KR20020071650A - 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산, 이의 유도체 및 이의 제조방법 및 이를 함유하는 ＨＭＧ-ＣｏＡ 환원효소 저해제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 김치 추출물로부터 분리하여 구조결정된 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산, 이의 유도체 및 유기합성법에 의한 이의 제조방법에 관한 것이며, 또한 이를 함유하는 HMG-CoA 환원효소 저해제, 상기 HMG-CoA 환원효소 저해 활성에 기인한 고콜레스테롤혈증 치료제 및 항동맥경화제에 관한 것이다.

일반식 1

상기 식에서,

X는 수소, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬, 페닐, 나트륨, 칼륨, 암모늄염이다.

Y는 수소, 아세틸, 프로피오닐, 부티로일, 벤조일이다.

Description

3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산, 이의 유도체 및 이의 제조방법 및 이를 함유하는 ＨＭＧ-ＣｏＡ 환원효소 제해제{3-(4'-hydroxyl-3',5'-dimethoxyphenyl) propionic acid and its derivatives, preparation method thereof and HMG-CoA reductase inhibitor composition containing thereof}

본 발명은 김치로부터 분리 및 구조결정된 동맥경화의 발생을 억제하는 효과가 있는 활성물질인 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 및 유기합성법에 의해 합성된 상기 활성 물질 및 이의 유도체 (일반식 1의 화합물)에 관한 것이다.

동맥경화는 혈관 내벽에 지질 및 기타 물질이 축적되어 심장질환 및 뇌졸중 등의 성인병질환을 일으켜 사망에 이르게 하는 현대인 사인의 1순위를 차지하기 때문에 이의 발생 억제 및 치료를 위한 많은 노력이 있어 왔다(통계청. 1999).

동맥경화의 발생은 지질대사 이상으로 일어나며 혈액 내 지방의 농도가 높을 때 특히 콜레스테롤의 농도가 높을 때 그 발생 빈도가 높은 것으로 보고되고 있다(Casteli et al. 1986). 혈 중 콜레스테롤 농도는 식품으로 섭취한 외인성 콜레스테롤과 체내에서 합성되는 내인성 콜레스테롤에 의해 이루어지므로 혈 중 콜레스테롤 농도를 조절하는 방법은 지질물질의 섭취를 억제하거나 이들의 흡수 억제 또는 배설 촉진 등에 의해 외부로부터 체내로 들어오는 것을 조절하는 방법과 체내에서 콜레스테롤 대사 조절에 관여하는 HMG-CoA 환원효소와 ACAT (acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase)을 조절하는 방법이 있다. HMG-CoA 환원효소는 간에서 콜레스테롤 합성을 조절하는 중요한 율속효소이며 ACAT는 소장, 간 및 기타 조직의 유리 콜레스테롤을 에스테르화하는 효소로서 식이 콜레스테롤의 장내 흡수 와 간장에서 초저밀도지단백질(very low density lipoprotein, VLDL)-콜레스테롤의 분비 및 동맥혈관의 콜레스테롤 축적에 관여한다. 그리고 혈액 중에서 콜레스테롤을 가장 많이 함유하고 있는 저밀도지단백질(low disndity lipoprotien, LDL)의 산화를 억제함으로서 혈관 내 콜레스테롤의 축적을 억제하여 동맥경화의 발생을 억제할 수 있는 것으로 보고되고 있다(Miesenock et al. 1990). 지금까지의 보고에 의하면 콜레스테롤 흡수를 저해하는 제품, 콜레스테롤 대사 조절에 관여하는 효소의 활성을 제해하는 제품과 LDL 산화를 억제하는 항산화제가 사람을 포함한 여러 실험동물에서 혈 중 콜레스테롤 농도를 낮추는 효과를 나타내었을 뿐만 아니라 항동맥경화 효과를 나타내었다. 이와 관련하여 많은 신약들이 합성 또는 개발되고 있는데 현재까지 개발되어 시판되는 고지혈증 치료제를 살펴보면 콜레스테롤 흡수를 억제하고 배설을 촉진하는 효과가 있는 것으로 LDL-콜레스테롤의 혈중 농도를 낮출 수 있는 콜레스티라민 (Cholestylamine)(Aki Nakai et al. 1996), 콜레스티폴 (Cholestipol), 클로티브레이트 (Clotibrate), 젬리브로질 (Gemlibrazil)(Stein, 1994) 과 같은 콜레스테롤 유도체들이 있다. 그리고 콜레스테롤 생합성에 관여하는HMG CoA 환원효소 저해제인 로바스타틴 (Lovastatin : Havet, 1987), 심바스타틴 (Simvastatin: Illingworth et al. 1987), 프로바스타틴 (Proavastatin : Kajinaml et al, 1986) 등이 개발되어 시중에 판매되고 있으나 고콜레스테롤혈증을 억제할 수는 있지만 간 독성 등의 심각한 부작용을 수반하고 있어 이상적인 약물요법으로는 적합하지 못한 것으로 알려져 있다. 또 니코틴산 등은 간의 LDL 이나 VLDL의 생합성을 저하시켜(Grundy et al., 1981) 심혈관계질환의 발생빈도를 낮추려 시도하고 있으나 부작용이 심하여 일부국가에서는 사용을 금지하고 있다. 따라서 콜레스테롤 저하 물질의 개발에 있어서 인체에 부작용을 일으키지 않는 천연물로부터 개발된 물질에 관심을 기울이지 않을 수 없다.

배추김치는 한국인이 상용하는 식품으로 김치를 만드는 재료인 배추의 beta-sitosterol(Fujiwara. 1972), 고추의 캡사이신 (capsaicin)(Kawada et al. 1986), 마늘의 메틸시스테인 술폭사이드 및 S-알릴시스테인 술폭사이드(Stacy et al. 1993), 그리고 파와 양파 등의 알릴 화합물(Cheigh et al. 1994) 등이 지질을 저하시키는 효과가 있음이 동물 또는 임상실험에서 보고되고 있고, 한국인의 심혈관계 질환의 발병율이 서구인에 비해 낮다고 보고되고 있다. 이러한 보고들과 관련지어 본 연구팀은 김치의 지질 저하 효과 및 항동맥경화 효과를 보고하였다. 김치를 섭취한 흰쥐의 혈장 콜레스테롤, 중성지방 및 LDL-콜레스테롤은 김치 첨가 농도량에 비례하여 감소하였고, 김치섭취군의 HMG CoA 환원 효소 활성은 억제되었다 (권 등, 1998). 이러한 결과는 노화촉진 쥐에게 1년 동안 김치를 섭취시켰을 때 확인되었는데 역시 혈중지질 농도가 감소하고, 김치군의 동맥경화지수가 감소하고 이 군의HMG CoA 환원효소의 활성이 억제되었다(이 등, 2001). 이러한 김치의 항동맥경화 활성은 김치의 재료인 배추, 마늘, 또는 고춧가루 등의 원재료 자체보다는 김치의 발효과정 중 생성된 물질에 기인하는 것으로 생각되었고(Song et al., 1999), 이에 김치의 용매 분획의 항동맥경화에 대한in vitro와in vivo연구 결과, 김치의 디클로로메탄 분획의 효과가 가장 큰 것으로 확인되었다.

이에, 본 발명자들은 천연물로부터 동맥경화를 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 분리하고자 하였으며, 본 연구팀의 선행 연구를 바탕으로 동맥경화를 예방할 수 있는 기능성물질이 김치에 있을 것으로 생각하고 김치 추출물로부터 항동맥경화 효과가 있는 활성물질을 분리 동정하고자 연구를 하게 되었다.

아울러, 김치로부터 항동맥경화성 물질을 분리하였다 하더라도 천연물로부터 활성물질을 대량으로 얻기는 불가능하므로, 김치로부터 분리한 활성물질의 구조를 확인하여 이를 유기합성법으로 대량 생산하고자 연구하게 되었다. 그리고 이 활성물질의 신약으로의 가능성을 개발하기 위하여 유도체의 합성에 관한 연구도 하게 되었다.

그 결과, 배추김치의 디클로로메탄 분획으로부터 분자량 226의 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산을분리하여 LDL 산화억제 효과 및 DPPH 유리기 소거능을 측정하여 항동맥경화성이 있는 물질임을 확인하였고, 이를 유기합성하여 김치에서 분리한 물질과 동일 물질임을 화학적 및 생물학적으로 확인하였다. 유기합성한 활성물질은 고콜레스테롤혈증을 낮추는 효과 뿐만 아니라 동맥의 지질침착을 억제하고 간을 보호하는 효과가 기존의 치료제인 심바스타틴 보다 뛰어나 동맥경화 예방 뿐만 아니라 치료의 기능도 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 배추김치의 디클로로메탄 분획으로부터 활성물질을 정제하는 과정을 도시한 것이다.

도 2은 배추김치의 디클로로메탄 분획으로부터 추출된 활성물질 (제조예 2의 화합물)의 LDL 산화억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3는 유기 합성된 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산 (제조예 4의 화합물)의 지질저하 효과를 조사하기 위해 디자인한 동물실험을 나타낸다.

도 4 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 정맥으로 투여하였을 때의 혈장 콜레스테롤 및 중성지질의 저하효과를 나타낸 그래프이다.

도 5은 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 정맥으로 투여하였을 때의 저밀도 지단백질 저하 및 고밀도 지단백질 상승효과에 관한 그래프이다.

도 6은 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 정맥으로 투여하였을 때의 간 보호 작용에 대한 것으로, 정상대조군과 심바스타틴 처리군 및 본 발명의 물질인 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산를 투여한 경우를 비교할수 있도록 광학현미경 사진을 배열하였다.

도 7는 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 정맥으로 투여하였을 때의 동맥지질 침착 저하 효과에 대한 수단(sudan) 염색 결과를 나타낸 사진이다.

도 8는 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 경구로 투여하였을 때의 혈장 콜레스테롤 및 중성지방 저하 효과에 관한 그래프이다.

따라서, 본 발명은 김치 추출물로부터 분리 및 구조결정된 HMG-CoA 환원효소의 활성을 저해함으로써 콜레스테롤 저하 효과가 있는 하기 일반식 1의 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 및 그의 유도체에 관한 것이다.

상기 식에서,

X는 수소, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬, 페닐, 나트륨, 칼륨, 암모늄염이고,

Y는 수소, 아세틸, 프로피오닐, 부티로일, 벤조일이다.

또한, 본 발명은 상기 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 및 그의 유도체의 유기합성 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 HMG-CoA 환원효소 제해의 활성을 이용한 고콜레스테롤혈증 치료제 및 항동맥경화제에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 및 그의유도체를 활성성분으로 포함하는 HMG-CoA 환원효소 제해제에 관한 것이다.

본 발명은 하나 또는 그 이상의 무독성, 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 희석액, 또는 다른 활성성분과 함께 상기 일반식 (Ⅰ)의 화합물을 치료학적으로 유효한 양으로 함유하는 HMG-CoA 환원효소 저해제(β-hydroxy-β-methylglutaryl-CoA reductase inhibitor) 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사, 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 들어있다.

경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘, 인산나트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말, 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴, 아카시아 등의 결합제; 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 , 탈크 등의 윤활제와 같은 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 함께 섞여진 상태로 본 발명의 화합물을 가지고 있다. 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용한다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용해도 좋다. 경질캅셀은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질캅셀은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol), 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀, 올리브 오일등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다.

수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는, 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스검(gum tragacanth), 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유한다.

유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀, 세틸 알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유한다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료, 감미료 등을 함유하는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.

분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제, 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 가지고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제는, 예를 들어, 감미료, 향신료, 착색제 등이 있다.

유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것이다.

시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 슈크로스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합한 것이다.

비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사한다. 사용 가능한 부형제나 용매중에는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노-, 디- 글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.

본 발명의 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 경우, 활성성분인 화합물(Ⅰ)의 용량은 환자의 나이, 체중, 일반적 건강 상태, 성, 식사, 투여시간, 배설 속도, 약물 병용, 치료하는 동안의 질병의 정도 등에 따라 다르지만, 질병에 따라 0.01∼140mg/체중kg 까지를 매일 사용할 수 있으며, 환자 당 0.5mg∼7g까지 사용할 수 있다.

한편, 한가지 제형을 결정짓기 위해 담체 물질과 섞는 본 발명의 화합물의 양은 투여 경로별 방식과 치료하는 환자에 따라 달라진다. 예를 들어, 사람에게 경구투여를 목적으로 하는 제형은 전체 조성중에서 5∼95%를 차지하는 담체 물질들과 0.5mg∼5g의 활성성분을 함유하게 되고, 사람에게 비경구 투여를 목적으로 하는 제형은 전체 조성 중에서 5∼99%를 차지하는 담체 물질들과 0.1mg∼2.5g의 활성성분을 함유하게 된다.

본 발명의 물질을 고콜레스테롤혈증을 유발한 토끼에게 활성물질을 정맥 및 경구 투여하면서 사육한 토끼의 혈장 지질 및 지단백질의 농도를 측정하고, 혈장내 GOT, GPT의 활성도와 간조직의 HMG-CoA 환원효소의 활성도를 측정하며, 장기조직의 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 측정한 후, 간의 미세조직 및 동맥의 지질침착도를 측정하여 김치 활성성분의 항동맥경화 효과를 조사한 결과, 혈장지질 농도 및간 조직의 지질을 저하시키고 콜레스테롤 합성저해의 중요한 지표로 이용되고 있는 HMG-CoA 환원 효소의 활성을 억제하여 콜레스테롤 대사를 조절하는 효과가 있으며, 이 효과는 고콜레스테롤혈증 치료제로 광범위하게 쓰이는 심바스타딘과 유사할 뿐만 아니라 간 독성에 대한 보호 효과가 있어 콜레스테롤조절제 및 항동맥경화로 뛰어난 효과가 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 배추김치의 디클로메탄분획을 제조예 1을 통하여 수득하였다. 수득된 배추김치의 디클로로메탄 분획으로부터 활성물질의 정제하여, 하기 단계를 통해 활성물질을 분리하였다.

3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산의 구조를 결정하는 단계(제조예 2);

제조예 2의 화합물의 항동맥경화성을 LDL 산화억제능과 유리기 소거능으로 확인하는 단계;

제조예 2의 화합물의 유도체의 유기합성 단계 (제조예 3);

제조예 2의 화합물의 유기합성단계 (제조예 4);

제조예 2과 제조예 4의 화학적 생물학적 동등성 확인 단계;

토끼에 고지방식이를 섭취시켜 고콜레스테롤혈증을 유발하는 단계;

고콜레스테롤혈증 토끼에 일반식이를 섭취시키면서 정맥으로 제조예 4를 주사하여 일정시간 간격으로 혈액을 채취하는 단계;

상기방법으로 채취한 혈액의 중성지방 및 콜레스테롤을 측정하는 단계;

혈장으로부터 HDL-콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤을 분리하여 콜레스테롤 농도를 측정하는 단계;

고콜레스테롤혈증 토끼에게 고지방식이를 섭취시키면서 정맥으로 제조예 4의 화합물을 주사하여 채취한 혈액으로부터 혈장지질 및 HDL-C와 LDL-C를 측정하는 단계:

상기의 토끼를 해부하여 조직 및 동맥을 절취하는 단계;

간조직으로부터 마이크로좀을 분리하고 이를 효소원으로 하여 HMG CoA 환원효소의 활성을 측정하는 단계;

간조직으로부터 광학현미경을 이용하여 간조직을 촬영하는 단계;

동맥의 지질침착 정도를 수단염색을 통하여 확인하는 단계.

고콜레스테롤혈증 토끼에게 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 (제조예 4의 화합물)을 경구 투여하여 채취한 혈액으로부터 혈장 콜레스테롤과 중성지방을 분석하는 단계로 구성한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법 단계별로 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이들 방법에 의해 제조된 화합물에만 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 영문약자는 다음과 같은 의미를 갖는다.

BnBr = 벤질브로마이드 (benzyl bromide)

NaH = 수소화나트륨(sodium hydride )

CH₃I = 요오드화 메틸 (methyl iodide)

DIBAL = 수소화이소부틸알루미늄(diisobutylaluminum hydride )

CH₂Cl₂= 디클로로메탄(dichloromethane )

PDC = 중크롬산 피리디늄(pyridinium dichromate)

DMF = 디메틸포름아미드(dimethyl formamide)

PPh₃= 트리페닐포스핀(triphylphosphine)

t-BuOK = t-부톡시화칼륨 (potassium t-butoxide)

Pd/C = 팔라듐 탄소(palladium on carbon)

EtOH = 에틸알코올(ethyl alcohol)

MeOH = 메틸알코올 (methyl alcohol)

TMS = 테트라메틸실란(teterametylsilane ) : NMR 스펙트럼의 기준물질

CDCl₃= 츄테로클로로포름 (deuterated chloroform) : NMR 스펙트럼의 용매

본 발명에 따른 물질의 동정은 질량분석기 및 람버트 등의 방법(Lambert et al., Organic Structural Analysis, MacMillan Publ. Cl., NY 1993)에 따라 NMR(베리언사 제품, 200MHz)를 사용하여 행하였다.

제조예 1

김치로부터 디클로로메탄 분획을 수득하는 과정은 하기와 같다.

김치의 동맥경화 예방효과를 지니고 있는 활성 성분을 분리하기 위해서 동결 건조한 김치 3kg을 헥산으로 추출하고 탈지한 다음 100% 메탄올로 추출하여 메탄올추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물에 극성이 다른 용매를 사용하여 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 등으로 순차적으로 분획하였다. 각분획의 활성은 LDL 산화를 측정하여 억제 효과가 가장 큰 디클로로메탄 분획을 선정하였다. 동결건조 김치 3kg으로부터 디클로로메탄분획 49.8g을 얻었으며 수득률은 1.66%였다.

제조예 2

디클로로메탄 분획으로부터 유효성분인 하기 일반식 10의 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산의 정제 및 구조결정

배추김치의 디클로로메탄 분획의 헥산층과 메탄올층의 유리기 소거능과 LDL 산화억제능을 비교하였을 때 메탄올층의 효과가 높았으므로 이 층으로부터 활성물질을 정제하였다.

샘플	50% reduct (SC50)㎕/m
메탄올 분획	77.12±4.12
헥산 분획	182.4±11.83
Vit. C	2.68±1.28

티클로로메탄의 메탄올층을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피, Sep-pak 카트리지를 통과시키면서 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 분리하였다(도 1 참조). 정제과정 중 활성은 7% DPPH 분무법으로 확인하였다. 정제된 제조예 2는 mp = 101-102도이고 IR, EI-MS,¹H-NMR,¹³C-NMR의 분석결과(표 2, 표 3)를 바탕으로 분자량 226이고, 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산으로 구조결정을 하였다.

¹H-NMR 결과

Proton (CDCl3, TMS)	제조예 2 (δ)
233' , 5'2' , 6'4' (OH)1' (COOH)	2.70 ( t, 2H, J = 7.69 Hz )2.85 ( t, 2H, J = 7.69 Hz )3.83 ( s, 6H )6.37 ( s, 2H )5.5 ( br, 1H )10.5 ( br, 1H )

¹³C-NMR의 결과

Carbon (CDCl3, TMS)	제조예 2 (δ)
13＇, 5＇1＇4＇2＇, 6＇OCH323	177.6147.0133.2131.3104.956.335.930.9

실시예 1

제조예 2의 화합물 (3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산)의 in vitro 에서의 항동맥경화능 측정

제조예 2의 화합물을 2mg 취하여 메탄올로 25ml로 정용한 후 각각의 농도를1.25μg/ml에서 80μg/ml이 되게 9단계로 희석한 후 희석된 시료용액 4ml과 1.5 x 10^-4M/ml 농도로 메탄올에 용해시킨 DPPH 용액 1ml을 혼합하여 실온에서 30분간 방치 후, 520nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH기를 50% 소거하는 데 사용된 농도를 표 4에 나타내었다. 제조예 2의 유리기 소거능은 비타민 C에 비해 4.5배 정도 높았다.

샘플	50% reduct (IC50)μM
제조예 2Vt.C	3.6±0.0815.6±0.32

동맥경화를 발생시키는 주요한 원인으로 알려진 LDL 산화를 억제하는 제조예 2의 효과를 살펴보았다. LDL 단백질의 농도 100μg/ml이 되게 제조한 산화용액에 시료물질을 농도별로 첨가하고 Cu⁺⁺의 농도가 2μM되게 첨가하여 37℃에서 2시간 산화시켜 생성된 산화생성물을 0.5ml 취하여 여기에 TBARS 용액 1ml을 섞어 이를 95∼100도 수욕상에서 20분간 반응시켜 생성된 말론디알데히드 농도를 532nm에서 측정한 결과를 살펴보면 도 2에 나타낸 바와 같이 제조예 2는 LDL 산화를 농도 의존적으로 억제시켰으며, 그 효과를 항산화제로 알려진 BHT와 동일농도에서 비교하였을 때 4배 이상 높았다.

제조예 3 및 제조예 4

3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산(제조예 4의 화합물) 및 그의 에스테르 (제조예 3의 화합물)의 유기합성

상기 제조예 2에서 구조 결정된 활성물질을 대량생산하기 위하여 하기 반응식 1에 따라 제조할 수 있다.

일반식 2의 화합물의 제조

(2-에톡시-2-옥소에틸)(트리페닐)포스포늄 염의 제조:

140ml의 무수 DMF에 9.42g의 트리페닐 포스핀을 녹이고 상온에서 5.0g의 브로모아세트산에틸을 첨가한 후 12시간 동안 환류시킨 후 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔여물질을 디클로로메탄 200ml와 디에틸 에테르200ml와 혼합하여 12시간동안 교반시킨 후에 디클로로메탄층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 제거한 후, 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:3)을 사용하여 컬럼 클마토그래피하여 화합물 2 10.8g을 얻었다. 이때의 Rf는 0.3이었고 수율은 85%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 1.05 (t, 3H, J = 6.96Hz), 3.22 (s, 2H), 4.04 (q, 2H, J = 7.32Hz), 7.38-7.82 (m, 15H)

일반식 4의 화합물의 제조

4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조산 메틸에스테르의 제조:

15g의 3,4,5-트리히드록시벤조산메틸을 90ml의 THF에 녹이고 9.7g의 벤질브로마이드와 4.7g의 수소화나트륨(50%)를 가한 후 12시간 동안 환류한 후, 상온에서 500ml의 아세트산에틸로 희석시키고 증류수로 4회 씻었다. 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 제거한 후, 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:2)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 화합물 4 6.6g 얻었다. 이때의 Rf는 0.4이었고 수율은 30%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 3.88 (s, 3H), 5.13 (s, 2H), 7.21 (s, 2H), 7.39 - 7.52 (m, 5H)

일반식 5의 화합물의 제조

4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조산 메틸에스테르의 제조:

얻어진 화합물 4 5.6g을 DMF 50ml에 녹이고 1.96g의 수소화나트륨(60%)을 가한후 상온에서 6시간 동안 교반시킨 후, 아세트산에틸 300ml로 희석시키고 증류수로 4회 씻었다. 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 제거한 후, 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:6)을 사용하여 컬럼크로마토그래피하여 화합물 5 6.4g을 얻었다. 이때 Rf는 0.25이었고 수율은 95%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H 및¹³C NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 3.85 (s, 6H), 3.92 (s, 3H), 5.15 (s, 2H), 7.27 - 7.47 (m. 7H)

¹³C NMR δ: 52.0, 56.0, 74.7, 106.5, 125.1, 127.8, 128.0, 128.2, 128.4, 137.2, 140.7, 153.0, 166.5

일반식 6의 화합물의 제조

[4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐]메탄올의 제조:

얻어진 화합물 5 4.31g을 디클로로메탄 45ml에 녹인 후, -78。C에서 1M DIBAL 용액 20ml을 가하고 -78。C에서 90분간 교반한 후, 10ml의 메틸알코올을 가한후 반응혼합물의 온도를 상온으로 높였다. 반응혼합물을 150ml의 디에틸에테르로 희석시키고 20ml의 소금물로 씻어준 후, 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 용매를 제거한후, 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:1)을 사용하여 컬럼크로마토그래피하여 화합물 6 6.4g을 얻었다. 이때 Rf는 0.25이었고 수율은 98%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 3.82 (s, 6H), 4.61 (s, 2H), 4.99 (s, 2H), 6.58 (s, 2H), 7.29 - 7.51 (m, 5H)

일반식 7의 화합물의 제조

4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤즈알데히드의 제조:

얻어진 화합물 6 4.25g을 DMF 10ml에 녹인후 0。C에서 중크롬산 피리디늄 9.28g을 가하고 4시간 교반한 후, 10ml의 증류수를 가하고 200ml의 디에틸 에테르로 희석시킨 후 증류수로 4회 씻었다. 얻은 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 제거한 후, 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:4)을 사용하여 컬럼크로마토그래피하여 화합물 7 2.66g을 얻었다. 이때 Rf는 0.25이었고 수율은 61%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 3.92 (s, 6H), 5.12 (s, 2H), 7.10 (s, 2H), 7.30 - 7.48 (m, 5H), 9.85 (s, 1H)

일반식 8의 화합물의 제조

(2E)-3-[4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐]-2-프로펜산 에틸에스테르의 제조:

얻어진 화합물 7 2.0g과 화합물 2 4.0g을 에틸알코올 10ml에 혼합한 후, 상온에서 1M t-부톡시화칼륨 9.4ml을 가한 후, 상혼에서 4시간 교반한 후, 100ml의 디클로로메탄으로 희석 시키고 증류수로 3회 씻었다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 제거한 후, 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:4)을 사용하여 컬럼크로마토그래피하여 화합물 8 2.07g을 얻었다. 이때 Rf는 0.25이었고 수율은 81%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H 및¹³C NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 1.22 (t, 3H, J = 6.96 Hz), 3.72 (s, 6H), 4.20 (q, 2H, J = 7.32 Hz), 4.97 (s, 2H), 6.33 (d, 1H, J = 16.11 Hz), 6.65 (s, 2H), 7.27 - 7.47 (m, 5H), 7.56 (d, 1H, J = 16.11 Hz)

¹³C NMR δ: 14.0, 55.7, 60.1, 74.6, 104.9, 117.1, 127.6, 127.9, 128.1, 129.7, 137.4, 138.6, 144.3, 153.4, 166.5

일반식 9의 화합물의 제조

3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산 에틸에스테르의 제조:

얻어진 화합물 9 1.8g을 5ml 에틸알코올에 녹이고 300mgdnk 10% 팔라듐 탄소를 가한후 70psi 압력하의 수소가스 하에서 수소화 반응을 시켰다. 반응 후 30ml의 디클로로메탄으로 희석시키고 여과한 후, 용매를 제어한 후 농축된 부분을 용리제로 아세트산에틸 : n-헥산 (1:2)을 사용하여 컬럼크로마토그래피하여 화합물(9) 0.91g을 얻었다. 이때 Rf는 0.23 었고 수율은 42%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H 및¹³C NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 1.23 (t, 3H, J = 6.96 Hz), 2.55 (t, 2H, J = 7.69 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 7.69 Hz) 3.76 (s, 6H), 4.07 (q, 2H, J = 7.32 Hz), 6.35 (s, 2H)

¹³C NMR δ: 13.9, 30.8, 36.0, 55.9, 60.1, 104.6, 131.3, 132.8, 146.7. 172.6

일반식 10의 화합물의 제조

3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산의 제조

수득된 화합물 9 180mg을 3ml THF에 녹인 후, 5N 수산화나트륨 2ml을 가한후 아르곤하에서 5시간 동안 환류하였다. 얻어진 혼합물을 상온으로 식히고 감압하에서 THF를 제거하고 5N 염산으로 산성화 시킨 후, 아세트산에틸 50ml로 추출하였다. 얻은 유기층을 5ml 소금물로 씻은 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 제거한 후, 용리제로 메틸알코올 : 디클로로메탄 (1:17)을 사용하여 컬럼크로마토그래피하여 정제한 후 디클로로메탄과 헥산을 사용하여 흰색 결정인 화합물 9 121mg을 얻었다. 이때 Rf는 0.2이었고 수율은 75%이었다.

CDCl₃와 TMS에 녹여¹H 및¹³C NMR로 측정한 결과는 다음과 같았다.

¹H NMR δ: 2.70 (t, 2H, J = 7.69 Hz), 2.85 (t, 2H, J = 7.69 Hz) 3.86 (s, 6H), 5,5 (br, 1H), 6.35 (s, 2H), 10.5 (br, 1H)

¹³C NMR δ: 30.8, 35.9, 56.2, 104.9, 131.2, 133.2, 147.0. 178.9

mp : 101-2。C

유기합성된 제조예 4의 화합물(화학물 10)과 김치추출물로부터 분리된 제조예 2의 화합물의 화학적 및 생물학적 동등성 확인

상기 반응식 1에서 유기합성된 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산은 김치에서 추출 및 분리된 제조예 2에서 얻어진 화합물과 동등한 분광학적 데이터를 보임으로서 화학적으로 동등함을 알 수 있다.

Proton (CDCl3, TMS)	제조예 2 (δ)	제조예 4 (δ)
233' , 5'2' , 6'4' (OH)1' (COOH)	2.70 ( t, 2H, J = 7.69 Hz )2.85 ( t, 2H, J = 7.69 Hz)3.83 ( s, 6H )6.37 ( s, 2H )5.5 ( br, 1H )10.5 ( br, 1H )	2.70 ( t, 2H, J = 7.69 Hz )2.85 ( t, 2H, J = 7.69 Hz)3.86 ( s, 6H )6.35 ( s, 2H )5.5 ( br, 1H )10.5 ( br, 1H )

Carbon(CDCl3, TMS)	제조예 2 (δ)	제조예 4 (δ)
13＇, 5＇1＇4＇2＇, 6＇OCH323	177.6147.0133.2131.3104.956.335.930.9	178.9147.0133.2131.2104.956.235.930.9

	제조예 2	제조예 4
mp	101-2。C	101-2。C

유기합성된 제조예 4의 유리기 소거능을 실시예 2에서 설명한 DPPH법으로 측정하였을 때(표 8) 제조예 4의 효과가 비타민 C의 4.4배로 높아 김치로부터 분리한 제조예 2의 화합물과 유사한 효과를 보였다.

샘플	50% reducta)(IC50)μM
제조예 2제조예 4Vt.C	3.63.515.6

또한 유기합성된 제조예 4의 LDL 산화억제능을 실시예 1에서 설명한 것과 동일한 방법으로 측정하였을 때, 제조예 4는 농도 의존적으로 산화를 억제하였으며, 산화억제 효과는 동일농도의 BHT의 약 4배 정도이었다. 이와 같이 제조예 4와 제조예 2는 화학적 및 생물학적 동등성함을 보이고 있다

실시예 2

정상식 공급시 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 정맥투여하였을 때의 고콜레스테롤혈증 치료 효과

도 3에 나타낸 바와 같이, 뉴질랜드산 흰 토끼에게 고형사료에 콜레스테롤 0.5중량% 와 코코낫기름 10중량%를 첨가하여 6주 동안 사육하여 토끼에게 고콜레스테롤혈증을 유발한 후 혈중 콜레스테롤 농도에 따라 군당 6마리씩 세군으로 나누어, 대조군, 제조예 4의 화합물, 심바스타틴을 1차 20% 에탄올에 10mg/ml의 농도가 되게 제조한 다음 인산염 완충용액(PBS)에 1mg/ml이 되게 제조하여 이틀에 2ml씩 2주 동안 주사하였다. 대조군은 동일량의 PBS를 주사하였다. 토끼는 자동 세척 장치가 부착된 케이지에 한 마리씩 넣어 사육하였는 데 실험기간에는 콜레스테롤과 코코낫 기름을 첨가하지 않은 고형사료를 자유식으로 공급하였으며 식수는 증류수를 병에 넣어 제한 없이 섭취하도록 하였고, 사육실의 온도는 20℃, 상대습도는 55%을 유지하고, 12시간 간격으로 조명을 조절하였다. 체중은 1주일 간격으로 측정하고, 채혈은 4일 간격으로 후이개 정맥에서 채혈하였다. 채혈한 혈액은 3,000rpm에서 20분간 분리하여 혈장을 얻은 후 분석시까지 냉동 보관하였다.

혈장지질 및 지단백질 농도 측정

상기에서 분리 보관한 혈장은 중성지질, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 농도 측정에 사용하였다.

중성지방 분석용 키트(Triglyceride kit BC 118, 영동제약)와 콜레스테롤 키트(Cholesterol E kit BC 108-E, 영동제약)를 이용하여 중성지질과 혈장 콜레스테롤 농도를 측정하였고, 지단백질은 초원심분리에 의한 연속 분리법(Converse et al, 1992)으로 장시간 분리하여 저밀도 지단백, 초저밀도 지단백, 그리고 고밀도 지단백을 분리한 다음, 이들의 콜레스테롤 농도는 콜레스테롤 키트를 이용하여 측정하였다.

혈장 콜레스테롤 농도는 16일 사육 후 대조군은 실험 시작일에 비해 37% 감소하였고, 제조예 4군은 55.65% 감소하였으며, 심바스타틴군은 66.67% 감소하여 모든 군의 콜레스테롤 농도가 감소하였는 데 이는 실험기간 중 고 지방식이를 공급하지 않았기 때문이다. 제조예 4의 고콜레스테롤혈증 치료 효과는 현재 임상적으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 심바스타틴과 유사하였다(도 4 참조).

혈장 중성지질 농도는 16일 사육 후 콜레스테롤과 같은 감소하는 양상을 모든 군에서 보였으며, 제조예 4의 중성지질 감소 효과는 대조군 보다 높았고 심바스타틴 보다는 현저하게 높았다. 심바스타틴은 콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA 환원효소를 억제시킴으로서 체내 콜레스테롤 대사를 조절하는 것으로 알려져 있으나 중성지질을 감소하는 효과는 보고된 적이 없고 본 실험에서도 확인되었다(도 4).

저밀도 지단백질은 16일 주사 후 대조군 56.88%, 제조예 4군 62.36% 그리고 심바스타틴군에서 61.74% 감소하여 심바스타틴과 제조예 4군에서 더욱 감소하였고이에 반해 고밀도 지단백질은 대조군에서 변화가 없는 데 비해 심바스타틴군은 15.83% 그리고 제조예 4군은 40.06% 증가하여 제조예 4가 저밀도 지단백질은 억제시키고, 고밀도 지단백질은 증가시키는 효과를 관찰하였다.(도 5 참조)

실시예 3

고지방식이 공급시의 3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 정맥투여하였을 때의 고콜레스테롤혈증 치료 효과

상기 실시예 2와 같은 방법으로 토끼에게 고콜레스테롤혈증을 유발시킨 후 제조예 4와 심바스타틴을 2일에 2mg/ml의 농도로 16일간 주사하였고, 이 때의 식이는 실시예 2와는 달리 실험기간 중 고형사료에 0.5% 콜레스테롤과 10% 코코낫 기름이 첨가된 고지방식이를 공급하여 제조예 4의 치료 효과를 확인하고자 하였다. 실험기간 중 4일 간격으로 혈액을 채취하였으며, 16일 사육 후, 24시간 절식한 다음, 체중 당 2ml의 케이란(Keiran, 50mg/ml, 한국유나이트 제약(주))을 후이개 정맥에 주사하여 마취하였다. 헤파린 처리한 주사기로 심장에서 채혈한 후, 간은 적출하여 0.9% 생리식염수에서 씻은 후 액체 질소에 담가 -70℃에서 냉동보관하고, 대동맥의 지질 침착 정도를 살펴보기 위하여 토끼의 동맥판막에서 회장의 분기점까지 절단하여 PBS 완충액으로 혈액을 씻어낸 후 즉시 염색하였다.

혈장지질 및 지단백질 농도 측정

상기에서 분리 보관한 혈장은 중성지질, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤농도 측정에 사용하였다.

혈장 콜레스테롤과 중성지질은 실시예 2와 동일한 키트를 사용하여 측정하였고, 지단백질도 상기 예 3에서 설명한 바와 동일한 방법으로 분리하고 콜레스테롤 농도는 키트를 이용하여 측정하였다.

혈장 콜레스테롤 농도는 사육 기간동안 공급한 고지방식이 때문에 표 9에서 보는 바와 같이 서서히 증가하였는데, 대조군은 실험 시작일에 비해 54.95%, 제조예 4군은 21.16% 증가하였으며, 심바스타틴군은 33.14% 증가하여 제조예 4 주사군의 혈 중 콜레스테롤의 상승이 가장 억제되어 고골레스테롤 치료효과가 현저하였고, 그 효과는 현재 임상적으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 심바스타틴 보다 좋았다.

그룹	0일	4일	8일	12일	16일
대조군	1084.39±326.19	1312.07±226.38	1359.86±342.07	1671.64±299342	1680.21±322.39
제조예 4	1121.14±496.02	1206.86±229.17	1258.93±423.40	1397.25±275.98	1358.36±214.86
심바스타틴	946.39±153.13	1159.39±185.27	1047.26±106.57	1149.00±48.52	1260.00±133.97

혈장 중성지질 농도 역시 실험기간 중 증가하였는 데 표 10에서 보는 바와같이 16일 사육 후 대조군의 중성지질 농도는 136.26% 증가하였고, 제조예 4의 화합물의 주사군은 30.77%, 그리고 심바스타틴군은 73.43% 증가하여, 제조예 4의 화합물을 주사한 경우 증가가 가장 억제되었다.

그룹	0일	4일	8일	12일	16일
대조군	131.32±44.09	175.81±55.96	241.71±50.04	332.16±122.47	310.26±131.67
제조예 4	127.89±35.23	109.59±13.33	126.58±29.53	172.70±2.95	167.24±43.53
심바스타틴	119.87±31.37	152.70±11.28	174.61±18.88	169.10±37.69	167.24±43.53

저밀도 지단백질은 16일 주사 후 대조군 160.14%, 제조예 4군에서 29.24% 그리고 심바스타틴을 주사한 군에서 29.13% 증가하여 심바스타틴과 제조예 4에서 그증가의 폭이 억제되었다(표 11).

그룹	0일	8일	16일
대조군	354.30±83.66	488.09±139.09	921.68±235.33
제조예 4	540.55±68.91	467.58±209.41	698.63±112.10
심바스타틴	433.61±88.76	472.92±75.01	559.9±101.67

이에 반해 고밀도 지단백질은 대조군, 제조예 4군, 및 심바스타틴군에서 다소 감소하는 경향을 보여 실시예 2에서 나타난 결과가 다소 차이가 있는데 이는 고지방식이에 의한 영향으로 생각된다(표 12).

그룹	0일	8일	16일
대조군	20.82±2.81	21.29±3.81	18.23±6.06
제조예 4	21.69±3.67	22.46±3.37	20.73±4.69
심바스타틴	18.23±3.67	16.38±1.34	14.31±3.21

HMG-CoA 환원 효소의 활성

제조예 4의 콜레스테롤 생합성 조절 효소인 HMG-CoA 환원 효소의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 간조직으로부터 마이크로좀(microsome)을 분리하여 효소원으로 사용하였다. 효소원으로 사용되는 간 마이크로좀 분획의 분리는 간을 2g 취한 뒤 6㎖의 0.1M 트리에타놀아민, 0.02M 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA, pH 7.4), 2mM 디티오티레톨(dithiothreitol) 완충용액에서 분쇄한 후 10,000 x g와 12,000 x g에서 10분간 차례로 원심분리하여 세포핵과 미토콘드리아를 제거하였다. 상층액을 취하여 100,000 x g에서 초원심분리한 후, 상층액을 버리고, 현탁, 세척하여 다시 100,000 x g에서 초원심분리하는 작업을 2회 반복하였다. 얻어진 침전물을 1㎖의 완충용액에 녹여 단백질 양을 측정하였다.

HMG-CoA 환원효소 활성 측정은 Shapiro 등의 방법(1974)을 따라서 정량하였다. 즉, 마이크로 펠렛(100~500㎍ 단백질)을 NADPH 500nmol, 그리고 HMG-CoA 50nmol (specific acitivity; 2,400cpm/nmol)과 혼합하여 전체반응부피를 60μl로 하였으며 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응과정중 HMG-CoA는 메발노네이트(mevalonate)로 전환되며 반응 종료시 반응 부피의 1/6에 해당하는 10N HCl을 가하여 가용화한 후, 37℃에서 15분간 반응시킴으로서 마이크로좀 프로테인이 변성됨과 동시에 이때 발생하는 메발로네이트 락톤(mevalonate lactone)이 생성된다. 반응종료된 혼합액을 10,000X g에서 5분간 원심분리하여 그 상등액을 실리카켈 60g TLC 판에 점적한 후 벤젠-아세톤(1:1) 용매에서 전개시켰다. 건조시킨 TLC란에서 Rf 0.3-0.6의 메발로네이트 스팟(mevalonate spot)을 이미지 분석기(FLA 2000,Japan)을 사용하여 확인한 후 밴드를 잘라 신티레이트 카운터 (WALLAC,1409-012,USA)로 계측하였다. 효소활성단위는 반응시간 1분당 마이크로좀 단백질 1mg이 생성하는 메발로네이트의 양을 pmol로 나타내었다 (pmol mevalonate/min/mg microsomal protein).

제조예 4가 HMG Co A 환원효소의 활성을 얼마나 억제하는지를in vitro상에서 측정하여 심바스타틴과 비교하여 보았을 때 표 13에서 보는 바와 같이 10μM 농도 첨가시 두 물질의 HMG CoA 환원효소 활성을 억제하는 정도가 유사하여 제조예 4는 고지혈증 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

HMG-CoA 환원효소 활성(pmole/min/mg 단백질)
대조군	15.50±0.73
제조예 4	12.65±0.57
심바스타틴	12.63±0.54

이러한 제조예 4의 HMG-CoA 활성 억제 효과를 동물시험에서 확인하였을 때 고지방식이를 섭취하면서 제조예 4 주사를 맞은 토끼의 HMG-CoA 환원효소의 활성은 대조군에 비해 244.36% 높았고, 심바스타틴군은 392.56% 상승하였는데(표 14), 이는 제조예 4와 심바스타틴에 의해 혈중 지질 농도가 떨어짐에 따라 이를 수준으로 유지하기 위한 항상성의 기전에 의거 효소 활성이 상승한 것으로 나타났다.

HMG-CoA 환원효소활성(pmole/min/mg 단백질)
대조군	3.90±0.10
제조예 4	9.53±0.37
심바스타틴	15.31±0.59

간조직 손상 정도 측정

간 조직이 손상된 정도를 나타내 주는 지표로 사용되는 GOT 및 GPT 효소의 활성을 혈액으로부터 측정하였고, 간조직을 전자현미경하에서 간조직을 살펴보았다.

간조직을잘게 짜라 4% 파라포름알데히드로 24시간 고정한후 6시간도안 수돗물로 씻어내기로 광학현미경에서 볼 수 있도록 파라핀으로 고정시킨다. 파라핀에 고정된 간조직을 3μm 두께로 자른 다음 자이랜에 세척하고 다음 알코올 농도를 100%에서 70%로 농도를 달리하여 파라핀을 제거하고 탈수시킨 다음 이를 수돗물로 깨끗이 세척한다. 얻어진 간 조직을 헤마토자이렌(hematoxylin) 염색액에서 4분 동안 염색한 후 30분 동안 수돗물로 세척한다. 그리고 간조직을 에오신 용액에서 1분간 염색한 후 이를 물로 씻어내고 에탄올 용액을 70%에서 100%로 증가시키면서 1차 탈수시키고 자일렌에 담구어 완전히 탈수시킨다. 이를 카나다산 발삼(Canadian balsam)에 고정시켜 광학 현미경 하에서 관찰하였다.

혈장 GOT의 경우 L-아스파라긴산과 α-케토글루탐산을, GPT의 경우 DL-알라닌과 α-케토글루탐산을 넣으면 혈장의 효소에 의해 기질이 피루빈산으로 바뀌며 이 피루빈산이 2,4-디니트로 페닐히드라진과 반응하여 0.4N NaOH를 처리하면 비색으로 발색반응이 나타나고 이를 490nm-530nm에서 흡광도를 측정하여 피루빈산 리튬의 표준에 비교하여 활성도를 측정하는 데 본 실험에서는 키트를 이용하여 측정하였다.

혈장의 GOT와 GPT는 간세포에만 존재하는 효소로서 간조직이 손상되면 혈증으로 방출되는 특징을 가지고 있다. 제조예 4의 고지혈증 치료제로서의 가능성을 확인하기 위하여 제조예 4 주사군의 간 독성 관련 효소의 활성을 살펴보았을 때 표 12에 나타난 바와 같이 GOT 효소 활성은 고콜레스테롤혈증 유발에 의해 실험시작부터 그 활성이 상당히 높아 간 손상이 있는 것으로 예측되었으나 실험기간중 주사한 물질에 의해 어떠한 영향을 받는지를 살펴보았을 때, 16일 사육 후 GOT 및 GPT의 활성이 제조예 4군에서 가장 낮았고 대조군과 심바스타틴군의 이들 효소의 활성은 유사하였다.

GOT
그룹	0일	8일	16일
대조군	433.60±282.40	520.49±241.27	540.38±169.59
제조예 4	458.29±196.15	444.57±110.86	586.95±142.69
심바스타틴	441.29±124.75	344.37±99.96	531.06±55.46
GPT
그룹	0일	8일	16일
대조군	312.69±212.92	442.78±165.88	442.20±146.27
제조예 4	312.19±171.54	382.42±93.35	422.79±125.65
심바스타틴	314.21±95.14	266.90±78.22	399.12±36.26

표 15로부터 간 손상을 나타재는 지표로 사용된 효소의 활성이 제조예 4군이 가장 낮고 대조군과 심바스타틴군 사이에는 차이가 없는 것으로 나타났으나, 간조직을 전자현미경하에서 살펴보았을 때 도 6에서 보는 바와 같이 대조군의 간세포 조직이 정상세포인 육각형의 세포 모습을 보이지 않는 데 비해 제조예 4의 간조직은 상당히 보호되어 간 특유의 세포배열을 유지하고 있었다. 그러나 심바스타틴 주사군의 간세포는 간섬유화 및 염증세포 침윤이 보이고 간손상이 있는 것으로 나타나 심바스타틴이 고콜레스테롤혈증 치료제로 광범위하게 쓰이나 간손상 등의 부작용이 지적되고 있는 사실을 확인할 수 있었다.

대동맥의 지질 침착정도

대동맥의 지질 침착정도를 측정해 보기 위하여 토끼의 동맥판막에서 회장의 분기점까지 절단하여 인산완충액으로 동맥피를 씻어낸 후, 고정 전 준비단계로 포말린 설탕액(4% 파라포름알데히드, 5% 수크로즈 20μmol/BHT, 2μmol/EDTA, pH 7.4)으로 다시 세척하였다. 혈관조직에 붙어 있는 이 물질을 조심스럽게 제거한 뒤, 미세한 해부용 가위를 사용하여 종단을 개봉하였다. 개봉된 동맥을 70% 에탄올로 세척한 후 염색용액(0.5% 수단 IV, 35% 에탄올, 50% 아세톤 용액)에 5-6분간 두어 동맥내벽의 지질이 완전히 염색되게 한 다음, 80% 에탄올 용액으로 지질 이외의부분에서 염색된 부분을 탈색시켰다. 지질염색이 완료된 혈관을 왁스종이에 핀으로 고정시켜 실험군간 동맥내벽의 지질 침착 정도를 비교하였다. 동맥내벽에 지질이 있는 부분은 염색용액에 의해 빨갛게 염색이 되어 동맥내벽의 지질 침착이 많을수록 염색된 동맥이 붉게 나타난다.

실험초기 혈중 콜레스테롤 농도가 유사한 토끼의 동맥을 비교한 결과 동맥벽의 지질축적 정도는 제조예 4군이 가장 낮았고, 다음이 심바스타틴군 그리고 대조군의 순서로 제조예 4군의 동맥지질 침착 억제 효과가 뚜렷하게 관찰되었다(도 7참조).

실시예 4

3-(4'-히드록실-3',5'-디메톡시페닐)프로피온산을 경구 투여하였을 때의 고콜레스테롤혈증 치료 효과

도 3 같이 고콜레스테롤혈증을 유발시킨 토끼를 군당 4마리씩 4군으로 나누어 대조군과 일반식 9 및 10의 화합물, 및 심바스타틴을 경구로 투여하여 일반식 9 및 10의 화합물의 지질 저하 효과를 살펴보기 위하여 실시예 2와 동일한 방법으로 토끼를 사육하였다. 일반식 9 또는 10의 화합물, 또는 심바스타틴 5mg을 100% 에탄올 0.4ml에 녹인 후 이를 PBS 완충용액으로 희석하여 5mg/ml이 되도록 한 후 물병에 1ml을 넣어 잘 섞은 다음 토끼에게 공급하였다. 4일 간격으로 혈액을 채취하여 시험예 4와 동일한 키트로 콜레스테롤과 중성지방을 분석하였다.

혈장 콜레스테롤은 16주 후 대조군에 비해 제조예 4군이 10.91%, 심바스타틴군이 29.73% 감소하였고, 제조예 3군은 2.96% 증가하였다. 고지방식이를 공급하였음에도 불구하고 콜레스테롤 농도가 감소한 것은 경구로 투여한 양이 정맥투여시의 5배 정도 공급하였기 때문으로 생각된다(도 8 참조). 그리고 혈장 중성지질의 농도는 제조예 4의 경우 대조군에 비해 9.8%, 심바스타틴은 19.31% 감소하였으며, 제조예 4군은 10.1% 증가하였다. 경구 투여에 의한 본 발명의 화합물의 지질 저하 효과는 심바스타틴 보다 못하였으나 대조군에 비해 지질을 저하하는 효과는 현저하였다.

본 발명은 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 김치추출물로부터 분리한 제조예 2와 이를 유기합성한 제조예 4는 동일한 물질이고, 제조예 4는 혈장지질 농도를 저하시키고 생체내 콜레스테롤 생합성과정의 중요한 율속 효소로서 콜레스테롤 합성저해제의 중요한 지표로 이용되고 있는 HMG-CoA 환원효소의 활성을 높이고, 간조직을 보호하는 효과가 뛰어났으며 동맥에 지질이 침착되는 것을 억제하는 효과가 있어 고콜레스테롤혈증을 치료하는 효과가 뛰어나 관상동맥 질환, 심장병, 뇌졸중 등의 성인병을 유도하는 고콜레스테롤혈증의 치료 및 예방의 치료제로 사용할수 있는 유용한 발명이다.

<참고문헌>

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Claims (11)

1. 하기 일반식 1로 표시되는 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 유도체, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염.

   [일반식 1]

   상기 식에서,

   X는 수소, 탄소수 1 내지 5의 저급알킬, 페닐, 나트륨, 칼륨, 암모늄염이고,

   Y는 수소, 아세틸, 프로피오닐, 부티로일, 벤조일이다.
2. 하기 반응식 2로 표시되는 반응에 의해 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 에틸에스테르를 제조하는 방법.
3. 하기 반응식 3의 반응에 따라 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 에틸에스테르로부터 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산를 제조하는 방법.
4. 제 2항의 방법에 의해 제조되는 하기의 3-(4'-히드록실-3', 5'-디메톡시페닐)프로피온산 에스테르의 중간체.

   브롬화 (2-에톡시-2-옥소에틸)(트리페닐)포스포늄염;

   4-(벤질옥시)-3,5-디히드록시벤조산 메틸에스테르;

   4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤조산 메틸에스테르;

   [4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐]메탄올;

   4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시벤즈알데히드;

   (2E)-3-[4-(벤질옥시)-3,5-디메톡시페닐]-2-프로펜산 에틸에스테르.
5. 활성물질로서 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항의 물질을 HGM-CoA 환원효소 활성을 저해하기에 유효한 양으로 함유하는 HGM-CoA 환원효소 저해제 조성물.
6. 활성물질로서 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항의 물질을 치료학적으로 유효한 양으로 함유하는 고콜레스테롤혈증 치료제.
7. 활성물질로서 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항의 물질을 치료학적으로 유효한 양으로 함유하는 동맥경화증 치료제.
8. HMG-CoA 환원효소 저해활성을 갖는 배추김치의 디클로로메탄 분획으로부터추출물.
9. 활성성분으로 제 8항의 김치추출물을 HGM-CoA 환원효소 활성을 저해하기에 유효한 양으로 함유하는 HGM-CoA 환원효소 저해제 조성물.
10. 활성물질로서 제 8항의 김치추출물을 치료학적으로 유효한 양으로 함유하는 고콜레스테롤혈증 치료제.
11. 활성물질로서 제 8항의 김치추출물을 치료학적으로 유효한 양으로 함유하는 동맥경화증 치료제.