KR20030072835A - 대장균(ｋ88), 대장균(ｋ99), 유행성설사병바이러스,전염성위장염바이러스에 대한 특수면역단백질을 함유한계란을 생산하는 방법과 상기 방법으로 생산한 계란에서분리한 난황분말 및 특수면역단백질을 함유한 돼지사료 - Google Patents
대장균(ｋ88), 대장균(ｋ99), 유행성설사병바이러스,전염성위장염바이러스에 대한 특수면역단백질을 함유한계란을 생산하는 방법과 상기 방법으로 생산한 계란에서분리한 난황분말 및 특수면역단백질을 함유한 돼지사료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자돈의 설사증 유발균에 대한 특수면역단백질의 생산방법 및 상기 특수면역단백질을 함유한 사료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 대장균(K88)과 대장균(K99)와 유행성설사병바이러스와 전염성위장염바이러스를 항원화하고 병아리에 면역화하여 특수면역단백질를 함유한 계란을 생산하는 생산방법과 상기 특수면역단백질을 함유한 사료에 관한 것이다.
상기 특수면역단백질을 함유한 사료를 자돈에게 급여시킴으로써 전염성, 유행성 또는 소화기 질환으로 인한 설사증 또는 위장염들을 예방하여 자돈의 폐사율을 감소시키며, 한국농가의 양돈사업을 증진시킬 수 있다.
Description
본 발명은 자돈의 설사증 유발균에 대한 특수면역단백질의 생산방법 및 상기특수면역단백질을 함유한 사료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 대장균(K88)과 대장균(K99)과 유행성설사병바이러스와 전염성위장염바이러스를 항원화하고 병아리에 면역화하여 특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법과 상기 특수면역단백질을 함유한 사료에 관한 것이다.
일반적으로 자돈의 설사증을 발병시키는 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스, 돼지 등포자충(Isospora suis), 캄필로박터(Champylobacter), 로타바이러스 등은 연중 지속적으로 발생하고 있다.
특히, 대장균, 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스로 인한 자돈의 설사증의 발병은 막대한 한국농가에 막대한 경제적 피해를 입히고 있다.
상기 대장균에 의한 자돈의 설사증은 돼지의 모든 연령에서 발생하며, 특히 가장 흔한 발생은 자돈에서 나타난다. 대장균에 의한 자돈의 설사증의 발생양상은 연중 지속적으로 발생하며 포유초기와 이유초기에 강한 감수성을 나타낸다. 대장균이 돼지의 소장을 침범하여 장벽에 부착하여 병을 유발하며, 이때 병을 빈번히 유발시키는 부착인자(pili)에는 K88, K99, 987p, F41 등이 있다. 설사는 1~2주령의 포유기 및 이유기 후에 다발하고 부종형은 이유 후 자돈에서 발생한다. 초유를 먹지 않는 자돈이나 초유에 대장균에 대한 항체를 공급받지 못하는 모돈에서 태어난 자돈은 대장균에 감염되기 쉽다.
상기 유행성설사병바이러스(PEDV)의 원인체는 코로나비리데 코로나바이러스(Coronaviridae Coronavirus)이며, 단독감염보다는 전염성위장염바이러스와 혼합감염의 형태로 나타나는 경우가 많으며, 특히 전염성위장염바이러스 등과 혼합감염시에 자돈의 폐사율은 더욱 증가한다. 유행성설사병바이러스(PEDV)에 의한 돼지 유행성 설사는 구토와 수양성 설사를 주증으로 하는 소화기 질병으로 전염성위장염과 매우 유사하나 2주령 미만의 어린 자돈의 폐사율이 높고 비육돈과 성돈의 발병율도 높게 나타난다. 겨울에 주로 발생하고 연중 발병하며 전파속도는 전염성위장염에 비해 완만한 편이다.
상기 전염성위장염바이러스는 연중 발생되지만 주로 기온이 낮은 겨울철에 많이 발생한다. 급성설사병으로 모든 일령의 돼지에 발생하며, 특히 1주 미만의 포유자돈에 발생할 경우, 대부분이 폐사하게 된다. 전염성위장염바이러스에 의한 질병의 발생은 전 세계적으로 일어나며, 우리나라에서도 1950년대 발생 이후 상재화되어 매년 발생하여 많은 경제적 피해를 주고 있다.
전술한 대장균, 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스로 인한 돼지 폐사율을 감소시키기 위한 예방책은 양돈장의 위생 및 소독관리를 철저히 하고, 임신돈이 분만하기 2~3주 전에 2차 예방접종하여 분만 후 모체이행항체를 통하여 자돈의 설사를 예방한다. 그러나, 이런 예방법을 실행하여도 발생이 지속적으로 일어나고 있으며, 일부 농가에서는 자돈의 설사증을 예방하기 위하여 포유기간 중 모돈들에 대한 사료 급여량을 지나치게 낮은 수준으로 유지하여 이유 자돈 체중 저하, 이유 후 발정 지연 등의 문제가 나타나고 있다.
상기 전술한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 자돈의 설사를 일으키는 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV:Porcine epidemic diarrhea virus), 전염성위장염바이러스(TGEV:Transmissible gastroenteritis virus)를 항원화시켜 병아리에 동시에 접종하여 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란에서 분리한 난황분말 또는 복합특수면역단백질을 함유한 사료를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 네 가지 항원을 독립적으로 병아리에 접종하고 상기 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 별개의 계란에서 분리하여 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말을 일정비율로 혼합한 난황분말의 혼합조성물을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 네 가지 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물을 함유한 사료를 제공하고자 한다.
도 1은 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)를 복합접종시 각각의 특수면역단백질의 역가변화를 나타낸 것이다.
도 2는 대장균(K88)을 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-대장균(K88) 특수면역단백질의 역가변화를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균(K99)을 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-대장균(K99) 특수면역단백질의 역가변화를 나타낸 것이다.
도 4는 유행성설사병바이러스(PEDV)를 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-유행성설사병바이러스(PEDV) 특수면역단백질의 역가변화를 나타낸 것이다.
도 5는 전염성위장염바이러스(TGEV)를 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-전염성위장염바이러스(TGEV) 특수면역단백질의 역가변화를 나타낸 것이다.
도 6은 대장균(K88)을 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-대장균(K88) 특수면역단백질의 평균 역가변화를 나타낸 것이다.
도 7은 대장균(K99)을 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-대장균(K99) 특수면역단백질의 평균 역가변화를 나타낸 것이다.
도 8은 유행성설사병바이러스(PEDV)를 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질의 평균 역가변화를 나타낸 것이다.
도 9는 전염성위장염바이러스(TGEV)를 단독접종시 및 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV), 전염성위장염바이러스(TGEV)와 복합접종시 항-전염성위장염바이러스(TGEV) 특수면역단백질의 평균 역가변화를 나타낸 것이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은, 자돈의 설사를 일으키는 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV:Porcine epidemic diarrhea virus), 전염성위장염바이러스(TGEV:Transmissible gastroenteritis virus)를 항원화시켜 병아리에 동시에 접종하여 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란에 특징이 있다.
또한 본 발명은 상기 네 가지 항원을 독립적으로 병아리에 접종하고 상기 네가지 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 별개의 계란에서 분리하여 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말을 일정비율로 혼합한 난황분말의 혼합조성물에 특징이 있다.
또한 본 발명은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란에서 분리한 난황분말 또는 복합특수면역단백질을 함유한 사료에 특징이 있다.
또한 본 발명은 상기 네 가지 각각의 항원에 대한 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물을 함유한 사료에 특징이 있다.
이하 본 발명의 구성을 살펴보면 다음과 같다.
본 발명은 병아리에 대장균(K88)항원과 대장균(K99)항원과 유행성설사병바이러스(PEDV)항원과 전염성위장염바이러스(TGEV)항원을 수산화알루미늄으로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고, 2회째부터 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균유화액을 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종하고, 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 상기 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균유화액을 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하여 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 병아리에 접종된 항원이, 대장균(K88)항원:대장균(K99)항원:유행성설사병바이러스항원:전염성위장염바이러스항원:수산알루미늄의 비율이 2.1:0.7:3.5:0.7:3이 되도록, 3.8×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.21㎖, 3.6×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.07㎖, 3×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스불활화항원 0.35㎖, 1.5×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.07㎖를 수산화알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고, 2회째부터 상기 네가지 동일비율의 동일항원을 동량의 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종하고, 상기 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하여 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 병아리에 대장균(K88)항원과 대장균(K99)항원과 유행성설사병바이러스(PEDV)항원과 전염성위장염바이러스(TGEV)항원을 프로인트 완전보조제로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고, 2회째부터 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 혼합균유화액을 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종하고, 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 상기 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 혼합균유화액을 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하여 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 병아리에 접종된 항원이, 대장균(K88)항원:대장균(K99)항원:유행성설사병바이러스항원:전염성위장염바이러스항원:유화보조제 비율이 2.1:0.7:3.5:0.7:3이 되도록, 3.8×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.21㎖와 3.6×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.07㎖와 3×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.35㎖와 1.5×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.07㎖를 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고, 2회째부터 상기 네가지 동일비율의 동일항원을 동량의 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하고, 상기 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하여 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기의 방법으로 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 2kg을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 10) 2㎏을 첨가하여 교반하고, 24시간 저온(5-10℃)에 방치 후 난황:알카리이온수(1:1)의 18배 분량(72㎏)의 알카리이온수를 혼합하고 48시간 방치하여 수용성 단백질을 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration)시스탬에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하고 동결건조하는 복합특수면역단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란에서 분리한 난황분말, 복합특수면역단백질에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아래 실시예와 같이 상기 난황분말 또는 복합특수면역단백질을 함유한 사료에 관한 것이다.
또한 본 발명은 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원 각각을 수산화알루미늄 유화보조제로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고, 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여, 총 5회 접종하여 상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 별개의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 병아리에 개별적으로 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 역가가 107TCID50/㎖이 포함되도록, 대장균(K88)항원:유화보조제, 대장균(K99)항원:유화보조제, 유행성설사병바이러스항원:유화보조제, 전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율이 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.5㎖, 2.0×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.5㎖ 각각을 수산화알루미늄 0.5㎖로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리다리에 1㎖를 1회 접종하고, 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고, 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여, 총5회 접종하여 상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원 각각을 프로인트 완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고, 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하여 상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을함유한 난황분말의 혼합조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게 본 발명은 병아리에 개별적으로 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 역가가 107TCID50/㎖이 포함되도록, 대장균(K88)항원:유화보조제, 대장균(K99)항원:유화보조제, 유행성설사병바이러스항원:유화보조제, 전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율이 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.5㎖, 2.0×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.5㎖ 각각을 프로인트 완전보조제 0.5㎖로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고, 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하여 상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질,항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 난황분말의 혼합조성물을 함유하는 사료에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 실시예 및 도면이나 도표에 의거하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예나 도면에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예1
본 실시예1은 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV),전염성위장염바이러스(TGEV)을 항원화하고 병아리에 접종하여 상기 병아리가 생산한 계란에서 복합특수면역단백질을 분리하며 상기 복합특수면역단백질을 함유한 자돈사료에 관한 것이다.
1. 대장균 (Enteropathogenic E.coli) 항원제조
가) 대장균(Escherichia coli)
본 시험에서 항원으로 사용된 대장균은 부착인자에 따른 혈청형 K88과 K99를 사용하였으며, 상기 혈청형 K88과 K99는 유전자은행(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. 선택된 집락은 멕콩키 배지(MacConkey agar)에서 핑크색의 집락으로 자랐으며,EMB배지(EMB agar)에 도말하여 철녹색(metalic green)으로 자라는 대장균(K88)과 대장균(K99)의 특이적인 집락성상을 확인하였다.
나) 대장균(K88), 대장균(K99)항원제조
상기 대장균(K88)과 대장균(K99)균주를 트립티케이스 소이 배지(Trypticase soy agr)에 접종하고 37℃ 항온기에서 18시간 배양하여 하나의 집락(colony)을 5㎖의 트립티케이스 소이 브로쓰(Trypticase soy broth)에 접종하였다. 2시간 후, 대량의 트립티케이스 소이 브로쓰에 접종하고 37℃에서 48시간 정치 배양하였다. 배양된 균액은 포름알데하이드(formaldehyde)를 총량의 0.5%되도록 섞고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체을 수확하였고 멸균생리식염수(pH7.2)로 3회 세척하였다. 수확된 균체는 -70℃에 동결보관하여 사용하였다.
2. 유행성설사병바이러스(PEDV)항원 제조
1) 바이러스의 증식
① 세포주
바이러스의 증식을 위한 숙주세포로 사용된 세포주는 원숭이 신장세포유래의 베로 세포(vero cell)를 사용하였다.
② 사용배지
세포유지용 배지로는 α-최소필수배지(α-Minimum essential Medium:MEM, Gibco BRL)를 사용하였고, 상기 배지에 송아지혈청(Fetal calf serum) 5%를 첨가하고 배지 1ℓ당 효모추출물(yeast extract) 0.02%, 트립토오스 인산배지(Typtosephosphate broth) 0.3%가 되도록 하여 사용하였다.
③ 유행성설사병바이러스의 증폭
베로 세포(Vero cell)를 1×105cell/㎖로 세포배양 플라스크에 분주하여 상기 베로 세포가 단층으로 플라스크의 70%정도로 찼을 때 10㎍/㎖의 트립신을 함유한 비혈청함유 사용배지로 3회 세척 후 유행성설사병바이러스액을 접종하였다. 37℃에서 90분간 감작시키고 2㎍/㎖의 트립신을 함유한 사용배지를 첨가 후 37℃ 항온기에서 세포변성여부를 관찰하였으며, 2일 후 세포변성이 확인된 것은 얼렸다 녹이는 과정을 3회 거쳐 -70℃에 보관하였다.
④ 유행성설사병바이러스의 불활화
유행성설사병바이러스의 불활화는 BEI(2-Bromoethylamide)를 이용하였다. 유행성설사병바이러스액에 최종농도 0.004M의 BEI를 첨가하여 37℃에서 5시간 교반반응시켜 불활화하였다. 상기 교반반응은 0.004M의 소디움 티오셀페이트 용액(Sodium thiosulfate solution, 2M)으로 정지하였다.
⑤ 엘라이자(ELISA)용 유행성설사병바이러스항원의 제조
베로 세포(Vero cell)에서 증폭된 유행성설사병바이러스를 25,000rpm에서 90분간 초고속 원심분리하였다. 원심분리한 후 침전된 바이러스를 2㎖의 완충용액으로 부유하여 4℃에서 16시간 정치시킨 뒤 재부유하였다. 부유된 액체는 18㎑에서 1분간 3회 고주파분리(sonication)하여 엘라이자(ELISA)항원으로 이용하였다.
3. 전염성위장염바이러스(TGEV)항원 제조
1) 바이러스의 증식
① 세포주
전염성위장염바이러스의 증식을 위한 숙주세포로 사용된 세포주는 돼지의 정소세포(Swine Testis cell:ST cell)를 사용하였다.
② 사용배지
세포유지용 배지로는 α-최소필수배지(α-Minimum essential Medium:MEM, Gibco BRL)를 사용하였고, 상기 배지에 소태아혈청(Fetal bovine serum) 5%를 첨가하여 사용하였다.
③ 전염성위장염바이러스의 증폭
상기 돼지정소세포(ST cell)를 1×105cell/㎖로 세포배양 플라스크에 분주하여 상기 돼지정소세포가 단층으로 플라스크의 70%정도로 찼을 때 비혈청함유 사용배지로 3회 세척 후 전염성위장염바이러스액을 접종하였다. 37℃에서 90분간 감작시키고, 1회 세척 후 0.5㎍/㎖의 트립신을 함유한 사용배지를 첨가한다. 37℃ 항온기에서 세포변성여부를 관찰하였으며, 2일 후 세포변성이 확인된 것은 얼렸다 녹이는 과정을 3회 거쳐 -70℃에 보관하였다.
④ 전염성위장염바이러스의 불활화
전염성위장염바이러스의 불활화는 BEI(2-Bromoethylamide)를 이용하였다. 전염성위장염바이러스액에 최종농도 0.004M의 BEI를 첨가하여 37℃에서 5시간 교반반응시켜 불활화하였다. 상기 교반반응은 0.004M의 소디움 셀페이트용액(Sodiumthiosulfate solution, 2M)으로 정지하였다.
⑤ 엘라이자(ELISA)용 전염성위장염바이러스항원의 제조
돼지정소세포(ST cell)에서 증폭된 유행성설사병바이러스를 25,000rpm에서 90분간 초고속 원심분리하였다. 원심분리한 후 침전된 바이러스를 2㎖의 완충용액으로 부유하여 4℃에서 16시간 정치시킨 뒤 재부유하였다. 부유된 액체는 18㎑에서 1분간 3회 고주파분리(sonication)하여 엘라이자(ELISA)항원으로 이용하였다.
4. 복합된 네 가지 항원을 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)
가) 중추12주령의 병아리에 접종된 항원은 대장균(K88)항원:대장균(K99)항원:유행성설사병바이러스항원:전염성위장염바이러스항원:수산화알루미늄의 비율이 2.1:0.7:3.5:0.7:3으로 하여, 3.8×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.21㎖와 3.6×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.07㎖와 3×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.35㎖와 1.5×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.07㎖를 수산화알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고, 2회째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하고, 28주령의 산란계에 4달 간격으로 동일한 비율로 제조한 상기 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균유화액을 0.5㎖씩 2회 접종하여 상기 네 가지 항원을 동시에 총5회 접종하였다. 그 결과 상기 혼합균유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 한 개의 계란에 항-대장균(K88) 특수면역단백질과 항-대장균(K99) 특수면역단백질과 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질과 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.
나) 중추12주령의 병아리에 접종된 항원은 대장균(K88)항원:대장균(K99)항원:유행성설사병바이러스항원:전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율이 2.1:0.7:3.5:0.7:3으로 하여, 3.8×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.21㎖와 3.6×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.07㎖와 3×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.35㎖와 1.5×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.07㎖를 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고, 2회째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)로 유화시킨 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하고, 28주령의 산란계에 4달 간격으로 동일한 비율로 제조한 상기 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)로 유화시킨 혼합균유화액을 0.5㎖씩 2회 접종하여 상기 네 가지 항원을 동시에 총5회 접종하였다. 그 결과 상기 혼합균유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균(K88) 특수면역단백질과 항-대장균(K99) 특수면역단백질과 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질과 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.
5. 난황분리, 난황분말추출, 특수면역단백질 분리 및 역가 측정
가) 난황분리
상기 방법에 의하여 생산된 계란을 깨서 난백을 제거하고 신선 난황을 분리하여 지정된 용기에 넣어 보관하였다.
나) 난황분말
상기 분리된 신선 난황을 동결건조하여 난황분말을 제조하고 냉소에 보관하였다.
다) 특수면역단백질의 분리
상기 가) 또는 나)에 의해 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 20g을 넣고 동량의 알카리이온수(pH 10) 20㎖를 첨가하여 교반한 후, 24시간 저온(5∼10℃)에 방치하고 난황:알카리이온수(1:1)의 18배 분량(720㎖)의 알카리이온수를 섞어 48시간 방치한 후, 수용성 단백질을 추출하고 상등액을 울트라 필터레이션 (Ultra filteration)시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하며 특수면역단백질분말을 제조하였다.
라) 역가측정
상기의 방법으로 얻어진 수용성 단백질 중 특수면역단백질의 함량을 다음과 같이 측정하였다.
또한, 특수면역단백질의 함량 측정은 샌드위치 엘리사(ELISA)방법으로 수행하였다. 대장균(K88)과 대장균(K99)의 흡광도(O.D.)값이 660㎚에서 0.05가 되도록 완충액으로 희석하였고, 유행성설사병바이러스와 전염성위장염바이러스는엘라이자(ELISA)항원으로 제작된 것을 100배 희석하여 사용하였다. 상기 희석된 원인체를 마이크로플레이트에 코팅하고 철야로 방치하였다. 이 마이크로플레이트를 세척하고 상기 여과된 수용성 단백질을 넣고 반응시켜 세척한 후, 1/10,000로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가하였다. HRP의 기질로는 TMB를 사용하였고, 반응 정지액으로는 2N-황산(2N-H2SO4)을 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 1, 도 2, 도 3, 도 4, 도 5, 도 6, 도 7, 도 8, 도 9에 도시하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스를 프로인트 유화보조제와 유화보조제(ISA25)를 사용하여 복합접종할 경우, 상기 세균 및 바이러스는 유화보조제(ISA25)보다는 프로인트 유화보조제로 유화시켜 접종한 경우 역가가 높게 나타났으며, 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스 순서로 역가가 높게 나타났다.
도 2와 도6에서 보는 바와 같이, 대장균(K88)은 단독 접종보다는 복합접종시에 프로인트 유화보조제를 사용하여 접종시 역가가 최고로 나타났으며, 접종 40일이 지난 후에도 역가가 일정히 유지되었다.
도 3과 도 7에서 보는바와 같이, 대장균(K99)는 단독 접종보다는 복합접종시에 프로인트 유화보조제를 사용하여 접종시 역가가 최고로 나타났으며, 접종 40일이 지난 후에도 역가가 일정히 유지되었다.
도 4와 도 8에서 보는바와 같이, 유행성설사병바이러스는 단독 접종보다는복합접종시에 프로인트 유화보조제를 사용하여 접종시 역가가 최고로 나타났으며, 접종 60일이 지난 후에도 역가최고치와 많은 차이없이 일정히 유지되었다.
도 5와 도 9에서 보는 바와 같이, 전염성위장염바이러스는 단독접종의 경우 역가최고치를 나타냈으나, 프로인트 유화보조제를 사용하여 복합접종시 접종 60일이 경과 후에도 높은 역가를 유지하였다.
6. 네 가지 특수면역단백질을 함유한 자돈사료 제조
가) 수용성 단백질 추출
수용성 단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다. 막을 제거한 난황 35g을 250㎖병에 넣고 알카리이온수 35㎖를 첨가하여 교반하였다. 24시간 저온(5~10℃)에서 방치하고 난황:알카리이온수(1:1)액의 18배 분량(1260㎖)의 알카리이온수와 혼합하여 48시간 방치한 후, 추출하고 상등액을 울트라 필터레이션 (Ultra filteration)시스탬에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하고 동결건조하였다.
나) 추출한 수용성 단백질을 함유한 자돈사료 제조
앞 항에서와 같이 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원으로 혼합시킨 복합항원을 접종 후, 생산된 계란에서 난황을 분리한 후, 추출한 수용성단백질(crude IgY)분말을 첨가하여 자돈사료로 사용하였다(표 1, 표 2).
다) 난황분말을 함유한 자돈사료 제조
앞 항에서와 같이 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원으로 혼합시킨 복합항원을 접종하여 생산된 계란에서 난황을 분리한 후, 동결건조하고 복합특수면역단벡질을 함유한 난황분말을 첨가하여 자돈사료로 사용하였다.(표 1, 표 2)
| 설사예방 자돈사료 배합비 예 | |||
| 원료 | 배합비A | 배합비B | 배합비C |
| 옥수수 | 62.5 | 64.00 | 64.00 |
| 대두박 | 24.8 | 22.25 | 17.90 |
| 어분 | 3.00 | 3.50 | 3.50 |
| 석회석 | 0.90 | 0.90 | 0.90 |
| 인상칼슘 | 1.50 | 1.40 | 4.00 |
| 가공염 | 0.40 | 0.40 | 1.40 |
| 당밀 | 1.00 | 2.00 | 0.40 |
| 과자분 | 2.00 | 2.00 | 2.00 |
| 영양제 | 3.70 | 3.50 | 2.00 |
| *복합특수면역단백질 함유 난황분말 | 0.20 | - | 3.50 |
| *복합특수면역단백질 분말 | - | 0.05 | - |
| ME(㎉/㎏) | 3,250 | 3,300 | 3,300 |
| 칼슘 | 1.12 | 1.10 | 1.20 |
| 인 | 0.68 | 0.60 | 0.60 |
| *복합특수면역단백질은 네 가지 항원을 복합접종하여 생산한 계란에서 추출 |
| 설사예방 자돈사료 배합비 예 | |||
| 원료 | 배합비A | 배합비B | 배합비C |
| 옥수수 | 36.8 | 36.8 | 36.6 |
| 대두박 | 21.8 | 20.05 | 18.6 |
| 어분 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 석회석 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 가공염 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 분말우지 | 9.6 | 9.5 | 9.6 |
| 포도당 | 11.0 | 11.0 | 11.0 |
| 대두유 | 15.0 | 15.0 | 15.0 |
| MCP | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 영양제 | 1.6 | 1.6 | 1.6 |
| 복합특수면역단백질 함유 난황분말 | 0.2 | 2.0 | 2.0 |
| 복합특수면역단백질 분말 | - | 0.05 | - |
| ME(㎉/㎏) | 3,300 | 3,280 | 3,300 |
| 칼슘 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 인 | 0.67 | 0.67 | 0.67 |
| *복합특수면역단백질은 네가지 항원을 복합접종하여 생산한 계란에서 추출 |
실시예2
본 실시예2는 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스(PEDV),전염성위장염바이러스(TGEV)를 항원화하고 서로 다른 병아리에 개별적으로 접종하여 상기 서로 다른 병아리가 생산한 개별적 계란에서 각각의 특수면역단백질을 분리하며 상기 각각의 특수면역단백질을 일정비율 혼합한 혼합조성물을 함유한 자돈사료에 관한 것이다.
1. 대장균(K88), 대장균(K99) 항원제조
본 발명에 사용된 대장균(K88)과 대장균(K99)의 항원제조는 실시예1에 제시된 바와 같다.
2. 유행성설사병바이러스(PEDV: porcine epidemic diarrhea virus)항원제조
유행성설사병바이러스(PEDV: porcine epidemic diarrhea virus)항원제조도 실시예1에 제시된 바와 같다.
3. 전염성위장염바이러스(Transmissible gastroenteritis virus)항원제조
전염성위장염바이러스(Transmissible gastroenteritis virus)항원제조도 실시예1에 제시된 바와 같다.
3. 네 가지 항원을 개별적으로 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)
가) 중추12주령의 병아리에 접종된 균체수는 108/㎖였으며, 대장균(K88)항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 대장균(K99)항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 유행성설사병바이러스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 대장균(K99) 사균액항원0.5㎖와 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원과 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.5㎖와 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시켜 제조한 각각의 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 2회째부터는 상기 각각의 네 가지 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리에 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하고, 성장한 산란계에 4달 간격으로 상기 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하였다.
나) 중추12주령의 병아리에 접종된 균체수는 108/㎖였으며, 대장균(K88)항원:유화보조제의 비율은 1:1, 대장균(K99)항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 유행성설사병바이러스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖과 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 대장균(K99) 사균액항원 0.5㎖와 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원과 수산화알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)0.5㎖를 유화시켜 제조한 각각의 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 2회째부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 개별균유화액을 상기 개별균유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 동일한 비율로 제조한 개별균유화액을 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하였다.
상기 가), 나)의 결과 상기 개별균유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란을 생산하였다.
4. 난황분리, 난황분말추출, 특수면역단백질 분리 및 역가 측정
난황분리, 난황분말추출, 시험분석에 사용한 특수면역단백질의 분리 및 측정법은 실시예1과 같다.
5. 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 자돈사료제조
앞 항에서와 같이 개별적으로 대장균(K88), 대장균(K99), 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스를 접종 후 생산된 계란에서 추출한 특수면역단백질분말(crude IgY) 또는 난황건조분말을 각각 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1의 비율 중 어느 하나의 비율을 선택하고 혼합하여 사료첨가제로 사용하였으며, 자돈사료의 제조 배합비는 아래 제시된 바와 같다.
| 설사예방 자돈사료 배합비 예 | |||
| 원료 | 배합비A | 배합비B | 배합비C |
| 옥수수 | 62.5 | 64.0 | 64.0 |
| 대두박 | 24.8 | 22.25 | 17.9 |
| 어분 | 3.0 | 3.5 | 3.5 |
| 석회석 | 0.9 | 0.9 | 0.9 |
| 인산칼슘 | 1.5 | 1.4 | 4.0 |
| 가공염 | 0.4 | 0.4 | 1.4 |
| 당밀 | 1.0 | 2.0 | 0.4 |
| 과자분 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 영양제 | 3.7 | 3.5 | 2.0 |
| *항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 난황분말 | 0.2 | - | 3.5 |
| *항-혼합균 특수면역단백질 | - | 0.05 | - |
| ME(㎉/㎏) | 3,250 | 3,300 | 3,300 |
| 칼슘 | 1.12 | 1.1 | 1.2 |
| 인 | 0.68 | 0.6 | 0.6 |
| *혼합균은 네 가지 항원을 개별접종하여 생산한 계란에서 추출 |
본 발명은 상술한 특정의 실시예, 도표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 생산된 계란에서 추출한 자돈의 설사증을 유발하는 대장균(K88), 대장균(99), 유행성설사병바이러스, 전염성위장염바이러스에 대한 특수면역단백질을 보유한 난황분말과 특수면역단백질을 함유한 사료는 전염성, 유행성 또는 소화기질환으로 인한 자돈의 설사증을 예방할 수 있다.
또한 본 발명은 자돈이 생후 또는 이유 직후 전염성 또는 유행성 설사증에 감염되었을 경우, 체내 항체 부족으로 인한 폐사율을 예방할 수 있다.
또한 본 발명은 사료에 특수면역단백질을 첨가함으로써 고가의 항생제나 백신의 사용을 지양하고 사료의 질을 향상시킬 수 있으며 한국농가의 양돈사업을 증진시킬 수 있다.
Claims (15)
- 병아리에 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원을 수산화알루미늄으로 유화시켜 제조한 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고,2회째부터 상기 네가지 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종하고,상기 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하는 방법으로,생산한 상기 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 동시에 공유하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법.
- 제1항에 있어서,상기 병아리에 접종된 항원이, 대장균(K88)항원:대장균(K99)항원:유행성설사병바이러스항원:전염성위장염바이러스항원:수산화알루미늄의 비율이 2.1:0.7:3.5:0.7:3이 되도록, 3.8×108/㎖ 대장균(K88) 사균액항원 0.21㎖, 3.6×108/㎖ 대장균(K99) 사균액항원 0.07㎖, 3×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.35㎖, 1.5×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.07㎖를수산화알미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고,2회째부터 상기 네가지 동일비율의 동일항원을 동량의 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종하고,상기 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하는 방법으로,생산한 상기 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 동시에 공유하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법.
- 병아리에 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원을 프로인트 완전보조제로 유화시켜 제조한 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고,2회째부터 상기 네가지 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종하고,상기 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하는 방법으로,생산한 상기 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 동시에 공유하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법.
- 제3항에 있어서,상기 병아리에 접종된 항원이, 대장균(K88)항원:대장균(K99)항원:유행성설사병바이러스항원:전염성위장염바이러스항원:유화보조제 비율이 2.1:0.7:3.5:0.7:3이 되도록, 3.8×108/㎖ 대장균(K88) 사균액항원 0.21㎖와 3.6×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.07㎖와 3×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.35㎖와 1.5×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.07㎖를 프로인트 완전보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균유화액 1㎖를 병아리 다리에 1회 접종하고,2회째부터 상기 네가지 동일비율의 동일항원을 동량의 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 상기 병아리 다리에 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종하고,상기 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 혼합균유화액을 성장한 산란계에 다시 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하는 방법으로,생산한 상기 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 동시에 공유하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질을 함유한 계란생산방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란.
- 제5항의 계란에서 분리한 난황을 동결건조하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질을 함유한 난황분말.
- 제6항의 복합특수면역단백질을 보유한 난황분말을 함유한 자돈사료.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 계란으로부터 분리한 난황을 용기에 넣어 동량의 알카리이온수을 첨가하여 교반하고,하루정도 5∼10℃ 온도에서 방치한 후 난황과 알카리이온수(1:1)액의 18배 분량이상의 알카리이온수와 다시 혼합하여 48시간 정도 방치하여 분리한 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration)시스탬에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 수용성 복합특수면역단백질을 추출하여 농축하고 동결건조하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질의 생산방법.
- 제8항의 생산방법으로 생산된 복합특수면역단백질분말.
- 제9항의 복합특수면역단백질분말을 함유한 사료.
- 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원 각각을 수산화알루미늄으로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고,상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고,상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여, 총5회 접종하여,상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물.
- 제11항에 있어서,상기 병아리에 개별적으로 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 역가가 107TCID50/㎖이 포함되도록, 대장균(K88)항원:유화보조제, 대장균(K99)항원:유화보조제, 유행성설사병바이러스항원:유화보조제, 전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율이 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.5㎖, 2.0×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.5㎖ 각각을 수산화알루미늄 0.5㎖로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고,상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시켜 제조한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고,상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여, 총 5회 접종하여,상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병 특수면역단백질, 항-전염성위장염 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물.
- 대장균(K88)항원, 대장균(K99)항원, 유행성설사병바이러스항원, 전염성위장염바이러스항원 각각을 프로인트 완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고,상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고,상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여, 총 5회 접종하여상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균( K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물.
- 제13항에 있어서,상기 병아리에 개별적으로 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 역가가 107TCID50/㎖이 포함되도록, 대장균(K88)항원:유화보조제, 대장균(K99)항원:유화보조제, 유행성설사병바이러스항원:유화보조제, 전염성위장염바이러스항원:유화보조제의 비율이 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균(K88)사균액항원 0.5㎖, 2.0×108/㎖ 대장균(K99)사균액항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 유행성설사병바이러스 불활화항원 0.5㎖, 2×107TCID50/㎖ 전염성위장염바이러스 불활화항원 0.5㎖ 각각을 프로인트 완전보조제 0.5㎖로 유화시켜 제조한 개별균유화액을 서로 다른 병아리 다리에 1㎖를 1회 접종하고,상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 개별균유화액을 상기 서로 다른 병아리 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종하고,상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시켜 제조한 개별균유화액을 서로 다른 성장한 산란계에 4달 간격으로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여, 총 5회 접종하여상기 각각의 항원에 대한 항-대장균(K88) 특수면역단백질, 항-대장균(K99) 특수면역단백질, 항-유행성설사병바이러스 특수면역단백질, 항-전염성위장염바이러스 특수면역단백질이 생산된 별개의 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 난황분말의 혼합조성물을 함유하는 사료.
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| CN111217906A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 郑洪杰 | 猪消化系统疾病的预防或治疗用卵黄抗体的制造方法以及基于此而制造的卵黄抗体及其用途 |
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