KR20020079097A

KR20020079097A - 구기자로부터 분리된 간보호 활성을 갖는 신규 피롤유도체 및 이를 함유한 조성물

Info

Publication number: KR20020079097A
Application number: KR1020010019749A
Authority: KR
Inventors: 김진웅; 진영원
Original assignee: 김진웅
Priority date: 2001-04-13
Filing date: 2001-04-13
Publication date: 2002-10-19
Also published as: KR100477957B1

Abstract

본 발명은 구기자(Lycium chinenseMILL)로부터 분리된 하기 화학식 1의 피롤 유도체 화합물 및 그의 간보호제로서의 용도에 관한 것으로서, 이 화합물들은 사염화탄소에 의한 간독성을 효과적으로 치료함으로써, 간염, 간경화와 같은 간질환 치료 및 예방에 유용한 약학 조성물 및 간질환을 예방할 수 있는 건강식품으로서 사용될 수 있다.

상기 식에서,

R¹내지R³는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C_1-4알킬기이며, 단 동시에 수소원자는 아니다.

Description

구기자로부터 분리된 간보호 활성을 갖는 신규 피롤 유도체 및 이를 함유한 조성물{NOVEL PYRROLE DERIVATIVES ISOLATED FROM LYCIUM CHINENSE MILL HAVING HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY AND COMPOSITION CONTAINING SAME}

우리나라에서 가장 이병율이 높은 질병의 하나인 간염은 술자리 등 간염 보균자와의 접촉에 의해 감염되는 것으로 알려져 있고 예방목적으로 바이러스성 B형 간염에 사용되는 백신이 개발된 바 있으나 이미 감염된 간염환자를 치료할 수 있는 특효약은 아직까지 개발되지 못하고 있다. 이러한 간염은 과로, 스트레스, 과음, 흡연에 의해 간손상을 가져와 만성간염, 간경변 및 간경화를 일으키고 결국 간암으로 발전하는 것으로 밝혀져 있다.

우리나라의 간장질환 환자의 수는 70년대 후반부터 급격히 증가하는 추세를 보이고 있는데 1996년에는 인구 10만명 당 944명의 이환률을 나타내었으며 사인 분류가 가능한 사망자 중 약 9%는 간장질환에 의해서 사망한다고 한다. 특히 주목할 만한 사실은 간장질환은 40대 남성의 사망 원인 중 26%를 점유하여 가장 높은 사망률을 보인다는 점이다 (1996년 사망원인통계연보 (인구동태신고에 의한 집계), 통계청, 서울, pp 20-40 (1997) 참조). 국내의 간질환중에서 가장 높은 사망률의 원인은 바이러스성 간염이지만, 서구에서는 바이러스성 간염보다는 간경화에 의한 사망이 5-10배 정도로 높게 보고되어있다. 간은 완충능력이 큰 기관으로 질환의 초기단계에서는 잘 나타나지 않고 상당히 악화되어서야 발견된다. 간경변증은 각종 간질환이 만성적으로 진행할 경우 공통적으로 이르는 마지막 단계이다. 그 원인으로는 알코올, 약물, 화학약품, 바이러스성 간염, 담도질환과 같은 대사성질환, 자가면역성 질환 등이 있으나 원인을 알 수 없는 경우도 많다. 간경변증의 경우 간혈류량저하, 간내혈류의 단축, 대사효소의 기능저하, 혈중단백의 질적, 양적 변화 및 담즙유량의 변화 등 전반적인 간기능이 저하된다.

또한 간은 인체에서 혈액 저장 및 순환, 혈액양 조절과 방어해독작용을 하며 정신적 활동과 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있다. 산업화에 따른 공해물질, 유독물질에 우리의 몸은 항상 노출되어 있어 우리의 간은 끊임없이 해독작용에 시달리고 있다. 더욱이 심각한 것은 정신적인 스트레스로 인한 간손상이다. 정신적 휴식을 가질 경우 손상된 간세포는 복구되지만 급박한 현대사회에서 정신적 휴식의 여유를 찾을 수 없어 정신적 스트레스, 과음, 흡연으로 간손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다.

간독성을 일으키는 유발물질에는 사염화탄소, D-갈락토사민 등이 있는데, 사염화탄소는 간세포의 과산화지질 반응을 일으켜 간독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. [레크나겔(Recknagel)의 문헌 (Pharmacol. Rev., 19, 145-208. 1967), 알퍼스 등(Alpers, et al.)의 문헌(Mol. Pharmacol., 4, 566-573, 1968) 및 슬레이터(Slater)의 문헌(Slater, T. F.(Eds), Academic Press, London, pp. 243, 1982) 참조]. 사염화탄소는 대사 활성화에 의하여 독성을 나타내므로 대사능이 있는 간에 선택적으로 작용하여 시토크롬 P-450을 파괴하고, 지방간을 유발시키며, 간괴사 및 간경변을 초래한다 [아자리 등(Azari, S et al.)의 문헌(Toxicol. Appl. Pharmacol.112, 81-89 (1992) 참조]. 사염화탄소의 독성 기전은 내형질 망상조직에 존재하는 약물대사 효소인 시토크롬 P-450 의존성 혼합 옥시다제에 의하여 생성된 대사물질인 삼염화메틸 자유기 (·CCl₃)가 세포단백질 및 지질에 결합하여 지질과산화를 초래하고 이로 인하여 내형질 망상조직의 형태적 변화, 약물대사 효소의 활성 감소, 단백질 합성의 감소 및 글루코스-6-포스페이트의 활성 감소를 일으키며, 간에서 합성된 트리글리세라이드의 방출을 억제하여 지방간을 유발하기 때문인 것으로 알려져 있다 [그라벨라(Gravela, E.) 등의 문헌(Biochem. J.178, 509-515 (1979) 참조].

간세포 독성이나 보호 활성은 간세포에 존재하는 여러 효소들을 측정함으로써 판단할 수 있다. 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제 (GPT) 및 소르비톨 디히드로게나제 (SDH) 등은 다른 장기보다 간세포에 선택적으로 존재하는 효소들로 간세포에 독성이 유발되면 궁극적으로 간세포가 파괴되어 간세포 내에서 배양액 중으로 유리되는 효소의 양이 증가한다. 이러한 사실은 사염화탄소에 의한 간세포 독성 및 그에 대한 보호 활성을 측정하는 데 많이 이용되고 있다.

아직까지도 간장 질환 치료제 개발은 인터페론을 제외하고는 별다른 진전이 없는 실정이며 만성 간염의 치료보조제로 생약자원에서 분리한 실리마린과 오미자에서 분리한 성분의 합성 유도체인 DDB (디메틸-4,4'-디메톡시-5,6,5'6'-디메틸렌디옥시비페닐-2,2'-디카르복실레이트) 등이 이용되고 있을 뿐이다. 따라서 간염 및 간경화증을 비롯한 각종 간장질환을 치료할 수 있는 새로운 의약품의 개발은 시급하다고 하겠다.

천연물로부터 인간의 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 신물질을 찾고자 하는 시도는 과거부터 많은 과학자들의 연구 대상이 되어 왔다. 그간 이들 자원을 이용한 의약품의 개발로 현재 사용되고 있는 의약품의 50% 이상이 천연물로부터 유래된 것이고 미국의 경우 사용하는 의약품 중 30%가 식물로부터 얻어진 것으로서, 미국 FDA로부터 승인된 의약품이 120종으로 시장 규모는 약 10조 달러에 이르고 있다. 천연물에서부터 간장질환 치료제를 개발하려는 그 동안의 수많은 노력에도 불구하고 실제로 치료제로 현재 사용중이거나 임상시험을 수행중인 예는 소수에 불과하다[타부르 등(Thabrew, M. I. et al)의 문헌(Phytotheraphy Res.10, 461-467 (1996) 참조).

천연물에서 분리되어 개발된 대표적인 간장질환 치료제인 실리마린은 간장질환의 치료나 예방의 목적으로 이용되어 온 실리붐 마리아눔(Silybum marianum)의성숙한 과실과 관모(冠毛)에서 분리되었다 [히끼노 등(Hikino, et al)의 문헌(Planta Med.50, 213-218 1984 참조]. 실리빈, 이소실리빈, 디히드로실리빈, 실리디아닌 및 실리크리스틴 등의 플라보리그난 계열 물질의 혼합물인 실리마린은 간세포의 RNA 폴리머라제를 활성화하여 단백질의 합성을 증가시켜 손상된 간조직의 재생을 촉진한다. 실리마린은 만성 전염성 간장 질환, 간경화 및 알코올성 간장 질환 등의 치료제로 현재 임상에서 이용되고 있다.

한방에서 강장제나 간장 질환의 예방 목적으로 사용되어온 오미자 (Schizandra chinensis)의 과실에서 분리된 리그난계 물질인 고미신 A는 유도체인 DDB로 합성되어 만성 간염의 치료제로 사용되고 있다. 고미신 A외에도 우웨이지수(wuweizisu) C, 쉬잔드린 D, 데옥시고미신 및 고미신 N 등의 유도체도 사염화탄소나 갈락토사민으로 유발시킨 간독성에 대한 회복효과가 보고되어 있다 [키소 등(Kiso, Y. et al.)의 문헌(Planta Med.50, 81-85 , 1984 참조].

최근에는 (+)-시아니다놀-3으로 알려진 (+)-카테킨을 급성 바이러스성 간염의 치료제로 개발하기 위한 임상실험이 진행중이다. 또한 일본에서는 글리시리진을 급성 바이러스성 간염이나 만성간염의 치료제로 개발하기 위한 임상 실험이 이루어지고 있다 [타부르 등(Thabrew, M. I.et al.)의 문헌(Phytotheraphy Res.10, 461-467 (1996) 참조].

인위적으로 독성을 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 간세포를 이용하여 식물에서 간세포 보호 활성을 갖는 성분을 분리한 예는 다수 있으며, 독성 유발 물질로는 사염화탄소와 갈락토사민이 가장 널리 이용되고 있으며 퍼옥시드나 이오노포아A23187을 이용하여 독성을 유발시킨 경우도 있다 [키소 등(Kiso et. al.)의 문헌(Shoyakugaku Zasshi39,218-221 1985) 참조].

키소(Kiso Y.)의 문헌(Planta Med., 49, 222-225 1983 참조)에는 민간에서 방향성 건위제나 황달의 치료 목적으로 이용되어 온 울금 (Curcuma aromatica)으로부터 사염화탄소나 갈락토사민으로 독성을 유발시킨 흰쥐의 일차 배양 간세포를 검색계로 하여 간세포 보호 활성을 갖는 쿠르쿠미노이드 (쿠르쿠민,p-쿠메로일페룰로일메탄, 디-p-쿠마로일메탄)를 분리 보고하였다. 또한 쿠르쿠미노이드의 대사물인 쿠마린 산, 페룰산 등의 신남산 유도체들의 간세포 보호 활성도 보고하였다.

이 등(Lee M. K. et al.)의 문헌(Planta Med., 61, 523-526 1995)에는 민간에서 강장제로 이용되고 있는 음양곽 (Epimedium koreanum)으로부터 사염화탄소로 독성을 유발시킨 흰쥐의 일차 배양 간세포를 검색계로 하여 생리활성 성분 추적 분획법(bioactivity-guided fractionation)에 의해 간세포 보호 활성을 갖는 이카린과 이카리시드 Ⅱ를 분리한 것이 보고되었다. 이카린은 이미 간장 질환 치료제로 이용되고 있는 실리마린 제제의 주 구성성분인 실리빈의 최대 활성 농도의 100분의 1에 불과한 낮은 농도에서 실리빈과 동등한 간세포 보호 활성을 나타냈다.

김 등(Kim S. Y. et al)의 문헌(J. Nat. Prod., 60, 274-276 1997)에는 음양곽과 마찬가지로 한방이나 민간에서 자양강장제로 널리 사용되고 있는 구기자 (Lycium chinense)로부터 사염화탄소로 독성을 유발시킨 흰쥐의 일차배양 간세포를 검색계로 하여 생리활성 성분추적 분획법에 의해 간세포 보호 활성을 갖는 새로운 세레브로시드 계열 물질을 분리하였다. 이 물질은 일차배양된 간세포에서 사염화탄소 독성에 의해 유리된 GPT와 SDH의 활성을 유의성있게 감소시키는 간세포 보호 활성을 나타낸다는 것이 보고된 바 있다. 그러나 지금까지 구기자로부터 분리된 피롤 유도체 화합물의 간독성 해소작용에 대해서 보고된 바는 없다.

본 발명자들은 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 간질환 예방 및 치료에 유용한 활성이 기대되는 식물을 탐색하는 과정에서 구기자(Lycium chinenseMILL.)로부터 분리되고 신규한 화학구조를 가진 피롤 유도체 화합물이 유용한 활성을 나타냄을 발견하였다.

구기자(Lycium chinenseMILL)는 가지과 덩굴성 관목으로서, 우리나라 전국에 분포되어 있으며, 그 성숙한 과실을 구기자라 하며 그 알려진 성분으로는 카로텐, 리놀렌산 등이 분리 보고된 바 있으며, 혈당 및 콜레스테롤 강하작용, 혈압 강하 작용 등을 나타낸다고 보고되어 있다(정보섭 등의 문헌[도해 향약 대사전(식물편), 영림사 p826-828, 1998 발간] 참조).

본 발명의 목적은 신규한 피롤 유도체 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 피롤 유도체를 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간질환 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 피롤 유도체를 포함하는 간질환의 예방을 위한 건강 식품을 제공하는 것이다.

도 1는 구기자로부터 활성 화합물들의 분리도이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 건조시킨 구기자(Lycium chinenseMILL)로부터 통상의 추출 및 분리방법으로 얻어진 하기 화학식 1의 피롤 유도체 화합물들을 제공한다.

화학식 1

상기 식에서,

본 발명의 피롤 유도체 화합물들은 통상의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있는데, 먼저, (1) 건조시킨 구기자와 함께 이의 약 1 내지 5배의 저급 알콜 , 예를 들어, 메탄올, 에탄올을 추출장치에 넣고 1 내지 24시간 동안, 30 내지 80℃로 초음파 추출 또는 환류 추출하고 이를 농축기로 농축 및 건조하여 저급알콜 추출물을 얻고 이 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 필요에 따라, 분리된 특정 분획물을 다시 역상 컬럼 크로마토그래피법 또는 세파덱스 컬럼 크로마토그래피법을 통하여 신규한 화학구조의 피롤 유도체들을 분리할 수 있다.

상기와 같은 분리공정을 통하여 얻어진 피롤 유도체 화합물들에 대한 간독성 해소 활성실험, 간질환 예방 및 치료활성실험 결과, 상기한 피롤 유도체 화합물들은 상기 간독성 해소, 간질환 예방 및 치료, 및 간질환 관련 효소 저해 실험에 있어서 유의성있는 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 각종 간질환, 즉 간염, 지방간, 간경화증뿐 아니라, 간장독성 등의 예방 및 치료에 유용할 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 구기자로부터 분리된 신규 화학구조의 피롤 유도체 화합물들을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간질환 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다. 또한 상기 화합물들 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

본 발명의 상기 피롤 유도체 화합물들을 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 각종 간질환, 특히 간염, 간독성에 대한 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의하여 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 상기 피롤 유도체 화합물들을 함유한 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 유효성분으로서 체중 1kg당 0.01 내지 10g, 바람직하게는 1 내지 5g의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 증증도에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 상기 피롤 유도체 화합물들은 각종 간질환 예방 등의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 피롤 유도체 화합물들의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물에 대해서는 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에 대해서는 100m1를 기준으로 1 ∼ 30g, 바람직하게는 3 ∼10g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 피롤 유도체 화합물들을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 크실리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100m1당 일반적으로 약 1 ∼ 20g, 바람직하게는 약 5 ∼ 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

건강식품용 개발을 위하여 본 발명의 상기 피롤 유도체 화합물들을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 음료류, 껌류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들만으로 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 시약 및 측정기기

컬럼크로마토그래피용 실리카겔은 키젤 겔 60(40-60 μm, 230-400 mesh, 제품번호 9385, 독일 머크사) 및 리크로프렙(Lichroprep RP-18, 40-63 μm 제품번호 11447, 미국 EM 사이언스사)를 사용하였으며, 컬럼크로마토그래피용 세파덱스는 세파덱스 LH-20 (비드 크기 25-100 μm, 스웨덴 파마시아사), 컬럼크로마토그래피용 XAD-2 수지 및 XAD-2 수지(일본 미츠비시사)를 사용하고, 박층 크로마토그래피용 프리코티드 플레이트는 키젤 겔 60 F₂₅₄(제품번호 5715,독일 머크사), RP-18 (제품번호 15685, 독일 머크사) 및 셀라이트 (셀라이트 545, 일본 쥰세이 화학사)를 사용하였으며, 사용기기중 오토클레이브는 일본 산요사 제품을(산요 MLS 3000), 분석용 저울은 스위스의 메틀러사 제품을(메틀러 AE 50), 원심분리기는 미국 듀폰사 제품(Technospin R.)을, ELISA 판독기는 미국 제품(Molecular Devices Emax), 증류기는 일본 제품(이엘라 NE)을, HPLC는 펌프는 히타치 L-6200제품(일본), 탐지기는 히타치 L-4000제품(일본), 컬럼은 마이크로소르브(Microsorb)^RC18 8ψ-299-C5 제품(라이닌 인스투루멘트사 미국)을 사용하였으며, 적외선 스펙트럼은 퍼킨 엘머 1710 분광기를(미국), 액체 신틸레이션 카운터는 Wallac 4019 모델(미국)을 밀리포아 여과지는 미국 밀리포아사 제품을, MS 스펙트럼은 VG Trio 2 분광기(영국) 및 JEOL JMS AX 505 WA 분광기(일본)를, 융점측정장치는 스위스의 Buchi 535모델을 NMR 스펙트럼은 JEOL GSX 400 분광기(400 MHz, 미국) 및 JEOL LA 300 분광기 (300 MHz, 미국), 및 부르커 AMX 500 분광기(500 MHz, 독일), pH 측정은 피닉스 PMS-500 모델(미국), 위상차현미경은 올림푸스 CK-2모델(일본), 폴라리미터는 JASCO DIP-1000 모델(일본), 소니케이터는 브랜슨(Branson) 5200모델(영국), (원심감압농축기는 사벤트(Savant) SVC-100H모델(미국), 자외선 분광기는 쉬마쯔(Shimadzu) UV-2101 모델(일본)을 사용하였다.

참고예 2: 실험 동물 및 간세포 보호 활성 측정용 시약 조제

흰쥐 (위스타, 수컷, 150-200 g)는 서울대학교 실험동물 사육장으로부터 공급받은 것을 온도 22 ± 1 ℃, 습도 60 ± 5 %로 유지되며 12시간 간격으로 명암을 바꿔주는 사육실에서 사료와 물을 마음껏 섭취하도록 하였다. 일차배양 간세포는 실험 하루 전부터 굶겨 공복 상태인 흰쥐에서 직접 취하였으며 간보호용 활성 측정용 시약으로 L-알라닌(A 3534), 암포테리신 B(A 4888), 콜라게나제 IV형(C 5138), 덱사메타손(D 1756), 황산 겐타마이신(G 3632), HBSS(H 2387), 인슐린(I 1881), L-세린(S 5511), 트립판 블루(T 8154), 웨이마우쓰(Waymouth) MB 752/1(W1625) 등은 시그마 사(미국 세인트루이스소재) 제품을, 우레탄(24310-0401)은 일본 쥰세이 화학 주식회사제품을, 소태아혈청은 히클론(Hyclone) (미국 유타주 소재) 제품을 사용하였으며, GPT 키트는 영동제약에서 구입하였고 실리빈(S 0417)은 시그마로부터 구입하였다.

실시예 1: 4-[포르밀-5(히드록시메틸)-1 H -피롤-1-일]부타노익 산의 분리

경동시장에서 구입한 건조상태의 구기자 100 kg을 에탄올 100 ℓ로 48시간 동안 30℃에서 초음파 추출하여 얻은 추출물 37.5 Kg을 물 1ℓ로 현탁한 후, 다시 분획 (분획용매:CHCl₃-MeOH= 5:1, 20 L)을 수행하여 얻은 비극성 용매 가용성 분획물 10 Kg을 다시 C₁₈역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 컬럼(용출 용매: 메탄올, 유속: 1 ml)를 실시하여 7개의 분획(300 ml 씩)으로 나누어 얻어진 3번째 분획 20g을 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 (전개용매: CHCl₃-MeOH= 10:1-0:1, 컬럼사이즈 4 X 60cm)를 수행하여 100ml씩 분취하여 얻어진 첫번째 분획 3g을, 다시 세파덱스 컬럼크로마토그래피(Sephadex LH-20, 용출용매: 메탄올)을 수행하여 10ml씩 분취하여 얻어진 4번째 분획 20 mg을 모아 다시 HPLC(히타치 L-6200, AcCN-H₂O=25:75, 유속 2 ml/분)를 통해 정제하여 갈색 분말의 화학식(C₁₀H₁₃O₄N) 4-[포르밀-5(히드록시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산 2 mg을 얻었다.

IR (neat) ν_max; 3443, 2923, 1715, 1651 cm^-1

LC-MS (m/z) ; 210 [M-1^-]

¹H-NMR (300MHz, CD₃OD) δ: 9.41, 6.98, 6.26, 4.64, 4.39, 2.31, 2.00.

¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 179.50, 177.30, 141.62, 132.35, 124.50, 110.64, 56.10, 44.54, 29.98, 25.82.

실시예 2: 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1 H -피롤-1-일]부타노익 산의 분리

실시예 1에 기재된 분리과정 중 C₁₈역상 실리카겔로부터 얻은 4번째 분획 12g을 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 (전개용매: CHCl₃-MeOH= 10:1-0:1, 컬럼사이즈 4 X 60cm)를 수행하여 100ml씩 분취하여 얻어진 4번째 분획 500 mg을, 다시 세파덱스 컬럼크로마토그래피(Sephadex LH-20, 용출용매: 메탄올)을 수행하여 10ml씩 분취하여 얻어진 2번째 분획을 HPLC(전개용매 MeOH-H₂O =40:60, 2ml/분)실시하여 갈색분말의 화학식(C₁₁H₁₅O₄N) 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산 2.2 mg을 얻었다.

IR (neat) ν_max; 3438, 2927, 1725, 1659 cm^-1

LC-MS (m/z) ; 224 [M-1^-]

¹H-NMR (300MHz, CD₃OD) δ : 9.44, 6.98, 6.28, 4.49, 4.36, 3.35, 2.29, 2.00

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 181.87, 175.90, 141.91, 134.62, 126.61, 113.59, 67.15, 56.10, 46.79, 33.25, 28.72.

실시예 3 : 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1 H -피롤-1-일]부타노에이트의 분리

실시예 1에 기재된 분리과정 중 C₁₈역상 실리카겔로부터 얻은 4번째 분획 12g을 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개용매: CHCl₃-MeOH= 10:1-0:1, 컬럼사이즈 4 X 60cm)를 수행하여 100ml씩 분취하여 얻어진 5번째 분획 600 mg을, 다시 세파덱스 컬럼크로마토그래피(Sephadex LH-20, 용출용매: 메탄올)를 수행하여 10ml씩 분취하여 얻어진 7번째 분획을 HPLC (AcCN- H₂O=25:75, 2ml/분)를 통해 분리 정제하여 갈색분말의 화학식(C₁₂H₁₇O₄N) 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노에이트 1.8 mg을 얻었다.

IR (neat) ν_max; 2923, 1737, 1660 cm^-1

EIMS (m/z) ; 239 [M⁺]

¹H-NMR (300MHz, CD₃OD) δ: 9.44, 6.98, 6.28, 4.48, 4.36, 3.65, 3.34, 2.35 , 2.00.

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 181.94, 175.89, 141.87, 134.67, 126.75, 113.74, 67.12, 59.01, 52.93, 46.60, 32.44, 28.29.

시험예 1 : 구기자 추출물 분리 화합물들의 간독성 해소 효과

상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 얻은 화합물들의 간독성 해소 효과를 하기와 같이 확인하였다.

(1) 실험재료 준비 및 간세포 배양

흰쥐의 간세포는 배리(Berry)와 프렌드(Friend)의 방법 (J. Cell. Biol., 43, 506-520 1984 참조)을 약간 수정한 2 단계 콜라게나아제 관류법을 이용하여 분리하였다 [Kleiman, Anal. Biochem., 94, 308-312 (1979) 참조]. 간세포를 얻기 위하여 우레탄(1 g / ㎏ 체중)으로 마취시키고 70%에탄올로 복부를 소독한 후 개복하였다. 간문맥에 21 게이지 카테터를 삽관하여 약 50 ㎖의 HBSS 용액을 30 ㎖/분의 속도로 관류시켰으며, 동시에 하대정맥을 신정맥 아래에서 잘라 혈액을 제거하였다. 다음 흉강을 열어 상대정맥에 18 게이지 카테터를 삽관한 다음, 하대정맥을 묶어 주어서, 소화용액이 상대정맥을 통하여 공급용기로 되돌아오는 재순환이 이루어지도록 하였다. 이산화탄소와 산소 혼합기체를 공급해주면서 HBSS 95 ㎖과 콜라게나제 5 ㎖ (50 ㎎/5 ㎖ HBSS, 최종 농도 0.05 %)로 구성된 소화용액으로 10-15분간 재순환을 시켰다. 간세포가 소화된 후 간을 떼어내어 HBSS 60 ㎖을 가한 후 간막을 가위로 열어서 간세포가 유리되게 한 다음, 거즈 및 렌즈 페이퍼로 여과하였다. 여액을 50 g에서 4 분간 원심분리한 다음 상등액을 버리고, 다시 배양액으로 같은 조건에서 원심분리한 후 세포 현탁액을 얻었다. 이렇게 얻은 간세포 현탁액을 5×10⁵세포 / ㎖ 농도로 희석하여 콜라겐으로 미리 도포된 배양 용기에 이식하였다.

배양액으로는 웨이마우스 MB 752/1 배양액 [조성: 5% 소태아혈청, 2.0 ㎎/㎖ 소 혈장 알부민 (분획 V), 10^-6M 덱사메타손, 10^-7M 인슐린, 5.32×10^-2M L-세린, 4.09×10^-2M L-알라닌, 2.67×10^-2M 중조, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 5 ㎍/㎖ 암포테리신 B 또는 50 ㎍/㎖ 황산 겐타마이신]을 사용하였다. 일정한 습도와 온도가 유지되는 37 ℃ 배양기에서 공기 (95 %)와 이산화탄소 (5 %)의 혼합기체를 계속 공급하면서 세포를 배양하였다.

(2) 사염화탄소로 인한 간독성의 해소 효과

간세포를 배양한지 1.5 시간 후 새로운 배양액으로 갈아주고 다시 24 시간 동안 계속하여 배양한 후 6.5 mM 사염화탄소를 함유한 배양액으로 1.5 시간 동안 처리하여 세포독성을 유도하였다. 사염화탄소 투여 직전에 검색하고자 하는 시료를 각 농도별(0.5, 1. 10, 50μM)로 투여하고 1.5 시간 더 배양한 후 그 배양액을 취하여 간세포 보호 활성을 측정하였으며 시료는 DMSO(최종 농도, 0.1 % 이하)로 용해시킨 후, HBSS로 희석시켜 이를 밀리포아 멤브레인(0.22 ㎛)을 사용하여 여과시켜 무균상태로 제조하여 사용하였으며, 비교군은 실리빈을 사용하였으며, 대조군은 시료를 처치하지 않은 군을 사용하였다.

세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 GPT 키트를 사용하여 라이트만(Reitman)-프랭클(Frankel)의 방법 (Am. J. Cli. Pathol., 28, 56-63 1957 참조)으로 GPT의 활성을 측정하였으며, 통계적 유의성을 검토하기 위해 대조치로부터의 변동을 아노바(ANOVA) 시험법에 의해 판정하였다. P 값이 5 % 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

하기 표 1에 나타난 바와 같이, 화합물 1, 2, 3의 사염화탄소로 인해 독성이 유발된 일차 배양 흰쥐의 간세포에 대한 보호활성을 검색한 결과, 화합물 1은 0.5 μM에서 54.4%, 화합물 2는 10μM에서 36.8%, 화합물 3은 10μM에서 48.1%의 간세포보호 효과를 나타내었다.

상대적 보호율은 하기와 같은 수학식으로부터 산출되었다.

사염화탄소로 독성을 유발한 일차배양 흰쥐의 간세포에 대한 보호 활성

화합물	상대적 보호율 (%)
화합물	0.5 μM	1μM	10μM	50μM
1	54.4	49.9	-	-
2	n.d.	15.8	36.8	-
3	n.d.	41.7	48.1	39.5
실리빈	-	-	-	55.5

본 발명의 실시예 1 내지 3 화합물들은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 주사제 및 액제 등과 같은 제제형태로 제제화하여 사용될 수 있다.

하기에 제제 실시예를 예시한다.

[제제실시예]

[산제의 제조]

실시예 1 화합물 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

[정제의 제조]

실시예 1 화합물 100mg

옥수수전분 100mg

유 당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[캡슐제의 제조]

실시예 1 화합물 100mg

옥수수전분 100mg

유 당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 젤라틴의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[주사제의 제조]

실시예 1 화합물 100mg

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.

또한 하기와 같은 방법으로 건강식품을 제조하였다.

[선식의 제조]

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후, 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 화합물분말을 다음의 비율로 배합하여 과립을 만들었다.

[곡물류 : 현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%,

종실류 : 들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%,

실시예 1 화합물 : 3 중량%, 영지 0.5중량%, 지황 0.5중량%]

본 발명의 신규한 화학 구조의 피롤 유도체 화합물들은 우수한 간독성 해소효과를 나타내므로 각종 간 질환의 예방 및 치료제로서 유용하다.

Claims

하기 화학식 1의 피롤환 유도체.

화학식 1

상기 식에서,

R¹내지R³는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C_1-4알킬기이며, 단 동시에 수소원자는 아니다.
제1항에 있어서,

4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산, 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산, 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 피롤환 유도체.
제1항의 피롤환 유도체를 약제학적으로 허용하는 담체와 함께 포함하는 간질환 예방 및 치료용 조성물.
제3항에 있어서,

상기 피롤환 유도체가 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산, 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산, 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 간질환 예방 및 치료용 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서,

간질환이 간염 또는 간경화인 조성물.
제1항의 피롤환 유도체를 식품학적으로 허용되는 첨가제와 함께 포함하는, 간질환 예방용 건강식품.
제6항에 있어서,

상기 피롤환 유도체가 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산, 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노익 산, 4-[포르밀-5(메톡시메틸)-1H-피롤-1-일]부타노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 간질환 예방용 건강식품.
제6항 또는 제7항에 있어서,

음료형태인 건강식품.