KR20030045039A - 유전자, 단백질 및 그들의 용도 - Google Patents
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Abstract
Neisseria meningitidis로부터의 일련의 유전자들은 면역화를 위한 대상이 되는 생성물을 코드화하는 것으로 나타났다. 따라서 이들 유전자의 동정은 백신 및 다른 치료용 생성물이 생산되는 것을 가능하게 한다.
Description
Neisseria meningitidis는 패혈병성 쇼크와 세균성 수막염(meningitis)에 관련되는 그램-음성 세균 병원체이다. 이 세균는 선진국에서 세균성 수막염을 일으키는 주요한 원인이며, 아프리카와 중국에서 대규모 전염병들을 일으킨다. 영국에서는,Neisseria meningitidis는 교통사고와는 별도로 아동 사망의 주요한 원인이다. 세균는 자연적으로 인간 비인강(nasopharynx)에 서식하며, 그 후 혈류에 접근하여 심각한 패혈증(septicaemia) 및 수막염을 일으킨다. 비록 최근의 항 미생물제들이 신체로부터 세균들을 제거하는데 효과적이기는 하지만, 수막염균성 패혈증 유래의 사망률은 아직 상당한 정도로 남아 있다.Neisseria meningitidis에 의해 야기되는 징후(condition)를 치료 또는 예방할 수 있는 수단, 예를 들면 면역화를 제공하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 세균의 유전자들과 단백질들 및 그들의 용도들에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 치료, 면역화 및 약제를 위한 선별(screening)에서의 그들의 용도에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은Neisseria meningitidis에서의 유전자들의 발견에 기초하는데, 이 들의 생성물은 이 미생물의 외부 표면에 위치하여 면역치료를 위한 표식으로 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에 의하면, 펩티드는 Seq ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 및 33의 뉴클레오티드 서열들 중 어느 것을 포함하는N. meningitidis의 유전자 또는 그것의 상동체(homologue) 또는 기능성 단편에 의하여 코드화된다. 그러한 펩티드는 예를 들어 단리되었을 때, 치료 또는 진단용에 적합하다.
본 발명의 두번째 양태에 의하면, 상기 정의된 펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드도 또한 치료 또는 진단에 유용할수 있다.
본 발명의 또다른 양태에 의하면, 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 잠재적인 항-미생물 약제를 선별(screening)하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에 의하면, 그램-음성 세균 또는Neisseria에 의한 감염과 관계되는 징후의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에서 동정한 생성물 중 어느 하나의 용도이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은Neisseria의 세포 표면에 위치하여서 감염 치료를 위한 치료제의 제조에 유용한, 펩티드를 코드화하는 유전자의 발견에 기초한다. 치료에 대한 언급은 면역화와 같은 예방적 치료를 또한 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 나아가, 본 발명의 생성물들은 원래 인간 환자들에 대한 감염의 치료용으로 의도되었으나, 수의학적 적용도 또한 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 보인다.
본 발명은Neisseria meningitidis에 관련하여 설명되었다. 그러나 모든Neisseria균주들 및 많은 다른 그램-음성 세균 균주들은 본 발명에서 동정된 것에 대해 아미노산 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 관련 펩티드 또는 단백질들을 포함할 수 있다. 이 펩티드들을 포함할 수 있는 균체들은 살모넬라(Salmonella),엔테로박터(Enterobacter),클렙시엘라(Klebsiella),쉬겔라(Shigella)및 예르시니아(Yersinia)속을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
바람직하기는, 발명의 다양한 양태에 유용할 수 있는 펩티드들은 본 발명에서 동정된 펩티드들과 40% 이상의 유사성을 가진다. 더욱 바람직하기는, 펩티드들은 60% 이상의 서열 유사성을 가진다. 가장 바람직하기는, 펩티드들은 80% 이상의 서열 유사성, 예를 들면 95% 유사성을 가진다. 본 발명에서 동정한 폴리뉴클레오티드와 관하여, 발명의 다양한 양태들에 유용할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드들은 발명에서 동정된 서열과 40% 이상의 동일성을 가진다. 더둑 바람직하기는, 폴리뉴클레오티드 서열은 60% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 가장 바람직하기는, 폴리뉴클레오티드 서열은 80% 이상의 서열 동일성, 예를 들면 95%의 서열 동일성을 갖는다.
"유사성(similarity)" 및 "동일성(identity)" 이란 용어는 당해 기술 분야에서 공지되어 있다. "동일성" 이란 용어의 사용은, 비교되고 있는 서열들에서 대응적으로 동일한 위치들에서 동일한 정합(match)에 기초한 서열 비교를 말한다. "유사성" 이란 용어는 아미노산 서열 들 간의 비교를 말하며, 대응되는 위치에서의 동일한 아미노산들 뿐만 아니라 대응되는 위치들에서의 기능적으로 유사한 아미노산들도 고려한다. 그러므로 폴리펩티드 서열들 간의 유사성은 서열 유사성에 덧붙여, 기능적 유사성도 나타낸다.
유전자 서열들 간의 동일성의 정도와 아미노산 서열들 간의 동일성 또는 유사성의 정도는, 공지된 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 관하여, 동일성과 유사성을 측정하기 위한 공개적으로 이용가능한 컴퓨터에 기반을 둔 방법은, NCBI로부터 이용가능한 BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschulet al., J. Molec. Biol., 1990; 215:403~410), BLASTX 프로그램 및 Genetics Computer Group, Madison WI에서 나온 Gap 프로그램를 포함한다. 본 발명에서 제공하는 유사성과 동일성의 정도는, 아미노산 서열 비교를 측정하기 위한 12의 갭 패널티(Gap penalty)와 4의 갭 길이 패널티(Gap length penalty)를 가지며, 폴리뉴클레오티드 서열 비교를 측정하기 위한 50의 갭 패널티와 3의 갭 길이 패널티를 가지는, Gap 프로그램을 사용하여 얻어졌다.
본 발명에 따른 유전자를 특징화한다면, 유전자 서열을 사용하여 다른 미생물들에서 관련 유전자 또는 펩티드를 조사하는 것이 가능하다. 이것은 EMBL 또는 GenBank 등의 현존하는 데이터 베이스에서 조사하여 실행될 수 있다.
본 발명에서 언급된 기술들은 관련 기술분야에서 잘 알려져 있다. 그러나, 특별히 Sambrooket al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(1989) 및 Ausubelet al, current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons, lnc가 참고될 수 있다.
본 발명에 의한 펩티드 또는 단백질들은 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의하여 정제되고 단리될 수 있다. 특히, 유전자 서열이 확인되면, 재조합 기술들을 사용하여 적합한 숙주에서 그 유전자들을 발현시키는 것이 가능할 것이다. 활성 단편들과 관련된 분자들이 동정될 수 있으며, 치료에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 펩티드 또는 그들의 활성 절편들은 면역 반응을 유도하기 위하여, 백신에서의 항원 결정기로 사용될 수 있다. 그들은 또한 수동적 면역화 또는 진단상 응용을 위한 항체의 제조에 사용될 수 있다. 적합한 항체는 단일 사슬 Fv 절편을 포함하는 모노클로날 항체 또는 그들의 절편을 포함한다. 인간화된 항체들 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 항체 제조를 위한 방법은 당업자들에게 자명하다.
펩티드의 활성 절편은 펩티드의 생물학적 기능을 보유하는 것들이다. 예를 들면, 면역 반응을 유도할 때, 절편은 충분한 크기를 가져서 그 절편으로부터 생산된 항체들은 그 펩티드와 세균 미생물에서의 다른 펩티드를 구별할 것이다. 통상적으로, 절편들은 적어도 30 뉴클레오티드(10개의 아미노산), 바람직하기는 60 뉴클레오티드(20개의 아미노산) 그리고 가장 바람직하기는 90 뉴클레오티드(30개의 아미노산) 이상의 크기일 것이다.
발명은 다른 미생물들로부터 나온 관련된 분자들에 더하여, 본 발명에서 동정된 폴리뉴클레오티드 및 펩티드에 만들어진, 심하게 생물학적 기능을 변화시키지는 않는 수식들을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 유전 암호의 변성(degeneracy)이 본 발명에서 상세화된 것들에 소수의 염기 변화를 일으킨 폴리뉴클레오티드를 생산할 것이나, 그럼에도 불구하고 이들이 같은 펩티드를 코드화한다는 것은 당업자들에게 자명할 것이다. 상보적인 폴리뉴클레오티드들 또한 본 발명의 범위 내이다. 다른 산성 또는 염기성 아미노산들이 상당한 기능 손실 없이도 치환 될 수 있는 등의 아미노산 수준에서의 보존적인 교환들 또한 관찰된다.
밝혀진 펩티드에 기초한 백신의 제조는 당업자들에게 공지되어 있다. 백신 조성은 감염에 대한 효과적 면역화를 제공하기 위하여 필요하거나 요구될 때, 적당한 담체 또는 명반 등의 보조제와 함께 명확히 결정될 수 있다. 백신 제제의 제조는 당업자들에게 자명할 것이다.
보다 일반적으로는, 당업자들에게 공지된 바와 같이, 치료적 용도로 적합한 양의 발명의 활성 요소들이 선택될 수 있고, 적합한 담체 또는 부형제 및 투여의 경로가 선택될 수 있다. 이들 요소들은 치료되어질 증상의 특성/심한 정도, 환자의 건강 상태 및 유형 등과 같은 알려진 카테고리에 의하여, 선택될 수 있거나 측정될 수 있을 것이다.
별도의 구현예에서, 발명의 생성물들은 독성(virulence)의 탐지를 위하여 또는 잠재적 항-미생물 약제의 동정을 위한 선별 분석법(screening assay)에 사용될 수 있다. 정형적 선별 측정평가들이 당업자에게 알려져 있고, 발명의 생성물을 사용하는데 적당한 방식으로 적용될 수 있다. 예를 들면, 항-미생물 활성을 나타내는 대상에 결합하거나 이를 불활성화 시키는 약제의 능력으로 인하여, 발명의 생성물들은 잠재적 약제를 위한 대상으로 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자들은 또한 미생물의 독성에 관계되며, 따라서 유전자를 결실하거나 불활성화 시키는 것은 감독된(독성 없는) 미생물을 생산하기에 충분할 수있다.
감독된 미생물들은 본 발명에서 동정한 유전자들 중 일부의 발현을 파괴시키는 돌연변이로 제조될 수 있다. 당업자들은 특정 유전자들의 발현을 파괴시키기 위한 방법을 인식할 것이다. 사용될 수 있는 기술에는 삽입 불활성화 또는 유전자 결실 기술들을 포함한다. 본 발명에 의한 감독된 미생물은 또한 다른 유전자에서의 부가적인 돌연변이들을 포함할 수 있는데, 예를 들면 본 발명에서 동정한 2번째 유전자에서, 또는 살모넬라에 대하여 WO-A-96/17951에서 동정된 SPI2 영역에 위치한 유전자의 aro 돌연변이 등이 있다.
감독된 미생물들은 또한 이형의 항원들, 치료용 단백질들 또는 핵산들(DNA 또는 RNA)의 운반을 위한 담체 시스템으로서 사용될 수 있다. 이 구현예에서, 감독된 미생물들은 이형 항원, 단백질, 핵산을 생체내 특정 부위로 운반하는데 사용된다. 이형 항원, 펩티드, 핵산을 감독된 미생물로 도입하는 것은 종래의 기술들에 의하여 실행되며, 이들은 이형 항원들 또는 치료용 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 또한 적합한 프로모터 서열들을 포함하는 벡터 등의 재조합 구조물의 사용을 포함한다. 대체적으로, 이종 항원 또는 단백질을 코드화하는 유전자가 균체의 게놈 및 발현을 조절하는데 사용되는 내인성 프로모터에 끼어들 수 있다.
발명의 여러 생성물들은 또한 수의학적 적용에 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드들은 다음과 같이 동정되었다.
펩티드의 동정
Neisseria meningitidis(균주 C311+) 염색체 DNA의 부분적 유전자 라이브러리는 플라스미드 벡터 pFW-phoA1, pFW-phoA2 및 pFW-phoA3을 사용하여 제조하였다(Podbielski, A. et al.,Gene 1996; 177:137-147). 이들 플라스미드는 구조적인 스펙티노마이신 아데닐트랜스퍼라제 항생제 저항 마커들을 가지는데, 이들이 고도의 스트렙토마이신 내성을 부여하여 쉽게 선택될 수 있다. 나아가 이들 벡터는 알칼라인 포스파타제를 위한 불완전한 (리더 서열이 없는; leaderless)E. coli phoA 유전자를 포함한다. 세 개의 벡터들은 해독틀 내의BamHⅠ제한 효소 부위의 상류(upstream)와 비교할 때, 리더 서열이 없는phoA 유전자이 존재하는 해독틀에 대해서만 다르다. 이 불완전한E.coli phoA 유전자는 세균 막을 통과하여 이 효소가 방출되기 위한 적당한 리더 서열이 부족하므로, 이 플라스미드들이E.coli phoA 돌연변이(예를 들면, 균주 DH5α)에 퍼져 있을 때는 외인성 알칼라인 포스파타제 활성이 없다. 색소 생성 알칼라인 포스파타제 기질, XP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트)는 손상되지 않은 세균 세포에는 들어가지 않아서 단지 방출되거나 표면에 연결된 알칼라인 포스파타제 활성만을 탐지할 수 있다. 방출되거나 표면에 연결된 알칼라인 포스파타제 활성이 있을 때, 색소 생성 XP 기질은 파란 색소를 생산하며 분열되고, 해당된 세균 콜로니들은 이들 파란색 때문에 동정될 수 있다.
플라스미드 DNA는BamHⅠ에 의하여 완전히 소화되고, 새우 알칼라인 포스파타제에 의하여 인산기가 제거된다.Neisseria게놈 DNA는Sau3AⅠ으로 부분적으로소화되어, 대다수의 절편들이 에티디움 브로마이드로 염색된 1% 아가로스 겔에서 띠(band)로 관찰되어질 때 0.5 ~ 1.0 kb의 크기로 나타난다. 이들Sau3AⅠ절편들은 준비된 pFW-phoA 벡터에 결찰된다.E.coli균주 DH5α는 기능을 가지는phoA 유전자가 부족하므로 클로닝 숙주로서 선택되었다. 재조합 플라스미드들은 100㎍/㎖의 스펙티노마이신 및 40㎍/㎖의 색소 생성 XP 기질을 포함하는 루리아 한천 배지(Luria agar)에서 선택되었다. 리더 서열이 없는phoA 유전자의 방출(export) 신호 서열을 보충하는Neisseria meningitidis삽입 DNA를 보유한 E.coli 재조합체들은 콜로니의 파란 색으로 동정되었다.
리더 서열이 없는phoA 유전자의 방출 신호 서열을 보충하는Neisseria meningitidis삽입 DNA를 서열화하고, 결과로 나온 서열이 GenBank 데이터 베이스에서 알려진 단백질인지를 조사하였다. 결과는 표1에 나타났다.
표1
| SEQ ID NO. | Ref. 이름 | 추정되는 단백질 | 접근 NO. | |
| 유전자 | 단백질 | |||
| 1 | 2 | pho 1-94 | L-젖산 퍼미아제 | NMB0543 |
| 3 | 4 | pho 1-61 | 막 융합 단백질 | NMB1716 |
| 5 | 6 | pho 1-96 | 단백질-방출 막 단백질 SECF | NMB0608 |
| 7 | 8 | pho 2- 7 | 유기용매 내성 단백질 | NMB0280 |
| 9 | 10 | pho 2-10 | 페니실린-결합 단백질 4 | NMB0749 |
| 11 | 12 | pho 2- 6 | 티올:이황화물 상호교환 단백질DSBD | NMB1519 |
| 13 | 14 | pho 2-35 | 단백질-방출 막 단백질 SECD | NMB0607 |
| 15 | 16 | pho 2-66 | 스퍼미딘/푸트레신-결합 단백질 | NMB0623 |
| 17 | 18 | pho 2-76 | 가상의 17.6 kD 단백질 | NMB0350 |
| 19 | 20 | pho 2-80 | 가상의 11.9 kD 단백질 | NMB0844 |
| 21 | 22 | pho 2-81 | - | NMB0159 |
| 23 | 24 | pho 2-86 | - | NMB1277 |
| 25 | 26 | pho 2-90 | 설페이트 ABC 트랜스포터 | NMB0880 |
| 27 | 28 | pho 2-91 | - | NMB0580 |
| 29 | 30 | pho 2- 5 | FRPC 오페론 단백질 | NMB1412NMB0584NMB0364NMB1414 |
| 31 | 32 | pho 2-25 | 가상의 10.2 kD 단백질 | NMB1546NMB1631 |
| 33 | 34 | pho 2-41 | - | NMB1830 |
단백질 백신 후보들의 보호적 특성들
선별 분석으로 동정된 유전자들은, 클론되고 발현된 그들의 단백질들이 토끼에서 면역 반응을 일으키는 능력에 기초하여 잠재적인 단백질 백신 후보들로서 평가되었으며, 결과로 생산된 항원들은Neisseria meningitidis의 보체-매개 세균용해를 촉진시키는 능력을 가진다. 재조합 단백질로 면역화된 마우스들에 대해 살아있는 세균로 공격함으로서, 보호적 반응이 측정되었다.
요약하면, 후보 유전자들은 PCR로 증폭되었고, 클로닝되고 코드화된 단백질이 발현 및 정제되었다. 정제된 단백질은 효소가 연결된 면역-흡수제 측정평가(ELISA)에서의 사용을 항체 생산에 사용되었다.PorA 유전자도 또한 PCR로 증폭되었고, 클론되어 발현되고 정제되었다.PorA에 대항한 단일클론 항체들은 유아(infant) 래트에서의 감염 모델에서 동물들을 수동적으로 보호함을보여왔다(Saukkonenet al, Microb. Pathog., 1987; 3(4): 261-267). 그래서 이 단백질은 몇몇 실험에서 양성 대조군으로 사용되었다.PorA는N. meningitidis의 다른 균주들로부터의 공격에 대항하여 동물을 보호할 수 없음을 보여왔고(Poolman, Infect.Dis.,1995;4:13), 따라서 다양한 범위의Neisseria meningitidis균주들에 대항한 보호적 면역 반응을 일으킬 수 있는 어떤 후보라도PorA에 대하여 유리한 점을 제공한다.
후보 유전자들은 균주 MC58로 부터 나온 게놈 DNA를 DNA 주형으로 사용하여 PCR로 증폭되었다. 프라이머들은 표 2에 나열되었다. F는 전방 프라이머를 나타내고, R은 후방 프라이머를 나타난다. 프라이머 짝 PRAF 및 PRAR은PorA 유전자 DNA를 증폭하는데 사용되었다.
표 2
| 후보 | 프라이머 서열 | 서열 ID 번호 |
| PRAFPRAR | 5' ATGCGAAAAAAACTTACCGCCCTC5' GAATTTGTGGCGCAAACC | 3536 |
| phoA 1-94RphoA 1-94F | 5' GAGGAAGAAAATCATTGCCGCGAC5' ATGGTGTCCGTATTCGCCGC | 3738 |
| phoA 1-61FphoA 1-61R | 5' ATGGCTTTTTATGCTTTTAAGGCG5' TTTCGCTTCAGAAGCAGGTTTGGC | 3940 |
| phoA 2-66RphoA 2-66F | 5' TTTGCCCGCTTTGAGCCCTTG5' ATGCTCAACATCTACAACTGGTCG | 4142 |
| phoA 2-10RphoA 2-10F | 5' GGAGTCGGCAAAAAGGTGGGC5' ATGCTCTCCTCACAGTCTGCCC | 4344 |
| phoA 1-97FphoA 1-97R | 5' ATGGAACTCTTTAAAATCAAACGCG5' AACCACGATTTCTTCTTTCTTCTTC | 4546 |
| phoA 2-5FphoA 2-5R | 5' ATGAGACCATATGCTACTAC5' TTTTTTACTTGGATTGTTTAC | 4748 |
백신 후보들의 클로닝
PCR 증폭된 후보들로부터 나온 DNA는 바로 InVitrogen pCRT7/CT-TOPO 벡터로 클로닝되었다. 이 백터는 T7 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 C-말단 6×His 표지융합을 제공하여 발현 및 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 재조합 단백질의 정제를 용이하게 한다.
클로닝을 위하여, 결찰 반응은 TOP10F'세포들(InVitrogen)로 옮겨진다. 형질전환된 DNA 클론으로부터 나온 DNA는 삽입 DNA의 방향을 확인하기 위하여 스크린되었다. 정확한 방향으로 삽입된 DNA를 가지는 것처럼 보이는 후보들의 클론이 서열화되어 구조물의 5' 영역의 완전성을 확인하였다.
발현 및 정제
클로닝된 후보들은 HMS174(DE3)pLysS 수용체 세포(InVitrogen)로 형질전환된 다음 후보 유전자들의 발현을 조사하였다. 후보 클론들의 발현은 IPTG로 유도되었고, 발현은 4시간의 유도 후 항-His 항체를 사용한 웨스턴 블라팅(western blotting) 및 SDS PAGE를 사용하여 분석되었다. 후보 단백질은 수지로부터 단백질의 용출을 위하여 이미도졸(Imidozole) 완충액 구배(10~100mM)를 사용하여, Talon 수지(단백질의 카르복시 말단에 클론된 6×His-표지를 사용한 금속 친화성 칼럼(Clontech))를 통하여 정제되었다.
항체 생산
항체 생산에 앞서, 동물 혈청을 ELISA 선별 분석법으로Neisseria meningitidis전체 세포에 대한 낮은 반응 생산성에 대하여 먼저 선별하였다. Freund's 보조제와 함께 100㎍의 단백질을 사용하여 초기 백신화하고 , 28일 간격으로 Freund's 불완전 보조제와 함께 3번의 연속적인 부스팅된(boosting) 토끼에서, 클론되고 정제된 후보 단백질 각각에 대하여 항체가 발생되었다. 각각의 추가면역 후에 혈청을 모아서, 혈청 샘플들을 생산하였다.
열로 살균된
N. meningitidis
전체에 대한 ELISA
열로 살균된N. meningitidis에 대한 ELISA 분석법(assay)이 실행되어 정제된 단백질에 대해 발생된 항체가Neisseria meningitidis전체 세포를 인식하는지를 확인하였다. 이들 측정평가는 다음의 균주 뿐만 아니라, 균주 MC58에 대해서도 실행되었다
Neisseria meningitidis(B)형 1000
Neisseria meningitidis(B)형 SW2 107
Neisseria meningitidis(B)형 NGH38
Neisseria meningitidis(B)형 NGE28
Neisseria meningitidis(B)형 2996
이들 모두는 널리퍼진 질병을 야기하는 균주들이며, MLST(multi-locus 서열형)에 의하여 제작된 덴드로그램에 기초하여 이 종들의 유전적 다양성을 포괄한다.
N. meningitidis은 쵸콜렛화된(chocolated) 말의 혈액과 함께 5% CO2,37℃에서 14시간 동안 콜롬비아 한천배지(Columbia agar)(Oxoid)에서 생육되었다. 한천배지 플레이트에서 세포들을 긁어내어 50㎖ 튜브에 든 20㎖의 PBS 중에 재현탁하였다. 세균를 죽이기 위하여 세포 현탁액을 30분 동안 56℃로 가열하였다.
열로 살균된Neisseria meningitidis50㎕ 샘플을 콜롬비아 한천배지에 쵸콜렛화된 말 혈액과 함께 도포하고, 18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 이것은 모든N. meningitidis세포들이 살균되었는지를 확인하게 한다. 그리고 나서 열-살균된 세포들은 PBS로 세척된다. 이 현탁액의 OD620는 PBS로 0.1 OD 단위로 조절하였다.
열-살균된
N. meningitidis
에 대한
ELISA
열로 살균된Neisseria meningitidis전체 세포를 사용하여 ELISA를 실시하였다. ELISA 플레이트는 열-살균된 세포로 밤새 코팅되었다(96 웰 플레이트의 각 웰에 담겨지고 4℃로 배양된 PBS 중 열-살균 세균 50㎕). 이들을 1시간 동안 37℃에서 배양한 후 표준 ELISA 프로토콜을 따랐다. PBS/3% BSA 차단 용액, PBS/트윈 0.1% 세척 용액, 항-토끼 AP 접합 2차 항체(Sigma)와 Sigma Fast P 니트로페닐 포스페이트 검출제(Sigma)를 사용하였다. 데이터는 적절한 미세역가 플레이트 판독기(micro-titer plate reader)를 사용하여, 405nm에서 읽었다. 데이터는 첫번째 부스터(booster) 백신화 이후 7일 만에(첫번째 백신화 후 35일)에 적절한 혈청을 사용하여 작성되었다.
ELISA 데이터
결과들은 각각의 후보 단백질에 대항하여 발생된 항-혈청들이N. meningitidis의 다른 균주들에 대하여도 강한 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
생체내 선별
백신 후보들의 보호적 효율을 측정하기 위하여, 다자란(adult) 마우스들을 재조합 단백질로 면역화하고, 살아있는 세균의 공격에 의하여 보호적 반응을 측정하였다.
각각의 백신 후보에 대하여, 15마리의 6주된 balb/C 마우스들을 3주간 간격으로 2개의 별도의 군(occasion)에 대하여, 25㎍의 항원으로 백신화하였다(피하접종). 백신화 일정이 끝난지 1주일 후, 동일한 세균 균주 MC58로 그 군을 공격하였다. 세균는 1×106cfu로 뇌 심장 혼합물/0.5% 철 덱스트란 배양액 중 500㎕ 부피를 복강으로 접종되었다. 과거의 결과들은 철이 이들 동물들에서 균혈성 질병의 개시를 위하여 요구된다는 것을 보여주었다. 이 모델은 이전에 백신화의 보호적 효율을 입증하기 위하여 사용되어 왔다(Lissolo et al, Infect. Immun., 1995; 63: 884-890).
대조구들은 보조제 만으로(음성 대조구), 정제된 PorA(양성 대조구)와 결합한 보조제와 함께, 또는 감독된 동일 균주로 백신화된 동물들을 포함한다. 공격에 이어이들의 생존을 모니터하였다.
13%(2/15)가 생존한 비백신화된 대조구들과 비교하여, 후보 pho2-5로 면역화된 동물들은 80%(12/15) 생존을 보여주었다. pho2-5 후보는 porA 단백질(13/15)와 대등한 보호 수준을 보여주였다.
후보 pho2-10, pho1-94 또는 pho2-66로 백신화된 동물들은 13%(2/15)가 생존한 비백신화된 대조들과 비교하여, 각각 40%(6/15), 47%(7/15) 또는 27%(4/15) 생존율을 가진다.
Claims (16)
- SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 및 33의 뉴클레오티드 서열들 중 어느 것을 포함하는N. meningitidis의 유전자 또는 그램-음성 세균에서의 그것의 상동체, 또는 그것의 기능적 단편에 의하여 코드화되는 치료 또는 진단용 펩티드.
- 제 1항에 있어서, 상기 상동체는 상기 펩티드 또는 뉴클레오티드 수준에서 적어도 40%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드.
- 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 상동체는 상기 펩티드 또는 뉴클레오티드 수준에서 적어도 60%의 서열 유사성 또는 동일성을 가진 펩티드.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상동체는 상기 펩티드 또는 뉴클레오티드 수준에서 적어도 90%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 펩티드.
- 제 1항에 있어서, SEQ ID No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 34의 아미노산 서열들 중 어느 것을 포함하는 펩티드.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 코드화하는, 치료용 또는 진단용 폴리뉴클레오티드.
- 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 의한 펩티드를 발현하도록 형질전환된 숙주.
- 제 1항에 정의된 뉴클레오티드 서열들 중 어느 것의 발현을 파괴하는 돌연변이를 포함하는 미생물.
- 제 8항에 있어서, 상기 돌연변이는 삽입 불활성화 또는 유전자 결실인 미생물.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 미생물은Neisseria meningitidis인 미생물.
- 제 8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 두번째 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 포함하는 미생물.
- 제 8항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 또는 진단용인 미생물.
- 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 의한 펩티드 또는 그것의 발현을 위한 수단을 포함하는 백신.
- 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드에 대한 항체.
- 선별 분석법에서의 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 생성물의 용도.
- Neisseria또는 그램-음성 세균에 의한 감염과 관련되는 징후의 방지 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 생성물의 용도.
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