KR20030082950A - 알레르기의 치료제 및 예방제로서의 유산균 - Google Patents

알레르기의 치료제 및 예방제로서의 유산균 Download PDF

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KR20030082950A KR10-2003-7011522A KR20037011522A KR20030082950A KR 20030082950 A KR20030082950 A KR 20030082950A KR 20037011522 A KR20037011522 A KR 20037011522A KR 20030082950 A KR20030082950 A KR 20030082950A
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Abstract

본 발명은 다양한 상이한 알레르겐에 대한 개인의 알레르기 반응 경향을 감소시킬 수 있는 유산균 균주에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 IgE 분자의 Fc영역의 적어도 부분에 대한 모방체 (mimic)로서 작용하는 펩티드 또는 항체 단편을 포함하는 표면 폴리펩티드를 발현하는 유산균 재조합 균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 미생물 또는 이의 활성 분획을 포함하는 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

알레르기의 치료제 및 예방제로서의 유산균 {LACTIC ACID BACTERIA AS AGENTS FOR TREATING AND PREVENTING ALLERGY}
면역 시스템은 임의의 침입하는 생물학적 또는 화학 물질, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충 및 균류 또는 단지 큰 화학 물질로부터 신체를 보호하는 복잡하고 다인자성인 방어 시스템이다. 신체의 본래의 상태를 유지하는데 필수불가결하지만, 어떤 경우에는 면역 시스템은 질병 자체, 예컨대, 자가면역질환, 염증 또는 알레르기의 원인이 될 수 있다.
알레르기는 다양한 물질 (알레르겐)에 대한 면역 시스템의 부적당한 반응이다. 일반적으로, 개인은 환경에서 규칙적으로 직면하는 물질, 예컨대, 꽃가루또는 식품 재료에 대한 현저한 면역 반응을 일으키지 않는데, 이러한 비반응성은 면역 시스템 그 자체의 억제 기작에 주로 기인한 것 같다. 그러나, 손상된 상태에서 면역 시스템은 상기 억제 활성을 수행하지 않아, 알레르겐에 대한 특이적인 면역 반응, 즉 알레르기 반응을 초래한다.
알레르기 반응의 일반적으로 확립된 기작은 상피막을 통과하여, 밀착결합의 수준 아래의 점막고유층(lamina propria) 또는 상피세포에 위치한 효과기 세포 (effector cell)에 도달하여 활성화시킬 필요가 있는 알레르겐의 흡수와 함께 시작하는 일련의 사건이 관여한다. 알레르기 반응과 관련된 임상 증상은 기본적으로 초기 특이적 면역 반응 및 후기 염증 반응의 결과이다. 초기 상 동안 알레르기 물질에 대한 면역글로불린 E (IgE)는 숙주 면역 시스템에 의해 생성되는데, 이는 이어서 수용체 단백질을 통해 예컨대, 비만세포 (mast cell) 및 호염구(basophil)에 결합된다. 이들 표면상에 IgE 분자를 결합하고 가교시, 세포는 히스타민 및 시토카인을 방출하는데, 이는 이어서 염증 세포를 비도 및 상기도 통로내로 보충함으로써 후기 상을 조절한다. 이어서 호산구, 대식세포, 림프구, 호중구 및 혈소판의 유입은 초기 면역 반응을 증폭시키는 염증 사이클을 시작하고, 이는 차례로 더욱 많은 염증 세포의 방출을 야기한다.
과거에, 알레르기로 고생하는 개인의 수는 증가하였는데, 이는 예컨대, 배기 가스의 원인인 계속 증가하는 대기 오염에 자주 기인한다. 또한, 단백질성 물질의 확대된 소비가 상기 발생, 특히 식품 알레르기의 증가하는 빈도에 기인하는 것 같다. 또한, 선진국에서 직면하는 미생물 감염의 부족은 또한 아토피 질환의 증가에 대한 또 다른 가능한 원인으로서 제안되어 왔다.
그러므로, 지금까지 상이한 접근법이 제안되었던 알레르기를 치료하는 것이 당업계에서 필요하게 되었다.
식품 알레르기 치료에 대해, 일부 방법은 이의 알레르겐 가능성이 감소되도록 식품 재료 자체를 변형시키는 것에 의존한다. 이것은 이의 화학 구조를 변경하거나, 상기 문제의 원인일 수 있는 식품 재료 또는 이의 성분을 각각 제한하거나 금지함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 종종 관련된 문제는 각각의 식품 재료에서 구체적인 알레르겐 물질이 자주 알려져 있지 않아, 대개의 경우에 어느 성분이 선택적으로 제거되거나 변경되어야 하는지가 명확하지 않다는 것에 있다.
식품 알레르기 및 식품 불내성(food intolerance) 을 치료하는 상이한 접근은 식품 알레르겐이 본질적으로 통과할 수 없도록, 장의 완전한 상태를 회복하고 유지하는데 있다. 이에 대해 US 5,192,750 에는 점막이 식품 알레르겐의 전이에 대해 필요한 막을 형성하고, 정상적인 기능을 유지할 수 있기 위한 N-아세틸 글루코사민의 용도가 기재되어 있다.
알레르기를 치료하는 가장 일반적인 접근은 알레르겐에 대해 환자를 탈감(desensitize)시키기 위해, 수 년의 기간에 걸쳐 알레르겐의 반복된 주사를 포함하는 면역요법이다. 그러나, 절차는 시간이 걸리고, 수년간의 치료가 필요하고, 종종 환자를 탈감시키는 목적을 달성할 수 없다.
더욱 최근의 접근에 따라, 비만 세포 및 호염구의 야기를 저해하는 IgE 분자에 대한 개인의 백신 접종이 제안된다. 이를 위해, WO 97/31948 에는 IgE 분자의 3차원적인 입체형태 부분을 닮는 백신 접종용 특이적인 펩티드, 즉 알레르기 및 염증 반응의 조절 역할을 하는 매개자의 방출에 관련된 면역글로불린이 제안된다. 개인 자신의 면역 시스템은 결국 상기 IgE 면역글로불린이 청소되어 없어지도록 상기 IgE 분자에 대한 항체를 형성할 것이다.
그러나, 상기 방법은 생물학적으로 활성인 물질이 침입하는 방법, 예컨대, 어느 투여 경로도 일반적으로 환자가 싫어하는 정맥내 주사에 의해 투여된다는 점에서 통상의 백신 접종 절차에 공통인 단점이 포함되어 있다. 다른 한편으로는, 경구 경로를 선택할 때, 생물학적으로 활성인 물질이 파괴되지 않고 위장관을 통과하도록 적합한 갈레닉 식 (galenic formula)이 고안되어야 한다. 상기 방법에서 직면하는 또 다른 문제는 대개의 경우에 미모토프 (mimotope)는 담체 및 부형제를 제외하고 보조제가 조성물 내에 포함되도록 실질적인 면역 반응을 야기하지 않는 짧은 길이의 펩티드라는 점에 있다.
그러므로, 알레르기를 치료하는 개선된 수단을 제공할 필요가 당업계에 존재한다. 특히, 본 발명의 목적은 효율적이고, 용이하고, 저렴한 방식으로, 바람직하게는 내과의사를 필요로 하지 않고, 상기 치료와 연결된 역 상관을 야기하지 않고, 알레르기의 치료를 허용하는 수단을 제공하는 것에 있다.
상기 목적은 이들의 표면에 IgE 분자의 입체형태적 항원결정부 (미모토프)의 적어도 부분을 모방하는 하나 이상의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 신규 유산균 균주를 제공함으로써 해결되었다.
본 발명은 알레르기 반응을 생성하는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 유산균의 신규 균주에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 IgE 분자의 Fc영역의 적어도 부분에 대한 모방체 (mimic)로서 작용하는 작은 펩티드 및 더 큰 펩티드를 포함하는 표면 폴리펩티드를 발현하는 유산균 재조합 균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 미생물 또는 이의 활성 분획을 포함하는 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1 은 락토바실러스 존슨아이 (Lactobacillus johnsonii) 재조합체의 단백질 염색 및 면역블롯 분석을 보여준다. (A) La1 야생형 (레인 1), pMD112TT 를 갖는 La1 (LalTT, 레인 2) 또는 pMD112ε4 를 갖는 La1 (Lalε4, 레인 3)의 단백질 염색. (B) LalTT (레인 2) 및 Lalε4 (레인 3)에서의 프로테이나아제 PrtB 발현. 대략 108개의 박테리아를 1:2000으로 희석된 항-PrtB 혈청을 이용한 면역블롯으로 분석하였다. 야생형 La1 을 음성 대조군으로서 로딩(loading)하였다 (레인 1). 결합하는 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase) 접합된 염소 항-토끼 IgG (Fc) 항체로 검출하였다. (C) La1TT 의 표면 상에서 파상풍 미모토프의 발현 (레인 2). 슬롯당 대략 108개의 박테리아를 1:1000으로 희석된 항-TT 혈청을 이용한 면역블롯으로 분석하였다. Lal (레인 1) 및 LalE4 (레인 3)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 결합하는 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-토끼 IgG (Fc) 항체로 검출하였다. (D) Lalε4 의 표면 상에서 ε4 미모토프의 발현 (레인 3). 슬롯당 대략 108개의 박테리아를 10㎍/ml의 농도로 항-E4 혈청 (SDS280)을 이용한 면역블롯으로 분석하였다. Lal (레인 1) 및 LalTT (레인 2)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 결합하는 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-토끼 IgG (Fc) 항체로 검출하였다. 화살표는 A-D 에서 보여진 프로테이나아제 밴드의 높이를 나타낸다.
도 2 는 ELISA 에서 유산균 상의 표면 현시된 (displayed) 엡실론 미모토프에 대한 항-TT IgG 의 결합 분석의 결과를 보여준다.
도 3 은 ELISA 에서 유산균 상의 표면 현시된 엡실론 미모토프에 대한 항-ε4 IgG 의 결합 분석의 결과를 보여준다.
본 발명을 이끈 연구에서, 상기 정의된 펩티드 서열을 포함하는 재조합 표면 폴리펩티드를 포함하는 유산균을 제공함으로써, IgE 에 대한 개인의 특이적인 면역화가 본질적으로 모든 항원에 대한 상기 개인의 알레르기 반응이 억제되는 결과와 함께 수득될 수 있다는 것이 지금 발견되었다.
임의의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 섭취시 일정 시간 동안 위장관에 남아 있는 유산균은 효과적인 면역 반응이 일어나서 개인에게 항-IgE 항체를 형성하도록 개인의 면역 시스템에 항원을 제공할 수 있다고 즉시 생각된다. 이 사실은 상기 표면 단백질을 포함하는 위장관 경로를 통해 수행되는 개인에게 박테리아의 투여가 결국 개인의 면역 시스템에 해당하는 항원-미모토프를 제공하여, 면역 시스템이 항원을 인식하고, 거기에 대해 면역 반응을 유도할 것인지를 예상할 수 없기 때문에 더욱 놀랍다. 더욱이, 미모토프를 면역 시스템에 제공하는 생물학적 환경은 명백히 항원에 대해 면역 반응을 유도하는 보조제의 사용이 필요하지 않다는 것이다.
바람직한 구현예에 따라, 미모토프를 포함하는 표면 폴리펩티드를 포함하는 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus) 군 또는 비피도박테리아 (Bifidobacterium) 군 또는 락토코커스 (Lactococcus) 군에 속하고, 더욱 바람직하게는 모두가 인간 또는 동물 유래인 락토바실러스 아시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 존슨아이 (L. johnsonii), 락토바실러스 가세리 (L. gasseri), 락토바실러스 카세이 (L. casei), 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei) 또는 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 군으로부터 유래된다. 더욱 바람직한 구현예에 따라, 유산균은 생균제 유산균이다. 생균제로서, 미생물은 본질적으로 생육가능한 살아 있는 형태로 위장관을 통과할 수 있고, 임의로 또한 숙주의 면역 시스템을 자극할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 가장 바람직한 구현예에 따라, 유산균은 락토바실러스 존슨아이이다.
표면 폴리펩티드의 성질은 "미모토프 펩티드 서열"이 면역 시스템에 접근가능하도록 삽입될 수 있다면 중요하지 않다. 바람직한 구현예에 따라, IgE 면역글로불린의 입체형태적 항원결정부를 모방하는 서열이 삽입되는 표면 폴리펩티드/단백질은 이의 서열이 [Gilbert 등, (1996) J. Bacteriol, 178, 3059-3065]에 발표된 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus)의 세포 표면에 고정된 프로테아제이다. 이 단백질은 2000 개의 아미노산 단백질이며, 효소의 세포밖 수송에 관련된 33 개의 아미노산의 리더 펩티드 (예비영역)에 이어, 절단시 효소의 단백질 가수분해 활성의 활성화와 관련된 일련의 154 개의 아미노산 (프로 영역) 및 활성화 자리의 700-800 개의 아미노산으로 이루어진 것으로 규명되었다. 후속 영역 (약 1000 개의 아미노산)은 생성된 펩티드의 세포에서 절단 및 수송의 특이성 및 세포벽을 가로지르는 역할을 하는 것으로 제안되었다. 상기 프로테아제는 세포벽 펩티도글리칸 구조에 특이적 공유 결합과 관련된 최종 200 개의 아미노산을 갖는 이의 카르복실 말단에 의해 세포벽에 고정된다.
폴리펩티드는 당업계에 주지된 방법에 따라 유산균에서 발현될 수 있다. 예컨대, 시판되는 벡터인 pNZ124 (Platteuw 등, (1994) Appl. Env. Microbiol. 60, 587), pGK12 (Walke 등, (1996) FEMS Microbiol. 138, 233) 또는 pG+host9 (Maguin 등, (1996) J. Bacteriol 178, 931)가 에피좀 발현에 사용될 수 있다. 그러나, 염색체 혼입의 우수한 안정성을 생각하면서, 상기 수행 방식은 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 유전자에 대해 바람직할 수 있다. 염색체 내로의 혼입을 위해, 상동 재조합이 예컨대, 억제하는 펩티드를 포함하고, 내재 유전자를 대체하는 유산규 유래의 재조합 유전자를 이용함으로써 적용될 수 있다. 그러나, 숙주 염색체 내로 재조합 유전자를 도입하는 방법은 당업자의 기술 내에 있다.
IgE 의 입체형태적 항원결정부를 모방하는 펩티드 서열 (서열 번호 1-17) 및 항이디오타입 VH 및 VL 서열 (서열 번호 18-19)은 IgE 의 Fc 부분에 대한 항체를 이용하여 랜덤 펩티드 및 인간 Fab 항체 파아지 현시 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견될 수 있다. 바람직한 미모토프 및 항이디오타입 Fab 서열은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일반적으로 IgE 불변부위의 부분을 모방한 펩티드 및 항이디오타입 VH 및 VL 서열의 분리 및/또는 제조에 관한 더욱 상세한 정보에 대해, 이의 교시가 본원에 참고로 포함된 WO 97/31948 을 참고한다.
본 발명은 또한 전술한 하나 이상의 상기 유산균을 포함한 식품 및 약학 조성물, 특히 백신에 관한 것이다.
박테리아 균주는 조성물 내에 물질 g 당 105내지 1012cfu (콜로니 형성 단위)의 양으로 포함될 수 있다. 식품 조성물은 우유, 요구르트, 응유, 치즈, 발효유, 우유 발효 산물, 아이스크림, 발효된 곡류 산물, 우유 분말, 유아식 또는, 동물의 경우에 애완식일 수 있으며, 약학 조성물은 정제, 액체 박테리아 현탁액, 건조 경구 보조제, 습식 경구 보조제, 건조 튜브 공급 또는 습식 튜브 공급 형태일수 있다.
본 발명의 유산균 및 식품/약학 조성물은 알레르기 반응과 관련된 임의의 질환 상태를 치료하는데 사용될 수 있는데, 여기에서, IgE 항체를 포함하는 면역 반응은 예컨대, 비염, 아토피 피부염, 홍반 등이 관련된다. 마찬가지로, 본 발명의 박테리아/조성물은 일반적으로 개인에서 알레르기의 시작을 막으면서, "백신접종제"로서 사용되는데 적합하다는 것을 인식할 것이다. 이것은 알레르기 치료를 필요로 하는 사람에게 단지 본 발명에 따른 식품 조성물 또는 약학 조성물을 공급함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 섭취시 박테리아는 일정 시간 동안 장에서 콜로니를 형성하여 본 발명의 조성물이 투여된 박테리아 세포수의 양 및 시간에 의존하여, 미모토프가 개인에게 제공되고, 그는 미모토프(들)에 대해 면역 반응을 형성할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함된 유산균외에 면역 시스템을 자극하는 것으로 알려진 물질이 또한 투여되어, 미모토프에 대한 면역 반응을 개선시킬 것이라는 것을 인식할 것이다.
하기 실시예는 또한 이에 제한되지 않고 본 발명을 예시할 것이다.
실시예 1
재조합 폴리펩티드의 구축
두 개의 펩티드, 즉, 파상풍 독소 (하기에 TT 로 불림; 하기 서열 참고) 유래의 펩티드 ε4 (서열 번호 1) 및 또 다른 펩티드 (대조군으로서 사용됨)를 박테리아 La1 (CNCM I-1225)의 표면 상에 현시되도록 락토바실러스 불가리쿠스의 세포표면 고정된 프로테아제와 융합하였다.
미모토프 (ε4)를 락토바실러스 불가리쿠스 유래의 세포 표면 프로테이나아제 (PrtB)와 인 프레임(in frame)으로 융합하였다 (Gilbert 등, (1996) J. Bacteriol, 178, 3059-3065).
프로테아제 유전자를 하기 두 개의 프라이머를 이용하여 이의 프로모터와 함께 먼저 증폭하였다:
5'-TTTTGTGGATCCTTAACTTCATAGCACG-3'
(BamHI 자리를 갖는 유전자의 프로모터 상류)
5'-ATATTATCTAGAATTGAATAGATTGCC-3'
(XbaI 자리를 갖는 유전자의 rho 독립 터미네이터 하류)
증폭 산물을 BamHI 및 XbaI 으로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단된 유산균 벡터 pNZ124에 클로닝하고, 결국 플라스미드가 없는 (베타갈락토시다아제 및 프로테아제 음성) 락토코커스 락타스 (Lactococcus lactis)내로 전기천공법에 의해 도입하였다.
클로닝된 프로테아제의 활성 부위의 영역은 양 말단에서 두 개의 시스테인 잔기에 의해 플랭킹된 TT 및 ε4 펩티드 서열로 대체되었다. 시스테인 잔기는 상기 두 개의 펩티드가 두 개의 시스테인 잔기에 의해 플랭킹된 원형 펩티드로서 파아지 현시 라이브러리로부터 분리되었기 때문에 첨가되었다. 상기 펩티드는 천연 항원결정부를 나타내는 것이 아니라 이들을 모방하므로, 이들은 미모토프라불린다:
이를 달성하기 위해, 클로닝된 프로테아제를 리더 펩티드의 절단 부위의 서열 하류 50 bp 에 위치한 NheI 및 추가의 800 bp 하류에 위치한 PvuI 으로 절단하였다. 목적하는 (이하 동일) 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 이들이 혼성화시 이들의 말단에 두 개의 제한효소 자리를 생성하도록 고안된, 두 개의 올리고뉴클레오티드로서 두 개의 제한효소 자리 사이에 삽입하였다. 올리고뉴클레오티드의 고안은 프로테아제 유전자에 연결시 재조합 단백질의 해독틀이 개방되도록 고려하였다. 증폭 산물을 제한효소로 절단하였다. 양 경우에 DNA 단편을 프로테아제 유전자에 연결하고, 락토바실러스 존슨아이내로 전기천공법으로 도입하였다.
실시예 2
락토바실러스 존슨아이의 형질전환
형질전환 목적으로 락토바실러스 존슨아이 균주 La1 (Institute Pasteur 시판, 등록번호 CNCM I-1225)을 혐기 조건에서 37℃에서 MRS 브로스에서 밤새 키웠다. 이 배양액의 분취량을 사용하여 0.5M 수크로오스를 포함한 또 다른 배양 브로스 (MRS)에 접종하였다 (1:10). 200 ml MRS + 0.5 M 수크로오스 내로 2% 로 추가 재접종 후에, 배양액을 OD595이 0.6 이 되도록 키웠다. 세포를 4℃,5000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리하여 수합하고, 펠렛을 1 M 수크로오스 및 2.5 mM CaCl2를 포함한 1/2 부피의 용액으로 2회, 1 M 수크로오스, 2.5 mM CaC12를 포함한 1/4 부피의 용액으로 1회 세정하고, 원심분리 후에 수득된 펠렛을 3.5 ml 의 1 M 수크로오스, 2.5 mM CaC12+ 0.459 ml 87 % 글리세롤 (최종농도 10 %) 용액 중에 재현탁하였다. 세포를 형질전환을 위해 직접 사용하거나 -80℃에 동결하였다.
전기천공을 위해, 40㎕ 세포를 10 - 100 ng 의 DNA (5㎕ 부피 미만)와 혼합하고, 빙냉 0.2 cm 전기천공 큐벳내로 옮겼다. 빙냉 0.2 cm 전기천공 큐벳 내에서 200 Ω, 25 μF, 2.5 kV 의 펄스를 적용하였다. 큐벳에 1 ml 의 MRS + 20 mM MgCl2, 2mM CaC12를 첨가하고, 현탁액을 37℃에서 2-3 시간 동안 배양하였다. 10㎕ 및 100㎕ 분취량 각각을 적당한 항생제를 포함한 MRS 한천 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 상기와 동일한 온도에서 24-48 시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 선택 배지로서 클로람페니콜 (10㎍/ml)이 포함된 MRS 배지를 사용하였다.
실시예 3
프로테이나아제 PrtB 에 대한 항혈청의 생성
PrtB 에 대한 항혈청을 생성하기 위해, 토끼를 프로테이나아제 B (PrtB)를 발현하는 락토바실러스 델브루엑키아이 아종 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus) 균주 ATCC11842 를 이용하여 피하로 면역화하였다.박테리아를 GasPak 혐기 시스템에서 42℃에서 MRS 배지에서 밤새 키웠다. 상기 배양액의 분취량을 사용하여 0.5M 수크로오스를 포함한 또 다른 배양 브로스 (MRS)에 접종하고, 배양액을 OD595이 0.6 이 되도록 42℃에서 5 시간 동안 키웠다. 세포를 4℃, 5000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리하여 수합하고, 펠렛을 10 ml PBS 로 2회 세정한 후, 2 ml PBS 중에 재현탁하였다. 토끼를 1.5 ml PBS 재현탁된 세포를 이용하여 2 주 간격으로 3회 면역화하고, 최종 공급 7일 후에 토끼의 피를 채취하였다. 2×109락토바실러스 존슨아이 (La1)가 되도록 혈청을 6회 정제하였다.
실시예 4
TT 및 ε4 미모토프에 대한 항혈청의 생성
TT 및 ε4 미모토프에 대한 혈청을 생성하기 위해, 토끼를 폴리옥심-TT 미모토프 구축물 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin: KLH) 접합된 ε4 미모토프를 이용하여 피하로 면역화하였다. 토끼를 2 주 간격으로 4회 면역화하고, 최종 주사 7일 후에 동물의 피를 채취하였다. 항-ε4 혈청을 ε4 미모토프가 커플링된 CH-Sepharose 4B 상에서 면역친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
실시예 5
항체에 의한 미모토프-PrtB 융합 단백질의 검출
유산균이 항체에 의해 접근가능하고, 인식되도록 하는 방식으로 미모토프를발현하는지를 알아보기 위해, 임의의 변형이 없는 PrtB 유전자를 포함하거나 재조합 유전자 (각각 ε4 또는 TT 미모토프를 코딩함)를 포함한 박테리아를 10㎍/ml 클로람페니콜을 포함하는 25 ml 배지에서 키웠다. 박테리아 세포를 4℃, 3000 ×g 에서 15 분 동안 원심분리하여 수확하고, 5 ml TBS 로 세정하고, 재원심분리하였다. 최종적으로 박테리아 펠렛을 450 ㎕ Tris 완충 염수 (TBS: 25mM Tris/HCl pH 7.5, 0.8% NaCl, 0.02% KCl) 및 150㎕ 4 ×비환원 시료 완충액 (80mM Tris/HCl pH 6.8, 2.5% SDS, 0.15% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루) 중에 재현탁하였다. 20㎕ 분취량을 25mM Tris, 192mM 글리신 완충액 (pH 8.3), 100V 에서 60 분 동안 수행한 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) (6% 아크릴아미드-Bis, 0.5M Tris-HCl pH 8.8)으로 분리하였다. 겔을 BM Fast stain (Boehringer Mannheim, 독일)으로 염색하거나 니트로셀룰로오스 막 (Protran BA 83, Schleicher & Schuell, Dassel, 독일) 상에 전기영동적으로 옮겼다. 옮긴 후에, 막을 실온에서 2 시간 동안 PBS/5% BSA 로 블록킹하였다. 면역블롯을 토끼 항-TT 혈청 (1:1000) 또는 항-PrtB 혈청 (1:2000) 으로 밤새 실온에서 인큐베이션하고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-토끼 IgG의 1:1000 희석액으로 실온에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 면역블롯을 2 분 동안 4-클로로-1-나프톨을 이용하여 생성하였다.
도 1 에 보여준 바와 같이, 재조합 락토바실러스 존슨아이는 검출용 적당한 항체를 이용하여 특이적인 밴드를 보여준다는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 프로테이나아제 PrtB 외에 ε4 및 TT 미모토프가 올바른 입체형태로 재조합 박테리아에의해 생산되었다는 것을 나타낸다.
실시예 6
락토바실러스 존슨아이 (La1) 상에 표면 항원 발현을 검출하기 위한 ELISA
형질전환된 박테리아를 10㎍/ml 클로람페니콜을 포함한 50 ml 배지에서 밤새 키웠다. 박테리아 세포를 4℃, 3000 ×g 에서 15 분 동안 원심분리하여 수확하고, 5 ml TBS 로 세정하고, 재원심분리하였다. 최종적으로 박테리아 펠렛을 900 ㎕ TBS 및 100㎕ 0.5M 비카보네이트 완충액 pH 9.6 중에 재현탁하였다. Costar EIA/RIA 하프 웰 (half-well) 플레이트 (Costar, Cambridge, MA)를 웰당 50㎕ 박테리아 용액 (대략 108개의 박테리아)으로 37℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 효율을 코팅 항원으로서 10㎍/ml 의 농도의 TTd 를 이용하여 평가하였다. 박테리아가 남아 있지 않을 때까지 플레이트를 PBS/0.1% Tween-20 으로 폭넓게 세정하였다. 웰을 37℃에서 2 시간 동안 PBS/5% BSA 에서 블록킹하고, 37℃에서 4 시간 동안 10㎍/ml 의 농도로 50㎕의 토끼 항-TT 혈청 또는 친화성 정제된 토끼 항-ε4 혈청 IgG 항체로 인큐베이션하였다. PBS/0.1% Tween-20 으로 6회 세정 후에, 플레이트를 1:1000 희석의 호스래디쉬 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-토끼 IgG 를 이용하여 37℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/O.1% Tween-20 으로 6회 세정하고, 테트라메틸벤지딘(TMB; Fluka Chemie AG, Buchs, 스위스)으로 생성하였다. 반응을 1M H2SO4를 이용하여 종료하고, 흡광도를 ELISA 판독기(Molecular devices, Basel, 스위스)를 이용하여 450 nm 에서 측정하였다.
도 2 및 3에서 설명된 바와 같이, 항-TT 및 항-ε4 항체는 TT 및 ε4 미모토프를 발현하는 살아 있는 재조합체 La1 을 특이적으로 인식하였는데, 이는 두 개의 미모토프가 박테리아의 세포 표면 상에서 발현되고, 현시된다는 것을 나타낸다.

Claims (11)

  1. IgE 분자의 입체형태적 항원결정부의 적어도 부분을 모방하는 펩티드 서열을 포함하는 표면 폴리펩티드를 발현하는 유산균 군의 박테리아 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 락토바실러스 (Lactobacillus) 군 또는 비피도박테리아 (Bifidobacterium) 군 또는 락토코커스 (Lactococcus) 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 아시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 존슨아이 (L. johnsonii), 락토바실러스 가세리 (L. gasseri), 락토바실러스 카세이 (L. casei), 락토바실러스 파라카세이 (L. paracasei) 또는 락토바실러스 루테리 (L. reuteri) 군으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 박테리아 균주.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 표면 폴리펩티드가 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus)의 세포 표면 고정된 프로테아제인 것을 특징으로 하는 박테리아 균주.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 서열이 서열 번호 1 내지 서열 번호 19에서 선택되는 서열 유래인 것을 특징으로 하는 박테리아 균주.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 균주 또는 이의 상층액을 함유하는 식품 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 우유, 요구르트, 응유, 치즈, 발효유, 우유 발효 산물, 아이스크림, 발효된 곡류 산물, 우유 분말, 유아식 또는 애완식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 박테리아 균주가 거기에 투여 형태 당 107내지 1012cfu 의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 식품 재료.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 균주를 함유하는 약학 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 박테리아 균주가 거기에 투여 형태 당 1010내지 1012cfu 의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 알레르기의 치료 및/또는 알레르기 반응의 시작의 예방을 위한 섭취가능한 담체의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 균주의 용도.
  11. 알레르기의 치료 및/또는 알레르기 반응의 시작의 예방을 위한 섭취가능한 담체의 제조를 위한 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 약학 조성물의 용도.
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