KR20030035912A

KR20030035912A - 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20030035912A
Application number: KR1020020063407A
Authority: KR
Inventors: 김민영; 박병영; 문창희; 박은규; 김경미
Original assignee: 주식회사 안지오랩; 김민영
Priority date: 2001-10-26
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2003-05-09
Also published as: KR100533777B1

Abstract

본 발명은 혈관신생 억제활성을 갖는 칠엽수(horse chestnut) 추출물을 유효성분으로 하는 조성물 및 이를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 사람의 제대혈관내피세포(HUVEC)를 이용한 모세혈관과 같은 관구조 형성 억제실험, 마우스 마트리젤 모델을 이용한 생체내 실험을 통하여 칠엽수 추출물이 혈관신생억제 효능을 가지고 있음을 확인하였으며, 또한 칠엽수 추출물은 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matix metalloproteinase; MMP)계 효소에 대한 억제 활성을 확인한 바, 본 발명의 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 조성물은 종양억제, 전이억제, 혈관신생에 의한 안과질환, 건선, 관절염 등 혈관신생에 의한 각종 질환의 치료 및 과다한 MMP활성과 관련된 질환의 치료에 사용할 수 있다.

Description

칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생 억제용 조성물{COMPOSITION FOR INHIBITING ANGIOGENESIS CONTAINING AN EXTRACT OF HORSE CHESTNUT}

본 발명은 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생 억제 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 칠엽수(horse chestnut) 추출물이 혈관신생을 억제하는 효능이 있음을 밝혀 이와 관련된 질환의 예방 및 치료제로 이용할 수 있는 칠엽수 추출물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아의 발생(embryonic development)시, 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다(Folkman and Cotran;Int. Rev. Exp. Pathol., 16, pp207 - 248, 1976).

새로운 혈관이 생기는 것은 엄밀한 의미에서 맥관형성(vasculogenesis)과 혈관신생으로 나누어진다. 맥관형성은 배발생 초기 장축중배엽에서 분화된 혈도로부터 발생하는 내피세포의 신생으로 정의된다. 단순확산으로는 복잡한 형태를 위해 세포 증식을 빠르게 향상시키는 영양의 요구를 만족시킬 수 없는 시점에서 배아의 맥관 형성이 시작된다. 혈관신생은 기존 혈관으로부터 내피세포에서 나와 자라는 과정으로, 통상적으로 미세혈관의 말단 정맥 및 후모세혈관을 형성하게 된다. 성인의 경우 혈관내피세포는 상대적으로 잘 분열하지 않으며, 내피 분열 속도는 통상 수개월 내지 수년이다. 그러나 성인의 혈관신생은 호르몬 신호반응, 염증세포에서의 전혈관신생(pro-angiogenesis), 시토킨의 방출, 세포 외부기질에 고립된 혈관 신생 매개체를 방출하는 가수분해성 효소의 활성 결과로서, 또는 혈관신생촉진 인자의 자극 등으로 필요에 따라 유발되어진다.

혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다. 그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종,혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염 등이 있으며, 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환이 있으며 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(D'Amato RJ and Adamis AP;Ophthalmol., 102, pp1261-1262, 1995 ; Arbiser JL;J Am Acad Derm,34(3), pp486-497, 1996; O'Brien K.D.et al.; Circulation, 93(4), pp672-682, 1996; Hanahan D and Folkman J;Cell, 86, pp353-364, 1996).

비정상적인 혈관신생으로 인한 질환은 상기 여러 가지 질환의 발병이나 진행과정에 깊이 관련되어 있어 이들 질환의 예방 또는 치료를 위하여 혈관생성을 억제하는 물질을 찾아내려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히 암의 경우에 혈관신생은 두가지 중요한 역할을 하는데, 첫째는 일차 종양과 전이된 이차 종양의 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급하는 것이고, 둘째는 종양까지 침투한 신생 모세혈관들이 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어갈 수 있게 기회를 주어 암세포가 온몸에 전이(metastasis) 되게 하는 것이다.

종양은 혈관신생이 일어나지 않으면 일정 기간동안 휴지 상태로 생존하며, 더 이상은 성장할 수 없게 된다(Folkman and Tyler;Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977). 또한 전이는 암 환자 사망의 주원인은 전이이며, 암세포가 일차 종양괴로부터 분리되어 해부학적으로 먼 곳에 있는 조직이나 장기에 착상하여 성장하는 현상이다 (Sugarbaker, Weingard and Rosoman;Cancer Invasion and Metastasis(L.A. Liotta and I.R. Hart ed.) Boston, Nijhoff, pp427-465, 1982).

현재 임상에서는 암의 치료성적을 향상시키기 위하여 화학요법이나 면역요법들을 이용하고 있는데, 이러한 치료방법이 일부 종양에서 어느 정도 효과를 거두고는 있지만 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

관절에서의 연골 파괴, 각종 안과질환에 의해 야기되는 실명현상, 피부세포 과다증식도 혈관신생이 원인이 되므로 혈관신생을 억제함으로써 관절염, 각종 안과질환, 건선과 같은 질병의 진행과 근본적인 치유가 가능하다 (Kocb AE, Polverini PJ and Lcibovich SJ;Arth. Rheum., 29, pp471-479, 1986; Stupack DG, Storgard CM and Cheresh DA, Braz;J Med Biol Rcs, 32, pp578-581, 1999, Koch AE;Atrhritis Rheum, 41, pp951-962, 1998; Jeffrey MI and Takayuki A;J Clin Invest, 103, pp1231-1236, 1999; Folkman J,J Invest Dermatol, 59, pp40-48, 1972].

혈관신생이 일어나기 위해서는 기저막이 분해되는 과정이 수반되는데, MMP족에 속하는 효소들은 기저막 성분을 분해하는 가장 대표적인 효소들이다. MMP족에 속하는 효소는 현재까지 약 20가지가 알려지고 있다. MMP는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 젤라틴과 같은 거대 생분자들을 분해시킬 수 있는 아연을 함유한 엔도펩티다아제 종류로서 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신 및 막형 MMP로 크게 분류된다. 이들은 모두 전구효소(proenzyme)의 형태로 발현된 후 일부분이 자체적으로 잘려나감으로써 활성화된다(Bond, J. S.,et al.; Int. J. Biochem., 75, pp565-574, 1985; Chen, J. M., Chen, W. T.;Cell,48, pp193~203, 1987).

콜라게나제류는 삼중나선형 간질성 콜라겐과 젤라틴등에 작용하며, 섬유아세포 콜라게나제(MMP-1), 호중구 콜라게나제(MMP-8) 및 콜라게나제-3(MMP-13)의 3종류가 알려져 있다(Goldberg, G. I.,et al.; J. Biol. Chem.,261, pp6600-6605, 1986; Fini, M. E.,et al.;Biochemistry,26, pp6156-6165, 1987; Hasty, K. A.,et al.;J. Biol. Chem.,265, pp11421-11424, 1990; Freije.et al.;J. Biol. Chem.,269, pp16766-16773, 1994).

젤라티나제는 변성 콜라겐과 제 IV, V, VII, X형 콜라겐을 분해하는 효소로, 섬유아세포가 분비하는 72kDa 젤라티나제(젤라티나제 A, MMP-2)와 단핵 식세포가 방출하는 92kDa 젤라티나제(젤라티나제 B; MMP-9)의 두 종류가 있으며, 특히 기저막의 주성분인 제 IV형 콜라겐에 특이하게 작용하는 것으로 알려져 있다(Murphy, G.,et al.;Biochem. J., 258, pp463-472, 1989; Stetler-Stevenson, W. G.,et al.;J. Biol. Chem.,264, pp1353-1356, 1989).

광범위한 단백질 분해 스펙트럼을 갖고 있는 스트로멜리신 종류에는 스트로멜리신-1(MMP-3), 스트로멜리신-2(MMP-10), 스트로멜리신-3(MMP-11) 및 매트릴라이신(MMP-7)이 있으며, 이외에도 메탈로엘라스타제(MMP-12)와 막형 MMP에 속하는 MT1-MMP (MMP-14), MT2-MMP(MMP-15), MT3-MMP(MMP-16) 등이 알려져 있다.

MMP는 혈관신생에 관여할 뿐만 아니라 동맥경화증, 알츠하이머 질환, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성과 같은 여러 가지 질환에서 과다하게 발현되는 것으로 알려져 있다 (Wossener Jr.;Annals NY Acad. Sci., 732, pp11-21, 1994; Warner et al.;Am. J. Pathol., 158, pp2139-44, 2001; Stetler-Stevenson;Surg. Oncol. Clin. N. Am.,10, pp383-92, 2001).

따라서, MMP 효소의 활성 저해제는 혈관신생억제제로 작용함과 다양한 MMP 매개 질환에 사용할 수 있으므로, 새로운 약제의 개발이 기대되고 있다.

최근에 혈관신생을 억제시켜서 현재까지 치료제가 없는 혈관신생관련 질환들을 치료하려는 노력이 경주되고 있으나, 현재까지 사용되는 약제는 없는 실정이다. 혈관신생 억제제는 보통 환자에게 장기적으로 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이어야 가장 이상적인 치료제로 사용할 수 있다. 따라서 혈관신생 억제제로서 독성이 미비한 약제의 개발이 요구되어지고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하고자 화학물질보다 상대적으로 독성이 적은 식물 추출물을 대상으로 혈관신생억제효과를 검색한 결과, 본 발명자들은 칠엽수 추출물이 혈관신생 억제 효과가 탁월함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

칠엽수(Horse chestnut)는 칠엽수과(Hippocastanaceae)에 속하며, 본 발명의 칠엽수 추출물은 그 잎 또는 종자(사라자)로부터 얻어진다.

칠엽수는 일본산 칠엽수(Aesculus turbintaBLUME), 중국산 칠엽수(Aesculus chinensisBge 및Aesculus wilculusRehd) 및 유럽산 칠엽수(AesculushippocastanumL.) 등이 있는데, 본 발명은 이러한 칠엽수들의 잎 또는 종자의 추출물들을 포함한다.

일본산 칠엽수는 일본 및 한국 경기도 이남지역에 자생하는 낙엽교목으로서, 그 종자를 사라자(裟羅子)라 하여 위통증 및 말라리아, 이질 등의 치료에 사용되어 왔으며, 그 성분으로는 사포닌, 올레인산과 같은 지방유, 전분 등이 알려져 있다(신민교, 정보섭저, 도해향약 대사전, 1998년 발행, 영림사 pp384-385 참조).

유럽산 칠엽수는 유럽동부 북온대 지방이 원산지이나 우리나라 중남부에서도 자생하며 그 잎에는 트리테르펜(triterpene) 사포닌들과 주성분으로서 히드록시 쿠마린 계통의 에스큘린(Esculin: Esculetin 6-glucoside)이 있으며, 그 외에도 프락신(fraxin)과 스코폴린(scopolin)이 있으며 루틴(rutin), 퀘르시트린(quercitrin) 및 이소퀘르시트린(isoquercitrin)이 함유되어 있다. 칠엽수 종자에 있는 유효성분으로는 트리테르펜 사포닌으로 디아실화 테트라- 및 펜타히드록시-베타-아미린 화합물인 아에신(aescin) 혹은 에신(escin)이 3 - 5% 함유되어 있다. 특히 종자는 제약의 원료로서 타박상이나 염증에 아주 잘 듣는 약으로서 널리 사용되고 있는데 그 성분은 소염성 사포닌인 아에신에 의한 것으로 알려지고 있다. 그 외에도 퀘르세틴(Quercetin)의 비오시드(biosides) 및 트리오시드(triosides) 계열 플라보노이드, 프로안토시아니딘(proanthocyanidines) 및 농축 탄닌 등이 함유되어 있으며 전분 성분이 50% 정도 차지하고 있다.(Hubner G.,et al.; 44th Ann. Congress of GA., 139, 1966)

일본에서는 이 종자를 물로 처리하거나 또는 잿물로 처리하면 탄닌 성분이다 제거되기 때문에 탄닌을 제거한 후 남아 있는 녹말로 칠엽수떡을 만들어 식용한다고도 한다.

보통 칠엽수 건조추출물은 칠엽수 종자로부터 제조되며 트리테르펜 글리코시드(triterpene glycosides), 즉 무수 아에신이 16-20% 함유되어 있는 것을 표준품으로 사용한다. 칠엽수 종자 또는 칠엽수엽으로부터 제조된 칠엽수 건조추출물은 현재 수술 후 및 외상 후의 종창 예방 및 치료, 치핵증상의 완화에 사용되고 있는 의약품이다.

본 발명은 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 칠엽수 추출물로부터 분리된 화합물들을 유효성분으로 한 독성이 적고 경구투여 가능한 혈관신생 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1 은 칠엽수 추출물의 인체 제대혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell; HUVEC)의 관형성에 미치는 영향을 관찰하기 위한 대조군 혈관내피세포 촬영사진이고,

도 2 는 칠엽수 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후, 마트리젤상에서 배양한 혈관내피세포의 관형성을 촬영한 사진이고,

도 3 은 칠엽수 추출물을 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 마트리젤상에서 배양한 혈관내피세포의 관형성을 촬영한 사진이고,

도 4 는 칠엽수 (일본산) 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후, 마트리젤상에서 배양한 혈관내피세포의 관형성을 촬영한 사진이고,

도 5 는 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 DMSO만을 처리한 대조군의 촬영사진이고,

도 6 은 칠엽수 추출물에 함유된 유효성분인 에스큘린 50 μM을 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 처리한 후 관찰한 사진이고,

도 7 은 칠엽수 추출물에 함유된 유효성분인 에스큘레틴 50 μM을 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 처리한 후 관찰한 사진이고,

도 8 은 칠엽수 추출물에 함유된 유효성분인 퀘르시트린 50 μM을 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 처리한 후 관찰한 사진이고,

도 9 는 칠엽수 추출물에 함유된 유효성분인 아에신 50 μM을 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 처리한 후 관찰한 사진이고,

도 10 은 칠엽수 추출물이 마우스 마트리젤 모델에서 혈관신생을 억제시키는 효과를 도시한 것이고,

도 11 은 칠엽수 추출물이 MMP-2 효소활성을 억제함을 보여주는 그래프이고,

도 12 는 칠엽수 추출물이 MMP-13 효소활성을 억제함을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 칠엽수(Horse chestnut) 추출물의 새로운 용도인 혈관신생억제제로서의 용도에 관한 것으로, 혈관신생 억제활성이 있는 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생 억제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 혈관신생 억제활성이 있는 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 MMP 활성 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 MMP 억제활성을 갖는 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 과다한 MMP 활성으로 기인된 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 칠엽수 추출물은 여러 가지 방법으로 추출하거나 또는 구입하여 사용할 수 있다. 칠엽수 추출물은 생약제제 또는 식물의 잎이나 종자에서 유효성분을 추출하는 통상적인 방법, 예를 들어 통상적인 열수추출에 따라 제조할 수 있다. 이 추출액을 농축하거나 건조시켜 칠엽수 추출물을 수득한다. 또한 이미 시판되고 있는 칠엽수 건조엑스를 사용하는 것도 바람직하다.

본 발명의 칠엽수 추출물은 현재 소염제로 판매중인 유럽산 칠엽수 추출물을 이용할 수도 있으며, 일본산 및 중국산 칠엽수의 추출물을 사용할 수도 있다.

상기 칠엽수 추출물들의 혈관신생 억제 효과를 실험하기 위해서는 예를 들어, 상온 또는 일광 건조된 칠엽수의 잎은 세절하고, 종자는 30~40℃에서 급속히 건조시키거나 또는 건조하지 않은 것을 사용하며 쇠절구 또는 파쇄기로 분쇄하고, 세절 또는 분쇄된 칠엽수의 잎 또는 종자 분말 무게(g)의 약 3배 내지 약 10배, 바람직하게는 약 5배 내지 7배의 부탄올, 에탄올, 메탄올과 같은 저급알코올 용매, 증류수 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 물과 메탄올 혼합물, 더욱 더 바람직하게는 80% 메탄올을 넣어 약 30 내지 100℃, 바람직하게는 약 50 내지 80℃의 온도에서 초음파 추출법, 환류추출법 또는 통상적인 추출방법으로 1시간 내지 48시간,바람직하게는 3시간 내지 10시간 동안 추출하여 조추출물을 얻어 혈관신생억제 실험에 사용한다.

본 발명의 칠엽수 추출물은 현재 시판되고 있는 칠엽수 종자 건조 엑스를 사용할 수도 있다.

본 발명은 칠엽수 추출물로부터 분리된 혈관신생 억제활성을 갖는 아에신, 에스큘레틴, 에스큘린 또는 퀘르시트린 등의 화합물을 유효성분으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 칠엽수(horse chestnut) 추출물을 유효성분으로 하는 MMP 활성 억제용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 과다한 MMP 활성으로 기인된 혈관신생에 의한 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 혈관신생에 의한 질환의 치료, 예를 들면 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 동맥경화증, 재협착증, MMP-매개 골감소증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화, 각막궤양, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤과 전이 등의 치료에 사용할 수 있다

본 발명에서는 칠엽수 추출물의 혈관신생 억제효과를 보기 위하여 혈관내피세포를 이용한 관형성 실험(Tube formation assay)과 마우스 마트리젤 어세이(Mouse matrigel assay)를 통하여 확인하였다.

본 발명의 칠엽수 추출물 또는 그 유효성분을 포함하는 조성물은 단일제로 사용하거나 약효를 증강시킬 수 있는 다른 유효성분과 함께 복합제로 사용할 수 있다.

이때 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하여 사용할 수 있으며, 희석제로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 말토덱스트린, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 복합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 칠엽수 추출물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 약학 조성물로 투여될 수 있다.

특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량 정도는 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물(예, 화학요법제)을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 칠엽수 추출물의 단위 투여량은 5㎎ 내지 2g이 바람직하며, 10㎎ 내지 1g이 가장 바람직하다.

또한 환자의 나이와 체중뿐 아니라 혈관신생에 의한 질환의 종류 및 질환의 정도에 따라 용량 및 투여방법이 달라지기는 하나 일반적으로 0.05 내지 200㎎/㎏체중으로 투여할 수 있으며 1일 1~3회 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학조성물은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 본 발명의 약학조성물의 비경구 투여는 바람직한 순도하에 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 사용되는 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 약학조성물의 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용할 수 있다. 상기 제형은 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제할 수 있고, 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 등 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.

상기 조성물은 칠엽수 추출물을 캅셀에 부형제 없이 충전하거나 미립된 고체 담체 또는 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조한다. 그 다음, 필요한 경우 생성물을 바람직한 제제로 성형한다.

이러한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 칠엽수 조추출물의 제조

대림원예종묘에서 구입한 일본산 칠엽수의 잎은 상온에서 건조시키고, 종자는 분쇄기로 분쇄하였다. 분쇄된 잎 및 종자를 상온에서 건조시킨 후, 칠엽수잎 500 g 및 칠엽수 종자 200g을 각각 80% 메탄올 2 L로 12시간 동안 50℃에서 초음파 추출하여 추출액을 여과한 후, 여과액을 농축하여 칠엽수잎의 조추출물 120g 및 칠엽수 종자 조추출물 53g을 얻었다.

실시예 2 : 칠엽수의 성분 확인

상기 실시예 1에서 얻은 조추출물을 증류수에 현탁시킨 다음, 에틸 아세테이트 1 L로 추출하였다. 이 에틸아세테이트 추출액을 진공건조기로 증발 건조시킨 후, 에탄올 50㎖에 녹여 2차원 페이퍼 크로마토그래피법(전개용매: BuOH:HAc:H₂O=4:1:5 와 2% 에틸아세테이트)을 수행하였다.

상기로부터 아에신, 퀘르시트린, 에스큘레틴 및 에스큘린이 주성분으로 검출됨을 TLC 및¹H-NMR과 같은 각종 분석기기로 분석하여 확인할 수 있었다.

실험예 1 : 칠엽수 추출물의 사람 제대혈관내피세포의 관형성에 미치는 영향

관형성 실험을 시행하기 위하여 우선 제대혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell : HUVEC)를 얻는 실험을 시행하였다. (Grant D.S.,et al.;Cell, 58, pp933-943, 1989) 즉, 제왕절개수술로 얻은 신선한 사람의 탯줄에서 정맥의 내피세포를 분리한 후 혈관내피세포를 배양하고 배양한 세포는 Ⅷ 인자의 항체를 이용한 세포면역학적 염색으로 혈관내피세포임을 확인하였다. 상기에서 확인된 혈관내피세포를 젤화된 마트리젤(Matrigel, BD Biosciences, Bedford, 미국)상에서 37 ℃의 온도하에서 16시간 배양하였다.

상기 방법으로 배양한 혈관내피세포를 대조군으로 하고, 칠엽수 추출물은 시판 칠엽수 종자 건조엑스(화일(Hwail) 제약, 한국)를 100 ㎍/㎖ 또는 10㎍/㎖ 농도로 마트리젤상의 혈관내피세포에 처리하였으며, 또한 칠엽수 추출물의 유효성분인 에스큘린(시그마사 E-8250, 미국), 에스큘레틴(시그마사 E-2631, 미국), 퀘르시트린(시그마사 Q-3001, 미국), 아에신(시그마사 E-1378, 미국)을 각각 50 μM 농도로 처리하고, 대조군으로는 DMSO 또는 물만을 처리한 혈관내피세포와 비교하였다.

실험 결과는 도 1 내지 도 9에 나타내었다.

도 1은 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포가 망상의 관구조를 형성한 것을 관찰한 것으로 혈관형성의 한 과정이라고 생각되는 망상의 관구조가 생성되고 있음을 알 수 있다. 도 2 및 도 4는 각각 유럽산 및 일본산 칠엽수 추출물을 처리하여 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포를 관찰한 것이다. 유럽산 칠엽수 추출액을 100㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 혈관내피세포가 전혀 튜브를 생성하지 못하는것을 도 2에서 볼 수 있었으며, 도 3에서는 추출물 10㎍/㎖에 의하여 망상의 관구조 연결이 끊어지는 것을 볼 수 있었다. 도 4는 일본산 칠엽수 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, 혈관내피세포가 관형성을 하지 못함을 나타낸다.

칠엽수 추출물의 주요 구성 성분이 혈관신생 억제 활성이 있는지 알아보기 위하여 다음의 실험을 실시하였다. 도 5는 각 성분의 용매로 사용한 DMSO의 효과를 배제하기 위하여, 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 DMSO만을 처리하였을 때 생성된 관구조이고, 도 6 내지 도 9는 칠엽수 추출물에 함유된 유효성분을 각각 50 μM 처리하였을 때 혈관내피세포의 관형성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다. 아에신을 처리하였을 경우, 혈관내피세포가 전혀 튜브를 생성하지 못하였으며(도 9), 에스큘레틴을 처리하였을 경우, 83% 관형성을 억제하였으며(도 7), 퀘르시트린은 64% 억제하여 마트리젤 상에서 배양한 혈관내피세포에 의한 망상의 관구조 연결이 끊어지는 것을 볼 수 있었다(도 8). 그에 비해 에스큘레틴에 당이 붙어 있는 에스큘린은 같은 농도로 처리하였을 때는 15% 정도 관형성을 억제하였다(도 6).

마트리젤상에서 형성된 튜브의 면적을 이미지 프로 플러스(Image-Pro Plus, Media Cybernetics사)로 분석하였을 경우 하기 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 칠엽수 추출물 및 그의 유효성분을 각각 처리한 실험군이 처리하지 않은 대조군에 비하여 관 형성이 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

시료 및 농도	관형성 면적	저해율 (%)
대조군 (물처리)	10.55	0
유럽산 칠엽수(100㎍/㎖)	0	100
유럽산 칠엽수(10㎍/㎖)	8.89	16
일본산 칠엽수(100㎍/㎖)	0	100

시료 및 농도	관형성 면적(%)	저해율 (%)
대조군 (DMSO 처리)	100	0
에스큘린	85	100
에스큘레틴	17	16
퀘르시트린	36	100
아에신	0	100

실험예 2 : 혈관신생을 측정하는 동물실험(마우스 마트리젤 모델)

생후 6 내지 8주령의 C57BL/6 마우스(대한실험동물센터, 한국)에 마트리젤 0.4㎖와 혈관신생 유도인자인 염기성 FGF(Fibroblast Growth Factor) 50ng/㎖ 및 헤파린 50 unit/㎖을 혼합하여 피하 주사하고 실시예 1에서 얻은 칠엽수 메탄올 추출물 및 시판중인 유럽산 칠엽수 추출물(화일제약, 한국)을 마우스 마리당 일회 1mg씩 일일 2회 4일 동안 경구투여하였으며 대조군은 같은 양의 물을 경구투여하였다. 경구투여를 시작한 지 5일째 되는 날 주사 부위의 피부를 절개하여 마트리젤을 회수하여 헤모글로빈의 양을 드랩킨 시약(Drabkin's reagent, 시그마사 제품번호 525-2, 미국)을 이용하여 측정한 결과, 도 10과 하기 표 3에서 보는 바와 같이 칠엽수 추출물을 경구투여한 실험군은 물만 투여한 대조군에 비해 마트리젤에 함유된 헤모글로빈 양이 9.8% 밖에 되지 않으므로 칠엽수 추출물에 의해 혈관신생이 90%억제됨을 알 수 있었다.

	헤모글로빈 함량(g/㎗)
대조군	635 ±50
칠엽수 추출물 투여군	62 ±43

실험예 3: 형광기질을 사용한 MMP 활성 억제 측정 실험

칠엽수 추출물이 MMP를 억제하는 작용이 있는가를 알아보기 위하여 분광형광계(Spectrofluorometer, Perkin-Elmer LS50B)를 이용하여 MMP 효소 활성 억제를 측정하였다. MMP계열의 효소중 콜라게나아제로는 MMP-13, 젤라티나제로는 MMP-2를 사용하였다.

MMP 효소는 바쿨로바이러스 시스템(Baculovirus system)을 이용하여 곤충세포(Sf21 곤충세포)에서 유전공학적으로 제조하였다. MMP-2 cDNA(GENEBANK No. XM_048244)를 포함하는 재조합 바이러스를 박-N-블루 선형 트랜스펙션 키트(Bac-N-Blue linear transfection kit; Invitrogen사, 제품번호 K855-01, 네덜란드)를 이용하여 제조하였으며 숙주세포로는 Sf21 곤충세포(Invitrogen사, 제품번호 B821-01, 네덜란드)를 사용하였다. 감염된 Sf21 세포를 27℃에서 72시간동안 키우고 배지를 수거하여 배지로부터 MMP를 정제하였다. MMP-2는 젤라틴-세파로즈 친화성 컬럼(gelatin-sepharose affinity column: SIGMA, 제품번호: G-5384)을 이용하였으며 5% DMSO를 사용하여 용출하였다.

MMP-13 (GENEBANK No. NM_002427)도 같은 방법으로 생산하여 SP-세파로스 (Amersham Pharmacia biotech, 제품번호: 17-0729-01)를 이용하여 정제하였으며 용출완충액으로는 20mM 트리스-Cl, pH7.0, 5mM 염화칼슘, 2M 염화나트륨을 이용하였다. 제조한 MMP 효소들은 활성측정에 사용하기 전 1mM APMA (p-아미노페닐 머큐릭 아세테이트)로 활성화시킨 후에 사용하였다.

MMP-2의 기질로는 2,4-디니트로페닐-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH (서열번호 1, Calbiochem사 제품)를 사용하였으며, MMP-13의 기질로는 MCA-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-Dpa-NH₂(서열번호 2, Calbiochem사 제품)를 이용하였다. [MCA=메틸 쿠마릴 아미드; Cha=L-시클로헥실알라닌; Dpa=3-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로판 산; Nva=L-노르발린]

2㎖의 큐벳에 기질 10 μM을 포함하는 완충용액(50 mM Tricine(pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 200 mM NaCl) 2㎖를 넣고 MMP 효소 10 nM 를 넣은 후, 분광형광계를 이용하여 실온에서 5-10분 동안 형광도 변화를 측정하였다.

기질을 포함하는 완충용액에 구입한 유럽산 칠엽수 추출물의 최종농도가 25 ㎍/㎖가 되도록 하고 MMP를 넣은 후, 분광형광계를 이용하여 시간 변화에 따른 형광도를 측정하였고 저해제를 포함하지 않은 효소 단독에 의한 형광강도를 시간에 따라 같은 방법으로 측정하여 대조군으로 하였다.

도 11 및 12에서 보는 바와 같이, 칠엽수 추출물을 처리하였을 때, 각각 MMP-2의 활성은 77%, MMP-13 활성은 85% 억제됨을 확인하였다.

하기에 상기 혈관신생 억제용 약학조성물의 제제예를 설명하나 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의 칠엽수 추출물을 유효성분 2% (건조중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

칠엽수 추출물 건조 분말, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖이 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

칠엽수 추출물 건조 분말 ··············· 2 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ······················· 4.0 g

소르브산 ······················ 0.4 g

증류수 ······················· 정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

칠엽수 추출물 건조 분말 25 g을 락토오스 17.5 g, 감자전분 18 g 및 콜로이드성 규산 3.2 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 16 g, 활석 5 g 및 스테아린산 마그네슘 0.5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

칠엽수 추출물 건조분말··············· 25 g

락토오스 ··················· 17.5 g

감자전분 ···················· 18 g

콜로이드성 규산 ················ 3.2 g

10% 젤라틴 용액 ················ 10 ㎖

감자전분 ···················· 16 g

활석 ······················ 5 g

스테아르산 마그네슘 ··············· 0.5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

칠엽수 추출물 건조분말 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

칠엽수 추출물 건조분말··············1 g

염화나트륨··················· 0.6 g

아스코르브산·················· 0.1 g

증류수····················· 정량

상기에 서술한 바와 같이, 본 발명의 칠엽수 추출물 및/또는 아에신, 에스큘레틴, 에스큘린, 퀘르시트린은 혈관신생 억제효과가 우수하여 종양억제제, 전이억제제, 혈관신생에 의한 안과질환, 건선 등과 같은 혈관신생과 관련된 각종 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

칠엽수(Horse chestnut) 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생억제용 조성물.
혈관신생 억제활성을 갖는 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 칠엽수가 일본산 칠엽수, 중국산 칠엽수 또는 유럽산 칠엽수인 조성물.
혈관신생 억제활성을 갖는 아에신을 유효성분으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
혈관신생 억제활성을 갖는 에스큘레틴 또는 에스큘린을 유효성분으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
혈관신생 억제활성을 갖는 억제퀘르시트린을 유효성분으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
칠엽수(horse chestnut) 추출물을 유효성분으로 하는 MMP 활성 억제용 조성물.
MMP 억제활성을 갖는 칠엽수 추출물을 유효성분으로 하는 과다한 MMP 활성으로 기인된 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 2항, 4항, 5항, 6항, 8항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 동맥경화증, 재협착증, MMP-매개 골감소증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화, 각막궤양, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤과 전이로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 약학조성물.
제 2항, 4항, 5항, 6항, 8항 중 어느 한 항에 있어서,

제형이 경구용 제제, 주사제 또는 도포제 형태인 약학 조성물.