KR20030086305A - 전당뇨병 상태의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자에게 신체적인 부담을 주지 않고 전당뇨병 상태를 보다 정확하게 측정하고 다수의 시험 샘플을 처리할 수 있는 스크리닝 방법, 및 여기에 사용되는 진단 시약을 제공한다.

피험자로부터 채취된 체액에서, D-만노스 농도, 바람직하게는 D-만노스 농도 및 글루코스 농도를 측정함으로써, 그리고 이것을 각각의 기준치와 비교함으로써, 전당뇨병 상태에 있는 환자를 검출할 수 있다. 또한, 만노스 농도의 측정은, 전자 수용체의 존재 하에서 샘플에 있는 만노스에, 만노스에 대하여 탈수소화에 의한 산화능을 갖는 효소가 반응하도록 전자 수용체의 형성된 환원체를 정량함으로써 수행된다.

Description

전당뇨병 상태의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시약{METHOD OF SCREENING PREDIABETIC STATE AND SCREENING REAGENT}

일본에서, 당뇨병 환자의 수는 약 690만명이고, 전당뇨병 상태라고도 할 수 있는 내당능 장애의 사람을 포함하면, 그 수는 1370만명에 이른다. 또한, 40세 이상의 국민 중 열에 하나는 당뇨병 환자인 것으로 나타난다.

당뇨병은 종래에 경계형으로 알려진 내당능 장애를 통해 발생하는 것으로 공지된다. 따라서 당뇨병으로의 진행은 이 상태를 가능한 한 빨리 검출하고 환자를 치료함으로써 저해될 수 있다.

내당능 장애 및 당뇨병의 종래에 임상적 진단은, 공복시 혈당 수준의 측정 및 75 g 경구 글루코스 부하 시험 후 1 시간 및/또는 2 시간에 혈당 수준을 측정함으로써 행해진다. 공복시 혈당 수준 (이하 "FBS"로서 지칭)은 그것의 낮은 부하 때문에 스크리닝에 사용된다. 일본 당뇨병 학회의 진단 기준에 따라서, 110 mg/dl 미만의 수준은 정상형으로, 110 내지 125 mg/dl는 경계형으로, 그리고 126 mg/dl 이상은 당뇨병형으로 판단된다. 상기 진단의 결과로서, 당뇨병으로 의심되는 경우, 최종 결정을 하기 위하여 또다른 75 g의 경구 당부하 시험을 더욱 수행한다 (당부하 시험 2 시간 후 혈당 수준에 있어서, 140 mg/dl 미만은 정상형, 140 내지 199 mg/dl는 경계형, 그리고 200 mg/dl 이상은 당뇨병 형이다).

그러나, FBS에 의한 상기 측정 방법은 불안정한 당뇨병 형 또는 검사 전야의 식사 내용과 같은 인자들 때문에 정확한 측정 방법이라고는 말할 수 없다. 더욱이, 75 g 경구 당부하 시험은 적어도 2시간 및 빈번한 혈액 채취를 필요로 하고, 환자에게 신체적인 부담을 주므로, 그다지 바람직한 방법이 아니다.

전당뇨병 상태 또는 당뇨병 상태를 검출하기 위하여, 하기 방법이 예로서 제시되었다.

(1) 당의 투여 후 사전 결정된 시간이 경과한 다음, 포유동물 환자의 소변 중 D-키로-이노시톨의 양 또는 증가율과 동일한 방식으로 정량적으로 측정된 건강한 사람의 그 양 및 증가율을 비교함으로써 전당뇨병 상태를 검출하는 방법 (JP-A-2000-298131).

(2) 포유동물 환자로부터 얻은 소변 샘플을 이용하여 당뇨병의 존재 가능성에 대하여 환자를 스크리닝하는 스크리닝 방법으로서, 1) 이 샘플을 무균 환경에 유지하는 단계, 및 2) D-키로-이노시톨의 존재에 대하여 이 샘플을 분석하는 단계를 포함하는데, 이는 D-키로-이노시톨의 부재, 또는 생체내에서 효과 없음을 가리키는 현저하게 낮은 D-키로-이노시톨 수준을, 피험자가 당뇨병에 걸린 상태로서 정의하는 단계를 포함하는데, 여기에서 이 낮은 수준은 비-당뇨환자의 수준보다 적어도 3 오더 더 낮다 (일본 특허 제 2,834,321).

(3) 당뇨병의 증상에 관계된 인슐린 내성을 검출하는 방법으로서, 여기에서 포유동물 환자로부터 얻은 소변 샘플 또는 혈청 샘플에서 당뇨병의 증상에 관련된 인슐린 내성의 표시로서 키로-이노시톨 농도를 측정한다 (일본 특허 제 3,118,458 호).

(4) 인슐린 내성에 대하여 인간을 스크리닝하는 방법으로서, 체액 중 D-키로-이노시톨의 농도를 측정하는 단계, 체액 중 미오이노시톨의 농도를 측정하는 단계, D-키로-이노시톨에 대한 미오이노시톨의 비율을 계산하는 단계, 및 계산된 비율과 인슐린 내성에 특징적인 비율을 비교하는 단계를 포함하는데, 여기에서 계산된 비율이 인슐린 내성에 특징적인 비율을 초과하면, 이 사람은 인슐린 내성일 것이다라고 결정된다 (일본 국제 공보 제 10-507826).

상기 스크리닝 방법 (1) 내지 (4)는 소변을 이용하는 정밀검사 방법으로 혈액 채취등이 필요 없지만, 당부하 후 사전결정된 기간 내에 소변을 채취해야 하고, 피험자는 사전결정된 시간에 대하여 억제된다. 위로부터, 이들 방법은 일반 검사에 적합하지 않다. 더욱이, 이들은 너무 복잡하여 다수의 검체를 처리하는 것이 불가능하다는 문제점을 갖는다.

발명의 개시

따라서, 본 발명의 목적은 피험자에게 신체적, 시간적 및 비용적으로 과도한 부담을 주지 않고 내당능 장애에 의해 야기되는 전당뇨병 상태를 더 정확하게 측정하는 스크리닝 방법 및 스크리닝 시약을 제공하는 것이다.

상기 목적을 성취하기 위하여, 본 발명의 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 방법 중 하나는 환자로부터 채취된 체액 중 D-만노스 농도를 측정하는 단계 및 D-만노스 농도를 D-만노스의 사전결정된 기준치와 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명의 전당뇨병 상태에 대한 또다른 스크리닝 방법은 피험자로부터 채취된 체액 중 D-만노스 농도 및 글루코스 농도를 측정하는 단계; D-만노스 농도를 D-만노스 농도의 사전결정된 기준치와 비교하는 단계; 및 글루코스 농도를 사전결정된 D-글루코스 농도의 기준치와 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 체액은 공복 조건 하에서 피험자의 혈액, 혈청 또는 혈장이 바람직하다. 게다가, D-만노스 농도의 기준치는 공복 조건 하에서 건강한 사람으로부터 채취된 혈액, 혈장 또는 혈청을 측정함으로써 얻은 D-만노스 농도를 통계적으로 처리하여 얻은 상한치인 것이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따라, 종래의 FBS에 의한 판정 방법으로는 간과되기 쉬웠던 불안정형의 당뇨병 환자, 및 정상 FBS 수치를 나타내는 잠재적 내당능 장애와 같은 전당뇨병 상태의 환자를 더욱 정확하게 검출하는 것이 가능하다.

한편, 본 발명의 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 시약은 전자 수용체의 존재 하에서 만노스에 대하여 탈수소에 의한 산화능을 갖는 효소 및 이 효소에 유용한 전자 수용체를 포함한다.

본 발명의 스크리닝 시약은 바람직하게 글루코스 소거제를 더욱 포함한다. 게다가, 효소는 EC 1.1.1.119로 분류되는 글루코스 탈수소효소가 바람직하며, 글루코노박터 속에 속한 미생물로부터 유래된 알도헥소스 탈수소효소가 더욱 바람직하다. 게다가, 글루코스 소거제는 글루코스 6-위 인산화 효소 및 아데노신 삼인산을함유한 것이 바람직하다. 더욱이, 전자 수용체는 조효소 NADP인 것이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝 시약은 D-만노스를 정량할 수 있고, 다수의 검체를 처리할 수 있는데, 이는 복잡한 효소 커플링 시스템을 통해서가 아니라 D-만노스에 직접 반응하고 탈수소에 의한 산화능을 갖기 때문이다. 게다가, 본 발명의 스크리닝 시약은 샘플에서 글루코스에 의해 거의 영향받지 않기 때문에, 글루코스 소거제를 이용하면 D-만노스를 더욱 정확하게 정량할 수 있다.

본 발명은 내당능 장애로 인한 전당뇨병 상태를 손쉽게 검출할 수 있는 스크리닝 방법, 및 스크리닝 시약에 관련된다.

도 1은 본 발명의 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 방법에 의해여, 당부하 전 혈장 중 D-만노스 농도 및 글루코스 농도의 비교 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 검출되는 전당뇨병 상태는 식사의 섭취에 의해 혈류 내로 당이 유입될 때, 혈중 당이 골격근, 간 및 지방 조직과 같은 말초 조직 내로 충분히 흡수될 수 없어서, 혈중 당 수준의 증가를 일으키는 상태, 이른 바 내당능 장애이다. 여기에서, 본 발명이 적용된 환자는 주로 인간이지만, 가축 및 애완동물과 같은 포유동물을 포함할 수 있다. 본 발명에서, "피험자"는 이러한 포유동물을 포함한다.

전당뇨병 상태에 대하여 피험자를 스크리닝하기 위한 본 발명의 방법에서, 피험자로부터 채취된 체액 중 D-만노스 농도를 측정하고, 이 농도를 사전결정된 기준치와 비교한다. 게다가, 스크리닝이 좀더 정확하게 수행될 때, D-만노스 농도의 측정 및 글루코스 농도의 측정이 수행되고, 이들 농도는 각각 사전결정된 기준치와비교된다.

상기 체액으로서는, 피험자로부터 채취된 소변, 혈액 등이 언급될 수 있다. 특히, 체액은 혈액, 혈장 또는 혈청이 바람직하고, 공복 조건 하에서 채취된 것이 더욱 바람직한데, 이는 이들을 이용하면 혈중 글루코스 수준을 또한 측정할 수 있기 때문이다.

피험자의 체액으로부터 측정된 D-만노스 농도에 기초된 전당뇨병 상태를 판단하기 위한 D-만노스 농도의 기준치는 다음과 같이 설명될 수 있다. 첫째로, 당뇨 진단 기준에 따라 전당뇨병은 물론이고 당뇨병에도 걸리지 않은 것으로 미리 판단된 다수 (바람직하게는, 수십 내지 수백명)의 건강한 사람들의 체액 (바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청)중 D-만노스 농도를 측정하고; 둘째로, 통계적 처리에 의한 그것의 결과로부터 정상범위를 측정하고; 그 다음, 이 정상 범위의 상한치등을 취한다.

이 기준치는 다수의 피험자에게 예비 시험을 수행함으로써 더욱 정확하게 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명에서, 하기 언급된 예로부터 혈중 D-만노스 농도의 기준치는 약 9 μg/ml인 것으로 확립되지만 특히 제한되는 것은 아니다. 따라서, 하기-언급된 실시예에서, 혈중 9 μg/ml 미만의 D-만노스 농도는 정상인 것으로 판단되고, 9 μg/ml 이상은 전당뇨병 상태로 의심되는 경우로 판단된다.

D-만노스 농도를 측정하는 방법으로서는, 종래 방법이 사용될 수 있다. 이들 가운데, 다수의 피험자를 처리할 수 있는 방법이 바람직하며, 하기 언급된 스크리닝 시약을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

게다가, 글루코스 농도의 기준치로서, FBS 표준으로서 이용되어 온 일본 당뇨병 학회의 당뇨병 진단 기준 (110 mg/dl 미만의 수준은 정상형, 110 내지 125 mg/dl은 경계형, 그리고 126 mg/dl 이상은 당뇨병 형으로 판단하는 것)을 이용하는 것이 바람직하다. 글루코스 농도는 자동 분석기를 위한 시중 구입가능한 시약을 이용하는 것 등에 의해 측정될 수 있다.

이하, 본 발명의 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 방법은 바람직한 구체예를 참조로 하여 설명될 것이다.

첫째로, 바람직하게는 공복 상태인 피험자의 혈액을 종래 방식에 따라 채취하고, 이로부터 혈장 또는 혈청 (이하 샘플로서 지칭함)을 순차적으로 분리한다. 여기에서, 피험자는 전당뇨병 상태에 대하여 점검된 모든 사람을 의미하는데, 이는 건강한 사람, 당뇨 의심 환자, 및 당뇨병 환자를 포함한다.

그 다음, 조효소 NADP와 같은 전자 수용체의 존재 하에서, 이 샘플에 작용하는 알도헥소스 탈수소효소와 같은 탈수소화에 의해 만노스에서 산화능을 갖는 효소를 사용함으로써, 전자 수용체의 형성된 환원체를 정량하여 D-만노스 농도를 측정한다. 게다가, 시중 구입가능한 분석용 시약을 사용하여, 동일한 샘플의 글루코스 농도 또한 측정한다.

이렇게 측정한 혈중 D-만노스 농도 및 글루코스 농도는 각 기준치와 비교하여 피험자가 전당뇨병 상태에 있는지를 판단한다. 특정 판단의 결과로서, 예를 들어, 기준치를 초과하는 D-만노스 농도 및 진단 기준의 정상 범위 내에 있는 글루코스 농도를 갖는 피험자는 내당능 장애를 갖는 것으로 의심된다. 따라서, 이러한피험자는 75 g 경구 당부하 시험에 의해 재검사해야 한다는 것을 권고한다.

나아가, 기준치를 초과하는 글루코스 농도를 갖는 피험자에 있어서, 내당능 장애의 가능성이 높지만, 이 경우에서 조차도, D-만노스 농도가 기준치를 초과하지 않는다면, 일시적인 혈중 글루코스 상승을 의심할 수 있다. 이러한 경우에서, 확인을 위해 환자에게 음식물의 섭취에 대하여 질문한 후, 일시적인 내당능 장애의 가능성을 판단한다.

상술한 것과 같이, 공복 상태 하에서 혈중 D-만노스 농도를 측정함으로써, FBS 만으로 판단할 때는 거의 검출되지 않는 잠재적인 내당능 장애를 갖는 사람을 손쉽게 검출할 수 있다. 나아가, 혈중 D-만노스 농도는 음식물 섭취 등에 의해 야기된 혈중 글루코스 수준에서의 변동에 비하여 작은 변동을 나타낸다. 따라서, 일시적인 혈당 증가로 의심되는 피험자에 있어서, 혈당 증가가 D-만노스 농도로부터 일시적인지 아닌지를 판단하는 것이 가능하다.

나아가, 공복 조건 하에서 혈중 D-만노스 농도 및 글루코스 농도를 측정하고 이들을 각각 그 기준치와 비교함으로써, 오직 75 g 경구 당부하 시험에 의해서 내당능 장애 및 당뇨병을 갖고 그런 것으로 검출된 피험자 (당부하 시험 2 시간 후 측정한 혈당 수준이 140 mg/dl 이상인 피험자)를 검출하는 것이 가능해진다.

다음으로, 전당뇨병 상태에 대한 상기 스크리닝 방법에 사용되는 시약이 설명될 것이다.

본 발명에 사용된 효소는 전자 수용체의 존재 하에서 만노스에 대하여 탈수소에 의한 산화능을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 그러나, EC. 1.1.1.119로분류된 효소가 바람직하다. 특히, 예를 들어 OKAMOTO의 문헌 (J. Biochem. 53 (5), 1963, pp348-353)에 설명된 것과 같이 Acetobacter suboxydans로부터 이용가능한 NADP 의존성 글루코스 탈수소효소, AVIGAD 등의 문헌 (J. Biol. Chem. 243 (8), 1968, pp1936-1941)에 설명된 것과 같이 Glucomobacter cerinus로부터 이용가능한 NADP 의존성 알도헥소스 탈수소효소, DAHMS 등의 문헌 (J. Biol. Chem. 247 (7), 1972, pp2222-2227)에 설명된 것과 같은 NAD 의존성 알도헥소스 탈수소효소 등을 언급할 수 있다.

본 발명에서, 상기 효소는 글루코노박터 속에 속한 미생물로부터 유래된 알도헥소스 탈수소효소인 것이 특히 바람직하다. 글루코노박터 속에 속한 미생물로는, 예를 들어 Gluconobacter asaii (G. asaii) IFO 3276, Gluconobacter cerinus (G. cerinus) IFO 3267, Gluconobacter frateurii (G. frateurii) IFO 3264, Gluconobacter oxidans (G. oxydans) IFO 14819 등을 언급할 수 있다. 효소를 얻기 위하여, 첫째로, 이들 미생물을 배양하여 그로부터 세포를 회수하고, 초음파 처리등으로 이들을 파쇄함으로써 파쇄액을 준비하고; 그 다음 얻은 파쇄액은 황산 암모늄 분획, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 히드록시 인회석 겔, 겔 여과 등을 포함하는 컬럼 크로마토그래피와 같은 기술 중 어느 하나, 또는 필요하다면 이것의 조합을 이용하여 정제한다.

사용된 만노스 탈수소효소의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 0.1 내지 100 유닛(u)/ml의 범위 내에 있는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 유닛 (u)/ml이다. 여기에서, 위에 언급된 효소의 1 유닛(u)은 하기 방법에 의해 측정된것과 같이 분당 1μmol의 NADPH를 형성하는데 요구되는 효소의 양으로서 정의한다.

즉, 0.3 ml의 10 mM, 0.85 ml의 정제수 및 0.3ml의 500 mM D-만노스를 1.5 ml의 200 mM Tris-HCl (pH9.0)과 혼합하고, 37℃에서 5분동안 사전인큐베이션 한 후; 0.05 ml의 샘플을 이 사전인큐베이션한 용액과 혼합하고, 그 반응을 37℃에서 개시하여 340 nm에서의 흡광도의 분당 증가를 측정한다. 블랭크로서, D-만노스 대신에 정제수를 사용하였다. 상기 측정 방법에 의해 측정된 샘플 및 블랭크로부터의 각 흡광도를 할당함으로써, 하기 식에 의해 역가를 측정하였다.

(식 1)

u/ml = ((ΔOD 샘플/분 - ΔOD 블랭크/분) X 3/(6.3 X 0.05)) X 희석배율

본 발명에서, 전자 수용체로서, NAD 및 NADP와 같은 조효소, 산소, 페나진 메토설페이트, 디클로로페놀 인도페놀, 페리시아니드 등에서 하나 또는 둘 이상이 사용을 위해 임의적으로 선택될 수 있다. 조효소 NADP가 특히 바람직하다. 사용된 전자 수용체의 농도는 0.1 내지 10 mmol/l의 범위 내에 있는 것이 바람직하고, 0.5 내지 2 mmol/l가 더욱 바람직하다.

나아가, 전자 수용체의 환원체를 정량하기 위하여, 전자 수용체를 환원시킴으로써 발색하는 발색제가 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 발색제는 사용된 전자 수용체에 의존하여 임의적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 조효소 NADP의 환원체인 NADPH를 정량하기 위하여, 전자 운반체로서 페나진 메토설페이트 또는 디아포라제 및 테트라졸륨 염이 공존하도록 허용되고, 형성된 포르마잔 염료를 비색 정량한 방법을 들 수 있다.

나아가 본 발명에 사용된 만노스 탈수소효소는 또한 만노스 외에 글루코스와 반응하기 때문에, 특히 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플에 있는 만노스를 측정할 때, 결과는 글루코스에 의해 적잖은 영향을 받는다. 따라서, 생물학적 샘플에 있어서의 측정 정확도를 증가시키기 위하여, 글루코스 소거제를 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 글루코스 소거제로서는, 글루코스 6-위 인산화 효소 및 ATP를 함유한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

글루코스 6-위 인산화 효소로서는, 글루코키나제, 헥소키나제 등이 언급될 수 있고, 시중 구입가능한 것도 EC 2.7.1.2 또는 EC 2.7.1.1에 속하는 한 특별한 제한없이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 글루코스에 대한 높은 특이성을 나타내는 글루코키나제가 사용된다. 그것의 양은 샘플 내의 글루코스 양에 의존하지만, 보통 0.1 내지 50 u/ml이다. 또한, 샘플 내의 글루코스 양에 의존하는, 글루코스의 인산화에 필요한 ATP 양은 일반적으로 1 내지 20 mM이다. 게다가, 글루코스의 인산화를 가속하기 위하여, 보통 무기 또는 유기 염으로서 마그네슘 이온이 약 5 내지 50 mM의 양으로 함유된다. 글루코스 소거를 위한 글루코스의 인산화는 20 내지 50℃, 바람직하게는 25 내지 37℃에서 첨가 직후에 약 10분 동안 pH 6 내지 10의 완충 용액에서 수행된다.

또한, 글루코스를 소거하는 방법으로서, 예를 들어 글루코스 옥시다제 및 카탈라제를 이용한 종래 방법이 사용될 수 있다.

본 발명에 사용된 완충 용액으로서는, 인산 완충 용액, 글리신 완충 용액, 트리스-HCl 완충 용액, Good 완충 용액, 붕산 완충 용액 등과 같은 pH 6 내지 10을갖는 통상적인 것들이 사용될 수 있다.

본 발명에 사용된 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 시약으로서는, 글루코스 소거제 및 정량용 효소는 독립적일 수도 있고 조합될 수도 있다. 보다 구체적으로, 시약은 두 가지 시약, 즉 전자 수용체 및 글루코스 소거제를 함유한 제 1 시약, 및 만노스 탈수소효소를 함유한 제 2 시약에 의해 구성되는 것이 바람직하다.

만노스 정량용 시약을 셈플에 첨가하고 반응을 수행한 후, 반응 용액에서 환원된 전자 수용체의 측정은 예를 들어, 전자 수용체의 환원체에 특이적인 흡광 파장에서의 흡광도를 측정하거나, 또는 전자 수용체의 환원체에 의해 발생된 발색제의 색 발생 강도를 측정함으로써 수행된다.

이하, 본 발명은 실시예를 참조로 하여 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 결코 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

효소의 제조 예 (Gluconobacter asaii로부터 유래된 알도헥소스 탈수소효소의 제조)

Gluconobacter asaii (기탁 번호 IFO 3276, 기탁 기관 : 재단법인 발효 연구소, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan)는 0.5 %의 효소 추출물 및 1 %의 과당을 함유한 배지에 접종하고, 28℃에서 24 시간동안 진탕 배양한 후, 원심분리하여 세포를 얻었다. 세포를 20 mM 인산 완충 용액 (pH 7)에 현탁하고, 빙냉하에서 초음파 진동기로 처리하였다. 그 다음, 조 효소 용액은 원심 분리 후 파쇄액으로부터 세포 잔류물을 제거함으로써 얻는다.

황산 암모늄 분말을 이 조 효소 용액에 첨가하여 거기에 녹여서 황산 암모늄이 30%의 포화가 되도록 하고, 침전된 단백질은 원심분리로써 제거하였다. 얻은 상청액은 효소를 흡수하도록 Butyl Toyopearl 컬럼에 로딩하고, 30 내지 0%의 포화량에서 황산 암모늄을 함유한 20 mM 인산 완충용액으로 효소를 용리하였다.

각 용리 화분의 효소 활성을 측정하고 활성 화분을 채취한 후, 20 mM 인산 완충용액 (pH 7)으로 활성 화분을 탈염하였다. 그 다음, 이것을 DEAE Toyopearl 컬럼에 로딩하여 효소를 흡수하고, 0 내지 0.25 M NaCl을 함유한 20 mM 인산 완충 용액 (pH 7)으로 용리하였다.

각 용리 화분의 효소 활성을 측정하고 활성 화분을 채취한 후, 20 mM 인산 완충용액 (pH 7)으로 활성 화분을 탈염하였다. 그 다음, 이것을 DEAE Toyopearl 컬럼에 로딩하여 효소를 흡수하고, 20 내지 150 mM 인산 완충 용액 (pH 7)으로 용리하였다. 각 용리 화분의 효소 활성을 측정하고 활성 화분을 회수하여, 정제된 효소 용액으로 사용하였다.

75g 글루코스 경구 당부하 시험은 당뇨병으로 의심되는 피험자 59 명에서 수행하였고, 당 부하 직전 (공복시), 또는 당 부하 후 30분, 60분 및 120분에 각각 혈당 측정용 채혈관을 이용하여 혈액을 채취하였다. 그 다음, 혈장을 분리하여 시중 구입가능한 자동 분석기용 시약인 "Pureauto S-GLU" (상품명, Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.)로 각 혈장에서의 글루코스 농도를 측정하였다.

한편, 아래 언급된 것과 같이 제 1 시약 및 제 2 시약을 포함하는 정량용 시약을 이용하여 D-만노스 농도를 측정하였다. 즉, 256 ㎕의 제 1 시약을 8 ㎕의 각혈장에 첨가하고, 37℃에서 5분동안 반응시킨 다음, 56 ㎕의 제 2 시약을 첨가하고 마찬가지로 37℃에서 5분동안 반응시켰다. 그 다음, 주 파장 450 nm 및 부 파장 700 nm의 두 파장을 갖는 2-포인트 검정으로 흡광도를 측정하였다. 이러한 조작은 Hitachi 7150 Model 자동 분석기로 수행하였다. 표준 물질로서는, 시중 구입가능한 D-만노스를 수용액 형태로 사용하였다. 또한, 용혈 등에 의한 이 측정 시스템에서 측정 오차를 야기할 수도 있는 샘플에 관해서는, 제 2 시약으로부터 알도헥소스 탈수소효소를 제외한 블랭크 시약을 별도로 제조하였고, 동시에 각 샘플을 측정한 다음, 얻은 비-특이적 발색은 특이적 발색으로부터 감산하여 측정 오차를 수정한다.

제 1 시약 :

125 mM Tris-HCl 완충 용액

1.25 mM NADP

0.75 mM WST-1

1.25% Tween 20

6.25 u/ml 디아포라제

12.5 u/ml 글루코키나제

10 mM ATP

2 mM 아세트산 마그네슘

(pH 8.5)

제 2 시약 :

20 mM 인산 완충 용액

23 u/ml 알도헥소스 탈수소효소 (상기 제조예로 얻은 효소)

(pH 7.0)

측정 결과는 도 1에 나타난다.

즉, 75 g 경구 당 부하 시험의 결과로부터, 일본 당뇨병 학회의 진단 기준에 따라 피험자를 정상형, 경계형 및 당뇨병형의 세 집단으로 판단하였다. 그 결과, 정상형 24 명, 경계형 15명, 및 당뇨병형 20명으로서 피험자를 판단하였다. 도 1에서, 정상형으로 판단된 사람은 ◆로 나타내었고, 경계형으로 판단된 사람은 ○로 나타내었고, 당뇨병형으로 판단된 사람은 ×로 나타내었다.

한편 도 1에서, 세로축은 D-만노스 농도를 나타내고, 가로축은 당 부하 직전의 혈장 내 글루코스 농도 (공복시 혈당 수준:FBS)를 나타내고, 각 피험자를 플롯하였다.

FBS에서, 110 mg/dl 미만의 수준은 정상형으로 분류하였고, 110 내지 125 mg/dl의 수준은 경계형으로 분류하였고, 126 mg/dl 이상의 수준은 당뇨병형으로 분류하였다. FBS만으로의 분류에 의해, 정상형은 46명, 경계형은 7명, 그리고 당뇨병형은 6명이었다.

또한, 이 샘플에서 D-만노스 농도의 기준치는 일본 당뇨병 학회의 진단 기준에 따라 정상형인 것으로 판단된 24명의 D-만노스 농도로부터 통계적인 방식으로 계산하였다. 구체적으로, 정상형인 것으로 판단된 24명의 D-만노스 농도가 정상적인 분포를 나타내는 것으로 가정하고, 건강한 사람의 정상 수치 범위가 "평균 수치± 2 x 표준 편차"인 것으로 추정하면, 건강한 사람의 정상 수치 범위는 6.6 ± 2.4 ㎍/ml이고, 상한은 9 ㎍/ml로 계산된다. 또한, 이 상한의 95% 신뢰 구간은 7.3 내지 10.7 ㎍/ml인 것으로 계산된다. 그러나, 이 실시예에서, 기준치를 상한의 9 ㎍/ml인 것으로 설정하였다.

결과로서, FBS의 기준치가 110 mg/dl을 초과하고 그럼으로써 경구 당 부하 시험의 결과에 기초하여 경계형 또는 당뇨병형인 것으로 판단된 13명의 피험자 중 10명은, 혈장에서 D-만노스의 기준치를 초과하는 것으로 나타났다. 즉, FBS에 의해 검출될 수 있는 경계형 또는 당뇨병형 피험자의 70 내지 80%는, 또한 D-만노스 농도의 측정에 의해서도 검출될 수 있는 것으로 나타났다.

또한, FBS의 결과에서 정상형인 것으로 판단된 46 명은, 경계형 또는 당뇨병형인 것으로 분류된, 다시 말해 경구 당 부하 시험의 결과에서는 내당능 장애로 의심된 22 명의 피험자를 포함하였다. 이들 피험자가 경계형 상태 또는 당뇨병형 상태에 있음에도 불구하고, 이들은 정상형인 것으로 분류되었고 1차 시험에서 FBS만을 이용한 종래 진단 시스템에서는 간과되었다. 그러나, 혈장 내의 D-만노스 농도를 이용하는 본 발명에 있어서, 상기 22명의 피험자 중 8명은 기준치를 초과하는 것으로 나타났다.

한편, FBS 및 경구 당 부하 시험 모두에서 정상형인 것으로 분류된 24명의 피험자 (도 1에서 ◆)에 있어서는, 혈장내 D-만노스 농도의 기준치를 초과하는 것으로 확인된 사람이 없었다.

이들 결과로부터, 혈장내 B-만노스 농도를 측정함으로써, 경미한 내당능 장애를 갖는, 즉 전당뇨병 상태에 있고, 그 자신의 정상 FBS 수치 때문에 간과되었던 경계형 피험자를 높은 확률로 검출 또는 발견하는 일이 가능한 것으로 밝혀졌다.

상기 언급된 것과 같이, 본 발명은 공복시의 혈당 수치를 이용한 종래 측정 방법에 의해 간과되어 왔던, 불안정한 당뇨병 환자 및 경미한 내당능 장애에 있는 전당뇨병 환자를 보다 정확하게 발견할 수 있는 전당뇨병 상태의 스크리닝 방법을 제공한다. 결과적으로, 경미한 내당능 장애 등을 갖는 전당뇨병 환자를 초기에 발견하고, 약물 등으로 초기에 적절히 치료하여 당뇨병으로의 진행을 예방하고 나아가 치료 과정을 모니터링하는 것이 가능해졌다.

또한, 현재 사용되는 당뇨병의 검사에 본 발명의 스크리닝 방법을 통합시킴으로써, 본 발명은 예를 들어, 검사 항목의 패널화, 및 이 목적을 위한 소프트웨어의 개발 등, 전체적인 당뇨병 진단 시스템의 구축에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 시약은 단순한 반응 시스템을 갖기 때문에, 다양한 자동 분석기에 손쉽게 적용할 수 있고 다수의 시험 샘플의 처리에도 적합하다.

Claims (10)

1. 피험자로부터 채취한 체액 중의 D-만노스 농도를 측정하는 단계 및 D-만노스 농도를 D-만노스 농도의 사전결정된 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 전당뇨병 상태의 스크리닝 방법.
2. 피험자로부터 채취한 체액 중의 D-만노스 농도 및 글루코스 농도를 측정하는 단계; 및 D-만노스 농도를 D-만노스 농도의 사전결정된 기준치와 비교하는 단계 및 글루코스 농도를 D-글루코스 농도의 사전결정된 기준치와 비교하는 단계를 포함하는, 전당뇨병 상태의 스크리닝 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 체액은 공복 상태 하에 있는 피험자의 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 전당뇨병 상태의 스크리닝 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, D-만노스 농도의 기준치는 공복 상태 하에 있는 건강한 피험자로부터 채취한 혈액, 혈장 또는 혈청을 측정함으로써 얻은 D-만노스 농도를 통계학적으로 처리하여 얻은 상한인 것을 특징으로 하는 전당뇨병 상태의 스크리닝 방법.
5. 전자 수용체의 존재 하에서 만노스에 대하여 탈수소에 의한 산화능을 갖는효소와, 그 효소에 유용한 전자 수용체를 포함하는, 전당뇨병 상태에 대한 스크리닝 시약.
6. 제 5 항에 있어서, 글루코스 소거제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 시약.
7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 효소는 EC.1.1.1.119로 분류되는 글루코스 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 스크리닝 시약.
8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 글루코노박터 속에 속하는 미생물로부터 유래된 알도헥소스 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 스크리닝 시약.
9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 소거제는 글루코스 6-위 인산화 효소 및 아데노신 삼인산을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 스크리닝 시약.
10. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 전자 수용체는 조효소로서 산화된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산인 것을 특징으로 하는 스크리닝 시약.