KR20030026653A - 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체의생산용 항원 및 그의 제조방법과 이용 - Google Patents
프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체의생산용 항원 및 그의 제조방법과 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스 (P. acnes)의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적인 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 항원에 관한 것이며, 또한 이와 같이 제조한 항원을 이용하여 조류에 면역화함으로써 상기 균주에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법 및 결과적으로 생성된 여드름 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알에 관한 것이다.
Description
본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스 (P. acnes)의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적인 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 항원에 관한 것이며, 또한 이와 같이 제조한 항원을 이용하여 조류에 면역화함(immunization)으로써 상기 균주에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법 및 결과적으로 생성된 여드름 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알에 관한 것이다.
여드름은 호르몬의 불균형으로 인한 피지 양의 변화로 인해 발생한다. 호르몬 변화에 의해 피지선의 활동이 왕성하게 되면 피지선이 커지게 되며, 피지의 양이 증가하여 피지가 나오는 모공이 막히게 된다. 이 막힌 모공에 프로피오니박테리움 아크네스인 여드름 원인균이 성장하며 이 균에서 분비되는 리파제가 중성지방을 분해하여 유리지방산이 생성된다. 이 지방산이 피부의 각질을 두껍게 함으로써 여드름이 생기는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 여드름을 치료하기 위해 현재 과산화벤질, 레티노산, 항생제, 아젤라산, 이소트레티노인, 에스트로겐 호르몬제, 부신피질 호르몬제 등이 사용되고 있으며 또한 기계적 박피술, 화학 박피술, 레이저 박피술 등의 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 방법들은 생체내의 호르몬의 불균형 등을 야기시킬 수 있을 뿐만 아니라 여러 가지 부작용을 갖는다. 또한 항생제 등의 치료 방법은 임산부 등에는 치명적인 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 항생제에 대한 내성을 증가시키는 문제가 있다.
위와 같은 부작용들을 피하기 위해, 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항체를 함유하는 계란를 제조하여 여드름 예방 및 치료에 이용하는 방법들이 시도되어 왔다. 이 방법들에서는 프로피오니박테리움 아크네스 균 자체를 항원으로 이용하거나 이 균이 생산하는 리파제 등의 단백질을 추출하여 항원으로 사용했다. 그러나, 균 자체를 항원으로 사용하여 제조된 항체는 전체 균에 대한 모든 항체들을 포함하여, 생성된 전체 항체의 양은 일정한데 균에 반응할 때 불필요한 항체들을 다수 함유한다. 따라서, 프로피오니박테리움 아크네스 균체를 항원으로 사용하여 면역화된 닭으로부터 얻은 계란은 사실상 이 균에 대한 면역 반응의 효능이 미흡하다.
나머지 방법인 프로피오니박테리움 아크네스의 리파제 등의 단백질을 추출하여 항원으로 사용하는 경우에서는, 리파제 등의 단백질 만을 분리 및 정제하는 방법이 시간적 그리고 경제적 측면에서 용이하지 않아서, 실험실에서 사용할 수 있는 양의 추출은 가능할 수 있으나 항체 생산에 요구되는 항원의 대량 제조 측면에서는현실적이지 않다.
본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조하는 방법 및 이 방법으로 제조된 특이적 항원을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 항원의 제조방법에 이용되는 특이적인 프라이머들을 제공한다.
또한 본 발명은 제조된 항원을 이용하여 조류에 면역화함으로써 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항체를 난황에 포함하는 조류의 알을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항체를 난황에 포함하는 여드름 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 난황을 포함하는 여드름 치료 및 예방의 작용을 갖는 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 의한 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조하는 방법은 하기와 같은 단계들로 이루어진다:
(a) 프로피오니박테리움 아크네스의 게놈성 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여, 리파제, dnaK, groEL 및 hyase (hyaluronidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는어느 하나의 항원 단백질을 코드화하는 유전자를 선택적으로 분리하는 단계;
(b) 분리된 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 이 벡터로 적절한 대장균 균주를 형질전환하여 이 벡터를 증폭하여 벡터 DNA를 추출하는 단계;
(c) 추출된 벡터 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 상기 항원 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 단계;
(d) 증폭된 유전자를 적절한 벡터에 클로닝하여 이 벡터로 적절한 숙주를 형질전환하는 단계;
(e) 숙주를 배양하여 항원 단백질을 과발현시키서 추출하는 단계.
본 발명의 항원 제조방법에서는 프로피오니박테리움 아크네스의 게놈 DNA 중에서 리파제, dnaK, groEL 및 hyase 단백질중 어느 하나를 코드화하는 유전자를 표적화하여 선택적으로 증폭하는 것을 특징으로 한다. 이 단백질들을 항원으로 표적화한 근거는 다음과 같다. 프로피오니박테리움 아크네스의 리파제는 중성지방을 분해하여 유리지방산을 생성하므로 이 기전을 방해하는 항체를 생성하고자 항원으로 표적화했고, hyase는 세포막에 걸쳐있는 단백질로서(cell-associated) 이에 대한 항체가 균의 성장을 막을 수 있다는 점에서 항원으로 표적화 했고, 또한 groEL과 dnaK는 열충격(heat shock) 단백질로서 염증성 여드름(inflammatory acnes)을 유발하는 단백질을 생산하므로 이 기전을 방해하는 항체를 생성하고자 항원으로 표적화 했다.
본 발명의 항원 제조방법의 (a) 단계에 사용된 프로피오니박테리움 아크네스의 게놈성 DNA는 당업계에 널리 알려진 방법에 의해 균주로부터 분리될 수 있으며,그 일례를 하기의 실시예에서 예시하고 있다. 또한, (a) 단계의 PCR에 사용되는 특이적 프라이머들은 표적화하는 하는 항원 단백질 즉, 리파제, dnaK, groEL 및 hyase를 코드화하는 유전자 서열 (Gene Bank 참조)을 토대로 하여 고안하여 합성하여 사용한다. 본 발명의 실시예에서는 그 일례로 상기 PCR에 특이적인 SEQ ID NO. 1 ~ SEQ ID NO. 8의 프라이머들을 예시하고 있다.
단계 (b)에서, 적절한 벡터로는 바람직하게는 플라스미드이고, 가장 바람직하게는 pEZ-T 벡터이다. 적절한 대장균 균주로 가장 바람직한 것은E. coliJM 109균주이다. 왜냐하면 pEZ-T 벡터에는 양쪽으로 티민이 붙어 있는데, PCR을 수행하고 나면 증폭된 유전자의 양쪽 끝에 아데닌이 붙게 되므로, 리가제를 이용하여 벡터에 유전자를 안정적으로 삽입시킬 수 있기 때문이다. 증폭된 벡터 DNA의 추출은 통상적인 기술에 의하고, 그 일례를 하기 실시예에 예시하고 있다.
단계 (c)에서, PCR에 사용되는 특이적 프라이머들은 증폭된 벡터 DNA가 클로닝될 벡터 (단계 (d))의 제한부위를 고려하여 고안하여 합성한다. 이때 제한효소부위는 PCR 산물 내에서 존재하는 제한효소 부위가 아닌 것을 선택해야 한다. 왜냐하면 이와 같은 경우 PCR된 유전자가 절단될 수 있기 때문이다. 본 발명의 실시예에서는 4가지 항원의 유전자를 포함한 각각의 증폭된 벡터 DNA와 클로닝될 벡터의 제한 부위를 고려하여 SEQ ID NO. 9 ~ SEQ ID NO. 16을 고안하여 사용하였다.
단계 (d)에서, 적절한 벡터로 가장 바람직한 것은 pEZ-28b 벡터이다. pEZ-28b 벡터에는 유전자를 클로닝하여 발현되어 나오는 단백질에는 C-말단과 N-말단에6개씩의 His가 붙어 있어 Ni+-NAT 친화성 크로마토그래피를 이용하여 그 단백질만을 쉽게 분리할 수 있는 이점이 있기 때문이다. 이 단계에서 형질전환에 적절한 숙주로는 대장균이며, 가장 바람직한 숙주로는 BL212(DE3)pLys 균주를 들 수 있다. 클로닝 및 형질전환은 당업계에 알려진 조건에 의하여 행해질 수 있으며, 그 일례를 하기 실시예에서 예시하고 있다.
단계 (e)에서, 숙주를 배양하여 항원 단백질을 과발현시키서 추출하는 것은 사용된 숙주에 특성에 따라 당업자가 용이하게 행할 수 있을 것이며, 그 일례를 하기 실시예에 예시하고 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기의 방법으로 제조된 항원을 조류에 면역시켜서 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 제조한 항원들을 조류에게 면역주사하여 그 조류가 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체를 생성케 하여, 결과적으로 그 조류가 생산한 알에도 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체가 포함되는 것이다. 본 발명에 이용될 수 있는 조류로는 닭, 오리, 기러기, 칠면조, 메추리 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 알은 여드름의 예방 및 치료 목적으로 하는 기능성 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 알을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 건강식품, 가공식품, 분말상 식품 등이 있다. 팔각회향 추출물을 식품 제조시 원료 물질에 첨가하거나 조리 또는 가공된 식품에 적절히 혼합하여 여드름 예방 작용을 갖는기능성 식품을 제조할 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예
프로피오니박테리움 아크네스의 게놈 DNA의 분리
프로피오니박테리움 아크네스(KCTC 3314)을 트립톤(20g/ℓ), 효모 추출액 (10g/ℓ), 글루코스(5g/ℓ)를 포함하는 배지(100ml)에 37 ℃에서 48 시간 배양한 후, 균체를 원심분리하여 회수하였다. 회수된 균체를 4ml의 TE 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA)에 현탁 후, 원심분리하여 2회 세척하였다. 회수된 균체를 1.8ml의 TE 완충용액으로 현탁하고 200㎕의 라이소자임(10mg/ml)을 넣고 37℃에서 2 시간 처리하였다. 처리된 용액에 250㎕의 20% SDS 와 250㎕의 프로테이나아제 K (10 mg/ml)를 넣고 55℃에서 16시간 방치한 후, 500㎕의 RNAse (10mg/ml)을 넣은 후 37 ℃에서 2시간 처리하였다. 전체 용적과 같은 양의 페놀:클로로포름 (1:1)을 넣은 후 교반하고 전체 부피의 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨, pH 6.0과 2.5 배 부피의 95% 에탄올을 넣은 후 -20℃에서 20분간 처리하였다. 처리된 용액을 10,000 g, 4 ℃에서 원심분리 한 후 상등액을 버리고 70% 에탄올로 세척하여 DNA 펠렛을 건조시켰다. 건조된 DNA는 TE 완충액에 녹여 보관하였다.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
(1) 리파제 유전자
프로피오니박테리움 아크네스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 리파아제 유전자의 전체 1197bp중 1,168bp의 크기를 대상으로 PCR에 의해 선택적으로 분리하였다. 게놈 DNA에 0.2mM의 dNTPs, 각각 20pmol 씩의 양방향의 프라이머와 1 유니트의TaqDNA 폴리머라제를 넣은 후, 최종 부피를 50㎕로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머를 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5'-3') | 크기 | 위치 |
| 센스가닥 | TACCCTTTTCGAATTGAATC (SEQ ID NO.1) | 20 | 12-31 |
| 안티센스가닥 | GACCGAGTACTGTTCGTTGT (SEQ ID NO.2) | 20 | 1179-1198 |
PCR의 수행은 94℃에서 1분 동안 DNA 변성을 행하고, 42℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분 30초 동안 연장하여 30회를 반복하여 수행하였다. 이때 증폭된 DNA의 길이는 총 1,168bp이었다.
(2) dnaK 유전자
프로피오니박테리움 아크네스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 dnaK 유전자 전체 2,203bp중 1,932bp를 대상으로 PCR에 의해 선택적으로 분리를 하였다. 게놈 DNA에 0.3mM의 dNTPs, 각각 20pmol의 양방향의 프라이머와 1 유니트의TaqDNA 폴리머라제를 넣은 후, 최종 부피를 50㎕로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머를 표 2에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5'-3') | 크기 | 위치 |
| 센스가닥 | CAGGGTCTAGAGTTGAGTCG (SEQ ID NO.3) | 20 | 202-221 |
| 안티센스가닥 | GGTCACTTTTTCTCGTCCTC (SEQ ID NO.4) | 20 | 2114-2133 |
PCR의 수행은 94℃에서 1분 동안 DNA 변성을 행하고, 51℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장하여 30회를 반복하여 수행하였다. 이때 증폭된 DNA의길이는 총 1,932bp이었다.
(3) groEL 유전자
프로피오니박테리움 아크네스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 groEL 유전자 전체 2,834bp중 1,700bp를 대상으로 PCR에 의해 선택적으로 분리를 하였다. 게놈 DNA에 0.3mM의 dNTPs, 각각 20pmol의 양방향의 프라이머와 1 유니트의TaqDNA 폴리머라제를 넣은 후, 최종 부피를 50㎕로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머를 표 3에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5'-3') | 크기 | 위치 |
| 센스가닥 | TCAATCTGACGTCCACGG (SEQ ID NO.5) | 18 | 1115-1132 |
| 안티센스가닥 | CAATGCACGATCACATCAT (SEQ ID NO.6) | 19 | 2794-2814 |
PCR의 수행은 94℃에서 1분 동안 DNA 변성을 행하고, 52℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분 30초 동안 연장하여 30회를 반복하여 수행하였다. 이때 증폭된 DNA의 길이는 총 1,932bp이었다.
(4) hyase 유전자
프로피오니박테리움 아크네스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 hyase 유전자 전체 2,991bp중 2,549bp를 대상으로 PCR에 의해 선택적으로 분리하였다. 게놈 DNA에 0.3mM의 dNTPs, 각각 20 pmol의 양방향의 프라이머와 1 유니트의TaqDNA 폴리머라제를 넣은 후 최종 부피를 50㎕로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머를 표 4에 표시하였다.
| 프라이머 | 서열 (5'-3') | 크기 | 위치 |
| 센스가닥 | TAACCGCTTTCCTGTAATGT (SEQ ID NO.7) | 20 | 393-412 |
| 안티센스가닥 | TTAGCGGCAATCTAGTTAGG (SEQ ID NO.8) | 20 | 2923-2942 |
PCR의 수행은 94℃에서 1분 동안 DNA 변성을 행하고, 50℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장하여 30회를 반복하여 수행하였다. 이때 증폭된 DNA 의 길이는 총 2,549bp이었다.
벡터에 결찰 (삽입)
증폭된 4가지 유전자들을 각각 pEZ-T 벡터 (RNA.com 제품)에 결찰하였다. 이때 사용된 T4 리가제와 PCR 산물의 양은 다음과 같다.
PCR 산물 : 3 ㎕ (50ng)
10X 결찰 완충용액 : 1 ㎕
pEZ-T 벡터 : 1 ㎕
DEPC 워터 : 4.5 ㎕
T4 DNA 리가제 : 0.5 ㎕
위의 산물을 4 ℃에서 12 시간 반응시켰다.
형질전환(Transformation)
위의 PCR 산물이 pEZ-T 벡터에 결찰된 벡터(플라즈미드) DNA를 pEZ-T 벡터의 유전자의 증폭과 발현이 최적화 되어 있는 JM 109 세포 (ATCC 53323)에 Cohen et al.(1972)의 염화칼슘을 사용하는 방법으로 형질전환시켰다.
상술하면, JM 109 세포를 LB 배지에 16시간, 37℃에서 배양한 후, 한 개의 콜로니 만을 취하여 LB 브로스에서 37℃에서 3시간 배양하여 세포수를 108세포/ml미만으로 만들었다. 배양된 세포를 빙조에 10분간 넣은 후 4℃, 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포만을 회수하고 세포를 10ml의 0.1M CaCl2에 녹인 다음, 다시 4℃, 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 회수된 JM 109 세포를 2ml의 0.1 M CaCl2에 녹인 후 200㎕을 취하였다. 여기에 벡터 DNA 10 ㎕ 넣고 빙조에 30 분간 넣어둔 후, 42℃에서 90초간 열처리한 후, 빙조에 2분간 넣어두었다. 그리고나서 800㎕의 LB 액체 배지를 넣은 후, 45분간 37 ℃에서 배양시켰다. 배양된 세포를 LB 플레이트에 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드), IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시드)와 앰피실린이 포함된 배지에 37℃에서 16시간 배양하여 흰색 콜로니 만을 취하였다.
벡터 DNA 추출
벡터 DNA를 알카리 용균법을 이용한 플라스미드 추출 키트(Bioneer 제품)를 사용하여 분리하였다.
상술하면, 흰색 콜로니를 5ml의 LB 액체배지(앰피실린 20㎍/ml)에 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양된 세포를 12,000rpm에서 원심분리하여 펠렛을 취한 후 250㎕의 재현탁 완충액에 녹였다. 다시 250㎕의 용균 완충액을 첨가하고 상온에서 5분간 방치한 후, 여기에 350㎕의 중화 완충액을 넣은 다음, 4℃에서 5분간 배양하고, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상등액만을 결합 칼럼에 넣은 후 12,000rpm에서 1 분간 원심분리하고 여과액은 버렸다. 500 ㎕의 변성 완충액을 넣고 5분간 방치한 다음, 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 여과액을 버렸다. 700㎕의 80% 에탄올을 칼럼에 넣고 12,000 rpm에서 1 분간 원심분리하고 여과액은 버렸다. 13,000rpm에서 1 분간 원심분리하여 에탄올을 완전히 제거한 후 100㎕의 용출 완충액을 칼럼에 넣고 1 분간 방치한 다음, 13,000rpm에서 원심분리하여 벡터 DNA를 얻었다.
클로닝을 위한
PCR
pET-28b(Novagen Cat No. 69865-3)에 벡터 DNA를 클로닝하기 위해 적절한 제한 부위를 포함할 수 있도록 벡터 DNA를 주형으로 새로운 PCR을 수행하였다.
(1) 리파제 유전자
PCR을 수행한 1,168bp중 pET-28b 벡터의 클로닝 위치 중에서 제한효소로 자를 수 있는 부분 중 겹치지 않는 제한효소를 NcoI과 Xho I으로 선택하였다. 따라서 표 5에서와 같은 프라이머를 사용하여 센스가닥 부분에는 Nco I(CCATGG)을 인식할 수 있는 부분을 붙이고, 안티센스가닥 부분에는 Xho I(CTCGAG)을 인식할 수 있는 부분을 붙였다. 센스와 안티센스 부분의 3bp (CGC)는 제한효소가 인식하기 쉽게 붙였다
| 프 | 서열 (5'-3') | 크기 |
| 센스가닥 | CGCCCATGGTACCCTTTTCGAAT (SEQ ID NO.9) | 23 |
| 안티센스가닥 | CGCCTCGAGGACCGAGTACTGTT(SEQ ID NO.10) |
(2) DnaK 유전자
PCR을 수행한 1,932bp와 pET-28b의 클로닝 위치 중 제한 효소로 자를 수 있는 부분 중 겹치지 않는 제한 효소를 Bgl II와 EcoRI으로 선택하였다. 따라서 표6에서와 같은 프라이머를 사용하여 센스가닥 부분에는 Bgl II (AGATCT)을 인식할 수 있는 부분을 붙이고, 안티센스가닥 부분에는 EcoRI (GAATTC)을 인식할 수 있는 있는 부분을 붙였다. 센스와 안티센스 부분의 3bp(CGC)는 제한효소가 인식하기 쉽게 붙였다.
| 프라이머 | 서열 (5'-3') | 크기 |
| 센스가닥 | CGCAGATCTCAGGGTCTAGAGTT (SEQ ID NO.11) | 23 |
| 안티센스가닥 | CGCGAATTCGGTCACTTTTTCTC (SEQ ID NO.12) | 23 |
(3) groEL 유전자
PCR을 수행한 전체 1,700bp와 pET-28b의 클로닝 부위 중 제한효소로 자를수 있는 부분 중 겹치지 않는 제한효소를 Xba I과 Nhe I으로 선택하였다. 따라서 표 7에서와 같은 프라이머를 사용하여 센스가닥 부분에는 Xba I(TCTAGA)을 인식할 수 있는 부분을 붙였다. 안티센스가닥 부분에는 Nhe I (GCTAGC)을 인식할 수 있는 부분을 붙이고, 이때 안티센스 쪽의 첫번째 C는 원래 존재하므로 5 bp (GCTAG)만 붙였다. 센스 부분의 3bp (CGC)와 안티센스 부분의 4bp (CCGC)는 제한효소가 인식하기 쉽게 붙였다.
| 프라이머 | 서열 (5'-3') | 크기 |
| 센스가닥 | CGCTCTAGATCAATCTGACGTCC (SEQ ID NO.13) | 23 |
| 안티센스가닥 | CCGCGCTAGCAATGCACGATCAC (SEQ ID NO.14) | 23 |
(4) hyase 유전자
PCR을 수행한 전체 2,549bp와 pET-28b의 클로닝 부위중 제한 효소로 자를 수 있는 부분 중 겹치지 않는 제한효소를 Xba I과 Hind IIII으로 선택하였다. 따라서표 8에서와 같은 프라이머를 사용하여 센스가닥 부분에는 Xba I (TCTAGA)을 인식할 수 있는 부분을 붙이고, 안티센스 가닥 부분에는 Hind III (AAGCTT)을 인식할 수 있는 부분을 붙였다. 이때 첫번째와 두번째 TT는 원래 존재하므로 4bp (AAGC)만 붙었다. 센스가닥 부분의 3bp (CGC)와 안티센스 가닥 부분의 2bp (CG)는 제한효소를 인식하기 쉽도록 붙였다.
| 프라이머 | 서열 (5'-3') | 크기 |
| 센스가닥 | CGCTCTAGATAACCGCTTTCCTG (SEQ ID NO.15) | 23 |
| 안티센스가닥 | CGAAGCTTAGCGGCAATCTAGTT (SEQ ID NO.16) | 23 |
벡터에
결찰, 형질전환, 추출 등
pET-28b 벡터의 제한효소 부분과 PCR된 유전자의 제한효소를 비교하여 pET-28b벡터의 His 부분의 앞 혹은 뒤 부분을 제한효소로 자르고 또한 PCR 산물도 같은 제한효소로 잘라 T4 DNA 리가제를 이용하여 붙였다. pET-28b (Novagen 69865-3)벡터에 결찰된 DNA의 형질전환에는 pET-28b 벡터의 복제와 발현이 최적화되도록 만들어진 BL212(DE3)pLysS 균주 (Novagen 70236)를 사용하였다. 그 이외는 상기에서 언급된 PCR 산물의 pEZ-T 벡터으로의 결찰, 형질전환, DNA의 추출의 과정들과 동일한 방법으로 수행하였다.
단백질 발현
형질전환된 BL212(DE3)pLys 균주를 LB-한천 배지에서 앰피실린에 내성을 가진 균주만을 선별하여 LB 액체배지(5ml)에 37℃에서 12시간 배양한 후 다시 앰피실린이 들어있는 1ℓ의 LB 액체배지에 옮겨 다시 37℃에서 배양하여 O.D.600이 약 0.7정도 도달하였을 때 단백질 발현을 유도하기 위하여 최종농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 후 다시 5시간 배양하였다. 배양된 균주는 4℃, 5,000rpm에서 10분간 원심분리 후 침전물에 30ml의 음파처리 완충액(50mM Na-인산염 pH 7.8, 300mM NaCl)에 현탁시켜 초음파 분쇄기로 세포를 깨뜨렸다. 위의 현탁액을 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액 만을 취하였다. 상등액을 Ni+-NTA 친화성 칼럼에 넣었다. 그 후 50ml의 음파처리 완충액과 세척 완충액(50mM Na-인산염 pH 6.0, 300mM NaCl, 10% 글리세롤)으로 씻어준 후 His-친화성 태그에 붙어있는 단백질을 50~300 mM의 이미다졸 용출 완충액을 사용하여 용출시켰다.
조류에서 항체 생성
추출된 재조합 단백질(100㎍)을 포함한 이미다졸 용출 완충액과 프로인드 완전 보조액을 1:1로 혼합한 후, 마리 당 1ml씩 산란계의 가슴에 1차 주사하였으며 2차와 3차는 2주 간격으로 동일한 단백질과 프로인드 불완전 보조액을 1:1 로 혼합하여 1ml씩 가슴에 주사하였다.
항체 추출 방법
면역된 난황만을 같은 양의 물과 교반 한 후, 난황의 4배 분량의 λ-카라기난(Carrageenan, Sigma.)를 섞은 다음, 상온에서 30분 방치 후 4 ℃ , 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 와트만 #2 여과지로 여과하여 수용성 단백질만을 추출하였다.
본 발명의 항원 제조방법에 따르면 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항원의 제조방법에 이용되는 특이적인 프라이머들을 제공한다. 본 발명의 항원 제조방법에 제조된 항원은 전체 균체의 항원에 비하여 선택적으로 프로피오니박테리움 아크네스에 대항하여 작용할 수 있는 특이적인 항체를 생산케할 수 있다. 또한, 프로피오니박테리움 아크네스에서 원하는 단백질만을 추출하여 항원으로 사용할 경우의 정제에 상당한 비용과 시간이 요구된다는 종래 기술의 단점을 극복한 것이다.
본 발명의 항원 제조방법에 의해 제조된 항원을 조류의 면역화에 사용함으로써 여드름의 원인균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스 균에 대항하는 항체를 조류의 난황을 통하여 용이하게 얻을 수 있다. 즉, 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항체를 난황에 포함하는 여드름 예방 및 치료 효과를 갖는 조류의 알을 제공한다. 아울러, 본 발명은 상기 난황을 포함하는 여드름 치료 및 예방의 작용을 갖는 기능성 식품을 제공한다.
Claims (9)
- 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원을 대량으로 제조하는 방법으로, 상기 방법은(a) 프로피오니박테리움 아크네스의 게놈성 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여, 리파제, dnaK, groEL 및 hyase로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항원 단백질을 코드화하는 유전자를 선택적으로 분리하는 단계;(b) 분리된 유전자를 적절한 벡터에 삽입하여 이 벡터로 적절한 대장균 균주를 형질전환하여 이 벡터를 증폭하여 벡터 DNA를 추출하는 단계;(c) 추출된 벡터 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 상기 항원 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 단계;(d) 증폭된 유전자를 적절한 벡터에 클로닝하여 이 벡터로 적절한 숙주를 형질전환하는 단계;(e) 숙주를 배양하여 항원 단백질을 과발현시키서 추출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 PCR에서 사용되는 프라이머는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 8중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 단게 (c)의 PCR에서 사용되는 프라이머는 SEQ ID NO. 9 내지 SEQ ID NO. 16중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 벡터는 pEZ-T 벡터이고, 대장균 균주는E. coliJM 109균주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 벡터는 pEZ-28b 벡터이고, 숙주는 BL212(DE3)pLys 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 억제하기 위한 항체를 생산하는데 사용되는 특이적 항원.
- 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알을 제조하는 방법으로, 상기 방법은 제 6항에 따른 항원을 조류에 면역주사함에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항의 방법에 의해 제조된 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체를 함유하는 조류의 알.
- 제 8항에 따른 조류의 알의 난황을 포함하는 여드름의 예방 및 치료 작용을 갖는 기능성 식품.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020010059730A KR20030026653A (ko) | 2001-09-26 | 2001-09-26 | 프로피오니박테리움 아크네스의 활성을 저해하는 항체의생산용 항원 및 그의 제조방법과 이용 |
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| KR (1) | KR20030026653A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102084163B1 (ko) * | 2019-12-27 | 2020-05-15 | 주식회사 인투앱 | 프로피오니박테리움 아크네스 균으로부터 유래한 지방산 분해 효소에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 용도 |
-
2001
- 2001-09-26 KR KR1020010059730A patent/KR20030026653A/ko not_active Application Discontinuation
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