KR20020046356A - 디벤질부틸로락톤 화합물의 퇴행성 뇌신경계 치료제로서의용도 및 이 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제 - Google Patents

디벤질부틸로락톤 화합물의 퇴행성 뇌신경계 치료제로서의용도 및 이 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음 일반구조식 (I)의 화합물의 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제로서의 용도 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하고 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제와 혼합하고, 통상의 약제학적 제제의 제조방법으로 통상의 약학적 제제의 형태로 제제화시킨 약학적 제제에 관한 것이며, 이들 제제는 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제로서 유용하다.
(I)
상기식에서 R1은 하이드록실기, 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기, 또는 -OGlc (여기에서 Glc는 글루코실기를 의미한다)기이며, R2는 수소원자, 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이며, R3는 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이다.

Description

디벤질부틸로락톤 화합물의 퇴행성 뇌신경계 치료제로서의 용도 및 이 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제 {Use of dibenzylbutyrolactone lignan derivatives for treatment of neurodegenerative disease and pharmaceutical preparations containing them}
본 발명은 다음 일반구조식 (I)로 표시되는 디벤질부틸로락톤 화합물의 뇌신경계 질환 치료제로서의 용도 및 이 물질을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제에 관한 것이다.
(I)
상기식에서 R1은 하이드록실기, 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기, 또는 -OGlc (여기에서 Glc는 글루코실기를 의미한다)기이며, R2는 수소원자, 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이며, R3는 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이다.
상기의 일반구조식(I)의 화합물중, R1이 하이드록실기이고 R2가 수소원자이고, R3가 메톡시기인 화합물이 (-)-악티게닌 ((-)-arctigenin : 화합물 1)이며, R1이 하이드록실기이며, R2가 수소원자이고, R3가 메톡시기인 화합물이 (-)-트락실라게닌 ((-)-traxillagenin: 화합물 2)이며, R1및 R3가 각각 하이드록실기이고, R2가 메톡시기인 화합물이 (-)-4'-데메틸트락실라게닌 ((-)-4'-demethyltraxillagenin : 화합물 3)이며, R1이 OGlc기이고, R2가 수소원자이고, R3가 메톡시기인 화합물이 (-)-악티인 ((-)-arctiiin : 화합물 4)이고, R1이 OGlc기이고, R2및 R3가 각각 메톡시기인 화합물이 (-)-트락실라사이드 ((-)-traxillaside : 화합물 5)이다.
최근 노인 인구가 증가됨에 따라 퇴행성 뇌신경계 질환, 특히 노인성 치매 환자가 급증하고 있다. 퇴행성 뇌신경계 질환은 노화에 의한 뇌신경세포의 구조적 퇴화, 순환기 장애 등 다른 성인병에 기인한 이차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등 물리적, 기계적 요인에 의하여 뇌가 손상을 입으면 일어날 수 있다 (Rothman, S. M. (1984) Synaptic release of excitatory amino acid neurotransmitter mediates anoxic neuronal death.J. Neurosci.4: 1884-1891; and Weiloch, T. (1985) Hypoglycemia-induced neuronal damage prevented by anNMDA antagonists.Science230: 681-683). 뇌조직의 손상은 크게 두 가지 기전에 의한 것으로 알려졌는데, 첫 번째로는 세포막 전압의 변화에 의한 흥분성 아미노산 유리의 증가에 의한 것이며, 두 번째로는 직접적인 oxidative stress에 의한 것이다 (Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system.Neuron1: 623-634; and Coyle, J. T. and Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenera- tive disorders.Science262: 689-695). 최근의 연구에 따르면 글루타메이트는 ionotrophic receptor를 활성화시킴으로써 oxidative stress를 일으키는 주된 원인물질로 생각되고 있어 글루타메이트성 신경의 이상은 stroke, trauma 및 ischemic injury의 주 발병원인으로 여겨지고 있다 (Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system.Trends Neurosci.5: 22-26; and Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases.Mol. Aspects Med.8: 89-193). 뇌의 혈류량이 감소하게 되면 신경 접합부에서 글루타메이트의 유리가 증가되며, 신경세포 안으로의 유입이 감소되어 세포 외의 글루타메이트 농도가 급속히 증가되면서 독성을 유발시켜 결국 신경세포는 사멸하게 된다 (Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. and Diemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis.J. Neurochem.43: 1369-1374; and Hagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. and Hamberger, A. (1985)Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments.J. Cereb. Blood Flow & Metab.5: 413-419).
본 연구에서는 천연물에서부터 글루타메이트 (glutamate)에 의한 신경세포 독성을 차단시키는 물질을 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 생약의 총 메탄올 추출물을 작용시키고, 과량의 글루타메이트로 인하여 유발되는 신경세포의 사멸에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보는 방식으로 찾던 중 비자나무의 수피 총 메탄올 추출물이 유의성 있는 신경세포 보호 활성을 가짐을 알 수 있었다.
비자 (榧子)는 주목과 (Taxaceae)에 속하는 상록 침엽교목으로 전세계적으로 우리 나라와 일본에만 제한되어 분포한다. 성장이 너무 느려 나이테가 잘 보이지 않는 것이 특징이며, 우리 나라에서는 천연기념물로 지정되어 보호되고 있다. 비자나무는 식용, 관상용, 공업용, 약용으로 쓰이고 종자는 먹으며 한방과 민간에서 과실을 구충, 발모, 건위, 조경, 장출혈 등에 약재로 쓰고 종자는 기름을 짜내며 목재는 건축재, 기구재, 선박용재 등에 쓰인다 (김태정 (1996) 한국의 자원식물 I, p. 40, 서울대학교 출판부; 및 육창수 (1997) 아세아 생약도감, p. 23, 도서출판 경원). 잎과 종자에서 분리 보고된 성분에는 sesquiterpenoids (Sakai T, Nishimura K, Hirose Y. (1965) Structure and stereochemistry of four new sesquiterpenes isolated from the wood oil ofTorreya nucifera, Bull. Chem. Soc. Japan ; 38: 381-725), labdane계열과 abietane계 diterpenoids (Sayama Y, Kyogoku K, Murayama H. New diterpenes ofTorreya nucifera, Agric. Biol. Chem. 1971; 35: 1068-73; and Harrison LJ, Asakawa Y. 18-Oxoferruginol from the leafofTorreya nucifera, Phytochemistry 1987; 26: 1211-2), 그리고 flavonoids (Kariyone T, Sawaka T. Flavonoids of the leaves of Coniferae and allied plants. I. Flavonoid from the leaves ofTorreya nucifera, Yakugaku Zasshi 1958; 78: 1010-3) 등이 있다.
이에 본 연구에서는 비자나무 수피의 추출물, 그 CH2Cl2분획물 및 이로부터 분리된 단일물질들을 퇴행성 뇌신경계 질환의 치료제로 개발하기 위한 기초연구를 수행하고 그 작용기전을 밝힘으로써 뇌졸중이나 노인성 치매와 같은 퇴행성 뇌신경계 질환 등의 예방 및 치료제로 개발될 수 있는 후보물질로 제시하고자 하였다.
다음에 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱상세히 설명한다.
실시예 1
비자 수피의 추출 및 분획
건조된 비자 수피 3.1㎏을 MeOH로 3회, 2시간 동안 초음파 추출하였고, 그 추출액을 감압농축하여 총 엑스 750g을 얻었다. 비자 수피 총엑스 (800g)를 증류수에 현탁시킨 다음, CH2Cl2으로 분획하여 CH2Cl2분획 (120g)과 물 분획 (610g)을 얻었다 (Scheme 1).
실시예 2
Compound1과2의 분리
CH2Cl2분획 (120g)을 CHCl3와 MeOH의 혼합용매 (100:1 → 0:1)로 silica gel column chromatography하여 15개의 소분획 (A-1 ∼ A-15)으로 나누었다. 이들 중 활성이 나타난 A-2와 A-3을 n-hexane과 ethyl acetate 혼합용매로 다시 silica gel column chromatography를 수행하여 12개의 분획 (B-1 ∼ B-12)을 얻었다. B-2 분획을 H2O : MeOH : AcCN (아세포니트릴) = 30 : 50 : 20, 2㎖/min의 조건으로 high peformance liquid chromatography (HPLC)를 반복 실시하여 retention time 10.97분과 13.33분에 유출되는 compound1(155㎎)과 compound2(210㎎)을 각각 얻었다.
Compound1의 구조결정 - 무색 액상. [α]18 D= -23.5° (c=1 in MeOH). MS:m/z= 372 [M]+, 151, 137. UV λmaxnm (log e) : 227, 281. IR νmaxcm-1: 3500 (OH), 1765 (CO), 1600, 1520 (arom. C=C).1H-NMR (400MHz, CDCl3): d 6.76 (1H, d,J= 7.96, H-5), 6.68 (1H, d,J= 8.05, H-5), 6.58 (1H, d,J= 1.70, H-2), 6.55 (1H, dd,J= 7.97, 1.70, H-6), 6.49 (1H, dd,J= 8.05, 1.78, H-6), 6.40 (1H, d,J= 1.76, H-2), 4.08 (1H, dd,J= 9.00, 7.21, H-9b), 3.82 (1H, dd,J= 9.00, 7.44, H-9a), 2.89 (1H, dd,J= 14.1, 5.32, H-7b), 2.84(1H, dd,J=14.1, 6.70, H-7a), 2.58 (1H, m, H-7b), 2.51 (1H, m, H-8), 2.49 (1H, m, H-7a), 2.44 (1H, m, H-8), 3.79 (3H, s, OCH3), 3.76 (3H, s, OCH3), 3.75 (3H, s, OCH3).13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ 34.24 (C-6), 37.83 (C-5), 40.70 (C-3), 46.28 (C-2), 55.53 (OMe), 55.57 (OMe), 55.63 (OMe), 71.08 (C-4), 111.04 (C-5"), 111.41 (C-2"), 111.55 (C-2'), 113.98 (C-5'), 120.34 (C-6"), 121.80 (C-6'), 129.26 (C-1'), 130.39 (C-1"), 144.31 (C-4'), 146.54 (C-4"), 147.52 (C-3'), 148.63 (C-3"), 178.63 (C-1). 이상의 spectral data를 근거로 compound1을 (-)-arctigenin으로 동정하였다.
Compound2의 구조결정 - 무색 액상. [α]18 D-25.6° (c=1 in MeOH). MS:m/z= 402 [M]+, 181, 137, UV λmax nm (log e) : 229, 280. IR max cm-1: 3550 (OH), 1760 (CO), 1600, 1520 (arom. C=C).1H-NMR (400MHz, CDCl3): d 6.76 (1H, d,J= 7.98, H-5), 6.58 (1H, d,J=1.88, H-2), 6.54 (1H, dd,J= 7.99, 1.87, H-6), 6.12 (2H, s, H-2, 6), 4.11 (1H, dd,J= 9.21, 7.33, H-9b), 3.84 (1H, dd,J= 9.21, 7.57, H-9a), 2.89 (1H, dd,J= 13.9, 5.38, H-7b), 2.85(1H, dd,J= 13.9, 5.38, H-7a), 2.55-2.41 (4H, m, H-7b, H-8 H-7a, H-8), 3.75, 3.74,3.73 (4OCH3).13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ 34.45 (C-6), 38.91 (C-5), 40.86 (C-3), 46.53 (C-2), 55.75 (OMe), 56.01 (OMe ×2), 60.83 (OMe), 71.27 (C-4), 105.41 (C-2', C-6'), 111.41 (C-5"), 114.01 (C-2"), 122.01 (C-6"), 129.41 (C-1'), 133.66 (C-1"), 136.67 (C-4'), 144.53 (C-4"), 146.69 (C-3"), 153.26 (C-3', C-5'), 178.67 (C-1). 이상의 spectral data를 근거로 compound2를 (-)-traxillagenin으로 동정하였다.
실시예 3
Compound3의 분리
Compound3(151㎎)은 소분획 B-3으로부터 조결정으로 석출되어 MeOH로 재결정하여 백색의 분말상으로 정제하였다.
Compound 3의 구조결정 - 백색 분말; [α]18 D: -38.2° (c=1 in CHCl3), MS:m/z= 388 [M]+, 194, 167, 137: UV λmax = 231, 287 : IR max cm-1: 3500 (OH), 1760 (CO), 1605, 1525 (arom. C=C) :1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): 6.82 (1H, d,J= 1.71, H-2), 6.75 (1H, d,J= 8.04, H-5), 6.68 (1H, dd,J= 8.04, 1.70, H-6), 6.39 (2H, s, H-2, 6), 4.12 (1H, dd,J= 8.55, 7.21, H-4), 3.89 (1H, dd,J=8.61, 7.80, H-4), 2.94 (1H, dd,J= 13.89, 5.47, H-5), 2.82 (1H, dd,J= 13.90, 6.50, H-5), 2.69-2.48 (4H, m, H-6 , H-2 , H-6 , H-3), 3.79 (3H, s, OCH3), 3.76 (3H, s, OCH3), 3.75 (3H, s, OCH3).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 35.61 (C-6), 39.36 (C-5), 42.77 (C-3), 47.48 (C-2), 56.73 (OMe), 57.06 (OMe ×2), 72.11 (C-4), 107.49 (C-2', C-6'), 114.24 (C-5"), 116.13 (C-2"), 123.36 (C-6"), 130.56 (C-1'), 131.06 (C-1"), 135.94 (C-4'), 146.74 (C-4"), 148.80 (C-3"), 149.20 (C-3', C-5'), 179.47 (C-1). 이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 compound3을 (-)-4'-demethyltraxillagenin으로 결정하였다.
실시예4
Compound4와5의 분리
활성 분획인 A-10 분획을 CHCl3와 MeOH의 혼합용매로 (CHCl3: MeOH = 50 : 1 → 1 : 1) silica gel column chromatography를 시행하여 dragendorff 양성 반응을 나타내는 혼합물 (650mg)을 얻었으며, 이를 다시 HPLC를 (H2O : AcCN = 70 : 30, retention time = 55.3 min, 58.7 min) 시행하여 compound4(100mg)와5(120mg)를 각각 분리하였다. 이 화합물들은 anisaldehyde-H2SO4에 진녹색으로 발색하였고, dragendorff 시약에 강한 황적색 발색을 나타내었다.
Compound4의 구조결정 - 백색 분말, Rf= 0.20 (CHCl3: MeOH = 10 : 1, silica), mp = 110 - 112℃, [α]18 D= -53.5° (c=1 in MeOH), Positive FABMS (m/z, relative intensity) = 557 ([M+Na]+, 61), 372 ([M-glucose]+, 68), 151(81), 137 (100), UV λmaxnm (log ε) : 226 (4.67), 276 (4.45), IR νmax(thin film, cm-1) : 3450 (OH), 1770 (γ lactone), 1600, 1520, 1470 (arom. C=C),1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ 6.97 (1H, d,J= 8.28, H-5), 6.82 (1H, d,J= 8.04, H-5'), 6.77 (1H, d,J= 1.71, H-2), 6.65 (1H, dd,J= 8.25, 1.71, H-6), 6.65 (s, 1H, H-2'), 6.59 (1H, dd,J= 8.04, 1.79, H-6'), 4.83 (d, 1H,J= 7.32, Glc-H-1), 4.08 (1H, m, H-9'β), 3.82 (1H, m, H-9'α), 3.70 (3H, s, OCH3), 3.69 (6H, s, OCH3), 2.79 (1H, m, H-7β), 2.73 (m, 1H, H-7α), 2.60 - 2.40 (m, 4H, H-7'β, H-8, H-7'α, H-8'),13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ 178.86 (C-9), 149.06 (C-3, 3'), 147.71 (C-4'), 145.79 (C-4), 132.17 (C-1), 131.61 (C-1'), 121.71 (C-6), 120.82 (C-6'), 115.46 (C-5), 114.19 (C-2), 112.76 (C-2'), 112.23 (C-5'), 71.11 (C-9'), 56.02 (OCH3), 55.80 (OCH3×2), 45.98 (C-8), 41.16 (C-8'), 37.27 (C-7'), 33.92 (C-7), 100.55 (Glc-1), 77.42 (Glc-5), 77.29 (Glc-3), 73.63 (Glc-2), 70.05 (Glc-4), 61.05 (Glc-6). 이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 compound4를 (-)-artiin으로 동정하였다.
Compound5의 구조 결정 - 백색 분말, Rf= 0.20 (CHCl3: MeOH = 10 : 1, silica), mp = 88 - 92℃, [α]18 D= -67.5° (c=1 in MeOH), Positive FABMS (m/z, relative intensity) = 587 ([M+Na]+, 27), 402 ([M-glucose]+, 72), 181 (88), 137 (100) UV λmaxnm (log ε) : 225 (4.23), 277 (3.42), IR νmax(thin film, cm-1) : 3550 (OH), 1765 (γ lactone), 1600, 1520, 1470 (arom. C=C),1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ 6.97 (1H, d,J= 8.28, H-5), 6.79 (1H, d,J= 1.71, H-2), 6.65 (1H, dd,J= 8.28, 1.71, H-6), 6.37 (2H, s, H-2', 6'), 4.81 (d, 1H,J= 7.32, Glc-H-1), 4.12 (1H, m, H-9'β), 3.88 (1H, m, H-9'α), 3.72 (6H, s, OCH3), 3.59 (3H, s, OCH3), 2.82 (1H, m, H-7β), 2.74 (m, 1H, H-7α), 2.60 - 2.40 (m, 4H, H-7'β, H-8, H-7'α, H-8'),13C NMR(100 MHz, DMSO-d6) δ 178.85 (C-9), 153.25 (C-3', 5'), 149.13 (C-3), 145.85 (C-4), 136.38 (C-4'), 135.00 (C-1), 132.28 (C-1'), 121.80 (C-6), 115.58 (C-5), 114.39 (C-2), 106.24 (C-2', 5'), 71.14 (C-9'), 60.41 (OCH3), 56.25 (OCH3×2), 56.14 (OCH3), 45.98 (C-8), 40.61 (C-8'), 38.02 (C-7'), 34.00 (C-7), 100.76 (Glc-1), 77.48 (Glc-5), 77.34 (Glc-3),73.66 (Glc-2), 70.11 (Glc-4), 61.10 (Glc-6). 이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 compound5를 (-)-traxillaside로 동정하였다.
실험예 1
1. 실험방법
1) 실험동물:
Sprague-Dawley계 흰쥐를 서울대학교 동물사육장에서 공급받아 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 사육장의 환경은 실내온도를 22 ± 5 ℃로 유지하고 조명시간을 아침 7시에서 저녁 7시로 고정하였으며, 사료는 조단백 23.2%, 조지방 4.0%, 조섬유 6.0%, 조회분 10.0%, 조칼슘 0.6%, 조인 0.4%등이 함유된 고형사료 (서울, 삼양사)를 사용하였다.
2) 흰쥐의 대뇌피질세포의 분리 및 배양:
흰쥐의 대뇌피질세포의 분리 및 배양은 다음의 문헌에 기재된 방법으로 본 연구실에서 확립한 방법으로 시행하였다 (Choi, D. W. (1985) Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent.Neurosci. Lett. 58: 293-297; and Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.J. Immuno. Methods65: 55-61).
3) 비자 수피의 총추출물과 분획 및 리그난 유도체들의 신경세포 보호활성 측정:
비자 수피의 총 추출물, 분획물 및 리그난 유도체들은 DMSO (최종농도 0.1% 이내)에 용해시킨 후 증류수로 희석하여 1㎎/㎖의 농도로 제조한 다음 millipore membrane (0.22 ㎛, Millex-GV, U.S.A.)을 통과시켜 무균상태로 만들고 농도를 달리하여 투여하였다. 십 사일 동안 배양한 대뇌피질세포에 글루타메이트 100μM을 30분간 노출시키기 1시간 전 (전처리) 혹은 노출 후 (후처리)에 활성을 측정하고자 하는 시료 (분획물과 리그난들)를 처리하였다. 이후 24시간을 시료와 함께 (후처리) 혹은 DMEM 단독으로 배양한 다음 독성으로부터의 보호활성 정도를 MTT assay와 LDH assay로 측정하였다.
4) MTT assay:
배양 중인 대뇌피질세포의 배양액에 MTT (5㎎/㎖)를 배양액의 10%가 되도록 가하고 계속하여 3시간 더 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO로 녹여낸 다음 540nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다 ( Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.J. Immuno. Methods65: 55-61).
5) LDH assay:
일차배양한 대뇌피질세포로부터 배양액 중으로 유리되는 LDH의 활성을 Choi와 Koh의 방법 (Choi, D. W. and Koh, J. (1987) Ionic dependence of glutamate neurotoxicity.J. Neurosci.7: 369-379)을 이용하여 측정하였다.
6) Kainate 수용체 결합능 측정:
수컷 SD 랫트 (200-250g)로부터 대뇌피질 세포막 분획을 Zhou 등의 방법에 따라 제조하였다 (Zhou, L. M., Gu, Z. Q., Costa, A. M., Yamada, K. A., Mansson, P. E., Giordano, T., Skolnick, P., Jones, K. A. (1997) (2S, 4R)-4-Methylglutamic Acid (SYM 2081): A Selective, High-Affinity Ligand for Kainate Receptors.J. Pharmacol. Exp. Ther. 280: 422-427). 결합능 측정은 세포막 현탁액 (200㎍ 단백질), [3H]-kainate, 그리고 활성을 측정하고자 하는 리그난으로 구성된 총 500㎕의 반응액으로 수행하였다. 비특이적 결합능은 글루타메이트를 결합 길항제로 사용하여 결정하였다. 시료의 전처리에 의한 결합능 측정에서는 [3H]-kainate를 투여하기 전 세포막을 리그난들과 4℃에서 1시간 동안 전처리한 후 수행하였고, 동시 투여에 의한 결합능 측정에서는 [3H]-kainate의 투여와 동시에 리그난들을 투여하였다. 측정 반응액에 [3H]-kainate를 투여한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 48,000×g로 5분간 원심분리 (Beckman XL-100 ultracentrifuge)하여 반응을 중단시켰다. 펠렛을 얼음으로 냉각시킨 50mM Tris-HCl buffer 1㎖로 두 번 세척한 후 HydroSol scintillation cocktail 10㎖에 녹여 Beckman Model DU-40 Liquid Scintillation Spectrometer로 [3H] 양을 정량하였다.
7) 세포 내 Ca2+농도 측정:
일차배양한 대뇌피질세포 내의 Ca2+의 농도는 Grynkiewicz 등의 방법에 따라 측정하였다 (Grynkiewicz, G., Poenie, M. and Tsien, R. Y. (1985) A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties.J. Biol. Chem.260: 3440-3450).
8) Nitrite의 정량:
일차배양한 대뇌피질세포로부터 배양액 중으로 유리되는 nitrite의 양은 Dawson 등의 방법으로 측정하였다 (Dawson, V.L., Brahbhatt, H.P., Mong, J.A. and Dawson, T.M. (1994). Expression of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary mixed neuronal-glial cortical cultures. Neuropharmacology 33: 1425-1430).
9) 세포 내 peroxide의 측정:
배양 세포 내의 상대적인 free radicals의 양은 Goodman과 Mattson의 방법을 이용하여 측정하였다 (Goodman, Y., Mattson, M. P. (1994) Selected forms of amyloid precursor protein protect hippocampal neurons against amyloid peptide induced oxidative injury. Exp. Neurol. 128: 1-12).
10) 항산화효소 활성 측정:
배양 세포에서의 Superoxide dismutase (SOD) (McCord, J.M. and Fridovich, I. (1969). Superoxide dismutase, an enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein). J. Biol. Chem. 244: 6049-6055), catalase ( Beers, R.F. and Sizer, I.W. (1952). A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem. 195: 133-140), glutathione peroxidase (GSH-px) (Flohe, L. and Gunzler, W.A. (1984). Assays of glutathione peroxidase. Method Enzymol. 105: 114-121), glutathione reductase (GSSG-R) ( Carlberg, I. and Mannervik, B. (1975). Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductase from rat liver. J. Biol. Chem. 250: 5475-5480)의 활성은 기존의 방법을 알맞게 변형하여 측정하였다 ( Kim, Y.C., Kim, S.R., Markelonis, G.J. and Oh, T.H. (1998). Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J. Neurosci. Res. 53: 426-432).
11) Total GSH (글루타치온) (GSH + GSSG) 및 GSSG (산화형 글루타치온) 양의 측정:
Total GSH 및 GSSG의 양은 Tietz의 방법에 따라 측정하였다 ( Tietz, F. (1969). Enzymatic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Anal. Biochem. 27: 502-522).
12) 단백질 정량:
단백질 정량은 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 Lowry 등의 방법으로 정량하였다 (Lowry, O., Rosebrough, H., Farr, A. and Randall, R. (1951). Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275).
13) 통계처리:
통계적 유의성 검토는 각 실험군의 수를 3으로 하였으며 (n=3) 대조치로부터의 변동을 "ANOVA test"로 하였다. P값이 5% 미만일 때는 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
2. 결과 및 고찰
1) 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 글루타메이트에 의한 신경독성에 미치는 비자 수피의 총 추출물 및 각각의 분획물의 효과를 MTT assay로 측정하였다. 십사일간 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 비자 수피의 총 추출물 및 각각의 분획물을 농도별로 투여하고 100??M 글루타메이트를 30분간 작용시키고 24시간 더 배양하였다. 이 때에도 계속하여 비자 수피의 총 추출물 및 각각의 분획물을 작용시켰다 (Throughout treatment). 비자 수피의 총 추출물과 CH2Cl2분획이 글루타메이트에 의한 신경독성을 차단시키는 효과가 우수하였다. 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 신경세포 보호활성이 우수한 CH2Cl2분획을 CHCl3와 MeOH 혼합용매로 silicagel column chromatography를 수행하여 15개의 소분획으로 나누고 이들 중 유의성 있는 신경세포 보호활성을 나타낸 A-2와 A-3 분획을 합쳐n-hexane과 ethyl acetate 혼합용매로 다시 silica gel column chromatography를 시행하였다. 이 column chromatography를 통해 다시 얻은 12개의 소분획 중 B-2와 B-3에서 신경세포 보호 활성이 뛰어난 화합물 compound 1, 2와 compound 3을 각각 분리하였다. 활성 소분획 A-10으로부터 HPLC를 연속적으로 수행하여 compound 4와 5를 분리하였다. 이들 화합물들은 (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxilla genin, (-)-artiin, (-)-traxillaside로 각각 그 구조가 동정, 규명되었다. 이 중 (-)-4'-demethyltraxillagenin은 처음으로 분리, 보고되는 물질이다.
2) 분리한 화합물들 중 화합물 1, 2와 3의 신경세포 보호 활성을 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 검색하였다. 그 결과를 다음의 표 1에 나타내었다(Table 1). 20일간 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 이들 리그난들을 농도별로 투여하고 LDH assay를 시행하여 그 효과를 측정한 결과 이들 디벤질부틸로락톤 리그난들은 0.1μM∼10μM의 농도에서 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 각각 나타내었다 (Table 1). 이에 이들 리그난들이 어떠한 기전으로 글루타메이트에 의한 신경독성을 차단시키는지 알아보기 위하여 분리한 화합물들의 투여시기를 달리하여 보았다. 즉, (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxillagenin을 농도별로 글루타메이트를 투여하기 1시간 전부터 글루타메이트를 작용시킬 때까지만 투여하고 (pre-treatment), 배양액을 DMEM으로 교환하고 24시간 더 배양하고 LDH assay를 시행하였다. 또한, 14일간 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트를 30분간 작용시킨 후 DMEM으로 갈아주면서 (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-de- methyltraxillagenin을 농도별로 투여하여 24시간 더 배양하고 (post-treatment) LDH assay를 시행하였다. 그 결과 이들 세 리그난들은 전처리와 후처리 모두에서 유의성 있는 활성을 나타내었으나, 전처리에서 약간 더 높은 보호활성을 나타내었다. 그 결과를 다음의 표 2에 나타내었다 (Table 2). 이러한 결과는 이들 화합물들이 글루타메이트의 독성발현의 초기에 더 효과적으로 작용한다는 것을 제시한다.
3) 이상의 실험결과에서 글루타메이트에 의한 신경독성에 대하여 우수한 보호활성을 보인 (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxillagenin이 글루타메이트성 수용체에 작용하는가를 글루타메이트 수용체 중 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용체 및 non-NMDA 수용체에 대하여 알아보았다. 즉, 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 이들 세 리그난들을 농도별로 작용시키고 1시간 후에 NMDA 효능제인 NMDA 및 non-NMDA 효능제인 kainic acid (KA)를 투여하여 신경독성을 유발시키면서 이들 리그난들이 유발되는 신경독성에 어떠한 영향을 미치는 가를 알아보았다. 그 결과를 다음의 표 3에 나타내었다(Table 3). 이들 세 리그난들은 NMDA와 KA에 의한 독성에 모두 유의성 있는 보호활성을 나타내었으나, KA에 의한 독성에 보다 높은 차단 효과를 나타내었다. 이는 이들 리그난들이 글루타메이트 수용체 중 NMDA 수용체보다 KA 수용체에 대한 선택성이 뛰어나다고 생각할 수 있다. 이러한 결과는 다음의 일련의 실험을 통해 더욱 확실히 결론내릴 수 있었다.
4) NMDA나 글루타메이트에 의한 NMDA 수용체의 흥분은 세포 내로의 칼슘의 유입을 증가시키고 잇따른 nitric oxide synthase (NOS)의 활성을 증가시키며 결국 nitric oxide (NO)의 과다생성을 유발하여 독성을 일으키게 된다. 이들 리그난들의 세포 내 칼슘의 양과 NO 양에 미치는 영향을 살펴본 결과, 과량의 글루타메이트에 의해 증가된 세포 내 칼슘의 양을 유의성 있게 감소시키지 못하였다. 그 결과를 다음의 표 4에 나타내었다(Table 4). 또한, 글루타메이트에 의해 증가된 세포 내 NO의 양도 유의성 있게 줄이지 못하였다 (데이터 생략). 이들 결과는 비자 수피의 리그난들이 NMDA 수용체나 NMDA 수용체와 관련된 일련의 세포 내 반응들에 강하게 작용하지 않는다는 것을 설명한다.
5) 비자 수피로부터 분리한 세 리그난들이 글루타메이트에 의한 초기 독성에 작용하며 KA에 의한 세포독성에 보다 우수한 차단작용을 나타내므로, 이 중 가장 뛰어난 보호작용을 갖는 악티게닌의 KA 수용체에 대한 결합능을 흰쥐의 대뇌 피질 세포막 분획에 대한 [3H]-kainate의 결합능을 이용해 알아보았다. 악티게닌은 대뇌피질의 세포막에 전처리하여 반응시켰을 때, [3H]-kainate의 결합능을 상당히 저해하였다. 악티게닌의 IC50는 83nM로 non NMDA 길항제로 알려진 CNQX (IC50, 90nM)와 비슷하였다. 그러나, 악티게닌을 [3H]-kainate와 동시에 투여하였을 경우에는 IC50가 388nM로 떨어져 (CNQX: IC50, 189.1nM) KA 수용체에 대한 친화력이 CNQX보다는 떨어짐을 알 수 있었다. 하지만, 악티게닌의 KA 수용체와의 정확한 상호작용을 알기위해선 결합 방식과 친화력 그리고 동력학적 지표를 밝히기 위한 추가적인 실험이 필요할 것이다.
6) KA에 의한 신경세포 독성은 hydroxyl radicals과 superoxide anions을 포함하는 자유기에 의한 것으로 알려져 있다. 비자 수피의 리그난들이 KA로 유발된 독성에 보다 높은 보호작용을 나타내므로, 이들 리그난들이 세포 내의 peroxide의 양에 미치는 영향을 특이적 형광 염료인 2, 7-DCF-DA를 사용하여 알아보았다 (Table 4). 실제로, 이들 리그난들은 과량의 글루타메이트에 노출되어 증가된 세포 내 peroxide의 양을 효과적으로 감소시켰다. 이 결과는 비자 수피로부터 분리된 리그난들이 항산화작용을 가짐을 제시한다.
7) 자유기는 arachidonic acid 대사 중에 생성되며 phospholipase A2의 활성을 증가시킨다 ( Lafon-Cazal, M., Pietri, S., Culcasi, M. and Bockaert, J. (1993). NMDA-dependent superoxide production and neurotoxicity. Nature 364: 535-537). Oxidative stress는 글루타메이트에 의해 유도되는 신경세포의 퇴화에 있어 잘 알려진 기전이다 (Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system.Trends Neurosci.5: 22-26; and Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases.Mol. Aspects Med.8: 89-193). CNS의 신경세포들은 비이상적으로 oxidative stress에 취약한데, 이는 이들 세포들이 산소 소비량이 다른 세포들에 비해 높고 세포 내에 다중 불포화 지방산을 다량 함유하고 있기 때문이다 (Buckman, T.D., Sitphin, M.S. and Mitrovic, B. (1993). Oxidative stress in a clonal cell line of neuronal origin: effects of antioxidant enzyme modulation. J. Neurochem. 60: 2046-2058). 뇌는 글루타치온 (GSH)과 같은 항산화 물질과 catalase, SOD, GSH-px, GSSG-R과 같은 항산화 효소를 포함하는 세포적 방어시스템을 갖고 있다. 그러므로, 이들 뇌세포 보호활성을 갖는 리그난들의 항산화 효소에 대한 작용을 알아보았다. (-)-Arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxillagenin은 GSSG-R의 활성을 아주 효과적으로 보존하였는데 (Table 5), 이 효소는 환원형 GSH의 세포 내 항상성을 유지시키는 데 중요한 역할을 담당한다. 또한, 이들 리그난들은 catalase의 활성도 유지시켰다. Oxidative stress를 유발하는 물질들 중 하나인 superoxide anion들은 SOD에 의해 H2O2로 변환되고 다시 catalase에 의해 물로 전환된다 (Olanow, C. W. (1993) A radical hypothesis for neurodegeneration. Trends Neurosci. 16: 439-444). 글루타메이트에 의한 독성에서 산소 분자의 물로의 환원과정은 가장 강력한 산화제인 hydroxyl radical을 생성한다 (Yu, B. P. (1994) Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. Physiol. Reviews 74: 139-162). 이들 리그난들에 의한 catalase 활성의 보존은 과산화수소와 hydroxyl radical의 제거율을 높임으로써 oxidative stress를 감소시키게 된다.
8) GSH는 oxidative stress에 의해 생성되는 각종 자유기와 반응성이 높은 중간 산물들을 제거하는 데 중요한 역할을 담당한다 ( Freeman, B.A. and Crapo, J.D.(1982). Biology of disease. Free radicals and tissue injury. Lab. Invest. 47: 412-426). GSSG는 독성을 가진 중간대사체로 흔히 세포 내 산화적 반응의 결과물로 생성된다 (Pan, Z. and Perez-Polo, R. (1993). Role of nerve growth factor in oxidant homeostasis: Glutathione metabolism. J. Neurochem. 61: 1713-1721). 그러므로, 비자 수피로부터 분리한 리그난들이 세포 내 산화적 반응에 미치는 영향을 더 자세히 알아보기 위하여 배양한 신경 세포에서의 총 GSH와 GSSG의 양을 측정하였다. 그 결과, 리그난들은 과량의 글루타메이트에 의해 유도되는 총 GSH의 양의 감소에는 영향을 미치지 않았지만 GSSG의 양은 유의성 있게 감소시켰다. 그 결과를 다음의 효 6에 나타내었다(Table 6). 결과적으로 세포 내 산화적 지표인 GSH/GSSG의 값은 거의 정상상태로 회복되었다. 이상의 결과를 통해 이들 디벤질부틸로락톤 리그난들은 GSSG-R의 활성을 유지시킴으로써 GSH의 생산을 촉진시키는 것으로 생각된다. 이와는 대조적으로, 이들 리그난들은 SOD와 GSH-px의 활성에는 유의성 있는 보호활성을 나타내지 않았다. 그 결과를 다음의 표 5에 나타내었다(Table 5).
이상의 결과를 통해 비자 수피로부터 분리된 디벤질부틸로락톤 리그난들인 (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxillagenin은 신경세포의 항산화 방어시스템을 유지시킴으로써 과량의 글루타메이트로 유도되는 독성으로부터 신경세포를 보호하는 작용을 나타내는 것으로 결론내릴 수 있다.
3. 결론
1) 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트를 투여하여 신경독성을 유발시켰을 경우, 비자 수피의 총 추출물, CH2Cl2분획물은 농도 의존적으로 유의성 있는 신경세포보호 활성을 나타내었다.
2) 비자 수피의 CH2Cl2분획물로부터 분리한 디벤질부틸로락톤 리그난들인 (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin 및 (-)-4'-demethyltraxillagenin은 과량의 글루타메이트로 유도되는 뇌신경세포 독성에 대해 유의성 있는 보호활성을 나타내었다.
3) 이들 중 가장 뛰어난 보호활성을 나타낸 악티게닌은 글루타메이트 수용체 중 non NMDA 수용체인 KA (kainic acid) 수용체에 보다 높은 친화력을 나타내었다.
4) 상기의 리그난들은 과량의 글루타메이트로 인하여 증가된 세포 내 peroxide의 양을 유의성 있게 감소시켰다.
5) 상기의 리그난들은 과량의 글루타메이트로 인하여 감소된 세포 내 항산화 효소들인 GSSG-R, catalase의 활성을 보존시켜 신경세포 보호 활성을 나타내었다.
6) (-)-Arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxillagenin은 신경세포의 항산화 방어시스템을 유지시킴으로써 과량의 글루타메이트로 유도되는 독성으로부터 신경세포를 보호하는 작용을 나타내었다.
7) 이상의 실험결과로 비자 수피의 총 메탄올 추출물, CH2Cl2분획물, 및 이로부터 분리된 (-)-arctigenin, (-)-traxillagenin, (-)-4'-demethyltraxillagenin의 다이벤질부틸락톤 리그난 유도체들은 뇌졸중 및 치매의 치료제로 사용할 수 있으리라 생각된다.
Scheme 1. Extraction and fractionation of the cortex ofTorreya nucifera
Table 1. The neuroprotective activity of compounds isolated fromT. nuciferaon glutamate-induced neurotoxicity in primary cultures of rat cortical cells in throughout treatment.
Compounds Concentration (μM) Protection (%)
control 100 ± 4.2
glutamate-treateda,b 0.0 ± 1.3
1 0.01 5.7 ± 1.9
0.1 29.0 ± 3.3*
1 72.9 ± 4.8***
10 57.4 ± 2.9**
2 0.01 37.2 ± 2.9*
0.1 51.8 ± 1.3**
1 21.3 ± 4.8
10 -13.5 ± 2.7
3 0.01 3.3 ± 4.1
0.1 11.0 ± 3.8
1 25.3 ± 1.1*
10 60.5 ± 2.5***
MK-801 c 10.0 83.6 ± 4.2***
APV d 10.0 43.6 ± 3.2**
CNQX e 10.0 61.6 ± 2.7***
aLDH released from control and glutamate-treated cultures were 110.9 ± 8.3 and 197.6 ± 10.2 mU/ml, respectively. Cell viability was calculated as 100 (LDH released from glutamate-treated LDH released from glutamate + test compound) / (LDH released from glutamate-treated LDH released from control).
bGlutamate-treated value differs significantly from the untreated, control at a level of p < 0.001.
cMK 801 : dizocilpine maleate, a non-competitive antagonist of the NMDA receptor.
dAPV : DL-2-amino-5-phosphonovaleric acid, a competitive antagonist of the NMDA receptor.
eCNQX : 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2, 3-dione, non-NMDA receptor antagonist.
Results differ significantly from the glutamate-treated,*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001.
Table 2. Neuroprotective activities of dibenzylbutyrolactone lignans isolated fromTorreya nuciferaon glutamate-induced neurotoxicity in primary cultures of rat cortical cells.a,b
a Pre-treatment: Lignan treatment was conducted 1 hr prior to the glutamate insult.
b Post-treatment: Lignan was added after glutamate insult.
cLDH released from control and glutamate-treated cultures measured 110.9 ± 8.3 and 197.6 ± 10.2 mU/ml, respectively. Protection (%) was calculated as 100 × (LDH released from glutamate-treatedminusLDH released from glutamate + test compound) / (LDH released from glutamate-treatedminusLDH released from control).
dGlutamate-treated cells differ significantly from the control at a level of p < 0.001.
Table 3. Neuroprotective activities of dibenzylbutyrolactone lignans isolated fromTorreya nuciferaonN-methyl-D-aspartate- or kainate-insultedrat cortical cells.
Cortical cultures werepretreatedwith arctigenin, traxillagenin or 4'-demethyl traxillagenin for 1 hr. The cultures were then exposed to 50μM NMDA for 30 min or to 50μM KA for 3 hr and then washed. The cultures were maintained for an additional 24 hr in DMEM. Cell viability was measured by the LDH assay. The control was not treated with NMDA or KA. LDH release fromcontrol, NMDA or KA-treated cultures measured 110.9 ± 8.3, 210.3 ± 6.7 and 186.1 ± 5.2 mU/ml, respectively. Protection (%) was calculated as 100 × (LDH released from NMDA/KA treated - LDH released from NMDA/KA + test compounds) / (LDH released from NMDA/KA treated - LDH released from control).
aNMDA or KA treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.
Mean value is significantly different from the mean value of excitotoxin-treated;*p< 0.05,**p< 0.01,***p < 0.001.
Table 4. Effects of dibenzylbutyrolactone lignans isolated fromTorreya nuciferaon intracellular [Ca2+]i and intracellular peroxide in the glutamate-insulted rat cortical cellsa
aThe lignans were added aspretreatmentsas in Table 2. Values shown are the mean ± SEM of three experiments.
bGlutamate-treated value differs significantly from the control at a level of p < 0.001.
cResults differ significantly from the glutamate-treated at a level of*p <0.05;**p < 0.01;***p < 0.001.
dEffects of dibenzylbutyrolactone lignans on intracellular [Ca2+]i in cultured cortical cells were compared with that of well-known Ca2+channel blocker, MK-801. When cortical cells were treated with MK-801, [Ca2+]i was 294.4 ± 4.1 nM (p < 0.01) or 136.7 ± 2.9 nM (p < 0.001) at concentrations of 0.1 μM and 1.0 μM, respectively.
Table 5. Effects of dibenzylbutyrolactone lignans on the activities of SOD, catalase, GSH-px and GSSG-R in cortical cell cultures injured by glutamate.
SOD(mU/ml) Catalase(mol/H2O2consumed/min/mg protein) GSH-px GSSG-R(mol NADPH consumed/min/mg protein)
Control 60.5 ± 4.1 38.7 ± 4.2 21.2 ± 2.7 14.2 ± 1.2
Glutamate-treated 25.2 ± 3.1 17.9 ± 3.5 8.2 ± 0.7 5.2 ± 1.0
arctigenin 31.6 ± 5.2 29.8 ± 7.6* 10.0 ± 1.1 12.5 ±0.7***
traxillagenin 25.4 ± 4.9 32.1 ± 4.1** 9.8 ± 2.7 13.0 ±1.1***
4'-demethyl traxillagenin 25.6 ± 2.2 31.3 ± 3.9** 11.3 ± 3.3 12.6 ±1.0***
Cortical cell cultures werepretreatedwith 1 μM arctigenin, 0.1 μM traxillagenin or 10.0 μM 4'-demethyl traxillagenin for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Values given represent the mean ± S.D. of three separate experiments. Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated;*p<0.05,**p<0.01,***p < 0.001.
Table 6. Effects of dibenzylbutyrolactone lignans on the content of total GSH and GSSG and the ratio of GSH/GSSG in rat cortical cultures injured with glutamate.
Groups Total GSH(nmol/mg protein) GSSG(nmol/mg protein) GSH/GSSG
Control 89.3 ±7.9 7.2 ±1.1 11.4 ± 0.9
21.8 ±3.1
Glutamate-treated 4.8 ±0.2 3.5 ± 0.2
arctigenin 31.1 ±4.7 2.8 ±0.4** 9.9 ± 1.2***
traxillagenin 29.8 ±6.4 3.2 ±1.1* 8.2 ± 2.9**
4'-demethyltraxillagenin 25.5 ±2.3 2.7 ±0.1** 8.4 ± 3.1**
Cortical cell cultures werepretreatedwith 1.0 μM arctigenin, 0.1 μM traxillagenin or 10.0 μM 4'-demethyltraxillagenin for 1 hr before exposure to 100 μM glutamate and then maintained for 24 hr. Values given represent the mean ± S.D. for three separate experiments. Mean value is significantly different from the value for the glutamate-treated;*p<0.05,**p<0.01,***p < 0.001.
따라서 본 발명의 비자추출물, 그 CH2Cl2분획물 및 이로부터 분리된 일반구조식 (I)의 화합물들은 퇴행성 뇌신경계 질환의 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 비자추출물 및 그 CH2Cl2분획물은 일일 3mg 내지 1000mg을 1 내지 3회 투여할 수 있다.
본 발명의 일반구조식 ( I )의 화합물은 일일 1mg 내지 200mg을 1 내지 3회 투여할 수 있다.
본 발명의 추출물, CH2Cl2분획물 및 일반구조식 (I)의 화합물은 환자의 체중, 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다.
본 발명의 일반구조식 ( I )의 화합물은 퇴행성 뇌신경계 질화의 예방과 치료에 사용될 수 있고, 이 화합물은 통상으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 약제학적으로 통상으로 하용되는 약학적 제제, 예를들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.
다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
제제실시예 1
화합물 1 10mg
주사용 멸균증류수 적량
pH조절제 적량
주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
제제 실시예 2
화합물 2 2mg
주사용 멸균증류수 적량
pH조절제 적량
화합물 I을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.
제제실시예 3
화합물 3 10mg
유당 100mg
전분 100mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제실시예 4
화합물 4 10mg
유당 100mg
전분 50mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제실시예 5
화합물 5 5mg
유당 50mg
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 6
화합물 1∼5의 혼합물 10mg
유당 100mg
전분 93mg
탈클 2mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 7
비자의 메탄올추출물 1g
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.
제제실시예 8
CH2Cl2분획물 500mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.
비자의 수피의 총 저급알콜 추출물, CH2Cl2분획물 및 이로부터 분리된 일반구조식 (I)의 화합물은
1) 과량의 글루타메이트로 유도되는 뇌신경세포 독성에 대해 유의성 있는 보호활성을 나타내었으며, 2) 글루타메이트 수용체 중 non NMDA 수용체인 KA (kainic acid) 수용체에 보다 높은 친화력을 나타내었고, 3) 과량의 글루타메이트로 인하여 증가된 세포 내 peroxide의 양을 유의성 있게 감소시켰으며, 4) 과량의 글루타메이트로 인하여 감소된 세포 내 항산화 효소들인 GSSG-R, catalase의 활성을 보존시켜 신경세포 보호 활성을 나타내었고, 5) 신경세포의 항산화 방어시스템을 유지시킴으로써 과량의 글루타메이트로 유도되는 독성으로부터 신경세포를 보호하는 작용을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 비자의 수피의 총 메탄올 추출물, CH2Cl2분획물 및 이로부터 분리된 일반구조식 (I)의 화합물은 뇌졸중 및 치매의 치료제로 사용될 수 있다.

Claims (2)

  1. 비자의 수피의 총 저급알콜 추출물, CH2Cl2분획물 및 이로부터 분리된 일반구조식 (I)의 화합물의 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제로서의 용도.
    (I)
    상기식에서 R1은 하이드록실기, 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기, 또는 -OGlu(여기에서 Glu는 글루코실기를 의미한다.)기이며, R2는 수소원자, 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이며, R3는 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이다.
  2. 비자의 수피의 총 저급알콜 추출물, CH2Cl2분획물 및 이로부터 분리된 일반구조식 (I)의 화합물을 유효성분으로 함유하고 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제와 혼합하고, 통상의 약제학적 제제의 제조방법으로 통상의 약학적 제제의 형태로제제화시킨 퇴행성 뇌신경계 질환 치료제로서의 용도를 가지는 약학적 제제.
    (I)
    상기식에서 R1은 하이드록실기, 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기, 또는 -OGlu(여기에서 Glu는 글루코실기를 의미한다.)기이며, R2는 수소원자, 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이며, R3는 하이드록실기 또는 탄소수 1 ∼ 4의 저급알콕시기이다.
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