KR20040010656A - 분리장치를 위한 이미징 수단 - Google Patents

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KR20040010656A
KR20040010656A KR10-2003-7015396A KR20037015396A KR20040010656A KR 20040010656 A KR20040010656 A KR 20040010656A KR 20037015396 A KR20037015396 A KR 20037015396A KR 20040010656 A KR20040010656 A KR 20040010656A
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spots
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KR10-2003-7015396A
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브린에드먼드조셉
존스로널드
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프로테옴 시스템즈 인텔렉츄얼 프라퍼티 피티와이 엘티디.
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Abstract

스캐너는 X 축과 Y 축을 따라서 X,Y 이동하기 위하여 가동하도록 장착된 머신헤드를 포함하며, 집적화되고 자동화된 겔 분리 및 샘플처리장치의 일부를 구성하는, 레일 상에서 이동하는 스캐닝헤드가 그 밑에서 가동하는 유리플레이트를 가진다.
절단헤드가 Z 축 상에서 상,하 이동가능하도록 장착된다. 일련의 4 개의 기준으로 알려진 십자선(22)이 플레이트 상의 겔의 스캔된 이미지와 중첩되도록 유리플레이트의 각 모서리 하면에 정의되어 있다. 따라서 스캔된 이미지는 배열 내의 스팟을 위한 참조점을 가진다. 그레이스케일 카드(24)는 그 휘도와, 각 이미지 내의 적,녹,청과 같은 색상에 적용될 수 있는 반사 밀도가 알려진 겔의 이미지를 따라서 함께 스캔되고 이미지 대 이미지, 스캐너 대 스캐너로 절대 명암도 값이 비교되도록 배열 내에서의 각 스팟의 명암도를 해석하기 위하여 사용된다. 장치는 또한 배열 내의 적어도 하나의 스팟이 작업을 위한 최적의 작업영역, 특히, 스팟 주변에 영향을 미침이 없이 겔로부터 하나의 스팟을 절단하기 위한 최적장소를 정의한다.

Description

분리장치를 위한 이미징 수단{Imaging means for excision apparatus}
데스크톱형 스캐너는 사진과 문서 등과 같은 것을 전자적인 형태로 변환하기 위한 가장 대중적이고도 저렴한 주변기기이다. 대부분의 데스크톱형 스캐너는 스캔되어질 대상물이 놓여지는 유리시트를 가진다. 유리시트 아래에는, 전형적으로는 치형이 형성된 고무벨트를 사용하는 벨트드라이브 등과 같은 것으로 레일이나 한 쌍의 레일을 따라서 구동되는 동안, 유리를 통하여 스캔대상을 스캔하는 스케닝헤드가 놓여진다.
그러나, 시간이 경과함에 따라서 치형이 형성된 고무벨트는 신장하는 경향이 있고 스캐닝의 정확도가 저하된다. 새 것의 경우에도 스캐너의 정확도는 좋지 못하다.
동일한 사진이 데스크톱형 스캐너 상에서 수 회 스캔되면, 사진 상의 그림의 위치는 300 내지 600 dpi 사이의 해상도를 가지는 전형적인 스캐너에서는 ± 9 픽셀 움직이게 된다.
비록 상기하는 사실이, 사진이나 텍스트를 스캔하여 컴퓨터 상에 저장하는단순한 작업에 사용된다면 별 문제는 아니지만, 스캔된 이미지 내의 다양한 대상물의 위치가 정확하게 파악되어야 하는 분석적으로 사용되는 스캐너에서는 문제가 발생하게 된다.
그러한 사용을 위하여서는 데스크톱형 스캐너는 적합하지 않고 더욱 고가의 분석 스캐너가 구입되어야 하는 것이다.
스캐너와 관련한 두 번 째의 문제점은, 하나의 스캐너 상에서 스캔된 이미지와 다른 스캐너에서 스캔된 이미지와 비교하는 문제를 다루는 경우에 스캔된 이미지들의 명암도의 값이 다른 다는 것이다.
본 발명의 특별한 관점은 이미지들, 특히 겔 내에 또는 고형 지지체 내에 배열된 2 차원 생체분자의 배열들의 이미지들의 스캔들로부터 모여진 정보의 활용과, 그들 스팟 들의 조작과 취급을 가능하게 하는 정보의 활용에 있다.
2002 년 5 월 27 일자로, 프로테옴 시스템즈 리미티드와 시마즈 코포레이션의 명의로 같이 출원되어있는 국제특허 출원 " 분리장치를 위한 액체 취급수단" 과 " 샘플 수집과 준비장치"가 겔들로부터의 스팟 분리와 MALDI 분석을 위하여 사용되는 자동로봇장치가 기술하는 내용으로서 본 발명에서는 참조로서 사용된다. 본 발명은 그러한 장치에 사용 될 수 있는 스캐너에 관한 것이다.
본 발명에 포함되는 어떠한 서류적인 논의, 행위, 재료, 디바이스 등은 순전히 본 발명의 배경의 예로서 제공된다. 이들의 모든 것 또는 어떤 것이 선행기술의 베이스를 형성하거나, 본 출원의 각 청구하는 우선권 주장일 이전에 오스트레일리아나 다른 곳에서 존재하는 본 발명에 관련한 분야의 일반적으로 알려진 지식을 인정하는 것은 아닐 것이다.
본 발명은 분리장치(excising apparatus)를 위한 이미징 수단에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 실시예가 부수된 도면과 함께 단지 예로서 설명된다.
도 1 은 스캐너를 도시하기 위하여 일부 부품이 생략된 겔 분리 및 처리 장치도,
도 2 는 분석 스캐너의 개략적인 측면을 도시하는 도면,
도 3 은 커팅툴의 절단 자국에 중첩된 배열의 인접한 2 개의 스팟의 개략적인 다이아그램도,
도 4 는 절단 자국이 제거된 도 3 에서의 동일한 스팟 들을 도시하는 도면,
도 5 는 스팟을 가로질러서의 명암도의 변화를 도시하는 그래프도,
도 6 은 스캐너의 캘리브레이션을 도시하는 도면이다.
제 1 의 넓은 관점에서, 겔 내에 또는, 고형지지체 상의 생체분자의 배열을 스캐닝하기 위하여, 배열의 이미지와 함께 캘리브레이션 스트립의 이미지를 스캐닝하는 방법을 제공한다.
전형적으로, 캘리브레이션 스트립은 그레이스케일의 스트립이고, 배열의 각 컴포넌트는 그레이스케일 이미지로 보여질 수 있고, 절대 명암도 값이 이미지 대 이미지, 스캐너 대 스캐너로 비교되어 질 수 있다.
배열 상의 스팟(spot) 들의 절대 명암도 값은 본 발명의 방법에서는, 배열의 후속 처리에서의 각각의 스팟 상에 얼마나 시약이 부여될 지를 결정하기 위하여 , 또는 배열 내의 스팟 들이 어떠한 순서로 취급되어질 지를 결정하기 위하여 사용되어 진다.
절대 명암도 값의 제공은 스팟의 농도에 따라서 더욱 정확하고, 스팟 내에 존재하는 물질의 양에 어울리도록 스팟 들로의 시약의 정확한 부여를 가능하게 한다.
절대 명암도의 사용은 또한 배열의 처리 동안 적용되어질 절단(cut-off)을 허용한다. 예를 들면 어떤 하나의 방법으로 처리되는 특정한 명암도를 가지는 스팟 들과 다른 방법으로 처리되어지는 더 작은 명암도를 가지는 배열 상의 스팟들을 기초로 처리가 수행될 수 있다.
예를 들면, 스탠다드팁(standardtip) 대신, 분리된 스팟을 취급하기 위하여사용되어지는 보다 고가의, 레진과 협동하는 집톱(Ziptop) 하의 광학적 밀도의 절단값이 있을 수 있다.
또 다른 이점은 스팟(전형적으로는 단백질)을 펩타이드로 소화하기 위하여 필요한 트립신이나 다른 효소의 양이 정확하게 결정되어 질 수 있다는 것이다.
MALDI-TOF 분석이 부속적인 순서로서 소화된 단백질 상에 수행되어질 때에, 초과된 트립신은 펩타이드에 의하여 발생되는 신호를 억제하고, 그에 따라서 트립신의 최소양의 사용이 MALDI-TOF 분석의 결과를 향상시키는 것이다.
본 발명의 2 번째의 관점은 인접한 스팟 들의 처리에 관한 것이며, 특히 배열 내의 스팟 들의 상대적인 위치가 중요한 배열 내의 스팟 들의 처리에 관련하고 있다.
넓게는 본 발명은, 배열 내의 적어도 하나의 스팟이, 그 스팟의 경계 내에서 작업하고 그 최적영역 주위에 경계를 생성하는 스텝, 최적 영역을 정의하기 위하여 인접한 스팟 들의 위치와 같은 스팟의 주위에 대한 정보를 사용하는 스텝을 가진다.
작업을 위하여 최적 영역을 뽑아내는 스텝은 스팟의 명암도에 기초할 것이다. 예를 들면, 스팟의 최적 작업영역은, 스팟의 가장 강한 명암도 부분의 적어도 90 % 의 명암도인 스팟의 영역일 수 있을 것이다.
특정한 영역에서의 "작업"은 스팟을 절단하여 내거나 또는 스팟 상에 시약을 부여하는 것이다. 스팟 상에 시약을 부여하는 스텝은 여기에서 그 내용이참고자료로서 사용되는 AU722578 프린터를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 커팅툴 헤드의 크기, 즉 그것이 전형적으로 점유하게 되는 스팟의 사이즈나 자국(footprint)이 중요하다. 스팟 자신의 사이즈 또한 중요할 것이다.
전형적으로는, 영역을 세밀화하기 위하여 주변정보의 사용은, 인접한 스팟으로부터 가능한 멀리 떨어져 특정 스팟의 취급이 유발되도록 하는 것이 가능하게 한다.
정보는 또한 배열 내의 다양한 스팟 들이 어떠한 순서로 취급되어져야 할 지를 결정하는 데에도 사용되어 질 수 있다.
이것은, 만일 배열이 겔 내의 스팟 들의 배열이고, 또한 겔이 관통되고 스팟이 커팅툴을 사용하여 흡착되는 처리과정에 의하여 스팟이 겔로부터 분리되어져야 하는 경우에 중요하다.
그러한 절단이 겔의 모서리에 인접하여 이루어지는 경우, 그것이 배열의 경계이던, 이전에 스팟이 절단되어진 모서리이든, 절단은 어렵고 겔은 종종 흩어지게 된다.
도면과 관련하여, 도 2 는 겔(14)의 시트가 그 위에 놓여지는 투명한 유리판(12)이 형성되는 박스형태의 컨테이너 또는 몸체의 형태로서 10 으로 지시되는 스캐너를 도시한다. 몸체의 내방에는 유리판(12)을 통하여 겔의 하면을 스캔하는 스캐닝헤드(16)가 있다.
겔을 조사하는 광원이 스캐닝헤드에 대하여 유리와 동일한 측에 위치하는 반사형 모우드, 또는 광원이 겔의 반대측에 위치하여 겔을 통하여 스캔이 통과하는 광을 기록하는 투과형 모우드로서 스캔이 수행될 수 있다.
스캐닝헤드는 스캐너의 전기회로나 제어장치에 부착된 레일(18)을 따라서 플랙시블케이블(18)에 의하여 가동한다. 도 2 와 6 은 유리판(12)의 각 코너부에 가까운 "기준(flucidals)"으로서 알려진, 유리판의 하면에 형성되어 겔의 스캔된 이미지상에 중첩되는 4 개의 일련의 십자선(22)을 도시한다. 스캔된 이미지는 따라서 배열 상에 스팟 들을 위한 참조점 들을 포함하게 된다.
스캐너(10)는, X축(54)과 Y축(56a)을 따라서 X,Y 방향으로 이동이 가능하도록 장착되는 가동가능한 기구헤드(52)를 포함하는 집적화되고 자동화된 겔분리 및 샘플처리장치(50)의 일부를 구성한다. 커팅헤드(58)는 수직축인 Z축(6)을 따라서상,하로 이동가능하도록 장착된다. 장치는 또한 액체이송수단(55)을 가진다.
도 6 은 그 휘도와 알려진 겔의 이미지를 따라서 스캐닝하고 그 반사명암도가 알려진 그레이스케일카드(24)인 본 발명의 제 2 의 특징을 도시한다. 이것은 적, 녹, 청 등과 같이 이미지에서의 각 색상에 적용될 수 있고, 배열 내의 각 스팟 들의 명암도를 해석하여, 이미지 대 이미지 그리고 스캐너 대 스캐너에서의 절대 명암도값의 비교가 가능하게 된다.
본 발명에서 언급하고자 하는 제 3 의 문제는, 스팟 들이 커팅툴과 같은 장치에 의하여 잘려져 취급될 때에, 인접한 스팟 들의 근접성의 문제인 것이다.
도 3 은 전형적으로 둥근, 커팅툴의 절단자국(34)이 중첩된 배열의 2 개의 인접한 스팟(30,32)을 도시한다. 겔을 절단하기 위한 커팅툴의 특별한 형태는 중요하지 않다. 만일 커팅툴이 스팟의 중심(36)에 기초하여 스팟(32)을 절단한다면 스팟(30)의 일부분을 역시 절단하게 되고, 분리를 오염시키게 된다. 나아가서 그것은 스팟(30)에/ 또는 근처에 에지를 형성하게 될 것이다. 겔의 에지 가까이에서의 절단은 어렵고 스팟(30)을 커팅하여 내기에 어렵게 한다. 대부분의 커팅툴은 겔을 관통하고 스팟을 흡입하게 된다. 만일 이것이 겔의 에지 부근에서 일어난다면 겔은 외방으로 흩어지고 커팅은 어렵게 된다.
도 4 는 스팟 들 사이의 거리와, 스팟 들의 형상, 스팟 들을 분리하는 절단 들의 거리를 최대한 크게 하기 위하여 커팅툴헤드의 크기를 분석하기 위하여 본 발명의 제어시스템이 어떻게 사용되는 지를 도시한다. 스팟(32)을 위한 절단(40)의 중심이 스팟(30)으로부터 떨어진 거리의 스팟(32)의 에지로 이동하기 때문에, 절단은 스팟(30)에 영향을 미치거나, 스팟(32)의 분리된 부분이 스팟(30)의 부분과 오염되지 아니한다.
마찬가지로, 스팟(30)을 위한 절단의 중심(38)이 스팟(32)으로부터 떨어진 스팟의 측면으로 이동한다. 전형적으로는 분석은 스팟의 형상에 기초하여 수행되지만 그러나 선택적으로는 스팟의 명암도와 관련한 정보에 의하여 계산은 가중치가 부여된다.
예를 들면, 도 5 는 스팟을 가로질러서의 명암도의 변화를 도시하는 그래프이다. 만일 커팅툴이 그 하나의 스팟의 절단에만 사용되고, 그 부근에 다른 스팟이 없다면, 제어시스템은 스팟의 명암도가 적어도 90%인 즉, 스팟이 가장 집중된 영역에 있는 가장 좋은 영역을 작업을 위하여 선택할 것이다.
명암도 정보는 또한 2 개 또는 그 이상의 스팟 들이 근접하여 있을 때 이동/작업을 위한 최적의 영역을 결정하기 위하여서도 사용된다.
이하는 겔 들의 이미지 내의 스팟 들의 중심을 위치를 결정하기 위한 분할화(segmentation)를 위하여 겔(14)의 이미지의 휘도를 캘리브레이팅하고, 기준마커(22)를 사용하는 스캐너상의 겔(14)의 공간 상의 위치를 감지하기 위한 알고리즘이다.
휘도(luminosity)
목적: 플랫폼을 가로질러서 수회에 걸쳐 표준화하기 위한 이미지의 휘도를 캘리브레이팅함.
입력이미지: 겔, 기준마커와 캘리브레이션스트립을 포함한 전체 스캔 면.
출력이미지: 캘리브레이션된 휘도를 가지는 겔의 이미지.
S = 그레이스케일의 캘리브레이션 조각을 포함하는 입력 이미지의 서브세트(subset).
F = 특정치수의 평방 평균 필터를 사용하는 이미지(S) 의 평균 필터링.
n = 1,2,3 인 이미지(F)의 각 컴포넌트(Fn)를 위한 루프훅-테이블(LUT)을 생성.
Fn= 이미지(F)의 n 번째 컴포넌트.
Vn［］= 조각 이미지(F) 내에서의 조각블럭의 수가 N 인, N 그레이스케일의 세트.
( Vn［i］은 Fn 내의 i 번째 의 중심에서의 그레이스케일. )
VO［］= N 매핑값의 세트, ( 여기에서 VO［i］는 i * 255/N )
LUTLn 을 하기와 같이 형성.
Ln［i］=((j-Vn［i］/(Vn［i+1］-Vn［i］))* 255/N + VO［i］,
(여기에서, Vn［i］< = j < = Vn［i+1)
= 0 ( j < Vn［1］일 때)
=255 ( j > Vn［N］일 때)
I=(R,G,B) = 겔만을 가지는 입력이미지의 서브세트
출력 = 색채이미지(RO,GO,BO) , 여기에서
RO =L1 을 통한 'R' 의 LUT매핑
GO= L2 를 통한 'G'의 LUT매핑
BO = L3 을 통한 'B'의 LUT매핑
분할화 텍스트
목적: 겔 이미지 내의 스팟 들의 중심의 위치설정.
입력이미지: 캘리브레이트된 휘도를 가지는 겔의 이미지.
출력: 입력이미지에서 발견된 스팟 들의 (x,y)축 중심좌표를 포함하는 파일.
3 차원 색상이미지 R(적색), G(녹색) , B(청색)로부터 그레이스케일 이미지 'input' 을 생성.
만일 겔이 쿠마시(coomassie) 블루 스테인 겔이면 I=B-(R+G)/2,
아니면 input = 255-(R+G)/2
이미지로부터 백그라운드를 제거하기 위하여 최정상의 이미지인 이미지( tophat)를 생성.
O = 12 다각형을 이용하는 이미지(input)의 형태학적인 개구부
tophat = input - O
O = 작은 사각형을 이용하는 이미지(tophat)의 형태학적인 개구부
R = 8-연결성(connectivity)을 가지는 이미지(O)에서의 영역적인 최대값
B = R > t, ( t 는 특정된 스레스홀드)
G= B * R * c ( c 는 특정상수 )
R2 = 8-연결성을 가지는 G(시드:seeds)를 사용하는 R(참조:reference)의 팽창에 의한 형태학적인 재구성
D = R - R2
B2 = D > t2 ( t2 는 특정 스레스홀드 )
markers = 8-연결성을 가지는 B(시드)를 사용하는 B2(참조)의 이진 재구성.
백그라운드 픽셀의 이미지(background)를 생성.
B = 이미지(input) 의 에지의 특정 거리 내에 있는 픽셀의 이진 이미지
B2 = 스레스홀딩의 키틀러(kittler)와 일링워스(Illingworth) 방법을 사용하는 이미지(input)의 이진 스레스홀드
background = 이미지(B)와 (B2)의 픽셀향(pixelwise) OR
이미지(markers)를 필터링하고 라벨링함에 의하여 시드이미지 인 이미지(seed) 구성.
B = 이미지(marker) 와, 이미지(background)의 역의 픽셀향 AND
O = 작은 객체를 제거하기 위한 B 내의 객체의 형태학적인 영역개방부
seeds = 8-연결성을 가지는 O(seeds)를 사용하는 markers(참조)의 이진 재구성
이미지(seeds) 내의 객체의 중심점들을 라벨링하고 계산한다.
L = 8-연결성을 사용하는 'seeds' 내의 라벨 객체
C= L 내의 객체의 중심
출력은, 그들이 특정한 최소거리 떨어지고 이미지(seeds) 내의 객체 내에 놓여지도록 처리된 중심점이다.
공간
목적: 4개의 표시마커를 발견하고 그들의 중심을 기록한다.
입력이미지: 겔, 표시마커, 측정스트립을 포함하는 전체 스캔된 표면
출력: 각 기준마커의 중심
각 기준마커를 위한 계산.
S = 기준마커를 포함하기에 충분히 큰 입력이미지의 서브세트
C = 주어진 치수의 직사각형을 이용한 'S' 의 형태학적인 폐쇄
D= C - S
V = 주어진 길이의 수직선을 사용하는 이미지(D)의 선형 개방부
H = 주어진 길이의 수평선을 사용하는 이미지(D)의 선형 개방부
M = 이미지(V,H)의 픽셀향 최소값
B = M > t (t 는 특정한 스레스홀드)
L = 8-연결성을 사용하는 'B' 에서의 스팟 들의 라벨링
C = L 에서의 객체의 (X,Y)중심
출력: 이미지(S)의 중심에 가장 근접한 'C' 에서의 점(X,Y)
이상에서 광범위하게 서술된 본 발명의 기술적인 범위로부터 벗어남이 없이 당해 기술분야에서 수많은 변경 또는/그리고 수정이 본 발명에 가능할 것이다.
본 발명의 실시예는 따라서 예시적인 관점에서 기술된 것으로서, 한정적인 것은 아니다.

Claims (15)

  1. 샘플들의 2 차원적인 배열로부터 스팟 형태로 샘플을 분리하기 위한 커팅헤드를 제어하기 위하여 사용되는 방법이,
    배열 내의 적어도 하나의 스팟이, 상기 스팟의 경계 내에서 작업하기 위한 최적의 영역을 설정하는 스텝, 상기 최적영역 주위에 경계를 생성하는 스텝, 인접한 스팟의 위치와 같은 스팟의 주위에 대한 정보를 최적 영역을 정의하기 위하여 사용하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 샘플은 겔 내의 생체분자의 배열인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서,
    상기 최적 영역을 정의하는 스텝은 스팟의 명암도에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 최적 영역을 정의하는 스텝은, 스팟의 가장 강한 부분의 적어도 90 % 의 명암도인 스팟의 영역을 선택하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 4 항 기재의 어느 한 항에 있어서,
    상기 배열로부터 스팟을 분리하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 5 항 기재의 어느 한 항에 있어서,
    상기 스팟 상에 시약을 부여하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 겔 내의 또는, 고형지지체 상의 생체분자의 배열을 스캐닝하기 위한 방법에서, 배열의 이미지와 캘리브레이션 스트립의 이미지를 함께 스캐닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 캘리브레이션 스트립은 그레이 스케일의 스트립이고, 배열 상의 스팟 들의 절대 명암도 값들이 계산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항 또는 8 항에 있어서,
    상기 계산된 명암도는 배열의 후속 처리에서의 각각의 스팟 상에 얼마나 시약이 부여되어야 하는 지를 결정하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 계산된 명암도는 배열 내의 스팟 들이 어떠한 순서로 취급되어야 하는지를 결정하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    어떤 하나의 방법으로 처리되어지는 사전 값보다 크거나 동일한 특정 명암도 값을 가지는 스팟 들과, 또 다른 방법으로 처리되어지는 명암도보다 적은 명암도를 가지는 배열 내의 스팟 들에 기초하여 스팟의 후속 처리가 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 겔 내의, 또는 고형 지지체 상의 생체분자의 배열의 스캐닝은 복수 개의 마커를 가지는 플레이트 상에서 수행되고, 배열의 이미지와 함께 마커의 이미지를 스캐닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    플레이트는 유리판이고, 4 개의 십자마크가 유리판의 각 모서리에 인접하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 13 항 기재의 어느 한 항에 있어서,
    각 스팟의 중심의 위치를 결정하는 스텝을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    2 개의 인접한 스팟 들에서, 스팟을 분리하는 절단이 최대한 떨어지도록, 2 개의 스팟 들의 하나를 제거하기 위하여 절단 중심을 이동시키는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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