KR20030032948A - 독성 유전자, 단백질, 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)로부터의 일련의 유전자는 독성에 관련된 생성물을 코드화하는 것으로 나타난다. 그러므로, 이들 유전자의 동정은 감독된 미생물이 생산되는 것을 가능하게 한다. 더구나, 상기 유전자 또는 그들의 코드화된 생성물은 치료상의 응용을 위한 백신의 제조에 사용될 수 있다.
Description
나이제리아 메닌지티디스는 패혈증성 쇼크 및 세균성 수막염에 관련된 그램 (Gram) 음성적인 세균성 병원균이다. 이 세균은 선진국에서는 세균성 수막염의 주된 원인이고, 아프리카 및 중국에서 대규모의 유행병의 발생 원인이다. 영국에서는,나이제리아 메닌지티디스는 교통 사고를 제외한, 어린이 사망의 주된 원인이다. 상기 세균은 자연적으로 사람의 비인강(卑咽腔)에 서식하면서 혈관에 접근하게 되어 심한 패혈증 또는 수막염을 야기한다. 현재의 항-미생물학이 신체로부터 세균을 제거하는 데에 효과적일지라도, 수막구균성 패혈증으로부터의 사망률은 아직 상당하다.나이제리아 메닌지티디스에 의하여 야기되는 징후를 치료하거나 예방하기 위한 수단을, 예를 들어, 면역화에 의하여 제공하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 독성 유전자, 단백질, 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)로부터 얻어진 유전자 및 단백질/펩티드에 관한 것이고, 치료 및 약 선별에서의 그들의 용도에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은나이제리아 메닌지티디스에서의 독성 유전자의 발견을 기반으로 하고 있다.
본 발명의 첫 번째 관점에 있어서, 본 발명의 펩티드는 치료상의 또는 진단상의 사용을 위해, 청구항 제 1항에서 동정된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 그램(Gram)-음성적인 세균 내의 이들의 동족체를 포함하는 오페론, 또는 그의 기능적인 분절에 의해 코드화된다.
상기 펩티드는 예방적 적용을 위한 백신의 사용을 포함하는,나이제리아감염의 치료를 위한 많은 치료학적인 사용을 포함할 수 있다.
두 번째 관점에 있어서, 상기에 정의된 펩티드를 코드화하는 다중뉴클레오티드 또한 치료 또는 진단에서 유용할 수 있다.
세 번째 관점에 있어서, 펩티드를 코드화하는 유전자는 감독(減毒)된 미생물의 제조에 사용할 수 있다. 감독된 미생물은 독성이 결핍된 균류를 제공하기 위해, 여기서 동정된 유전자의 하나 이상의 발현을 파괴하는 돌연변이를 갖는 것이 일반적이다. 이들 미생물은 또한 치료 및 진단에서 사용될 수 있을 것이다.
네 번째 관점에 있어서, 본 발명에 의한 펩티드, 유전자 및 감독된 미생물은나이제리아또는 그램-음성 세균에 의한 감염과 연계된 상태의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 독성에 관계된 펩티드를 코드화하는 유전자의 발견에 기반을 두고있다. 그러므로 본 발명의 펩티드 및 유전자는 감염을 치료하는 치료상의 제제를 제조하기에 유용하다. 치료에 대한 참조로 또한 예를 들어 백신화같은, 예방 치료를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 더구나, 본 발명의 생성물이 사람 환자의 감염 치료를 우선으로 하고 있더라도, 수의학적인 응용도 또한 본 발명의 범주 안에서 고려된다.
본 발명은나이제리아 메닌지티디스에 관하여 기재하였다. 하지만, 모든나이제리아균주, 및 많은 다른 그램-음성 세균 균주는 여기서 동정된 것과 아미노산 서열의 동일성 또는 유사성을 가지는 단백질 또는 관련된 펩티드를 포함하는 것 같다. 상기 펩티드를 함유할 수 있는 미생물은살모넬라(Salmonella),엔테로박테르(Enterobacter),클렙시엘라(Klebsiella), 쉬겔라(Shigella)및예르슬니라(Yerslnia)를 포함하지만, 이것에 한정되지는 않는다.
나이제리아 메닌지티디스균주 B를 사용한 본 발명의 독성 유전자를 동정하기 위해 본 실험을 실행하였다. 균주 A의 데이타베이스에서 상동성을 조사하였지만, 균주 B로부터의 단백질 및 유전자가 바람직하다.
바람직하기는, 본 발명의 다양한 관점에서 사용될 수 있는 펩티드는 여기서 동정된 펩티드와 40%이상의 유사성을 가진다. 더욱 바람직하기는, 상기 펩티드는 60%이상의 유사성을 가진다. 가장 바람직하기는 상기 펩티드는 80%이상의, 예를 들어, 95%의 유사성을 가진다. 여기서 동정된 다중뉴클레오티드 서열에 관해서는, 본 발명의 다양한 관점에서 사용될 수 있는 관련 다중뉴클레오티드는 여기서 동정된 서열과 40%이상의 동일성을 가질 수 있다. 더욱 바람직하기는, 다중뉴클레오티드서열은 60%이상의 서열 동일성을 가진다. 가장 바람직하기는, 다중 뉴클레오티드 서열은 80% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 95%의 동일성을 가진다.
"유사성" 및 "동일성"이라는 용어는 당기술 분야에 알려져 있다. "동일성"이라는 용어의 사용은 비교되는 서열에서 상보적으로 동일한 위치 사이에 동일한 짝을 기반으로 하는 서열 대조를 나타낸다. "유사성"이라는 용어는 아미노산 서열 사이의 유사성을 나타내고, 상응하는 위치에서 동일한 아미노산뿐만 아니라 상응하는 위치에서의 기능적으로 유사한 아미노산을 고려하는 것이다. 그러므로 다중펩티드 서열 사이의 유사성은 서열 유사성에 더하여, 기능의 유사성을 나타낸다.
유전자 서열 사이의 동일성 수준과 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 유사성의 수준은 알려진 방법을 사용하여 계산할 수 있다. 본 발명에 관련하여, 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터를 기반으로 한 방법은 BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Atschulet al., J. Molec. Biol., 1990;215:403-410), NCBI로부터 사용 가능한 BLASTX 프로그램, 및 Genetics Computer Group, Madison WI사로부터의 Gap 프로그램을 포함한다. 여기서 제공한 유사성 및 동일성의 수준은 아미노산 서열 유사성을 결정하기 위한 12의 갭 페널티(Gap penalty) 및 4의 갭 페널티, 그리고 다중뉴클레오티드 서열 비교를 위한 50의 갭 페널티 및 3의 갭 페널티를 가지고, Gap 프로그램을 사용하여 얻었다.
본 발명에 의한 특징적인 유전자를 가진다면, 다른 미생물내 관련된 유전자 또는 펩티드를 조사하기 위해 유전자 서열을 사용하는 것은 가능하다. 이것은 예를 들어 EMBL 또는 GenBank와 같은, 현존하는 데이타베이스에서 조사하는 것으로 실행할 수 있다.
본 발명에 의한 펩티드 또는 단백질은 당기술 분야에 알려진 방법으로 단리하고 정제할 수 있다. 특히, 동정된 유전자 서열을 가진다면, 유전자를 적합한 숙주에 발현시키는 재조합 기술을 사용하는 것이 가능할 것이다. 활성 분절 및 관련된 분자를 동정할 수 있고 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드 또는 그들의 활성 분절을 면역 반응을 유도하기 위해, 백신에서 항원 결정자로 사용할 수 있다. 또한, 수동면역, 또는 진단의 응용을 위한, 항체의 제조에 그들을 사용할 수 있다. 적합한 항체는 단일사슬 Fv 분절을 포함하는, 단일클론성 항체, 또는 이의 분절을 포함한다. 항체의 제조를 위한 방법은 당업자들에게는 명확할 것이다.
펩티드의 활성 분절은 펩티드의 생물학적 기능을 유지하는 것이다. 예를 들어, 면역 반응을 일으키기 위해 사용될 때, 분절은 충분한 크기를 가져서, 분절로부터 생성된 항체가 박테리아 미생물에서의 펩티드 및 다른 펩티드를 식별할 것이다. 전형적으로, 상기 분절은 크기가 30개의 뉴클레오티드(10개의 아미노산)이상일 것이고, 바람직하기는 60개의 뉴클레오티드(20개의 아미노산)이상, 그리고 가장 바람직하기는 크기가 90개의 뉴클레오티드 (30개의 아미노산)보다 클 것이다.
다른 미생물로부터 관련된 분자에 더하여, 본 발명은 여기서 동정된, 생물학적 기능이 현저하게 변경되지 않은 펩티드 및 다중뉴클레오티드에 이루어지는 변형을 포함한다. 당업자들에게는, 유전자 코드의 퇴화가 여기서 열거된 그들로부터 소수염기 변화를 가지는 다중뉴클레오티드를 나타내지만, 그럼에도 불구하고 같은 펩티드를 코드화한다는 것은 명백한 것이다. 상보적인 다중뉴클레오티드 또한 본 발명에 속한다. 아미노산 수준에서의 전통적인 대체도 또한 고려된다, 즉 다른 산성 또는 염기성 아미노산을 기능의 실질적인 손실없이 치환할 수 있다.
감독된 미생물을 기반으로 하는 백신의 제조는 당업자들에게는 알려져 있다. 백신 조성물은 적합한 운반체 또는 부형제, 예를 들어, 감염에 대하여 효과적인 면역을 제공하기에 필요하거나 또는 원하여지는, 명반과 같은 것으로 제제화 할 수 있다. 백신 제제의 조제는 당업자들에게는 명백할 것이다. 여기서 동정된 유전자 중 어느 하나의 발현을 파괴하는 돌연변이로 감독된 미생물을 제조할 수 있다. 당업자들은 특정 유전자의 발현을 파괴하기 위한 방법을 알고 있을 것이다. 사용될 수 있는 기술은 삽입성 유전자 비활성 또는 유전자 결손 기술을 포함한다. 본 발명에 의하여 감독된 미생물은 예를 들어, 여기서 동정된 두 번째 유전자에서 또는aro돌연변이와 같은 미생물의 성장에 요구되는 분리된 유전자에서, 또는살모넬라에 관하여, W0-A-96/17951에서 동정된 SPI2 영역에 위치한 유전자에서처럼 다른 유전자에서의 첨가적인 돌연변이를 또한 포함할 수 있다.
감독된 미생물은 이종성 항원, 치료단백질 또는 핵산(DNA 또는 RNA)운반을 위한 운반체 시스템으로 사용될 수도 있다. 이 구현예에서, 생체 내 특정 부위로 이종성 항원, 단백질 또는 핵산을 운반하기 위해 상기 감독된 미생물을 사용한다. 감독된 미생물로 이종성 항원, 펩티드 또는 핵산을 도입하는 것은 예를 들어, 이종성 항원 또는 치료상의 단백질을 발현하는 다중뉴클레오티드를 포함하고, 또한 적당한 프로모터(promoter) 서열을 포함하는, 벡터(vector)와 같은 재조합 구조물의 사용을 포함하는, 전통적인 기술로 실행할 수 있다. 대체 가능하게는, 이종성 항원또는 단백질을 코드화하는 유전자를 유기체의 게놈 및 발현을 조절하기 위해 사용한 동종성 프로모터에 결합할 수 있다.
더 일반적으로, 그리고 당업자들에게 잘 알려진 바와 같이, 치료 용도로 적당한 운반체 또는 부형제처럼, 그리고 투여 경로에 맞게 본 발명의 활성 성분의 적당한 양을 선택할 수 있다. 치료되는 이상 상태의 기질/심각성, 환자의 종류 및/또는 건강, 등등과 같은 알려진 기준에 의하여 이러한 인자들이 선택되거나 또는 결정될 수 있다.
별개의 구현예에서, 본 발명의 생성물을 잠재적 항생제의 동정 또는 독성의 탐지를 위한 선별 평가에 사용할 수 있다. 전형적인 선별 평가(routine screeing assay)는 당업자들에게 알려져 있고, 적절한 방법으로 본 발명의 생성물을 사용하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 항균성 활성을 나타내는 표적에 결합하거나 또는 비활성화하는 약효를 가지는, 잠재성 있는 약을 위한 표적으로서 본 발명의 생성물을 사용할 수 있다.
본 발명의 다양한 생성물은 또한 수의학에 응용할 수 있다.
다음은 독성 유전자를 동정하기 위해 사용한 실험 절차의 간단한 개요이다.
패혈증 감염에 핵심적인나이제리아 메닌지티디스의 유전자를 기호-태그드 (signature-tagged) 돌연변이법(STM)(Hensel et al., Science, 1995; 269: 400-403)을 사용하여 동정하였다. STM에서, 각각의 돌연변이는 많은 수의 돌연변이가 동시에 분석될 수 있도록 단일한 서열의 식별자로 태그드된다. 하지만,N.meningitidis를 연구하는 데에 한정하여, 삽입성 돌연변이의 라이브러리(library)를 구성하는 것이 바람직하다. 상기 돌연변이법은나이제리아DNA가 Tn10치환의 정제된 구성성분을 사용하여 인 비트로에서 변형되는 방법을 사용하여 성공적으로 수행하였다.나이제리아 메닌지티디스가 외인성 DNA를 효과적으로 받아들이므로, 그 다음 변형된 대립 형질 유전자는 형질 전환(transformation)에 의하여나이제리아 메닌지티디스로 도입된다. 그런 다음 돌연변이는 전신적인 감염을 야기하는 그들의 능력으로 인하여 선별할 수 있다.
벡터 pSTM115(Sunet al.,Nature Medicine, 2000; 6(11):1269-1273)를 인 비트로 돌연변이법용 트랜스포슨(transposon) 공여체로 사용하였다. 96개의 별도의 형질 전환 반응은, 동일한 기호-태그를 포함한 각각의, 96개의 pSTM115 유도체를 포함한다. 변형된 게놈 DNA는 회복되고, 형질 전환에 의하여 숙주로 복귀된다. Tn10삽입이 다양한 위치에서 발생하는가를 결정하기 위해, 40개의 형질전환체를 서던 블라트 분석(Southern blot analysis)에 의한 단일 형질 전환 반응으로 평가하였다. 각각은 단독의, 독특한 Tn10삽입을 가졌다. Tn10융합이 유년기 래트(rat)의 전신 감염시 동안 안정한지를 확인하기 위해, 래트를 통한 배양 전후의 6개의 돌연변이의 교잡 패턴을 비교하였다. 감염 전후의 동일한 교잡 패턴을 얻었다.
실시된 실험 조건은 다음과 같다.
세균 균주 및 성장;
C311+는 ET-5, 침입적인 수막구균성 감염 환자로부터 분리한 혈청그룹 B나이제리아 메닌지티디스이다(Virjl et al., Mol. Microbiol., 1991; 5: 1831-1841).나이제리아 메닌지티디스를 5%의 레빈탈(Levinthal) 보충물이 포함된 뇌-심장 융합 배지에서 생육시켰다.E. coli균주를 루리아 베르타니(Luria Bertani) 배지에서 증식시켰다. 카나마이신(kanamycin)을나이제리아 메닌지티디스및이. 콜라이(E. coli)의 경우에 각각 75 및 50 ㎍/㎖의 농도가 되도록 고체 배지에 첨가하였다.
인 비트로 형질 전환 및 삽입 위치 특성화:
pSTM115에서 복제의 pACYC184 기시점(起始點)을 표지 구조(marker rescue)에 의하여 삽입 위치를 분리하도록 사용하였다. 뉴클레오티드 서열화는 프라이머 (primer) NG62(5'-TTGGTTAATTGGTTGTAACACTGG-3')(SEQ ID NO. 209) 또는 NG99(5'-ATTCTCATGTTTGACAGCG-3')(SEQ ID NO. 210)와 염료종결법(dye-termination method) (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut)을 사용하여 실행하였다. 상동성 조사는 혈청 A 및 B나이제리아 메닌지티디스및나이제리아 고노리아에(N. gonorrhoeae)게놈 서열(각각 http://www.sanger.ac.uk/Projects/N_meningitidis 및 http://www.tigr.org 및 http://dna1.chem.ou.edu/gono.html)을 포함하는, 단백질 데이타베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 대하여 수행하였다.
태그 증폭, 클로닝 및 서던 블라트 분석:
도트 블라트(dot blot)의 교잡 및 제조는 태그가 프라이머 NG13 (5'-ATCCTACAACCTCAAGCT-3') (SEQ ID NO. 211) 및 NG14 (5'-ATCCCATTCTAACCAAGC-3') (SEQ ID NO. 212)으로 증식된 것을 제외하고는 Henselet al., supra에 기재된 대로 수행하였고, 플라스미드(plasmid) DNA보다는, PCR 생성물이 막에 고정되었다.올리고뉴클레오티드 S1 (5'-AAGAGATTACGCGCAGACC-3') (SEQ ID NO. 213) 및 S2 (5'-AATACGCAACCGCCTCTC-3') (SEQ ID NO. 214)는 '기호 태그'에 인접한 pSTM115에서의 서열에 어닐링(annealing)하고, 각각의 pSTM115 유도체로부터 367-염기-쌍 생성물을 증폭하기 위해 사용되었다. 서던 블라트 분석을 위해, pSTM115로부터의 카나마이신 내성 카세트(cassette)는 무작위 프라이머 방법(NEB)을 사용하여 표시되어지고,Cla1에 의하여 분해되는 게놈 DNA에 대한 탐침자로서 사용되었다.
동물 모형:
STM 풀(pool)을 선별하기 위해, 돌연변이를 각각 미세역가 플레이트 (microtiter plate)에서 18시간 동안 생육하였다. 세균들을 울혈(pool)한 다음, PBS에 재-현탁하였다. 위스타(Wistar) 래트(생후 5일)에 현탁액 100㎕를 복강 내로 접종하고, 48시간 동안 관찰하였다. 돌연변이의 경쟁지수를 확정하기 위해, 야생형 및 돌연변이 세균을 고체 배지에서 18시간 동안 생육하고, PBS에서 수집하고, 총 접종물 5x106CFU에서 야생형 세포에 대한 돌연변이의 비율 1:1로 하여 래트에 접종하였다. 야생형(카나마이신에 민감한) 세균에 대한 돌연변이(카나마이신에 내성인)의 비율은 복제 샘플을 항생물질이 첨가된 또는 첨가되지 않은 배지에 플레이트화하는 것에 의해 결정되었다.
상동성 조사의 결과를 표 1에 나타낸다.
| SEQ ID NO. | 단백질 | 수탁번호 | 유기체 |
| 3 & 4 | 3'디히드로퀴네이트 신타제 | NMB0647 | N. gonorrhoeae |
| 25 & 26 | 글리코실 트랜스퍼라제 | LS12 | N. gonorrhoeae |
| 35 & 36 | 다중리보뉴클레오티드 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 | NMB0758 | N. meningitidis |
| 37 & 38 | 포스포리보실 포밀 글리신아미드 신타제 | PURL | E. coli |
| 43 & 44 | 쉬키메이트 디히드로게나제 | AROE | N. meningitidis |
| 47 & 48 | 가설의 21.7 kD 단백질 | NMB0673 | N. meningitidis |
| 53 & 54 | 추정의 세포 결합 인자 | NMB0345 | N. meningitidis |
| 57 & 58 | 가설의 단백질 | HI0633 | H. influenzae |
| 61 & 62 | Na+/H+역운반체 | NMBN0536 | N. meningitidis |
| 63 & 64 | 코리스메이트 신타제 | AROC | V. anguillarum |
| 67 & 68 | 파라콰트-유도가능 단백질 B | PQ15B | E. coli |
| 71 & 72 | 5'-메틸테드라히드로프테로일릴 트리글루타메이트-호모시스테인 메틸 트랜스퍼라제 | NMB0944 | N. meningitidis |
| 79 & 80 | α-1,2 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제 | RFAK | N. meningitidis |
| 83 & 84 | 추정의 RNA 메틸라제 | NMB1348 | N. meningitidis |
| 89 & 90 | L-락테이트 퍼미아제 | NMB0543 | N. meningitidis |
| 91 & 92 | ABC 수송체 | NMB1240 | N. meningitidis |
| 103 & 104 | 예상 GTP-결합 단백질 | HI0393 | H. influenzae |
| 109 & 110 | 캡슐 다당류 변형 단백질 | LIPB | N. meningitidis |
| 113 & 114 | 가설의 17.8 kD 단백질 | NMB0734 | N. meningitidis |
| 115 & 116 | E. coli가설의 단백질 | YIGC | S. typhimurium |
| 119 & 120 | 리보뉴클라제 Ⅲ | NMB0686 | N. meningitidis |
| 121 & 122 | AMPD 단백질 | NMB0668 | N. meningitidis |
| 123 & 124 | 5-메틸테드라히드로프테로일릴 트리글루타메이트-호모시스테인 메틸 트랜스퍼라제 | NMB0944 | N. meningitidis |
| 133 & 134 | 추정의 ATP-의존 RNA 헬리카제 | NMB1422 | N. meningitidis |
| 137 & 138 | 추정의 RNA 메틸라제 | NMB1348 | N. meningitidis |
| 141 & 142 | 쉬키메이트 디히드로겐아제 | AROE | N. meningitidis |
| 143 & 144 | 추정의 외부 막 단백질 | OMPU | N. meningitidis |
| 145 & 146 | TONB 단백질 | TONB | N. meningitidis |
| 147 & 148 | 추정 아포리포단백질 N-아실 트랜스퍼라제 | NMB0713 | N. meningitidis |
| 149 & 150 | 트랜스포사제 | NMB0991 | N. meningitidis |
| 153 & 154 | UTP-글루코스-1-포스페이트 유리딜릴트랜스퍼라제 | NMB0638 | N. meningitidis |
| 157 & 158 | ADP 햅토스-LPS 헵토실 트랜스퍼라제Ⅱ | NMB1527 | N. meningitidis |
| 161 & 162 | 추정 막-결합 분해 뮤레인 트랜스글리코실라제 B | NMB1279 | N. meningitidis |
| 171 & 172 | 추성 세포-결합 인자 | NMB0345 | N. meningitidis |
| 173 & 174 | P-아미노 벤조에이트 신서타제 | PABB | H. pylori j99 |
| 177 & 178 | 5'-메틸테드라히드로프테로일릴 트리글루타메이트-호모시스테인 메틸 트랜스퍼라제 | NMB0944 | N. meningitidis |
| 183 & 184 | 보존된 가설의 단백질 | NMB0183 | N. meningitidis |
| 185 & 186 | E. coli가설의 단백질 | YIGC | S. typhi LT2 |
여기서 동정된 남은 서열에서는, 상동성의 결과가 얻어지지 않았다.
유전자 생성물을 사용하여 폴리클로날(polyclonal) 항체를 생산하고 백신 후보물질로서의 효율성을 평가하기 위해 다양한나이제리아 메닌지티디스균주에 대한 엘리자(Elisa) 평가로 시험하였다. 사용된 균주는 다음과 같다:
나이제리아 메닌지티디스(B) Type 1000
나이제리아 메닌지티디스(B) Type NGE31
나이제리아 메닌지티디스(B) Type NGH15
나이제리아 메닌지티디스(B) Type SW2 107
나이제리아 메닌지티디스(B) Type NHG38
나이제리아 메닌지티디스(B) Type NGE28
나이제리아 메닌지티디스(B) Type 2996
이것은 이들 항체에 의하여 인식되는나이제리아 메닌지티디스균주의 다양성에 관하여 정보를 제공한다.
나이제리아 메닌지티디스를 초콜렛색의 말 혈액이 함유된 콜럼비아 아가(Columbia agar)(Oxoid)에서 5%의 CO2상태의 37℃에서 14시간 동안 생육하였다. 상기 세포를 아가 플레이트에서 긁어내고 50㎖ 튜브에서 PBS 20㎖에 재-현탁하였다. 상기 세포 현탁액에서 세균을 죽이기 위해 56℃에서 30분 동안 가열하였다.
가열되어 죽은나이제리아 메닌지티디스의 샘플 50㎕를 초콜렛색의 말 혈액이 함유된 콜럼비아 아가에 엷게 펼치고, 5%의 CO2상태의 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이것으로 모든나이제리아 메닌지티디스세포가 죽었다는 것을 확인할 수 있다. 상기 현탁액의 OD620은 PBS에 대하여 0.1 OD units로 조절된다.
가열되어 죽은나이제리아 메닌지티디스를 사용한 엘리자
엘리자 평가는 다음의 프로토콜을 사용하고 가열되어 죽은나이제리아 메닌지티디스를 사용하여 실행하였다. 엘리자 플레이트는 가열되어 죽은 세포(96 웰 플레이트의 각 웰에는 PBS에서의 죽은 세균 50㎕가 첨가되고, 4℃에서 배양된다)로 하룻밤 동안 코팅되었다.
37℃에서 1시간 동안의 배양되면서 표준 엘리자 프로토콜이 이어졌다. PBS/3% BSA 차단액, PBS/Tween 0.1% 세척액, 항-토끼 AP 연계된 이차 항체 (Sigma) 및 Sigma Fast P 니트로페닐 포스페이트 탐지 시약(Sigma)을 사용하였다. 데이타는 적절한 미세역가 플레이트 판독기를 사용하여 405㎚에서 판독하였다. 사용된 혈청은 첫 번째 보조투여 백신화 후 7일째에 사용가능하다(첫 번째 백신화 후 35일).
시험된 항체는 SEQ ID NOS. 8, 102, 140, 158 및 202로 동정된 유전자 생성물에 대하여 발생한 항체였다. 각각의 경우에서, 상기 결과는 항혈청이나이제리아 메닌지티디스B의 여러 다른 균주를 인식하였다는 것을 나타냈다.
엑스 비보/인 비트로 선별
사람에서 수막구균성 질병에 대한 예방은나이제리아 메닌지티디스에 대한 살균 항체의 존재와 연계되어 왔다(Goldscheideret al.,J. Exp. Med., 1969; 129: 1307-1326). 또한, 탐지할 수 있는 살균 작용 활성의 존재 및 인 비보 모형에서의 예방 사이의 상호 관계를 나타내는 증거도 있다(참조: Martin, J. Bacteriol., 2000; 83: 27-31). 그러므로, 생성된 항혈청은 생성된 항체의 살균 활성을 평가하기 위하여 사용하였다.
살균성 평가는 전-면역 혈청 및 상응하는 항체 후보물질에 대한 토끼 항혈청으로 수행하였다. 시판 중인 토끼 혈청은 단지 치사의 보충물을 제거하기 위한 전-선별에 따르는 보충물 공급원으로 사용하였다. Dulbecco's PBS(Gibco)는 필요한 경우에 완충 용액으로 사용하였다.나이제리아 메닌지티디스균주 MC58를 판별법에 사용하기에 앞서 37℃(5% CO2)에서 14시간 동안 생육하였다.
50㎕ 중의 MC58 200-400 CFU를 일련의 열-불활성화된 혈청 희석물 100㎕을 가진 보충물(50㎕)의 존재 하에서 배양하였다. 0시간에서의 샘플은 초콜렛색의 말 혈액 (Oxoid)를 포함한 콜럼비아 아가에 도포하였다. 60분 동안 배양한 후, 생존 세균의 수는 초콜렛색의 말 혈액(Oxoid)을 포함한 콜럼비아 아가에 도포하여 평가되었다. 살균 활성은 60분 후에 생존하는 세균을 퍼센트로 환산하여 나타내었다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였고, 세번 도포하였다. 모든 적절한 양성 및 음성 대조군을 이용하였다. 각각의 시험 샘플에서, 살균 활성은 실질적으로 전-면역 혈청에서보다 훨씬 컸다.
인 비보 선별법
백신 후보물질의 예방 효능을 평가하기 위해, 성체 마우스를 여기서 SEQ ID NOS. 102 및 108로 동정된 재조합 단백질로 면역화하였고, 예방 반응은 살아 있는 세균의 면역성 검사로 결정하였다. 백신 후보물질 각각에 대해, 6주된 15마리의 마우스(6주된 balb/C 마우스)는 3주 간격으로 개별적으로 두번씩 항원 25㎍으로(피하에서) 백신화하였다.
면역화 스케줄이 끝나고 일주일째에, 상기 그룹은 상동의 세균 균주 MC58로 면역성 검사되었다. 세균은 107cfu를 1회 투여량으로 하는 뇌-심장 혼합/0.5% 철덱스트란 배지 500㎕을 복강 내로 접종하였다. 이전의 결과는 철이 이러한 동물에서 균혈증 질병의 초기에 필요하다는 것을 보여준다. 이 모형은 이전에 백신화의 예방 효능을 예증하기 위해 사용되었다(Lissoloet al.,Immujn. 1995; 63: 884-890).
대조군은 부형제 단독(음성 대조군)으로 또는 정제된 PorA(양성 대조군)이 결합된 부형제로 백신화한 동물을 포함한다. PorA는 오로지나이제리아 메닌지티디스에 의해 발현된 외부 막 단백질이고, 외부 막 소포 백신에 의하여 유발된 살균성 항체를 위한 주요한 목표이다. PorA에 대한 모노클로날 항체는 또한 유아 래트 모형에서의 수동적으로 동물을 보호하는 것을 보여준다. 어쨌든, PorA는 균주 사이에 상당히 다양하고, 상동의 균주로 면역성 검사되는 경우 약간의 보호를 이끄는 반면에, 이상적인 백신 후보물질이 아니다. 생존체는 다음의 면역성 검사로 관찰되었다. 음성적인 대조군은 48시간 후에 아무런 생존체가 없다는 것은 보여준다. PorA로 백신화된 것들은 72시간에 6마리가 생존하는 것으로 나타났다. SEQ ID NOS. 102 및 108의 단백질로 백신화된 것들은 각각 5마리 및 3마리가 생존하는 것으로 나타났다.
Claims (19)
- 치료 또는 진단에 사용하기 위한,나이제리아 메닌지티디스(N. meningitidis)의 SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207로 동정된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 그램-음성 박테리아내 펩티드 또는 뉴클레오티드 수준에서 40%이상의 서열 유사성 또는 동일성을 가지는 관련된 분자를 포함하는 오페론, 또는 이의 기능적 분절에 의해 코드화된 펩티드.
- 제 1항에 있어서, 상기 서열 유사성 또는 동일성이 60%이상인 펩티드.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 서열 유사성 또는 동일성이 90%이상인 펩티드.
- 제 1항에 있어서, SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206 및 208로 동정된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
- 치료 또는 진단에 사용하기 위한, 상기 항 중 어느 한 항에 의한 펩티드를 코드화하는 다중뉴클레오티드.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 펩티드를 발현하기 위해 형질 전환된 숙주.
- 제 1항에서 정의된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 발현을 파괴하는 돌연변이를 포함하는 감독된 미생물.
- 제 7항에 있어서, 상기 돌연변이는 삽입성 유전자 불활성 또는 유전자 결실인 미생물.
- 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 미생물이나이제리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)인 미생물.
- 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 두 번째 뉴클레오티드 서열에서 두 번째 돌연변이를 포함하는 미생물.
- 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 치료 또는 진단에 사용하기 위한 미생물.
- 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 항원, 치료상의 펩티드 또는 핵산을 포함하는 미생물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 펩티드를 포함하는 백신, 또는 그것의 발현을 위한 수단
- 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 의한 미생물을 포함하는 백신.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 펩티드에 대항하여 만들어진 항체.
- 나이제리아(Neisseria)또는 그램-음성 박테리아에 의한 감염과 연계된 상태의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 생성물의 용도.
- 제 16항에 있어서, 상기 상태가 수막염인 용도.
- 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 수의학적인 치료를 위한 용도.
- 항균성 약의 동정을 위한 선별 평가에서의 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 생성물의 용도.
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