KR20020092913A - 신규 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 유전자 - Google Patents

Abstract

서열번호 : 2, 4 또는 6 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 DNA, 그리고 그 폴리펩티드에 대한 항체, 또한 이들의 사용. 상기 아미노산 서열은 연골세포의 증식·분화의 조절 및 혈관신생 저해작용을 갖는 콘드로모듈린-Ⅰ에 대하여 상동성을 갖는다.

Description

신규 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 유전자{NOVEL POLYPEPTIDES AND GENES ENCODING THE SAME}

포유류의 대부분의 뼈는 연골세포의 증식, 분화를 거쳐 석회화가 일어나 마지막에는 뼈로 치환되는 소위 「내연골 골화」라는 구조에 의해 만들어진다. 이 일련의 과정에는 여러 가지 호르몬이나 성장인자가 관여하고 있으며, 인슐린양 증식인자(IGF1, IGF2), 선유아세포 증식인자(FGF), 암세포 증식인자(TGF), 성장호르몬 등이 알려져 있다. 히라키 등은, 상기 호르몬이나 성장인자 외에 연골세포의 증식, 분화기능을 촉진하는 인자로서 ChM-I 유전자를 단리하였다 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 175, 971-977, 1991, 유럽공개특허 제 473080호). 인간 ChM-I 는 334 아미노산 잔기로 이루어지는 Ⅱ 형 막단백질로서 합성되어 당쇄 수식된 후, 프로세싱을 받아 120 아미노산 잔기로 구성되는 C 말단 부분이 세포 외부로 분비된다 (Hiraki et al, Eur. J. Biochem. 260, 869-878, 1999). ChM-I은 배양 연골세포의 증식을 촉진할 뿐만 아니라 단백질글리칸 합성, 아가로스 중에서의 연골세포의 콜로니 형성을 강하게 촉진한다 (Inoue et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 241, 395-400, 1997). 또한, ChM-I 는 연골뿐만 아니라 골아세포의 증식도 촉진한다 (Mori et al, FEBS Letters, 406 310-314, 1997).

한편, 연골은 무혈관 조직일 뿐만 아니라 혈관 침입에 대하여 저항성을 나타내는 것은 오래 전부터 지적되어 왔다. 히라키 등은 연골조직 추출물로부터 혈관 내피세포에 대한 증식 억제 인자의 정제를 시도하여, 그 완전정제에 성공하였다. 그 결과, 이것이 ChM-I 라는 것이 판명되었다 (Hiraki et al, FEBS Letter, 415, 321-324, 1997, Hiraki et al, J. Biol. Chem., 272, 32419-32426, 1997). 연골조직은 통상 무혈관으로 유지되어 있는 것이 특징이지만, 뼈조직으로 치환하기 위해서는 연골조직에 대한 혈관 침입이 필요하다고 생각되고 있다. 1차 골화 중심의 형성을 준비하는 혈관 침입에 앞서, 예정 혈관 침입 영역에서는 연골세포의 비대화와 연골기질의 석회화가 발생한다. ChM-I 는 비대화 연골과 이것에 이어지는 석회화 연골의 출현 영역에서 극적으로 발현이 소실된다. 즉, ChM-I 유전자의 발현은 연골 특이적이지만, 혈관 침입에 저항성을 나타내는 무혈관 연골에 국한되게 된다. 이미 서술한 바와 같이, ChM-I 는 연골의 증식과 분화성숙을 촉진할 뿐만 아니라 혈관 내피세포의 증식저해에 의해 혈관 침입을 억제하는 것은 아닌가 생각된다. 따라서, 무혈관 연골에서의 발현과 혈관 침입에 앞선 석회화층에서의 발현소실은 ChM-I 의 bifunctional 인 작용과 잘 일치하고 있다.

또한, 연골조직에는 강력한 혈관신생 촉진인자인 bFGF 가 세포주변부 (pericellular space) 에 다량 축적되어 있지만, ChM-I 는 bFGF 를 둘러싸도록 하여 영역사이부 (interterritorial space) 에 존재하는 것이 밝혀져 있다 (Hiraki et al, J. Biol. Chem., 272, 32419-32426, 1997). 즉, 무혈관 연골에서는 ChM-I 가 혈관신생 촉진인자를 마스크하는 형태로 존재하고 있어, ChM-I 의 혈관신생 저해작용은 연골에 혈관이 존재하지 않음을 설명할 수 있는 것이라고 생각되고 있다 (단백질 핵산 효소 Vol.40 No.5. 1995). 또, ChM-I 는 생체내에서 인간 종양 세포에 대한 혈관 침입을 저해하여 암 세포의 증식을 억제하는 것이 확인되어 있다 (Hayami et al, FEBS Letters, 458, 436-440, 1999). 마우스의 각 조직에 있어서의 ChM-I 의 mRNA 발현해석으로부터 ChM-I 는 연골 이외에도 눈과 흉선에서 발현하고 있다는 것이 밝혀졌으나, 이들 조직에서의 ChM-I 의 기능에 관해서는 아직 알려지지 않았다 (Shukunami et al, Int. J. Dev. Biol. 43, 39-49, 1999).

골절의 치유, 각종 연골질환의 치유과정에는 연골세포의 증식, 분화기능의 발현이 중요하다. 따라서, 연골세포의 증식과 분화를 촉진하는 인자인 ChM-I 는 연골세포 증식제로서의 응용이 기대되고 있다 (일본 공개특허공보 평7-138295호). 암 세포의 증식, 전이에 있어서는, 에너지 획득을 위해 조직 내에 대한 혈관 침입이 필수적이다. 따라서, 혈관신생 저해작용을 갖는 ChM-I 는 항종양제로서의 응용도 기대되고 있다 (일본 공개특허공보 평7-138295호). 이상과 같이, ChM-I 는 연골세포의 증식·분화를 제어함과 동시에 혈관신생 저해작용도 갖는 분자이며, 그 기능으로 인해 의약품으로의 응용이 기대되고 있다.

최근 바이오테크놀로지는 급속한 진보를 계속하고 있고, 인간 게놈 프로젝트의 진행과도 관련되어 대량의 신규 유전자가 클로닝되고 있다. 인간 유전자는 약 10 만 개 존재하는 것으로 알려져 있는데, 그 중에는 아미노산 서열에 상동성이 인정되는 분자군이 패밀리를 형성하고 있는 경우가 있다. 아미노산 서열에 상동성이 인정되는 분자군으로는, TNF 패밀리, TNF 수용체 패밀리, 케모카인 및 G-단백질 커플링된 수용체 등 다종의 유전자 패밀리가 존재한다고 알려져 있다. 예컨대, TNF 패밀리에 속하는 분자로는 종양 괴사 인자 α(TNFα, Pennica et al, Nature 312, 724, 1984), Fas 리간드 (FasL, Suda et al, Cell 75, 1167, 1993), TNF-관련 세포소멸-유도 리간드 (TRAIL, Steven et al, Immunity 3, 673, 1995) 및 B 림프구 자극자 (BLYS, Moore et al, Science 285, 260-263, 1999) 등 약 20 종류 존재한다고 알려져 있다.

TNF 패밀리에 속하는 분자는 Ⅱ 형 막단백질이고, 세포외 영역에 아미노산 서열상의 상동성이 인정된다. 이들 분자는 아미노산 서열에 상동성이 인정되지만, 각각의 분자는 고유 기능을 가진다고 밝혀져 있으며, 여러 가지 질환에 대하여 의약품으로서의 적용이 시도되고 있다. 또, TNF 패밀리의 분자에는 각각 고유 수용체가 존재한다고 밝혀져 있고, 이들 수용체도 의약품으로서의 적용이 시도되고 있으며, 실제로 의약품으로서 인가(認可)된 것도 존재한다 (예 : 가용성 TNF 수용체, Immunex 사). 또한, 이들 분자에 대한 항체도 의약품으로서의 연구개발이 진행되고 있어, 실제로 의약품으로서 승인된 것도 존재한다 (예 : 항 TNFα항체, Centocore 사). 아미노산 서열에 상동성이 인정되는 분자를 의약품 개발에 응용한 예로서, TNF 패밀리 및 TNF 수용체 패밀리를 상기에 예로 나타내었다. 이들 분자를 의약품에 응용가능하게 한 배경에는, 각 분자의 기능해석이 실시되어 그 유사성과 차이가 밝혀진 것을 들 수 있다.

또, TNF 패밀리의 분자는 Ⅱ 형 막단백질 구조를 갖는 분자이고, 주로 혈액계, 림프계의 세포에 발현되고 있는 것이 많으므로, 실험수법이나 재료면에서는 공유할 수 있는 부분이 많다. 따라서, TNF 패밀리에 속하는 신규 유전자가 발견된 경우에는, 그 기능해석의 속도는 초기에 발견된 분자보다도 가속된 것이라 생각된다. 이와 같이, 아미노산 서열에 상동성을 갖는 신규 유전자를 발견하여 그 기능해석을 실시하는 것은, 향후 발견될 신규 유전자의 기능해석에 일조할 뿐만 아니라 그 해석결과에 의해 이미 알려진 분자와 비교할 수 있기 때문에, 이미 알려진 분자의 기능에 관해서도 보다 상세한 지견을 얻을 수 있다고 생각된다.

일반적으로, 이미 알려진 분자와 아미노산 서열에 상동성이 인정되는 단백질을 코드하는 신규 유전자를 클로닝한 경우에는, 기능해석에 사용하는 기술이나 재료는 이미 알려진 분자의 예를 참고로 할 수 있다. 그러나, 아미노산 서열에 상동성이 인정되는 분자라 해도 상기 TNF 패밀리와 같이 각각의 분자는 고유의 기능을 갖고 있다고 생각되므로, 의약품에 대한 응용을 고려한 경우에는 재조합 단백질의 발현과 정제, 항체의 제작, 각종 조직에서의 mRNA 및 단백질의 발현 등을 명확히 하여, 이미 알려진 분자와의 구조 및 기능면에서의 차이를 밝힐 필요가 있다.

발명의 개시

따라서, 본 발명은 ChM-I 과 유사한 새로운 폴리펩티드 및 그것을 코드하는유전자를 제공하는 것을 목적으로 하고 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 그 폴리펩티드에 대한 항체의 제작, 각종 조직에서의 그 유전자 및 폴리펩티드의 발현 레벨 해석, 재조합 단백질의 발현 및 구조 해석 등을 실시하여 ChM-I 와의 유사성과 차이를 분명히 함과 동시에 기능을 해명하여 이들이 관여하는 질환의 병태해명이나 진단, 치료 등을 가능하게 하는 것을 목적으로 하고 있다.

ChM-I 는, 연골세포의 증식·분화를 조절하여 혈관신생 저해작용을 갖는 Ⅱ 형 막단백질이며, 의약품에 대한 응용이 기대되고 있는 분자이다. 따라서, ChM-I 과 유사한 새로운 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 제공할 수 있으면, 그 각종 세포에서의 발현레벨이나 구조 및 기능을 해석할 수 있고, 또한 그 발현물의 해석 등에 의해 이들이 관여하는 질환의 병태해명이나 진단, 치료 등이 가능해진다고 생각된다. 그러나, 현시점에서 ChM-I 의 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 분자가 보고된 바는 없고, ChM-I 가 유전자 패밀리를 구성하고 있는지의 여부는 불분명하다. 따라서, ChM-I 과 유사한 새로운 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 유전자의 존재가 분명해지면, 그 구조 및 기능 등의 해석에 의해 ChM-I 와의 유사성 및 상이성을 검토하는 것이 가능해져, 서로의 분자의 생리적인 기능의 해명 및 이들 분자가 관여하는 병태의 해명, 진단 및 치료약의 개발 등을 가속하는 것도 기대된다.

본 발명자들은 상기 목적으로 예의연구를 거듭한 결과, 인간, 마우스 및 랫트 cDNA 라이브러리로부터 새롭게 상기 목적에 합치되는 유전자 (ChM1L 유전자) 를 단리하는 것에 성공하여, 그 각 조직에서의 발현레벨의 해석, 그 폴리펩티드에 대한 항체의 제작, 그 유전자가 코드하는 폴리펩티드의 포유동물 세포에서의 발현, 검출 및 정제 등을 실시하여 그 폴리펩티드가 혈관신생 저해작용을 갖는다는 것을 밝혀, 여기에 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 서열번호 2, 4 및 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자이다. 상기 유전자로는, 예컨대 서열번호 1, 3 및 5 로 표시되는 염기 서열을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2, 4 및 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 인간, 마우스 및 랫트 유전자가 코드하는 폴리펩티드이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자의 적어도 일부와 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합체 DNA 이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합체 DNA 에 의해 형질전환된 형질전환체이다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 얻을 수 있는 배양물로부터 본 발명 유전자가 코드하는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드의 제조방법이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드로 면역된 항체생성세포와 미에로마 세포를 융합시킴으로써 얻을 수 있는 상기 모노크로날 항체를 생성하는 하이브리도머이다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 유전자의 검출시약이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드 및 상기 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체를 포함하는 진단 키트이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2, 4 또는 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 유전자가 코드하는 폴리펩티드로 이루어지는 의약조성물이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 모노크로날 항체 또는 폴리크로날 항체로 이루어지는 의약조성물이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자의 일부와 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 의약조성물이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자의 적어도 일부를 포함하는, 유전자 치료에 이용할 수 있는 핵산으로 이루어지는 의약조성물이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 세포막 결합형인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드이다.

또한, 본 발명은 상기 세포막 결합형 폴리펩티드를 코드하는 유전자이다.

또한, 본 발명은 상기 인간 유전자가 X 염색체에 존재하는 것을 특징으로 하는 유전자이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 혈관신생 저해작용을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드이다.

또한, 본 발명은 상기 혈관신생 저해작용을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자이다.

본 발명은 연골세포의 증식·분화를 조절하여 혈관신생 저해작용을 갖는다고 알려져 있는 콘드로모듈린-I(ChM-I) 과 아미노산 서열에 상동성이 인정되는 신규의 인간, 마우스 및 랫트 폴리펩티드, 그리고 그것을 코드하는 인간, 마우스 및 랫트 유전자 (이하, 「ChM1L 유전자」로 약기하기도 한다) 에 관한 것이다.

도 1A 는 인간 ChM1L 과 인간 ChM-I 의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸다.

도 1B 는 인간, 마우스 및 랫트 ChM1L 의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸다.

도 2 는 인간 ChM-I, 인간 ChM1L 및 마우스 ChM1L 의 아미노산 서열의 소수성 프로필을 나타낸다.

도 3 은 마우스의 성체 및 태아의 각 조직에서의 ChM1L mRNA 의 발현해석, 및 마우스의 태아 발생단계에서의 ChM1L 및 ChM-I mRNA 발현해석의 결과를 나타낸다.

도 4 는 COS7 세포에 있어서 인간 및 마우스 ChM1L 단백질을 발현시켜 웨스턴 블로팅에 의해 검출한 결과를 나타낸다. (a) 는 Mock(레인 1), 인간 ChM1L(레인 2) 및 마우스 ChM1L(레인 3) 을 트랜스펙트하여 세포성분을 전기영동한 후 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색한 결과를, (c) 는 같은 샘플을 항 ChM1L 펩티드 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출한 결과를 나타낸다. (b) 는 Mock(레인 1), 인간 ChM1L (His 태그 첨부)(레인 2) 및 마우스 ChM1L (His 태그 첨부)(레인 3) 을 트랜스펙트하여 세포성분을 전기영동한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 염색한 결과를, (d) 는 같은 샘플을 항 His 태그 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출한 결과를 나타낸다.

도 5 는 COS7 세포에 있어서 발현시킨 가용성 ChM1L(레인 2) 및 Mock(레인1) 을 항 FLAG M2 항체를 사용한 웨스턴 블로팅법에 의해 검출한 결과를 나타낸다.

도 6 는 COS7 세포에 있어서 마우스 ChM1L (His 태그 첨부) 단백질을 발현시키고 세포성분을 회수하여 당쇄 소화반응을 한 후, 항 His 태그 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 ChM1L 단백질을 검출하여 당쇄 구조를 해석한 결과를 나타낸다. 레인 1 은 미처리, 레인 2 은 NANase Ⅱ + O-글리코시다제 DS + PNGase 처리, 레인 3 은 NANase Ⅱ 처리, 레인 4 은 O-글리코시아제 DS 처리, 레인 5 는 PNGase 처리한 샘플의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸다.

도 7 은 마우스의 늑연골 조직에서의 ChM1L 단백질의 발현을 항 ChM1L 폴리펩티드 항체를 사용한 면역염색에 의해 검출한 결과를 나타낸다.

도 8 은 COS7 세포의 배양액 중에 발현시킨 가용성 인간 ChM1L 단백질을 항 FLAG M2 친화 겔을 사용한 친화 크로마토그래피에 의해 정제하고 전기영동한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 염색한 결과를 나타낸다. 레인 1 은 COS7 세포의 배양 상청, 레인 2 는 정제한 ChM1L 단백질의 전기영동 결과를 나타낸다.

도 9 는 인간 제대정맥 내피세포의 관강 모양 구조의 형성계에, (a) 버퍼만, (b) BSA (bovine serum albumin) 20㎍, (c) 가용성 인간 ChM1L 1O㎍, (d) 가용성 인간 ChM1L 20㎍, (e) PF-4 (platelet factor 4) 1㎍, (f) PF-4 10㎍ 을 처리한 결과를 나타낸다.

발명의 실시형태

본 발명에 있어서, 「실질적으로 포함한다」는 것은, 본 발명의 유전자 또는 폴리펩티드는 그 기능을 갖는 한 서열번호 1, 3 또는 5 로 표시되는 염기 서열, 또는 서열번호 2, 4 또는 6 으로 표시되는 아미노산 서열로 치환, 삽입 또는 결실 등의 변이가 생겨도 된다는 것을 의미한다.

본 발명의 ChM1L 유전자 서열은 RACE (RACE : Rapid amplification of cDNA ends ; Frohman, M. A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988) 법에 의해 취득할 수 있으나, 그 개요를 서술하면 다음과 같다.

일반적으로 RACE 법은, cDNA 의 일부 서열이 이미 알려진 경우, 이것을 기초로 완전길이 cDNA 를 효율적으로 취득하는 방법이다. 이미 알려진 서열 영역에서 3' 말단 또는 5' 말단 각각의 방향으로 신장할 수 있도록 프라이머를 제작하여, PCR (Polymerase Chain Reaction, Science, 230, 1350-1354, 1985) 법에 의해 cDNA 를 증폭한다. PCR 법을 실시할 때에는, 이미 알려진 영역에서는 특이적으로 어닐링하는 프라이머, 3' 말단 및 5' 말단에서는 결찰 반응 등에 의해 부가한 서열로 어닐링하는 프라이머를 사용한다. 따라서, PCR 법에 의해 증폭시킨 영역은 서열이 아직 알려지지 않은 영역을 포함하고 있다. 증폭시킨 DNA 단편의 단리·정제는 후술하는 실시예에서도 서술하는 바와 같이 통상의 방법에 따를 수 있으며, 예컨대 겔 전기영동 등에 의하면 된다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 단편 등의 염기 서열의 결정도 통상의 방법에 따를 수 있으며, 예컨대 디데옥시법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977) 이나 맥섬-길버트법 (Methods in Enzymology, 65, 499, 1980) 등에 의해 행할 수 있다. 이러한 염기 서열의 결정은 시판하는 서열 키트 등을 사용해도 용이하게 행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명에서의 후술할 실시예 2 에서 상세하게 서술하겠으나, 개략적인 것은 이하와 같다. 인간 ChM-1 의 아미노산 서열을 사용하여 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ : DNA data bank of Japan) 에 있어서, EST 데이터 베이스 (dbEST, EST : Expressed sequence tag) 로 TBLASTN 서치를 실시하여 EST 파일, Genbank 승인 번호 제 AI123839 호를 검출하였다. AI123839 는 dbEST 에 등록된 염기 서열 단편이지만, 상기한 TBLASTN 서치에 의해 비로소 ChM-I 과 유사한 아미노산 서열을 코드하는 신규 유전자 단편인 것이 밝혀졌다. 그래서, 이 dbEST 에서 얻은 cDNA 의 일부 서열로부터 프라이머를 합성하고, RACE 법을 사용하여 인간 ChM1L 유전자의 서열을 결정하기에 이르렀다. 그 후, 마찬가지로 마우스 및 랫트 ChM1L 유전자의 서열을 결정하였다. 인간, 마우스 및 랫트 ChM1L 유전자의 서열을 서열번호 1, 3 및 5 로, 그것이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 서열번호 2, 4 및 6 으로 나타낸다.

본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드는 317 아미노산으로 구성된다 (서열번호 2, 4 및 6). ChM1L 의 아미노산 서열은 ChM-I 와 상동성을 갖지만, 특히 ChM-I 의 프로세싱을 받아 세포 외부로 분비되는 C 말단 부분과 매우 높은 상동성을 갖는다 (도 1(a)). 또한, ChM1L 의 아미노산 서열은 인간, 마우스및 랫트 사이에서 매우 높은 상동성을 갖는다 (도 1(b)). 아미노산 서열의 소수성도의 해석으로부터, ChM1L 은 ChM-I 와 마찬가지로 Ⅱ 형 막단백 구조를 갖는 분자라고 생각된다 (도 2). 도 2 에 나타낸 바와 같이, 그 폴리펩티드 및 ChM-I 는 모두 막결합성을 갖는 분자에 특징적으로 인정되는 약 20 아미노산으로 이루어지는 소수성 도메인이 N 말단에서 수십 아미노산 부근에 존재한다. 그 폴리펩티드가 Ⅱ 형 막단백 구조를 갖는 분자인 것은 그 폴리펩티드를 COS7 세포에 발현시킨 실시예 8 의 결과로부터도 분명하다 (도 4).

본 발명의 인간 ChM1L 유전자는, 후술할 실시예 12 에서 서술하는 바와 같이 인간 X 염색체에 존재한다는 것이 밝혀졌다 (Genbank 승인 번호 제 AL035608 호).

본 발명의 ChM1L 유전자는, cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR 에 의해 단리된 DNA, 게놈 DNA 및 그들의 조합이 있다. 그 게놈 DNA 는 표준적인 기법을 사용하여 본 명세서 중에 개시된 ChM1L 유전자에 대한 하이브리드 형성에 의해서도 단리할 수 있다. 그 ChM1L 유전자로부터 전사된 RNA 도 역시 본 발명에 의해 포함된다. 서열번호 1, 3 및 5 로 표시되는 본 발명 유전자의 서열은 이것에 의해 코드되는 각 아미노산 잔기를 나타내는 코돈의 한 조합예이며, 본 발명의 ChM1L 유전자는 이것에 한정되지 않고 각 아미노산 잔기에 대하여 임의의 코돈을 조합하여 선택한 DNA 서열을 갖는 것도 물론 가능하다. 그 코돈의 선택은 통상의 방법에 따를 수 있으며, 예컨대 이용할 숙주의 코돈 사용빈도를 고려할 수 있다 (Nucleic Acids Research, 9, 43-74, 1981).

그리고 본 발명의 ChM1L 유전자에는 서열번호 2, 4 및 6 으로 표시되는 아미노산 서열의 일부가 치환, 결실, 부가된 변이체를 코드하는 DNA 서열도 역시 포함된다. 이들 폴리펩티드의 제조, 개변(변이) 등은 천연적으로 발생하는 경우도 있으며, 또한 번역후의 수식에 의해, 또는 유전자공학적 수법에 의해, 예컨대 사이토 스페시픽 뮤타제네시스 (Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382, 1987 ; 동 100, 468, 1983 ; Nucleic Acids Research, 12, 9441, 1984 ; 속 생화학실험강좌 1「유전자 연구법 Ⅱ」, 일본생화학회편, 105, 1986) 등의 방법에 의해 수득할 수 있다.

본 발명의 ChM1L 유전자의 제조는, 본 발명의 ChM1L 유전자의 서열정보에 기초하여 일반적 유전자공학적 수법에 의해 용이하게 실시할 수 있다 (Moleculer Cloning 2nd ED, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ; 속 생화학실험강좌 「유전자연구법 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ」, 일본생화학회편, 1986 등 참조).

이것은, 예컨대 cDNA 라이브러리 (ChM1L 유전자가 발현되는 적당한 기원세포로부터 통상의 방법에 따라 조제된 것) 로부터 본 발명 유전자에 특유한 적당한 프로브나 항체를 사용하여 원하는 클론을 선택함으로써 실시할 수 있다 (proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6613, 1981 ; Science, 222, 778, 1983 등).

상기 방법에 있어서, 기원세포로는 ChM1L 유전자를 발현하는 각종 세포, 조직이나 이들에 연유하는 배양세포 등이 예시되고, 이들로부터의 전체 RNA 의 분리, mRNA 의 분리나 정제, cDNA 로의 변환 (합성) 과 그 클로닝 등은 모두 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 또한, cDNA 라이브러리는 시판도 되고 있어 본 발명에서는 그들 cDNA 라이브러리, 예컨대 클론테크사가 시판하는 각종 cDNA 라이브러리 등을 사용할 수도 있다.

cDNA 라이브러리로부터의 본 발명 ChM1L 유전자의 스크리닝은 상기 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 그 스크리닝 방법으로는, 예컨대 cDNA 가 생성하는 폴리펩티드에 대하여 본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드에 대한 특이적 항체를 사용한 면역적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선택하는 방법,원하는 염기 서열에 선택적으로 결합하는 프로브를 사용한 플라크 하이브리다이제이션, 콜로니 하이브리다이제이션 등이나 이들의 조합을 예시할 수 있다. 여기에서 사용되는 프로브로는, 본 발명의 ChM1L 유전자의 DNA 서열에 관한 정보를 기초로 하여 화학합성된 DNA 서열, 이미 취득된 본 발명의 ChM1L 유전자나 그 단편을 이러한 프로브로서 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 ChM1L 유전자의 취득에 있어서는, PCR 법에 의한 DNA/RNA 증폭법을 바람직하게 이용할 수 있다. 이러한 PCR 법을 채용할 때 사용되는 프라이머는, 이미 본 발명에 의해 밝혀진 본 발명의 ChM1L 유전자의 서열정보에 기초하여 적당히 설정할 수 있으며, 이것은 통상의 방법에 따라 합성할 수 있다.

보다 구체적으로는, 실시예 2 에서 상세하게 서술하겠지만 개략적인 것은 이하와 같다. ChM1L 유전자의 코드 서열을 포함하도록 프라이머를 합성하고, 이것을 사용하여 PCR 법에 의해 ChM1L 유전자를 증폭한다. 그 후, 아가로스 전기영동을 행하여 원하는 밴드를 잘라낸 후 DNA 를 정제한다. 정제한 DNA 와 플라스미드 벡터를 결찰 반응시켜 대장균으로 형질전환을 행한다. 그 후, 대장균 배양액으로부터 플라스미드를 정제하고, DNA 시퀀서에 의해 원하는 서열이 도입된 것을 확인한다. 이렇게 하여 클로닝된 ChM1L 유전자는 적절한 제한효소를 사용함으로써 다른 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터로 옮겨 바꾸는 것이 가능하다.

이렇게 하여 얻어진 ChM1L 유전자 (cDNA 및 게놈 DNA) 를 이용하면, 통상의 방법에 따라 ChM1L 유전자의 발현이 증가, 감약 및 소실된 유전자개변 동물을 작성하는 것이 가능하다.

본 발명의 ChM1L 유전자의 서열정보를 기초로 하면, 그 유전자의 일부 또는 전부의 염기서열을 이용함으로써 각종 조직에서의 본 발명의 ChM1L 유전자의 발현을 검출할 수 있다. 이것은 통상의 방법에 따라 행할 수 있고, 예컨대 RT-PCR (Reverse transcribed-polymerase chain reaction ; Kawasaki, E.S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27, 1989) 법, 노던 블로팅 해석 (Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 등에 의해 모두 양호하게 실시할 수 있다. RT-PCR 법의 프라이머 및 노던 블로팅 해석의 프로브는 ChM1L 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 서열인 한 아무런 제한은 없고, 이러한 서열은 본 발명의 ChM1L 유전자의 염기 서열에 의해 적당히 설정하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 ChM1L 유전자의 검출에 유용한 프라이머 및/또는 프로브를 제공하는 것이다. 또한 그 프로브는 서던 블로팅 해석에 의한 게놈 DNA 의 검출에도 이용 가능하다.

ChM1L mRNA 의 발현을 검출하는 수단으로는, 실시예 6 에서 서술하는 RT-PCR 법을 예시할 수 있다. 상세한 것은 실시예 6 에서 서술하겠지만 개략적인 것은 이하와 같다.

각 조직을 적출하여 RNA 를 추출한 후 역전사반응에 의해 cDNA 를 합성한다. 이 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 반응을 하고, 얻어진 반응액을 아가로스 겔로 전기영동하여 자외선조사 하에서 밴드를 관찰함으로써, 각 조직에서의 ChM1L 유전자의 발현량을 검출하였다. 그 결과, 성체 마우스의 각 조직에 있어서의 ChM1L mRNA의 발현은 뇌, 안구, 골격근, 전체 늑골 (whole rib) 및 갑상선에서 인정되었다 (도 3(a)). 한편, 마우스에서의 ChM-I mRNA 의 발현은 안구, 흉선, 연골 및 전체 늑골에서 확인되고 있다 (Shukunami et al, Int. J. Dev. Biol 43, 39-49, 1999). 따라서, ChM1L 과 ChM-I 는 생체 내에서 다른 조직에 발현하고 있는 것이 분명해져, 그 생리적인 기능은 다르다고 생각되었다. ChM1L 은, ChM-I 에서는 발현이 확인되고 있지 않는 조직인 뇌, 골격근 및 갑상선에서 발현이 인정되었다.

또, ChM-I 에서도 발현이 인정되고 있는 조직이고 혈관 침입에 대하여 저항성이 있는 조직인 안구 및 연골을 포함하는 전체 늑골에서 발현하고 있기 때문에 ChM1L 은 혈관신생에 관여하고 있다고 생각된다. 이들 결과로부터, ChM1L 은 알츠하이머병 등 뇌가 관련된 질환, 근육 디스트로피 등 골격근이 관련된 질환, 바세도우씨병 등 갑상선이 관련된 질환, 당뇨병성 망막증 등 안구가 관련된 질환, 변형성 관절증이나 류머티스성 질환 등 연골조직이 관련된 질환 및 암을 포함하는 혈관신생이 관련된 질환에 관여하고 있다고 생각된다.

따라서, 본 발명의 ChM1L 유전자, ChM1L 폴리펩티드, ChM1L 에 결합하는 항체를 포함하는 ChM1L 에 대한 길항제 및 작용제, ChM1L 유전자의 발현을 촉진 또는 감약시키는 물질 등을 이들 질환의 치료약으로서 적용할 수 있다고 생각된다. 그리고, 여기에서 든 작용제나 길항제 등의 물질은 펩티드, 단백질 및 저분자 화합물 등을 생각할 수 있으며, 그 기능을 갖는 한 물질의 성상에 제한은 없는 것으로 한다.

태아의 각 조직에서 ChM1L mRNA 의 발현은 안구, 신장, 위, 전체 늑골 및 기관에서 인정되었다 (도 3(b)). 성체 마우스에서는 신장 및 위에서의 ChM1L mRNA 의 발현은 인정되고 있지 않지만, 태아에서 이들 조직에 ChM1L mRNA 가 발현되고 있는 것은 이들 장기의 발생·형태 형성에 ChM1L 이 관여하고 있다는 것을 나타내고 있는 것이라 생각된다. 따라서, ChM1L 은 성체에서도 이들 장기의 수복이나 재생에도 관여하고 있다고 생각된다. 또한, 기관에서도 ChM1L mRNA 가 발현하고 있는 것이 분명해졌다. 따라서, 본 발명의 ChM1L 유전자, ChM1L 폴리펩티드, ChM1L 에 결합하는 항체를 포함하는 ChM1L 에 대한 길항제 및 작용제, ChM1L 유전자의 발현을 촉진 또는 감약시키는 물질 등을 만성신부전 등 신장이 관련된 질환, 위암이나 위궤양 등 위가 관련된 질환 및 만성기관지염이나 천식 등 기관이 관련된 호흡기계 질환에 대한 치료약으로서 적용할 수 있다고 생각된다.

태아 발생단계에서 ChM1L mRNA 의 발현은, 임신 1O일째에서는 대단히 약하고 11일째에서 13일째에 걸쳐 발현이 상승하고 있다 (도 3(c)). 한편, ChM-I 도 ChM1L 과 마찬가지로 태아의 발생과 함께 발현이 상승하지만, 임신 1O일째 및 11일째에서는 확실히 ChM1L 보다도 강한 발현을 나타내었다. 따라서, 태아 발생단계에서 ChM1L 은 ChM-I 보다도 늦게 발현이 상승한다는 것이 밝혀져, 양분자가 태아 발생에 있어서 상이한 기능을 갖는다는 것이 분명해졌다. 또, 태아 발생단계에서 ChM1L 의 발현이 상승하는 것은, ChM1L 이 장기나 골격의 형성에 깊이 관여하고 있는 것을 나타내고 있다. 따라서, 본 발명의 ChM1L 유전자, ChM1L 폴리펩티드, ChM1L 에 결합하는 항체를 포함하는 ChM1L 에 대한 길항제 및 작용제,ChM1L 유전자의 발현을 촉진 또는 감약시키는 물질 등은 장기의 불충분한 발달에 의한 선천성 질환이나 후천적으로 장기가 손상된 경우에 장기를 재생 및 수복시키는 약제로서 적용할 수 있다고 생각된다. 또, ChM1L 과 ChM-I 에서는 성체 및 태아의 각 조직에서의 발현, 태아 발생단계에서의 발현에 차이가 인정되므로 이들 분자 및 이들 분자를 타깃으로 한 약제를 각종 질환의 치료약으로서 적용하는 경우에는 그 용도는 상이한 경우가 있다고 생각된다.

본 발명의 ChM1L 유전자의 서열을 사용하면, 유전자공학적 수법에 의해 그 유전자가 코드하는 폴리펩티드를 제조하는 것이 가능하다.

그 폴리펩티드의 제조는, 본 발명의 ChM1L 유전자가 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 재조합체 DNA 를 제작하여 이것을 숙주세포에 도입하고 형질전환하여 그 형질전환체를 배양함으로써 행해진다.

여기서 숙주세포로는 진핵성 숙주세포 및 원핵성 숙주세포 어느 것이든 이용할 수 있다.

그 진핵성 숙주세포에는 척추동물, 효모 및 곤충세포 등이 포함된다. 척추동물 세포로는 예컨대 CHO 세포 및 COS 세포 등을 들 수 있다.

척추동물의 발현벡터로는, 통상 발현하고자 하는 유전자의 상류에 위치하는 프로모터, 폴리아데닐화 부위 및 전사종료서열 등을 보유하는 것을 사용할 수 있다. 그 발현벡터로는, 예컨대 SV40 의 초기 프로모터를 보유하는 pSV2dhfr(Mol. Cell. Bio」., 854, 1981), pcDNA3.1(+)(Invitrogen 사) 및 pCAGGS (Gene, 108, 193-200, 1991) 등을 예시할 수 있다.

진핵 세포 중에서 목적 폴리펩티드를 발현시키는 수단은 그 자체 해당 분야에서는 대부분의 계가 주지이다.

예컨대 효모 중에서 발현시키는 계로는 일본 공개특허공보 소57-159489호에 기재된 「효모 중에서의 폴리펩티드의 발현」을 들 수 있고, 곤충세포 중에서 발현시키는 계로는 일본 공개특허공보 소60-37988호에 기재된 「재조합 버큐로 바이러스 발현 벡터의 제법」을 들 수 있으며, 포유류 동물세포 중에서 발현시키는 계로는 일본 공개특허공보 평2-171198호에 기재된 「진핵성 발현의 개량」을 들 수 있지만, 물론 이들 외에도 다수 존재한다.

본 발명의 ChM1L 유전자는, 예컨대 대장균, 고초균 및 스트렙토마이세스 등의 원핵성 숙주세포 내에서도 발현할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주로서의 대장균은 Echerichia coli K12 주 등이 흔히 사용되며, 벡터로는 pBR322 및 그 개량 벡터가 흔히 사용되지만, 이들에 한정되지 않고 공지된 각종 균주 및 벡터도 이용할 수 있다. 프로모터로는 예컨대 대장균 락토스(lac), 대장균 trp 등의 프로모터를 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 또, 상기 프로모터는 모두 이미 특성화되어 있고 당업자가 숙지하고 있는 것이며, 합성적으로 또는 이미 알고 있는 플라스미드로부터 조립할 수 있는 것이다.

본 발명의 예시 DNA 서열, 플라스미드 및 바이러스에는 많은 수식이나 변경이 가능하다. 예컨대, 유전 암호의 동의성에 의해 폴리펩티드의 암호영역 전체를 통하여 뉴클레오티드를 치환할 수 있다. 그와 같은 서열은, 본 발명 ChM1L 유전자의 염기서열 또는 그것이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 추정할 수 있으며, 하기의 종래부터의 합성법에 의해 조립할 수 있다. 그와 같은 합성법은, 실질상 이타쿠라 등의 방법 (Itakura et al, Science 198, 1059, 1977) 및 크레아 등의 방법 (Crea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765, 1978) 에 따라 행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 예시한 염기서열, 플라스미드 및 바이러스에 특별히 한정되는 것은 아니다.

이렇게 하여 얻을 수 있는 원하는 본 발명의 제조합체 DNA 의 숙주세포에 대한 도입방법 및 이것에 의한 형질전환방법으로는 일반적인 각종 방법을 채용할 수 있다. 또, 얻을 수 있는 형질전환체는 통상의 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드가 생산된다. 그 배양에 사용되는 배지로는, 채용한 숙주세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적당히 선택할 수 있으며, 그 배양도 숙주세포의 육성에 알맞는 조건하에서 실시할 수 있다.

상기한 것에 의해, 형질전환체의 세포내, 세포외 또는 세포막상에 그 폴리펩티드가 생산된다. 그 폴리펩티드는, 원하는 바에 따라 그 물리학적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리조작 [「생화학데이터북 Ⅱ」, 1175-1259 페이지, 제 1 판 제 1 쇄, 1980년 6월 23일 주식회사 동경화학동인 발행 ; Biochemistry, 25(25), 8274-8277(1986) ; Eur. J. Biochem., 163, 313-321(1987) 등 참조] 에 의해 분리, 정제할 수 있다. 그 방법으로는, 구체적으로는 예컨대 통상의 재구성처리, 폴리펩티드 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 침투압 쇼크법, 초음파 파쇄, 한외 여과, 겔 여과, 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다. 또, 그 폴리펩티드에 친화 태그를 융합한 단백질을 발현시키면, 이 태그를 이용하여 친화 정제를 실시하는 것이 가능하다. 여기서 말하는 친화 태그란, 예컨대 폴리히스티딘 태그 (His 태그, Sisk et al, J., Virol. 68, 766, 1994) 및 FLAG 태그 (Hopp et al, Biotechnology 6, 1204-1210, 1988) 를 들 수 있다. 이들 친화 태그를 융합한 ChM1L 폴리펩티드의 발현 및 검출은 실시예 8 및 9 에서 서술한 바와 같이 실시하는 것이 가능하고, 이들 태그를 사용하여 ChM1L 폴리펩티드를 정제하는 것도 실시할 수 있다.

본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드의 제조방법은, 보다 구체적으로는 실시예 8 에서 상세하게 서술하겠지만 개략적인 것은 이하와 같다.

본 발명의 인간 및 마우스 ChM1L 유전자 및 C 말단에 His 태그가 융합한 ChM1L 단백질을 코드하는 유전자를 pcDNA3.1(+) 벡터로 클로닝하여 (실시예 4) 이것을 COS7 세포로 트랜스펙트하였다. 약 48시간 후에 배양 상청 및 세포성분을 회수하여 웨스턴 블로팅 법으로 ChM1L 재조합 단백질의 검출을 시도하였다. 그러나, 배양 상청 및 세포성분 어느 것에서도 ChM1L 단백질의 발현을 검출할 수는 없었다.

그래서, ChM1L 재조합 단백질의 발현을 검출하는 조건을 검토한 결과, 발현벡터에 pCAGGS 를 사용함으로써 COS7 세포에서의 그 폴리펩티드의 발현을 검출하는 것이 가능해졌다. 본 발명의 인간 및 마우스 ChM1L 유전자 및 C 말단에 His 태그가 융합한 ChM1L 단백질을 코드하는 유전자를 pCAGGS 벡터에 클로닝하여 (실시예4) 이것을 COS7 세포로 트랜스펙트하였다. 약 48시간 후에 배양 상청 및 세포성분을 회수하여 웨스턴 블로팅 법으로 ChM1L 재조합 단백질을 검출하였다. 배양 상청에서는 ChM1L 단백질의 발현은 확인되지 않고, 세포성분에서는 40 kDa 부근에 2개의 밴드가 검출되었다.

따라서, ChM1L 단백질은 막결합성 단백질인 것이 밝혀졌다. 한편, ChM-I 을 COS7 세포로 발현시키면 배양 상청 중에 가용성 단백질로서 분비되는 것이 확인되어 있다 (Hiraki et al, J. Biol. Chem., 272, 32419-32426, 1997). 따라서, COS7 세포에 의한 해석으로부터 ChM1L 과 ChM-I 는 상이한 구조를 갖는 단백질인 것이 분명해졌다. 즉, ChM1L 은 세포막 결합형 단백질이고, ChM-I 는 분비성 단백질이며, 양분자의 프로세싱 기구가 상이한 것이 분명해졌다. 또, ChM1L 단백질의 밴드 2개 중 고분자량측 밴드는 N 결합형 당쇄에 의해 수식된 폼인 것이 후술할 실시예 10 에 의해 분명해졌다 (도 6).

이렇게 하여 발현시킨 ChM1L 단백질은, ChM1L 특이적 항체 또는 히스티딘이 6잔기 융합한 태그 (His 태그) 등에 대한 항체 및 니켈칼럼 등을 사용하여 친화 정제하는 것이 가능하다.

본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드는, 막결합성 폴리펩티드 및 세포막 결합성을 갖지 않는 가용성 폴리펩티드일 수도 있다. 예컨대, 세포막상에 막결합성 폴리펩티드로서 발현한 후, 절단되어 가용성이 되는 경우 등을 생각할 수 있다. COS7 세포에서의 발현에서는 ChM1L 단백질은 막결합형 단백질로서 검출되었지만 (실시예 8), 숙주세포나 배양조건 등이 다르면 프로세싱을 받아 가용성단백질이 되는 경우도 있을 수 있다. 또, 막관통 영역이 없는 가용성인 이 폴리펩티드는 이종(異種) 시그널펩티드를 N 말단에 융합함으로써 발현시킬 수 있다.

보다 구체적으로는 실시예 9 에서 상세하게 서술하겠지만 가용성 ChM1L 단백질을 발현시키는 방법의 개략적인 것은 이하와 같다.

pCAGGS 벡터에 N 말측으로부터 프리프로트립신의 시그널 서열, FLAG 태그, ChM1L 의 세포외 영역의 C 말단측이 융합된 단백질 코드하는 염기서열을 도입한 벡터를 구축하였다 (실시예 5). 이 벡터를 사용하여 발현시킨 ChM1L 단백질은 프리프로트립신의 시그널 서열이 절단된 후, 가용성 단백질로서 배양액 중에 분비된다 (실시예 9, 도 5).

이렇게 하여 배양액 중에 분비된 가용성 ChM1L 폴리펩티드는 항 ChM1L 항체 또는 FLAG 태그가 융합되어 있기 때문에 항 FLAG 항체 (Sigma 사) 를 사용하여 정제하는 것이 가능하다. 또, FLAG 융합 단백질을 엔테로키나제로 절단함으로써 FLAG 태그를 제거하는 것도 가능하다.

보다 구체적으로는 실시예 13 에서 상세하게 서술하겠지만 가용성 ChM1L 단백질의 정제방법의 개략적인 것은 이하와 같다.

리포펙트 아민 시약 (GIBCO BRL 사) 을 사용하여 제품설명서에 따라 pSF-shChM1L 을 COS7 세포로 트랜스펙트하여 약 48시간 후에 배양 상청을 회수하였다. 이 배양 상청으로부터 항 FLAG M2 친화 겔 (Sigma 사) 을 사용한 친화 크로마토그래피에 의해 가용성 인간 ChM1L 단백질을 정제하였다 (도 8).

본 발명의 ChM1L 폴리펩티드는 폴리펩티드 정제 시약으로서 사용할 수 있다.고체 지지재료에 결합한 그 폴리펩티드는 친화 크로마토그래피에 의한 그 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 정제에 유용하다. ChM1L 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드로는, 가용성 폴리펩티드, 막결합성 폴리펩티드 및 항체 등을 생각할 수 있다. 가용성 ChM1L 폴리펩티드는 생체외에서는 세포배양액 중으로 첨가, 생체내에서는 정맥내 투여 등으로 용이하게 적용할 수 있다.

본 발명 ChM1L 폴리펩티드의 활성을 검색할 목적으로, 인간 제대정맥 내피세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cells : HUVECs) 를 사용하여 혈관신생 저해작용의 유무를 해석하였다. 상세한 것은 후술할 실시예 14 에서 서술하겠지만 개략적인 것은 이하와 같다. HUVECs 를 마트리겔 (BECTON DICKINSON) 로 코팅한 플레이트상에서 배양하면, 혈관 내피세포가 관강 모양의 구조를 형성한다 (도 9). 이 배양액 중에 상술한 친화 크로마토그래피에 의해 정제한 ChM1L 폴리펩티드를 가하면 HUVECs 의 관강 모양의 구조의 형성이 저해된다 (도 9). 따라서, ChM1L 은 혈관신생 저해작용을 갖는 것이 분명해지고, 가용성 ChM1L 폴리펩티드는 당뇨병성 망막증, 암, 만성관절 류머티스 등 혈관신생에 수반되는 질환의 치료약으로서 적용할 수 있는 것이 분명해졌다.

본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드는 이것을 사용하여 특이항체를 제작하는 것도 가능하다. 여기서 사용되는 항원은, 상기 유전자공학적 수법에 따라 대량으로 생산되는 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드가 있으며, 얻을 수 있는 항체는 폴리크로날 항체 및 모노크로날 항체 모두이며 이들 항체는 그 폴리펩티드의 정제, 측정, 식별 등에 효과적으로 이용할 수 있다. 따라서, 그 폴리펩티드에 대한 폴리크로날 항체 및 모노크로날 항체는 그 폴리펩티드에 의해 (직접적으로 또는 간접적으로) 매개되는 질환의 치료 및 치료법의 개발에 사용할 수 있어, 상기 질환의 진단용 시약으로서 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 ChM1L 유전자가 코드하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 실시예 7 에 나타낸 바와 같이 제작할 수 있다. 제작한 항 ChM1L 폴리펩티드 항체가 그 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것은 실시예 8 의 웨스턴 블로팅의 결과에 의해 확인되었다 (도 4).

항 ChM1L 폴리펩티드 항체는, 실시예 11 에 나타낸 바와 같이 조직 절편의 면역 염색에도 사용할 수 있다. 늑연골 조직을 항 ChM1L 폴리펩티드 항체를 사용하여 염색하면, 연골조직 주위를 둘러싸도록 하여 존재하는 선유아세포 모양의 편평한 형태를 나타내는 세포가 특이적으로 염색되었다 (도 7). 한편, ChM-I 는 연골 세포에 특이적으로 발현하고 있고, 면역 염색에 의해서도 연골세포 및 연골세포외의 매트릭스에 축적되어 있는 것이 분명해져 있다 (Hiraki et al, J. Biol. Chem., 272, 32419-32426, 1997). 따라서, ChM1L 과 ChM-I 는 연골을 포함하는 조직에 있어서 상이한 세포에 발현하고 있는 것이 분명해졌다. 따라서, ChM1L 은 ChM-I 와 상이한 기능을 갖는 분자인 것이 분명해졌다.

면역염색에 의해 ChM1L 단백질을 발현하고 있는 것이 분명해진 선유아세포 모양의 형태를 나타내는 세포군을 포함하는 조직은, 종래부터 연골막 (perichondrium) 라고 불리고 있다 (Suda et al, 뼈형성과 뼈흡수 및 그것의 조절인자 1, 2, 1995). 연골막이라는 조직에 관해서는 현 시점에서 명확한 정의는없지만, 본 명세서 내에서는 연골세포 주위를 둘러싸는 선유아세포양의 형태를 나타내는 세포를 포함하는 조직인 것을 가리키기로 한다.

연골막에 존재하는 세포는, 내연골성 골화의 과정에서 연골조직이 성장할 때의 연골세포의 공급원이라고 생각되고 있다. 따라서, 연골막은 발생과정에서의 골격형성이나 성체에서의 뼈, 연골의 손상시에 연골세포를 공급하는 중요한 조직이다. 또, 연골조직에는 혈관, 신경, 림프관이 존재하지 않는 것이 특징이지만, 연골조직과 다른 조직의 경계에 존재하는 것이 연골막이므로 연골막은 연골세포에 대한 혈관, 신경, 림프관의 침입을 제어하고 있다고 생각된다. 이와 같이, 연골막은 중요한 조직이라고 인식되어 있으나, 상술한 바와 같이 명확하게 정의된 조직이 아니라서 현 시점에서 상세한 연구는 되어 있지 않다. 그 이유로는, 연골막 특이적으로 발현하는 분자가 전혀 밝혀지지 않은 것을 들 수 있다.

따라서, 연골조직 주위를 둘러싸는 연골막이라 불리는 조직에 특이적으로 발현하는 분자의 존재가 밝혀지면, 연골막 및 연골조직의 연구에 매우 중요한 툴로서 이용할 수 있다.

본 발명의 ChM1L 은 연골막 특이적으로 발현하고 있는 것이 밝혀진 유일한 분자이며, 혈관, 신경, 림프관의 연골조직에 대한 침입을 제어하고 있다고 생각된다.

따라서, ChM1L 유전자의 발견과 본 발명에 포함되는 ChM1L의 기능해석 결과는, 금후 연골막 및 연골조직을 포함하는 ChM1L 이 발현하고 있는 그 밖의 조직이 관여하는 질환의 원인이나 치료법의 개발에 새로운 시점을 부여할 수 있는 것으로생각된다.

따라서, 본 발명의 ChM1L 유전자, ChM1L 폴리펩티드, ChM1L 에 결합하는 항체를 포함하는 ChM1L 에 대한 길항제 및 작용제, ChM1L 유전자의 발현을 촉진 또는 감약시키는 물질 등은 상기의 ChM1L 을 발현하고 있는 세포가 관여하고 있는 질환의 치료약으로서 적용할 수 있다고 생각된다.

본 발명의 ChM1L 유전자 및 그것이 코드하는 폴리펩티드는 상기 mRNA 의 발현해석 및 면역염색의 결과로부터 뇌, 안구, 골격근, 갑상선, 연골을 포함하는 전체 늑골, 신장, 위, 기관 및 연골조직 주위를 둘러싸도록 하여 존재하는 선유아세포양의 편평한 형태를 나타내는 세포에 발현하고 있는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 ChM1L 유전자 및 그것이 코드하는 폴리펩티드는, 그것이 발현하고 있다고 확인된 상기 조직이 관련된 질환, 예컨대 당뇨병성 망막증, 근육 디스트로피, 바세도우씨병, 만성신부전, 위암, 만성기관지염, 변형성 관절증 및 류머티스성 질환 등에 관여하고 있다고 생각된다.

따라서, 본 발명의 ChM1L 유전자, ChM1L 폴리펩티드, ChM1L 에 결합하는 항체를 포함하는 ChM1L 에 대한 길항제 및 작용제, ChM1L 유전자의 발현을 촉진 또는 감약시키는 물질 등은 이들 질환에 대한 치료약으로서 적용할 수 있다고 생각된다.

(실시예)

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예 1. ChM1L 아미노산 서열의 해석

ChM-I 와 ChM1L 의 아미노산 서열의 상동성을 비교하였다 (도 1(a)). 그리고 아미노산 서열은 알파벳 1문자로 표시하였다. ChM1L 은 분자 전체를 통해 ChM-I 와 상동성을 갖지만, ChM-I 의 프로세싱을 받아 세포 외부로 분비되는 C 말측과 특히 높은 상동성을 갖는 것이 밝혀졌다.

인간, 마우스 및 랫트 ChM1L 의 아미노산 서열의 상동성을 비교하였다 (도 1(b)). ChM1L 폴리펩티드는 인간, 마우스 및 랫트 모두 317 아미노산으로 구성되지만, 3 종간에서 300 아미노산 잔기가 동일하였다 (약 95%).

ChM-I 와 ChM1L 의 소수성도의 도면을 나타낸다 (도 2). ChM-I 및 ChM1L 모두 N 말측에 소수성의 큰 피크가 인정된다. 이 소수성의 영역은, 세포막 결합형 단백질에 특징적으로 인정되는 것이며, ChM1L 은 ChM-I 와 마찬가지로 Ⅱ 형 막결합성 단백질인 것이 나타나 있다.

실시예 2. ChM1L 유전자의 클로닝

일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ : DNA data bank of Japan) 로부터, 인간 ChM-I 의 아미노산 서열 (Genbank 승인 번호 제 M16441 호) 을 사용하여 발현된 서을 태그 데이터 베이스 (dbEST) 상에서 TBLASTN 서치를 실시하였다. 그 결과, ChM-I 와 상동성을 갖는 신규유전자 단편으로서 EST 파일, Genbank 승인 번호 제 AI123839 호를 검출하였다.

클론테크사 제조 Human fetus Marathon-Ready™ cDNA 를 사용하여 제품설명서에 따라 RACE 법에 의해 cDNA 를 증폭하였다. 프라이머는 상기 dbEST 에서 얻어진 염기 서열로 합성하고, ExTaq polymerase (다까라슈조) 를 제품설명서에 따라 사용하며, GeneAmpPCR System 9700 (PE Applied Biosystems 사) 를 사용하고 반응 사이클은 96℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분을 30 회 반복하게 하여 마지막에 72℃에서 6분간 인큐베이트하여 PCR 반응액을 얻었다. 이 반응액을 주형으로 하여 1/10량 가하고, 같은 조건으로 2번째의 PCR 을 행하였다.

얻어진 PCR 산물을 에티듐 브로마이드가 들어간 1% 아가로스 겔로 전기영동하여 이 겔을 자외선하에서 관찰함으로써 DNA 밴드를 조사하였다. 증폭된 프래그먼트를 겔에서 잘라내고 제품설명서에 따라 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제하였다.

정제 프래그먼트의 염기 서열은 제품설명서에 따라 PE Applied Biosystems 사 제조 DNA 시퀀서 (ABI PRISM™31O Genetic Analyzer) 및 ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit 을 사용하여 결정하였다.

인간 ChM1L cDNA 의 핵산 염기 서열을 서열번호 1 로, 아미노산 서열을 서열번호 2 로 나타낸다.

서열번호 1 로 표시되는 인간 ChM1L 유전자에 의해 코드되는 아미노산 서열이 인간 ChM-I 과 상동성을 나타내므로, 이 유전자를 ChM1L 유전자 (ChM-I like gene) 이라 부르기로 하였다.

인간 ChM1L cDNA 의 코드 서열 (CDS) 를 PCR 에 의해 증폭, 아가로스 전기영동한 후 정제하여 pCR-Script™Amp 클로닝 키트 (Stratagene 사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 클로닝하였다. PCR 에 사용한 프라이머의 서열을 서열번호 7 (정방향 (Forward) 프라이머) 및 서열번호 8 (역방향 (Reverse) 프라이머) 로 나타내었다. 벡터에 도입된 ChM1L 유전자 서열은 제품설명서에 따라 ABI PRISM™310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems 사) 및 ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit 를 사용하여 결정하였다.

인간 ChM1L 의 아미노산 서열 (서열번호 2) 을 사용하여 상기 인간의 경우와 마찬가지로 TBLASTN 서치를 실시하였다. 그 결과, 마우스 ChM1L 을 코드하는 유전자 단편으로서 EST 파일, Genbank 승인 번호 제 AVO09191 호, 랫트 chM1L 를 코드하는 유전자 단편으로서 EST 파일, Genbank 승인 번호 제 AI112003 호가 검출되었다. 클론테크사 제조 Mouse 11-day Embryo Marathon-Ready™ cDNA 및 Rat Skeletal muscle Marathon-Ready™ cDNA 를 사용하여 인간 ChM1L 유전자의 단리와 마찬가지로 RACE 법에 의해 마우스 및 랫트 ChM1L 유전자 서열을 결정하였다.

마우스 ChM1L cDNA 의 핵산 염기 서열을 서열번호 3 으로, 아미노산 서열을 서열번호 4 로 나타낸다. 랫트 ChM1L cDNA 의 핵산 염기 서열을 서열번호 5 로, 아미노산 서열을 서열번호 6 으로 나타낸다.

마우스 및 랫트 ChM1L cDNA 의 코드 서열 (CDS) 를 PCR 에 의해 증폭, 아가로스 전기영동한 후 정제하여 pCR-Script™ Amp 클로닝 키트 (Stratagene 사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 클로닝하였다. 마우스 유전자의 PCR 에 사용한 프라이머의 서열을 서열번호 9 (정방향 프라이머) 및 서열번호 10 (역방향 프라이머) 으로, 랫트 유전자의 PCR 에 사용한 프라이머의 서열을 서열번호 11 (정방향 프라이머) 및 서열번호 12 (역방향 프라이머) 로 나타내었다. 벡터에 도입된 ChM1L 유전자 서열은 제품설명서에 따라 ABI PRISM™31O Genetic Analyzer (PE AppliedBiosystems 사) 및 ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit 을 사용하여 결정하였다.

본 실시예에서 제작한 인간, 마우스 및 랫트 ChM1L 유전자를 도입한 벡터는 이하의 약칭을 사용하기로 한다.

·인간 ChM1L 유전자를 포함하는 벡터 : pCR-hChM1L

·마우스 ChM1L 유전자를 포함하는 벡터 : pCR-mChM1L

·랫트 ChM1L 유전자를 포함하는 벡터 : pCR-rChM1L

실시예 3. C 말단에 히스티딘 6잔기가 융합된 인간 및 마우스 ChM1L 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 벡터의 구축

인간 및 마우스 ChM1L cDNA 의 코드 서열 (CDS) 를 PCR 에 의해 증폭, 아가로스 전기영동한 후 정제하고, C 말단에 히스티딘 6잔기 (His 태그) 가 융합하도록 개량한 pCR-Script SK(+)벡터 (Stratagene 사) 및 pCR-Script™ Amp 클로닝 키트 (Stratagene 사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 클로닝하였다. 인간 유전자의 PCR 에 사용한 프라이머의 서열을 서열번호 7 (정방향 프라이머) 및 서열번호 13 (역방향 프라이머) 으로, 마우스 유전자의 PCR 에 사용한 프라이머의 서열을 서열번호 9 (정방향 프라이머) 및 서열번호 14 (역방향 프라이머) 로 나타내었다. ChM1L 의 C 말단에 His 태그가 융합한 단백질을 코드하는 염기서열이 도입되어 있는 것은 ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems 사) 및 ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit 을 제품설명서에 따라 사용하여 확인하였다. C 말단에 His 태그가 융합된 인간 및 마우스 ChM1L의 아미노산 서열을 서열번호 17 및 18 로, 그것을 코드하는 핵산 염기 서열을 서열번호 15 및 16 으로 나타내었다.

본 실시예에서 제작한 His 태그가 융합된 ChM1L 단백질을 코드하는 유전자를 클로닝한 벡터는 이하의 약칭을 사용하기로 한다.

·인간 ChM1L 과 His 태그가 융합된 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 벡터 : pCR-hChM1LHis

·마우스 ChM1L 과 His 태그가 융합된 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 벡터 : pCR-mChM1LHis

실시예 4. 발현벡터의 구축

포유동물 세포에서 ChM1L 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 pcDNA3.1(+)벡터 (Invitrogen 사) 및 pCAGGS 벡터 (Gene, 108, 193-200, 1991) 에 상기 pCR-hChM1L, pCR-mChM1L, pCR-hChM1LHis 및 pCR-mChM1LHis 벡터로부터 CDS 를 제한효소 EcoRI 및 NotI 로 잘라내어 아가로스 전기영동한 후, 원하는 밴드를 정제하여 Ligation high (도요보) 를 제품설명서에 따라 사용하여 결찰 반응을 행하였다. 결찰 반응 후의 용액을 E.coli JM109 Competent cell (다까라슈조) 를 사용하여 제품설명서에 따라 트랜스포메이션하였다. 플라스미드를 정제한 후 원하는 유전자가 도입되어 있는 것은 제한효소 반응과 아가로스 전기영동에 의해 확인하였다.

본 실시예에서 제작한 벡터는 이하의 약칭을 사용하기로 한다.

·hChM1L, mChM1L, hChM1LHis 및 mChM1L 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+)벡터:

pcDNA-hChM1L, pcDNA-mChM1L, pcDNA-hChM1LHis 및 pcDNA-mChM1LHis

·hChM1L, mChM1L, hChM1LHis 및 mChM1L 유전자를 포함하는 pCAGGS 벡터 :

pCAGGS-hChM1L, pCAGGS-mChM1L, pCAGGS-hChM1LHis 및 pCAGGS-mChM1LHis

실시예 5. FLAG 태그가 융합한 인간 가용성 ChM1L 단백질을 발현하는 벡터의 구축

본 실시예에서 서술하는 FLAG 태그 (Sigma 사) 는 8 개의 아미노산으로 이루어지는 친수성 마커펩티드 (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys) 이고, 마지막 5 개 아미노산 (Asp Asp Asp Asp Lys) 은 엔테로키나제의 인식서열로 되어 있다. 본 실시예에 의해 제작된 벡터는, N 말측으로부터 프리프로트립신의 시그널 서열, FLAG 태그, ChM1L 의 세포외 영역의 C 말단측이 융합한 단백질을 발현시키는 것이 가능하다. 이 벡터를 사용하여 발현시킨 단백질은, 후술할 실시예 9 에서 상세하게 서술하는 것처럼, 프리프로트립신의 시그널 서열이 절단된 후 가용성 단백질로서 배양액 중에 분비된다. 또, 이 벡터에 의해 발현된 단백질은 FLAG 태그가 융합하고 있기 때문에 항 FLAG 항체 (Sigma 사) 를 사용하여 정제하는 것이 가능하고, 융합단백질을 엔테로키나제로 절단함으로써 FLAG 태그를 제거하는 것도 가능하다.

pCAGGS 벡터에 N 말단으로부터 프리프로트립신의 시그널 서열과 FLAG 태그 (서열번호 20) 를 코드하는 염기서열 (서열번호 19, Sigma 사제 pFLAG-CMV-1 벡터에 포함된다) 을 도입한 벡터를 구축하였다 (이하, pSF 벡터라 한다). pSF 벡터에 서열번호 2 로 표시되는 인간 ChM1L 의 아미노산 번호 212 내지 317 및 번역정지코돈을 포함하는 영역을 코드하는 염기 서열 (서열번호 1 인 염기 서열 번호 684 내지 1020) 를 PCR 법에 의해 증폭하고, 이 증폭산물을 pSF 벡터의 FLAG 태그를 코드하는 염기서열의 3' 측에 도입하였다. PCR 에 사용한 프라이머의 서열을 서열번호 21 (정방향 프라이머) 및 서열번호 8 (역방향 프라이머) 로 나타내었다. 구축한 벡터에 목적으로 하는 염기서열이 도입되어 있는 것은, ABI PRISM™ 31O Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems 사) 및 ABI PRISM™ BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit 을 제품설명서에 따라 사용하여 확인하였다. 본 실시예에서, 벡터에 도입한 핵산 염기 서열을 서열번호 22 로, 그것이 코드하는 아미노산 서열을 서열번호 23 으로 나타내었다. 본 실시예에서 제작한 벡터는 pSF-shChM1L 이라는 약칭을 사용하기로 한다.

실시예 6. ChM1L mRNA 의 발현해석

성채 (10 주령) 의 각 조직에서의 ChM1L mRNA 의 발현해석 : 도 3(a)

10 주령인 C57BL/6 마우스를 해부하여 각 조직을 얻어 즉시 액체질소로 동결하였다. 동결한 조직을 잘게 자르고 ISOGEN (닛폰진사) 를 제품설명서에 따라 사용하여 각 조직의 total RNA 를 얻었다. 얻어진 각 조직의 total RNA 1㎍ 을 주형으로 하여 Superscript Ⅱ preamprefication kit (GIBCO BRL 사) 를 제품설명서에 따라 사용하여 cDNA 20㎕ 를 합성하였다. RT-PCR 는 반응계의 총액량을 50㎕ 로 하여 각 조직의 cDNA 0.5㎕, ExTaq polymerase (다까라슈조) 를 0.25㎕ 사용하고, 정방향 프라이머 (서열번호 9) 및 역방향 프라이머 (서열번호 1O) 를 각각 0.2uM 가 되도록 가하여 GeneAmpPCR System 9700 (PE Applied Biosystems 사)를 사용해 96℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 증폭시켰다. 얻어진 반응액을 에티듐브로마이드가 들어간 1% 아가로스 겔로 전기영동하여 겔을 자외선 조사하에서 촬영해서 각 조직에 있어서의 ChM1L mRNA 의 발현을 검토하였다.

도 3(a) 에 나타낸 바와 같이, 성체 마우스의 각 조직에 있어서의 ChM1L mRNA 의 발현은 뇌, 안구, 골격근, 전체 늑골 및 갑상선에서 인정되었다. 마우스에서의 ChM-I 의 발현은 안구, 흉선, 연골 및 전체 늑골 에서 확인되고 있다. 따라서, ChM1L 과 ChM-I 는 생체 내에서 상이한 조직에 발현하고 있는 것이 분명해져 그 생리적인 기능은 상이하다는 것이 시사되었다.

태아 (임신 17일째) 의 각 조직에서의 ChM1L 용 RNA의 발현해석 : 도 3(b)

C57BL/6 마우스의 임신 17일째의 태아를 제왕절개술에 의해 꺼내고 각 조직을 꺼낸 즉시 액체질소로 동결하였다. 동결한 조직으로부터의 총 RNA 의 추출, cDNA 의 합성, RT-PCR 의 실시는 상술한 <성체 마우스의 각 조직에서의 ChM1L mRNA 의 발현해석> 과 동일한 방법으로 실시하였다.

도 3(b) 에 나타낸 바와 같이, 태아의 각 조직에서의 ChM1L mRNA 의 발현은 안구, 신장, 위, 전체 늑골 및 기관에서 인정되었다. 태아 마우스에 있어서는, 성체 마우스에서는 발현이 인정되지 않은 신장 및 위에서 발현이 인정되었다. 따라서, ChM1L 은 이들 장기의 발생·형태형성에 관여하고 있을 가능성이 있어, 장기 수복이나 재생에도 관여한다고 생각된다. 또한, 기관에 있어서도 ChM1L mRNA 가 발현하고 있다는 것이 밝혀졌다.

태아 발생단계에서의 ChM1L mRNA 의 발현해석 : 도 3(c)

C57BL/6 마우스의 임신 10일째에서 출생일까지 각 일령의 태아를 제왕절개술에 의해 꺼내고 태아를 그대로 액체질소로 동결하였다. 동결한 태아로부터의 total RNA 의 추출, cDNA 의 합성, RT-PCR 의 실시는 상술한 <성체 마우스의 각 조직에서의 ChM1L mRNA 의 발현해석> 과 동일한 방법으로 실시하였다.

ChM-I mRNA 의 해석은 정방향 프라이머 (서열번호 23) 및 역방향 프라이머 (서열번호 24) 를 사용하여 같은 조건으로 실시하였다.

도 3(c) 에 나타낸 바와 같이, 태아 발생단계에서의 ChM1L mRNA 의 발현은 임신 10일째에서는 대단히 약하고, 11일에서 13일에 걸쳐 발현이 상승하고 있다. 한편, ChM-I 의 발현도 ChM1L 과 동일한 발현상승을 나타내지만, 임신 1O일째 및 11일째에서는 분명히 ChM1L 보다도 강한 발현을 나타내었다. 따라서, 태아 발생단계에서는, ChM1L은 ChM-I 보다도 늦게 발현이 상승하는 것이 분명해져, 양분자가 태아 발생에 있어서 상이한 기능을 갖는다는 것이 분명해졌다.

실시예 7. 항 ChM1L 펩티드 폴리크로날 항체의 제작

인간 ChM1L 의 서열번호 2 에 나타낸 245∼252 잔기까지의 서열의 C 말단에 시스테인을 갖는 펩티드를 화학합성하였다. 이 합성펩티드에 MBS/KLH (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester/keyhole limpet hemocyanin, 베링거만하임사) 를 커플링시켰다. 이 복합체를 생리식염수에 용해시킨 후, 등량의 FCA (프플로인트 완전 아쥬반트) 을 가하고 초음파처리하여 에멀전을 조제하였다. 이 에멀전을 토끼의 피하에 투여하여 초회 면역으로 하였다. 초회 면역으로부터 4주 후에 FIA (프로인트 불완전 아쥬반트) 을 사용하여 대퇴근에 추가면역을 하고, 그 후는 약 2주간 또는 약 4주간의 간격으로 피하투여에 의해 4회 면역을 하였다. 추가면역하는 동안 이개로부터 부분채혈, 최종 면역후에는 전채혈을 하여 혈청을 분리하고, 펩티드 칼럼에 의한 친화 정제를 실시하여 항 ChM1L 펩티드 폴리크로날 항체를 얻었다.

실시예 8. 인간 및 마우스 ChM1L 재조합 단백질의 웨스턴 블로팅법에 의한 해석 : 도 4

리포펙트 아민 시약 (GIBCO BRL 사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 pCAGGS, pCAGGS-hChM1L 및 pCAGGS-mChM1L (도 4(a) 및 4(c)) 또는 pCAGGS, pCAGGS-hChM1LHis 및 pCAGGS-mChM1LHis (도 4(b) 및 4(d)) 을 COS7 세포에 트랜스펙트하였다. 트랜스펙션하고 나서 약 48시간 후에 배양 상청 및 세포성분을 12.5% 겔로 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 를 행한 후, 니트로 셀룰로스막으로 트랜스퍼하였다. 1차 항체반응 및 2차 항체반응을 하고 ECLplus 시약 (아마샴 파르마시아 바이오테크사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 발색반응을 하였다. pCAGGS, pCAGGS-hChM1L 및 pCAGGS-mChM1L 을 트랜스펙트한 경우의 웨스턴 블로팅은 1차 항체에 앞서 기재한 실시예에서 서술한 항 ChM1L 폴리크로날 항체, 2차항체에 허스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 로 표식된 항토끼 IgG 항체 (Dako 사) 를, pCAGGS, pCAGGS-hChM1LHis 및 pCAGGS-mChM1LHis 를 트랜스펙트한 경우의 웨스턴 블로팅에는 1 차 항체에 항 His 태그 항체 (Invitrogen 사), 2 차 항체에 HRP 으로 표식된 항마우스 IgG 항체 (아마샴 파르마시아 바이오테크사) 를 사용하여 실시하였다.

웨스턴 블로팅과 동일한 샘플로 SDS-PAGE 를 실시하여 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) 로 염색한 결과를 도 4(a) 및 4(b) 에 나타내었다.

웨스턴 블로팅의 결과, 모든 배양 상청에서 ChM1L 의 밴드는 확인되지 않았다. 세포성분에서는 도 4(b) 및 4(d) 에 나타낸 바와 같이 재조합 ChM1L 단백질은 항 ChM1L 펩티드 항체 및 항 His 태그 항체 어느 것을 사용해도 40 kDa 부근에 2개의 밴드로서 검출되었다. 후술할 실시예에서 자세하게 서술하겠지만, 당쇄구조의 해석에 의해 고분자량측의 밴드는 N 결합형의 당쇄가 결합한 폼인 것이 확인되었다.

실시예 9. 가용성 인간 ChM1L 재조합 단백질의 웨스턴 블로팅법에 의한 해석 : 도 5

리포펙트 아민 시약 (GIBCO BRL 사) 을 사용하여 제품설명서에 따라 pCAGGS 및 pSF-shChM1L 을 COS7 세포에 트랜스펙션하였다. 배양 상청을 12.5% 겔로 SDS-PAGE 한 후, 니트로 셀룰로스막에 트랜스퍼하였다. 1차항체로는 항 FLAG M2 항체 (Sigma 사) 를, 2 차 항체로는 HRP 으로 표식된 항 마우스 IgG 항체 (아마샴 파르마시아 바이오테크사) 를 사용하고 ECLplus 시약 (아마샴 파르마시아 바이오테크사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 발색반응을 하였다.

도 5 에 나타낸 바와 같이, 가용성 인간 ChM1L 단백질은 17-181 kDa 부근에 1개의 밴드로서 검출되었다.

실시예 1O. ChM1L 재조합 단백질의 당쇄 구조 해석

리포펙트 아민 시약 (GIBCO BRL 사) 을 사용하여 제품설명서에 따라 pCAGGS-mChM1LHis 를 COS7 세포에 트랜스펙트하였다. 디시에 2% SDS 를 함유하는 PBS 를 가하여 스크레이퍼로 세포를 회수하고 이 현탁액을 95℃ 에서 60분간 가열한 후, 그 상청을 SDS-OUT^TMSDS Precipitation kit (Pierce 사) 를 사용해 처리하여 SDS 를 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 단백질 용액을 사용하고 Enzymatic Deglycosylation Kit (BIO RAD 사) 를 사용하여 제품설명서에 따라 NANase Ⅱ, O-Glycosidase DS 및 PNGase F 로 상기 단백질 용액을 처리하여 당쇄 소화반응을 실시하였다. 이 반응액을 12.5% 겔로 SDS-PAGE 한 후, 니트로 셀룰로스막으로 트랜스퍼하였다. 1차항체로는 항 His 태그 항체 (Invitrogen 사) 를, 2차항체로는 HRP 으로 표지된 항 마우스 IgG 항체 (아마샴 파르마시아 바이오테크사) 를 사용하고, ECLplus 시약 (아마샴 파르마시아 바이오테크사) 을 사용하여 제품설명서에 따라 발색반응을 하였다.

도 6 에 나타낸 바와 같이, ChM1L 단백질의 고분자량측 밴드는 PNGase F 로 처리한 경우 (레인 2 및 5) 에만 소실되었다. 따라서, ChM1L 단백질은 N 결합형 당쇄로 수식되어 있는 것이 분명해졌다.

실시예 11. 늑연골에서의 ChM1L 단백질의 면역염색법에 의한 해석

약 10 주령인 C57BL/6 마우스를 해부하여 전체 늑골을 꺼내 4% 파라포름알데히드를 함유하는 10mM 인산 완충버퍼, pH7.4 (PBS) 중에서 고정하여 파라핀으로 포매한 후, 절편을 작성하였다. 면역염색의 각 공정은 히스토파인 SAB-PO(R) 키트 (니치레이) 를 사용하여 제품설명서에 따라 실시하였으나, 개략적인 것은 이하와 같다. 탈파라핀 처리한 후 3% 과산화 수소수로 내인성 페르옥시다제를 소화하였다. PBS 으로 세정하여 10% 정상 염소혈청으로 블로킹한 후, 상기 항 ChM1L 펩티드 항체를 1/160 희석으로 가하여 4℃ 에서 밤새 인큐베이트하였다. 음성 대조구로는 토끼 IgG 를 사용하였다. 비오틴 표지 항토끼 IgG 항체 및 페르옥시다제 표지 스트렙토아비딘을 반응시킨 후, 3, 3-디아미노벤티딘·4HCl 을 가하여 발색반응을 하였다. 핵을 헤마톡실린으로 염색, 봉입한 후 관찰을 실시하였다.

도 7 에 나타낸 바와 같이, ChM1L 단백질은 늑연골 조직에 있어서 연골세포 주위에 존재하는 편평한 선유아세포양의 형태를 나타내는 세포에 발현하고 있는 것이 밝혀졌다. 한편, ChM-I 가 발현하고 있다고 보고되어 있는 연골세포에서는 발현이 인정되지 않았다.

실시예 12. 인간 ChM1L 유전자의 염색체 맵핑

일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ : DNA data bank of Japan) 로부터, 인간 ChM1L 유전자 서열 (서열번호 1) 을 사용하고 DDBJ 전체 데이터를 대상으로 하여 BLASTN 서치를 실시하였다. 그 결과, ChM1L 유전자의 게놈 서열로서 Genbank 승인 번호 제 AL035608 호를 검출하였다. AL035608 은 인간 X 염색체에 맵핑되어 있는 서열이다. 따라서, 인간 ChM1L 유전자는 X 염색체 상에 존재하는 것이 분명해졌다.

실시예 13. 가용성 인간 ChM1L 재조합 단백질의 정제

리포펙트 아민 시약 (GIBCO BRL 사) 을 사용하여 제품설명서에 따라 pSF-shChM1L 을 COS7 세포에 트랜스펙트해서 약 48 시간후에 배양 상청을 회수하였다. 항 FLAG M2 친화 겔 (Sigma 사) 을 사용하여 친화 칼럼을 제작하고 배양 상청을 칼럼에 적용하였다. 25mM Tris-HCl, 150mM NaCl (pH7.4) 으로 칼럼을 3회 세정한 후, 0.1M 글리신-HCl (ph3.5) 을 사용하여 용출하고, 1/20 용량의 1M Tris-HCl (pH9.5) 을 사용하여 용출액을 중화하였다.

배양 상청 및 용출액을 사용하여 SDS-PAGE 를 행하고 쿠마시 브릴리언트 블루 (CBB) 염색을 실시한 결과를 도 8 에 나타내었다. 배양 상청 중에는 다양한 종류의 단백질이 존재하지만 (도 8, 레인 1), 용출액 중에서는 가용성 인간 ChM1L 단백질이 약 20 kDa 인 밴드로서 확인되며, 상기 조작에 의해 가용성 인간 ChM1L 단백질이 농축, 정제되었다는 것이 밝혀졌다 (도 8, 레인 2).

실시예 14. 인간 제대정맥 내피세포를 사용한 혈관신생 저해작용의 검토

인간 제대정맥 내피세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVECs, Clonetics 사) 는 내피세포 전용 배지 (EGM-2 Bullet Kit, Clonetics 사) 에서 배양하였다. 12 웰플레이트에 Growth factor reduced Matrigel (BECT0N DICKINS0N 사) 를 60O㎕/웰로 가하여 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다. 헤파린을 함유하지 않는 내피세포 전용 배지를 내피세포 기본 배지 (EBM-2, Clonetics 사) 에서 1/8 로 희석한 배지를 사용하여 5 ×10⁴cells/mL 의 HUVECs 를 함유하는 세포현탁액을 조제하였다.

각 피험물질 용액은 O.1M 글리신-HCl (pH3.5) 에 1/20 용량의 1M Tris-HCl(pH9.5) 를 가한 용액으로 조제하여, 200㎕/웰의 용량으로 처리하였다. 음성 대상으로서 상기 버퍼 및 BSA (bovin serum albumin) 을 20㎍/웰로, 양성 대상 물질로서 Pletelet factor 4 (PF-4, CHEMICON 사) 를 1 및 1O㎍/웰로, 가용성 인간 ChM1L 재조합 단백질은 실시예 13 의 용출 분획을 10 및 20㎍/웰로 처리하였다. 세포현탁액 2㎖ (1 ×1O⁵cells) 와 각 피험물질 용액 20O㎕ 을 혼합하여 Growth factor reduced Matrigel 로 코트한 12 웰플레이트에 시딩하고, 9시간 후에 관강양 구조의 형성을 관찰하여 사진을 촬영하였다. 그 결과를 도 9 에 도시하였다. 음성 대상에서는 HUVECs 가 관강양 구조를 형성하고 있으나 (도 9(a) 및 9(b)), ChM1L 을 20㎍/웰로 처리한 경우에는 (도 9(d)), 음성 대상과 비교하여 관강양 구조의 형성이 저해되었다.

따라서, ChM1L 은 혈관신생 저해작용을 갖는 것이 분명해져, 가용성 ChM1L 폴리펩티드는 당뇨병성 망막증, 암, 만성관절 류머티스 등의 혈관신생을 수반하는 질환의 치료약으로서 적용할 수 있는 것이 분명해졌다.

Claims (27)

1. 서열번호 2 로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 인간 유전자.
2. 서열번호 4 로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 마우스 유전자.
3. 서열번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 랫트 유전자.
4. 제 1 항에 있어서, 서열번호 1 로 표시되는 염기서열을 갖는 인간 유전자.
5. 제 2 항에 있어서, 서열번호 3 으로 표시되는 염기서열을 갖는 마우스 유전자.
6. 제 3 항에 있어서, 서열번호 5 로 표시되는 염기서열을 갖는 랫트 유전자.
7. 서열번호 2 로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는, 인간 유전자가 코드하는 폴리펩티드.
8. 서열번호 4 로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는, 마우스 유전자가 코드하는 폴리펩티드.
9. 서열번호 6 으로 표시되는 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는, 랫트 유전자가 코드하는 폴리펩티드.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자의 적어도 일부와 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 프로브.
11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합체 DNA.
12. 제 11 항에 기재된 재조합체 DNA 에 의해 형질전환된 형질전환체.
13. 제 12 항에 기재된 형질전환체를 배양하여 얻을 수 있는 배양물로부터 인간, 마우스 및 랫트 유전자가 코드하는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드의 제조방법.
14. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 모노크로날 항체.
15. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 폴리크로날 항체.
16. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드로 면역된 항체생성세포와 미에로마 세포를 융합시킴으로써 얻을 수 있는, 제 14 항에 기재된 모노크로날 항체를 생성하는 하이브리도머.
17. 제 10 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 유전자의 검출시약.
18. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 및 제 14 항에 기재된 모노크로날 항체 및/또는 제 15 항에 기재된 폴리크로날 항체를 포함하는 진단용 키트.
19. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 의약조성물.
20. 제 14 항에 기재된 모노크로날 항체 또는 제 15 항에 기재된 폴리크로날 항체로 이루어지는 의약조성물.
21. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자의 일부와 특이적으로 하이브리다이즈하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 의약조성물.
22. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 유전자의 적어도 일부를 포함하는, 유전자 치료에 이용할 수 있는 핵산으로 이루어지는 의약조성물.
23. 제 1 항 또는 제 4 항 기재의 X 염색체 상에 존재하는 것을 특징으로 하는 인간 유전자.
24. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드가 세포막 결합형인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
25. 제 24 항에 기재된 세포막 결합형 폴리펩티드를 코드하는 유전자.
26. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드가 혈관신생 저해작용을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
27. 제 26 항에 기재된 혈관신생 저해작용을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자.