KR20020061279A

KR20020061279A - 신규 내산성 및 내담즙성 유산균 균주 락토바실러스람노서스 씨엘-90 및 이를 포함한 가축용 생균활성제 조성물

Info

Publication number: KR20020061279A
Application number: KR1020010002240A
Authority: KR
Inventors: 홍진규; 강용호
Original assignee: 홍진규
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2001-01-15
Publication date: 2002-07-24
Also published as: KR100396485B1

Abstract

본 발명은 내산성 락토바실러스 속 미생물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 국내 토종닭 내장으로부터 혐기적으로 분리한 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus CL-90) 씨엘-90 균주는 내산성, 내담즙성을 가지면서, 항생제에 대하여 내성이 있고, 병원성 세균과 같은 유해 미생물의 생장을 억제하고, 가축의 장관에 점착성이 있는 특성을 나타내는 신규 유산균이어서 가축용 생균활성제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 내산성 및 내담즙성 유산균 균주 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 및 이를 포함한 가축용 생균활성제 조성물{Novel Microorganism of Lactobacillus rhamnosus CL-90 and Probiotics Comprising Said Microorganism}

본 발명은 유해 미생물 억제 활성을 갖는 신규 내산성 락토바실러스 속 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한국 토종 닭의 내장에서 혐기적으로 분리된 신규 유산균으로서, 내산성, 내담즙성을 가지면서 항생제에 대하여 내성을 나타내고, 병원성 세균과 같은 유해 미생물의 생장을 억제하는 특성을 나타내어 가축용 생균활성제로 사용될 수 있는 신규 미생물 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus CL-90) 씨엘-90 에 관한 것이다.

락토바실러스 속 균주는 정상적으로 사람을 포함한 동물의 장관에 일정한 균총을 생성하고 면역증진 작용, 유해병원균의 성장억제, 유해독소의 중화 및 합성 차단, 영양분의 소화흡수의 증대 그리고 여러 유익한 생리활성을 나타내는 것으로 이미 잘 알려져 있어서 사람은 물론 동물에게도 많이 투여하고 있다. 야생동물들은 어미와 환경으로부터 장내 정상 균총을 빠르게 구성하지만, 인간에 의해서 오랫동안 길들여진 가축들은 인위적인 환경조건에 처해지기 때문에 질병에 저항하는 정상적인 장내 균총을 구성하지 못하고 있다. 유산균은 유산을 생성하여 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 하며, 박테리오신(bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며, 기타 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성한다. 이와 같은 유산균을 가축용 생균활성제로 개발하기 위해서는 다음과 같은 기본 조건들을 충족해야 한다.

첫째, 내산성이 있어서 살아있는 상태로 장관에 도달하여 활성을 유지할 수 있어야 한다.

둘째, 장점막에 점착성이 강하여 분변과 함께 배출이 적어야 한다.

셋째, 다른 첨가제인 항생제와 혼합 후에도 그 활성이 유지되어야 한다.

넷째, 온도 변화 등의 외부 환경에 대한 균주의 안정성이 확립되어야 한다.

현재까지 사용되고 있는 가축용 유산균은 대부분 외국에서 수입되거나 국내 가축의 분변에서 분리한 균주이다. 외국에서 수입한 균주들은 국내의 특수한 자연 환경에 맞지 않아서 균주의 안정성이 약하고, 가축의 분변에서 분리한 균주들은 장점막에의 점착성이 약하여 분변과 함께 쉽게 배출되는 단점이 있다. 이런 문제점을 극복하기 위하여 본 발명자는 국내의 자연 환경에 적응된 토종 닭의 내장에서 혐기적으로 내산성, 내담즙성 및 유해 미생물 억제 활성을 갖는 유산균 120여종을 분리하였으며, 그 중 활성이 가장 강력하며 항생제 및 고온에 안정성이 높은 유산균 균주를 선별하였다. 이 유산균을 가축사료와 혼합하여 펠릿형 가축사료를 제조한 결과 생균활성제로서의 균주 안정성이 우수함을 입증하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 내산성, 내담즙성, 유해미생물 억제 활성, 항생제에 대한 내성 뿐 아니라 가축의 장내 점착성이 높은 신규 유산균 균주와 상기 균주로부터 제조된 가축용 생균활성제를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 국내 토종닭의 내장으로부터 혐기적으로 분리된, 유해 미생물 억제 활성 및 항생제에 대한 내성을 갖는 신규 내산성 및 내담즙성 유산균 균주 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus CL-90) 씨엘-90 및 이를 함유하는 가축용 생균활성제를 제공한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

<신규 미생물의 분리>

경상북도 경산시 팔공산 지역에서 방목하는 국내 토종 닭의 내장을 채취하여 멸균증류수로 세척한 다음 유산균 선별배지인 BCP 고체배지(Eiken Co., Japan)에 도말하여 37℃에서 혐기배양하였다. 여기에서 유산균 생성 균주 120 여종을 선별하여 계대 배양한 다음 유해 미생물 12종에 대한 생장 억제 능력을 비교하여 가장 우수한 유산균 균주 1종을 최종 선발하였다.

<신규 미생물의 동정>

상기와 같이 선별 분리된 유산균 균주는 한국종균협회(KCCM)에 의뢰하여 API 키트로 분석한 결과 표 1에서와 같이 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 99.9% 유사한 생리학적 특성을 가지는 것으로 동정되었다.

<표 1> API 키트 분석결과

기질	반응	기질	반응	기질	반응
Glycerol	-	Ertythritol	-	D-Arabinose	-
L-Arabinose	-	Robose	+	D-Xylose	-
L-Xylose	-	Adonitol	-	βMethyl-xyloside	-
Galactose	+	D-Glucose	+	D-Fructose	+
D-Mannose	+	L-Sorbose	+	Rhamnose	+
Dulcitol	-	Inositol	+	Mannitol	+
Sorbitol	+	αMethyl-D-mannoside	-	αMethyl-D-glucoside	+
N Acetyl glucosamine	+	Amygdaline	+	Arbutine	+
Esculine	+	Salicine	+	Cellobiose	+
Maltose	+	Lactose	+	Melibiose	-
Saccharose	+	Trehalose	+	Inuline	-
Melezitose	+	D-Raffinose	-	Amidon	-
Glycogene	-	Xylitol	-	βGentiobiose	+
D-Turanose	+	D-Lyxose	-	D-Tagatose	+
D-Fucose	-	L-Fucose	-	D-Arabitol	-
L-Arabitol	-	Gluconate	-	2 ceto-gluconate	-
5 ceto-gluconate	-

따라서 상기 분리된 미생물을 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 (Lactobacillus rhamnosus CL-90) 으로 명명하고, 2000년 12월 30일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국종균협회에 기탁하여 수탁번호 KFCC-11253를 부여받았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 내산성 실험

MRS 배지(Merck Co., Germany)에서 사전 배양한 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주를 pH 2, 4, 6, 8로 각각 조정한 0.9% NaCl 용액으로 10^-6배 희석하였다. 희석한 균액을 37℃에서 배양하면서 일정한 시간대별로 MRS agar 배지에 도말하여 24시간 동안 혐기적으로 배양한 후 콜로니 수를 측정하였다. 내산성 실험의 결과는 표2에 나타낸 바와 같이 pH2 와 pH4 용액에서도 생존 균수의 수가 큰 감소가 없어서 균주의 내산성을 입증할 수 있었다.

<표 2> pH 별로 배양 시간에 따른 생존 유산균수 (CFU/ml).

시간 (분)	pH2	pH4	pH6	pH8
0	1x10⁷	5x10⁸	4x10⁸	2x10⁷
30	6x10⁷	6x10⁸	3x10⁸	5x10⁶
60	5x10⁶	7x10⁸	<10⁵	<10⁵
90	9x10⁶	5x10⁸	<10⁵	<10⁵
120	7x10⁶	2x10⁸	<10⁵	<10⁵

<실시예 2> 내담즙성 실험

MRS agar (pH7)배지에 제균한 담즙산액 (Oxgall)을 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5% 가 되도록 농도를 맞춘 후, 0.9% NaCl용액으로 희석한 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균을 접종하여 혐기적으로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 균수를 측정한 결과는 표 3에 요약하였다. 담즙산 (옥스갈) 0.5% 에서도 균이 정상적인 생육을보여주어, 동물체내에서 담즙산이 분비되더라도 투여된 유산균이 생육할 수 있어서 생균활성제로서의 역할을 할 수 있는 우수한 유산균이라는 결론을 내릴 수 있었다.

<표 3> 담즙산에 대한 내성 실험.

Bile 농도	0.0%	0.1%	0.2%	0.3%	0.4%	0.5%
생존균수(CFU/ml)	6x10⁶	9x10⁶	13x10⁶	8x10⁶	9x10⁶	11x10⁶

<실시예 3> 항생제 내성 실험

MRS 배지에서 하룻밤 배양한 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주를 MRS agar 배지에 균일하게 도말하였다. 도말한 MRS agar위에 직경 6mm, 깊이 4mm의 둥근 홈을 파내고, 각각의 항생제를 농도별로 희석한 것을 30㎕씩 분주하였다. 항생제가 배지속으로 충분히 스며들때까지 실온에 방치한 후 37℃에서 18시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 저해환의 크기는 전체 투명환의 직경과 agar 홈의 직경의 차로 측정하였다.

하기 표 4에 의하면 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주는 페니실린 G나 앰피실린과 같은 세포벽 합성을 저해하는 항생제에 대해서는 낮은 농도에서 생육이 억제되었으나, 클로람페니콜, 테트라싸이클린, 카나마이신, 하이그로마이신 B와 같은 단백질 합성을 저해하는 항생제에 대해서는 비교적 높은 농도에서 생육이 억제됨을 확인하였다.

<표 4> 항생제에 의한 발육 억제 농도의 비교.

항생제종류및 농도	클로렘페니콜(㎍/㎖)	앰피실린(㎍/㎖)	테트라싸이클린(㎍/㎖)	카나마이신(㎎/㎖)	페니실린 G (㎍/㎖)	하이그로마이신 B(㎍/㎖)
항생제종류및 농도	15	30	3.1	6.2	3.1	6.2	1.5	3.0	0.39	0.78	6	12
환의 크기 (mm)	0	7	0	4	0	2	0	2	0	6	0	5

<실시예 4> 내열성 실험

MRS 배지에서 하룻밤 배양한 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주를 0.9% NaCl 용액으로 희석하여 37℃, 55℃, 75℃, 100℃의 온도로 맞춰져 있는 항온수조에 담근 후 0, 30, 60, 90, 120 분의 시간대 별로 균액을 항온수조에서 꺼내어 MRS agar에 도말한 다음 37℃에서 혐기적으로 24시간 동안 배양하여 생존 균수를 측정하였다. 표 5는 상기 실험결과로서 영양원의 공급이 전혀 없는 상태에서 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주의 초기 밀도가 처음 것의 1%로 감소하는데 소요된 시간은 55℃ 에서 90분, 75℃ 에서 30분 소요됨을 보여주고 있다. 이러한 결과는 상기 균주가 40∼60℃의 중온 온도에서 내열성이 있음을 증명하고 있는 것이다.

<표 5> 고온 처리에 따른 생존 균수 (CFU/ml).

배양시간(분)	37℃	55℃	75℃	100℃
0	3.3x10⁷	3.3x10⁷	3.3x10⁷	3.3x10⁷
30	3.8x10⁷	9.0x10⁵	1x10³	<10¹
60	4.3x10⁷	3.0x10⁵	<10²	<10¹
90	3.0x10⁷	3.0x10⁵	<10²	<10¹
120	2.9x10⁷	8.0x10⁴	<10²	<10¹

<실시예 5> 항균활성 실험

Nutrient broth(S.aureus를 제외한 11종의 병원균) 및 Tryptic soy broth(S.aureus)에 24시간 액체 배양된 12종의 병원균을 멸균된 면봉으로 Nutrient agar 및 Tryptic soy agar에 균일하게 도말하였다. 도말한 후 직경 6mm, 깊이 4mm의 둥근 홈을 파내고, 홈 안에 유산균 (또는 상등액)을 30㎕씩 분주하였다. 유산균 (또는 상등액)이 배지속으로 충분히 스며들 때까지 실온에 방치한 다음 37℃에서 18시간 동안 혐기배양하였다. 저해환의 크기는 전체 투명환의 직경과 agar 홈의 직경의 차로 측정하였다. 그 결과는 표 6에 나타냈다. 표 6에서 '균주배양액'은 MRS 배지에서 18시간 동안 배양한 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 배양액을 사용한 것이고, '상등액'은 배양한 유산균액을 4000rpm에서 15분간 원심분리한 다음 그 상등액을 0.25 ㎛ filter로 제균한 것이며, '저온상등액'은 제균한 상등액을 4℃에서 72시간 동안 보관한 것이다. 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주 배양액은 스테필로코카스 오리어스 (Staphylococcus aureus)균을 제외하고는 병원성 미생물에 대한 증식억제 작용을 나타내었다. 마이크로필터로 제균한 상등액의 성분만으로도 대부분의 병원성 미생물의 생육이 저해되었다. 이러한 결과는 이 균주가 생성하는 대사산물에 의한 것이기 때문에 본 발명의 신규 유산균을 가축에게 적용시 유해 미생물 증식을 억제할 수 있음을 증명하고 있다.

<표 6> 병원성 미생물에 대한 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 의 항균력

병원성 미생물	저해환의 크기 (mm)
병원성 미생물	균주배양액	상등액	저온상등액
Bacillus subtilis(KCTC1021)	11	9	10
Staphylococcus aureus(KCTC1621)	0	0	0
Staphylococcus epidermidis(KCTC1917)	8	0	0
Citrobacter freundii(KCTC2006)	16	13	15
Shigella flexneri(KCTC2008)	7	6	6
Klebsiella pneumoniae(KCTC2208)	14	13	0
Enterobacter cloacae(KCTC2361)	8	5	11
Escherichia coli(KCTC2441)	7	3	7
Escherichia coli(KCTC2571)	8	4	4
Salmonella choleraesuis(KCTC2932)	6	5	5
Salmonella typhimuriumTA98	14	4	0
Salmonella typhimuriumTA100	16	4	5

<실시예 6> 펠릿형 가축 사료에 포함된 유산균 활성 측정

락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주를 이용하여 펠릿형 가축 사료를 공지의 제조법에 의거하여 제조하였다. 이때 펠릿형 가축 사료에 포함된 유산균의 활성을 측정하기 위하여 펠릿형 사료를 잘게 분쇄하여 37℃, MRS 배지에서 혐기적으로 배양하면서 시간대별로 BCP agar 배지에 도말하여 유산균수를 측정하였다. 그 결과는 표 7에 나타냈다. 펠릿형 가축사료를 제조하는데는 고온 고압처리가 필요하지만 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 균주를 분말형 생균제로 제조하여 혼합한 경우에는 펠릿형 사료제조 후에도 유산균 활성이 높게 나타났다. 따라서 본 발명의 신균주는 가축용 생균활성제재의 용도로서 매우 유효함을 알 수 있으며, 본 발명의 신균주를 포함하는 생균활성제 조성물은 유산균 제제, 발효 사료제, 사일리지, 가축사료제의 첨가물로서 성공적으로 제공될 수 있음을 확인할 수 있다.

<표 7> 펠릿형 가축 사료에서의 유산균수.

배양시간(h)	0	6	11	13	17
유산균수(CFU/mg)	1.2x10⁴	6.1x10⁵	6.1x10⁵	9.8x10⁵	7.1x10⁶

본 발명의 락토바실러스 람노서스 씨엘-90 (Lactobacillus rhamnosus CL-90) 균주는 한국 토종닭의 장관에서 분리하였으므로 국내 기후환경에 대한 적응성 및 가축의 장관에 대한 점착성이 높으며, 내산성 및 내담즙성이 있고, 항생제에 대하여 내성이 있고, 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 생리활성을 갖고 있는 신규 유산균이어서, 이를 가축용 생균활성제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

유해미생물 억제활성 및 항생제에 대한 내성을 갖는 신규 내산성 및 내담즙성 유산균 균주 락토바실러스 람노서스 CL-90 (KFCC-11253).
제 1항의 미생물을 함유하는 가축용 생균활성제 조성물
제 2항에 있어서, 상기 생균활성제 조성물은 유산균 제제, 발효 사료제, 사일리지, 가축사료제의 첨가물로 제공됨을 특징으로 하는 생균활성제 조성물.