H, s, tBu); 1.25(3H, t, -CH3, J=7 Hz); 1.35-1.55(1H, m, 1 -CH2); 1.55-1.74(1H, m, 1 -CH2); 1.79(6H, s, 6Ad.); 1.95(1H, m, -CH-COOEt) 2.07(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s, 6Ad.); 2.48-2.65(1H, m, -CH-Ar); 3.85(2H, q, -OCH2, J=7 Hz); 4.18(2H, q, -OCH2, J=7 Hz); 6.82(1H, dd, 1Ar, J=1.84 Hz, 8.46 Hz); 7.15(1H, d, 1Ar, J=8.46 Hz); 7.25(2H, dd, 2Ar, J=8.0 Hz, 1.84 Hz); 7.45-7.50(3H, m, 3Ar).
실시예 18
시스 및 트랜스 2-(4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐))사이클로프로판카복실산의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 18에 따라 제조하였다.
미세하게 분쇄된 Al2O3(40%)상의 KF 113 ㎎을 디메톡시에탄 4.4 ㎖ 중의 메틸 2-[4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐)]사이클로프로판카복실레이트(110 ㎎) 용액에 가하고 실온에서 2 일간 교반하였다. 여과 후에, 용매를 증발시키고, 조생성물을 수 중의 50% 테트라하이드로푸란 12.4 ㎖ 중의 LiOH.H2O 63 ㎎ 용액에 가하였다. 이를 실온에서 3 일간 교반하고, 용매를 증발시키고, 에틸 에테르로 추출하고, 2M HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 증발시킨 후에, 생성물(58 ㎎)을 헥산:에틸 아세테이트(40:60)로 실리카겔 상에서 크로마토그래피시켰다. 6 ㎎의 트랜스-2-4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐)]사이클로프로판카복실산(융점 190 ℃), 10 ㎎의 디아스테레오머들의 혼합물 및 20 ㎎의 시스-2-[4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시페닐)]사이클로프로판카복실산을 수득하였다.
융점: 204 ℃. Rf= 0.23 시스; 0.44 트랜스(Merck 실리카겔 60F254, EtOAc/헥산 6/4)
1HNMR(MeOD) δ 트랜스: 1.45-1.50(1H, m, 1 -CH2); 1.60-1.65(1H, m, 1 -CH2); 1.95-2.0(7H, m, -CH-COOEt + 6Ad) 2.2(3H, s, 3Ad.); 2.35(6H, s, 6Ad.); 2.50-2.58(1H, m, -CH-Ar); 6.84(1H, d, 1Ar, J=8.46 Hz); 7.24(2H, dd, 2Ar, J=7.35 Hz, J=1.84 Hz); 7.31(1H, dd, 1Ar, J=8.46 Hz, 2.57 Hz); 7.42(1H, d, 1Ar, J=2.57 Hz); 7.52(2H, dd, 2Ar, J=7.35 Hz, J=1.84 Hz).
1HNMR(MeOD) δ 시스: 1.40-1.50(1H, m, 1 -CH2); 1.70-1.75(1H, m, 1 -CH2); 1.95-2.0(6H, s, 6Ad); 2.10-2.15(4H, m, 3Ad +-CH-COOH); 2.30(6H, s, 6Ad.); 2.70-2.78(1H, m, -CH-Ar); 6.83(1H, d, 1Ar, J=8.46 Hz); 7.30(1H, dd, 1Ar, J=8.46 Hz, 2.57 Hz); 7.38(2H, dd, 2Ar, J=7.30 Hz, J=1.84 Hz); 7.42(1H, d,1Ar, J=2.57 Hz); 7.49(2H, dd, 2Ar, J=7.30 Hz, J=1.84 Hz).
MS(m/z): 388(M+, 100); 135(50).
실시예 19
메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)신나메이트의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 19에 따라 제조하였다.
DMF 3.3 ㎖ 중의 NaH(광물성 오일 중의 60%, 66 ㎎, 2.74 밀리몰)의 현탁액에 N2하에서 메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-하이드록시신나메이트 969 ㎎(2.49 밀리몰)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 이어서 CH3I 186 ㎕(2.99 밀리몰)를 적가하였다.
반응물을 실온에서 밤새 방치시키고; 냉수 80 ㎖을 첨가한 후에 수성 상을 CH2Cl2(4 x 60 ㎖)로 추출하였다. 유기 층들을 물로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 생성물 972 ㎎을 수득하였다(97%).
1HNMR(CDCl3) δ: 1.75(6H), 2.1(9H), 3.75(s, 3H, OCH3), 3.80(s, 3H, -COOCH3); 6.40(d, 1H, CH=, J=16 Hz), 6.90(d, 1H, 1 Ar, J=8.8 Hz), 7.35(dd, 1H, 1Ar,J=8.8, 1.8 Hz); 7.42(d, 1H, 1 Ar, J=1.8 Hz); 7.48-7.53(m, 4H, 4 Ar); 7.65(d, 1H, CH=, J=16 Hz).
실시예 20
E-4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)신남산(ST 1898)의 제조
표제 화합물을 하기 합성 반응식 20에 따라 제조하였다.
LiOH.H2O 455 ㎎(10.8 밀리몰)을 THF:H2O(1:1) 90 ㎖에 용해시키고, 메틸 E-4-(3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐)신나메이트 873 ㎎(2.17 밀리몰)을 가하고 상기와 같이 수득된 용액을 실온에서 2 일간 교반 하에서 유지시켰다. THF를 증발시키고, 2N HCl로 산성화시키고 백색 침전물을 여과하였다. 고체를 AcOEt 및 Et2O로 세척하여 표제 화합물 792 ㎎(94%)을 수득하였다.
Rf= 0.28(Merck 실리카겔 60F254, EtOAc/헥산 9/1)
1HNMR(DMSO-d6) δ: 1.74(6H, s, 6Ad.); 2.04(3H, s, 3Ad.); 2.12(6H, s,6Ad.); 3.75(3H, s, -OCH3); 6.50(1H, d, -CH=, J=16 Hz); 6.98(1H, d, 1Ar, J=8.8 Hz); 7.40-7.70(7H, m, 6Ar + CH=); 12.3(1H, brs, -COOH).
종양 세포주에 대한 ST 1926의 세포독성
세포독성 시험을 수행하기 위해서, 2 개의 급성 전골수세포성 백혈병(APL) 세포 주를 사용하였다.
1. 세포 주 NB4, 융합 단백질 PML/RARα를 생성시키는 염색체 전좌 t(15;17)를 수반한다. 상기 세포 주는 약제 용량의 ATRA(10-7내지 10-6M)의 분화 작용에 매우 민감하다.
2. 세포 주 HL60, 세포 주 NB4에 비해 ATRA에 덜 민감하게 반응한다. 상기 세포 주는 상기 언급한 염색체 전좌를 수반하지 않는다.
이들 세포 주를 10% 송아지 태아 혈청(FCS) 및 1% 글루타민을 함유하는 RPMI 1640에서 유지시켰다.
충실성 종양들로부터 유래되는 상이한 세포 주들을 또한 사용하였다.
1. 인간 전립선 암종 PC3 및 DU145. 상기 세포 주를 10% FCS, 1% 나트륨 피루베이트 및 1% 글루타민을 함유하는 RPMI 1640에서 유지시켰다.
2. 인간 결장 선암종 LoVo. 상기 세포 주를 10% FSC 및 1% 글루타민을 함유하는 햄스(HAM's) F-12 배지에서 유지시켰다.
3. 인간 난소 암종, 예를 들어 A2780 및 A2780/Dx(각각 약물(독소루비신, 탁솔, 에토포시드, 빈크리스틴)에 대해 민감하고 내성이다); IGROV-1 및 IGROV-1/Pt(각각 백금계 화학요법에 민감하고 내성이다)를 10% FCS, 1% 나트륨 피루베이트 및 1% 글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
4. 인간 흑색종 MeWo 및 MeS 2.21, 아교모세포종 GBM, 비 소 세포 폐 암종 A431, NCI-H460, 골육종 SAOS 및 U2OS를 10% FCS, 1% 나트륨 피루베이트 및 1% 글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
세포 독성 시험들을 현탁액 중의 NB4 또는 HL-60 세포(10000/세포)를 사용하여 수행하였다. 상기 세포들을 96 웰 플레이트에서 250 ㎕의 부피로 시딩하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 다음 날, 시험 화합물 ST 1926[(2E)-3-[3'-(1-아다만틸)-4'-하이드록시[1,1'-비페닐]-4-일]-2-프로페노에이트/프로페노산]을 증가하는 농도로 가하고, 세포들을 5% CO2함유 가습 분위기 하에 37 ℃에서 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 세 번째 날에, 배지를 상기 플레이트를 1600 x g에서 10 분간 원심분리시켜 제거하고, 상등액을 버렸다. PBS 250 ㎕를 가하고; 이어서 상기 플레이트를 다시 1600 x g에서 10 분간 원심분리시키고 상등액을 버렸다. 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지 200 ㎕/웰을 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 추가로 48 시간 동안 배양하였다. 다섯번째 날에, 플레이트를 1600 x g에서 10 분간 다시 원심분리시키고, 배지를 상기 플레이트를 뒤집어 제거하고, PBS 200 ㎕ 및 저온의 80% TCA 50 ㎕를 가하였다. 이어서 플레이트를 얼음 상에서 1 시간 이상 배양하였다. TCA를 뒤집어 제거하고; 상기 플레이트를 증류수에 담가 3 회세척하고 먼저 종이 상에서, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 모든 웰에 1% 아세트산 중의 0.4% 설포로다민 B 200 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 추가로 30 분간 배양하였다. 설포로다민 B를 뒤집어 제거하고, 상기 플레이트를 1% 아세트산에 담가 3 회 세척하고, 이어서 먼저 흡수성 종이, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 100 mM 트리스 염기 200 ㎕를 모든 웰에 가하고 플레이트들을 20 분 이상 교반하였다. 광학 밀도를 540 ㎚에서 멀티스캔(Multiskan) 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.
유착된 세포에 대해서, 채택된 과정은 동일한 반면, 세 번째 날의 플레이트의 세척을, 뒤집은 다음 PBS를 3 회 첨가하고 1600 x g에서 원심분리시키지 않고 수행하였다. 또한 5 번째 날에, 상등액을 상기 플레이트를 뒤집어 제거하였다.
세포 생존을 ST1926과 함께 24 시간 동안 배양하고, 상기 화합물 제거 후 48 시간째에 측정하였다. 24 시간 동안 상기 생성물과 함께 배양하면 농도 의존적인 방식으로 세포 증식을 억제시킬 수 있었다. 표 1은 연구된 각 종양 세포 주에 대해 계산된 IC50 값(세포 생존을 50%까지 억제하는 생성물의 농도)을 나타낸다. ST1926은 다른 종양 주들에 대해 계산된 값들에 비해, 인간 전골수세포성 백혈병 종양 세포 주 NB4(IC50=0.022 μM)에 약 10 배 이상 큰 세포독성을 나타내었다.
ST1926의 세포독성
세포 주 IC50(μM)
전골수세포성 백혈병
NB4 0.02
HL-60 0.2
전립선 암종
PC3 0.21
DU145 0.10
결장 암종
LoVo 0.24
난소 암종
A2780 0.10
A2780/Dx 0.20
IGROV-1 0.23
IGROV-1/Pt 0.33
흑색종
MeWo 0.23
MeS2.21 0.23
아교모세포종
GBM 0.18
폐 암종
A431 0.25
NCI-H460 0.19
골육종
SAOS 0.25
U2OS 0.26
실시예 21
종양 세포 주기에 대한 ST1926의 효과의 평가
본 발명에 따른 화합물의 효과를 평가하기 위해서, 다양한 단계의 세포 주기에 대해 세포 형광측정에 의한 세포 주기 분석을 수행하였다.
HL60 또는 NB4 세포를 10% FCS 함유 RPMI 1640 배지에서 150.000 세포/㎖의 밀도로 플레이트 상에 시딩하고, 시험 화합물(ST 1926)을 가하고, 최적 이하 용량의 ATRA(NB4의 경우 5 내지 10 nM, HL60의 경우 0.5 μM)의 존재 또는 부재 하에 암실에서 0.1% DMSO 중에 0.01 내지 0.1 μM의 농도로 용해시키고, 3 일 동안 배양 배지를 바꾸지 않고 배양기에 두었다.
처리 3 일째에, 500.000 세포를 샘플링하고, 180 x g에서 5 분간 원심분리시키고, 칼슘 및 마그네슘 비 함유 PBS로 2 회 세척하였다. 세포(1 x 106/고정액 ㎖)를 -20 ℃에서 50%의 칼슘 및 마그네슘 비 함유 PBS에서 유지된 아세톤/메탄올(1:4, v/v)로 이루어진 고정액 혼합물로 1 시간 이상 고정시키고; 이어서 상기 세포를 원심분리시키고, 칼슘 및 마그네슘 비 함유 PBS로 세척하고, 다시 원심분리시키고 세척하였다. 세포 침전물을 암실, 실온에서 30 분간 프로피듐 요오데이트(100 ㎕/㎖) 200 ㎕ 및 RNAse(150 KU/㎎) 200 ㎕와 함께 배양하였다.
상기 샘플들을 나일론 필터(60 내지 80 ㎛ 직경)를 통해 여과시키고 세포 형광계 FACScan(Becton Dickinson)으로 분석하여, 488 ㎚의 여기 파장 및 620 ㎚의 방출 파장에서 20000 사건/샘플을 수득하였다. 세포 주기 단계의 백분율 분석을 전용 소프트웨어 패키지 Modfit v. 2.0(Becton Dickinson)을 사용하여 수행하였다.
전립선 암종 세포 PC3의 세포 주기 분석을 위해서, 세포들을 RPMI 배지에서 500000 세포/㎖의 밀도로 플레이트에 시딩하였다. 24 시간 동안 화합물 ST1926으로 처리한 후에, 세포들을 상술한 바와 같이 분석하였다.
실시예 21/1
인간 전골수세포성 백혈병 NB4 세포의 세포 주기에 대한 ST1926의 효과의 평가
NB4의 세포 주기에 대한 ST1926의 처리(3 일간) 효과의 분석은 본 발명에 따른 화합물이 0.08 내지 0.1 μM의 농도에서 상기 주기의 복제 S 단계에서의 성장정지 및 세포사멸을 유도함을 입증하였다. 수득된 결과를 표 2에 나타낸다.
NB4의 세포 주기에 대한 ST1926의 효과
처리 G0/G1 S G2+M 세포사멸
대조군 53.4 35.5 11.1 26.6
ST1926 0.01μM 48.4 38.8 12.8 19.9
ST1926 0.02μM 48.2 39.4 12.4 28.4
ST1926 0.04μM 51.3 35.7 13.0 33.9
ST1926 0.08μM 41.4 53.6 5.0 45.0
ST1926 0.1μM 50.6 46.1 3.3 53.6
실시예 21/2
인간 전골수세포성 백혈병 HL-60 세포의 세포 주기에 대한 ST1926의 효과의 평가
HL-60 세포에서 세포 주기에 대한 ST1926의 3 일간의 처리에 대한 효과의 분석은 0.5 및 1 μM의 농도에서, 세포 주기를 측정할 수 없으나 상기 화합물이 강한 전 세포사멸 효과를 나타냄을 보인다.
수득된 결과를 표 3에 나타낸다.
인간 전골수세포성 백혈병 HL-60 세포의 세포 주기에 대한 ST1926의 효과
처리 G0/G1 S G2+M 세포사멸
대조군 57.9 30.9 11.2 10.5
ST1926 0.0025μM 54.9 33.4 11.7 8
ST1926 0.005μM 53.4 34.4 12.2 14.0
ST1926 0.01μM 52.0 35.4 12.6 12.5
ST1926 0.05μM 45.0 42.0 13.0 13.0
ST1926 0.1μM 39.9 46.8 13.3 27.5
ST1926 0.5μM n.e. n.e. n.e. 82
ST1926 1μM n.e. n.e. n.e. 86.5
실시예 21/3
전립선 암종 PC3 세포의 세포 주기에 대한 ST1926의 효과
PC3의 세포 주기에 대한 ST1926의 24 시간 처리 효과의 분석은 처리 직후 시험 화합물이 조사된 최고 농도(0.4 μM)에서 세포사멸을 유도하고; 세포 회수 24 시간 후에, 세포들이 S 단계에서 축적되는 반면, 0.4 μ의 농도에서는 세포 사멸이 유도되었음을 나타내었다.
수득된 결과를 표 4에 나타낸다.
인간 전립선 암종 PC3 세포의 세포 주기에 대한 ST1926의 효과
처리 G0/G1 S G2+M 세포사멸
처리 24시간째 및 회수 0시간째
대조군 54.8 24.6 20.6 8
ST1926 0.02μM 54.0 24.2 21.8 9
ST1926 0.05μM 55.8 23.6 20.6 11
ST1926 0.1μM 52.0 35.4 28.0 10
ST1926 0.2μM n.v. n.v. n.v. 13.5
ST1926 0.4μM n.v. n.v. n.v. 25
처리 24시간째 및 회수 24시간째
대조군 49.9 31.8 22.3 10.5
ST1926 0.02μM 44.6 30.4 25.0 13
ST1926 0.05μM 44.9 29.5 25.6 15
ST1926 0.1μM 45.8 25.8 28.4 10
ST1926 0.2μM 31.8 43.2 25.0 13
ST1926 0.4μM n.e. n.e. n.e. 26
TRAIL(종양 괴사 인자-관련된 세포사멸 유발 리간드)과 병행된 ST1926의 생체 외 세포독성 활성
림프구는 자연 세포독성 세포와 함께 TNF 사이토카인 계열(종양 괴사 인자)의 일원인 TRAIL(종양 괴사 인자 관련된 세포사멸 유발 리간드) 생산을 초래한다. 상기 막 단백질은 광범위하게 다양한 형질전환된 세포에서 세포사멸을 유도하고 상기 계열의 다른 구성원들과 달리 생체 외에서 정상 세포에 세포독성인 것처럼 보이지 않는다. TRAIL은 2 개의 치사 도메인-함유 치사 수용체 DR4 및 DR5와 상호작용하여 세포사멸을 유도한다. 따라서, TRAIL은 종양 선택적인 세포사멸 유도 사이토카인이고 암 예방 및 치료에 전도유망한 새로운 후보인 것으로 고려된다(Neoplasia, 6:535-546, 2001).
TRAIL과 병행된 ST1926의 세포독성에 대한 연구가 2 개의 상이한 종양 세포 주, 예를 들어 M109 쥐 폐 암종 및 A2780/Dx 다중약물-내성 인간 난소 암종에서 수행되었다. 세포를 10% FCS, 1% 나트륨 피루베이트 및 1% 글루타민 함유 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다.
세포를 96 웰 플레이트에서 250 ㎕의 부피로 시딩하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 다음 날, 시험 화합물 ST1926[(2E)-3-[3'-(1-아다만틸)-4'-하이드록시[1,1'-비페닐]-4-일]-2-프로페노에이트/프로페노산] 또는 TRAIL을 증가하는 농도로 가하고, 세포들을 5% CO2함유 가습 분위기 하에 37 ℃에서 추가로 72 시간 동안 배양하였다. 다섯 번째 날에, 상기 플레이트를 뒤집어 상등액을 제거하였다. PBS 200 ㎕ 및 저온의 80% TCA 50 ㎕를 가하였다. 이어서 플레이트를 얼음 상에서 1 시간 이상 배양하였다. TCA를 뒤집어 제거하고; 상기 플레이트를 증류수에 담가 3 회 세척하고 먼저 종이 상에서, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 모든 웰에 1% 아세트산 중의 0.4% 설포로다민 B 200 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 추가로 30 분간 배양하였다. 설포로다민 B를 뒤집어 제거하고, 상기 플레이트를 1% 아세트산에 담가 3 회 세척하고, 이어서 먼저 흡수성 종이, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 100 mM 트리스 염기 200 ㎕를 모든 웰에 가하고 플레이트들을 20 분 이상 교반하였다. 광학 밀도를 540 ㎚에서 멀티스캔 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.
ST1926과 TRAIL간의 상호작용을 문헌[Drewinko et al. Cancer Biochem. Biophys. 1:187-195, 1976]의 분석을 사용하여 측정하였다.
상기 분석을 하기와 같이 수행하였다:
(SFaxSFb/Sfa+SFb)/100(여기에서 SFa는 ST1926의 생존 분율이고 SFb는 TRAIL의 생존 분율이다).
값들은 하기 효과를 나타낸다:
값 >1 상승작용, <1 길항작용, =1 효과 없음
2 개의 세포 주 모두에서, ST1926은 TRAIL과 상승 활성을 보였다(도 1 및 2).
쥐 폐 암종 모델 M109 및 3LL에서 ST1926의 항종양 활성
쥐 폐 선암종 매디슨(Madison) 109 세포(M109)를 종양 단편의 피하 통과에 의해 유지시켰다. 접종 일에, 세포 현탁액을 20 g 수컷 BALB/c 마우스의 왼쪽 뒷다리에 3 x 105세포/마우스의 밀도로 근육 내 주입하였다. 3LL 쥐 루이스 폐 암종을 C57BL/6J 마우스에서 1 x 105세포/마우스의 근육 내 통과(매 10 내지 14 일마다)에 의해 통상적으로 유지시켰다. 항종양 활성 실험을 위해서, 종양을 공여 마우스로부터 절제하여 기계적으로 탈분리시키고 효소적으로 절단한 후에 종양 세포 생존력을 트립판 블루 염색 배제 시험에 의해 평가하였다. 이어서 1 x 105세포/100 ㎕/마우스를 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 뒷다리 근육에 근육 내 주입하였다.
종양 치수를 덩어리가 만져지는 날로부터 매주 2 회 디지털 캘리퍼스(버니어 캘리퍼스)를 사용하여 측정하였다. 종양 덩어리를 2 개의 주요 치수(길이 및 너비)의 크기로부터 평가하고 ㎜로 나타내어 식(길이 x 너비2)/2, 즉 종양 부피 ㎣에 대입하였다. 매 실험 그룹에 대해 종양 부피의 억제율(TVI%)을, 대조군에 대한 것을 (100-(T/C%)로 하여 계산하였다. TVI를 ST1926 최종 투여 후 2 일째에 평가하였다.
평균 생존 시간(MST)을 또한 측정하고 평균 수명의 증가를 (MSTT/MSTC)x100-100으로 계산하여 ILS%(수명 증가)로서 나타내었다.
각 그룹에 대해 얻은, TVI 값과 생존시간 값간의 비교를 Instat 소프트웨어(GraphPad Inc.)를 사용하여 짝을 이루지 않은 데이터에 대한 비 매개변수 만 휘트니 시험으로 수행하였다.
ST1926 용액을 사용 직전에 제조하여 크레모포어:에탄올(1:1)에 용해시키고 후속적으로 완충염수 용액으로 1:4로 희석하였다. 동물들의 처리를 10 ㎖/㎏의 부피로 수행하였다. 상이한 용량의 ST1926에 대한 처리 계획은 종양 세포로 접종한 후 제 1 일에 시작하여 연속해서 5 일(qdx5)이었으며 3 주기간 반복하였다.
마우스(각 그룹에 대해 8 마리)를 먼저 약물 투여 기간 전체를 통해 관찰된 체중의 최종 변화를 기준으로 정확한 물질의 양을 투여할 수 있고, 또한 처리기간 전체를 통해 최대 체중 손실(BWL% 최대)을 기록할 수 있도록, 각 처리 전에 체중 측정하였다.
결과를 하기 표 5에 나타낸다. ST1926은 처리 프로토콜 qdx5x3w에 따라 10 ㎎/㎏(po) 및 15 ㎎/㎏(i.p.)의 용량에서 쥐 폐 종양 M109를 갖는 동물의 생존율의 증가를 나타내었고 종양 덩어리를 억제하는 것으로 나타났다.
더욱이, ST1926은 3LL-종양 함유 마우스의 수명을 10 ㎎/㎏(p.o.)의 용량에서 증가시켰고 종양 부피를 65%로 감소시켰다.
쥐 폐 M109 종양에 대한 ST1926(qdx5x3w)의 항종양 활성
처리 용량(㎎/㎏) BWL%최대 MST(날짜 범위) ILS% TVI%
M109
대조군 / 9 22(13-34) / /
ST1926 10, i.p. 9 *28(25-35) 27 18
ST1926 15, i.p. 10 **36(30-42) 64 *46
ST1926 10, p.o. 10 **35(27-42) 59 *49
3LL
대조군 / 3 21(15-33) / /
ST1926 10, po 7 *32(24-42) 52 ***65
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 대 대조군(만-휘트니).
인간 난소 암종 모델 A2780 및 A2780/Dx 및 인간 비 소세포 폐 암종 NCI-H460에서 ST1926의 항종양 활성
인간 난소 암종 세포 A2780, A2780/Dx 및 NCI-H460을 5% CO2함유 가습 분위기 하에 37 ℃에서 10% FCS, 2 mM 글루타민, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 세포들을 트립신 처리하고, 완전 배지에 수거하여 약 1100 rpm에서 10 분간 원심분리시키고 침전물을 행크스 199 배지에 재 현탁시키고; 상기 과정을 2 회 수행하였다. 세포를 행크스 199 배지에 20 x 106/㎖의 밀도로 재 현탁시키고 0.1 ㎖(2 x 106세포/마우스에 상당함)을 6 주된 CD1 nu/nu 암컷 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주입하였다.
ST1926 용액을 사용 직전에 제조하여 크레모포어:에탄올(1:1)에 용해시키고 후속적으로 완충염수 용액으로 1:4로 희석하였다. 동물들의 처리를 10 ㎖/㎏의 부피로 수행하였다. 상이한 용량의 ST1926에 대한 처리 프로토콜은 종양 세포 접종 후 제 1 일에 시작하여 연속해서 5 일(qdx5)이었으며 3 주기간 반복하였다.
종양 치수를 덩어리가 만져지는 날로부터 매주 2 회 디지털 캘리퍼스(버니어 캘리퍼스)를 사용하여 측정하였다. 종양 덩어리를 2 개의 주요 치수(길이 및 너비)의 크기로부터 평가하고 ㎜로 나타내어 식(길이 x 너비2)/2, 즉 종양 부피 ㎣에 대입하였다. 매 실험 그룹에 대해 종양 부피의 억제율(TVI%)을, 대조군에 대한 것을 (100-(T/C%)로 하여 계산하였다. TVI를 ST1926 최종 투여 후 2 일째에 평가하였다.
마우스를 대조군 종양이 2 g의 중량에 도달할 때까지 측정하고, 이어서 상기 마우스를 경부 탈구에 의해 죽였다.
각 그룹에 대해 수득된 TVI 값들간의 비교를 Instat 소프트웨어(GraphPadInc.)를 사용하여 짝을 이루지 않은 데이터에 대한 비 매개변수 만 휘트니 시험으로 수행하였다.
마우스를 먼저 약물 투여 기간 전체를 통해 관찰된 체중의 가능한 변화를 기준으로 정확한 물질의 양을 투여할 수 있고, 또한 처리기간 전체를 통해 최대 체중 손실(BWL% 최대)을 기록할 수 있도록, 각 처리 전에 체중 측정하였다.
결과를 표 6에 나타낸다. 또한 이 경우에 ST1926은 인간 난소 선암종 A2780, 다중약물-내성 A2780/Dx 및 인간 비 소세포 폐 암종 NCI-H460을 갖는 마우스에서 처리 프로토콜 qdx5x3w에 따라 15 내지 5 ㎎/㎏(po) 범위의 용량으로 종양 덩어리를 억제시켰다.
인간 난소 암종 A2780, A2780/Dx 및 비 소세포 폐 암종 NCI-H460에 대한 ST1926(qdx5x3w)의 항 종양 활성
처리 용량(㎎/㎏) BWL%최대 치사율 TVI%±SE
A2780
대조군 / 0 0/8 /
ST1926 5, p.o. 3 0/8 *34±8
ST1926 10, p.o. 5 0/8 *39±5
A2780/Dx
대조군 / 0 0/8 /
ST1926 10, po 0 0/8 *34±3
ST1926 15, po 6 0/8 *54±9
NCI-H460
대조군 /
ST1926 15, po 4 0/8 *40±2
*P<0.05 대 대조군.
ST1926은 qdx4x3w 스케줄에 따라 NCI-H460 비 소세포 폐 암종에서 탁솔(q7dx3 스케줄에 따라, 15 ㎎/㎏, ip)의 존재 및 부재 하에서 15 ㎎/㎏(po)의 용량에서 효능이 있는 것으로 나타났다(표 7).
탁솔(q7dx3)의 존재 및 부재 하에서 비 소세포 폐 암종 NCI-H460에 대한 ST1926(qdx4x3w)의 항 종양 활성
처리 용량(㎎/㎏) BWL%최대 치사율 TVI%±SE
대조군 / 3 / /
ST1926 15, p.o. 14 0/8 **38±8
탁솔 15, ip 4 0/8 0
1926 +탁솔 15, po15, ip 16 0/8 **°56±6
**P<0.01 대 대조군;°P<0.05 대 ST1926(만-휘트니).
ST1926은 qdx3x3w 스케줄에 따라, 15 ㎎/㎏의 용량으로 투여 시 현저한 항 종양 활성을 보였다(표 8).
비 소세포 폐 암종 NCI-H460에 대한 ST1926(qdx3x3w)의 항 종양 활성
처리 용량(㎎/㎏) BWL%최대 치사율 TVI%±SE
대조군 / 3 / /
ST1926 15, p.o. 4 0/8 **52±7
**P<0.05 대 대조군(만-휘트니).
소 부신 미소환상 내피(BMEC) 세포 주에 대한 ST1879의 세포독성
내피 세포 주 BMEC를 하기의 방식으로 새로운 소 부신으로부터 미리 준비하여 사용하였다. 동물들을 죽인 직후 부신을 회수하여 실험실에 도착할 때까지 얼음 중에서 보관하였다. 멸균 조건(Bio-Hazard 층류 후드)에서, 상기 부신을 베타딘 용액으로 5 분간 세척하고 후속적으로 2 ℓ의 멸균 PBS로 세척하였다. 이어서 상기 부신을 소독된 일회용 외과용 메스를 사용하여 약 2 ㎜의 단편들로 절단하고 PBS(부신 당 30 ㎖)를 함유하는 폴리스티렌 팔콘 튜브로 옮겼다. 4 ℃에서 냉장보관된 원심분리기에서 600 rpm에서 원심분리시킨 후에, 상등액을 경사분리시켰다.펠릿을 같은 부피(침전물의 부피에 대해)의 콜라게나제 A(Boehringer Mannheim)에 0.12%로 재 현탁시키고 37 ℃에서 교반 하에 2 시간 동안 배양하였다. 먼저 200, 이어서 100 메쉬의 필터(Sigma)를 통한 연속적인 여과에 이어서, 상등액을 15% DMEM FBS 용액에 가하여 콜라게나제 A의 작용을 억제시켰다. 상기 용액을 실온에서 1000 rpm에서 원심분리시키고 침전물을 20% FBS, 50 ㎍/㎖의 소 뇌 추출물(BBE), 50 ㎍/㎖의 헤파린(Sigma), 0.5% v/v의 젠타마이신(Sigma), 1% v/v의 L-글루타민을 함유하는 DMEM 배지에 재 현탁시키고 1%의 젤라틴(돼지 젤라틴 Sigma)에 의해 젤라틴화된 페트리 디쉬 상에 시딩시켰다. 합류에 도달하면, 세포를 내피 마커, 예를 들어 인자 VIII에 의해 특성화하였다.
세포독성 시험을 BMEC 세포를 사용하여 수행하였다. 세포를 96 웰 플레이트에서 200 ㎕의 부피로 시딩하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 다음 날, 시험 화합물 ST1879를 200 μM에서 1.56 μM로 감소하는 농도로 가하였다. 세포를 5% CO2함유 가습 분위기 하에 37 ℃에서 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 세 번째 날에, 배지를 플레이트를 뒤집어 제거하고 상기 세 번째 날에 상기 플레이트를 뒤집어 300 ㎕의 PBS를 4 회 가함으로써 세척을 수행하였다. 세척 후에, 앞서 개시된 젤라틴 상에의 도말에 사용된 배지 200 ㎕/웰을 가하였다. 다섯 번째 날에 상기 배지를 플레이트를 뒤집어 제거하고 세포를 저온 15% TCA 용액으로 1 시간 동안 처리하였다. 웰들을 플레이트를 침지시켜 물로 3 회 세척하고 뒤집어 제거하였다. 각 웰에 1% 아세트산 중의 0.4% 설포로다민 B 200 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 추가로 30 분간 배양하였다. 설포로다민 B를 뒤집어 제거하고, 플레이트를 1% 아세트산에 3 회 침지시켜 세척하고, 이어서 먼저 흡수성 종이 상에서, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 각 웰에 10 mM 트리스 염기 200 ㎕를 가하고 플레이트를 20 분 이상 동안 교반하면서 유지시켰다. 광학 밀도를 멀티스캔 분광 광도계를 사용하여 540 ㎚에서 측정하였다.
세포 생존을 ST1879와 함께 24 시간 동안 배양하고, 상기 화합물 제거 후 48 시간째에 측정하였다. 24 시간 동안 상기 생성물과 함께 배양하면 농도 의존적인 방식으로 세포 증식을 억제시킬 수 있었다. 표 5는 계산된 IC50 값(세포 생존을 50%까지 억제하는 생성물의 농도)을 나타낸다. ST1879는 105 μM에 상당하는 불충분한 세포독성과 25 μM(이는 나중에 내피 세포 이동에 대한 ST1879의 효과를 연구하는데 사용되었다)에 상당하는 무 독성 농도를 나타내었다(표 9 참조).
내피 세포에 대한 ST1879의 세포 독성
세포 주 IC50±SD(μM) IC0
BMEC 105±14 25 μM
내피 BMEC 세포 화학주성
내피 세포 화학주성에 대한 ST1879의 효과를 평가하기 위해서, 규정 기공 크기가 8 ㎛인 폴리카보네이트 필터에 의해 위, 아래로 분리된 2 개의 웰을 갖는 챔버로 이루어진 보이든(Boyden) 챔버를 사용하였다. 하부 웰에는 DMEM 중의 화학유인물질 인자 1% FBS를 도입시키고, 상부 웰에는 1% 지방산 비 함유 돼지 혈청 알부민을 함유하는 DMEM에 현탁된 소 신장 하부 미소환상 내피 세포(BMEC)를 도입시켰따. 상기 폴리카보네이트 필터를 통해 화학유인물질 인자의 방향으로 세포가 이동하는 것을 억제시키는 ST1879의 능력을 상기 필터의 하부면 상에 존재하는 세포의 수를 세어 정량적으로 평가하였다. 표 8에 보고된 이동 퍼센트를 식 (처리된 샘플-대조군/대조군) x 100에 따라 계산하였다. ST1926은 50 및 25 μM에 상당하는 농도에서 화학유인물질 자극제 FCS에 대한 BMEC 세포의 화학주성을 억제시키는 것으로 나타났다(표 10).
ST1879에 의해 유도된 BMEC 세포의 이동 억제
세포주 이동 억제%
50 μM 25 μM
BMEC 91%(6.1 세포 ± 2.4 대대조군 중의 72.1±7.4 세포) 42.7%(41.3 세포 ± 10.2 대대조군 중의 72.1±7.4 세포)
매트리겔 상에서의 HUVEC 세포의 분화에 대한 ST1879의 영향
매트리겔 상에서의 내피 세포의 분화 분석은 생성물의 혈관형성 억제 활성을 평가하는데 통상 사용되는 분석이다. 매트리겔은 종양들로부터 추출된 재 조성된 기본 막 추출물이며, 라미닌과 콜라겐 IV로 주로 이루어지고 이 위에서 내피 세포들이 모세관과 유사한 3 차원 구조를 조직한다. 네트워크 강도를 2 개 이상의 관상 구조가 분리되는 교차점으로서 규정되는 "결절"을 현미경에 의해 카운트하거나, 또는 모세관 구조가 차지하는 면적 퍼센트를 계산할 수 있는 컴퓨터화된 영상 시스템을 통해 측정할 수 있다.
4 ℃에서 매트리겔(Becton-Dickinson)을 24 웰 플레이트에 도말하고 배양기에서 37 ℃에서 30 분간 젤화시켰다. 인간 탯줄 도관 내피 세포 HUVEC(Clonetics)를 25 μM의 무 독성 농도로 ST1879의 존재 또는 부재 하에 배양 배지 500 ㎕에 재 현탁시키고 이를 매트리겔 상에 도말하였다. 배양 5 시간 후에, 세포를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 결과를 3 개의 독립적인 시야들에 대한 결절/시야의 수를 현미경에 의해 카운트하여 정량화하고 양성 대조군에 대해 백분율로서 나타내었다.
ST1879는 25 μM의 농도에서 매트리겔 상의 내피 세포 분화를 61% 억제하는 것으로 나타났다(표 11).
ST1879에 의해 유도된 HUVEC 세포의 분화 억제
세포 주 매트리겔 상에서의 분화 억제%
HUVEC ST1879(25 μM) = 61%(결절 8.2 대 대조군의 결절 21.2)
인간 종양 세포 주에 대한 ST1879 및 ST1898의 세포 독성
인간 급성 전골수세포성 백혈병 세포 주 NB4를 사용하여 세포독성 시험을 수행하였으며, 10% 송아지 태아 혈청(FCS) 및 1% 글루타민을 함유하는 RPMI 1640에서 유지시켰다.
추가로 2 개의 충실성 종양 세포 주를 또한 사용하였다:
1. 인간 전립선 암종 PC3.
상기 세포 주를 10% FCS, 1% 나트륨 피루베이트 및 1% 글루타민을 함유하는RPMI 1640에서 유지시켰다.
2. 인간 결장 선암종 LoVo.
상기 세포 주를 10% FSC 및 1% 글루타민을 함유하는 햄스 F-12 배지에서 유지시켰다.
세포독성 시험을 10000 NB4 세포/웰을 사용하여 수행하였다. 상기 세포를 96 웰 플레이트에서 250 ㎕의 부피로 시딩하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 다음 날 시험 화합물 ST1879를 증가하는 농도로 가하고, 세포를 5% CO2함유 가습 분위기 하에 37 ℃에서 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 세 번째 날에, 배지를 상기 플레이트를 1600 x g에서 10 분간 원심분리시켜 제거하고, 상등액을 버렸다. PBS 250 ㎕를 가하고; 이어서 상기 플레이트를 다시 1600 x g에서 10 분간 원심분리시키고 상등액을 버렸다. 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지 200 ㎕/웰을 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 추가로 48 시간 동안 배양하였다. 다섯 번째 날에, 상기 플레이트를 다시 1600 x g에서 10 분간 다시 원심분리시키고, 배지를 상기 플레이트를 뒤집어 제거하고, PBS 200 ㎕ 및 저온의 80% TCA 50 ㎕를 가하였다. 이어서 플레이트를 얼음 상에서 1 시간 이상 배양하였다. TCA를 뒤집어 제거하고; 상기 플레이트를 증류수에 담가 3 회 세척하고 먼저 종이 상에서, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 각각의 웰에 1% 아세트산 중의 0.4% 설포로다민 B 200 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 추가로 30 분간 배양하였다. 설포로다민 B를 뒤집어 제거하고, 상기 플레이트를 1% 아세트산에 3 회 담가 세척하고, 이어서 먼저 흡수성 종이, 이어서 고온 공기 제트로 건조시켰다. 각각의 웰에 100 mM 트리스 염기 200 ㎕를 가하고 플레이트들을 20 분 이상 교반하였다. 광학 밀도를 540 ㎚에서 멀티스캔 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.
유착된 세포 주 PC3 및 LoVo에 대해서, 사용된 과정은 동일한 반면, 세 번째 날의 플레이트의 세척을, 뒤집은 다음 PBS를 3 회 첨가하고 1600 x g에서 원심분리시키지 않고 수행하였다. 또한 5 번째 날에, 상등액을 상기 플레이트를 뒤집어 제거하였다.
세포 생존을 ST1879 또는 ST1898과 함께 24 시간 동안 배양하고, 상기 화합물 제거 후 48 시간째에 측정하였다. 상기 생성물을 48 시간 동안 배양하는 것은 농도 의존 방식으로 세포 증식을 억제하기에 충분하였다. 표 10은 연구된 각 종양 세포 주에 대해 계산된 IC50 값(세포 생존을 50%까지 억제하는 생성물의 농도)을 나타낸다. ST1879는 전립선 암종 주 PC3(IC50=13.6 μM) 및 인간 전골수세포성 NB4 주(58.5 μM)에 대해 계산된 값들에 대해 보다 큰 세포독성을 나타내었다. ST1898도 또한 결장 암종 LoVo에 대해 보다 활성이 있는 것으로 나타났다(표 12 참조).
ST1879 및 ST1898의 세포 독성
시험 화합물 세포 주 IC50±SD(μM)
ST1879 NB4 58.5±3.2
ST1879 PC3 13.6±2.1
ST1879 LoVo 5.2±0.9
ST1898 NB4 8.8±0.6
ST1898 PC3 1.7±0.2
ST1898 LoVo 0.38±0.02
NB4 세포에 대한 ST1879 및 ST1898의 전 분화 효과
NB4 세포를 10% 태아 혈청 함유 RPMI 1640에 150000 세포/㎖의 밀도로 도말하였다. 이어서 세포를 0.4 μM에서 시작하여 0.01 μM로 감소하는 농도로 ST1879 또는 ST1898로 처리하고 배지의 어떠한 변화도 없이 3 일간 배양기에 두었다. 분화 효과를 측정하기 위해서, 각 샘플로부터 500000 세포를 수거하고, 원심분리시키고 10% 혈청, 1 ㎎/㎖의 니트로블루 테트라졸륨(NBT) 및 100 ng의 PMA(포르볼 미리스틸 아세테이트)를 함유하는 RMPI 1640 배지 1 ㎖에 재 현탁시켰다. 상기와 같이 재 현탁시킨 세포를 37 ℃에서 60 분간 배양하였다. 배양의 끝에서, 세포를 원심분리시키고 침전물을 10% 트리톤 x 100 함유 PBS 1 ㎖에 재 현탁시켰다. 샘플을 용해될 때까지 초음파처리하고 이어서 540 ㎚의 파장에서 분광 광도계로 판독하였다. 분화된 세포를 함유하는 세포는 자줏빛으로 변한 반면, 대조용 샘플 및/또는 분화된 세포가 없는 샘플은 백색 혹은 훨씬 덜 진한 색을 유지하였다. ST1879 또는 ST1898의 전 분화 작용을 하기 나타내는 바와 같이 AC50(50% 세포 분화에 대한 활성화 농도)의 항으로 평가하였다. ST1898은 19 nM에 상당하는 AC50 값에 의해 측정가능한 양호한 전 분화 능력을 갖는 것으로 나타났다(표 13 참조).
NB4 세포에 대한 ST1879 및 ST1898의 전 분화 효과
생성물 AC50(nM±SD)
ST1879 55±9
ST1898 19±0.8
병아리 융모막요막(CAM) 모델에서 ST1879, ST1926 및 ST1898의 혈관정지 활성
병아리 융모막요막은 발생 4 일째에 혈관이 나타나고, 발생 8 일째까지 동정맥계가 발달하며 11 일째까지 활발하게 증식하는 매우 혈관화된 막이다.
본 연구의 목적은 기본 조건 하에 혈관증식 유도인자 bFGF(기본 섬유아세포 성장 인자)의 존재 하에서 CAM의 혈관 발달을 이해하는 것이었다. 본 연구는 발생 초기 단계의 병아리 배아 란을 사용하였다. 발생 3 일째에, 껍질에 구멍을 뚫어 CAM의 혈관을 가시화시켰다. 약 1 ㎣의 멸균 젤라틴 단편(GELFOAM Pharmacia-Upjohn)을 CAM 표면에 적용시킴으로써 발생 9 일째에 처리제를 투여하여, 상기 표면 위로 3일 연속해서 bFGF(50 ng/배아) 또는 관심 생성물을 투여하였다.
혈관 증식에 대한 상기 분자의 효과를 0 시간째 처리와 이후 시간들(12 일)과의 비교에 의해 평가하였다.
결과를 하기 표 14에 나타낸다. 3 개의 생성물은 0.25 내지 0.5 ㎍/태아의 농도에서 병아리 융모막요막 모델에서 혈관정지 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 14).
ST1879, ST1926, ST1898의 혈관정지 활성
처리 농도(㎍/태아) n 제 9 일(T0) 제 12 일(72 시간) Δ혈관
bFGF 0.05 7 5±1 19±1 15±1
bFGF+1879 0.05+0.5 6 4±1 8±1 4±1(-73%)
bFGF 0.05 6 3±1 22±1 19±1
bFGF+1926 0.05+0.25 8 3±1 12±2 9±2(-53%)
bFGF 0.05 4 3±1 28±2 24±1
bFGF+1898 0.05+0.25 6 3±1 10±1 7±1(-71%)
결과는 스펀지 당 혈관 수의 평균±SE이다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식 I의 화합물:
    화학식 I
    상기 식에서, R은 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 페닐, 치환된 페닐, 아다만틸을 나타내고, 여기에서 CH 중 하나 이상이 C-할로겐 또는 C-알킬로 치환될 수 있고 CH2중 하나가 O, S, CH-할로겐, CH-아릴, CH-헤테로아릴, CH-아릴알킬, CH-헤테로아릴알킬, CH-아미노로 치환될 수 있으며;
    R'는 OR"', OCOR"', CORIV를 나타내고;
    R'-D는 O-(CH2)n-O를 나타내고, 이때 n은 1 내지 3이고;
    D는 H, OH, O-알킬, (CH2)n-NH2, (CH2)n-NH-알킬, (CH2)n-OH를 나타내고, 이때 n은 1 내지 4이고;
    R"는 테트라졸, SO3H, NHSO3H, CHO, COOH, COO-알킬, CONHOH, CONH-아릴, CONH-C6H4OH, CH2OR"'; PO3H2; CO-(CH2)n-아릴을 나타내고, 이때 n은 0 내지 4이고;
    R"'는 H, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, SO3H, α 또는 β D- 및 L-글리코실을 나타내고;
    RIV는 H, OH, OR"'를 나타내고;
    [A]는 [C(RVRVI)-C(RVIIRVIII)]n, [C(RIX)=C(RX)]n, [C≡C]n을 나타내고, 이때 n은 0 내지 3이고;
    RV, RVI, RVII, RVIII는 H, 알킬, 할로겐, OH, OR"', NO2, NH2, 아릴, -O-, -CH2-, CX2-(이때 X는 할로겐이다), -CH(R"')-를 나타내고;
    RIX, RX는 H, OH, 할로겐, 알킬, 아릴, CN, NO2, COOR"'를 나타낸다.
  2. 제 1 항의 화학식 I의 화합물 및 의학 분야에서 그의 용도.
  3. 유효 성분으로서 화학식 I의 화합물 및 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  4. 변경된 혈광형성과 관련된 병리상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 화학식 I 화합물의 용도.
  5. 제 4 항에 있어서, 병리상태가 관절염 질환, 종양, 전이, 당뇨성 망막병증, 건선, 만성 염증 및 죽상경화증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 병리상태가 당뇨성 망막병증인 용도.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 병리상태가 건선인 용도.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 병리상태가 만성 염증 질환인 용도.
  9. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 병리상태가 죽상 경화증인 용도.
  10. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 관절염 질환의 치료를 위한 용도.
  11. 항종양 활성을 갖는 약제를 제조하기 위한 화학식 I 화합물의 용도.
  12. 제 11 항에 있어서, 항종양 활성이 세포독성 성질을 갖는 용도.
  13. 제 11 항에 있어서, 항종양 활성이 세포사멸 성질을 갖는 용도.
  14. 제 11 항에 있어서, 항종양 활성이 혈관형성 억제 성질을 갖는 용도.
  15. 종양 전이의 예방 및 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한 화학식 I 화합물의 용도.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 육종, 암종, 암양종, 골 종양, 신경내분비 종양, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 단핵구 백혈병, 거핵구 백혈병 및 호지킨병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  17. 제 16 항에 있어서, 종양이 만성 전골수구성 백혈병인 용도.
  18. 하나 이상의 화학식 I 화합물과 하나 이상의 공지된 항암 약물로 이루어진 복합약.
  19. 제 18 항에 있어서, 항암 약물이 알킬화제, 국소이성화효소 억제제, 항튜불린제, 중격 화합물, 대사길항물질, 천연 산물, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, 효소, 탁산, 세포분화성 화합물, 포스포티로신 키나제 억제제, 예를 들어 이레사 또는 글리벡, TRAIL(종양 괴사 인자-관련된 세포사멸 유도성 리간드), DR4 또는 DR5 수용체(TRAIL의 부위)의 작용물질, 면역학적 항종양 요법용 화합물, 항종양 백신 및 인터페론 α, β, γ로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 복합약.
  20. 제 18 항의 복합약 및 약물학적으로 허용 가능한 하나 이상의 부형제 또는 비히클을 포함하는 약학 조성물.
  21. 종양 치료용 약제의 제조를 위한 하나 이상의 화학식 I 화합물과 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 용도.
  22. 화학식 I의 화합물이 항암 약물의 공동 보조제로서 존재함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제의 제조를 위한 하나 이상의 화학식 I 화합물과 하나 이상의 공지된 항암 약물과의 용도.
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