KR20030045041A - 크립토 종양 폴리펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 암, 특히 폐암, 결장암, 결장직장암 및 유방암을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 예시된 조성물은 하나 이상의 크립토 종양 폴리펩타이드, 이것의 면역원성 부분, 이러한 폴리펩타이드를 인코딩시키는 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 대해 특이적인 T 세포를 포함한다. 개시된 조성물은, 예를 들어 질환, 특히 폐암, 결장암, 결장직장암 및 유방암을 진단하고, 예방하고/하거나 치료하는데 유용하다.

Description

크립토 종양 폴리펩타이드 {CRIPTO TUMOUR POLYPEPTIDE}

크립토(CRIPTO)는 표피 성장 인자(EGF) 계열과 유사성을 공유하는 188개의 아미노산 단백질이다[참조: EMBO Journal(1989) Vol 8(7) pp1987-1991].

사람 크립토(huCRIPTO) mRNA는 미분화 세포에서만 검출되고, 세포 분열 m크립토가 임신 및 수유기[포유동물 상피 세포에서 분지(branching) 형태발생을 유도한다] 동안에 발현된 후 소멸하고, 정상적인 유방 세포에 대한 자가분비 성장 인자인 것으로 추정된다. 크립토는 마우스 배아에서 전후 축의 정확한 배향을 위해 요구된다.

사람 크립토 유전자가 미국 특허 제5,654,140호에서 밝혀졌다.

암은 세계 각지에서 상당한 건강상의 문제가 되고 있다. 암의 검출 및 치료가 발전되어 왔지만 예방 및/또는 치료용 백신 또는 기타 보편적으로 성공적인 방법이 현재 유용하지 못한 실정이다. 일반적으로 화학요법 또는 수술 및 방사선 치료의 병용을 기반으로 하는 현재 치료법은 많은 환자에게 부적당한 것으로 판명되고 있다.

결장 암은 미국에서 가장 흔히 진단되는 제2의 악성 암일 뿐만 아니라 암 사망의 가장 일반적인 제2의 원인이다. 1998년에 95,600명으로 추정되는 새로운 사례의 결장 암이 진단되었고 이중에서 47,700명이 사망한 것으로 추정된다. 조기 국소 단계에서 검출된 결장직장암을 앓는 환자에 대한 5년 생존율은 92%이지만 불행하게도 결장직장암의 37%만이 조기 단계, 즉 생존 단계에서 진단된다. 생존율은 암이 인접한 기관 또는 림프 결절로 전이되는 경우 64%로 저하되고, 보다 멀리 전이가 진행된 환자의 경우는 7%로 저하된다.

결장암의 징후는 장벽에 대한 종양의 침투 정도, 전이 수준, 결절과 연관되어 있는지의 여부와 직접 관련이 있어, 결과적으로 조기 검출 및 치료가 특히 중요하다. 현재 진단은 대변 잠혈에 대한 스크리닝 분석법, 구불결장경검사, 결장내시경술 및 이중 조영 바륨 관장을 사용하여 보강된다. 치료 섭생은 암의 유형 및 진행 단계에 의해 결정되고, 수술, 방사선 치료 및/또는 화학치료를 포함한다. 수술후 재발(치료의 가장 공통된 양태)이 주요 문제점이고 흔히 사망의 궁극적인 원인이 된다. 질환 치료에 대한 상당한 연구에도 불구하고 결장암을 진단하고 치료하기가 여전히 어려운 상태이다. 따라서, 결장암을 치료하기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이들 요구를 충족시키고 추가로 또 다른 관련 이점을 제공한다.

유방암은 미국 및 세계 각처의 여성에게 있어서 상당한 건강상의 문제가 되고 있다. 질환의 검출 및 치료가 발전되어 왔지만, 유방암은 여전히 여성의 암 관련 사망에 있어서 2번째의 원인이 되고 있다. 해마다 미국에서는 180,000명의 여성에게 발병되고 있다. 북아메리카의 여성에게 있어서 일생동안 유방암이 발병할 가능성은 현재 8명중 1명 꼴이다.

유방암의 예방 또는 치료용 백신, 또는 또 다른 보편화된 성공적인 방법이 현재 유용하지 못하다. 현재 질환에 대한 조치는 조기 진단(통상적인 유방 스크리닝 과정에 의한) 및 수술, 방사선치료, 화학치료 및 호르몬 치료와 같은 하나 이상의 다양한 치료를 포함하는 적극적인 치료법을 병용하는데 있다. 특정 유방암에 대한 치료 과정은 흔히, 특이적 종양 마커의 분석을 포함하는 다양한 징후 파라미터를 근거로 하여 선택된다[참조: Porter-Jordan and Lippman, Breast Cancer 8: 73-100 (1994)]. 그러나, 확립된 마커의 사용은 흔히 질환 분석을 어렵게 하고, 유방암에서 관찰되는 높은 치사율은 질환의 치료 및 예방이 개선될 필요가 있음을 지적한다.

폐암은 미국에서 남성 및 여성 모두에서 암의 주요 원인이고 1994년에 172,000명으로 추정되는 새로운 사례가 보고되었다. 모든 폐암 환자중에서 5년 생존율은 13%에 불과하다. 이것은, 여전히 질환이 국소적인 것으로 검출된 경우의 5년 생존율이 46%인 것과는 대조적이다. 그러나, 폐암의 16%만이 암이 전이하기 전에 발견된다.

당해 암 및 기타 암에 대한 치료법이 상당히 연구되었지만 유방암, 결장암 및 결장직장암은 여전히 진단하기가 어려워 효과적으로 치료하기가 곤란하다. 따라서, 당해 기술 분야에서는 상기 암의 치료 및 예방을 위한 방법이 개선될 필요가 있다. 본 발명은 이들 필요성을 충족시키고 추가로 기타 관련 장점을 제공한다.

발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은,

(a) SEQ ID NO: 1 또는 3의 전체 서열이 아닌 SEQ ID NO: 1 또는 3에 제시된 서열의 20개 이상의 연속 잔기로 이루어진 서열 및

(b) SEQ ID NO: 1 또는 3으로 이루어진 서열 또는 SEQ ID NO: 1 또는 3에 제시된 20개 이상의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 서열 및 이종성 융합 파트너를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 면역원성, 즉 이들은 면역 반응, 특히, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있고 필요한 경우 이들은 적합한 담체 및/또는 애쥬반트와 결합된다.

본 발명은 추가로, 기술된 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 단편, 변이체 및/또는 유도체를 제공하는데, 여기에서 단편, 변이체 및/또는 유도체는 바람직하게 SEQ ID NO: 2 또는 4에 제시된 폴리펩타이드 서열의 면역 활성 또는 SEQ ID NO: 1 또는 3의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 서열의 면역 활성 수준의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상 및 보다 바람직하게는 90% 이상의 면역 활성 수준을 갖는다.

본 발명은 추가로, 당해 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 당해 발현 벡터로 형질전환되거나(transformed), 트랜스펙팅된(transfected) 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 관련 측면에서, 약제학적 조성물, 예를 들어, 백신 조성물이 예방학적 또는 치료학적 적용을 위해 제공된다. 당해 조성물은 일반적으로 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 애쥬반트와 같은 면역자극제를 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 상기된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예시된 항원 제공 세포는 수지상 세포, 마크로파아지, 단핵구, 섬유아세포 및 B 세포를 포함한다.

관련 측면에서, (a) 상기된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 (b) 면역자극제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명은 추가로, 또 다른 측면에서, 전형적으로 생리학적으로 허용되는 담체 및/또는 면역자극제를 포함하는 약제학적 조성물, 예를 들어, 백신 조성물 형태로서 상기된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질 뿐만 아니라 당해 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 다중 면역원성 폴리펩타이드 또는 이의 일부/변이체를 포함할 수 있고, 폴리펩타이드(들)의 발현, 정제 및/또는 면역원성을 촉진시키기 위한 하나 이상의 폴리펩타이드 절편을 추가로 포함할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 환자의 면역 반응, 바람직하게는 사람 환자의 T 세포 반응을 자극시키는 방법을 제공한다. 환자는 폐암 또는 결장암 또는 결장직장암 또는 유방암을 앓을 수 있고, 이 경우에 질환 치료용 방법이 제공되거나 당해 질환에 걸릴 위험에 처한 것으로 사료되는 환자는 예방학적으로 처치될 수 있다. 특히, 환자는 크립토 항원을 발현하는 종양을 앓는다.

추가의 측면에서, 본 발명은 상기된 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게서 발병된 암의 진행을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 환자는 폐암, 결장암, 결장직장암 또는 유방암을 앓을 수 있고, 이 경우에 질환 치료용 방법이 제공되거나 당해 질환에 걸릴 위험에 처한 것으로 사료되는 환자는 예방학적으로 처치될 수 있다.

본 발명은 추가로 또 다른 측면에서 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계(여기서, 접촉 단계는 단백질을 발현하는 세포를 샘플로부터 제거하기에 충분한 조건하에 그리고 시간동안 수행한다)를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.

관련 측면에서, 상기된 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 환자에게 투여함을 포함하는 환자에게서 발병된 암의 진행을 억제하는 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, T 세포를 자극시키고/시키거나 확장시키는데 충분한 조건 하에 및 시간동안 (i) 상기된 바와 같은 폴리펩타이드, (ii) 당해 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 (iii) 당해 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포중 하나 이상을 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포를 자극시키고/확장시키는 방법이 추가로 제공된다. 상기된 바와 같이 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단이 또한 제공된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 유효량의 T 세포 집단을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에게서 발병된 암의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, (a) 환자로부터 분리된 CD4⁺및/또는 CD8⁺T 세포를 (i) 본원에 기술된 크립토 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드, (ii) 당해 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 (iii) 당해 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포로 인큐베이팅시키는 단계 및 (b) 유효량의 증식된 T 세포를 환자에게 투여함으로써 환자에게서 발병된 암의 진행을 억제하는 단계를 포함하는, 환자에게서 발병된 암의 진행을 억제하는 방법을 제공한다.

이들 측면 및 본 발명의 또 다른 측면은 하기의 상세한 설명을 참조로 명백해질 것이다. 본원에 인용된 모든 참조 문헌은 각각이 개별적으로 인용되는 바와같이 이의 전반적인 내용이 참조로서 본원에 인용된다.

본 발명은 일반적으로 결장암, 결장직장암, 유방암, 방광암, 폐암 및 자궁암과 같은 암의 치료에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 적어도 일부의 크립토(cripto) 종양 단백질을 포함하는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 특히, 약제학적 조성물, 예를 들어, 특정 작지 않은 장(long) 세포 암종, 유방암, 결장암, 결장직장암과 같은 크립토 발현 암종인 암의 치료용 백신 및 기타 조성물에 관한 것이다.

서열 확인

SEQ ID NO 1: 크립토 1 폴리뉴클레오타이드,

SEQ ID NO 2: 크립토 3 폴리뉴클레오타이드,

SEQ ID NO 2: 크립토 3 폴리펩타이드 1,

SEQ ID NO 3: 크립토 1 폴리펩타이드,

SEQ ID NO 4: 크립토 3 폴리펩타이드,

SEQ ID NO 5: 미국 특허 제5654140호에 기술된 바와 같은 크립토 폴리뉴클레오타이드,

SEQ ID NO 6: 미국 특허 제5654140호에 기술된 바와 같은 크립토 폴리뉴클레오타이드,

SEQ ID NO 7 내지 10: PCR 프라이머,

SEQ ID NO 11 및 12: 합성 크립토 1 펩타이드,

SEQ ID NO 13 내지 94: 크립토 1 및 3으로부터 유래한 에피토프,

SEQ ID NO 95: 크립토 1 변이 폴리뉴클레오타이드,

SEQ ID NO 96: 크립토 1 변이 폴리펩타이드.

본 발명은 일반적으로 암, 특히 크립토 발현 암, 및 크립토 발현 폐암, 결장암, 결장직장암 및 유방암을 포함하는 전이 암의 치료 및 진단용 조성물; 및 이의용도에 관한 것이다. 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 본 발명의 예시된 조성물은 폴리펩타이드, 특히, 면역원성 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 항체 및 기타 결합제, 항원 제공 세포(APC) 및 면역계 세포(예를 들어, T 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시에는 특별히 다르게 언급되지 않는 경우, 당해 분야의 기술 범위내에 있는 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술에 대한 통상적인 방법을 사용하고, 이들 대다수는 설명을 목적으로 하기에 기술되어 있다. 당해 기술은 문헌에 상세하게 기술되어 있다: Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985) ; Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

이전 또는 이후에 상관없이 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 문헌 및 특허원은 이들의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 정관사 및 부정관사("a", "an" 및 "the")는 내용에서 명백하게 다르게 언급하지 않는 경우 복수를 포함한다.

폴리펩타이드 조성물

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 이의 통상적인 의미(즉, 특정 서열의 아미노산)로 사용된다. 폴리펩타이드는 특정 길이의 생성물에 제한되지 않아 폴리펩타이드 정의에는 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질이 포함되고 이러한 용어는 특별히 달리 언급되지 않는 경우, 본원에 상호적으로 사용될 수 있다. 당해 용어는 또한 발현후 변형된(예를 들어, 당화, 아세틸화, 인산화등) 폴리펩타이드 및 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 당해 분야에 공지된 또 다른 변이체를 언급하거나 이를 배제하지 않는다. 폴리펩타이드는 완전한 단백질 또는 이의 부분 서열일 수 있다. 본 발명에서 관심있는 특정 폴리펩타이드는 즉, 실질적으로 폴리펩타이드에 면역원성을 부여하고 면역 반응을 자극할 수 있는 항원성 결정인자인 에피토프를 포함하는 아미노산 부분 서열이다.

본 발명의 바람직하게 예시된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2 또는 4의 크립토 단백질의 10개 이상의 연속 아미노산 서열, 바람직하게는 20개 이상, 보다 바람직하게는 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개 및 180개 이상의 연속 아미노산 서열을 포함한다.

특정 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역원성이어서 이들은 면역분석법(예를 들어, ELISA 또는 T-세포 자극 분석법)에서 크립토 발현 암을 앓는 환자로부터 채취한 항혈청 및/또는 T-세포와 검출가능하게 반응한다. 면역 활성에 대한 스크리닝은 당해 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 하나의 예에서, 폴리펩타이드는 고형 지지체상에 고정화될 수 있고 환자 혈청과 접촉되어 혈청내 항체가 고정화된 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 혈청은 제거될 수 있고, 결합된 항체는 예를 들어,¹²⁵I-표지된 단백질 A를 사용하여 검출된다.

당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 또한 본원에 기술된 폴리펩타이드의 면역원성 부위를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 부위"는 그 자체로서 폴리펩타이드를 인식하는 B 세포 및/또는 T 세포 표면 항원 수용체와 면역학적으로 반응(즉, 특이적으로 결합하는)하는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드의 단편이다. 면역원성 부위는 일반적으로 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(Raven Press, 1993)] 및 기타 본원에 인용되는 참조문헌에 요약된 바와 같이 널리 공지된 기술을 사용하여 동정될 수 있다. 당해 기술은 폴리펩타이드가 항원 특이적 항체, 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 스크리닝하는 방법을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항혈청 및 항체는 이들이 항원(즉, 이들은 ELISA 또는 기타 면역분석법에서 단백질과 반응하고 관련없는 단백질과 검출가능하게 반응하지 않는다)과 특이적으로 결합하는 경우 "항원-특이적"이다. 당해 항혈청 및 항체는 본원에 기술된 바와 같이 널리 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성 부위는 실질적으로 전장 폴리펩타이드의 반응성 못지 않은 수준(예를 들어, ELISA 및/또는 T 세포 반응 분석에서)에서 항혈청 및/또는 T 세포와 반응하는 부위이다. 바람직하게, 면역원성 부위의 면역 활성 수준은 전장 폴리펩타이드에 대한 면역원성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상이다. 몇몇 경우에, 상응하는 전장 폴리펩타이드 보다 큰 면역 활성 수준을 갖는, 예를 들어 약 100% 이상 또는 150% 이상의 면역 활성을 갖는 바람직한 면역원성 부위가 동정될 것이다.

특정 또 다른 양태에서, 예시된 면역원성 부위는 N 말단 리더 서열 및/또는 막관통 도메인이 결실된 펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예시된 면역원성 부위는 성숙한 단백질과 비교하여 소형 N-말단 및/또는 C-말단이 결실(예를 들어, 1 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산)된 것을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 또한 본 발명의 폴리펩타이드, 특히, 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체에 대해 생성된 T 세포 및/또는 항체와 면역학적으로 반응성인 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열에 포함되는 연속 핵산 서열에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체 또는 중간정도의 엄중 조건 내지 높은 엄중 조건하에서 하나 이상의 당해 서열과 하이브리드화하는 하이브리드화하는 하나 이상의 핵산 서열과 면역학적으로 반응성인 T 세포 및/또는 항체를 유도할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 또는 4에 제시된 폴리펩타이드 또는 SEQ ID NO: 1 또는 3에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 같이, 모든 중간 길이를 포함하여 본원에 제시된 폴리펩타이드 조성물중에 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개, 100개 또는 150개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 단편을 제공한다. 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 13 내지 94에 제시된 바와 같이 바람직하게 하나 이상의 다수의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 임의로 단편은 이종성 담체에 융합되거나 결합된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩타이드 조성물의 변이체를 제공한다. 본 발명에 일반적으로 포함되는 폴리펩타이드 변이체는 전형적으로 본원에 제시된 폴리펩타이드 서열과 이의 서열 길이를 따라 약 70% 이상, 75% 이상, 80%이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 나타낼 것이다.

하나의 바람직한 양태에서, 본 발명은 본원에 특별히 제시된 전장 폴리펩타이드와 반응하는 항체 및/또는 T 세포와 면역학적으로 반응성인 폴리펩타이드 단편 및 변이체를 제공한다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 본원에 특별히 제시된 전장 폴리펩타이드 서열이 나타내는 면역 활성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 면역 활성 수준을 나타내는 폴리펩타이드 단편 및 변이체를 제공한다.

본원에 사용된 용어로서 폴리펩타이드 "변이체'란 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함하여 본원에 특별히 제시된 폴리펩타이드와 전형적으로 상이한 폴리펩타이드이다. 당해 변이체는 천연적으로 존재하거나, 예를 들어, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 서열 하나 이상을 변형시키고 본원에 기재된 바와 같이 이의 면역 활성을 평가하고 당해 기술분야에 널리 공지된 다수의 기술중 어느 하나를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 예시된 변이체는 N 말단 리더 서열 또는 막관통 도메인과 같은 하나 이상의 부위가 제거된 변이체를 포함한다. 또 다른 예시된 변이체는 소형 부위(예를 들어, 1 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개의 아미노산)가 성숙한 단백질의 N 및/또는 C 말단으로부터 제거된 변이체를 포함한다.

다수의 경우에, 변이체는 보존성 치환을 포함할 것이다. "보존성 치환"은 아미노산이 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것으로서, 펩타이드 화학 분야의 기술자라면 폴리펩타이드의 2차 구조 및 친소수성(hydropathic) 특성이 실질적으로 변화되지 않을 것임을 예상할 것이다. 상기된 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조가 변형될 수 있지만 여전히 바람직한 특성, 예를 들어, 면역원 특성을 갖는 변이되거나 유도된 폴리펩타이드를 인코딩하는 작용성 분자를 수득할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시켜 동등하거나 심지어 개선된 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성 변이체 또는 부위를 제조할 필요가 있는 경우, 당해 기술 분야의 기술자는 전형적으로 표 1에 따라 코딩 DNA 서열의 코돈 하나 이상을 변화시킬 것이다.

예를 들어, 항체의 항원 결합 영역 또는 기질 분자에 대한 결합 부위와 같은 구조의 상호작용 결합 능력을 감지할 수 있을정도로 상실시키지 않으면서 특정 아미노산은 단백질 구조에서 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 그 단백질의 생물학적 기능 활성을 한정하는 단백질의 상호작용 능력과 성질이 있기때문에 단백질 서열은 물론 이의 기본 DNA 코딩 서열에 특정 아미노산 서열의 치환이 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 성질을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 따라서, 생물학적 용도 또는 활성을 감지할 수 있을 정도로 상실시키지 않으면서 본 발명에 개시된 조성물의 펩타이드 서열이나 이 펩타이드를 인코딩하는 상응하는 DNA 서열을 다양하게 변화시킬 수 있을 것으로 사료된다.

이와 같은 변화를 만들 때, 아미노산의 친소수성 지수가 고려되어야 한다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 친소수성 아미노산 지수의 중요성은 당해 기술분야에 널리 알려져 있다(참고 인용되는 문헌 Kyte and Doolittle, 1982 참조). 아미노산의 상대적인 친소수성 특성은 최종 단백질의 2차 구조에 기여하여, 결과적으로 그 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 나타내는 것으로 인정되고 있다. 각 아미노산의 친소수성 지수는 소수성과 전하 특성에 기초하여 결정된다(Kyte and Doolittle, 1982). 그 값은 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2);류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

특정 아미노산은 친소수성 지수 또는 값이 유사한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 그 결과 생물학적 활성이 유사한 단백질, 즉 생물학적 기능적 등가 단백질을 얻을 수 있다는 것은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이와 같은 변화를 만들 때, 친소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산으로의 치환이 바람직하고, 특히 ±1 이내인 아미노산으로의 치환이 더 바람직하며, ±0.5 이내인 아미노산으로의 치환이 특히 더 바람직하다. 또한, 당업자라면 유사한 아미노산의 치환이 친수성에 기초하여 효과적으로 실시될 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 미국 특허 제4,554,101호(그 전체적으로 본 발명에 구체적으로 참고인용됨)는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 경우 단백질의 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 성질과 상호관련이 있음을 기술하고 있다.

미국 특허 제4,554,101호에 기술된 바와 같이, 아미노산 잔기마다 할당된 친수성 값은 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 즉, 아미노산은 친수성 값이 유사한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 생물학적 등가, 특히 면역학적으로 등가인 단백질을 만들 수 있다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 범위내인 아미노산으로의 치환이 바람직하고, 특히 ±1 범위내의 아미노산으로의 치환이 더 바람직하며, ±0.5 범위내의 아미노산으로의 치환이 더욱 더 바람직하다.

간략히 전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 이와 같은 다양한 특징을 고려한 치환의 예는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 그 예로는 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신이 있다.

또한, 폴리뉴클레오타이드는 생체내 안정성을 증가시키기 위한 추가 변형을 실시할 수 있다. 가능한 변형으로는, 5' 및/또는 3' 말단에 인접한 서열의 첨가; 주쇄에 포스포디에스테라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸 결합의 이용; 및/또는 이노신, 퀘오신 및 위부토신과 같은 비통상적인 염기는 물론 아세틸, 메틸, 티오 및 다른 변형된 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 내포가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

아미노산 치환은 또한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하의 아미노산으로는 아스파르트산과 글루탐산이 있고, 양전하의 아미노산으로는 라이신과 아르기닌이 있으며, 친수성값이 유사한 전하를 띠지 않은 극성 헤드기를 가진 아미노산으로는 류신, 이소류신 및 발린; 글라이신과 알라닌; 아스파라긴과 글루타민; 및세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 타이로신이 있다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 군으로는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; (5) phe, tyr, trp, his 이 있다. 변이체는 또한, 또는 대안적으로 비보존적 변화를 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 변형 폴리펩타이드는 천연 서열과 5개 아미노산 또는 그 이하의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 차이가 있는 것이 좋다. 변이체는 또한(또는 대안적으로) 예를 들어 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 친소수성 특성에 최소 영향을 미치는 아미노산의 결실이나 첨가에 의해 변형될 수 있다.

전술한 바와 같이, 폴리펩타이드는 단백질의 N-말단에 시그날(또는 리더) 서열을 포함할 수 있어, 해독과 동시에 또는 해독 후 단백질의 전이를 유도할 수 있다. 이 폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하거나 폴리펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 향상시키기 위하여 링커 또는 다른 서열(예를 들어, 폴리-His)에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합될 수 있다.

폴리펩타이드 서열을 비교할 때, 두 서열 중의 아미노산 서열이 하기 기재되는 바와 같이 최대 상응성이 나타나게 정렬시켰을 때 동일한 경우에는 "동일성"이 있는 것이라 할 수 있다. 두 서열간의 비교는 일반적으로 비교창 상의 서열을 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역들을 동정하고 비교함으로써 실시한다. 본 명세서에 사용된 "비교창"이란 용어는 약 20개 이상의 인접 위치의 단편, 보통 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 단편을 의미하는 것으로, 두 서열을 적당하게 정렬시킨 후 서열을 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.

비교 서열들의 최적의 정렬은 디폴트(default) 변수를 사용하여 메갈라인 프로그램[Lasergene suite of bioinformatics software(DNASTAR, Inc., Madison, WI)]을 사용하여 실시할 수 있다. 이 프로그램은 다음과 같은 참조 문헌에 기술된 몇몇 정렬도를 구체화한 바 있다: Dayhoff, M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships; In Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC. Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J.(1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W.(1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D.(1971) Comb.Theor 11:105; Saitou, N. Nes, M.(1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.(1973) Numerical Taxonomy- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur,W.J. and Lipman, D.J.(1983) Proc.Natl.Acad., Sci. USA 80:726-730.

또는, 비교 서열들의 최적 정렬은 문헌[참조:Smith and Waterman(1981) Add.APL. Math 2:482]에 기술된 국소 동일성 알로리듬, 문헌[참조:Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443]에 기술된 동일성 정렬 알고리즘,문헌[참조:Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444]에 기술된 유사성 방법에 대한 연구, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)의 전산 처리 또는 검색으로 수행할 수 있다.

서열 동일성% 및 서열 유사성%를 측정하는데 적합한 알고리즘 중 바람직한 일예는 문헌[참조:Altschul et al.(1977) Nucl.Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기술되어 있는 BLAST 알고리즘과 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에 기술된 변수들과 함께 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 서열 동일성%를 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 용이하게 입수할 수 있다. 아미노산 서열의 경우에는 득점 매트릭스를 사용하여 누적값을 계산할 수 있다. 누적된 정렬 값이 최대 값 보다 X만큼 떨어지거나, 하나 이상의 마이너스 값의 잔기 정렬들의 축적으로 인하여 누적값이 0 또는 그 이하가 되거나 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하게 되면 각 방향으로 진행되는 단어 적중의 전개를 중지시킨다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다.

바람직한 하나의 방법으로서, "서열 동일성 %"는 20개 위치 이상의 비교 창에 있는 2개의 적절하게 정렬된 서열을 비교하여 측정한다. 이 때 비교 창에 있는 폴리펩타이드 서열의 일부는 두 서열을 최적으로 정렬시키기 위하여 대조 서열(즉,첨가나 결실을 포함하지 않는 서열)과 비교했을 때 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일성 %는 두 서열에 존재하는 동일한 아미노산 잔기의 위치의 수를 측정하여 정합 위치의 수를 얻고, 이 정합 위치의 수를 대조 서열의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나눈 뒤, 그 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 얻는다.

예시적인 다른 양태로서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 복수의 폴리펩타이드를 포함하거나 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리펩타이드와 공지의 종양 단백질과 같은 무관련 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어 T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 도움을 주거나 또는 천연의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는데 도움을 줄 수 있다. 바람직한 특정 융합 파트너는 면역학 및 발현 양자를 모두 향상시키는 융합 파트너이다. 또한, 폴리펩타이드가 목적하는 세포내 구획으로 표적화될 수 있도록 하거나 폴리펩타이드의 용해성을 증가시키기 위하여 다른 융합 파트너를 선택할 수도 있다. 또 다른 융합 파트너로는 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하는 친화성 태그를 포함한다.

융합 폴리펩타이드는 일반적으로 화학적 접합을 비롯한 표준 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 발현계에서 비융합된 폴리펩타이드에 비하여 생산 함량이 증가된 재조합 폴리펩타이드로서 발현되는 것이 좋다. 간략히 설명하면, 폴리펩타이드 성분을 인코딩하는 DNA 서열은 각각 조합되어 적당한 발현 벡터에 결합될 수 있다. 제1 폴리펩타이드 성분을 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단이 제2 폴리펩타이드 성분을 인코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 펩타이드 링커의 존부를 불문하고 서열의 판독 프레임이 유지되는 상태로 결합된다. 이와 같이 하면, 두 폴리펩타이드 성분의 생물학적 활성을 보유하는 하나의 융합 폴리펩타이드로 해독될 수 있다.

펩타이드 링커 서열은 각각의 폴리펩타이드가 자신의 2차 및 3차 구조로 접힐 수 있는 충분한 거리를 두고 제1 폴리펩타이드 성분과 제2 폴리펩타이드 성분을 분리시키는데 사용할 수 있다. 이와 같은 펩타이드 링커 서열은 당해 기술분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 융합 폴리펩타이드에 포함시킨다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음과 같은 요인에 근거하여 선택할 수 있다: (1) 유연하게 전개된 입체적 구조를 형성할 수 있는 능력; (2) 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 상의 기능적 에피토프들과 상호작용할 수 있는 2차 구조를 형성하지 않는 성질; (3) 폴리펩타이드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 띤 잔기의 부족. 바람직한 펩타이드 링커 서열로는 Gly, Asn 및 Ser 잔기가 있다. 다른 중성 부근의 아미노산인 Thr 및 Ala도 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열로는 문헌[참조:Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 개시된 것을 포함한다. 링커 서열은 일반적으로 아미노산 길이가 1 내지 약 50개일 수 있다. 링커 서열은 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드가 기능적 도메인을 분리하여 입체 장애를 방지할 수 있는데 사용할 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 가진 경우에는 필요하지 않다.

결합된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 인자에 작동가능하게 결합된다. DNA의 발현에 중요한 역할을 하는 조절 인자는 제1 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열의 5'측에만 위치한다. 이와 마찬가지로, 해독을 종결시키는데 필요한 종결 코돈 및 전사 종결 시그날은 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열의 3' 측에만 존재한다.

융합 폴리펩타이드는 관련이 없는 면역원성 단백질, 예를 들어 조회 반응을 유도할 수 있는 면역원성 단백질과 함께 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이와 같은 단백질의 예로는 파상풍, 결핵균 및 간염 단백질을 포함한다[예를 들어, Stoute et al. New Engl.J.Med., 336: 86-91, 1997].

바람직한 한 양태로서, 면역학적 융합 파트너는 마이코박테리아 종 유래의 것, 예를 들어 인형결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래의 Ra12 단편일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 향상시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 이의 사용 방법에 대해서는 그 전체 내용이 본 발명에 참고인용되는 미국 특허 출원번호 60/158,585호에 설명되어 있다. 간략히 설명하면, Ra12는 인형결핵균 MTB32A 핵산의 준서열인 폴리뉴클레오타이드 영역을 의미한다. MTB32A는 인형결핵균의 독성 균주 및 무독성 균주 중의 유전자에 의해 인코딩된 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 문헌[참조:예를 들어, 미국 특허 출원번호 60/158,585호;Skeiky et al., Infection and Immun.(1999) 67:3998-4007, 본 발명에 참고인용됨]에 제시되어 있다. MTB32A 코딩 서열의 C-말단 단편은 다량으로 발현하여 정제 과정을 통해 용해성 폴리펩타이드로서 남아 있는다. 더욱이, Ra12는 여기에 융합된 이종의 면역원성 폴리펩타이드의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 바람직한 Ra12 융합 폴리펩타이드의 하나는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14KD C-말단 단편을 포함하는 것이다. 다른 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 Ra12 폴리펩타이드의 일부를 인코딩하는 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 약 30개 이상의 뉴클레오타이드, 약 60개 이상의 뉴클레오타이드, 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 약 200개 이상의 뉴클레오타이드 또는 약 300개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 인코딩하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오타이드 변이체는 인코딩된 융합 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 천연의 Ra12 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 비하여 실질적으로 감소되지 않는 정도의 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연의 Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타내는 것이 좋다.

다른 바람직한 양태로서, 면역학적 융합 파트너는 그람 음성 세균인 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인 단백질 D(WO91/18926)에서 유래하는 것이다. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 이 단백질의 대략 처음 1/3(즉, 처음 N-말단의 100 내지 110개 아미노산)을 포함하는 것이 좋으며 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 바람직한 특정 양태로서, N-말단 상에 리포단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기를 포함하여 추가 외인성 T-세포 에피토프를 갖고 이. 콜리에서의 발현량이 증가된(즉, 발현 인핸서) 폴리펩타이드를 제공할 수 있다. 지질 꼬리는 항원 제공 세포에 대하여 항원의 최적 제시에 도움을 준다. 다른 융합 파트너로는 독감 바이러스인 NS1 유래의 비구조 단백질(헤마글루티닌)을 포함한다. 일반적으로, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 다른 단편들도 사용될 수 있지만 N-말단의 81개 아미노산이 사용된다.

또 다른 양태에서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 알려진 단백질이나 또는 이의 일부(바람직하게는 C-말단 일부)이다. LYTA는 아미다제 LYTA로 알려진 N-아세틸-L-알라닌 아미다제(LytA 유전자에 의해 인코딩됨; Gene 43: 265-292, 1986)를 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에서 유래하는 것이다. LYTA는 펩티도글리칸 주쇄 중의 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자기분해제이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린이나 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화성에 주요 역할을 한다. 이와 같은 성질은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발에 이용된 바 있다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제에 대해서도 개시된 바 있다(Biotechnology 10:795-798, 1992). 바람직한 양태로서, LYTA의 반복 부분을 융합 폴리펩타이드에 포함시킬 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서 시작하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188 내지 305를 포함하는 것이다.

또 다른 예시적 양태는 융합 파트너가 미국 특허 제5,633,234호에 기술된 바와 같은 엔도솜/리소좀 구획으로 폴리펩타이드를 유도할 수 있는 표적 시그날을 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 같은 표적 시그날과 융합된 경우 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드는 MHC 부류 II 분자와 보다 효율적으로 결합하여, 이 폴리펩타이드에 특이적인 CD4⁺T-세포의 세포내 자극을 향상시킨다.

융합 분자의 크립토 부분은 본원에 기술된 바와 같은 크립토 1 또는 크립토 3의 전장 188개의 아미노산이거나 이의 단편일 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 공지의 합성 및/또는 재조합 기법을 사용하여 제조하며, 재조합 기법에 대해서는 이하 보다 상세하게 설명된다. 일반적으로 약 150개 미만의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 그 일부 및 다른 변이체는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 합성법으로 제조할 수 있다. 예시적 일 예로서, 이러한 폴리펩타이드는 아미노산을 성장하는 아미노산쇄에 연속적으로 첨가하는 메리필드 고상 합성법과 같은 상용화된 고상 기법을 사용하여 합성한다[Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85:2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동 합성 장치는 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼(Foster City, CA)과 같은 공급회사들로부터 구매할 수 있으며, 제조자의 지시에 따라 작동시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물(예를 들어, 융합 폴리펩타이드 포함)은 분리된 것이다. "분리된" 폴리펩타이드는 본래 환경에서 분리된 것이다. 예를 들어, 자연 발생의 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연계에 공존하는 물질 일부 또는 전체로부터 독립된 것이라면 분리된 것이다. 바람직하게는, 이와 같은 폴리펩타이드는 정제되기도 하는데, 예를 들어 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 정제된 것이 좋다.

폴리뉴클레오타이드 조성물

본 발명은 다른 측면으로서 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. "DNA"와 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 특정 종의 총 게놈 DNA으로부터 분리된 DNA 분자를 의미하는 것으로, 본 명세서에서는 대부분 상호교환적으로 사용되고 있다. 본 명세서에 사용된 "분리된"이란 폴리뉴클레오타이드가 다른 코딩 서열로부터 실질적으로 독립되어 있고, DNA 분자가 무관련 코딩 DNA, 예를 들어 큰 염색체 단편이나 다른 기능적 유전자 또는 폴리펩타이드 코딩 영역 등을 대부분 포함하지 않는 것을 의미한다. 물론, 이 용어는 본래 분리된 자체의 DNA 분자를 의미하지만, 인위적으로 절편에 이후 첨가된 유전자 또는 코딩 영역을 배제하는 것은 아니다.

당업자에게는 자명하듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 게놈 서열, 게놈외 서열 및 플라스미드 코딩 서열 및 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나 발현하도록 조작된 것일 수 있는 이보다 작은 조작된 유전자 단편을 포함할 수 있다. 이와 같은 단편은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된것일 수 있다.

또한, 당업자에게 자명하듯이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(코딩 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있고, DNA 분자(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하고 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에는 추가 코딩 서열 또는 비코딩 서열이 포함될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 결합될 수 있지만, 반드시 결합될 필요는 없다.

폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 본 발명의 폴리펩타이드/단백질 또는 그 일부를 인코딩하는 내인성 서열)을 포함하거나 이와 같은 서열의 변이체 또는 유도체, 바람직하게는 면역원성 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

일반적으로, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을, 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 면역원성이 본 명세서에 구체적으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에 비하여 유의적으로 감소되지 않을 정도로 포함하는 것이 좋다. "변이체"란 용어는 또한 이종성의 상동성 유전자를 포함하는 것으로 이해해야 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 3의 하나 이상과 상보적이거나 동일한 다양한 길이의 연속 선상의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 제공한다. 본 발명은, 예를 들어, 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 30개 이상, 약 40개 이상, 약 50개 이상, 약 75개 이상, 약 100개 이상, 약 150개 이상, 약 200개 이상, 약 300개 이상, 약 400개 이상 또는 SEQ ID NO: 1의 서열 및 이 사이의 중간 길이의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 내용에서 "중간 길이"란 인용된 수치 사이의 모든 길이, 예를 들어, 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200 내지 500, 500 내지 100 등에 속하는 모든 정수에 속하는 모든 길이를 의미한다. 특히 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 13 내지 94에 제시된 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편이나 이의 상보성 서열과 중간 내지 높은 엄중 조건하에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. 하이브리드화 기법은 분자생물학 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 것으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 시험하기에 적합한 중간 엄중 조건은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0) 용액으로 예비세척하는 단계; 50 내지 60℃에서 5X SSC 하에 하룻밤동안 하이브리드화하는 단계; 그 다음 65℃에서 20분 동안 각각 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 각각 2회씩 세척하는 단계를 포함하는 것이다. 당업자라면, 하이브리드화의 엄중도는 하이브리드화 용액의 염 함량 및/또는 하이브리드화가 수행되는 온도를 변화시키는 등의 방법으로 용이하게 조작될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 다른 양태로서, 적합한 높은 엄중한 하이브리드화 조건은 하이브리드화 온도를 예를 들어 60 내지 65℃ 또는 65 내지 70℃로 증가시키는 것을 제외하고는 전술한 바와 같다.

바람직한 특정 양태로서, 전술한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 변이체, 단편 및 하이브리드화 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3에 구체적으로 제시된 폴리펩타이드 서열과 면역학적으로 교차반응성인 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 바람직한 양태에서,이와 같은 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 구체적으로 제시된 폴리펩타이드의 면역원성 활성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 수준을 보유하는 폴리펩타이드를 인코딩한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이 그 전체 길이를 상당히 변화시킬 수 있는 다른 DNA 서열, 예를들어 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 단편 등과 조합될 수 있다. 따라서, 거의 어떤 길이의 핵산 단편도 이용할 수 있으며, 전체 길이는 사용하고자 하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조와 사용의 용이성에 의해서만 제한된다. 예를 들어, 전체 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2000, 약 1000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50염기쌍(그 중간 길이도 모두 포함해서)인 예시적인 폴리뉴클레오타이드 단편은 본 발명의 많은 실시에 유용한 것으로 생각된다.

폴리뉴클레오타이드 서열을 비교할 때, 두 서열 중의 뉴클레오타이드 서열이 하기 기재되는 바와 같이 최대 상응성이 나타나게 정렬시켰을 때 동일한 경우에는"동일성"이 있는 것이라 할 수 있다. 두 서열간의 비교는 일반적으로 비교창 상의 서열을 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역들을 동정하고 비교함으로써 실시한다. 본 명세서에 사용된 "비교창"이란 용어는 약 20개 이상의 인접 위치의 단편, 보통 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 단편을 의미하는 것으로, 두 서열을 적당하게 정렬시킨 후 서열을 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.

비교 서열들의 최적의 정렬은 디폴트(default) 변수를 사용하여 메갈라인 프로그램(Lasergene suite of bioinformatics software(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 실시할 수 있다. 이 프로그램은 다음과 같은 참조 문헌에 기술된 몇몇 정렬도를 구체화한 바 있다: Dayhoff, M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships; In Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC. Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J.(1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W.(1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D.(1971) Comb.Theor 11:105; Santou, N.Nes, M.(1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.(1973) Numerical Taxonomy- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur,W.J. and Lipman, D.J.(1983) Proc.Natl.Acad., Sci.USA 80:726-730.

또는, 비교 서열들의 최적 정렬은 문헌[참조:Smith and Waterman(1981) Add.APL. Math 2:482]에 기술된 국소 동일성 알로리듬, 문헌[참조:Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443]에 기술된 동일성 정렬 알고리즘, 문헌[참조:Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444]에 기술된 유사성 방법에 대한 연구, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)의 전산 처리 또는 검색으로 수행할 수 있다.

서열 동일성% 및 서열 유사성%를 측정하는데 적합한 알고리즘 중 바람직한 일예는 문헌[참조:Altschul et al.(1977) Nucl.Acids Res. 25:3389-3402 및 Altschul et al.(1990) J,Mol.Biol. 215:403-410]에 각각 기술되어 있는 BLAST 알고리즘과 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에 기술된 변수들과 함께 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 서열 동일성%를 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 용이하게 입수할 수 있다. 예시적 일 예로, 뉴클레오타이드 서열에 대하여 변수 M(정합 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(부정합 잔기에 대하여 패널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 누적값을 계산할 수 있다. 누적된 정렬 값이 최대 값 보다 X만큼 떨어지거나, 하나 이상의 마이너스 값의 잔기 정렬들의 축적으로 인하여 누적값이 0 또는 그 이하가 되거나 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하게 되면 각 방향으로 진행되는 단어 적중의 전개를 중지시킨다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어길이(W) 11, 예상치(E) 10을 사용하고 BLOSUM62 득점 매트릭스(Henikoff and Henikoff(1989) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10915) 정렬은 (B) 50, 예상치(E) 10, M=5, N=-4 및 두 쇄의 비교값을 사용한다.

바람직하게는, "서열 동일성 %"는 20개 위치 이상의 비교 창에 있는 2개의 적절하게 정렬된 서열을 비교하여 측정한다. 이 때 비교 창에 있는 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열을 최적으로 정렬시키기 위하여 대조 서열(즉, 첨가나 결실을 포함하지 않는 서열)과 비교했을 때 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 동일성 %는 두 서열에 존재하는 동일한 핵산 염기의 위치의 수를 측정하여 정합 위치의 수를 얻고, 이 정합 위치의 수를 대조 서열의 위치의 총 수(즉, 창 크기)로 나눈 뒤, 그 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 얻는다.

유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 다수개 존재한다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 몇가지는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소의 상동성을 보유하기도 한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 상이한 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 구체적 예로 포함되는 것이다. 또한, 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자들도 본 발명의 영역에 속하는 것이다. 대립유전자는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 변이, 예를 들어 결실, 첨가 및/또는 치환에 의해 변화된 내인성 유전자이다. 그 결과 얻어지는 mRNA 및 단백질은 구조나 기능이 변화될 수 있으나, 반드시 그런 것은 아니다. 대립유전자는 표준 기법(예를 들어, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)으로 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 명세서에 제시된 폴리펩타이드의 면역원성 변이체 및/또는 유도체를 제조하기 위하여 부위 특이적 돌연변이유발법과 같은 돌연변이유발 방법을 사용할 수 있다. 이 방법에 의하면, 폴리펩타이드 서열에 특정 변형들을 이들을 인코딩하는 기본 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발을 통해 이룰 수 있다. 이 기법은 예를 들어 폴리뉴클레오타이드에 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 변화를 도입시켜 전술한 변형을 하나 이상 포함하는 서열 변이체를 제조하고 시험하는 직접적인 방법을 제공한다.

부위 특이적 돌연변이유발법은 결실 접합부의 양 측이 교차하는 안정한 이본쇄를 형성하기에 충분한 크기와 서열 복잡성을 가진 프라이머 서열을 제공하기 위하여 충분한 수의 인접 뉴클레오타이드는 물론 목적한 돌연변이의 DNA 서열을 인코딩하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열을 사용하여 돌연변이를 만들 수 있다. 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드 자체의 성질을 개선, 변화, 감소, 변형 또는 다른 변화를 일으키고(또는) 인코딩된 폴리펩타이드의 성질, 활성, 조성, 안정성 또는 1차 서열을 변화시키기 위하여 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 실시될 수 있다.

본 발명의 특정 양태로서, 본 발명자들은 인코딩된 폴리펩타이드의 하나 이상의 성질, 예를 들어 폴리펩타이드 백신의 면역원성을 변화시키기 위하여 개시된폴리뉴클레오타이드 서열을 돌연변이시키는 방법을 고찰한다. 부위 특이적 돌연변이유발법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 폴리펩타이드는 물론 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 제조하는데 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이유발법은 종종 DNA 분자의 특정 부위를 변화시키는데 사용되기도 한다. 이와 같은 양태에서, 일반적으로 약 14개 내지 약 25개 뉴클레오타이드 정도의 길이를 포함하고 이 서열의 접합부 양측의 약 5개 내지 약 10개 잔기가 변화된 프라이머를 사용한다.

당업자에게는 자명하듯이, 부위 특이적 돌연변이유발법은 일본쇄 및 이본쇄 형태로 모두 존재하는 파아지 벡터를 종종 이용한다. 부위 지시성 돌연변이유발법에 유용하나 일반적인 벡터로는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이 파아지는 쉽게 입수할 수 있고, 그 사용법 역시 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있다. 이본쇄 플라스미드는 목적 유전자를 플라스미드에서 파아지로 전이시키는 단계를 없앤 부위 지시성 돌연변이유발법에 통상적으로 이용된다.

일반적으로, 본 발명에 따른 부위 지시성 돌연변이유발법은 먼저 목적하는 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 일본쇄 벡터를 수득하거나 또는 이본쇄 벡터의 두 쇄를 용해 분리시킨다. 목적하는 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 일반적으로 합성법으로 제조한다. 이 프라이머를 그 다음 일본쇄 벡터에 어닐링시키고, 대장균의 폴리머라제 I 클리나우 단편과 같은 DNA 중합 효소로 처리하여 돌연변이 보유 쇄를 완전히 합성한다. 그 결과, 제1 쇄는 본래의 비돌연변이 서열을 인코딩하고 제2 쇄는 목적하는 돌연변이를 보유하는 이종이본쇄를 형성시킨다. 그 다음 이 이종이본쇄 벡터를 사용하여 적당한 세포, 예를 들어 대장균 세포를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 보유하는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선발한다.

부위 지시성 돌연변이유발법을 사용하여 선발된 펩타이드 코딩 DNA 단편의 서열 변이체를 제조하는 방법은 매우 유용한 종을 생산하는 수단으로서, 펩타이드의 서열 변이체 및 이를 인코딩하는 DNA 서열을 수득할 수 있는 다른 방법이 있는 것처럼, 이 방법에만 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 목적하는 펩타이드 서열을 인코딩하는 재조합 벡터는 서열 변이체를 얻기 위하여 하이드록실아민과 같은 돌연변이유발제로 처리할 수 있다. 이 방법과 프로토콜에 대한 구체적인 사항은 같은 목적에 대하여 문헌[참조:각각 참고인용되는 Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; 및 Maniatis et al., 1982]에 교시된 내용을 참조할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은, "올리고뉴클레오타이드 지시성 돌연변이유발법"이란 용어는 특정 핵산 분자의 농도를 초기 농도에 비해 증가시키거나, 또는 검출 시그날의 농도를 증가시키는 주형 의존적 과정 및 벡터 매개의 전파, 예를 들어 증폭을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "올리고뉴클레오타이드 지시성 돌연변이유발법"이란 용어는 주형에 의존적인 프라이머 분자의 신장을 포함하는 과정을 의미한다. 주형 의존적 과정이란 용어는 새로 합성된 핵산 쇄의 서열이 공지된 상보성 염기쌍 규칙(예를 들어, Watson, 1987)에 따르는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 의미한다. 일반적으로, 벡터를 매개로 한 방법론은 핵산 단편을 DNA또는 RNA 벡터에 도입시킨 뒤, 벡터를 클론 중폭시키고, 증폭된 핵산 단편을 회수하는 과정을 포함한다. 이러한 방법론의 예는 전체적으로 참고인용되는 미국 특허 제4,237,224호에 제시되어 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 생산하는 또 다른 방법으로, 미국 특허 제5,837,458호에 개시된 바와 같은 반복적 서열 재조합법을 이용할 수 있다. 이 방법에서는 재조합과 선별 또는 선발을 반복 실시하여, 예컨대 면역원성 활성이 증강된 본 발명의 각 폴리뉴클레오타이드 변이체를 "진화"시킨다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 단백질 합성에 대해 효과적이고 표적화된 억제제임이 입증되었고 결과적으로 질환에 기여하는 단백질의 합성을 억제함으로써 질환이 치료될 수 있는 치료학적 방법을 제공한다. 단백질 합성을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능이 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 폴리갈락타우로나제 및 무스카린 2형 아세틸콜린 수용체의 합성이 이들 각각의 mRNA 서열에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다[참조: 미국 특허 제5,739,119 및 미국 특허 제5,759,829호]. 추가로, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 내성 유전자(MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선 GABAA 수용체 및 사람 EGF에 의해 입증되었다[참조: Jaskulski et al., Science. 1988 Jun 10 ; 240(4858) : 1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989; 1 (4): 225-32; Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15; 57 (2): 310-20; 미국 특허 제5,801,154호; 미국 특허제5,789,573호; 미국 특허 제5,718,709호 및 미국 특허 제5,610,288호]. 안티센스 작제물은 또한 다양한 비정상적인 세포 증식, 예를 들어, 암을 억제하고 이를 치료하는데 사용될 수 있다고 기술되어 있다[참조: 미국 특허 제5,747,470호; 미국 특허 제5,591,317호 및 미국 특허 제5,783,683호].

따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 특이적으로 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있는 임의의 서열 모두 또는 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 제공한다. 한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 한 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 제3 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트화된 변형된 골격을 포함하는 변형된 DNA이다. 제4 양태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 펩타이드 핵산 또는 이의 유도체를 포함한다. 각각의 경우에, 바람직한 조성물은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 일부와 상보적이고 보다 바람직하게는 실질적으로 상보적이고 심지어 보다 바람직하게는 완전히 상보적인 서열 영역을 포함한다.

소정의 유전자 서열에 특이적인 안티센스 조성물은 선택된 표적 서열(즉, 이들의 예로서 래트 및 사람 서열)의 분석 및 2차 구조, Tm, 결합 에너지, 상대적 안정성의 측정 결과를 기초로 선별되고 안티센스 조성물은 이량체, 헤어핀 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특이적 결합을 감소시키거나 억제하는 또 다른 2차 구조의 상대적 안정성을 근거로 선별된다.

mRNA의 고도로 바람직한 표적 영역은 AUG 해독 개시 코돈에 있거나 이 근처의 영역이고 실질적으로 mRNA의 5'영역과 상보적인 서열 영역이다. 이들 2차 구조 분석 및 표적 부위 선별은 예를 들어, v.4의 올리고 프라이머 분석 소프트웨어 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다[참조: Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402].

또한 짧은 펩타이드 벡터(27개의 잔기)를 사용하는 안티센스 전달 방법의 사용이 고려된다. MPG 펩타이드는 HIV gp41의 융합 서열로부터 유래한 소수성 도메인 및 SV40 T-항원의 핵 국소화 서열로부터 유래한 친수성 도메인을 포함한다[참조: Morris et al., Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15;25(14):2730-6]. 여러 분자의 MPG 펩타이드가 1시간내에 비교적 높은 효능(90%)으로 배양된 포유동물 세포내로 전달될 수 있는 안티센스 올리올리고뉴클레오타이드를 피복시킬 수 있는 것으로 입증되었다. 추가로, MPG와의 상호작용은 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오타이드의 안정성 및 세포질 막을 통과하는 능력 모두를 상당히 증가시킨다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 조성물은 종양 세포내에서 본 발명의 종양 폴리펩타이드 및 단백질의 발현을 억제하기 위한 리보자임 분자의 디자인 및 제조에 사용된다. 리보자임은 부위 특이적 양상으로 핵산을 절단하는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 소유한 특이적 촉매 도메인을 갖는다[참조: Kim and Cech, Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Dec; 84(24):8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20]. 예를 들어, 대다수의 리보자임은 고도의 특이성으로 포스포디에스테르 전달 반응을 촉진시키고 흔히 올리고뉴클레오타이드 기질내 여러개의 포스포디에스테르중 하나 만을 절단한다[참조: Cech et al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96; Michel and Westhof, J Mol Biol. 1990 Dec 5;216(3):585-610; Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14;357(6374):173-6]. 이러한 특이성은 기질이 특이적 염기쌍 상호작용을 통해 화학 반응전에 리보자임의 내부 가이드 서열("IGS")에 결합해야 한다는 요구성에 기인한다.

6개의 기본적으로 다양한 천연적으로 존재하는 효소 RNA가 현재 공지되어 있다. 이의 각각은 생리학적 조건하에서 트랜스 양상으로(따라서, 또 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다) RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매할 수 있다. 일반적으로 효소 핵산은 우선 표적 RNA와 결합하여 작용한다. 이러한 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소적 부위에 근접해 있는 효소 핵산의 표적 결합 부위를 통해 일어난다. 따라서, 효소 핵산은 우선 상보적인 염기쌍을 통해 표적 RNA를 인지하여 이에 결합하고 일단 올바른 부위에 결합하는 즉시 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA를 전략적으로 절단함으로써 인코딩된 단백질의 합성을 지시하는 능력이 파괴될 것이다. 효소 핵산이 이의 RNA 표적물에 결합하고 이를 절단한 후에 이것은 해당 RNA로부터 방출되어 또 다른 표적물을 탐색하여 새로운 표적물과 반복적으로 결합할 수 있고 이를 절단 할 수 있다.

리보자임의 효소적 특성은, 치료학적으로 치료하는데 필요한 리보자임의 농도가 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도 보다 낮기 때문에 안티센스 기술(핵산 분자가 단순이 핵산 표적물과 결합하여 이의 해독을 차단하는 기술)과 같은 많은 기술에 유리하다. 이러한 장점은 효소적으로 작용하는 리보자임의 능력을 반영한다. 따라서, 단일 리보자임 분자는 표적 RNA의 많은 분자를 절단 할 수 있다. 추가로, 리보자임은 고도로 특이적인 억제제이고 억제 특이성은 표적 RNA와 결합하는 염기쌍 형성 기작에 의존할 뿐만 아니라 표적 RNA 절단 기작에 의존한다. 절단 부위 근처에서 단일 미쓰매치 또는 염기-치환은 리보자임의 효소 활성을 완전히 상실시킬 수 있다. 안티센스 분자에서의 유사한 미스매치는 이의 작용을 막지 못한다[참조: Woolf et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Aug 15;89(16):7305-9]. 따라서, 리보자임 작용 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 결합 특이성 보다 높다.

효소 핵산 분자는 해머머리, 헤어핀, 간염 γ 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNaseP RNA(RNA 가이드 서열과 연합됨) 또는 붉은빵곰팡이 VS RNA 모티프로 형성될 수 있다. 해머머리 모티프의 예는 문헌[참조: Rossi et al. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11;20(17):4559-65]에 기술되어 있고 헤어핀 모티프의 예는 문헌[참조: Hampel et al.(Eur. Pat. Appl. Pub1. No. EP 0360257), Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33; Hampel et al., Nucleci Acids Res. 1990 Jan 25;18(2):299-304 및 미국 특허 제5,631,359호]에 기술되어 있다. 간염 γ 바이러스 모티프의 예는 문헌[참조: Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dec 1;31(47):11843-52]에 기술되어 있고 RNaseP 모티프의 예는 문헌[참조: Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dec;35(3 Pt 2):849-57]에 기술되어 있고 붉은빵곰팡이 VS RNA 리보자임 모티프는 문헌[참조: Collins(Saville and Collins, Cell. 1990 May 18;61(4):685-96; Saville and Collins, Proc Natl Acad Sci USA.1991 Oct 1; 88(19):8826-30; Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23;32(11):2795-9]에 기술되어 있고 그룹 I 인트론의 예는 미국 특허 제4,987,071호에 기술되어 있다. 본 발명의 핵산 분자에 중요한 것은 하나 이상의 표적 유전자 RNA 영역에 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 갖고, 기질 결합 부위내에 또는 주변에 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것이다. 따라서 리보자임 작제물은 본원에 언급된 특정 모티프에 제한될 필요가 없다.

리보자임은 본원에 각각 특정하게 참조로서 인용되는 문헌[참조: Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569 and Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595]에 기술된 바와 같이 디자인될 수 있고 기술된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 시험하기위해 합성될 수 있다. 당해 리보자임은 또한 전달을 위해 최적화될 수 있다. 특정 예를 제공하면서 당해 분야의 기술자는 또 다른 종에서 동등한 RNA 표적물이 경우에 따라 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

리보자임 활성은, 리보자임 결합 팔의 길이를 변형시키거나 혈청 리보뉴클레아제에 의한 이의 분해를 예방하는 변형[참조: Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 92/07065; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/15187; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 91/03162; Eur. Pat. Appl. Publ. No. 92110298.4; 미국 특허 제5,334,711호 및 Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/13688, 이러한 문헌은 효소 RNA 분자의 당 잔기에 가해질 수 있는 다양한 화학적 변형을 기술하고 있다], 세포에서 이의 효능을 증진시키는 변형 및 RNA 합성 시간을 단축시키고 화학적 요구량을 감소시키는 스템 II 염기의 제거에 의해 리보자임을 화학적으로 합성함으로써 최적화될 수 있다.

문헌[참조: Sullivan et al. Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595]은 효소 RNA 분자를 전달하기 위한 일반적인 방법을 기술하고 있다. 리보자임은 당해 기술분야에 익숙한 기술자에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포로 투여될 수 있고 이러한 방법은 리포좀내 캅셀화, 이온삼투요법 또는 또 다른 비히클(예를 들어, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캅셀 및 생접착성 미소구)에 혼입시킴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몇몇 경우에, 리보자임은 생체외에서 상기 언급된 비히클 존재 또는 부재하에 세포 또는 조직으로 직접 전달될 수 있다. 또한, RNA/비히클 배합물은 직접 흡입, 직접 주사 또는 카테터, 주입 펌프 또는 스텐트에 의해 국부적으로 전달될 수 있다. 또 다른 전달 경로는 혈관내, 근육내, 피하내 또는 관절 주사, 에어로졸 흡입, 경구(정제 또는 환제), 국소적, 전신성, 안내, 직장내 및/또는 힘줄내 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 리보자임 전달 및 투여에 대한 보다 상세한 설명은 본원에 참조로서 각각 인용되는 문헌[참조: Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595 및 Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569]에 제공된다.

고농도의 리보자임을 세포내에 축적시키는 또 다른 수단은 리보자임 코딩 서열을 DNA 발현 벡터내로 도입하는 것이다. 리보자임 서열은 진핵 RNA 폴리머라제 I(pol I), RNA 폴리머라제 II(pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III(pol III)에 대한 프로모터에 의해 전사된다. pol II 또는 pol III 프로모터로부터 전사된 전사체는 모든 세포에서 고농도로 발현될 것이고 특정 세포 유형에서 특정 pol II 프로모터의 수준은 인접해 있는 유전자 조절 서열(인핸서, 사일렌서 등)의 특성에 의존할것이다. 원핵 RNA 폴리머라제 프로모터가 또한 사용될 수 있는데 단 원핵 RNA 폴리머라제 효소는 적절한 세포에서 발현된다. 상기 프로모터로부터 발현된 리보자임은 포유동물 세포에서 작용하는 것으로 나타났다. 당해 전사 단위체는 포유동물 세포로 도입하기 위해 다양한 벡터내로 도입될 수 있고 이러한 벡터는 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터) 또는 바이러스 RNA 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 펩타이드 (PNA) 조성물이 제공된다. PNA는 핵산 염기가 슈도펩타이드 골격에 부착되어 있는 DNA 모사체이다[참조: Good and Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4) 431-37]. PNA는 통상적으로 RNA 또는 DNA를 사용하는 다수의 방법에 사용될 수 있다. 흔히, PNA 서열은 상응하는 RNA 또는 DNA 서열보다 우수하게 기술에 적용될 수 있고 RNA 또는 DNA에는 없는 용도를 갖는다. 이의 제조 방법, 이의 특징 및 사용 방법을 포함하는 PNA는 문헌[참조: Corey(Trends Biotechnol 1997 Jun; 15(6):224-9]에 보고되었다. 이와 같이 특정 양태에서 ACE mRNA 서열의 하나 이상의 부위에 상보적인 PNA 서열을 제조할 수 있고 당해 PNA 조성물을 사용하여 ACE-특이적 mRNA의 해독을 조절하거나 변형시키거나 감소시키거나 저하시킬 수 있어 당해 PNA 조성물이 투여된 숙주 세포에서 ACE 활성 수준을 변형시킬 수 있다.

PNA는 DNA의 통상적인 포스포디에스테르 골격을 대신하는 2-아미노에틸-글라이신 연결체를 갖는다[참조: Nielsen et al., Science 1991 Dec 6;254(5037):1497-500; Hanvey et al., Science. 1992 Nov 27; 258(5087):1481-5; Hyrup and Nielsen, Bioorg Med Chem. 1996 Jan;4(1):5-23]. 이러한 화학적 방법은 3개의 중요한 결과를 낳는다: 첫번째로 DNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드와는 대조적으로 PNA는 중성 분자이고; 두번째로는 PNA는 입체특이적 합성을 필요로 하지 않는 비 키랄이고; 세번째로는 PNA 합성은 변형된 메리필드 방법을 포함하는 또 다른 방법이 사용되지만 고상 펩타이드 합성을 위한 표준 Boc 또는 Fmoc 프로토콜을 사용한다.

PNA 단량체 또는 기성(ready-made) 올리고머는 제조원[PerSeptive Biosystems(Framingham, MA)]으로부터 시판되고 있다. Boc 또는 Fmoc 프로토콜에 의한 PNA는 수동 또는 자동화된 프로토콜을 사용하여 직접 합성된다[참조: Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr;3(4):437-45]. 수동화 프로토콜은 화학적으로 변형된 PNA를 제조하는데 사용되거나 밀접하게 연관된 PNA 계열을 동시에 합성하는데 사용된다.

펩타이드 합성에 관하여, 특정 PNA 합성의 성공 여부는 선택된 서열의 성질에 달려있다. 예를 들어, 이론적으로 PNA는 임의의 배합된 뉴클레오타이드 염기를 도입할 수 있지만 퓨린이 인접하여 존재하는 경우 생성물내에 하나 이상의 잔기를 결실시킬 수 있다. 상기 난점을 예상하여, 퓨린이 인접해 있는 PNA를 제조하는데 있어서 비효율적으로 첨가될 가능성이 있는 잔기를 반복적으로 커플링시켜야만 한다. 이것은 이후에 펩타이드 합성동안에 관찰되는 것과 유사한 생성물의 수율 및 순도를 부여하는, 역상 고압 액체 크로마토그래피로 PNA를 정제해야만 한다.

특정 적용을 위해 PNA는 고상 합성동안에 아미노산을 커플링시키거나 카복실산 그룹을 포함하는 화합물을 노출된 N 말단 아민에 부착시켜 변형될 수 있다. 또한 PNA는 도입된 라이신 또는 시스테인에 커플링시켜 합성후 변형될 수 있다. PNA가 용이하게 변형될 수 있어 보다 우수한 용해도 또는 요구되는 특이적 작용을 위해 용이하게 최적화될 수 있다. 일단 합성된 후, PNA의 실체 및 이의 유도체는 질량 스펙트럼으로 확인될 수 있다.

다양한 연구가 수행되었고 변형된 PNA가 사용되었다[참조: Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr; 3 (4): 437-45; Petersen et al., J Pept Sci. 1995 May-Jun; [1] (3): 175-83; [ORUM ET AL.,] Biotechniques. 1995 Sep; 19 (3): 472-80; Footer et al., Biochemistry. 1996 Aug 20; 35 (33): 10673-9; Griffith et al., Nucleic Acids Res. 1995 Aug 11; 23 (15): 3003-8; Pardridge et al., Proc Natl Acad Sci [U S A.] 1995 Jun 6; 92 (12): 5592-6; Boffa et al., Proc Natl Acad Sci [U S A.] 1995 Mar 14; 92 (6): 1901-5; Gambacorti-Passerini et al., Blood. 1996 Aug 15; 88 (4): 1411-7; Armitage et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Nov 11; 94 (23): 12320-5; Seeger et al., Biotechniques. 1997 Sep; 23 (3): 512-7]. 미국 특허 제5,700,922호는 PNA-DNA-PNA 키메라 분자 및 진단, 기관내 단백질의 조절 및 치료에 민감한 증상의 치료에 있어서의 이의 용도를 논의하고 있다.

PNA의 안티센스 결합 성질의 특징을 밝히는 방법은 문헌[참조:Rose (Anal Chem. 1993 Dec 15; 65 (24): 3545-9) and Jensen et al. (Biochemistry. 1997 Apr22; 36 (16): 5072-7)]에 기재되어 있다. 로즈(Rose)는 모세관 겔 전기영동을 사용하여 PNA의 이의 상보적인 올리고뉴클레오타이드로의 결합을 측정하여 상대적인 결합 동역학 및 화학양론을 측정하였다. 유사한 유형의 측정이 비아 코어 기술을 사용하여 얀센(Jensen)등에 의해 수행되었다.

기술된 바와 같고 당해 기술자에게 명백해진 PNA의 또 다른 적용은 DNA 쇄 공격, 안티센스 억제, 돌연변이 분석, 전사 인핸서, 핵산 정제, 전사 활성 유전자의 분리, 전사 인자 결합의 차단, 게놈 절단, 바이오센서, 원위치 하이브리드화등에 사용함을 포함한다.

폴리뉴클레오타이드 특성 및 발현

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 잘 알려진 다양한 기법 중 임의의 방법을 사용하여 동정, 제조 및/또는 조작할 수 있다[일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 및 다른 유사 문헌].

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 이의 융합 단백질 또는 이의 기능적 등가물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이나 이의 단편은 적당한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 직접 발현시키기 위한 재조합 DNA 분자에 사용할 수 있다. 유전자 코드의 고유 축퇴성으로 인하여 실질적으로 동일하거나 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 인코딩하는 다른 DNA 서열을 만들고, 이 서열을 사용하여 소정의 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현시킬 수 있다.

당업자라면 잘 알고 있는 바와 같이 몇몇 경우에는 비자연발생의 코돈을 보유하는 폴리펩타이드 코딩성 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 것이 유리할 수도 있다. 예를 들어, 특정 원핵 또는 진핵 숙주가 선호하는 코돈을 선발하여 단백질 발현율을 증가시키거나 자연 발생의 서열에서 얻어진 전사체의 반감기보다 더 긴 반감기와 같은 바람직한 성질을 가진 재조합 RNA 전사체를 제조할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 방법으로 조작하여 다양한 목적, 예를 들어 비제한적으로 유전자 생성물의 클로닝, 가공 및/또는 발현을 변화시키는 변형을 위해 폴리펩타이드 코딩 서열을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 무작위 단편화 및 유전자 단편들과 합성 올리고뉴클레오타이드의 PCR 재조립에 의한 DNA 셔플링(shuffling)을 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 조작할 수 있다. 또한, 부위 지시성 돌연변이유발법을 이용하여 새로운 제한 부위를 삽입하거나, 글리코실화 패턴을 변화시키거나, 코돈 선호성을 변화시키거나, 접목 변이체를 만들거나 또는 돌연변이를 도입시키는 등의 변이를 일으킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 천연 핵산 서열, 변형된 핵산 서열 또는 재조합 핵산 서열을 이종 서열에 결합시켜 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 활성의 억제제에 대한 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위하여 시판용 항체가 인식할 수 있는 키메라 단백질을 인코딩하는 것이 유용할 수 있다. 융합 단백질은 또한 폴리펩타이드 코딩 서열과 이종 단백질 서열 사이에 절단 부위가 위치하도록 조작될 수 있고, 따라서 폴리펩타이드는 절단되어 이종 부로부터 정제될 수 있다.

목적하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열은 당해 기술분야에 공지된 화학적 방법을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다[Caruthers, M.H. et al.(1980) Nucl.Acid.Res.Symp.Ser. 215-223, Horn,T.et al.(1980) Nucl.Acids Res. Symp.Ser. 225-232]. 또는, 단백질 자체를 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 합성하는 화학적 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 합성은 다양한 고상 기법을 사용하여 수행할 수 있고[Roberge, J.Y.et al.(1995) Science 269:202-204], 자동 합성은 예를 들어 ABI 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer, Palo Alto, CA)를 사용하여 실시할 수 있다.

새로 합성한 펩타이드는 정제용 고성능 액체 크로마토그래피[예, Creighton, T.(1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.]나 또는 당해 기술분야에 잘 알려진 비슷한 다른 기법을 사용하여 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩타이드의 조성은 아미노산 분석이나 서열분석(예, 에드만 분해법)으로 확인할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 일부분의 아미노산 서열은 직접 합성법으로 변화시키고(또는) 다른 단백질 또는 이의 임의의 일부분 유래의 서열과 화학적 방법으로 조합하여 변형 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다.

목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이나 기능적 등가물을 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사와 해독에 필요한 인자를 포함하는 벡터에 삽입시킬 수 있다. 이와 같이 목적한 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열과 적당한 전사 및 해독 조절 인자를 함유하는발현 벡터를 작제하기 위하여 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성법 및 생체내 유전자 재조합법이 있다. 이와 같은 기법은 예를 들어 문헌[참조:Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F.M. et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 설명되어 있다.

다양한 발현 벡터/숙주계를 이용하여 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함시키고 발현시킬 수 있다. 그 예로는, 비제한적으로 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균과 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 형질전환되거나 세균 발현 벡터(예, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물 세포계 등이 있다.

발현 벡터에 존재하는 "조절 인자" 또는 "조절 서열"로는 전사 및 해독을 수행하기 위하여 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비해독 영역, 즉 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비해독 영역이 있다. 이와 같은 인자들은 강도와 특이성이 다양할 수 있다. 사용되는 벡터계와 숙주에 따라 구성형 프로모터 및 유도형 프로모터를 비롯한 임의의 수의 적합한 전사 및 해독 인자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세균계에 클로닝하는 경우에는, PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 등의 하이브리드lacZ 프로모터와 같은 유도형 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포계에서는 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스 유래의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 복수 카피를 포함하는 세포주가 필요한 경우에는 SV40 또는 EBV를 기초로 한 벡터를 적당한 선택성 마커와 함께 사용하는 것이 유리하다.

세균계에서는 발현된 폴리펩타이드의 목적 용도에 따라 다수의 발현 벡터 중 임의의 벡터를 선발할 수 있다. 예를 들어, 항체를 유도하기 위하여 다량이 필요한 경우에 정제 용이한 융합 단백질의 다량 발현을 유도하는 벡터를 사용할 수 있다. 이와 같은 벡터로는, 목적하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열이 아미노 말단 Met에 대한 서열 및 이후 하이브리드 단백질을 생산하기 위한 베타 갈락토시다제의 7개 잔기에 대한 서열과 정확한 프레임으로 벡터에 결합될 수 있는 BLUESCRIPT(Stratagene)과 같은 다기능성 대장균 클로닝 및 발현 벡터; pIN 벡터(Van Heeke, G. and S.M. Schuster(1989) J.Biol.Chem 264:5503-5509) 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)도 역시 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 이종 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 융합 단백질은 용해성이므로, 용균된 세포로부터 글루타치온-아가로스 비드에 대한 흡착 후 유리 글루타치온 존재하의 용출에 의해 용이하게 정제할 수 있다. 이와 같은 계에서 제조된 단백질에는 목적하는 클로닝된 폴리펩타이드가 의지에 따라 GST 부로부터 방출될 수 있도록 헤파린, 트롬빈 또는 XA 인자 프로테아제 절단 부위를 포함시킬 수 있다.

효모, 사카로마이세스 세레비지애의 경우 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유한 많은 벡터가 사용될 수 있다 (참조: 상기 Ausubel et al. 및 Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544).

식물 발현 벡터를 사용하는 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 발현은 많은 프로모터에 의해 시동될 수 있다. 예를 들면, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV의 오메가 리더 서열과 조합하여 사용할 수 있다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 다른 방안으로서, RUBISCO의 작은 아단위와 같은 식물 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 사용할 수 있다(Coruzzi, G. et al., (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al., (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 작제물은 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체-매개된 트랜스펙팅에 의해 식물 세포내로 도입할 수 있다. 이러한 기술들은 많은 문헌에 기술되어 있다(참조: Hobbs, S. 또는 Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196).

또한, 해당 폴리펩타이드를 발현하기 위해 곤충계를 사용할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 이러한 계로서, 오토그라파 캘리포르니카 핵 다형 바이러스(AcNPV)가 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충에서 외래 유전자를 발현하는 벡터로 사용한다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비필수 영역내로 클로닝하고 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 설정할 수 있다. 폴리펩타이드-코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성으로 만들고 피복 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 그런 다음, 이 재조합 바이러스를 사용하여 예를 들면 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플러시아 유충을 감염시킬 수 있다(Engelhard, E.K. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).

포유류 숙주 세포의 경우 많은 바이러스-계 발현계가 일반적으로 이용되고 있다. 예를 들면, 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 해당 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 후기 프로모터와 3조 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/해독 복합체내로 연결할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역을 사용하여 감염된 숙주 세포에서 그 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 살아있는 바이러스를 얻을 수 있다(Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 또한, 전사 인핸서, 예를 들면 로우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서를 사용하여 포유류 숙주 세포에서 발현을 증가시킬 수 있다.

또한, 특정 개시 시그날을 사용하여 해당 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 해독을 보다 효율적으로 달성할 수 있다. 이러한 시그날은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열, 이의 개시 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터내로 삽입되는 경우, 어떠한 추가적인 전사 또는 해독 조절 시그날도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 단지 코딩 서열 또는 이의 일부분이 삽입되는 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 조절 시그날이 제공되어야 한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위해서는 정확한 판독 프레임에 있어야 한다. 외인성 해독 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 여러 기원으로부터 유래될 수 있다. 발현 효율은 문헌[참조:Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162]에 기술된 것과 같이 사용된 특정 세포계에 적절한 인핸서의 삽입에 의해 강화될 수 있다.

또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하는 능력 또는 원하는 양상으로 발현된 단백질을 프로세싱하는 능력에 대해 선택할 수 있다. 폴리펩타이드의 그러한 변형은 이들로 한정되는 것은 아니지만 아세틸화, 카복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함한다. 단백질의 "prepro" 형태를 분해하는 해독 후 프로세싱을 또한 사용하여 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진할 수 있다. 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해, 해독 후 활성에 대한 특정한 세포의 기계적 및 특징적인 메카니즘을 갖는 CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38과 같은 상이한 숙주 세포가 선택될 수 있다.

재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해, 일반적으로 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 해당 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 오리진 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 동일하거나 별개의 벡터상에 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는 증식 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 다음 선별 배지로 옮긴다. 선별 마커의 목적은 선별 내성을 제공하는데 있으며 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장과 회수를 허용한다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클론은 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.

형질전환 세포주의 회수를 위해 많은 선별 시스템을 사용할 수 있다. 이들 시스템에는 이들로 한정되는 것은 아니지만 tk^-또는 aprt^-세포에서 사용할 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23) 유전자가 포함된다. 또한, 항대사, 항생 또는 살균 내성이 선별 기본으로 사용할 수 있다; 예를 들면, 메톡트렉세이트에 대해 내성을 제공하는 dhfr(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 내성을 제공하는 npt(Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 및 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 각각에 내성을 제공하는 als 또는 pat(상기 Murry). 추가적인 선별 유전자, 예를 들면 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하도록 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD(Hartman, S. C. 및 R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS 및 루시퍼라제 및 이의 기질과 같은 시각적인 마커가 형질전환체를 동정하고 더불어 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적이거나 안정한 단백질 발현의 양을 정량하는데 널리 이용되어 왔다(Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).

비록 마커 유전자 발현의 유무가 해당 유전자가 또한 존재함을 제시할지라도, 그의 존재 및 발현은 검증할 필요가 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열이 마커 유전자 서열내에 삽입되는 경우, 서열을 함유하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 동정할 수 있다. 다른 방안으로서, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드-코딩 서열과 직렬로 배치할 수 있다. 유도 또는 선별에 반응한 마커 유전자의 발현은 보통 그 직렬 유전자의 발현을 가리킨다.

다른 방안으로서, 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 여러 절차에 의해 동정할 수 있다. 이들 절차는 이들로 한정하는 것은 아니지만 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생검정 또는 면역검정 기술을 포함하며, 이들의 예로는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 막, 용액 또는 칩 기반 기술이 포함된다.

해당하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 단백질의 발현 및 세포 배양물로부터의 회수에 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 세포내로 분비 또는 내재할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유한 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 인코딩된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 시그날 서열을 함유하도록 설계할 수 있다. 다른 재조합 작제법을 사용하여 해당 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 가용성 단백질의 정제를 촉진하는 폴리펩타이드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결할 수 있다. 이러한 정제 촉진 도메인은 이들로 한정하는 것은 아니지만 고정된 금속에 정제를 허용하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트화 펩타이드, 고정된 면역글로불린에 정제를 허용하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템에 사용되는 도메인(Immunex Corp., Seattle, Wash.)을 포함한다. 정제 도메인과 인코딩된 폴리펩타이드사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제에 특이한 것(Invitrogen, San Diego, Calif.)과 같은 절단가능한 링커 서열의 도입은 정제를 촉진하는데 사용할 수 있다. 한 가지 그러한 발현 벡터는 해당 폴리펩타이드를 함유한 융합 단백질의 발현과 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위 앞에 6개의 히스티딘 잔기를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 히스티딘 잔기는 문헌[참조:Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)]에 기술된 바와 같이 IMIAC(고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피)에서 정제를 촉진하는 한편, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 목적하는 폴리펩타이드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 함유한 벡터는 문헌[참조:Kroll, D.J. et al., 1993, DNA Cell Biol. 12:441-453]에 기술되어 있다.

재조합 제조 방법이외에, 본 발명의 폴리펩타이드 및 이의 단편은 고체상 기술(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)을 사용하여 직접적인 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 실시할 수 있다. 자동화 합성은 예를 들면 Applied Biosystems 431A 펩타이드 합성기 (Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다. 다른 방도로서, 여러 단편을 별도로 화학 합성하고 화학 방법에 의해 결합시켜 전체 길이의 분자를 제조할 수 있다.

T 세포 조성물

본 발명은 또 다른 측면에서 본원에 개시된 종양 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 유도체에 대해 특이적인 T 세포를 제공한다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 Isolex™ 시스템(구입원: Nexell Therapeutics, Inc.)과 같은 세포 분리 시스템 시판품을 사용하여 환자의 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 분획으로부터 분리할 수 있다[참조: Irvine, 미국 특허 제5,240,856호, 미국 특허 제5,215,926호, 제WO 89/06280호, 제WO 91/16116호 및 제WO 92/07243호]. 달리, T 세포는 관련되거나 무관한 사람, 사람을 제외한 동물, 세포주 또는 배양물로부터 유래할 수 있다.

T 세포는 종양 폴리펩타이드, 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포(APC)로 자극할 수 있다. 이러한 자극은 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포를 생성하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 실시한다. 바람직하게는, 종양 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 특이적인 T 세포의 생성을 촉진하기 위해 미소구와 같은 전달 비히클내에 존재한다.

T 세포가 종양 폴리펩타이드로 피복된 표적 세포 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 발현시키는 표적 세포를 특이적으로 증식시키거나, 분비하거나 사멸시킬 경우, 이는 종양 폴리펩타이드에 대해 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 임의의 다양한 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어,크롬 방출 검정법 또는 증식 검정법에서, 용해 및/또는 증식에 있어서 네가티브 대조군에 비하여 2배 이상 증가의 자극 지수는 T 세포 특이성을 가리킨다. 이러한 검정법은, 예를 들어, 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 달리, T 세포의 증식의 검출은 다양한 공지된 기법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가 속도를 측정함으로써(예를 들어, T 세포의 배양물을 삼중수소화 티미딘으로 펄스-표지시키고, DNA내로 삽입된 삼중수소화 티미딘의 양을 측정함으로써) 검출할 수 있다. 3 내지 7일 동안 종양 폴리펩타이드(100ng/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 200ng/ml 내지 25㎍/ml)와의 접촉은 전형적으로는 T 세포의 증식을 2배 이상 증가시킬 것이다. 상기한 바와 같이 2 내지 3일 동안의 접촉은 표준 사이토킨 검정을 사용하여 측정한 바와 같이, T 세포의 활성화 결과를 초래하여야 하며, 여기서, 사이토킨(예를 들어, TNF 또는 IFN-γ) 방출의 수준이 2배 증가한 것은 T 세포 활성화의 지표이다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]. 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 종양 폴리펩타이드-발현 APC에 대한 반응으로 활성화된 T 세포는 CD4⁺및/또는 CD8⁺일 수 있다. 종양 폴리펩타이드-특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, T 세포는 환자 또는 관련되거나 무관한 공여자로부터 유도시켜, 자극 및 증식 후에 환자에게 투여한다.

치료 목적상, 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여증식하는 CD4⁺또는 CD8⁺T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 수적으로 증식시킬 수 있다. 이러한 T 세포의 시험관내 증식은 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 T 세포 성장 인자, 예를 들어, 인터류킨-2 및/또는 종양 폴리펩타이드를 합성하는 자극 세포를 첨가하거나 첨가하지 않고서 종양 폴리펩타이드에 재노출시킬 수 있다. 달리, 종양 폴리펩타이드의 존재하에 증식하는 하나 이상의 T 세포는 클로닝에 의해 수적으로 증식시킬 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 제한 희석을 포함한다.

약제학적 조성물

추가의 양태에서, 본 발명은 세포 또는 동물에 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제의 사용과 함께 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 용액 중의 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T-세포의 제형에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 치료용 약제학적 조성물중에 크립토 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 단편, 융합체 및 변이체의 용도에 관한 것이다. 특히, 크립토는 크립토 1인 것이 바람직하다.

본원에 개시된 조성물은 필요한 경우 다른 제제, 예를 들어, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약제학적으로 활성인 제제와 함께 투여할 수 있다는 것은 이해될 것이다. 사실, 추가의 제제가 표적 세포 또는 숙주 조직과의 접촉에 유의적으로 유해하게 작용하지 않는 한 추가로 포함시킬 수 있는 다른 성분에 대한 제한은 실질적으로 없다. 따라서, 당해 조성물은 특정 사례에서 필요로 하는 다양한 다른 제제와 함께 전달할 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제할 수 있거나, 달리 본원에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성할 수 있다. 마찬가지로, 이러한 조성물은 또한 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및/또는 T-세포 조성물을 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방학적 및 치료학적 백신용으로 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 포함한다. 백신 제제는 일반적으로 문헌[참조: M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 하나 이상의 면역자극제와 함께 포함할 것이다.

본원에 기술된 임의의 약제학적 조성물은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 염은, 예를 들어, 유기 염기(예를 들어, 1차, 2차 및 3차 아민과 염기성 아미노산과의 염) 및 무기 염기(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 포함한 약제학적으로 허용되는 무독성 염기로부터 제조할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명의 예시적인 면역학적 조성물(예를 들어, 백신 조성물)은 폴리펩타이드가 동일 반응계에서 생성되도록 하나 이상의 상기한 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 포함한다. 위에서 주지된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 전달계로 투여할 수 있다. 사실, 다수의 유전자 전달 기법이 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998] 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다. 적합한 폴리뉴클레오타이드 발현계는 물론 환자의 체내에서 발현하는데 필요한 DNA 조절 서열(예를 들어, 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 달리, 세균 전달계는 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 이의 세포 표면에서 발현시키거나 이러한 에피토프를 분비하는 세균(예를 들어, 바실러스-칼메트-구에린)의 투여를 포함할 수 있다.

따라서, 특정한 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 다수의 공지된 바이러스계 시스템을 사용하여 적합한 포유동물 숙주 세포내로 도입한다. 한 예시적인 양태에서, 레트로바이러스는 유전자 전달계를 위해 편리하고 효과적인 기반을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 특정 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 벡터내로 삽입하고, 레트로바이러스 입자에 팩키징시킬 수 있다. 다음, 재조합 바이러스를 분리하여, 피검체에게 전달할 수 있다. 다수의 예시적인 레트로바이러스계가 기술되어 있다[참조: 미국 특허 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al., (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109].

또한, 다수의 예시적인 아데노바이러스계 시스템이 또한 기술되어 있다. 숙주 게놈내로 통합된 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 염색체외에 존재하며, 이에 따라 삽입에 의한 돌연변이 유발과 관련된 위험은 최소화한다[참조: Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al.(1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K.L. (1988) BioTechniques 6:616-629; 및 Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476].

다양한 아데노-관련된 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 또한 폴리뉴클레오타이드 전달을 위해 개발되었다. AAV 벡터는 당해 분야에 익해 공지된 기법을 이용하여 용이하게 작제할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,173,414호 및 5,139,941호; 국제 특허 공개 공보 제WO 92/01070호 및 제WO 93/03769호; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875].

유전자 전달에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는데 유용한 추가의 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스 및 조류 수두바이러스와 같은 수두 바이러스 계열로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 새로운 분자를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체를 다음과 같이 작제할 수 있다. 먼저, 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 이것이 백시니아 프로모터 및 플랭킹 백시니아 DNA 서열, 예를 들어, 티미딘 키나제(TK)를 인코딩하는 서열에 인접하도록 적합한 벡터내로 삽입한다. 다음, 당해 벡터를 사용하여 세포를 감염시켜, 세포를 동시에 백시니아로 감염시킨다. 상동 재조합을 이용하여 백시니아 프로모터와 함께 해당 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 바이러스 게놈내로 삽입시킬 수 있다. 생성된 TK.sup.(-) 재조합체는 세포를 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에서 배양하고, 이에 대해 내성인 바이러스 플라크를 선택함으로써 선별할 수 있다.

백시니아계 감염/트랜스펙팅 시스템은 유기체의 숙주 세포에서 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드의 유도성, 일시성 발현 또는 공발현을 제공하는데 편리하게 사용할 수 있다. 당해 특정 시스템에서, 세포를 우선 시험관내에서 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 백시니아 바이러스 재조합체로 감염시킨다. 당해 폴리머라제는 단지 T7 프로모터를 갖는 주형만을 전사시킨다는 점에서 특이성을 나타낸다. 감염 후, 세포를 T7 프로모터에 의해 구동되는 해당 폴리뉴클레오타이드로 감염시킨다. 백시니아 바이러스 재조합체로부터 세포질내에 발현된 폴리머라제를 감염된 DNA를 RNA로 전사시킨 다음, RNA를 숙주 해독 기작에 의해 폴리펩타이드로 해독시킨다. 당해 방법은 다량의 RNA 및 이의 해독 산물의 고수준의일시적 세포질내 생성을 제공한다[참조: Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Sci. USA (1986) 83:8122-8126].

달리, 계두 및 카나리폭스 바이러스와 같은 아비폭스바이러스를 또한 해당 코딩 서열을 전달하기 위해 사용할 수 있다. 포유동물 병원체로부터의 면역원을 발현시키는 재조합 아비폭스바이러스는 비조류 종에 투여될 때 보호 면역성을 제공하는 것으로 공지되어 있다. 아비폭스 벡터의 사용은 특히 사람 및 기타 포유동물 종에서 바람직한데, 이는 아비폭스 속의 구성원이 민감성 조류 종에서만이 풍부하게 복제할 수 있고, 이에 따라 포유동물 세포에는 감염되지 않기 때문이다. 재조합 아비폭스 바이러스를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 백시니아 바이러스의 제조와 관련하여 상기된 바와 같이 유전자 재조합을 사용한다[참조: 제WO 91/12882호; 제WO 89/03429호; 및 제WO 92/03545호].

임의의 다수의 알파바이러스 벡터를 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물의 전달에 사용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,843,723호, 제6,015,686호, 제6,008,035호 및 제6,015,694호에 기술된 벡터이다. 베네주엘라 말 뇌염(VEE)을 기초로 한 특정 벡터를 또한 사용할 수 있으며, 이의 대표적인 예는 미국 특허 제5,505,947호 및 제5,643,576호에서 찾아볼 수 있다.

또한, 문헌[참조: Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 및 Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103]에 기술된 아데노바이러스 키메라 벡터와 같은 분자 결합 벡터가 또한 본 발명하에 유전자 전달을위해 사용할 수 있다.

이들 및 기타 공지된 바이러스계 전달계에 관한 추가의 예시적인 정보는 문헌[참조: Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; 제WO 89/01973호; 미국 특허 제4,777,127호; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 및 Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 및 Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에 기술되고 개설된 바와 같이 "나출형" DNA로서 투여하고/전달한다. 나출형 DNA의 유입은 세포내로 효율적으로 이송되는 DNA를 생체분해성 비드에 피복시킴으로써 증가시킬 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 입자 충격 방식을 통해 전달할 수 있으며, 이 가운데 다수가 기술되어 있다. 한 대표적인 예로써, 가스-구동된 입자 가속은 파우더젝트 파마슈티칼스 피엘씨(Powderject Pharmaceuticals PLC; Oxford, UK) 및 파우더젝트 백신즈 인코포레이티드(Powderject Vaccines Inc.; Madison,WI)에 의해 제조된 것과 같은 장치로 달성할 수 있으며, 이 가운데 몇몇은 미국 특허 제5,846,796호, 제6,010,478호, 제5,865,807호 및 유럽 특허 제0500 799호에 기술되어 있다. 이러한 방식은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 입자와 같은 미세 입자의 무수 산제를 휴대용 장치로 발생된 헬륨 가스 제트내에서 고속으로 가속시키고, 입자를 해당 표적 조직내로 추진시키는 니들-비함유 전달 방식을 제공한다. 핵산을 전달하는 경우, 당해 입자는 바람직하게 직경이 0.4 내지 4.0㎛, 보다 바람직하게는 0.6 내지 2.0㎛인 금 비드이고 DNA 결합체는 이들 비드위에 피복되고 이어서 유전자 건(gun)에 위치시키기 위해 카트리지에 포함된다. 입자는 전형적으로 및 바람직하게 피부에 전달된다. 피부에 전달하기 위한 또 다른 수단은 액체 제형의 니들을 통한 니들 전달의 사용을 포함한다.

일반적으로 DNA 백신은 일반적으로 바이러스인 강한 프로모터, 항원 펩타이드를 인코딩하는 목적하는 유전자 및 폴리아데닐화/전사 종결 서열이 삽입된 세균 플라스미드 벡터로 이루어진다. 따라서 목적하는 유전자는 기술된 바와 같은 완전한 크립토 단백질을 인코딩할 수 있거나 SEQ ID NO: 13 내지 94에 기술된 바와 같이 단순히 항원성 펩타이드 서열을 인코딩할 수 있다. 플라스미드는 세균(예를 들어, 대장균)에서 복제될 수 있고 이어서 숙주에 투여되기 전 의도된 투여 경로에 의존하여 적당한 매질에서 분리되고 제조된다. 투여 후, 플라스미드는 인코딩된 펩타이드가 생산되는 숙주 세포에 의해 흡수된다. 플라스미드 벡터는 바람직하게 진핵 새포에서 작용성인 복제 오리진 없이 작제되어 포유동물 숙주에서의 플라스미드 복제 및 관련 동물의 염색체 DNA로의 통합을 차단할 수 있다.

통상적인 백신화 기술에 비해 DNA 백신화가 다수의 이점을 갖는다. 첫번째로, DNA 서열에 의해 인코딩된 단백질이 숙주에서 합성되기 때문에 단백질의 구조 또는 형태가 질환 상태와 관련된 천연 단백질과 유사한 것으로 예상된다. 또한 DNA 백신화는 보존성 단백질로부터의 에피토프를 인지하는 세포독성 T 림프구 반응을 발생시켜 상이한 종류의 바이러스에 대해 보호 작용을 할 가능성이 있다. 추가로, 플라스미드는, 항원 단백질이 생산될 수 있는 숙주 세포에 의해 취득되기 때문에 오랫동안 지속적인 면역반응을 유발할 것이다. 당해 기술은 또한 다양한 면역원/에피토프를 단일 제제로 배합할 가능성을 제공한다.

DNA 백신화와 관련된 유익한 기본 정보는 본원에 참조로서 전반적인 내용이 인용된 문헌[참조: Donnelly et al "DNA vaccines" Ann. Rev Immunol. 1997 15:617-648]에 의해 제공된다.

관련된 양태에서, 본 발명의 조성물의 가스-구동된 니들-비함유 주사에 유용할 수 있는 다른 장치 및 방법은 바이오젝트, 인코포레이티드(Bioject, Inc.; Portland, OR)에 의해 제공된 것을 포함하며, 이 가운데 몇몇은 미국 특허 제4,790,824호, 제5,064,413호, 제5,312,335호, 제5,383,851호, 제5,399,163호, 제5,520,639호 및 제5,993,412호에 기술되어 있다.

또 다른 양태에 따라, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T-세포 및/또는 APC 조성물 이외에 하나 이상의 면역자극제를 함유한다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 (항체 및/또는 세포-매개된) 면역 반응을 증강시키거나 강화시키는 물질을 가리킨다. 면역자극제의 한 가지 바람직한 유형은 애쥬반트를 포함한다. 다수의 애쥬반트는 신속한 신진대사로부터 항원을 보호하도록 고안된 물질, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응 자극제, 예를 들어, 지질 A, 보르타델라 페르투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질을 함유한다. 특정 애쥬반트가 시판되고 있으며, 예로는 프로인트 불완전 애쥬반트 및 완전 애쥬반트(Difco Laboratories; Detroit, MI); 머크 애쥬반트 65(Merck and Company, Inc.; Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham; Philadelphia, PA); 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 겔(칼륨명반) 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생체분해성 미세구체; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A이다. 사이토킨, 예를 들어, GM-CSF, 인터류킨-2, -7, -12 및 기타 유사한 성장 인자를 또한 애쥬반트로서 사용할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 애쥬반트 조성물은 바람직하게는 Th1 유형의 면역 반응을 우세하게 유도하는 것이다. 고수준의 Th1-유형 사이토킨(예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포 매개된 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 대조적으로, 고수준의 Th2-유형 사이토킨(예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 백신의 적용 후, 환자는 Th1- 및 Th2-유형 반응을 포함한 면역 반응을 지지할 것이다. 반응이 우세하게 Th1-유형인 바람직한 양태에서,Th1-유형 사이토킨의 수준은 Th2-유형 사이토킨의 수준보다 더 많은 정도로 증가한다. 이들 사이토킨의 수준은 표준 검정을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨의 부류의 개관을 위해서는 문헌[참조: Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989]을 참고한다.

Th1-유형 반응을 우세하게 유도하는 특정의 바람직한 애쥬반트는, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염과의 혼합물을 포함한다. MPL^R애쥬반트가 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation; Seattle, WA)[참조: 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호]에서 구입가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(여기서, CpG 디뉴클레오타이드는 비메틸화되어 있음)가 또한 Th1 반응을 우세하게 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 제WO 96/02555호, 제WO 99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기술되어 있다. 면역자극성 DNA 서열은 또한 문헌[참조: Sato et al., Science 273:352, 1996]에 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 애쥬반트는 사포닌(예를 들어, Quil A) 또는 QS21 및 QS7를 포함한 이의 유도체(Aquila Biopharmaceuticals Inc.; Framingham, MA); 에스신; 디지토닌; 또는 깁소필라(Gypsophila) 또는 체노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 본 발명의 애쥬반트 배합물, 예를 들어, QS21, QS7, Quil A, β-에스신 또는 디지토닌을 포함하는 그룹 중 2개 이상의 배합물에 하나이상의 사포닌을 포함한다.

대안적으로, 사포닌 제형은 키토산 또는 다른 다가양이온성 중합체, 폴리락타이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코스아민계 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적으로 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질계 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자로 이루어진 백신 비히클과 배합할 수 있다. 사포닌을 또한 콜레스테롤의 존재하에 제형화시켜, 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미세 구조를 형성시킬 수 있다. 또한, 사포닌을 비입자성 용액 또는 현탁액에서 또는 파우시라멜라 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미립 구조에서 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 제형화시킬 수 있다. 사포닌은 또한 Carbopol^R과 같은 부형제와 제형화시킬 수 있거나, 점성을 증가시키거나 락토즈와 같은 분말 부형제와 함께 무수 산제 형태로 제형화시킬 수 있다.

한 바람직한 양태에서, 애쥬반트 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체와의 배합물, 예를 들어, WO94/00153에 기술된 QS21과 3D-MPL^R애쥬반트와의 배합물 또는 WO96/33739에 기술된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 급냉된 보다 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPL^R애쥬반트 및 토코페롤을 사용한 특히 바람직한 다른 애쥬반트 제형이 WO95/17210호에 기술되어 있다.

또 다른 증강된 애쥬반트 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드와 사포닌 유도체와의 배합물, 특히 제WO 00/09159에 개시되어 있는 바와 같은 CpG와 QS21의배합물을 포함한다. 바람직하게는, 당해 제형은 추가로 수중유 에멀젼과 토코페롤을 포함한다.

본 발명의 조성물에 사용하기 위한 추가의 예시적인 애쥬반트는 Montanide ISA 720(Seppic, France), SAF(Chiron, California, United States), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), 애쥬반트의 SBSA 시리즈(예를 들어, SBAS-2 또는 SBAS-4, 구입원: SmithKline Beecham; Rixensart, Belgium), Detox(Enhanzyn^R)(Corixa, Hamilton, MT), RC-529(Corixa, Hamilton, MT) 및 전체 내용이 본원에 참고로 인용된 계류중인 미국 특허원 제08/853,826호 및 제09/074,720호에 기술된 바와 같은 기타 아미노알킬 글루코스아미니드 4-포스페이트(AGP) 및 제WO 99/52549A1호에 기술된 바와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 애쥬반트를 포함한다.

다른 바람직한 애쥬반트는 다음 화학식 I의 애쥬반트 분자를 포함한다:

HO(CH ₂ CH ₂ O) _n -A-R

상기 식에서,

n은 1 내지 50이고,

A는 결합 또는 -C(O)-이고,

R은 C_1-50알킬 또는 페닐 C_1-50알킬이다.

본 발명의 한 양태는 화학식 I의 폴리옥시에틸렌 에테르(여기서, n은 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R은 C_1-50, 바람직하게는 C_4-20알킬, 가장 바람직하게는 C₁₂알킬이고; A는 단일 결합이다)를 포함하는 백신 제형으로 구성된다. 폴리옥시에틸 에테르의 농도는 0.1 내지 20%의 범위, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%의 범위이어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 그룹으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 머크 인덱스(12^thedition: entry 7717)에 기술되어 있다. 이들 애쥬반트 분자는 제WO 99/52549호에 기술되어 있다.

상기 화학식 I에 따르는 폴리옥시에틸렌 에테르는 필요한 경우 다른 애쥬반트와 배합할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 애쥬반트 배합물은 바람직하게는 계류중인 영국 특허원 제9820956.2호에 기술된 바와 같이 CpG와 배합한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본원에 기술된 면역학적 조성물은 항원 제공 세포(APC), 예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵세포 및 효율적인 APC가 되도록 공학적으로 조작될 수 있는 기타 세포를 통해 숙주에 전달할 수 있다. 이러한 세포는 반드시 필요한 것은 아니지만, 항원을 제시하는 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키며, 항-종양 효과 자체를 가지고/가지거나 수용체에게 면역학적으로 적합할 수 있도록(즉, 정합된 HLA 일배체형) 변형시킬 수 있다. APC는 일반적으로 다양한 생물학적 체액 및 기관으로부터 분리할 수 있으며, 자가, 동종이형, 유전자 동계형 또는 이종 세포일 수 있다.

본 발명의 특정한 바람직한 양태는 항원 제공 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조 세포를 이용한다. 수지상 세포는 고도로 효능적인 APC이며[참조: Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998], 예방 또는 치료학적 항종양 면역성을 나타내기 위한 생리학적 애쥬반트로서 효과적인 것으로 제시되어 있다[참조: Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이들의 전형적인 모양[원위치에서 방사상, 시험관내에서 뚜렷한 세포질 돌기(수지상 돌기)가 가시화], 이들의 수용 능력, 고도의 효율을 갖는 과정 및 존재하는 항원 및 천연 T 세포 반응을 활성화하는 능력을 기준으로 하여 동정할 수 있다. 수지상 세포는 물론 생체내 또는 생체외에서 수지상 세포에서 흔히 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 공학적으로 조작할 수 있으며, 이와 같이 변형된 수지상 세포는 본 발명에 의해 고려된다. 수지상 세포의 대안으로서, 분비된 소포 항원-부하된 수지상 세포(소위 엑소좀)를 백신내에서 사용할 수 있다[참조: Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998].

수지상 세포 및 선조 세포는 말초혈, 골수, 종양-침윤 세포, 종양 주변 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 기타 다른 적합한 조직 또는 체액으로부터 채취할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 말초혈로부터 수확된 단핵세포의 배양물에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토킨의 배합물을 가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 달리, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 수확한 CD34 양성 세포를 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드및/또는 수지상 세포의 성숙 및 증식을 유도하는 기타 화합물(들)의 배합물을 배양 배지에 첨가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.

수지상 세포는 통상적으로 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류되는데, 이러한 분류는 2개의 잘 특성화된 표현형을 구분할 수 있는 간단한 방법을 제공해 준다. 그러나, 이러한 분류법이 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리에 대한 고도의 능력을 가진 APC로서 특징지워지며, 이는 Fcγ 수용체 및 만노즈 수용체의 고도의 발현과 상관관계가 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 보다 낮은 발현 및 I형 및 II형 MHC, 흡착 분자(예를 들어, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자(예를 들어, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같이 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자의 높은 발현에 의해 특징지워진다.

APC는 일반적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 이의 일부 또는 다른 변이체)로 트랜스펙팅시킬 수 있으며, 이에 따라 항원 또는 이의 면역원성 부분을 세포 표면상에서 발현시킨다. 이와 같은 트랜스펙팅은 생체외에서 발생할 수 있으며, 이러한 트랜스펙팅된 세포를 함유한 조성물 또는 백신은 본원에 기술된 바와 같이 치료용으로 사용할 수 있다. 달리, 수지상 또는 다른 항원 제공 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여할 수 있으며, 결과적으로 생체내에서 트랜스펙팅이 실시된다. 수지상 세포의 생체내 또는 생체외 트랜스펙팅은, 예를 들어, 일반적으로 제WO 97/24447호에 기술된 방법 또는 문헌[참조: Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 건 방법과 같은당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 수지상 세포의 항원 부하는 수지상 세포 또는 선조 세포를 폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터내) 또는 RNA와 함께 배양하거나, 항원-발현 재조합 세균 또는 바이러스(예를 들어, 백시니아, 계두, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 배양하여 달성할 수 있다. 부하하기 전에 폴리펩타이드는 T 세포 조력을 제공하는 면역학적 파트너(예를 들어, 담체 분자)에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 달리, 수지상 세포를 비결합된 면역학적 파트너로 별도로 또는 폴리펩타이드의 존재하에서 펄스시킬 수 있다.

본 발명의 조성물에 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 사용할 수 있는 한편, 담체의 종류는 전형적으로 투여 방식에 따라 다양하다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 국소, 경구, 비내, 점막내, 정맥내, 두개골내, 복강내, 피하 및 근육내 투여를 포함한 임의의 적합한 투여 방식에 대해 제형화시킬 수 있다.

약제학적 조성물에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이고, 또한 생체분해성일 수 있다. 특정한 양태에서, 제형은 바람직하게는 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 그러나, 다른 양태에서, 투여시 보다 신속한 방출이 바람직할 수 있다. 이러한 조성물의 제형은 공지 기술을 이용하는 당업자의 수준에 속한다. 이와 관련하여 유용한 대표적인 담체는 폴리(락타이드-코-글리코라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로즈, 덱스트란 등의 미세입자를 포함한다. 다른 예시적인 지연 방출 담체는 비액체 친수성 코어(예를 들어, 가교된 다당류 또는 올리고당류) 및 임의로 인지질과 같은 양쪽성 화합물을 포함한 외층을 포함한거대분자 바이오벡터를 포함한다[참조: 미국 특허 제5,151,254호 및 국제 특허 공개 공보 제WO 94/20078호, 제WO 94/23701호 및 제WO96/06638호]. 서방성 제형에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상되는 기간 및 치료 또는 예방하고자 하는 증세의 성질에 의존한다.

또 다른 예시적인 양태에서, 생체분해성 미세구체(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 본 발명의 조성물에 대한 담체로서 사용한다. 적합한 생체분해성 미세구체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,76호, 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호에 기술되어 있다. 제WO 99/40934호 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술된 바와 같은 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템이 또한 다수의 용도에 유용할 것이다. 다른 예시적인 담체/전달계는, 숙주에서 I 부류-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기술된 바와 같은 미립자-단백질 복합체를 포함한 담체를 사용한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 종종 추가로 하나 이상의 완충제(예를 들어, 중성 완충 염수 또는 인산염 완충 염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코즈, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 산화방지제, 살균제, 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타치온, 애쥬반트(예를 들어, 수산화알루미늄), 제형을 수용체의 혈액과 함께 등장성, 저장성 또는 약한 저장성으로 만드는 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 보존제를 포함할 것이다. 달리, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화시킬 수 있다.

본원에 기술된 약제학적 조성물은 밀봉된 앰풀 또는 바이알과 같은 단일 용량 또는 수회 용량 용기에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 전형적으로 사용시까지 제형의 무균성 및 안정성을 보존하는 방식으로 밀봉된다. 일반적으로는, 제형은 오일 또는 수성 비히클에 현탁제, 용제 또는 에멀젼으로 저장될 수 있다. 달리, 약제학적 조성물은 사용하기 직전에 무균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다.

경구, 비경구, 정맥내, 비후내 및 근육내 투여 및 제형을 포함한 다양한 치료 섭생에서 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하기 위해 적합한 용량 및 치료 섭생의 개발은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 이의 일부는 일반적인 예시의 목적상 아래에 간단히 논의되어 있다.

특정 용도에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 경구 투여를 통해 동물에 전달할 수 있다. 이러한 경우에, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 제형화시키거나, 경질 또는 연질-쉘 젤라틴 캡슐에 밀봉하거나, 정제로 압축시키거나, 식품에 직접 혼입할 수 있다.

활성 화합물은 부형제와 함께 혼입하거나, 섭취가능한 정제, 협부 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제 등의 형태로 사용할 수 있다[참조: Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27; 386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998; 15(3):243-84; 미국 특허 제5,641,515호, 제5,580,579호 및 제5,792,451호]. 정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 또한 임의의 다양한 추가의 성분을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 결합제, 예를 들어, 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어, 인산이칼슘; 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 활택제, 예를 들어, 스테아르산마그네슘; 및 감미제, 예를 들어, 수크로즈, 락토즈 또는 사카린을 첨가하거나 박하, 동록유 또는 체리향과 같은 풍미제를 첨가할 수 있다. 용량 단위형이 캡슐제인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 재료는 피복제로서 존재하거나, 달리 용량 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제는 셀락, 당 또는 둘 다로 피복시킬 수 있다. 물론, 임의의 용량 단위형을 제조하는데 사용되는 임의의 재로는 약제학적으로 순수하여야 하며, 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 제형내로 혼입할 수 있다.

전형적으로는, 이들 제형은 비록 활성 성분(들)의 퍼센트가 다양할 수 있으나, 전체 제형을 기준으로 하여 적어도 약 0.1%의 상기 화합물을 함유하며, 편리하게는 약 1 또는 2중량% 또는 용량% 내지 약 60 또는 70중량% 또는 용량% 이상일 수 있다. 물론, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물(들)의 양은 적합한 용량을 화합물의 임의의 제공된 단위 용량으로 수득할 수 있는 방식으로 제조할 수 있다. 용해성, 생체이용성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장 수명과 같은 요소 뿐만 아니라, 다른 약리학적 요인이 약제 제형을 제조하는 분야의 숙련가에 의해 고려될 것이며, 이러한 경우에 다양한 용량 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.

경구 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 구강세정액, 치약, 협부 정제, 경구스프레이 또는 설하 경구 투여 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 함께 혼입할 수 있다. 달리, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유한 것과 같은 경구 용액에 혼입되거나, 치약에 분산되거나 물, 결합제, 연마제, 풍미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물에 치료학적으로 유효한 양으로 첨가할 수 있다. 달리, 당해 조성물은 설하에 위치되거나 구강내에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태를 취할 수 있다.

특정한 상황에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 비경구, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 이 가운데 몇몇은, 예를 들어, 미국 특허 제5,543,158호, 제5,641,515호 및 제5,399,363호에 기술되어 있다. 특정한 양태에서, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용제는 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조할 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 일반적으로는 미생물의 성장을 억제하는 보존제를 함유한다.

주사용으로 적합한 대표적인 약제학적 형태는 멸균된 수성 용제 또는 분산제 및 멸균 주사 용제 또는 분산제의 즉석 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다[참조: 미국 특허 제5,466,468호]. 모든 경우에 있어서, 당해 형태는 멸균되어야 하고, 주사가 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는,예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 피복물의 사용, 분산제의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 억제는 다양한 항균 및 항진균 물질, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진시킬 수 있다. 다수의 경우에, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장성 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 달성할 수 있다.

한 양태에서, 수성 용제로 비경구 투여하기 위해, 용제는 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며, 액체 희석제를 우선 충분한 염수 또는 글루코즈로 등장성으로 만들어야 한다. 이들 특정 수성 용제는 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시와 관련하여 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 용량을 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시킬 수 있으며, 1000ml의 피하 관세액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580]. 용량에서의 약간의 변화는 치료할 환자의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 또한, 사람에게 투여하는 경우, 제제는 물론 바람직하게는 FDA 사무국의 생물제제 표준에 의해 요구되는 바와 같은 무균성, 발열원성 및 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족시킬 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화시킬 수 있다. 약제학적으로 허용되는 예시적인 염은 (단백질의 유리 아미노 그룹과 형성되는) 산 부가 염 및 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성되는 산 부가염을 포함한다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도할 수 있다. 제형화시 용제는 용량 제제와 일치하는 방식으로 및 치료학적으로 효과적인 양으로 투여할 것이다.

담체는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 피복제, 희석제, 항균 및 항진균 물질, 등장성 및 흡수 지연 제제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 혼화되지 않는 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이들의 사용은 고려된다. 보충적인 활성 성분을 또한 조성물에 혼입할 수 있다. 구 "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여할 경우에 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 유발하지 않는 분자 자체 및 조성물을 가리킨다.

특정한 양태에서, 약제학적 조성물은 비내 분무, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달할 수 있다. 유전자, 핵산 및 펩타이드 조성물을 비내 에어로졸 분무를 통해 폐로 직접 전달하는 방법이 미국 특허 제5,756,353호 및 제5,804,212호에 기술되어 있다. 또한, 비내 미세입자 수지[참조: Takenage etal., J. Controlled Release 1998 Mar 2;52(1-2):81-7] 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물[참조: 미국 특허 제5,725,871호]을 사용한 약물의 전달은 약학 분야에 익히 공지되어 있다. 또한, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스의 형태로 예시적인 경점막 약물 전달이 미국 특허 제5,780,045호에 기술되어 있다.

특정한 양태에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 소포 등을 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/유기체내로 도입하는데 사용한다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구체 또는 나노입자 등에 캡슐화된 형태로 제형화시킬 수 있다. 달리, 본 발명의 조성물은 담체 비히클의 표면에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합시킬 수 있다.

강력한 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀-유사 제제의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다[참조: Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug;35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3):233-61; 미국 특허 제5,567,434호, 제5,552,157호, 제5,565,213호, 제5,738,868호 및 제5,795,587호; 각 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 상세하게 인용되어 있음].

리포좀은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양물 및 PC 12 세포를 포함한 다른 절차에 의해 정상적으로 감염되기 어려운 다수의 세포 유형에 성공적으로 사용되어 왔다[참조: Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221-9]. 또한, 리포좀은 바이러스계 전달계의 특징인 DNA 길이 제약을 받지 않는다. 리포좀은 유전자, 다양한 약물, 방사능 치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 작동인자 등을 다양한 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀의 사용은 전신 투여 후 자가면역 반응 또는 허용되지 않는 독성과 무관한 것으로 보인다.

특정한 양태에서, 리포좀은 수성 매질 중에 분산되어 자발적으로 멀티라멜라 동심성 다중층 소포(멀티라멜라 소포(MLV)라고도 함)를 형성하는 인지질로부터 형성시킨다.

또한, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캅셀 제형을 제공한다. 나노캅셀제는 일반적으로 안정하고 재생가능한 방식으로 화합물을 포집할 수 있다[참조: Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec;24(12):1113-28]. 세포내 중합 오버로딩으로 인한 역효과를 회피하기 위해 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 상기 초미세 입자(크기 약 0.1㎛)를 디자인할 수 있다. 당해 입자는 예를 들어, 문헌[참조: Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar; 45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 1998 Jan 2;50(1-3):30-40; 및 미국 특허 제5,145,684호]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

암 치료 방법

본 발명의 추가의 양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 암 치료, 특히 결장 또는 결장직장 암의 면역치료를 위해 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서 조성물은 유방암 또는 비 소형 세포 폐 암종을 치료하는데 사용될 수 있다. 전형적으로 조성물은 암이 크립토 항원을 발현하고 전이암이 크립토 항원을 발현하는 환자를 치료하는데 유용하다. 당해 방법에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 환자, 전형적으로 온혈 동물, 바람직하게는 사람에게 투여된다. 환자는 암을 앓거나 앓지 않을 수 있다. 따라서, 당해 약제학적 조성물을 사용하여 암의 진행을 예방하거나 암에 걸린 환자를 치료할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 1차 종양의 수술적 제거 및/또는 방사선 치료 약물 또는 통상적인 화학 치료 약물의 투여와 같은 치료전에 또는 치료후에 투여될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 약제학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내, 진피내, 항문, 질내, 국소 경로 및 경구 경로로의 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다.

특정 양태 내에서, 면역치료는 치료가, 면역 반응 개질제(예를 들어, 본원에 제공되는 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드)의 투여와 함께 종양에 대해 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존하는 능동 면역치료일 수 있다.

또 다른 양태내에서, 면역 치료는 치료가, 확립된 종양 면역 반응성을 갖고 직간접적으로 항종양 효과를 매개할 수 있고 반드시 온전한 숙주 면역계에 의존하지 않는 제제(예를 들어, 작동세포 또는 항체)의 투여를 포함하는 수동 면역 치료일 수 있다. 작동세포의 예는 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현하는 상기 논의된 바와 같은 T 세포, T 림프구(예를 들어, CD8⁺세포독성 T 림프구 및 CD4⁺T-헬퍼 종양 침투 림프구), 킬러 세포(예를 들어, 천연 킬러 세포 및 림포킨 활성 킬러 세포), B 세포 및 항원 제공 세포(예를 들어, 수지상 세포 및 마크로파아지)를 포함한다. 본원에 언급된 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 수용체 및 항체 수용체가 클로닝 및 발현될 수 있고 입양 면역을 위해 또 다른 매개 세포 또는 작동세포로 전달될 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드를 또한 사용하여 수동 면역을 위해 항체 또는 항-이디오타입 항체(본원 및 미국 특허 제4,918,164호에 제공된 바와 같음)를 제조할 수 있다.

작동세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 시험관내에서 성장시켜 입양 면역을 위해 충분한 양으로 수득될 수 있다. 단일 항원 특이적 세포를 생체내에서 항원 인지를 보유하는 수십억의 수로 확충하기 위한 배양 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 당해 시험관내 배양 조건은 전형적으로, 흔히, 사이토킨(예 IL-2) 및 비-분열 영양 세포의 존재하에 항원을 사용하여 간헐적으로 자극시키는데 사용한다. 상기 주지된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 면역반응성 폴리펩타이드를 사용하여 항원-특이적 T 세포 배양물을 신속하게 확충시켜 면역치료를 위해 충분한 수의 세포를 제조할 수 있다. 특히, 항원-제공 세포(수지상, 마크로파아지, 단핵구, 섬유아세포 및/또는 B 세포)를 면역반응성 폴리펩타이드와 펄스시키거나 당해 기술 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙팅시킬 수 있다. 예를 들어, 항원-제공 세포는 재조합 바이러스또는 기타 발현계에서의 발현을 증가시키기 위해 적당한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 트랜스펙팅시킬 수 있다. 치료에 사용하기 위한 배양한 작동세포는 광범위하게 성장시키고 분포될 수 있고 생체내에서 장기간 생존할 수 있어야만 한다. 연구는 배양된 작동세포가, IL-2가 보충된 항원과 반복적으로 자극시켜 상당한 수로 생체내에서 성장하고 장기간 생존할 수 있도록 유도될 수 있음을 보여준다[참조: Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997].

또한, 본원에 언급된 폴리펩타이드를 발현하는 벡터를 환자로부터 채취한 항원 제공 세포로 도입하여 동일 환자에게 재이식되는 이식물을 위해 생체외에서 클론적으로 증식시킬 수 있다. 트랜스펙팅된 세포는 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 사용하여, 바람직하게는 멸균 형태로 정맥내, 강내, 복강내 또는 근육내 투여로 환자에게 재도입될 수 있다.

본원에 기술된 치료학적 조성물의 투여 경로 및 투여 횟수 및 투여량은 환자 마다 다양하고 표준 기술을 사용하여 용이하게 확립될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 진피내 또는 피부내), 비강내(예를 들어, 흡인) 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 바람직하게, 1 내지 10회 투여량이 52주에 걸쳐 투여될 수 있다. 바람직하게 6회 투여량이 1개월 간격으로 투여되고 백신화를 위한 부스터는 이후에 주기적으로 투여될 수 있다. 또 다른 프로토콜이 각 환자에게 적합할 수 있다. 적합한 투여량은 상기된 바와 같이 투여되는 경우, 항 종양 면역반응을 촉진시킬 수 있고 기본(즉, 비처리된) 수준을 10 내지 50% 이상 초과하는 화합물의 양이다. 당해 반응은 환자내의 항 종양항체를 측정하거나 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 작동세포의 백신 의존적으로 합성하여 모니터할 수 있다. 당해 백신은 또한 면역 반응을 유발하여 백신 투여되지 않은 환자와 비교하여 백신 투여된 환자내에서의 임상적 결과(예를 들어, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 보다 장기간 동안 질환이 없는 생존)를 개선시킬 수 있어야만 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신을 위한 각각의 폴리펩타이드의 양은 숙주 kg당 25㎍ 내지 5㎎ 범위의 투여량이다. 적합한 투여량은 환자의 크기에 따라 다양하지만 전형적으로 범위는 약 0.1 mL 내지 약 5mL이다.

일반적으로, 적합한 투여량 및 처리 섭생은 치료학적 및/또는 예방학적 이득을 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물을 제공한다. 당해 반응은 비처리된 환자와 비교하여 처리된 환자내에서 개선된 임상적 결과(보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 장기간 동안 질환이 없는 생존)를 확립하여 모니터할 수 있다. 종양 단백질에 대해 기존의 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상적 결과와 관련이 있다. 당해 면역 반응은 일반적으로 표준 증식, 세포 독성 또는 사이토킨 분석을 사용하여 평가할 수 있고 처리 전후의 환자로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.

실시예 1a

사람 병변에서 면역반응성 크립토-1N의 발현

조직 비관여 상피 전암성 병변 암종

TA TVA

결장 25/193 26/65(40) 10/13(77) 122/168(73)^**

IM17/37(46)^**

위 1/37(3) 16/30(53)

췌장 10/58(17) 58/98(59)^**

비대증 샘종

쓸개 N.D. 6/9(67) 4/7(58) 89/132(68)^**

DCIS

유방 5/33(15) 26/55(47) 497/631(79)^**

작지않은

세포 폐 178/195(91)^**

조직 비 관여 상피 낭샘종 장액 점액

장액 점액

난소 6/7(86) 폐경후 6/14(43) 0/7 4/10(40) 4/5(80)

23/40(58)

25/48(52)

3/9(33) 3/8(38) 4/8(50) 9/10(90)

경계선:10/10

자궁내막 10/28(36)폐경후 53/91(58)^*

비대증

18/30(60) 68/96(71)^*

자궁목 4/25(17) 40/74(54)^*

고환 0/3 29/51(57)^**

배아암종 고환종

19/19(100)^**10/32(31)

부신 피질 1/3(33)

방광 0/6 23/39(60)^**

신장 0/18

전립선 0/9

TA = 관샘종

TVC = 대롱융모샘종

IM = 장 화생

^**비 관여 조직에 대한 암종에서의 통계학적으로 유의적인 발현

실시예 1.6: 암 조직에서의 크립토 과발현

실시간 RT-PCR(참조: U. Gibson. 1996. Genome Research: 6,996)을 사용하여 정상적인 조직과 종양 조직 및/또는 세포주의 판넬에서 표적 단백질에 대한 mRNA 전사체의 양을 비교한다. 당해 분석은 우수한 백신 후보물이라면 갖추어야만 하는 중요한 척도가 되는 크립토 발현에 대한 종양 특이성을 확립하는데 중요하다.

총 RNA는 순간 냉동 생검 또는 세포주로부터 TriPure 시약(Roche)을 사용하여 추출한다. 정상 조직의 총 RNA는 또한 제조원[InVitrogen]으로부터 구입한다. 폴리-A + mRNA는 올리고-dT 자성 비드(Dynal)를 사용한 DNAase 처리후 총 RNA로부터 정제한다. mRNA는 리보그린(RiboGreen) 염료(Molecular Probes)를 사용한 분광형광측정기로 정량한다.

실시간 RT-PCR 증폭을 위한 TaqMan 프라이머(정방향 프라이머 서열: TGGGTAGGAAAGAGGAAGCAAAT, SEQ ID NO: 7; 역방향 프라이머 서열: TGCTTCTCTACCACCACCTAATCA, SEQ ID NO: 8)는 TaqMan 증폭조건에 대한 디폴트 옵션을 사용하는 퍼킨 엘머 프라이머 발현 소프트웨어로 디자인한다.

각각의 반응에 대한 역전사 mRNA 2ng을 사용하는 표준 PCR(Expand RT, Roche)에 따라 실시간 반응물을 수집한다. 평가된 샘플에 따라 SybrI 또는 TaqMan을 검출한다. SybrI 검출의 경우에, SybrI 염료(분자 프로브)를 실시간 검출을 위한 1/75000의 최종 희석액에 첨가하고 TaqMan 프로브를 제거한다. 증폭(40회) 및 실시간 검출은 통상적인 장치 세팅을 사용한 퍼킨 엘머 바이오시스템 PE7700 시스템으로 수행한다. Ct 값은 PE7700 서열 검출기 소프트웨어를 사용하여 계산한다. Ct 값은 표적 mRNA(CtX) 및 액틴 mRNA(CtA)에 대한 각각의 조직 샘플로부터 구한다.

지배적인 실험 조건하에서 PCR 증폭의 효능이 이론적인 증폭 효능에 근접함으로써 2^(CtA-CtX)값은 액틴 전사체 수준으로 표준화된 샘플의 상대적인 표적 전사체 수준을 평가한 값이다. 따라서 1의 값은 후보 항원 및 액틴이 동일한 발현 수준임을 시사하는 것이다.

SybrI 검출을 사용한 RT-PCR 분석은 6명의 상이한 환자 및 48개의 정상 조직 샘플로부터 유래하는 한 세트의 결장 종양 및 상응하는 정상적인 결장에 대해 수행한다. TaqMan 검출은 6명의 상이한 환자(반응은 3회 수행한다) 및 48개의 정상 조직 샘플로부터 유래하는 한 세트의 결장 종양 및 상응하는 정상 결장에 대해 수행한다. 시험된 정상 조직(및 그래픽에 사용되는 약어)는 하기에 나타낸다:

부신선(Ad Gl)

대동맥(Ao)

방광(Bl)

골수 Bo Ma

뇌(Bra, Bra1, Bra2, Bra3, Bra4, Bra5)

목(Ce)

결장(Co)

자궁관(Fa Tu)

심장(He)

회장(Il)

신장(Ki)

간(Li, Lil, Li2)

폐(Lu)

림프선(Ly No)

식도(Oe)

난소(Ov)

췌장(Pa, Panc1, Panc2)

부갑상선(Pa Thy)

태반(Pl)

전립선(Pr)

직장(Re)

피부(Sk)

골격근(Sk Mu)

소장(Sm In)

비장(Sp)

위(St)

고환(Te)

갑상선(Thyr, Thy, Thy1, Thy2)

흉선(Thym1,Thym2)

기관(Tr, Tra)

SybrI 검출을 사용한 실시간 RT-PCR 반응은 또한 7개의 폐 세포주상에서 수행한다:

CRL-5803(암종, 작지않은 세포 폐암, 거대 세포, 신경내분비세포, 전이 부위: 림프선)

CRL-5807(기관지폐포 암종, 작지않은 세포 폐암)

CRL-5810(선암종, 작지않은 세포 폐암)

CRL-5815(유암종, 폐 기관지)

CRL-5865(선암종, 전이 부위: 흉막 삼출)

CRL-9609(정상적인 폐, 기관지, 상피, 형질전환된 바이러스)

HTB-177(암종, 거대 세포 폐암, 흉막 삼출) 및 2개의 결장 세포주:

CRL-2159(암종, 맹장, 듀크 B)

CCL-250

신선한 생검 정상 폐 조직(Lu(ucl), Lu(IVG) 및 폐 종양 조직(LuTum)을 또한 대조군으로서 사용한다.

결장직장 생검 및 정상 조직에 대한 RT-PCR 결과는 도 1 내지 4 및 표 1에 나타낸다. 세포주에 대한 RT-PCR 결과는 도 5에 나타낸다.

	Sybr 검출1	TaqMan 검출1
	결장직장 종양 vs 인접한 정상 결장 2
과발현 환자의 수	5/6	5/6
과발현 환자에서의 평균 과발현 폴드	200	90
중간 과발현 폴드(최소-최대)	64(22-724)	20(4-397)
	결장직장 종양 vs 평균 정상 조직 2
과발현 환자의 수	5/6	4/6
과발현 환자에서의 평균 과발현 폴드	10	12
중간 과발현 폴드(최소-최대)	11(3-22)	7(3-32)
고전사 수준3을 갖는 정상 조직(정상 대 종양의 비)	비장(0.5)	비장(0.75)난소(2)4

표 2: 결장직장 종양 및 정상 조직에서의 크립토 발현

1. 전사 수준은 하기 2가지 검출 기술을 사용하여 정상 조직의 패널 및 결장직장 종양에서 계산되었다: TaqMan 및 Sybr. 크립토에 관해서, TaqMan 검출은 6명의 환자를 대상으로 하며 3회씩 측정되는 반면, Sybr 검출은 6명의 상이한 환자를 대상으로 실시되었다.

2. 결장직장 종양에서의 전사 수준을 매칭된 정상 결장 및 정상 조직의 전사 수준의 평균과 비교하였다.

3. 정상 조직은, 이것이 결장직장 종양의 전사 수준의 1/5보다 더 높은 경우에 높은 전사수준을 나타낸다.

4. 난소는 크립토 Sybr 실험에서 평가되지 않았다.

표 2 및 도 1, 2, 3 & 4로부터, 정상의 성인 조직의 가장자리에서 발현되는크립토가 10배가 넘는 과발현율로 결장직장 종양 대부분에서 매우 과발현된다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 5로부터 크립토가 폐암 세포주(CRL-5815)에서 극적으로 과발현된다는 것도 확실히 알 수 있다. 따라서, 크립토 종양에 관련된 항원은 결장직장암 및 폐암 환자 모두를 치료하는데 적합한 백신 후보물이다.

실시예 2: 폐종양 세포주로부터 크립토-1 c-DNA의 클로닝

전체 RNA를 7개의 상이한 폐 세포주의 10⁷배양세포로부터 TriPure 시약을 사용하여 추출하였다(세포주의 완전한 리스트에 대한 섹션 1을 참조). 전체 RNAs를 풀링하고, mRNA를 올리고-d(T) 자기 비드(Dynal)에 대한 풀링된 전체 RNA로부터 정제하였다. 250ng의 mRNA를 cDNA 합성에 대해서 사용하였다. mRNA의 정량화는 리보그린(Molecular Probes) 염료를 사용하여 분광계(VersaFluor, BioRad)로 실시하였다. cDNA는 전장의 전사체 만을 증폭시킬 수 있는 젠레이서 기술(Invitrogen)을 사용하여 합성하였다. mRNA를 CIP로 처리하였다. mRNA 5' 말단을 TAP(담배산 피로포스파타제)로 탈캡핑시키고, 특이적인 RNA 올리고뉴클레오타이드로 결찰시켰다. 결찰된 mRNA를 올리고(T) 테일을 갖는 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 젠레이서 플랭킹 프라이머(Advantage, Clontech) 모두를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 크립토 증폭을 유전자 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 10ng의 젠레이서 cDNA에 대해 실시하였다(정방향 프라이머 서열: CGTCCAAGGCCGAAAGCCCTCCAGTT, SEQ ID NO; 9; 및 역 프라이머 서열: TTGGGAGAGGGCAGGGCAAAGAAGTAAGAA, SEQ ID NO: 10). PCR 반응을 표준 조건하에서어드밴디지 II Taq DNA 폴리머라제(Clontech)를 사용하여 실시하였다. PCR 생성물은 pCR4-TOPO 플라스미드(Introgen)에서 클로닝하였다. 증폭된 서열(SEQ ID NO: 95)은 코돈 22(SEQ ID NO: 96)에서 변이체를 나타내는 것으로 보였다: 천연 상태(SeqID6)의 Val(GTC) 대신에 Ala(GCC). 천연 상태의 것은 PCR 돌연변이에 의해 저장되었다.

실시예 3: 동물 모델에서 크립토 종양-연관된 항원의 면역원성

본 발명의 항원의 면역원성을 다양한 면역 수단을 사용하여 토끼 및 마우스를 면역시킴으로써 확인하였다. 확실히, 크립토 형태의 펩타이드 또는 재조합 단백질 중 어느 하나를 사용하여 면역화시키면 크립토에 대해 특이적인 항체를 형성시키면서 체액성 면역 반응을 유발시킬 수 있고/있거나 크립토 특이적인 세포성 면역 반응을 유발시킬 수 있었다. 적당한 벡터가 인코딩된 크립토 또는 크립토 단편, 바이러스 벡터가 인코딩된 크립토 또는 크립토 단편에 의해 전달된 크립토 유전자 중에서 예를 들어 나출형 DNA를 사용하여 크립토 단백질을 생체내 전달시키는 것도 또한 크립토의 면역원성을 입증하는데 유용할 수 있었다.

3.1.: 합성된 펩타이드 면역화 반응

토끼를 면역화시키도록 선택된 사람 크립토-1- 아미노산 서열로부터 합성된 펩타이드는 GHQEFARPSRGYL (13 아미노산, SEQ ID NO:11) 및 QEEPAIRPRSSQRVPPMG(18 아미노산, SEQ ID NO: 12)이다. 이후, 합성된 펩타이드를 담체 단백질(KLH)로 접합시킨다. 접합체를 프로이트 애쥬반트로 제형화시키고, 2마리의 토끼는 각각의 접합체를 사용하여 면역화시킨다. 제 2 면역 반응을 실시하고 나서 2주 경과 후그리고 제 3 면역 반응을 실시하고 나서 4주 경과후에, 혈액 샘플을 채취한다. 항-크립토 항체 적정량을 혈청 내에서 ELISA 및/또는 웨스턴 블롯에 따른 표준 프로토콜에 의해 평가하였다(3.5 섹션 참조).

3.2: 핵산 면역화 반응

pcDNA 3.1 벡터(Invitrogen)을 백신용 플라즈미드를 작제하는데 사용한다. 생체 내의 해독된 단백질의 분비를 촉진시켜서 본 발명의 항원에 대한 체액성 반응을 유발시키기 위해서, 자신의 고유한 시그날 펩타이드를 갖는 핵산 서열을 인코딩하는 크립토-1을 벡터 폴리클로닝 부위 내로 삽입시킨다. 재조합 발현 플라즈미드를 BL21과 같은 숙주 대장균 균주를 형질전환시키는데 사용한다.

상기 재조합 균주를 종래 세포 배양 배지 내에서 성장시킨다. 박테리아는 정지기에 도달하기 전에 수집한다. 마우스 내에 주사하기 위해서 퀴아젠(quiagen)계를 사용하는 플라즈미드를 제조한다.

6 내지 8주령의 올드 Balb/c 마우스에게 재조합 발현 플라즈미드를 근육내 주사한다. 마지막으로 주입하고 나서 2주가 경과한 후에, 혈액 샘플을 채취한다. 본 발명의 항원에 대해 유도된 특이적인 항체의 적정량을 ELISA 및/또는 웨스턴 블롯으로 측정한다(3.5 섹션 참조).

3.3 아데노바이러스를 사용하는 바이러스 벡터 면역화

재조합 아데노바이러스가 인코딩된 항원에 대해 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에, 이들은 유전자계 백신화에 대해서 효과적인 벡터이다. 자신의 고유한 시그날 서열을 갖는 크립토-1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드서열을 적당한 아데노 유도체 바이러스 벡터 내로 삽입시킬 수 있었다. 아데노바이러스 재조합 벡터를 다양한 경로(근육내, 비강내, 진피내, 피하 또는 복막내)로 마우스에게 투여할 수 있었다. 2주 후에, 혈액 샘플을 채취할 수 있었고, 유도된 적정량의 항체를 검사하였다. 세포성 면역 반응을 측정하기 위한 부가적인 실험을 또한 실시할 수 있었다.

3.4: 재조합 단백질 면역화 반응

3.4.1: 크립토-1 재조합 단백질의 발현 및 정제

면역화시키기 위한 본 발명의 항원의 단편 또는 전체 단백질을 제조하기 위해서 미생물 숙주 내에서 발현시켰다. 재조합 단백질을 2개의 미생물 숙주, 즉 (사카로마이세스 세레비시아 또는 피키아 파스토리스와 같은) 대장균 및 효모 중에서 발현시킬 수 있다. 이것에 의해, 이러한 특수한 항원 생산에 있어서 최선의 특징을 갖는 발현계가 선택될 수 있다.

발현 전략은 일단 재조합 항원의 주요 구조를 디자인하는 것에 관련된다. 일반적으로, 발현 수준을 개선시키기 위한 발현 융합 파트너(EFP) 및/또는 항원의 면역원성을 조절하기 위한 면역 융합 파트너(IFP)가 N-최말단에 위치한다. 또한, 추가로 용이하게 정제시키는데 유용한 친화도 융합 파트너(AFP)가 C-말단에 포함된다.

재조합 균주가 입수가능한 경우, 재조합 생성물은 발현 수준을 평가함으로써 그리고 미정제 추출물 내에서 이것의 행동을 분석하여 가공처리된 단백질의 추가 용해도를 예측함으로써 특징화된다.

적당한 배양 배지 중에서 생장시키고 재조합 단백질 발현을 유발시킨 후에, 총 추출물을 SDS-PAGE로 분석한다. 재조합 단백질은 스테인드 겔 내에서 가시화되어, 토끼에서의 펩타이드 면역 반응에 의해 형성된 특이적인 항-펩타이드 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석으로 확인된다(3.1 섹션 참조).

다양한 정도로 발현된 항원 및 발현 숙주를 비교 평가함으로써 가장 가능성이 높은 후보물, 및 추가의 정제와 추가의 면역학적 평가에 사용될 수 있는 숙주를 선택할 수 있을 것이다.

정제는, 재조합 단백질에서 히스티딘 친화도가 있는 테일의 존재에 기초한 통상의 방법을 따라 수행된다. 전형적인 실험에서, 파괴된 세포가 여과되고, 특이적일 것으로 예상되는, 이온 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC; Quiagen으로부터의 Ni+ +NTA) 상으로 로딩된 무세포성 추출물이 재조합 단백질을 보유한다. 보유된 단백질이 인산염 완충액 내에서 0 내지 500mM의 이미다졸 구배(가능하게는, 세제의 존재하에서)에 의해 용리된다.

3.4.2: 단백질 면역화

토끼를 재조합 정제 단백질을 사용하여 수주 간격으로 수차례 근육내적으로 면역화시키고, 애쥬반트 3D-MPL/QS21 내에서 제형화시켰다. 각각의 면역 반응 후에 3주가 경과하면 혈액 샘플을 채취한다. 항-크립토 항체 적정물을 혈청 내에서 ELISA로 평가하였다. 형성된 항-크립토 항체의 특이성을 정제된 단백질을 사용하며 적절한 대조군을 포함하는 웨스턴 블롯에 의해 시험한다(3.5 섹션 참조).

3.5: 크립토-면역화된 동물의 면역학적 반응 검정

크립토 면역화에 대한 체액성 반응을, 동물 혈청 내에서의 ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 크립토 특이적인 항체 적정물을 측정함으로써 평가한다. 하기 물질을 함유하는 크립토-1로부터 유래한 펩타이드 또는 전체 단백질을 상기 시험을 실시하는데 사용할 수 있었다:

ㆍ크립토 합성 펩타이드(가능한 펩타이드에 대해서는 3.1 섹션을 참조함), 또는

ㆍ크립토-발현 세포주의 배양액으로부터 추출한 단백질 추출물(가능한 세포주에 대해서는 1 섹션을 참조함), 또는

ㆍ크립토 재조합 플라즈미드(하기함)를 일시적으로 발현시키도록 가공처리된 COS 세포의 세포용해물, 또는

ㆍ재조합 대장균 또는 효모 균주의 단백질 추출물(재조합 균주 형성에 대해서는 3.3.1 섹션을 참조함), 또는

ㆍ정제된 재조합 항원(항원 정제에 대해서는 3.3.1 섹션을 참조함)

COS 세포 내에서의 크립토의 일시 발현은, COS 세포를 핵산 백신화에 대해 제조된 재조합 pcDNA 3.1 플라즈미드를 사용하여 일시적으로 트랜스펙팅시킴으로써 얻어진다(3.2 섹션 참조).

ELISA 반응에 대해서는, 상기 항원 중 하나를 미세적정물 플레이트 상에 코팅시킨다(정제된 재조합 단백질이 바람직하다). 이후, ELISA는 표준 프로토콜을 사용하여 실시된다.

웨스턴 브롯이 표준 조건하에서 상기 항원 중 하나를 사용하여 실현된다(정제된 재조합 단백질이 바람직하며, 합성된 펩타이드는 사용되지 않는다).

또한, 세포성 반응은 시험관내에서 백신화시킨 마우스 비장 세포를 마우스를 면역시키는데 사용된 펩타이드, 또는 전체적인 항원 서열을 커버링하는 항원으로부터 유래한 오버랩핑 펩타이드로 자극함으로써 평가될 수 있다.

실시예 4: 시험관내 프라이밍에 의한 크립토에 특이적인 사람 T-세포의 존재 입증

크립토-1의 면역학적 상관성을 사람 T 세포를 시험관내에서 프라이밍시킴으로써 추가로 확인할 수 있다. 모든 T 세포 림프구, T 세포주 및 수지상 세포는 건강한 도너 또는 암환자(바람직한 도너는 HLA-A2 서브타입으로부터 유래함)의 PBMCs(구형의 혈액 단핵 세포)로부터 유래한다.

HLA 대립유전자 예측의 에피토프 결합:

HLA 클래스 I에 결합하는 펩타이드 서열(노나머, 데카머)은, 파커 알고리즘 [참조: Parker K, et al. 1994](http:// bimas. dcrt. nih.gov /molbio/ hla- bind/) 및 라멘스 방법 [참조: Rammensee, et al. 1997][Rammensee, et al. 1995](http:// syfpeithi. bmi-heidelberg. com/ Scripts/ MHCServer.dll/ EpPredict.htm)중 어느 하나에 의해 예측된다.

HLA 클래스 II에 결합하는 펩타이드 서열(노나머)은 테피토프 알고리즘[참조: Sturniolo, et al. 1999]을 사용하여 예측된다.

CD8 ⁺ T-세포 반응:

CD8⁺T 세포주를 집어올리기 위한 전략으로 하기 2가지가 사용된다: 펩타이드계 방법 및 전체적인 유전자계 방법. 이 두 방법 모두, 적당한 전달계 내에서 클로닝시키고 HLA에 결합하는 펩타이드 서열을 예측하는데 사용할 정확한 리딩 프레임에 사용되는 전장의 해당 cDNA가 필요하다.

펩타이드계 방법:

이 방법에 대해서, HLA-A2.1/Kb의 유전자이식된 마우스 모델이 HLA-A2.1 펩타이드를 스크리닝하는데 사용된다. 간단하게는, 유전자이식된 마우스를 애쥬반팅된 HLA-A2 펩타이드로 면역화시키고, (펩타이드-펄싱된 표적 세포) 효과적인 세포용해 또는 g-IFN 생성에 의해 정의된 바와 같은) CD8 반응을 유도시킬 수 있는 것들을 사람계 내에서 추가로 분석한다.

사람의 수지상 세포[ Romani et al에 따라 배양됨]가 선택된 펩타이드로 펄싱되고 (Facs에 의한) CD8⁺로 분류된 T 세포를 자극시키는데 사용될 것이다. 수주 동안에 자극시킨 후에, CD8⁺주는 펩타이드로 펄싱된 자동 BLCL(EBV-B 형질전환된 세포주)에 대해 먼저 시험한다. 펩타이드의 적절한 생체내 가공을 확인하기 위해서, CD8⁺주를 cDNA-트랜스펙팅된 종양 세포(HLA-A2로 트랜스펙팅된 LnCaP, Skov3 또는 CAMA 종양 세포)에 대해서 시험한다.

전체적인 유전자계 방법:

CD8⁺세포주를 프라이밍시키고, 유전자-건 트랜스펙팅된 수지상 세포, 레트로바이러스로 형질도입된 B7.1-트랜스펙팅된 섬유아세포, 재조합 폭스 바이러스[참조: Kim et al.] 또는 아데노바이러스[참조: Butterfield et al.]로 감염된 수지상 세포 중 어느 하나로 자극된다. 바이러스 감염된 세포는, 항원이 높은 수준에서는 발현되나 바이러스 T 세포주의 과성장을 방지하는데 단지 일회적으로 사용될 수 있기 때문에, 본 발명의 항원성 펩타이드에 매우 효과적이다.

대안적으로 시뮬레이션 시킨 후에, CD8⁺주는 cDNA로 트랜스펙팅된 종양 세포에 대해 상기한 바와 같이 시험된다. 펩타이드 특이성 및 동일성은 본 발명의 항원을 면역학적으로 확인하도록 측정된다.

CD4 ⁺ T-세포 반응:

마찬가지로, CD4⁺T-세포 면역 반응을 또한 평가할 수 있다. 재조합 정제 단백질 또는 T-세포를 자극시킬 펩타이드를 로딩시킨 수지상 세포를 사용하여 특이적인 CD4⁺세포를 형성시킨다.

결과:

A-파커 방법을 사용한 클래스 I 에피토프의 예측.

NB: 스코어는 이러한 서열을 함유하는 분자가 분열될 경우의 반감기의 추정치이다.

B-라멘스 방법을 사용하는 클래스 I 에피토프의 예측

C-테피토프 방법을 사용하는 클래스 II 에피토프의 예측

실시예 5: 크립토 백신에 의해 유발된 체액성 반응의 항종양 효능

암에서의 크립토의 병리학적 활성에 대한 크립토-특이적인 체액성 반응의 억제 효과를 평가하기 위한 일련의 실험은 시험관내 검정에 있어서의 다양한 표준을 사용함으로써 수행될 수 있었다. 시험관내 검정으로는, 여기에 한정되는 것은 아니나 성장 억제 검정, 세포 유동성 억제 검정, 화학주성 억제검정, 세포외 매트릭스 단백질(ECM)을 통한 침입 억제 및 성장 시그날 변환 경로의 억제가 있을 수 있었다. 크립토 펩타이드 또는 애쥬반트 내에서의 단백질, 또는 플라즈미드 DNA 또는 바이러스 전달계, 예를 들어 크립토 단백질을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 면역시킨 동물의 혈청 효과를, 크립토-발현 세포주에 대한 크립토로 매개된 생물학적 효과를 측정하는 이러한 시험관내 검정에서 평가할 수 있었다. 이와 마찬가지로, 동일한 동물로부터 채취한 예비면역 혈청의 효과를 음성 대조군으로서 시험할 것이다. 이러한 검정에서 사용된 세포주로는, 여기에 한정되는 것은 아니나 크립토를 자연적으로 과발현시키는 GEO 세포, NTERA2 세포, CRL-5815 세포주 또는 뮤린 종양 세포주와 같은 사람 종양 세포 발현 크립토일 수 있었다. 예로서, GEO 및 NTERA2 세포의 시험관내 성장 억제가 크립토 mRNA를 해독시키는 작업을 방지하도록 디자인된 안티-센스 올리고뉴클레오타이드로 처리함으로써 입증되었다[참조: Baldassarre et al, 1996; Ciardiello et al., 1994; Alper et al., 2000].

5.1: 면역 프로토콜:

애쥬반트 내의 펩타이드 또는 단백질을 족저내(intra-foodpad) 주사, 유전자-건(gene-gun) 장치를 사용하여 플라즈미드 DNA를 인코딩하는 크립토의 진피내 주사 또는 바이러스 벡터 전달계, 예를 들어 크립토를 인코딩하는 아데노바이러스를 진피내 주사시킴으로써, 0, 14 및 21일 째에 마우스 또는 토끼를 면역시켰다.

5.2: 세포 증식 억제 검정:

면역시킨 동물로부터 채취한 혈청을 수집하고, 이 혈청을 96웰 플레이트 내에 플레이팅된 세포의 배양 배지에 다양한 희석율로 첨가시킬 것이다. 마찬가지로, 이러한 동물의 예비면역 혈청을 음성 대조군으로서 세포에 첨가시킬 것이다. 이 세포들을 3 내지 7일 동안 처리시킬 것이다. 세포 성장을³H-티미딘 혼입 검정, MTT 검정, 자수정 스테이닝, 또는 연질 아가 배지 내에서의 증폭을 계수하기 위한 콜로니와 같은 표준 방법으로 평가할 것이다.

5.3: 세포 침입, 유동성 및 화학주성 억제 검정:

면역시킨 동물로부터 채취한 혈청을 수거하여 예비면역 및 후면역시키고, 이것을 침입, 유동성 및 화학주성 표준 검정에 사용된 세포 현탁액에 다양한 희석율로 첨가시킬 것이다. 크립토로 매개된 침입, 유동성 및 화학주성의 억제를, 예를 들어 여기에 한정되는 것은 아니나 마트리젤 삽입물(Collaborative Research)이 구비된 시판되는 팔콘(Falcon) 챔버, 아가로스 점적 유동성 검정(참조: Yamamoto et al., 1990) 및 시판되는 보이덴 장치(Neuro Probe)를 각각 사용하여 평가할 수 있었다.

5.4: 시그날 변환 억제 검정:

면역시킨 동물로부터 채취한 혈청을 수거하여 예비면역 및 후면역시키고, 배양중인 크립토-발현 종양 세포에 다양한 희석율로 첨가하였다. 그런 다음, ELISA에 의해 검출된 최고 농도의 크립토를 함유하는 외인성 크립토 단백질 또는 사람 혈청 또는 우유를 세포의 배양 배지에 첨가할 것이다. 다양한 횟수로 인큐베이팅시킨 후에, 세포를 수집하고, 면역블롯 검정을 실시하기 위해 표준 방법으로 가공할 것이다. 세포 증폭에 관련된 다양한 핵심적인 시그날 변환 경로의 인산화 위치를 예비 또는 후면역시킨 혈청의 존재하에서 이러한 크립토로 자극된 세포로 평가할 것이다. 예를 들어, erb B-4 및 ERK1, ERK-2 및 P38과 같은 미토젠으로 활성화된 단백질(MAP) 키나제 계열의 타이로신 인산화 위치를 포스포릴화된 상기한 바와 같은 (참조: Bianco et al., 1999; Paine et al., 2000) 이러한 효소의 활성 형태를 인지하는 항체를 사용하여 면역블롯팅시킴으로써 평가할 것이다.

실시예 6: 동물 모델에서 크립토 백신에 의해 유발된 면역 반응의 생체 내 항종양 효과

사람 크립토 단백질, 크립토 펩타이드 또는 크립토 유전자를 함유하는 백신의 예방 또는 치료학적 효능을 크립토를 발현하는 유전자 동계형(syngeneic) 뮤린 종양 세포주로 챌린지시킨 마우스에서 평가할 수 있다. 이러한 종양 세포주는 사람 크립토 유전자로 트랜스펙팅시킨 뮤린 종양 세포주일 수 있었다. 예를 들어, 트랜스펙팅된 세포주는 사람 크립토 유전자로 트랜스펙팅된 TC1 세포주일 수 있었다. 한편, 사람 크립토와 이것의 뮤린 동종체 사이의 높은 수준의 동종성으로부터, 사람 백신에 의해 유발된 교차반응성의 면역 반응이 마우스 크립토-발현 종양에 대해 보호될 수 있다는 사실이 제안된다. 확실하게, 크립토 유전자(TDGF-1)는 이것의 사람 상응물과 93%의 동일성을 갖는 171개의 아미노산 단백질을 인코딩한다[참조: Liguori et al., 1996]. 따라서, 마우스는 내인적으로 크랩토 단백질을 과발현시키는 것으로 공지된 자발적으로 성장하는 종양 또는 뮤린 종양 챌린지로부터 사람 크립토 백신을 사용하여 면역시킴으로써 보호될 수 있었다. 이러한 관점에서, MMTV-폴료마 바이러스 중심 T 항원, MMTV-c-ErbB2 및 MT-hTGF 알파와 같은 다수의 상이한 종양 유전자를 과발현시키도록 디자인된 유전자이식된 마우스에서 자발적으로 성장하는 종양은 또한 크립토를 과발현시키는 것으로 알려졌다[참조: Kenney et al., 1996; Niemeyer et al., 1999].

대안적으로, 유전학적으로 동계인 유전자를 사용하여 백신화시키기 위해, 종양을 함유하는 마우스를 플라즈미드 DNA 또는 바이러스 전달계, 예를 들어 뮤린 종양 성장을 억제하도록 뮤린 크립토 단백질이 인코딩되어 있는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 백신화시킬 수 있다.

6.1: 예방용 실험 디자인:

마우스를 종양 챌린지시키기 전에, 애쥬반트 중의 5㎍의 크립토 단백질을 족저내 주사시키거나, 유전자-건 기술을 사용하여 크립토가 인코딩된 DNA 플라즈미드를 진피내 주사시키거나, 바이러스 벡터, 예를 들어 크립토를 인코딩하는 아데노바이러스성 벡터를 진피내 주사시킴으로써 0 및 14일째에 백신화시켰다. 그런 다음, 10⁶TC1-CR-1 세포, 사람 크립토-발현 종양 세포를 백신화시키고 나서 1 또는 2주가 경과한 후에 C57BL/6의 면역경쟁적인 마우스의 측부에 피하 주사할 수 있었다. 종양 챌린지시키고 나서 수주가 경과한 후에 일주일에 2회씩 각 종양을 측정함으로써, 생체내에서 종양 성장을 모니터링해야 한다.

한편, 예방 백신의 효능을, 종양이 만져질 수 있을때까지 성장하기 전에 어느 한 형태의 크립토 백신을 사용하여 반복해서 면역시킨 유전자이식된 마우스(참조: Niemeyer et al., 1999) 내에서 자발적인 크립토-발현 종양이 진행되는 것을억제함으로써 평가할 수 있었다.

6.2: 치료 실험 디자인:

10⁶TC1-CR-1 세포, 사람-크립토 발현 종양 세포를 C57BL/6 면역경쟁적인 마우스의 측부에 피하 주사할 것이다. 마우스를 종양 챌린지시킨 후에, 애쥬반트 중의 5㎍의 크립토 단백질을 족저내 주사시키거나, 유전자-건 기술을 사용하여 크립토를 인코딩하는 DNA 플라즈미드를 진피내 주사시키거나, 바이러스 벡터, 예를 들어 크립토를 인코딩하는 아데노바이러스 벡터를 진피내 주사시킴으로써 7 및 14일째에 백신화시켰다. 종양 성장을 일주일에 2회씩 각 종양을 측정함으로써 생체내에서 모니터링해야 한다. 제 2 면역 후에 1 내지 4주에 그룹당 수마리의 마우스를 치사시켜, 비장 세포, 배출용 림프절 및 크립토 특이적인 면역 반응 유발과 항종양 효과 사이의 상관관계를 얻기 위한 면역 반응 분석용 혈청을 채취할 것이다. 면역화에 의해 유발된 크립토-특이적인 면역 반응의 분석은 항체 적정량, 항체 동기준 표본 프로파일, CD4⁺T-세포 증식 반응 및 사이토킨 생성과 크립토-발현 표적 세포에 대한 세포용해 활성을 포함하는 CTL CD8⁺T-세포 반응을 측정함으로써 평가될 수 있었다. 모든 검정은 표준 프로토콜에 따라 실시될 것이다.

유사한 유형의 실험은, 이식가능한 뮤린 포유동물의 종양주 고발현 크립토를 사용하여 모체 마우스를 챌린징시킴으로써 수행될 수 있었다. 이러한 세포들은, MMTV-폴리오마 바이러스 중간 T 항원, MMTV-c-ErbB2 및 MT-hTGF 알파 유전자이식된 마우스(참조: Niemeyer et al., 1999)와 같은 다양한 종양 유전자 유전자이식된 마우스 스트레인에서 유발되는 자발적인 종양으로부터 얻어질 것이다.

Claims (14)

1. (a) 전체 SEQ ID NO:1 또는 전체적인 SEQ ID NO: 3이 아니라, SEQ ID NO: 1 또는 3에 제시된 서열의 20개 이상의 연속 잔기로 이루어진 서열;

   (b) SEQ ID NO: 1 또는 이것의 20개 이상의 연속 잔기 및 이종성 융합 파트너를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 서열; 및

   (c) 상기 a) 및 b)의 서열의 축중된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
2. (a) 제 1항의 폴리뉴클레오타이드로 인코딩된 서열;

   (b) 제 1항의 폴리뉴클레오타이드로 인코딩된 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및

   (c) 제 1항의 폴리뉴클레오타이드로 인코딩된 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
3. 발현 대조 서열에 조작가능하게 결합된 제 1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
4. 제 3항에 따른 발현 벡터로 형질전환되거나(transformed)트랜스펙팅된(transfected) 숙주 세포.
5. SEQ ID NO: 2 또는 4, 또는 이것의 단편, 또는 이것의 변이체로 된 하나 이상의 폴리펩타이드; 및 이종성 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질.
6. 종양 단백질에 대해 특이적인 T 세포를 자극하고/하거나 확장시키기 위한 방법으로서,

   (a) 제 2항에 따른 폴리펩타이드;

   (b) SEQ ID NO: 2 또는 4의 폴리펩타이드;

   (c) 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드;

   (d) 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포; 및

   (e) T 세포를 자극하고/하거나 확장시키는데 충분한 시간 동안 그리고 이러한 조건 하로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 T 세포를 접촉시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항의 방법에 따라 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단.
8. 생리학적으로 허용되는 담체, 면역자극제 및 애쥬반트(adjuvant)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 1 성분; 및

   (a) 제 2항에 따른 폴리펩타이드, (b) SEQ ID NO: 2 또는 4의 폴리펩타이드,(c) 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드, (d) SEQ ID NO: 1 또는 3의 폴리뉴클레오타이드, (e) SEQ ID NO: 1의 단백질과 반응할 수 있는 항체, (f) 제 5항에 따른 융합 단백질, (g) 제 7항에 따른 T 세포 집단, (h) 제 2항에 따른 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포; 및 (i) SEQ ID NO: 2 또는 4의 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포로부터 이루어진 군으로부터 선택된 제 2 성분을 포함하는 조성물.
9. 제 8항의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게 면역 반응을 자극하기 위한 방법.
10. 제 9항의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게서 발병된 암을 치료하기 위한 방법.
11. 환자에게서 발병된 암의 진행을 억제하기 위한 방법으로서,

    (a) T 세포가 증식되도록, (i) 제 2항에 따른 폴리펩타이드, (ii) 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 (iii) 제 2항의 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분과 함께, 환자로부터 분리된 CD4⁺및/또는 CD8⁺T 세포를 인큐베이팅시키는 단계; 및

    (b) 유효량의 증식된 T 세포를 환자에게 투여하여, 환자에게서 발병된 암의진행을 억제시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
12. 의약에 사용하기 위한 제 8항에 따른 조성물.
13. 크립토 항원을 발현시키는 종양을 치료하는데 사용하기 위한 제 8항에 따른 조성물.
14. 크립토 항원을 발현시키는 종양을 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의,

    (a) 제 2항에 따른 폴리펩타이드;

    (b) SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드;

    (c) 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드;

    (d) SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오타이드;

    (e) SEQ ID NO: 1의 단백질과 반응할 수 있는 항체;

    (f) 제 5항에 따른 융합 단백질;

    (g) 제 7항에 따른 T 세포 집단;

    (h) 제 2항에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포; 및

    (i) SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 발현시키는 항원 제공 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 성분의 용도.