KR20020034094A - 항-αｖβ3 재조합 인간 항체, 이를 코딩하는 핵산 및사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 αvβ3에 대해 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체, 또는 이의 기능적 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 αvβ3을 증강된 LM609 이식 항체와 접촉시키는 것에 의해 αvβ3의 기능을 억제하는 방법을 제공한다.

Description

항-αｖβ3 재조합 인간 항체, 이를 코딩하는 핵산 및 사용 방법{Anit-αｖβ3 Recombinant Human Antibodies, Nucleic Acids Encoding Same and Methods of Use}
인테그린은 세포-세포, 및 세포-세포외 기질의 부착 현상을 모두 매개하는 세포 부착 수용체의 일 군이다. 인테그린은 단일 α사슬 폴리펩티드가 단일 β사슬와 비공유 결합적으로 결합한 헤테로다이머 폴리펩티드로 구성되어 있다. 현재 세포 부착 수용체의 인테그린과를 구성하는 약 14 가지의 상이한 α사슬 폴리펩티드 및 약 8 가지 이상의 상이한 β사슬 폴리펩티드가 존재한다. 일반적으로, 상이한 결합 특이성 및 조직 분포는 α 및 β사슬 폴리펩티드 또는 인테그린 서브유닛의 독특한 조합으로부터 유래하는 것이다. 특정 인테그린과 연관된 과는 보통 β 서브유닛으로 특징지워진다. 그러나, 인테그린의 리간드 결합 활성은 α 서브유닛에 의해 크게 영향받는다. 예를 들면, 비트로넥틴(vitronectin) 결합 인테그린은αv인테그린 서브유닛을 포함한다.
현재 비트로넥틴 결합 인테그린이 3 개 이상의 상이한 αv포함 인테그린으로 이루어짐이 공지되어 있다. 이들 αv포함 인테그린은 αvβ3, αvβ1및 αvβ5를 포함하고, 이들 모두는 상이한 리간드 결합 특이성을 나타낸다. 예를 들면, 비트로넥틴 외에도, αvβ3는 피브로넥틴, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 폰 빌브란트 (von Willebrand) 인자, 콜라겐, 오스테오폰틴 및 골 시알로단백질 (bone sialoprotein) I을 포함하는 매우 다양한 세포외 기질 단백질에 결합한다. 인테그린 αvβ1은 피브로넥틴, 오스테오폰틴 및 비트로넥틴에 결합하는 반면, αvβ5는 비트로넥틴 및 오스테오폰틴에 결합하는 것으로 알려져 있다.
세포 부착 수용체로서, 인테그린은 예를 들면, 세포 유착, 세포 이동 및 세포 증식을 포함하는 다양한 생리적 과정에 관여한다. 상이한 인테그린은 이들 생물적 과정 각각에서 상이한 역할을 하고, 이들 기능 또는 활성의 부적당한 조절은 다양한 병적 질환에 이르게 할 수 있다. 예를 들면, 종양의 신생혈관형성 도중의 부적당한 내피 세포 증식은 비트로넥틴 결합 인테그린 발현 세포에 의해 매개됨이 밝혀졌다. 이러한 견지에서, 비트로넥틴 결합 인테그린 αvβ3의 억제는 또한 종양 신생혈관형성의 상기 과정을 억제한다. 동일한 기준에 의하여, αvβ3는 또한 예를 들면 피부 상처 중의 과립화 조직의 발생 및 재협착과 연관된 비정상적 세포 증식을 매개함이 나타났다. αvβ3에 의해 매개 또는 영향받는 추가 질병 또는 병적 상태는 예를 들면, 전이, 골다공증, 연령관련 황반 변성 및 당뇨병성 망막증, 및 류마토이드 관절염 및 건선과 같은 염증성 질병을 포함한다. 따라서, 비트로넥틴 결합 인테그린을 특이적으로 억제할 수 있는 물질은 질병의 치료에 유용할 수 있다.
많은 인테그린이 다수의 세포외 기질 단백질에서 발견되는 트리펩티드 서열 Arg-Gly-Asp (RGD)를 인식함으로써 그들의 세포 부착 작용을 매개한다. 특정 인테그린 매개 병태를 표적화하기 위해 상기 서열을 본뜬 물질을 모델링하는 다양한 접근법이 시도되었다. 이러한 접근법은 예를 들면, RGD 코어 트리펩티드 서열에 접하는 서열에 의해 부여되는 특이성에 의존하는 RGD 포함 펩티드 및 펩티드 유사체를 사용하는 것을 포함한다. 비록 성공은 제한적이었지만, 대부분의 RGD 기재 억제제는 고작 표적 인테그린에 선택적이고, 따라서 다른 비표적 인테그린과의 교차 반응을 어느 정도 나타냄이 드러났다. 따라서, 이러한 교차 반응성 억제제는 효과적 치료제로 사용되기 위해 요구되는 특이성을 결여하고 있다. 이는 상기 확인된 인테그린 αvβ3억제제의 경우에 특히 그러하다.
반면에 모노클로날 항체는 효과적 치료제로 사용되기 위해 필요한 특이성을 나타낸다. 항체는 또한 본질적으로 모든 요망되는 항원에 대해 통상적으로 생성될 수 있는 잇점이 있다. 게다가, 조합 라이브러리의 발달로 인하여, 항체는 현재 당업계에서 과거 사용되던 방법보다 더욱 신속하고 더욱 효율적으로 생산될 수 있다. 조합 방법을 사용하는 것은 또한 요망되는 항체의 선택과 동시에 코딩 H 사슬(heavy chain) 및 L 사슬(light chain) 핵산을 단리하는 것을 가능하게 한다.따라서, 추가 클로닝 단계를 도입함이 없이 조합 항체에 추가 변화를 가할 수 있다.
치료제로서 모노클로날 항체를 사용하는 것과 연관된 가능한 잇점에 상관없이, 이들 분자는 그럼에도 불구하고 비인간 포유류 유기체로부터 거의 독점적으로 유래된다는 단점을 갖는다. 따라서, 치료제로서의 용도는 이들이 통상적으로 숙주 면역 반응을 유발할 수 있다는 점에 의해 제한된다. 비인간 항체의 항원 결합 부위 또는 상보성 결정 부위 (CDRs)를 인간 프레임으로 치환하는 방법이 기술되어 있다. 이러한 방법은 CDR에서 어떤 아미노산이 치환되어야 하는가 뿐만 아니라 결합 특이성을 유지하기 위해서 어떤 프레임워크 잔기가 변경되어야 하는가에 따라 달라진다. 이러한 점에서, β 시트 구조의 적합한 배향, H 사슬 및 L 사슬 계면의 정확한 팩킹(packing) 및 CDRs의 적합한 형태가 모두 이식 항체의 항원 특이성 및 친화도를 보존하는데 중요함이 이해된다. 그러나, 이들 방법 모두는 비인간 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 알아야 하고, 적합한 모델링된 인간 프레임워크가 입수가능해야 한다.
따라서, 인간에게 합당한 치료제로 사용될 수 있는 인테그린 억제 항체를 코딩하는 핵산의 입수가능성에 대한 요구가 존재한다. αvβ3매개성 질병에 대하여, 본 발명은 이러한 요구를 만족시킬 뿐만 아니라, 관련된 잇점을 제공한다.
본 발명은 일반적으로 인테그린 매개성 질병, 특히 αvβ3억제 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산, 및 αvβ3매개 질병의 치료를 위한 CDR 이식 αvβ3억제 항체에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 αvβ3에 대해 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체, 또는 이의 기능적 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 αvβ3을 증강된 LM609 이식 항체와 접촉시키는 것에 의해 αvβ3의 기능을 억제하는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 비탁신(Vitaxin) 항체의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1A는 비탁신 H 사슬 가변 영역의 (Gln1-Ser117) 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열 (각각 서열 확인 번호 1 및 2)을 나타내는 반면, 도1B는 비탁신 L 사슬 가변 영역 (Glu1-Lys107)에 대한 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열 (각각 서열 확인 번호 3 및 4)을 나타낸다.
도 2는 모노클로날 항체 LM609의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2A는 LM609 H 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열 (각각 서열 확인 번호 5 및 6)을 나타낸다. 가변 영역은 아미노산 Glu1 부터 Ala117 까지 뻗어 있다. 도 2B는 LM609 L 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열 (각각 서열 확인 번호 7 및 8)을 나타낸다. L 사슬의 가변 영역은 아미노산 Asp1 부터 Lys107 까지 뻗어 있다.
도 3은 인테그린 αvβ3에 대한 재조합 LM609 Fab와 LM609 IgG의 경쟁적 억제를 나타낸다. 가용성 재조합 쥐과 LM609 Fab 단편은 M13 박테리오파지 클론muLM609M13 12 및 muLM609M13 29의 원형질막 분획으로부터 제조되었다. 원형질막 분획 시료는 연속적으로 희석하고, 각각 1 ng/ml, 5 ng/ml 또는 50 ng/ml의 LM609 IgG와 혼합하고, 이어서 정제된 αvβ3로 코팅된 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 결합된 LM609 IgG를 알카라인 포스파타제에 접합된 염소 항-쥐과 Fc 특이적 항체로 검출하였다. 클론 muLM609M13 12에 의해 제조한 Fab는 1:27 이상의 희석비의 모든 농도의 Fab에서 1 ng/ml 및 5 ng/ml LM609 IgG 결합을 억제한다.
도 4는 비탁신 결합 특이성의 특징을 나타낸다. 도 4A는 비탁신이 인테그린 αIIbβ3및 αvβ5에 비하여 인테그린 αvβ3에 특이적으로 결합함을 나타낸다. 도 4B는 비탁신에 의한 αvβ3에 대한 LM609 결합의 경쟁적 억제를 나타낸다. 도 4C는 비탁신에 의한 αvβ3에 대한 피브리노겐 결합의 경쟁적 억제를 나타낸다.
도 5는 비탁신에 의한 αvβ3매개 세포 부착 (5A) 억제 및 이동 억제 (5B)를 나타낸다.
도 6은 신생혈관형성의 비탁신 매개 억제로 인한 종양 성장의 감소를 나타낸다. 도 6A는 병아리 융모요막 (CAMs) 상에서 성장시키고, 이어서 비탁신 처리한 HEp-3 인간 종양 단편 및 αvβ3-음성 Fg의 억제를 나타낸다. 도 6B는 이식 1 일 후 2 가지 상이한 용량의 비탁신을 투여하였을 때의 토끼에게 피하 이식한 Vx2 암종의 성장 억제를 나타낸다. 도 6C는 이식 7 일 후 4 가지 상이한 용량의 비탁신을 투여한 것을 제외하고는 도 6B와 유사하게 하였을 때의 Vx2 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 7은 LM609 이식 항체 단편의 L 사슬 가변 영역 (Glu1-Lys107)의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열 (각각 서열 확인 번호 31 및 32)를 나타낸다. L 사슬 가변 영역의 제49번 위치는 적어도 Arg 또는 Met 중 하나이다. LM609 이식 항체 단편의 H 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열은 도 1A에 나타내었다 (각각 서열 확인 번호 1 및 2).
도 8은 고정화 αvβ3상에서의 LM609 이식 항체 변이체 및 LM609 이식 Fab의 역가측정을 나타낸다. LM609 이식 항체를 포함하는 세균 세포 용균물 (닫힌 원), 1차 라이브러리로부터 단리한 친화도가 개선된 LM609 이식 항체 변이체를 포함하는 세균 세포 용균물 (S102, 닫힌 사각형; Y100, 열린 사각형; 및 Y101, 열린 삼각형) 또는 조합 라이브러리로부터 단리한 친화도가 개선된 LM609 이식 항체 변이체를 포함하는 세균 세포 용균물 (닫힌 삼각형), 또는 관련없는 Fab를 포함하는 세균 세포 용균물 (열린 원)을 고정화 αvβ3상에서 역가측정하였다.
도 9는 다수의 아미노산 치환을 포함하는 증강된 LM609 이식 항체 변이체의 조합 라이브러리의 구성을 나타낸다.
도 10은 LM609 이식 항체 변이체에 의한 αvβ3에 대한 피브리노겐 결합의 억제를 나타낸다. 도 10A는 고정화 αvβ3에 대한 피브리노겐 결합의 억제를 나타낸다. 도 10B는 항체 변이체의 친화도와 피브리노겐 결합 억제와의 상관관계를 나타낸다.
도 11은 LM609 이식 항체 변이체에 의한 피브리노겐에 대한 M21 인간 흑색종 세포 부착의 억제를 나타낸다. 10 ㎍/ml의 피브리노겐이 코팅된 기질에 대한 세포 결합을 다양한 농도의 LM609 이식 Fab (닫힌 삼각형) 또는 증강된 LM609 이식 Fab인 S102 (열린 원), G102 (닫힌 원), 또는 C37 (열린 삼각형)의 존재하에서 평가하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 모노클로날 항체 (MAb) LM609를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 항체는 인테그린 αvβ3을 특이적으로 인식하고, 이의 기능적 활성을 억제한다. 본 발명은 또한 LM609의 비-쥐과 이식형을 코딩하는 핵산, 및 이 이식형을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이들 이식 항체는 부모 쥐과 항체 LM609의 결합 특이성 및 억제 활성을 유지한다. 본 발명은 추가적으로 비-쥐과 부모 LM609 이식 항체와 비교하여 증가된 결합 친화도 및 특이성을 나타내는 최적 형태의 LM609 이식 항체에 관한 것이다.
한 실시태양에서, LM609를 발현하는 하이브리도마가 LM609를 코딩하는 cDNAs를 생성하고 클로닝하는 원천으로 사용되었다. H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 cDNA를 서열분석하고, 이들의 CDR 영역을 인간 항체 프레임워크로 치환시켜 이 항체의 비-쥐과 형태를 얻었다. CDRs의 치환 또는 이식을 코돈을 기초로 하는 돌연변이발생에 의해 수행하여 특정 위치에서 대체 잔기를 나타내는 멤버로 이루어지는 조합 항체 Fab 라이브러리를 얻었다. 라이브러리를 스크리닝하여 비탁신을 단리하였다. 인간 프레임워크 서열을 포함하는 이식 항체로서, 비탁신은 숙주 면역 반응을 일으킬 수 있을 것 같지 않으며, 따라서 αvβ3매개성 질병을 치료하는데 사용하기에 유리할 수 있다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체 LM609" 또는 "LM609"라는 용어는 문헌[ Cheresh, D.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6471-6475 (1987); 및 Cheresh 및 Spiro, J. Biol. Chem. 262:17703-17711 (1987)]에 기술된 인테그린 αvβ3에 대해 특이적인 쥐과 모노클로날 항체를 의미하는 것으로 의도된다. LM609는 현재 인테그린 αvβ3로 알려진 M21 세포 부착 수용체에 대한 항체로서 제조되었으며 반응성이다. LM609는 비트로넥틴, 피브리노겐 및 폰 빌브란트 인자와 같은 αvβ3리간드에 M21 세포가 부착하는 것을 억제하고 (Cheresh and Spiro, 상기 문헌), 또한 종양 유도성 혈관생성 (Brooks et al. Cell 79;1157-1164 (1994)), 피부 상처 중의 과립화 조직의 발생 (Clark et al., Am. J. Pathology, 148:1407-1421 (1996)) 및 재협착 도중에 발생하는 것과 같은 평활근 세포 이동 (Choi et al., J. Vascular Surg., 19:125-134 (1994); Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:2482-2487 (1996))과 같은 αvβ3매개성 병태의 억제제이다.
본원에서 사용된, "비탁신"이라는 용어는 LM609에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 H 사슬 및 L 사슬 CDR 아미노산 서열을 갖는 비쥐과 항체 또는 이의 기능적 단편을 지칭하는 것이 의도된다. H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 "비탁신"이라는 용어는 각각 LM609의 H 사슬 또는 L 사슬에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 H 사슬 또는 L 사슬 CDR 아미노산 서열을 갖는 비쥐과 H 사슬 또는 L 사슬, 또는 이의 기능적 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. 기능적 단편과 관련하여 사용될 때, 모든 LM609 CDR이 표현될 필요는 없다. 대신, 기능적 단편에 상응하는 항체 부분에 정상적으로 존재할 수 있는 CDRs만이 비탁신 기능적 단편의 LM609 CDR 아미노산 서열로 지칭되는 것이 의도된다. 유사하게, 코딩 핵산과 관련하여 사용되는 용어 "비탁신"은 H 사슬 및 L 사슬 CDR 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 비쥐과의 항체 또는 기능적 단편을 코딩하고, LM609에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 CDR 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된, 용어 "LM609 이식 항체"는 LM609에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 H 사슬 및 L 사슬 CDR 아미노산 서열을 갖고, 카바트(Kabat) 등의 문헌[U.S. Dept, of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에서 규정된 바와 같은 CDRs 이외에서는 LM609 아미노산 잔기의 치환이 없는 비쥐과 항체 또는 기능적 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 용어 "LM609 이식 항체" 또는 "LM609 이식"은 각각 LM609의 H 사슬 또는 L 사슬에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 H 사슬 또는 L 사슬 CDR 아미노산 서열을 갖고, 카바트 등의 상기문헌에서 규정된 바와 같은 CDRs 이외에서는 LM609 잔기의 치환이 없는 비쥐과 H 사슬 또는 L 사슬, 또는 이의 기능적 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. 기능적 단편과 관련하여 사용될 때, 모든 LM609 CDRs가 표현될 필요는 없다. 대신에, 기능적 단편에 상응하는 항체 부분에 통상적으로 존재할 수 있는 CDRs 만이 LM609 이식 기능적 단편의 LM609 CDR 아미노산 서열로 지칭되는 것이 의도된다. 유사하게, 코딩 핵산과 관련하여 사용되는 용어 "LM609 이식 항체" 또는 "LM609 이식"은 카바트 등의 상기 문헌에 규정된 바와 같은 CDRs 이외에서는 LM609 아미노산의 치환이 없는 비쥐과 항체 또는 기능적 단편을 코딩하고, H 사슬 및 L 사슬 CDR 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지며, LM609에서 발견되고, 카바트 등의 상기 문헌에서 규정한 바와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다.
H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 관련하여 사용될 때, 용어 "이식 항체" 또는 "이식"은 각각 공여체 항체와 실질적으로 동일한 H 사슬 또는 L 사슬 CDR을 갖고, 또한 카바트 등의 상기 문헌에 규정된 바와 같은 CDRs 이외에서는 공여체 아미노산 잔기의 치환이 없는 H 사슬 또는 L 사슬, 또는 이의 기능적 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. 기능적 단편과 관련하여 사용될 때, 모든 공여체 CDRs가 표현될 필요는 없다. 대신에, 기능적 단편에 상응하는 항체 부분에 통상적으로 존재할 수 있는 CDRs 만이 기능적 단편의 공여체 CDR 아미노산 서열로 지칭되는 것으로 의도된다. 유사하게, 코딩하는 핵산과 관련하여 사용될 때의 용어 "이식 항체" 또는 "이식"은 카바트 등의 상기 문헌에 규정된 바와 같은CDRs 이외에서는 공여체 아미노산의 치환이 없는 항체 도는 기능적 단편을 코딩하고, H 사슬 및 L 사슬 CDR 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고, 공여체 항체에서 발견되는 카바트 등의 상기 문헌에 규정된 바와 같은 실질적으로 동일한 CDR 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하는 것으로 의도된다.
상기 용어들의 의미는 그 기능이 손상되지 않고 남아있는 한, 항체의 사소한 변이 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다. Fab, F(ab)2, Fv, 단일사슬 Fv (scFv) 등과 같은 기능적 단편은 유사하게 용어 LM609 및 비탁신의 정의 내에 포함된다. 이러한 기능적 단편은 당업자들에게 공지되어 있다. 따라서, LM609 또는 비탁신 항체의 기능적 단편을 기술하는데 이들 용어를 사용하는 것은 당업자들에게 공지된 정의에 상응하는 것으로 의도된다. 이러한 용어들은 예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) 및 Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)]에 기술되어 있다.
LM609, 비탁신 및 LM609 이식 항체의 기능적 단편을 기술하기 위해 사용되는 상기 용어들과 마찬가지로, 다른 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체 도메인, 기능적 단편, 영역, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 및 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭하는 용어를 사용하는 것은 유사하게 당업계에 알려져 있고 사용되는 각 용어의 의미의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 용어들은, 예를 들면 "H 사슬 폴리펩티드" 또는 "H 사슬", "L 사슬 폴리펩티드" 또는 "L 사슬". "H 사슬 가변 영역" (VH) 및 "L 사슬 가변 영역" (VL) 뿐만 아니라 "상보성 결정 부위"를 포함한다.
용어의 정의가 2 가지 이상 당업계에서 사용되고(사용되거나) 허용되는 경우, 본원에서 사용된 용어는 달리 명시적으로 지시하지 않는 한 이러한 모든 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 구체적 예는 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접성 항원 결합 부위를 기술하는데 용어 "CDR"을 사용하는 것이다. 이 특정 구역은 카바트 등의 상기 문헌, 코티아(Chothia) 등의 문헌[J.Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 및 맥칼럼(MacCallum) 등의 문헌[J.Mol.Biol. 262:732-745 (1996)]에 기술되어 있고, 서로 비교하였을 때 그 의미는 아미노산 잔기의 오버래핑 또는 아집단을 포함한다. 그럼에도 불구하고, LM609, 비탁신, LM609 이식 항체 또는 그 변이체의 CDR과 관련하여 각 정의를 적용하는 것은 본원에서 정의하고 사용하는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 참고 문헌 각각에 정의된 CDRs를 포함하는 아미노산 잔기가 비교용으로 하기 표 1에 제시된다.
CDR 정의
카바트1 코티아2 맥칼럼3
VHCDR1 31-35 26-32 30-35
VHCDR2 50-65 53-55 47-58
VHCDR3 95-102 96-101 93-101
VLCDR1 24-34 26-32 30-36
VLCDR2 50-56 50-52 46-55
VLCDR3 89-97 91-96 89-96
1잔기의 넘버링은 카바트 등의 상기 문헌의 명명법에 따름.
2잔기의 넘버링은 코티아 등의 상기 문헌의 명명법에 따름.
3잔기의 넘버링은 맥칼럼 등의 상기 문헌의 명명법에 따름.
본원에서 사용된, 용어 "실질적으로" 또는 "실질적으로 동일한"은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 참고 서열과 비교할 때 상당한 정도, 양 또는 범위의 서열 동일성을 나타내는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 또한, 이러한 상당한 정도, 양 또는 범위의 서열 동일성은 중요하고 의미가 있는 것으로 여겨지고, 따라서 명확하게 인식되거나 알려진 특성을 나타낸다. 따라서, 그 단편을 포함하여 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체의 H 사슬 또는 L 사슬와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열인 뉴클레오티드 서열은 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체를 코딩하거나, 또는 이들의 아미노산 서열인 것으로 명확하게 알려졌거나 또는 인식가능한 특성을 나타내는 서열을 지칭한다. 유사하게, 비탁신, LM609 이식 항체의 H 사슬 또는 L 사슬, 또는 이의 기능적 단편과 실질적으로 동일한 아미노산 서열인 아미노산 서열은 비탁신 또는LM609 이식 항체 및 이에 대한 사소한 변형의 아미노산 서열을 나타내는 것으로 명확히 알려졌거나 인식가능한 특성 및 이에 대한 사소한 변형을 나타내는 서열을 지칭한다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비탁신 또는 LM609 이식 항체와 실질적으로 동일한 것인지를 결정할 때, 비탁신 또는 LM609 이식 항체에 대한 변화 갯수 뿐만 아니라 기능이 유지되는지를 고려한다. 예를 들면, 3 개의 아미노산으로 된 CDR에서 단일 아미노산 변화, 또는 16 개의 아미노산으로 된 CDR에서의 수개의 변화는 αvβ3결합 기능이 유지된다면, 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 따라서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 이것이 비탁신 또는 LM609 이식 항체 또는 이의 사소한 변형의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 나타내는 것으로 명확히 알려졌거나 인식가능한 특성을 나타낸다면, 비탁신 또는 LM609 이식 항체 기능이 유지되는 한 실질적으로 동일하다.
본원에서 사용된, 용어 "단편"은 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산과 관련하여 사용될 때 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산의 일부와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 핵산을 의미하는 것으로 의도된다. 핵산 단편은 길이 및 서열이 충분하여 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산, 또는 LM609, 비탁신 또는 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 하이브리드화된다. 따라서, 단편은 서열분석 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)용의 프라이머 뿐만 아니라 핵산 블롯 또는 용액하이브리드화 용의 탐침을 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어의 의미는 또한 LM609 코딩 유전자의 인트론 및 비해독 영역 서열과 같이 LM609 폴리펩티드를 직접 코딩하지 않는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된, 용어인 "기능적 단편"은 비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때 αvβ3결합 활성, αvβ3결합 특이성 및(또는) 인테그린 αvβ3억제 활성을 일부 또는 모두 유지하는 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드를 포함하여 비탁신 또는 LM609 이식 항체의 일부를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 기능적 단편은 예를 들면, Fab, F(ab)2, Fv, 단일사슬 Fv (scFV)와 같은 항체 기능적 단편을 포함할 수 있다. 다른 기능적 단편은 예를 들면, 이러한 기능적 단편이 결합 활성, 특이성 또는 억제 활성을 유지하는 한, H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드, 가변 영역 폴리펩티드 또는 CDR 폴리펩티드 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 폴리펩티드들이 상기 규정한 바와 같은 기능적 활성을 유지하는 한, 예를 들면, D-입체이성질체와 같은 자연발생 아미노산의 변형된 형태, 자연 발생하지 않는 아미노산, 아미노산 유사체 및 모방제를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된, 용어 "증강된"은 비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편과 관련하여 사용될 때 항체의 기능적 특성이 항체가 바람직한 성질 또는 활성을 나타낼 수 있도록 참고 항체와 비교하여 변화 또는 증대되었음을 의미하는 것으로 의도된다. 증강된 활성을 나타내는 항체는 예를 들면, 참고 항체와 비교하여 높은 친화도 또는 낮은 친화도 결합, 또는 증가 또는 감소된 결합 또는 해리 속도를 나타낼 수 있다. 증강된 활성을 나타내는 항체는 또한 특정 유기체 중에서 반감기의 증가와 같이 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 단백분해에 대한 민감성을 감소시키는 것에 의해 항체 활성이 증강되어 안정도가 증가될 수 있다. 고친화도 결합 또는 안정도의 증가와 같은 증강된 활성이 바람직하다면, 돌연변이를 프레임워크 또는 CDR 아미노산 잔기에 도입하고, 얻은 항체 변이체를 LM609 이식 부모 항체와 같은 참고 항체에 비하여 αvβ3에 대한 고친화도 결합, 또는 안정도 증가를 갖는지에 대해 스크리닝할 수 있다. 증강된 활성을 나타내는 항체는 또한 바람직하다면 감소된 결합 속도 또는 증가된 해리 속도를 포함하는 낮은 친화도 결합을 나타낼 수 있다. 낮은 친화도 결합을 나타내는 증강된 항체는 예를 들면, 고형 종양을 투과시키는데 유용하다. 고친화도로 인하여 종양의 주변 영역에 결합하나, 종양의 내부 영역으로 투과할 수 없는 고친화도 항체와는 대조적으로, 저친화도 항체는 종양의 내부 영역을 투과하는데 잇점이 있을 수 있다.
본 발명은 비탁신 또는 이의 기능적 단편의 H 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 비탁신 또는 이의 기능적 단편의 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 도 1A 및 1B (각각 서열 확인 번호 1 및 3)에서 나타낸 바와 실질적으로 동일한 H 사슬 또는 L 사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편으로 이루어진다.
비탁신 (이의 기능적 단편을 포함함)은 LM609와 실질적으로 동일한 결합 활성, 결합 특이성 및 억제 활성을 나타내는 비쥐과 항체이다. 비탁신 Fv 단편은 인간 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드 내의 CDRs를 LM609 유래의 CDRs로 기능적으로 대체하는 것에 의해 제조되었다. CDRs의 기능적 대체는 당업자들에게 공지된 재조합법에 의해 수행하였다. 상기 방법은 통상적으로 CDR 이식으로 지칭되고, 미국 특허 제5,225,539호의 주요 내용이다. 상기 방법은 또한 문헌["Protein Engineering of Antibody Molecules for Propylactic and Therapeutic Applications in Man," Clark, M. (ed.), Nottingham, England: Academic Titles (1993)]에 기술되어 있음을 발견할 수 있다.
간단하게, 각각의 H 사슬 및 L 사슬 CDRs와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드를 가지고, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 LM609 핵산 단편을 합성하였고, 각각 인간 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 핵산내로 치환시켰다. 신규 유도된 비탁신 항체의 기능을 유지하기 위하여, CDR 이외에서의 프레임워크 영역 내에 변형을 수행하였다. CDRs 이외에서의 모든 가능한 변화를 나타내는 CDR 이식 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역의 집단을 생성시키고, 이어서 결합 활성에 대해 집단을 스크리닝하여 적합한 항체를 선택하는 것에 의해 이러한 개별적 변화를 일으켰다. 본 스크리닝으로 본원에 기술된 비탁신 항체가 선택되었다.
비탁신 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 각각 도 1A 및 1B에 나타내었다. 이들 서열은 실질적으로 비탁신의 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드를 코딩하는 것에 상응한다. 이들 비탁신 핵산은 비탁신 코딩 서열의 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 단일 및 이중 가닥 핵산 뿐만 아니라 예를 들면 유전자의 인트론, 5'- 및 3'-비해독 영역 및 조절 서열과 같은 핵산의 비코딩 부분이 포함된다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, 비탁신 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드는 가변 영역의 아미노 말단 Gln1 잔기에서 시작하여 Ser117까지인 길이가 약 351개 뉴클레오티드인 핵산에 의해 코딩된다. 상기 비탁신 H 사슬 가변 영역을 코딩하는 핵산은 인간 IgG1 불변 영역에 연결되어 총 477 개 아미노산의 H 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 1431개 뉴클레오티드로 된 코딩 영역을 만든다. 도 1B에 나타낸 것은 가변 영역의 아미노 말단 Glu1 잔기에서 시작하여 Lys107까지인 길이가 약 321 개 뉴클레오티드인 핵산에 의해 코딩되는 비탁신 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드이다. 이 비탁신 L 사슬 가변 영역 핵산은 인간 카파 구조 영역에 연결되어 총 214 개 아미노산의 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 642개 뉴클레오티드로 된 코딩 영역을 만든다.
이들 뉴클레오티드 서열에 대한 사소한 변형은 H 사슬 및 L 사슬 비탁신을 코딩하는 핵산 및 이들의 기능적 단편으로서 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 사소한 변형은 예를 들면, 유전 코드의 변성(degeneracy)으로 인하여 코딩되는 아미노산 서열을 변화시키지 않는 것 뿐만 아니라 코딩되는 아미노산 서열의 보존적 치환만을 일으키는 것을 포함한다. 코딩되는 아미노산 서열의 보존적 치환은 예를 들면 다음의 그룹에 속하는 아미노산들을 포함한다: (1) 비극성 아미노산 (Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile); (2) 극성 중성 아미노산 (Cys, Met, Ser, Thr, Asn 및 Gln); (3) 극성 산성 아미노산 (Asp 및 Glu); (4) 극성 염기성 아미노산 (Lys, Arg및 His); 및 (5) 방향족 아미노산 (Phe, Trp, Tyr, 및 His). 다른 사소한 변형은 핵산 또는 코딩되는 폴리펩티드가 본원에서 기술한 기능을 일부 또는 모두 유지하는 한 비탁신 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내에 포함된다.
따라서, 본 발명은 또한 도 1A (서열 확인 번호 2)에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 비탁신의 H 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 비탁신 H 사슬, 또는 이의 기능적 단편 코딩 핵산 또는 이의 단편을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 도 1B (서열 확인 번호 4)에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 비탁신의 L 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 비탁신 L 사슬 또는 이의 기능적 단편 코딩 핵산 또는 이의 단편을 제공한다.
아미노산의 보존적 치환 외에도, 아미노산의 기능적 대체를 허용하는 비탁신 코딩 뉴클레오티드 서열의 사소한 변형도 또한 이 용어의 정의 내에 포함되는 것으로 의도된다. 비탁신 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 기능적으로 동등한 아미노산의 치환은 통상적인 것이고, 당업자들에게 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 간단하게, 기능적으로 동등한 아미노산의 치환은 변화시키고자 하는 아미노산을 동정하고, 코딩 핵산내로 변화를 도입하고, 이어서 재조합적으로 발현되고 변형된 비탁신 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 작용을 확인하는 것에 의해 할 수 있다. 다수의 동시적 변화를 일으키고 스크리닝하는 신속한 방법은 당업게에 공지되어 있고, 이를 이용하여 모든 가능한 또는 모든 바람직한 변화를 함유하는 코딩 핵산의 라이브러리를 제조하고, 이를 발현시키며, 상기 라이브러리를 기능을 유지하는 비탁신 폴리펩티드에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 방법은 예를 들면, 코돈에 기초한 돌연변이발생, 무작위 올리고뉴클레오티드 합성 및 부분 변성 올리고뉴클레오티드 합성을 포함한다.
코돈에 기초한 돌연변이발생은 미국 특허 제5,264,563호 및 제5,523,388호의 주요 내용이고, 이는 올리고뉴클레오티드 내의 임의적이고 모든 특정 코돈 위치에 코딩되는 아미노산 잔기를 실질적으로 임의적이고 모든 바람직한 빈도로 생성할 수 있으므로 상기 방법에 대해 잇점이 있다. 이러한 바람직한 빈도는 예를 들면, 20 가지 아미노산 모두 또는 이의 특정 아군의 진짜 무작위 도입 뿐만 아니라 다른 도입된 아미노산 잔기와 비교하여 높거나 낮은 빈도로 바이어스된 잔기를 도입하기 위한 1 이상의 특정 아미노산의 예정된 바이어스의 도입을 포함한다. 무작위 올리고뉴클레오티드 합성 및 부분 변성 올리고뉴클레오티드 합성은 유사하게 기능적으로 동등한 아미노산 변화를 생성하고 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 그러나, 유전 코드의 변성으로 인하여, 상기 방법은 바람직한 아미노산 위치에 유전자중복(redendancy)을 도입할 수 있다. 무작위 올리고뉴클레오티드 합성은 코돈 내에서 4 개의 뉴클레오티드 모두를 커플링하는 것인 반면, 부분 변성 올리고뉴클레오티드 합성은 예를 들면 처음 2 개의 뉴클레오티드 위치에 동일 비율의 4 개의 뉴클레오티드, 모두를 세번째 위치에 동일 비율의 2개의 뉴클레오티드를 커플링하는 것이다. 후술된 이들 합성법은 모두 예를 들면, 문헌[Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382, (1990) 및 Devlin et al., Science 249:404-406, (1990)]에 기술되어 있음을 발견할 수 있다.
변화시킬 아미노산의 동정은 항체의 구조 및 기능에 관한 현재 입수가능한정보 뿐만 아니라 CDR 이식 방법을 포함하는 현재 입수가능한 정보를 이용하여 당업자가 수행할 수 있다. 예를 들면, CDRs는 카바트 등의 상기 문헌, 코티아 등의 상기 문헌 및(또는) 맥칼럼 등의 상기 문헌에 명시된 임의의 또는 모든 기준에 의해 공여체 항체 내에서 동정될 수 있고, 이들 CDR 서열 외의 임의의 또는 모든 동일하지 않은 아미노산 잔기는 기능적으로 동등한 아미노산으로 변화될 수 있다. 상기 기술한 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 임의의 또는 모든 동일하지 않은 아미노산을 단독으로 또는 상이한 위치의 아미노산과 함께 변화시켜 각각의 원하는 위치에 원하는 갯수의 아미노산 치환을 도입할 수 있다. 이어서, 목적하는 치환된 아미노산을 포함하는 비탁신 폴리펩티드를 제조하고, 비치환 비탁신 폴리펩티드와 비교하여 기능이 유지 또는 증대되었는지를 스크리닝할 수 있다. 치환 비탁신 폴리펩티드의 제조는 예를 들면, 당업자들에게 공지된 방법을 사용하여 재조합 발현에 의해 수행될 수 있다. 비치환 비탁신과 비교하여 기능이 유지 또는 증대됨을 나타내는 비탁신 폴리펩티드는 1 이상의 아미노산의 기능적 대체를 가져오는 코딩 뉴클레오티드 서열의 사소한 변형을 포함하는 것으로 여겨진다.
아미노산의 기능적 대체는 공여체로부터 결합 기능을 성공적으로 전달하기 위해 어떤 아미노산이 치환되도록 고려되어야 하는지를 평가 및 확인하기 위해 필요한 구조적 정보 또는 힘겨운 방법을 요구함이 없이 동등한 아미노산 잔기를 신속하게 확인할 수 있도록 해주기 때문에 인간 프레임워크 서열을 갖는 이식 항체를 제조할 때 잇점이 있다. 게다가, 이는 치환용으로 동정된 아미노산을 변화 및 시험하는 현실적인 단계적 방법을 제거하여 준다. 본질적으로, 상기에 기술된 기능적 대체 접근법을 사용하여, 공여체 및 인간 프레임 사이의 모든 동일하지 않은 아미노산 잔기를 확인하고, 각각의 동일하지 않은 위치에서 임의의 또는 모든 다른 가능한 아미노산으로 치환하여 모든 가능한 또는 모든 바람직한 순열 및 조합을 포함하는 치환된 폴리펩티드의 집단을 제조할 수 있다. 이어서, 치환된 폴리펩티드의 집단을 기능을 유지하는 치환된 폴리펩티드에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 기술한 코돈에 기초한 돌연변이발생 방법을 사용하여, 치환된 아미노산 잔기의 라이브러리 생성 및 기능적으로 대체된 잔기의 스크리닝은 이식된 치료 항체의 신속한 제조 뿐만 아니라 항체 친화도의 신속한 변경을 위해 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, 각각 문헌[Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996), 및 Glaser et al., J. Immunol. 149:3903-3913 (1992)]에 예시되어 있다.
프레임워크 잔기 외에도, 1 이상의 CDRs 중의 아미노산을 기능적으로 대체하여 증강된 활성을 갖는 변형된 LM609 이식 항체를 동정하게 할 수 있다. 골격 잔기에 대하여 상기 기술된 방법을 사용하여, 아미노산 치환을 LM609 이식 항체 중의 1 이상의 CDRs 내로 유사하게 도입시킬 수 있다. 변형된 LM609 이식 항체를 결합 활성에 대하여 시험하여 αvβ3결합 활성이 유지되는지를 측정할 수 있다. 변형된 LM609 이식 항체를 더 시험하여 활성이 증강되었는지를 측정할 수 있다. 따라서, 1 이상의 CDRs 중의 아미노산 잔기의 기능적 대체는 따라서 증강된 활성과 같은 원하는 성질을 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 동정할 수 있게 한다.
변형된 LM609 이식 항체를 생성하고, 증강된 활성을 갖는 것을 선택하기 위해서, 돌연변이시킬 CDR 내의 잔기의 수 뿐만 아니라 변형시킬 LM609 이식 항체 내의 CDRs의 수를 선택하는데 다수의 접근법을 적용할 수 있다. CDRs의 돌연변이발생을 위한 선택 기준의 선정은 증강된 항체의 필요 및 바라는 응용에 의존할 수 있다. 예를 들면, 단일 CDR 내의 한 개 또는 수 개의 아미노산 위치를 변형시켜 선택한 아미노산을 이 위치에 포함되도록 할 수 있다. 별법으로, 표적 아미노산 위치를 변형시켜 모든 가능한 아미노산을 이 위치에 포함되도록 할 수 있다. 이어서, 얻은 변형된 항체의 집단은 증강된 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
또한 한 CDR 내의 모든 아미노산 위치를 돌연변이시켜 모든 가능한 아미노산을 포함하는 변형된 LM609 이식 항체 집단, 및 다수 CDRs 내의 아미노산 위치를 변형시켜 변이체 아미노산 잔기를 포함하는 변형된 LM609 이식 항체 집단을 구성할 수 있다. 이 방법에서, 2 내지 >107의 독특한 멤버로 된 집단들을 구성할 수 있다. 집단이 클 수록, 집단 내에 더 많은 수의 상이한 항체가 있을 수 있기 때문에 증강된 LM609 이식 항체의 선택이 더욱 효율적일 수 있다. 그러나, 작은 집단의 변형된 LM609 이식 항체를 만들어서, 증강된 LM609 이식 항체의 선택을 위해 성공적으로 사용할 수도 있다. 변형된 LM609 이식 항체의 집단의 크기는 특정 응용시 필요에 의존할 수 있고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
변형된 LM609 이식 항체의 생성은 LM609 이식 항체의 1 이상의 CDRs로 아미노산 치환을 도입하는 것에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 단일 아미노산 치환은 CDR 중의 주어진 한 아미노산을 임의의 또는 모든 아미노산으로 변화시키는 것에 의해 CDR 내로 계획적으로 도입할 수 있다. 또한, 1 이상의 CDRs 또는 모든 CDRs 중의 모든 아미노산 위치로 아미노산 치환을 도입하여 변형된 LM609 이식 항체 변이체의 집단을 생성할 수 있다. 이러한 단일 아미노산 치환을 갖는 변형된 LM609 이식 항체 변이체의 집단을 스크리닝하여 αvβ3결합 활성을 유지하는 변이체를 동정할 수 있다. αvβ3결합 활성을 갖는 변이체를 더 특성화하여 증강된 활성을 갖는 변이체를 동정할 수 있다. 단일 아미노산 치환을 도입하고, LM609 이식 항체 변이체의 집단을 생성하여 αvβ3에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 스크리닝하는 계획적 접근법은 실시예 VI에 기술되어 있다.
변형된 LM609 이식 항체 변이체의 집단을 생성시키는 것 이외에, 특정 CDR, 또는 CDR 중의 특정 아미노산을 선택하여 1 이상의 아미노산 치환을 도입할 수 있다. 예를 들면, 서열 동일성 또는 구조 모델을 사용하여 특정 아미노산 위치를 동정하여 아미노산 치환을 도입할 수 있다. 이러한 예에서는, 한 개 또는 수 개의 변형된 LM609 이식 항체 변이체만을 생성하고 αvβ3에 대한 결합 활성을 스크리닝한다. 당업자들은 증강된 활성을 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 스크리닝 및 동정하기 위해 큰 집단의 변형된 LM609 이식 항체 변이체를 생성하는 것이 바람직한지, 아니면 제한된 수의 변형된 LM609 이식 항체 변이체를 생성하는 것이 바람직한지를 알 수 있거나, 결정할 수 있다.
CDR에 단일 아미노산 치환을 갖는 변형된 LM609 이식 항체 집단을 생성하고 증강된 활성에 대해 스크리닝 하는 것에 의하여 증강된 LM609 이식 항체를 동정하는 것 이외에, 증강된 LM609 이식 항체 변이체는 또한 각각 독립적으로 증강된 활성을 생기게 하는 것으로 알려진 2 이상의 돌연변이를 하나의 항체 내로 조합하여 생성시킬 수 있다. 돌연변이가 2 개보다 많을 때, 활성을 더 증강시키는 돌연변이의 조합을 동정하는 효율적인 방법은 모든 가능한 조합 및 순열을 구성하고, 이어서 증강된 활성을 갖는 것에 대해 스크리닝하는 것이다. 예를 들면, 1 이상의 CDRs 중에 2 개의 단일 돌연변이를 조합하여 2 개의 CDR 돌연변이를 갖는 신규 변형된 LM609 이식 항체를 생성하고, 스크리닝하여 αvβ3결합 활성이 단일 돌연변이체의 경우보다 증가되었는지를 측정할 수 있다. 유사하게, 3 개의 돌연변이를 조합하고, 얻은 변형된 LM609 이식 항체를 증강된 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. CDR 돌연변이를 조합하는 이러한 접근법을 사용하여, 증강된 활성을 생기게 하는 단일 CDR 돌연변이의 모든 조합을 신규 변형된 LM609 이식 항체 변이체 내로 도입하고, 스크리닝하여 최적화된 증강된 LM609 이식 항체를 얻음으로써 변형된 LM609 이식 항체 변이체의 신규 집단을 생성시킬 수 있다.
증강된 LM609 이식 항체를 동정하기 위한 반복적 단계적 접근법은, 이러한 방법이 다수의 변형된 LM609 이식 항체 변이체를 생성시키고 스크리닝할 필요 없이 최적 결합 활성을 갖는 항체를 동정할 수 있게 한다는데 잇점이 있다. 예를 들면, 단일 돌연변이체를 동정하고, LM609 이식 항체 변이체의 신규 집단으로 조합하는 실시예 VI 및 VII에 기술된 접근법을 사용하여, 2592 개의 독특한 변이체를 생성시킴으로써 더 높은 친화도를 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 동정하였다. 반대로,8개 아미노산 잔기의 단일 CDR의 완전 무작위화는 >1010의 독특한 변이체를 필요로 할 수 있다. 따라서, 이러한 반복적 접근법은 상대적으로 소수의 독특한 변형된 LM609 이식 항체 변이체를 생성시키고, 스크리닝하여, 고친화도 결합을 나타내는 이러한 증강된 LM609 이식 항체 변이체를 동정하는 것에 의해 고친화도 결합과 같은 증강된 활성을 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 동정할 수 있게 한다.
증강된 LM609 변이체를 동정하기 위한 반복적 단계적 접근법은 또한 추가 단계를 사용하여 수행할 수 있다. 단일 아미노산 돌연변이의 모든 조합을 생성시키는 대신에, 단일 아미노산 돌연변이를 2 개를 한 쌍으로 조합하여 이중 돌연변이체의 모든 조합을 생성하고, 활성을 스크리닝할 수 있다. 이러한 증강된 활성을 갖는 이중 돌연변이체는 임의의 또는 모든 단일 돌연변이체와 조합하여 3중 돌연변이체를 생성하고, 이것을 증강된 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 변형된 LM609 이식 항체 변이체를 생성하는 반복되는 각 라운드는 추가의 단일 돌연변이를 도입할 수 있고, 얻은 변형된 LM609 이식 항체를 증강된 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 따라서, LM609 이식 항체의 단계적 생성법을 사용하여 최적 LM609 이식 항체를 동정할 수 있다. 추가로, 이러한 반복적 접근법은 또한 일정 범위의 상이한 증강된 결합 활성을 나타내는 많은 증강된 항체를 동정할 수 있게 한다.
최적화 LM609 이식 항체는 또한 LM609형 이식 항체 또는 αvβ3특이적 이식 항체로 지칭될 수 있고, 그 항체 또는 그의 기능적 단편이 LM609의 기능적 특성을 유지하기 때문에 인식가능하다. 예를 들면, 아미노산 치환을 가지며 증강된 활성을 갖는 증강된 LM609 이식 항체 변이체를 동정하고 특정 아미노산 치환과 관련시킬 수 있다. 이들 아미노산 치환을 조합하여 신규 변형된 LM609 이식 항체를 생성할 수 있고, 이것은 활성에 대해 시험할 수 있다. 유리한 CDR 아미노산 치환의 이러한 조합은 1 이상의 아미노산 치환을 갖는 다수 CDR 또는 다수의 아미노산 치환을 갖는 단일 CDR을 갖는 최적 LM609 이식 항체를 생기게 할 수 있으며, 이 변형된 LM609 이식 항체는 증강된 활성을 갖는다.
증강된 LM609 이식 항체, 특히 CDRs 중의 아미노산 잔기의 기능적 대체에 의해 최적화된 증강된 LM609 이식 항체는 증가된 친화도와 같은 요망되는 증강된 성질을 갖는다. 예를 들면, 친화도가 증가된 최적화 LM609 이식 항체는 아미노산의 기능적 대체를 도입하는데 사용된 부모 항체보다 더 높은 친화도를 가질 수 있다. 높은 친화도는 유사한 구조를 갖는 참고 항체와 비교하여 측정된다. 예를 들면, 최적화 LM609 이식 항체가 2 개의 H 사슬 및 2 개의 L 사슬을 포함하는 완전한 항체라면, 높은 친화도는 완전한 부모 LM609 이식 항체와 비교하여 측정된다. 유사하게, 최적화 LM609 이식 항체가 Fab라면, 높은 친화도는 부모 LM609 이식 항체의 Fab와 비교하여 측정된다.
고친화도 LM609 이식 항체를 얻기 위해 다수의 최적화 단계를 거치는 것이 필수적인 것은 아닐지라도, 일반적으로 친화도의 증가는 CDRs 내 및 CDRs 간의 변형 갯수 뿐만 아니라 최적화 단계의 수와도 관련이 있을 수 있다. 따라서, LM609 이식 항체는 여러 범위를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 친화도가 증강된 LM609 이식 항체는 참고 항체보다 약 2 배 이하 또는 그 이상의 더 높은 친화도, 일반적으로 약 2 내지 5 배 이상 높은 친화도, 예를 들면 약 4 내지 5 배 이상 높은 친화도, 또는 약 5 내지 10 배 이상 높은 친화도를 가질 수 있다. 특히, 친화도가 증강된 LM609 이식 항체는 참고 항체보다 약 10 내지 50 배 이상 높은 친화도, 약 50 배 이상 높은 친화도, 또는 약 100 배 이상 높은 친화도를 가질 수 있다.
상기에 기술한 바와 같이, CDR 아미노산 잔기의 기능적 대체를 사용하여 부모 LM609 이식 항체보다 높은 친화도를 나타내는 LM609 이식 항체를 동정할 수 있다. 마찬가지로, 코돈에 기초한 돌연변이발생, 무작위 올리고뉴클레오티드 합성 및 부분 변성 올리고뉴클레오티드 합성을 포함하는, 비탁신 또는 LM609 이식 항체 코딩 뉴클레오티드 서열 내로 사소한 변형을 도입하기 위한 상기 또는 하기에 기술한 방법을 사용하여 변형된 LM609 이식 항체 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들면, 코돈에 기초한 돌연변이발생을 사용하여 단일 아미노산 치환을 갖는 이러한 변형된 LM609 이식 항체 변이체의 라이브러리를 생성시킬 수 있다 (실시예 VI 참조).
변형된 LM609 이식 항체 변이체의 라이브러리를 생성시킨 후, 변이체를 발현시키고, αvβ3에 대한 결합 활성을 스크리닝할 수 있다. 항체-항원 상호작용을 측정하는 것에 관한 당업자들에게 공지된 방법을 사용하여 αvβ3에 대한 결합 활성을 나타내는 변형된 LM609 이식 항체를 스크리닝할 수 있다 (Harlow 및 Lane, 상기 문헌). 예를 들면, ELISA법을 사용하여 변형된 LM609 이식 항체 변이체의 라이브러리를 스크리닝하여 αvβ3결합 활성을 유지하는 변이체를 동정한다 (실시예VI 참조). αvβ3결합 활성을 유지하는 변형된 LM609 이식 항체만이 추가 특성화가 고려된다.
αvβ3결합 활성을 갖는 변형된 LM609 이식 항체를 추가 특성화하여 어떤 변형된 LM609 이식 항체가 증강된 활성을 갖는지를 측정할 수 있다. 증강된 활성을 평가하기 위해 사용되는 검정의 유형은 특정한 요구되는 특성에 의존한다. 예를 들면, 결합 활성이 바뀌는 것이 요구되면, 결합 친화도를 측정할 수 있는 결합 검정이 사용된다. 이러한 검정은 결합 검정, 경쟁 결합 검정 및 표면 플라스몬(plasmon) 공명 (실시예 VI에 기술됨)을 포함한다.
LM609 이식 항체의 CDRs 내로 단일 아미노산 치환을 도입하는 것을 사용하여 변형된 LM609 이식 항체의 라이브러리를 생성하고, αvβ3에 대한 결합 활성을 스크리닝할 수 있다. 이어서, αvβ3에 대한 결합 활성을 나타내는 상기 변형된 LM609 이식 항체를 추가 특성화하여 높은 결합 친화도와 같은 증강된 활성을 나타내는 증강된 LM609 이식 항체를 동정할 수 있다. 예를 들면, 이러한 접근법을 사용하여 도 1A에 도시한 H 사슬 가변 영역 (서열 확인 번호 2) 및 도 7에 도시한 L 사슬 가변 영역 (서열 확인 번호 32)을 사용하여 단일 아미노산 치환을 갖는 다수의 증강된 LM609 이식 항체를 생성시켰고, 부모 LM609 이식 항체보다 2 내지 13 배 개선된 친화도를 나타내는 LM609 이식 항체를 확인하였다 (실시예 VI 참조).
하나의 단일 아미노산 치환을 갖는 증강된 LM609 이식 항체의 동정에 이어서, 아미노산 돌연변이를 조합하여 추가로 활성을 증강시킬 수 있다. CDRs로 단일아미노산 치환을 도입하기 위한 상기 논의한 방법은 유사하게 아미노산 치환을 조합하는데 적용될 수 있다. 예를 들면, 증강된 αvβ3결합 친화도를 생기게 하는 아미노산 돌연변이의 조합적 라이브러리는 실시예 VII에 기술된 대로 변성 올리고뉴클레오티드 및 두 자리 혼성화 돌연변이를 사용하여 생성하였다. 다수의 CDR 아미노산 치환을 포함하는 증강된 LM609 이식 항체는 도 1A에 도시한 H 사슬 가변 영역 (서열 확인 번호 2) 및 도 7에 도시한 L 사슬 가변 영역 (서열 확인 번호 32)를 사용하여 생성하였, 부모 LM609 이식 항체보다 20 배 높은 친화도 내지 90 배 이상 높은 친화도를 갖는 LM609 이식 항체가 확인되었다.
CDR 아미노산 치환을 조합하여 증강 또는 최적화된 LM609 이식 항체를 생성하는 것 이외에, CDR 아미노산 치환은 또한 LM609 이식 항체에 바람직한 성질을 부여하는 프레임워크 돌연변이와 조합될 수 있다. 따라서, 활성을 증강시키는 CDR 또는 프레임 영역 중의 돌연변이를 조합하여 LM609 이식 항체를 더 최적화할 수 있다.
또한, 본 발명은 비탁신 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 핵산의 단편을 제공하고, 여기서 이러한 단편은 비탁신 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 가변 영역과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로 이루어진다. 비탁신 H 사슬 폴리펩티드의 가변 영역은 도 1A의 뉴클레오티드 1-351, 및 아미노산 잔기 Gln1 내지 Ser117로 필수적으로 이루어진다 (각각 서열 확인 번호 1 및 2). 비탁신 L 사슬 폴리펩티드의 가변 영역은 도 1B의 뉴클레오티드 1-321, 및 아미노산 잔기Glu1 내지 Lys107로 필수적으로 이루어진다 (각각 서열 확인 번호 3 및 4). 이러한 가변 영역을 코딩하는 핵산의 말단은 의도하는 목적 및 기능이 동일하게 남아있는 한은 결정적이지 않다.
가변 영역 핵산 단편 외의 단편도 제공된다. 이러한 단편은 예를 들면, 비탁신 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 CDR과 동일한 뉴클레오티드 서열로 실질적으로 이루어지는 핵산을 포함한다. 비탁신 CDRs에 대응하는 서열은 예를 들면, 카바트 등의 상기 문헌에 의해 규정된 영역 및(또는) 코티아 등의 상기 문헌에 의해 규정된 영역 뿐만 아니라 맥칼럼 등의 상기 문헌에 의해 규정된 영역을 포함한다. 상기 정의 각각의 비탁신 CDR 단편은 하기 표 2에 설명하는 뉴클레오티드에 대응한다. 뉴클레오티드 서열 넘버링은 도 1A 및 1B에 도시한 일차 서열 (서열 확인 번호 1 및 3)으로부터 취하고, 상기 표 1에 설명한 정의에 따른다.
비탁신 CDR 뉴클레오티드 잔기
카바트 코티아 맥칼럼
VHCDR1 91-105 76-96 88-105
VHCDR2 148-198 157-168 139-177
VHCDR3 295-318 298-315 289-315
VLCDR1 70-102 76-96 88-108
VLCDR2 148-168 148-156 136-165
VLCDR3 265-291 271-288 265-288
유사하게, 상기 정의 각각의 비탁신 CDR 단편은 표 3에 설명하는 아미노산 잔기에 상응한다. 아미노산 잔기 번호는 도 1A 및 1B에 도시한 일차 서열 (서열확인 번호 2 및 4)로부터 취하고, 상기 표 1에 설명한 정의에 따른다.
비탁신 CDR 아미노산 잔기
카바트 코티아 맥칼럼
VHCDR1 Ser31-Ser35 Gly26-Tyr32 Ser30-Ser35
VHCDR2 Lys50-Gly66 Ser53-Gly56 Trp47-Tyr59
VHCDR3 His99-Tyr106 Asn100-Ala105 Ala97-Ala105
VLCDR1 Gln24-His34 Ser26-His32 Ser30-Tyr36
VLCDR2 Tyr50-Ser56 Tyr50-Ser52 Leu46-Ile55
VLCDR3 Gln89-Thr97 Ser91-His96 Gln89-His96
따라서, 본 발명은 또한 비탁신 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 CDR과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편을 제공한다.
비탁신 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드 및 이의 단편을 코딩하는 핵산은 다양한 진단 및 치료 목적에 유용하다. 예를 들면, 비탁신 핵산을 사용하여 인테그린 αvβ3에 대한 결합 특이성 및 억제 활성을 갖는 비탁신 항체 및 이의 기능적 단편을 제조할 수 있다. 항체 및 이의 기능적 단편은 αvβ3매개성 질병의 진단 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 따라서, 비탁신 및 이의 기능적 단편을 사용하여 예를 들면, αvβ3매개성 질병의 진행에 필요한 αvβ3의 결합 활성 또는 다른 기능적 활성을 억제할 수 있다. αvβ3매개성 질병의 진행에 필요한 다른 기능적 활성은 예를 들면, αvβ3의 활성화, αvβ3매개성 신호 형질 도입 및 αvβ3매개성 아포토시스(apoptosis) 예방을 포함한다. 그러나, 유리하게는 비탁신은 비쥐과프레임워크 아미노산 서열을 포함하고, 그와 같은 것은 숙주 면역 반응을 유도하는 것과 관련하여 덜 항원성이다. 또한, 본 발명의 비탁신 핵산을 사용하여 코딩되는 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드의 기능적 동등물 모형을 모델화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 비탁신 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 제공한다. 비탁신 H 사슬 폴리펩티드는 도 1A에 도시한 것 (서열 확인 번호 2)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 나타내는 반면, 비탁신 L 사슬 폴리펩티드는 도 1B에 도시한 것 (서열 확인 번호 4)와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 나타낸다. 본 발명은 또한 비탁신 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다. 항체는 상기 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드, 또는 기능적 단편으로부터 생성되고, αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타낸다.
본 발명은 LM609 이식 항체의 H 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 LM609 이식 항체의 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 도 1A에 도시한 것 (서열 확인 번호 1)과 실질적으로 동일한 H 사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열, 및 도 7에 도시한 것 (서열 확인 번호 31)과 실질적으로 동일한 L 사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편으로 이루어진다.
LM609 이식 항체 (이의 기능적 단편을 포함함)은 LM609와 실질적으로 동일한 결합 활성, 결합 특이성 및 억제 활성을 나타내는 비-생쥐 항체이다. 본원에 기술된 LM609 이식 항체 Fv 단편은 인간 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드 내의 카바트 등에 의해 규정된 CDRs (이하, "카바트 CDRs"로 지칭함)을 LM609에서 유래한 카바트 CDRs로 기능적으로 대체하는 것에 의해 제조된다. 카바트 CDRs의 기능적 대체는 상기 기술된 CDR 이식법에 의해 수행되고, 이는 상기 미국 특허 제5,225,539호의 주요 내용이다. 카바트 CDR 이외에서의 아미노산 잔기의 치환을 추가로 수행하여 이러한 아미노산 치환이 특정 위치에서의 공여체 아미노산에 상응하지 않는 한 유익한 결합 성질을 유지 또는 증대시킬 수 있다. 이러한 치환은 임의의 생쥐 서열 특성을 카바트 CDRs 이외에서의 항체에 주는 것 없이 결합 특성이 조정되게 한다. 이러한 항체의 제조가 LM609 이식 항체와 관련하여 본원에 기술되어 있지만, 카바트 CDRs 이외에서의 이러한 비공여체 아미노산의 치환은 본질적으로 모든 이식 항체의 제조에 이용될 수 있다. LM609 이식 항체의 제조는 하기 실시예 V에 더 기술되어 있다.
LM609 이식 항체 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 각각 도 1A 및 7에 도시되어 있다. 이들 서열은 실질적으로 LM609 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드를 코딩하는 것에 상응한다. 이들 핵산은 LM609 이식 항체 코딩 서열의 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 단일 및 이중 가닥 핵산 뿐만 아니라 예를 들면 유전자의 인트론, 5'- 및 3'-비해독 영역 및 조절 서열과 같은 핵산의 비코딩 부분이 포함된다.
LM609 이식 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기 경계는 비탁신에 대해 상기 기술한 것과 동일하다. 예를 들면, LM609 이식 항체 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드는 가변 영역의 아미노 말단 Gln1 잔기에서 시작하여 Ser17 까지의 약 351개 뉴클레오티드 길이의 핵산에 의해 코딩된다 (도 1A, 각각 서열 확인 번호 2 및 1). LM609 이식 항체 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드는 가변 영역의 아미노 말단 Glu1 잔기에서 시작하여 Lys107 까지의 약 321개 뉴클레오티드 길이의 핵산에 의해 코딩된다 (도 7, 각각 서열 확인 번호 32 및 31). 비탁신의 경우에서처럼, 이들 뉴클레오티드 서열의 사소한 변형은 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 코딩 핵산 및 이들의 기능적 단편으로서 포함되는 것으로 의도된다.
따라서, 본 발명은 또한 도 1A에 도시한 것 (서열 확인 번호 2)와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 단편을 코딩하는, LM609 이식 항체 H 사슬을 코딩하는 핵산을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 도 2에 도시한 것 (서열 확인 번호 32)과 실질적으로 동일한 L 사슬 가변 영역 아미노산 서열 또는 이의 단편을 코딩하는, LM609 이식 항체 L 사슬을 코딩하는 핵산을 제공한다.
아미노산의 보존적 치환 이외에, 아미노산의 기능적 대체를 허용하는 LM609 이식 항체 코딩 뉴클레오티드 서열의 사소한 변형도 또한 이 용어의 정의 내에 포함되는 것으로 의도된다. 변화시킬 아미노산의 동정은 항체의 구조 및 기능에 관한 현재 입수가능한 정보 뿐만 아니라 CDR 이식 방법을 포함하는 현재 입수가능한 정보를 이용하여 당업자가 행할 수 있다. LM609 이식 항체 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 기능적으로 동등한 아미노산의 치환은 통상적인 것이고, 당업자들에게 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 상기 기술한 대로, 이러한 방법은 예를 들면, 코돈에 기초한 돌연변이발생, 무작위 올리고뉴클레오티드 합성 및 부분 변성올리고뉴클레오티드 합성을 포함하고, 이 방법이 구조 정보를 요하지 않고 동등한 아미노산 잔기의 신속한 동정을 가능케하므로 이식 항체를 제조할 때 유익하다.
또한, 본 발명은 LM609 이식 항체 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 핵산의 단편을 제공하고, 여기서 단편은 LM609 이식 항체 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 가변 영역과 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다. 비탁신의 경우에서처럼, 이러한 가변 영역 코딩 핵산의 말단은 의도하는 목적 및 기능이 동일하게 남아있는 한 결정적이지 않다.
가변 영역 핵산 단편 이외의 단편도 또한 제공되고, 이는 예를 들면 LM609 이식 항체 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 CDR과 동일한 뉴클레오티드 서열로 실질적으로 이루어지는 핵산을 포함한다. 비탁신의 경우에서처럼, LM609 이식 항체 CDR에 상응하는 서열은 예를 들면, 카바트 등의 상기 문헌, 코티아 등의 상기 문헌에 의해 규정된 영역 뿐만 아니라 맥칼럼 등의 상기 문헌에 의해 규정된 영역을 포함한다. LM609 이식 항체 CDR 영역은 비탁신에 대해 상기 기술한 것과 유사할 수 있다. 또한, 이러한 영역은 공지되어 있으며, LM609 서열 및 본원에서 제공하는 교시사항만 주어진다면 당업자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 LM609 이식 항체 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 CDR과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편을 제공한다.
비탁신의 경우에서처럼, LM609 이식 항체 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 이의 단편은 다양한 진단 및 치료 목적에 유용하다. 예를 들면,LM609 이식 항체 코딩 핵산을 사용하여 인테그린 αvβ3에 대한 결합 특이성 및 억제 활성을 갖는 재조합 항체 및 이의 기능적 단편을 제조할 수 있다. 항체 및 이의 기능적 단편은 αvβ3매개성 질병의 진단 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 이러한 질병 및 항-αvβ3항체를 사용하는 방법은 비탁신과 관련하여 상기에 기술하였고, 본원에 기술된 LM609 이식 항체에 동등하게 적용가능하다.
따라서, 본 발명은 LM609 이식 항체 H 사슬 및 LM609 이식 항체 L 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 제공한다. LM609 이식 항체 H 사슬 폴리펩티드는 도 1A에 도시한 것 (서열 확인 번호 2)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 나타내는 반면, LM609 이식 항체 L 사슬 폴리펩티드는 도 7에 도시한 것 (서열 확인 번호 32)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명은 또한 LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다. 항체는 상기 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편으로부터 생성되고, αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타낸다.
본 발명은 αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다. 증강된 LM609 이식 항체는 LM609 이식 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드 또는 LM609 이식 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드의 1 이상의 CDRs 중에 1 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 증강된 LM609 이식 항체의 αvβ3결합 친화도는 유지 또는 증강된다.
증강된 LM609 이식 항체를 동정하기 위하여, 변형된 LM609 이식 항체의 라이브러리를 상기 및 실시예 VI에 기술한 바와 같이 생성하였다. 초기에는, LM609 CDRs를 동정하고 선택하여 단일 아미노산 치환을 도입하였다. 카바트 등의 상기 문헌의 넘버링 시스템을 사용하여, 돌연변이발생용으로 선택한 CDR 잔기는 다음과 같다:
돌연변이발생용으로 선택한 CDR 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
단일 아미노산 치환을 LM609 이식 항체의 CDR 내로 도입하여 변형된 LM609 이식 항체의 집단을 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 1 이상의 CDRs 중의 모든 아미노산을 임의의 또는 모든 아미노산으로 돌연변이시켜 변형된 LM609 이식 항체의 집단을 생성시키고, 이 집단을 αvβ3결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 이 집단은 CDRs 중의 아미노산을 돌연변이시키는 것에 의해 생성되었지만, 또한 프레임워크 영역 잔기를 변화시키거나, 또는 CDRs 및 프레임워크 모두를 변화시킨 집단을 구성할 수 있다. 가변 영역에서의 이러한 돌연변이는 별개로, 조합하여 또는 단계적으로 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CDR 또는 프레임워크 영역에 아미노산 치환이 있는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다.
본 발명은 추가적으로 증강된 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다. 증강된 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체는 단일 아미노산 치환을 갖는 다음의 CDRs 중 1 이상을 포함하는 것을 포함한다:
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 VHCDR1;
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 VHCDR2;
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 VHCDR3;
VLCDR1 Gln-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-Phe-Leu-His-Trp-Tyr (서열 확인 번호 82);
VLCDR2 Leu-Leu-Ile-Arg-Tyr-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser (서열 확인 번호 84); 및
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 VLCDR3.
단일 아미노산 치환을 갖는 CDRs를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
단일 아미노산 치환을 갖는 CDRs를 가지고 부모 LM609 이식 항체보다 높은 결합 친화도를 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 동정할 수 있으며, 여기서 상응하는 아미노산 돌연변이를 조합하여 신규 변형된 LM609 이식 항체를 생성시킨다. 동정은 αvβ3결합 활성에 대해 스크리닝하여 수행된다. 일부 조합에서, LM609 이식 항체는 2 이상의 아미노산 치환을 갖는 1 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 본 발명은 다수의 아미노산 치환을 포함하는 하기 CDRs 중 1 이상을 포함하는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VHCDR,
다수 아미노산 치환을 갖는 CDRs를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
본 발명은 또한 αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체를 제공하고, 여기서 증강된 LM609 이식 항체는 LM609 이식 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드 또는 LM609 이식 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드의 2 이상의 CDRs에 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
LM609 이식 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드 또는 LM609 이식 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드의 2 이상의 CDRs에 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 증강된 LM609 이식 항체는 다음과 같이 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDRs의 조합을 포함하는 LM609 이식 항체를 포함할 수 있다: VLCDR1 서열 확인 번호 57 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 52; VLCDR1 서열 확인 번호 57; VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 51; VLCDR1 서열 확인 번호 57 및 VHCDR3 서열 확인 번호 52; VLCDR3 서열 확인 번호 59, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR3 서열 확인 번호 61 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; 및 VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50.
단일 아미노산 치환을 갖는 2 이상의 CDRs를 포함하는 증강된 LM609 이식 항체 이외에, 본 발명은 또한 1 이상의 CDRs가 2 이상의 아미노산 치환을 갖는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다.
2 이상의 아미노산 치환을 갖는 1 이상의 CDR를 갖는 증강된 LM609 이식 항체는 다음과 같이 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDRs의 조합을 포함하는 것을 포함할 수 있다: VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 63; VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 63; VLCDR3 서열 확인 버놓 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 64; VLCDR3 서열 확인 번호 61 및 VHCDR3 서열 확인 번호 63; VLCDR3 서열 확인 번호 61 및 VHCDR3 서열 확인 번호 65 및 VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 66.
본 발명은 추가로 αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타내는 고친화도 LM609 이식 항체를 제공한다. 고친화도 LM609 이식 항체는 LM609 이식 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드 또는 LM609 이식 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드의 1 이상의 CDRs 중에 1 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 고친화도 LM609 이식 항체의 αvβ3결합 친화도는 증가된다.
고친화도 항체는 다음과 같이 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDRs의 조합을 포함하는 것을 포함할 수 있다: VLCDR1 서열 확인 번호 57 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 52; VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 51; VLCDR1 서열 확인 번호 57 및 VHCDR3 서열 확인 번호 52; VLCDR3 서열 확인 번호 59, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 63; VLCDR3 서열 확인 번호 61 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 50; VLCDR1 서열 확인 번호 57, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인번호 63; VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 64; VLCDR3 서열 확인 번호 61 및 VHCDR3 서열 확인 번호 63; VLCDR3 서열 확인 번호 61 및 VHCDR3 서열 확인 번호 65; 및 VLCDR3 서열 확인 번호 61, VHCDR2 서열 확인 번호 44 및 VHCDR3 서열 확인 번호 66.
상기 기술한 바와 같이, 증강된 LM609 항체는 1 이상의 CDRs 또는 프레임워크 잔기 중에 추가 돌연변이를 도입하여 더 변형시킬 수 있다. 본원에 개시한 바와 같이, 증강된 LM609 이식 항체 클론 6H6 (표 10)을 1 이상의 CDRs로 돌연변이를 도입하여 더 변형시켰다 (실시예 VIII 참조). 이들 6H6 변이체는 αvβ3에 대해 고친화도의 결합을 갖는 것으로 발견되었고, 단백분해에 내성이었다.
또한, 본 발명은 VHCDR2 Lys-Val-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Pro-Asp-Thr-Val-Gln-Gly (서열 확인 번호 104); VHCDR3 His-Leu-His-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (서열 확인 번호 106); 또는 VLCDR1 Gln-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-Phe-Leu-His (서열 확인 번호 110)을 포함하는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 확인 번호 103, 서열 확인 번호 105 및 서열 확인 번호 109로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 증강된 Lm609 이식 항체를 제공한다:
본 발명은 또한 VHCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 33으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VHCDR2을 코딩하는 서열 확인 번호 101로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VHCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 105로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VLCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 107로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VLCDR2을 코딩하는 서열 확인 번호 111로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; 및 VLCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 89로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 증강된 lm609 이식 항체를 제공한다:
본 발명은 또한 VHCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 33으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VHCDR2을 코딩하는 서열 확인 번호 101로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VHCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 105로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VLCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 109로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VLCDR2을 코딩하는 서열 확인 번호 111로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; 및 VLCDR3를 코딩하는 서열 확인 번호 89로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
또한 본 발명은 다음을 포함하는 증강된 LM609 이식 항체를 제공한다:
본 발명은 또한 VHCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 33으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VHCDR2을 코딩하는 서열 확인 번호 103으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VHCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 105로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VLCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 109로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; VLCDR2을 코딩하는 서열 확인 번호 111로 지칭되는 뉴클레오티드 서열; 및 VLCDR3로 지칭되는 서열 확인 번호 89로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 핵산에 의해 코딩되는 증강된 LM609 이식 항체는 LM609 이식 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드 또는 LM609 이식 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드의 1 이상의 CDRs 중에 1 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 증강된 LM609 이식 항체의 αvβ3결합 친화도는 유지 또는 증강된다.
본 발명은 αvβ3에 대한 선택적 결합 친화도를 나타내는 고친화도 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 핵산에 의해 코딩되는 고친화도 LM609 이식 항체는 LM609 이식 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드 또는 LM609 이식 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드의 1 이상의 CDRs 중에 1 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 고친화도 LM609 이식 항체의 αvβ3결합 친화도는 증강된다.
본 발명은 모노클로날 항체 LM609의 H 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 모노클로날 항체 LM609의 L 사슬 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 도 2A 및 2B에 도시한 것과 실질적으로 동일한 H 사슬 또는 L 사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (각각 서열 확인 번호 5 및 7) 또는 이의 단편으로 이루어진다.
상기 기술한 바와 같이, 모노클로날 항체 LM609는 인테그린 αvβ3에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 당업계에 밝혀져 있다. 원칙적으로는 실질적으로 모든 표적에 대하여 특이성이 생길 수 있지만, LM609는 인테그린과 내의 단일 멤버에 대해 실질적 특이성 및 억제 활성을 나타내는 인테그린 억제 항체이다. 이 경우, LM609는 β3과 내의 αvβ3인테그린에 대해 실직적 특이성 및 억제 활성을 나타낸다. 모노클로날 항체 LM609의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 본원에 앞서 이전에 단리 및 특성화되지 않았다.
LM609 코딩 핵산의 단리 및 특성화는 하기 실시예에서 더 기술하는 당업자들에게 공지된 기술에 의하여 수행하였다. 간단하게, 하이브리도마 LM609로부터 cDNA를 생성시키고, LM609 코딩 핵산을 단리하기 위한 원천으로 사용하였다. 먼저 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드 각각에 대하여 N-말단 아미노산 서열을 정하고, 이어서 cDNA로부터의 항체 코딩 서열을 PCR에 의하여 증폭시키는 것에 의해 단리하였다. 5' 프라이머는 새롭게 결정한 N-말단 아미노산 서열에 상응하여 역해독시킨 반면, 3' 프라이머는 항체 불변 영역 서열과 실질적으로 유사한 서열에 상응하였다. 생성물의 증폭 및 클로닝은 LM609의 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 핵산이 단리되게 하였다.
LM609 H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 서열의 뉴클레오티드 서열은 각각 도 2A 및 2B에 도시되어 있다. 이들 서열은 LM609의 가변 영역 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 실질적으로 상응한다. 비탁신 핵산의 경우에서처럼, 이들LM609 핵산은 LM609 코딩 서열의 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 단일 및 이중 가닥 핵산 뿐만 아니라 예를 들면 유전자의 인트론, 5'- 및 3'-비해독 영역 및 조절 서열과 같은 핵산의 비코딩 부분도 포함된다.
도 2A에 도시한 바와 같이, LM609 H 사슬 가변 영역 폴리펩티드는 가변 영역의 아미노 말단 Glu1 잔기에서 시작하여 Ala117 까지의 약 351개 뉴클레오티드 길이의 핵산에 의해 코딩된다. 쥐과 LM609 항체 H 사슬은 IgG2a 불변 영역을 갖는다. 도 2B에 도시한 것은 가변 영역 아미노 말단 Asp1에서 시작하여 Lys107 까지의 약 321개 뉴클레오티드 길이의 핵산에 의해 코딩되는 LM609 L 사슬 가변 영역 폴리펩티드이다. 기능적 항체에서, LM609는 카파 L 사슬 불변 영역을 갖는다.
비탁신 핵산의 경우에서처럼, 이들 LM609 뉴클레오티드 서열의 사소한 변형은 H 사슬 및 L 사슬 LM609 코딩 핵산으로서 포함된다고 의도된다. 이러한 사소한 변형은 핵산 또는 코딩된 폴리펩티드가 기술한 바와 같은 그들의 기능의 일부 또는 모두를 유지하는 한 LM609 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내에 포함된다.
따라서, 본 발명은 또한 도 2A에 도시한 것과 실질적으로 동일한 모노클로날 항체 LM609의 가변 영역 아미노산 서열 (서열 확인 번호 6) 또는 이의 단편을 코딩하는, LM609 H 사슬 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 도 2B에 도시한 것과 실질적으로 동일한 모노클로날 항체 LM609의 가변 영역 아미노산 서열 (서열 확인 번호 8) 또는 이의 단편을 코딩하는, LM609 L 사슬 또는 기능적 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 LM609 H 사슬 및 L 사슬 코딩 핵산의 단편을 제공하고, 여기서 상기 단편은 LM609 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 가변 영역과 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다. LM609 H 사슬 폴리펩티드의 가변 영역은 도 2A의 뉴클레오티드 1-351 및 아미노산 잔기 Glu1 내지 Ala117 (각각 서열 확인 번호 5 및 6)으로 필수적으로 이루어진다. LM609 L 사슬 폴리펩티드의 가변 영역은 도 2B의 뉴클레오티드 1-321 및 아미노산 잔기 Asp1 내지 Lys107 (각각 서열 확인 번호 7 및 8)로 필수적으로 이루어진다. 상기 가변 영역 코딩 핵산의 말단은 원하는 목적 및 기능이 동일하게 유지되는 한 결정적이지 않다. 이러한 원하는 목적 및 기능은 예를 들면, H 사슬 및 L 사슬 가변 영역 서열에 대한 혼성화 탐침으로서 또는 재조합 폴리펩티드의 제조용으로 사용하는 것을 포함한다.
가변 영역 핵산 단편 이외의 단편도 또한 제공된다. 이러한 단편은 예를 들면, LM609 H 사슬 또는 L 사슬 폴리펩티드의 CDR과 동일한 뉴클레오티드 서열로 실질적으로 이루어지는 핵산을 포함한다. LM609 CDRs에 상응하는 서열은 예를 들면, 카바트 등의 상기 문헌에 규정된 가변 영역 내의 영역 및(또는) 코티아 등의 상기 문헌에 규정된 가변 영역 내의 영역 뿐만 아니라 맥칼럼 등의 상기 문헌에 규정된 영역을 포함한다. 상기 각 정의의 LM609 CDR 단편은 하기 표 4에 설명하는 뉴클레오티드에 상응한다. 뉴클레오티드 서열 넘버링은 도 2A 및 2B에 도시한 일차 서열 (서열 확인 번호 5 및 7)로부터 취하고, 상기 표 1에 설명한 정의에 따른다.
LM609 CDR 뉴클레오티드 잔기
카바트 코티아 맥칼럼
VHCDR1 91-105 76-96 88-105
VHCDR2 148-198 157-168 139-177
VHCDR3 295-318 298-315 288-315
VLCDR1 70-102 76-96 88-108
VLCDR2 148-168 148-156 136-165
VLCDR3 265-291 271-288 265-288
유사하게, 상기 각 정의의 LM609 CDR 단편은 하기 표 5에서 설명하는 아미노산 잔기에 상응한다. 아미노산 잔기의 넘버링은 도 2A 및 2B에 도시한 일차 서열 (서열 확인 번호 6 및 8)로부터 취하고, 상기 표 1에 설명한 정의에 따른다.
LM609 CDR 아미노산 잔기
카바트 코티아 맥칼럼
VHCDR1 Ser31-Ser35 Gly26-Tyr32 Ser30-Ser35
VHCDR2 Lys50-Gly66 Ser53-Gly56 Trp47-Tyr59
VHCDR3 His99-Tyr106 Asn100-Ala105 Ala97-Ala105
VLCDR1 Gln24-His34 Ser26-His32 Ser30-Tyr36
VLCDR2 Tyr50-Ser56 Tyr50-Ser52 Leu46-Ile55
VLCDR3 Gln89-Thr97 Ser91-His96 Gln89-His96
LM609 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 이의 단편은 다양한 진단 및 치료 목적에 유용하다. 예를 들면, LM609 핵산을 사용하여 인테그린 αvβ3에 대하여 결합 특이성 및 억제 활성을 갖는 재조합 LM609 항체 및 이의 기능적 단편을 제조할 수 있다. 항체 및 이의 기능적 단편을 사용하여 시료 중의 αvβ3의 존재 또는 부재를 측정하여 αvβ3매개성 질병 이환성 또는 발병을 진단할수 있다. 별법으로, 재조합 LM609 항체 및 이의 기능적 단편을 αvβ3매개성 질병 또는 병적 상태의 치료용으로 사용할 수 있다. 비탁신의 경우에서처럼, 재조합 LM609 및 이의 기능적 단편을 사용하여 αvβ3매개성 질병 또는 병적 상태의 진행에 필요한 αvβ3의 결합 활성 또는 다른 기능적 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 LM609 핵산을 사용하여 또한 코딩되는 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드의 기능적 등가물을 모델링할 수 있다 이러한 기능적 등가물은 예를 들면, 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편의 합성 유사체 또는 모방체를 포함한다. 구체적 예로는 일부 또는 실질적으로 동일한 LM609의 결합 또는 억제 활성을 유지하는 LM609 CDRs의 펩티드 모방체를 들 수 있다. 추가적으로, LM609 코딩 핵산을 사용하여 항체 LM609, 그의 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편의 변형된 형태 또는 유도체를 코딩하는 핵산을 엔지니어링하고 제조할 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 이러한 변형된 형태 또는 유도체는 예를 들면, LM609와 실질적으로 동일한 결합 및 억제 활성을 나타내는 비-생쥐 항체, 이의 상응하는 H 사슬 및 L 사슬 폴리펩티드 및 이의 기능적 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 αvβ3매개성 질병의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 αvβ3에 대한 결합을 가능케 하는 조건하에서 유효량의 비탁신, LM609 이식 항체, 이의 증강된 항체 또는 이의 기능적 단편을 투여하는 것으로 이루어진다. 본 발명은 또한 αvβ3의 기능을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 αvβ3에 대한 결합을가능케하는 조건하에서 αvβ3를 비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편과 접촉시키는 것으로 이루어진다.
상기 기술한 바와 같이, 비탁신 및 LM609 이식 항체는 이의 부모형 CDR 공여체 항체 LM609와 같이 본질적으로 모든 결합 특성을 나타내는 모노클로날 항체이다. 이들 특성은 예를 들면, 인테그린 αvβ3에 대한 상당한 결합 특이성 및 친화도를 포함한다. 하기 실시예는 이들 결합 성질을 설명하고, 상기 항체가 αvβ3에 결합하는 것이 αvβ3리간드 결합 및 기능을 억제한다는 것을 더 보여준다. 따라서, 비탁신 및 LM609 이식 항체는 αvβ3기능 억제와 관련된 여러가지 진단 및 치료 목적에 유용하다.
인테그린 αvβ3는 많은 세포 부착 및 이동과 연관된 현상에 작용한다. 이와 같이, 상기 인테그린, 그 작용 또는 상기 인테그린을 발현하는 세포의 기능장애 또는 조절장애는 많은 질병 및 질환과 연관되어 있다. 따라서, αvβ3결합 또는 기능 억제를 이러한 αvβ3매개성 질환을 치료하거나 질환의 심도록 완화시키는데 사용할 수 있다. 적어도 본 인테그린을 억제하는 것이 질환의 심도를 완화시키기 때문에, αvβ3에 의해 매개되는 여러가지 질환의 예를 하기한다. 이들 예는 대표적인 것을 의미하고, 그 자체로 모든 αvβ3매개성 질병을 포함하는 것은 아니다. 예를 들면, αvβ3결합 억제에 의해 완화될 수 있거나, 완화될 것이라고 발견되는,αvβ3결합, 기능의 조절장애 또는 이 인테그린을 발현하는 세포의 조절장애를 나타내는, 하기 논의하는 것 이외의 많은 질환이 존재한다. 이러한 특징을 나타내는 질환은 본원에서 사용되는 용어의 정의 내에 포함되는 것으로 의도된다.
혈관생성 또는 신생혈관형성은 조직 내에 이미 존재하는 혈관으로부터 신규 혈관이 생성되는 과정이다. 하기 더 기술하는 바와 같이, 이 과정은 αvβ3를 발현하는 내피 세포에 의해 매개되고, 적어도 이 인테그린을 억제하는 것은 신규 혈관 성장을 억제한다. 신규 혈관 형성 또는 조직 신생혈관형성을 필요로 하고, 이 과정을 억제하는 것이 질환을 억제하는 것인 질환은 다양하다. 이와 같이, 성장 또는 유지를 위하여 신생혈관형성을 필요로 하는 질환은 αvβ3매개성 질병으로 여겨진다. 따라서, 이들 질병의 치료 정도 또는 심도의 완화는 신생혈관형성의 억제 정도에 의존할 수 있다. 이들 αvβ3매개성 질병은 예를 들면, 면역 및 비면역성 염증, 만성 관절 류마티즘, 건선과 같은 염증성 질환; 당뇨병성 망막병증, 신생혈관 녹내장 및 죽상경화성 플라크 중의 모세혈관 증식과 같은 혈관의 부적절하거나 부적당한 침습과 연관된 질환; 뿐만 아니라 암 질환을 포함한다. 이러한 암 질환은 예를 들면, 고형 종양, 종양 전이, 맥관섬유종, 수정체후부 섬유증식증, 혈관종, 카포시 육종, 및 종양 성장을 지지하는 신생혈관형성을 필요로하는 다른 암을 포함한다. 혈관생성성이라 여겨지는 추가 질병은 건선 및 류마토이드 관절염 뿐만 아니라 황반 변성과 같은 망막 질병을 포함한다. αvβ3매개성 질병인 신규 혈관형성을 요하는 것 외의 질병은 예를 들면, 재협착 및 골다공증을 포함한다.
αvβ3매개성 질병의 치료는 αvβ3에 결합해서, 그 기능을 억제하도록 유효량의 비탁신, LM609 이식 항체, 이의 증강된 항체, 또는 이의 기능적 단편을 투여하는 것에 의해 수행될 수 있다. 투여는 당업계에 공지된 여러가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 방법의 선택은 특정 αvβ3매개성 질병에 의존할 수 있고, 예를 들면 비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편을 세포, 조직, 기관 및 유기체에 생체내, 제자리 및 생체외 투여하는 것을 포함한다. 게다가, 이러한 항체 또는 기능적 단편은 αvβ3매개성 질병을 나타내거나, 나타낼 위험이 있는 개체에 투여할 수 있다. αvβ3매개성 질병의 명확한 임상적 진단은 비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편의 투여를 정당화한다. 예방적 응용은 αvβ3매개성 질병 기전이 명백한 임상적 질병 발병에 앞서는 질병에서 정당화된다. 따라서, 가족 중에 병력이 있고 신뢰할만한 예후에 의해 걸릴 위험이 있다고 예측되는 개체는 예방적으로 처리하여 발병에 앞서서 αvβ3매개성 기전을 방해할 수 있다.
비탁신, LM609 이식 항체, 이의 증강된 항체, 또는 이의 기능적 단편은 αvβ3매개성 질병의 치료 또는 그 심도를 완화하기에 유효한 여러가지 제형 및 제약적으로 허용가능한 매체로 투여될 수 있다. 이러한 제형 및 제약적으로 허용가능한 매체는 당업자들에게 공지되어 있다. 추가로, 비탁신, LM609 이식 항체 또는이의 기능적 단편은 αvβ3매개성 질병을 치료 또는 그 심도를 완화하는 것을 증강 또는 보충할 수 있는 다른 조성물과 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 종양 유도성 신생혈관형성을 억제하는 비탁신 또는 LM609 이식 항체 및 종양 성장을 직접 억제하는 화학요법제를 병용투여하는 것은 다른 조성물의 투여가 αvβ3매개성 질병의 치료를 증강 또는 보충할 수 있는 한 가지 구체적 예이다.
비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편은 병태적 견지에서 αvβ3인테그린 결합의 억제를 유발하기에 충분한 용량으로 통상의 방법에 의해 투여된다. 억제는 병태 부위에서 αvβ3포함 세포의 유병률에 대한 제자리 면역조직화학법과 같은 당업게에 공지된 여러가지 방법에 의해 측정될 수 있을 뿐만 아니라 예를 들면, αvβ3매개성 질병의 증상의 심도 완화를 관찰하는 것을 포함한다.
생체내 투여 방식은 비탁신, LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편의 복강내, 정맥내 또는 피하내 투여를 포함할 수 있다. 항체 치료제의 투여량은 공지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 이러한 투여량은 전형적으로 약 0.01 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml, 바람직하게는 약 1-5 ㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎍/ml의 혈장 농도를 달성하도록 투여될 수 있다. 체중당 양으로 환산하면, 이들 투여량은 전형적으로 약 0.1-300 mg/kg, 바람직하게는 약 0.2-200 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.5-20 mg/kg에 상응한다. 필요에 따라서, 투여량은 치료 도중에 걸쳐서 일회 또는 다회 투여될 수 있다. 일반적으로,투여량은 연령, 상태, 성별 및 환자의 αvβ3매개성 병태의 정도에 따라 변할 수 있고, 부작용을 일으킬만큼 높지는 않아야 한다. 게다가, 치료를 증강하거나 또는 가능한 부작용의 발생을 완화시키기 위해 치료 도중 의사가 투여량을 조정할 수 있다. 이러한 방법은 공지되어 있고, 당업자에 의해 통상적으로 수행된다.
비탁신, LM609 이식 항체, 이의 증강된 항체 및 이의 기능적 단편의 특이성 및 억제 활성은 다수의 αvβ3매개성 질병의 치료를 가능케한다. 이러한 질병은 예를 들면, 종양 성장 및 건선과 같이 신생혈관형성을 필요로 하는 질환 뿐만 아니라 재협착 및 골다공증과 같이 αvβ3에 의해 직접적으로 매개되는 질환을 포함한다. 따라서, 본 발명은 이러한 질병의 치료 방법 뿐만 아니라 이러한 질병 치료용 비탁신 및 LM609 이식 항체 함유 조성물을 제공한다.
본 발명의 다양한 실시태양의 활성에 실질적으로 영향을 주지않는 변형도 또한 본원에서 제공하는 본 발명의 정의 내에 포함됨을 이해할 것이다. 또한, 하기 실시예는 예시할 의도일 뿐 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 I
LM609를 코딩하는 핵산의 단리 및 특성 분석
이 실시예는 LM609를 코딩하는 핵산 클로닝 및 서열 결정을 보여준다.
LM609는 인간 비트로넥틴 수용체인 인테그린 αvβ3에 대한 것이다. αvβ3는 흑색종, 교모세포종, 및 유선암에서 높은 수준으로 상향 조절되고, 시험관내 및생체내 양쪽에서 M21 흑색종 세포 증식에서 역할한다. αvβ3는 혈관생성, 재협착증 및 피부 상처에서의 과립화 조직 형성에서도 역할한다. LM609는 시험관내에서 M21 세포의 증식을 방해하는 것은 물론, M21 세포의 비트로넥틴에 대한 부착을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, LM609의 이식은 임상적으로 유용한 치료제를 생성한다.
LM609 가변 영역의 cDNA 합성 : cDNA 합성을 위해, 전체 RNA를 108LM609 하이브리도마 세포로부터 촘진스키 및 사시(Chomczynski and Sacchi, Analyt. Biocehm. 162:156 (1987))에 기술된 방법을 변형하여 제조하였다. LM609 가변 영역(V) 유전자를 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 BRL 슈퍼스크립트 키트(Superscript kit)에 의해 클로닝하였다. 간단히 설명하면,5mg의 전체 세포 RNA, 650ng의 올리고 dT 및 H2O를 총 부피 55ml로 만들었다. 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하고, 얼음 위에서 냉각시켰다. 반응 완충용액을 첨가하고, 혼합물에 10mM DTT 및 1mM dNTPs을 가하고, 37℃에서 2분 동안 가열하였다. 5ml(1,000 단위)의 역전사효소를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 얼음 위에서 냉각시켰다.
올리고뉴클레오티드는 전부 ABI 394 DNA 합성기에서 β-시아노에틸 포스포르아미디트 화학법에 의해 합성하였다. PCR 증폭 및 통상의 위치 지정 돌연변이 발생(site-directed mutagenesis)를 위해 사용된 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 정제 카트리지(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사)를 사용하여 정제하였다. 정방향 PCR 프라이머는 정제된 LM609 항체로부터 얻은 N-말단 단백질 서열 데이타로부터 고안하였다. 정방향 PCR 프라이머는 각각의 항체 가변 사슬의 처음 6개의 아미노산(샌디에고 주립 대학에서 시퀀싱된 단백질)을 코딩하는 서열을 함유한다. L 사슬 정방향 PCR 프라이머(997)의 서열은 5'-GCC CAA CCA GCC ATG GCC GAT ATT GTG CTA ACT CAG-3' (서열 확인 번호:19)인 반면, L 사슬 역방향 PCR 프라이머(734)의 서열은 5'-AC AGT TGG TGC AGC ATC AGC-3' (서열 확인 번호:20)을 사용하였다. 이 역방향 프라이머는 마우스 카파 L 사슬의 아미노산 잔기 109-115에 해당한다. H 사슬 정방향 PCR 프라이머(998)의 서열은 5'-ACC CCT GTG GCA AAA GCC GAA GTG CAG CTG GTG GAG-3'(서열 확인 번호:21)이었다. H 사슬 역방향 PCR 프라이머 (733)은 5'-GA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3' (서열 확인 번호:22)이었다. PCR 프라이머는 또한 면역발현 벡터 내의 특이적인 서열과 상동성이 있는 영역을 포함한다.
VL및 VH사슬을 2ml의 cDNA-RNA 이형 이중나선, 66.6mM의 Tris-HCl pH 8.8, 1.5mM MgCl2, 4종의 dNTPs 각각 0.2mM, 10mM의 2-멀캅토에탄올, 0.25 단위의 Taq 중합효소(인디애나주 인디애나폴리스 소재 베링거만하임 (Boehringer-Mannheim)) 및 프라이머 997 및 734 및 998 및 733 각각 50pmole을 함유한 2개의 별개의 50ml의 반응 혼합물 중에서 증폭하였다. 혼합물 위에 미네랄 오일로 중층하고, 각 사이클이 94℃(변성)에서 30초, 50℃(어닐링)에서 30초, 및 72℃(합성)에서 30초로 이루어지는 2회 사이클의 PCR을 수행하였다. 반응 후 즉시 각 사이클이 94℃(변성)에서 30초, 55℃(어닐링)에서 30초, 및 72℃(합성)에서 30초로 이루어지는 30회 사이클의 PCR을 한 후, 72℃에서 5분간 마지막 합성 반응을 하였다. 반응 생성물을 모으고, CHCl3로 추출하고, 에탄올로 침전하였다
증폭된 생성물을 20ml의 TE 완충 용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 중에 재현탁하고, 5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. VH및 VL예상 분자량으로 이동하는 밴드를 잘라내고, 겔 슬라이스로부터 화학적으로 용리해내고, 유기 용매로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다.
증폭된 VH및 VL유전자의 M13 파지 면역 발현 벡터로의 클로닝: 증폭된 V 영역 유전자 생성물을 이어서 혼성화 돌연변이 발생에 의해 파지 면역발현 벡터 중에 클로닝하였다(Near, R. Biotechniques 12:88 (1992); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2003 (1995)). 혼성화 돌연변이 발생에 의한 증폭된 VL및 VH서열의 도입은 효율적인 Fab 발현에 필요한 M13 벡터에 포함된 조절 인자와 항체 서열을 프레임에 맞게 배열한다. 이 기술의 한 가지 장점은 통상의 DNA 연결(ligation)방법으로 행하는 경우처럼 클로닝을 위한 VL또는 VH유전자 서열 중으로 어떠한 제한 효소 자리도 도입될 필요가 없다는 것이다.
클로닝을 수행하기 위해, 이중 가닥의 증폭된 생성물 각각 400ng을 폴리뉴클레오티드 키나제로 먼저 인산화하였다. 인산화된 LM609 VL생성물 100ng을 250ng의 우리디닐화된 BS11 파지 면역발현 벡터와 혼합하고, 90℃에서 변성화시키고, 실온으로 조금씩 냉각하여 어닐링하였다. BS11은 M13 IX로부터 유래한 M13 면역 발현 벡터이고, 쥐 IgG1의 CH1및 쥐 카파 L 사슬의 불변 도메인(Huse, W. D., Antibody Engineering: A Practical Guide, C. A. K. Borrebaeck, ed. W. H. Freeman and Co., Publishers, New York, pp. 103-120(1991))을 코딩한다. PCR 증폭 프라이머 내에 포함된 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥 BS11 벡터 내에 존재하는 상보 서열에 어닐링한다. 어닐링된 혼합물을 T4 DNA 중합효소 + dNTPs에 의해 이중 가닥 분자로 완전히 전환하고, T4 리가아제로 연결하였다. 1ml의 돌연변이 발생 반응물을 이 콜리 균주 DH10B 중으로 전기천공하고, 이 콜리 XL-1의 런(lawn) 위에서 역가를 측정하고, 플라크(plaque)가 형성될 때까지 배양하였다. 플라크 리프트(lift) 분석을 알칼리성 포스파타아제에 접합된 염소 항-쥐 카파 사슬 항체를 사용하여 문헌[Yelton et al., 상기 참조; Huse, W.D., 상기 참조]에 기술된 대로 수행하였다. 15개의 쥐 L 사슬 양성 M13 파지 클론을 단리하고 모으고, PCR 증폭시킨 LM609 VH생성물에 의한 혼성화 돌연변이 발생을 위한 주형으로 사용하기 위한 우리디닐화된 벡터를 제조하는 데 사용하였다.
기능적 쥐 LM609 Fab을 발현하는 클론을 ELISA에 의해 정제된 αVβ3대한 결합으로 확인하였다. 간단히 설명하면, 이뮬론(Immulon) II ELISA 플레이트를 1mg/ml(100ng/웰)의 αVβ3로 밤새 코팅하고, 비특이적 부위를 27℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 가용성 Fab를 Fab를 발현하는 M13 파지 클론으로 감염된 이 콜리 균주 MK30-3(베링거 만하임사) 배양물의 원형질막 분획을 단리하여 제조하였다.원형질막 분획을 100mM NaCl, 50mM Tris pH 7.4, 2mM CaCL2, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 0.02% NaN3, 1mg/ml BSA을 함유하는 결합 완충 용액과 섞고, 고정화된 αVβ3로 27℃에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 결합 완충 용액으로 세척하고, 결합된 Fab를 알칼리성 포스파타아제에 접합된 염소 항-쥐 카파 사슬 항체로 탐지하였다. 4개의 αVβ3반응성 클론을 확인하였다: muLM609M13 12, 29, 31 및 69. MuLM609M13 12 및 29는 ELISA 분석에서 가장 강한 시그날을 나타냈다. DNA 서열 분석은 muLM609M13 12, 31 및 69 클론이 모두 동일한 L 사슬 서열을 갖는다는 것을 나타냈으며, 이전에 확인된 LM609 L 사슬 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열을 확인하였다. 4개의 클론 모두가 동일한 VHDNA 서열을 가지며, 또한 이전에 확인된 LM609 H 사슬 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열을 확인하였다.
각각의 클론의 결합 활성을 추가로 특성 분석하기 위해, 가용성 Fab 분획을 클론 12 및 29로 감염된 이 콜리 균주 MK30-3의 50ml 배양물로부터 제조하고, LM609 IgG를 사용한 경쟁적 ELISA에서 αVβ3에 대한 결합을 평가하였다. 이 ELISA의 결과를 도 3에 나타냈다. 클론 muLM609M13 12는 순수상태에서 1:80까지의 원형질막 역가에서 농도 의존 방식으로 LM609 IgG(LM609 IgG 농도 1ng/ml 및 5ng/ml)의 αVβ3에 대한 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 클론 muLM609M13 12를 플라크에서 정제하고 V 영역의 H 사슬 및 L 사슬의 두 DNA 서열을 결정하였다. 최종 클론 muLM609M13 12-5의 완전한 DNA 서열을 도 2A 및 2B에 나타냈다.
실시예 II
이식 LM609 기능적 단편 비탁신의 제조
항체를 이식하는 한 가지 목적은 비인간 CDRs을 인간 항체 프레임워크 중에 치환할 때 항체 특이성 및 친화도를 보존하기 위해서이다. 다른 목적은 인간 숙주에서 생길 수 있는 항원성을 감소시키기 위해 외래 아미노산 서열의 도입을 최소화하기 위해서이다. 이 실시예는 목적하는 항원에 대해 가장 높은 친화도를 나타내는 모든 가능한 멤버를 나타내는 이식된 항체의 라이브러리를 제조하여 이러한 두 목적을 달성하는 방법을 기술한다.
상기 라이브러리는 코돈에 기초한 돌연변이 발생을 이용하여 가능한 CDR 및 프레임워크(framework)에 변화가 도입된 이 콜리에서 제조하였다(Kristensson et al., :Vaccines 95. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY (1995); Rosok et al., J. Biol. Chem. (271:22611-22613(1996)). 이들 방법을 사용하여, 라이브러리를 제조하고 기능적으로 활성이 있는 인간화된 항-αVβ3-억제 항체를 확인하였다.
LM609의 한 이식 형태를 제조하기 위해, LM609 CDRs을 수용하기 위해 쥐 LM609 V 영역 유전자 서열과 가장 높은 동일성을 보이는 인간 프레임워크 서열을 선택하였다. 인간 H 사슬 V 영역 M72 'CL(HHC30Q, HC 서브그룹 3, Kabat et al., 상기 참조)는 LM609 H 사슬의 프레임워크 1, 2 및 3과 88%의 동일성을 가지며, 인간 L 사슬 V 영역 LS1 'CL(HKL312, 카파 서브그룹 3, Kabat et al., 상기 참조)는 LM609 L 사슬의 프레임워크 1,2 및 3과 79%의 동일성을 가진다. 쥐 LM609 CDR 서열을 카바트(Kabat) 등에 의해 확인된 것과 같이 (상기 참조) 인간 프레임워크 중으로 이식하였다. 가능한 변화를 계획할 때에, 구조에 영향을 주고 따라서 원래 쥐의 결합 부위의 결합 성질에 영향을 주는 묻혀질 것으로 예상되는 잔기들을 고려했다. (Singer et al., 상기 참조; Padlan, E.A. Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)). 결합 부위의 특이성 및 친화도를 보존하기 위해 중요한 것으로 여겨지는 프레임워크 잔기의 분석은 아주 작은 차이만을 드러냈다. 예를 들어, H 사슬 서열에서, 예상되는 묻혀진 잔기는 100%의 동일성을 나타냈다. 특히 주의할 점은 인간 H 사슬 V 영역 M72 'CL의 Arg16이 인간 사슬 중에서 상대적으로 특이한 잔기라는 점이다. 그러나, 이 잔기는 또한 LM609 VH에도 존재하는 것이 밝혀졌으며, 따라서 이를 유지하였다. 유사하게, LM609 중의 Arg19는 쥐 H 사슬 중에서는 상대적으로 드문 잔기이지만 M72 'CL에서는 나타난다는 것이 밝혀졌으며, 따라서 이를 유지하였다. L 사슬 서열 중에서, 두 개의 동일하지 않은 묻혀진 잔기가 LM609 및 LS1 'CL 프레임워크 영역 사이의 위치 49 및 위치 87에서 확인되었다. 이들 두 위치는 따라서 인간 및 쥐 양쪽 모두의 대체물로서 이식된 항체 라이브러리 중으로 도입하였다.
전장 이식 V 영역 유전자를 중첩하는 긴 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR에 의해 합성하였다. 위치 49 및 87에서 혼합된 아미노산 잔기를 함유하는 L 사슬올리고뉴클레오티드를 문헌[Glaser et al., J. Immunol. 149:3903-3913(1992)]에 기술된 대로 합성하고, VL올리고3 및 VL올리고4(각각 서열 확인 번호 16 및 서열 확인 번호 17)로 표시된 올리고뉴클레오티드로 나타내었다. 긴 올리고뉴클레오티드를 전부 겔에서 정제하였다.
어닐링 PCR 프라이머 존재 중에 5종의 중첩하는 올리고뉴클레오티드를 동몰농도로 혼합하여 이식 LM609 H 및 L 사슬 V 영역을 제조하였다. H 사슬 올리고뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드 위치에 맵핑된다: VH올리고뉴클레오티드 1 (VH올리고 1), 뉴클레오티드 (nt) 1-84; (서열 확인 번호 9); VH올리고 2, nt 70-153, (서열 확인 번호 10); VH올리고 3, nt 138-225 (서열 확인 번호 11), VH올리고 4, nt 211-291 (서열 확인 번호 12); VH올리고 5, nt 277-351(서열 확인 번호 13).
유사하게, 비탁신 L 사슬 올리고뉴클레오티드는 하기 위치에 맵핑된다: VL올리고뉴클레오티드 1 (VL올리고 1), 뉴클레오티드 (nt) 1-87; (서열 확인 번호 14); VL올리고 2, nt 73-144, (서열 확인 번호 15); VL올리고 3, nt 130-213 (서열 확인 번호 16), VH올리고 4, nt 199-279 (서열 확인 번호 17); VH올리고 5, nt 265-321(서열 확인 번호 18). 이식된 LM609 H 및 L 사슬 가변 영역을 제조하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 도 6에 나타내었다. VL올리고 3 , 및 VL올리고 4 내의 코돈 위치 49 및 87는 랜덤화된 코돈을 나타낸다. 어닐링 프라이머는 증폭된 V 영역 생성물의 단일 가닥 벡터에 대한 효율적인 어닐링을 위해 벡터 서열에 대해 상보적인 18개 이상의 뉴클레오티드 잔기를 함유한다. 어닐링된 혼합물을 T4 DNA 중합효소 + dNTPs에 의해 이중 가닥 분자로 완전히 전환시키고, T4 리가아제에 의해 연결되었다.
라이브러리를 생성하기 위해, 돌연변이 발생 반응물의 일부 (1㎕)를 이 콜리 균주 DH10B(BRL) 중으로 전기침공하고, XL-1(스트라타진 인크(Stratagene, Inc.))론 상에서 역가를 측정하고, 플라크가 생성될 때까지 배양하였다. 레플리카(Replica) 필터 리프트를 제조하고, VH유전자 서열을 함유하는 플라크를 LM609 H 서열 CDR 2 서열에 대해 상보적인 디곡시게닌-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한 혼성화 또는 벡터 CH1도메인의 C-말단에 첨부된 데카펩티드 서열 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser (서열 확인 번호 28)에 대해 생성된 모노클로날 항체인 7F11-알칼라인 포스파타아제의 접합체(캘리포니아주 샌디에고 소재 바이오사이트 인크 (Biosite, Inc.))와의 반응성 중 하나에 의해 스크리닝하였다. 이중 양성인 50개의 클론을 모으고 증폭된 이식된 LM609 VL생성물로 혼성화 돌연변이 발생 위한 우리디닐화된 주형을 제조하는 데 사용하였다.
표 6: 이식된 LM609 H 및 L 사슬 가변 영역을 제조하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드
VL올리고뉴클레오티드 1 내지 5(각각 서열 확인 번호: 14 내지 18)를 사용하였다는 것을 제외하곤, 상기에서 기술된 대로 VH올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이 발생 반응을 수행하였다. 반응물을 이 콜리 균주 DH10B 중으로 전기침공하고, 탐지를 위해 알칼라인 포스파타아제에 접합된 토끼 항-염소 2차 시약을 사용하여 알칼라인 포스파타아제에 접합된 염소 항-인간 카파 사슬 항체 또는 염소 항-인간 Fab 항체 중 하나로 필터 리프트를 프로브하였다. VH및 VL유전자 서열 양쪽 모두를 동시 발현하는 양성 클론(총 160개)을 선택하고, 가용성 Fab 단편을 제조하기 위해 이 콜리 균주 MK30-3을 감염시키는 데 사용하였다.
가용성 Fab 단편을 ELISA 분석에서 αVβ3에 대한 결합에 대해 스크린하였다. ELISA에서 αVβ3에 대해 강한 결합을 보인 4개의 클론을 동정하고 추가로 특성 분석하였다. 이들 클론을 huLM609M13-34, 54, 55 및 145로 명명하였다. 4개 모두의 클론을 플라크에서 정제하고 각각의 클론으로부터의 3개의 독립적인 서브클론을 ELISA에 의한 αVβ3에 대한 추가적인 결합 분석을 위해 Fab 단편을 제조하는 데 사용하였다.
이 추가 ELISA에서, 플레이트를 두 판씩 αVβ3리간드로 코팅하고, huLM609 원형질막 샘플과 함께 배양하였다. 한 플레이트에서는 결합된 huLM609 Fab를 알칼라인 포스파타아제에 접합된 염소 항-인간 카파 사슬 항체로 탐지하고, 다른 플레이트에서는 결합된 huLM609 Fab를 데카펩티드 태그를 인지하는 모노클로날 항체, 7F11-알칼라인 포스파타아제 접합체로 탐지하였다. 서브클론 huLM609M13-34-1, 2 및 3 및 huLM609M13-145-1, 2 및 3 모두는 Fab가 기능적 VH및 VL폴리펩티드를 포함하고 있음을 나타내는 이중 양성 시그날을 나타냈다. 이들 결과는 인테그린 αVβ3을 발현하는 세포주인 M21 상에서의 ELISA 분석에서 확인되었다.
서브클론 huLM609M13-34-3 및 huLM60913-145-3의 DNA 서열 분석은 올리고뉴클레오티드 합성에 기인한 에러 또는 PCR 증폭 중 발생하는 에러에 의해 라이브러리에 도입된 돌연변이를 밝혔다. 이들 돌연변이는 클론 huLM609M13-34-3에서 위치 지정 돌연변이에 의해 수정되었다. L 사슬 서열에서 다음과 같이 수정하였다 :His 36을 Tyr 36으로, Lys18을 Arg18로. H 사슬 서열에서 다음과 같이 수정하였다 : Glu1을 Gln1으로, Asn3을 Gln3으로, Leu11을 Val11로. 추가로, LM609 이식된 분자의 제조 중, H 사슬의 잔기 28은 중요하지 않은 프레임워크 잔기로 생각되었고, 인간 잔기 (Thr 28)을 유지하였다. 그러나, 이어서 잔기 28이 CDR의 일부인 것으로 생각될 수 있는 것으로 판단되었다. 따라서, 잔기 28을 올리고뉴클레오티드 5'-GCT ACT GAA GGC GAA TCC AGA G-3'(서열 확인 번호 29)을 사용하여 위치 지정 돌연변이 발생을 사용하여 그 위치 (Ala28)에서 상응하는 쥐의 잔기로 바꾸었다. 이후, 이 변화는 이 위치에서의 인간 프레임워크 쓰레오닌에 비해 장점을 제공하지 않는 것으로 판단되었고, 쓰레오닌을 유지하였다. 최종 이식 LM609 클론을 huLM609M13 1135-4로 표시하고, 본원에서 비탁신이라 명명하였다. 클론 비탁신의 DNA 서열을 도 2A 및 2B에 나타내었다.
실시예 III
비탁신의 기능적 특성 분석
이 실시예는 다수의 시험관내 결합 및 세포 유착 분석에서의 비탁신의 결합 특이성, 친화도 및 기능적 활성의 특성 분석을 나타낸다.
인테그린 αVβ3에 대한 비탁신의 결합 특이성을 처음에는 αVβ3에 대한 결합 및 다른 αV- 또는 β3-함유 인테그린에 대한 교차반응성을 측정하여 평가하였다. 특히, 결합 특이성을 혈소판에서 발현되는 주 인테그린인 αIIbβ3및 내피세포 및 결합 조직 세포 유형에서 우세한 것으로 발견된 인테그린인 αVβ5에 대한 결합을 측정하여 평가하였다.
간단히 설명하면, 교차반응성을 측정하기 위해, 인테그린을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 순차적인 항체 희석액에 대해 αVβ3및 다른 인테그린에 대한 비탁신 결합 활성을 측정하였다. 인테그린 αVβ3및 αVβ5을 체레시(Cheresh, 1987; 상기 참조) 및 체레시 및 스피로(Spiro) (1987, 상기 참조)에 의해 기술된 대로 친화성 크로마토그래피로 단리하였다. αVβ3을 칼바이오켐(CalBiochem)으로부터 구입하였다. 간단히 설명하면, 옥틸글리코사이드 인간 태반 용해물로부터 αVβ3을 단리하기 위해 LM609 친화성 칼럼(체레시 및 스피로, 1987, 상기 참조)를 사용한 반면, αVβ3-결핍 칼럼 유액으로부터 αVβ5을 단리하기 위해 항-αV친화성 칼럼을 사용하였다. 염소 항-인간 알칼라인 포스파타아제 접합체를 사용하여 ELISA로부터 항체 결합 활성을 측정하였다. 비탁신이 인간 IgG1골격을 포함하므로 정제된 인간 IgG1항체를 대조구로 사용하였다.
이 분석의 결과를 도 4A에 나타내었으며, 이는 비탁신이 αVβ3에 높은 친화도로 특이적으로 결합된다는 것을 밝혔다. 1.0mg/ml를 넘는 항체 농도에서 αV- 또는 β3-함유 인테그린에 대해 탐지될만한 결합이 없었다.
일련의 추가 결합 연구에서, 결합 친화도 및 특이성을 αVβ3에 대한 부모형 LM609 항체를 사용한 경쟁적 결합 분석에서 평가하였다. 경쟁적 결합을 상기에서 기술된 대로 LM609를 표지된 항체로 사용하여 ELISA 분석에서 측정하였다. LM609의 결합을 비탁신 경쟁제 농도를 점차 증가시키면서 측정하였다. 별법으로, 대조구 경쟁제 항체는 또 인간 IgG1이었다.
이 경쟁 결과를 도 4B에 나타내었으며, 이는 0.1㎍/ml를 넘는 비탁신 농도에서 LM609 결합의 특이적 억제가 관찰될 수 있음을 보여준다. 100㎍/ml를 넘는 비탁신 농도에서 거의 완전한 억제가 관찰된다. 이 수준의 경쟁적 억제는 부모형 모노클로날 항체 LM609 및 이식 형태의 비탁신이 실질적으로 동일한 특이성을 나타낸다는 것을 나타낸다.
또한 결합 친화성 및 특이성을 피브리노겐에 대한 αVβ3결합에 대한 비탁신의 억제 활성을 측정함으로써 평가하였다. 이들 연구를 위해, αVβ3를 비탁신/αVβ3결합 연구를 위해 상기에서 기술된 대로 ELISA 플레이트 상에 플레이팅하였다. 비탁신 또는 대조구 항체 농도를 증가시키면서 결합된 바이오티닐화된 피브리노겐의 양을 측정함으로써 비탁신의 억제 활성을 결정하였다. 간단히 설명하면, 피브리노겐을 칼바이오켐으로부터 구입하고, 제조자(피어스 라이프 사이언스 및 어낼리티칼 리서치 (Pierce Life Scienece and Analytical Research))에 의해 기술된 대로 N-히드록시숙신이미도바이오틴으로 바이오티닐화하였다.
이 분석의 결과를 도 4C에 나타내었으며, 이는 약 0.1㎍/ml을 넘는 비탁신 농도에서 특이적 결합 억제가 있음을 보여준다. 이들 결과는, αVβ3에 대한 비탁신의 특이적 결합 및 LM609의 경쟁적 억제를 보여주는 상기 결과들과 함께 비탁신이 부모형 모노클로날 항체 LM609가 나타내는 모든 결합 특성들 및 특이성을 실질적으로 유지한다는 것을 입증한다. 시험관내 결합 분석에 기초하여 이들 결론을 확증하는 추가의 기능 연구들을 하기한다.
비탁신 결합의 특이성을 추가로 평가하기 위해 추가적인 기능 연구들을 실행하였다. 이들 연구는 세포 유착 분석에서 인테그린 αVβ3결합의 억제에 관한 것이다. 내피 세포 유착 사건은 혈관생성 과정에서 중요한 구성 요소이고, αVβ3의 억제는 종양의 혈관신생을 감소시키며, 이로써 종양 성장률을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이들 분석에서 αVβ3매개성 세포 부착의 비탁신에 의한 억제는 이 항체가 제자리(in situ) 또는 생체내(in vivo)에서 사용될 때 예상되는 억제 활성의 표지이다.
간단히 설명하면,10% FBS를 함유한 RPMI에서 성장한 αVβ3-양성인 M21 흑색종 세포를 이들 세포 결합 분석에 사용하였다. 트립신 처리하여 세포를 배양 접시로부터 유리시키고 4 ×105세포/ml 농도로 유착 완충용액 중에 재현탁시켰다 (하기 참조). 비탁신, LM609 또는 정제된 인간 IgG1(대조구 항체)를 250㎕의 유착 완충용액(pH 7.4의 헤페스 완충 염수 중의 10mM 헤페스, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 0.2 mM MnCl2, 및 1% BSA) 중에 목적하는 농도로 희석하고, 피브리노겐으로 사전에 코팅된 48-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 피브리노겐을 상기에서 기술한 대로 단리하였다. 각각의 웰을 10㎍/ml 농도의 피브리노겐 200㎕으로 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 이 분석을 위해, 비탁신, LM609 또는 이소타입(isotype) 매칭된 대조구 항체를 함유한 같은 부피(250㎕)의 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 부드럽게 교반하여 혼합하고, 37℃에서 20분 동안 배양하였다. BSA 만으로 코팅된 대조구 웰에서 세포가 하나도 남아있지 않을 때까지 유착 완충용액으로 세척하여 결합하지 않은 세포를 제거하였다. 결합된 세포를 크리스탈바이올렛으로 염색하여 가시화하고, 100㎕의 아세트산 (10%)로 추출하고, 560nm에서 용해된 염료의 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
이 분석의 결과를 도 5A에 나타내었고, 이는 비탁신 및 부모형 항체 LM609 양자가 동일한 농도 범위에 걸쳐 M21 세포의 유착을 억제한다는 것을 밝혔다. 50% 최대 유착에 대한 억제 농도는 약 50ng/ml로 계산되었다. 비탁신의 특이성은 대조구 IgG1항체에서 관찰되는 억제가 결핍된 것으로 나타났다.
상기 세포 유착 결과에 더해, 또한 비탁신의 억제 활성을 내피 세포 이동 분석에서 시험하였다. 이러한 면에서, 비탁신이 내피 세포 이동을 억제하는 능력을 평가하기 위해 트랜스웰 세포 이동 분석을 사용하였다 (Choi et al., J. Vascular Surg., 19:125-134 (1994) 및 Leavesly et al., J. Cell Biol, 121:163-170(1993)).
간단히 설명하면, 대수기 및 낮은 계대수의 인간 제대(臍帶) 정맥 내피 세포를 부드럽게 트립신화하여 수거하고, 세척하고 2×106세포/ml의 농도, 37℃에서 1% BSA를 함유한 HBS (20mM HEPES, 150mM NaCl, 1.8mM CaCl2, 1.8mM MgCl2, 5mM KCl, 및 5mM 포도당, pH 7.4)에 재현탁하였다. 항체(비탁신, LM609, 및 IgG1대조구)를 스톡(stock) 용액에서 10㎍/ml로 희석하였다. 항체를 세포에 1:1 희석비로 첨가하고 (항체 최종 농도 = 5㎍/ml; 세포 최종 농도 =1×106세포/ml), 얼음에서 10-30분간 배양하였다. 이후, 세포/항체 현탁액 (각 구획에 200㎕씩)을 트랜스웰 세포 배양 챔버(코닝 코스타(Cornign Costar)사)의 상부 구획에 첨가하고, 하부 구획을 0.5ml의 10㎍/ml 비트로넥틴(HBS 중)로 코팅하였다. 비트로넥틴은 내피 세포에 대한 화학적 유인제로 작용한다. 챔버를 37℃에서 4시간 동안 방치하여 세포 이동이 일어나도록 하였다.
먼저 면봉으로 상부 구획에 남아 있는 세포를 제거하여 세포 이동을 가시화하였다. 인서트의 하부로 이동한 세포를 크리스탈바이올렛으로 30분간 염색한 후, 아세트산 중에 가용화하고, 염료의 흡광도를 550nm 파장에서 측정하였다. 흡광량은 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동한 세포 수에 정비례하였다. 분석의 결과를 도 7B에 나타내었다. 비탁신 및 부모형 항체 LM609는 실질적으로 동일한 억제 결과를 나타내었다. 특히, 비탁신 및 LM609는 IgG1대조구 및 억제제를 포함하지 않은 세포에 비해 비트로넥틴에 의해 유도되는 내피 세포의 이동을 약 60% 억제하였다.
실시예 IV
동물 모델에서 비탁신 매개된 α V β 3 의 억제
이 실시예는 두 종의 동물 모델에서 비탁신에 의한 종양 성장의 억제를 기술한다. 종양 성장은 최소한 αVβ3매개된 혈관신생을 비탁신으로 억제함으로써 억제된다.
첫번째 모델은 병아리 융모요막 (CAM) 중에서의 혈관생성을 측정한다. 이 분석은 전체 조직의 혈관신생이 일어나기 때문에 생체내 혈관생성의 모델로 잘 알려져 있다. 특히, 이 분석은 성장 인자가 주입된 필터 디스크를 향해 또는 CAM 상에서 성장하는 조직 중으로 성장하는 병아리 CAM 혈관의 성장 인자에 의해 유도된 혈관생성을 측정한다. 혈관신생의 억제는 새로운 혈관 성장의 양 또는 정도 또는 CAM 상에서 조직 성장의 억제에 기초한다. 분석은 다른 이들에 의해 상세히 기술되어 왔으며, 암 조직의 혈관신생은 물론 혈관신생을 측정하는 데 사용되어왔다 (Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597-618 (1975); Ossonski et al. Cancer Res., 40:2300-2309 (1980); Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994a) 및 Brooks et al., Cell, 79:1157-1164(1994b)).
간단히 설명하면, 성장 인자에 의해 유도되는 혈관신생을 위해 #1 와트만 퀄러터티브 서클(Whatman Qualitative Circles)로부터의 필터 디스크를 피부 생검 펀치를 사용하여 펀칭하였다. 먼저 디스크를 UV 광에 노출시켜 멸균한 후, 멸균 조건 하에서 음성 대조구로 다양한 농도의 TNF-α또는 HBSS로 침윤시켰다(최소 1시간 이상). 침윤된 필터 디스크를 CAM위에 올려 놓아 혈관생성을 유도하였다.
다양한 양의 비탁신 및 대조구(항체 또는 정제된 인간 IgG1)를 사용하여 배아를 처리하여 혈관생성의 억제를 수행하였다. 디스크를 놓은 후 약 24시간 후 정맥내 주사하여 처리를 수행하였다. 48시간 후, CAM을 절단하고, 혈관생성을 1-4의 스케일로 평가하였다. CAM 제조에서 조직 손상에 대한 반응으로 일어날 수 있는 혈관생성을 나타내는 HBSS 침윤된 필터 디스크를 음성 대조구로 사용하였으며, 이들 CAM에 대한 값을 백그라운드로 감하였다. 비탁신이 인간 IgG1 서브클래스이므로, 정제된 인간 IgG1을 주사에 대한 음성 대조구로 사용하였다. 비탁신은 투여량 의존 방식으로 TNF-α에 의해 유도되는 혈관생성을 억제하는 것으로 나타났다. 최대 억제는 300㎕의 비탁신의 1회 투여로 일어났으며, 인간 IgG1대조구에 비해 80%를 넘는 억제를 일으켰다.
성장 인자에 의해 유도되는 혈관신생을 사용한 상기에서 기술된 CAM 분석과 아울러, 종양에 의해 유도되는 혈관신생을 이용하여 추가 연구를 수행하였다. 이들 분석을 위해, CAM 중으로 αVβ3음성 종양 단편을 이식하여 혈관생성을 유도하였다. αVβ3음성 종양 단편의 사용은 어떠한 종양 성장의 억제도 CAM에 의해 유도되는 내피 세포에 의한 αVβ3매개 혈관신생의 억제에 의한 것이고, 종양 세포에존재하는 αVβ3에 의해 매개되는 유착 사건에 의한 것이 아님을 보증한다.
FG (8×106세포, 췌장암) 및 HEp-3 세포(5×105세포, 후두암)의 단일 세포 현탁액을 30㎕ 중의 CAM 상에 놓아 종양 성장의 억제를 평가하였다. 1주일 후, 종양을 제거하고, 약 50mg의 단편으로 절단하고, 이 때 이들을 새 CAM 위에 놓았다. 두 번째 정치 24시간 후, 비탁신 또는 음성 대조구인 인간 IgG1을 정맥내로 배아에 주사하였다. 약 7일 동안 종양이 성장하도록 한 후, 이들을 잘라내고 무게를 달았다.
종양의 혈관신생 상에서 비탁신 처리의 결과를 도 6A에 나타내었다. 데이타는 종양 무게의 평균 변화값으로 나타냈으며, 이는 비탁신이 FG 및 HEp-3 종양 단편과 같은 αVβ3음성 종양의 성장을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 보다 구체적으로, 비탁신 처리된 FG 종양 단편의 평균 무게 변화는 -5.38의 인 반면, 비탁신 처리된 HEp-3 종양의 평균 무게 변화는 -11.0로 관찰찰되었다. IgG1대조구는 FG 및 HEp-3 종양 단편에 대해 각각 25.29 및 28.5의 양의 평균 무게 변화를 나타내었다. 이들 결과는 1회의 정맥내 주사 후 얻었다.
두 번째 동물 모델에서, 토끼 V×2 암 세포의 억제를 종양에 대한 비탁신의 억제 효과 척도로 사용하였다. V×2 암은 쇼프(Shope) 바이러스 유도된 유두종으로부터 유래한 이식가능한 암이다. 이는 1940년대에 최초로 기술되었으며, 이후 종양 침범, 종양-숙주 상호 작용 및 혈관생성에 대한 연구에서 광범위하게 사용되었다. V×2 암은 본래 섬유증이며, 상당히 공격성이 있으며, 퇴행성 유형 암의 특징을 나타낸다. V×2 암의 증식은 공여체 토끼에서 연속적 이식을 통해 달성된다. 피하 이식 후, 초기 염증 반응 후 숙주 회복 기작이 2 내지 4일 사이에 시작된다는 것이 보고되었다. 이 회복 기작은 새로운 연결 조직의 형성 및 새로운 모세혈관의 생성이라는 특징이 있다. 새로 형성된 모세혈관은 4일째 되는 날에는 회복 대역에 한정되지만, 8일째 되는 날 이들은 종양 외부 영역으로 뻗어 나간다. 이들 특징 및 토끼에서 비탁신의 약물 동태학은 이들 실험에서의 최초 투여량 및 처리 스케줄을 결정하는 데 사용되었다. 1, 5 및 10mg/kg으로 투여된 동물 혈청 내에서 비탁신의 제거 반감기는 각각 38.9, 60.3 및 52.1 시간으로 밝혀졌다.
상기 동물 모델에서 V×2 암이 피하로 이식된 토끼에서 일차 종양 성장에 대한 초기 투여 후 비탁신의 영향을 연구하기 위해 V×2 종양의 성장이 사용되었다. 간단히 설명하면,V×2 종양(50mg)을 피부 및 근육 사이의 절개부를 통해 토끼대퇴부 내로 이식하였다. 25일간에 걸친 시험을 통해 일차 종얄을 측정하였다. 이식 28일 후, 동물을 희생시키고 종양을 절개해 내고 무게를 달았다. 28일째, 종양은 그 모양에 있어서 극도로 불규칙하게 되었으며, 그 결과, 측정은 어려워졌고, 종양 부피를 반영하지 못했다. 따라서, 25일간에 걸친 측정만 평가하였다.
첫번째 연구에서, 토끼를 종양 이식 1일 후 시작하여, 28일 동안 4일마다 총 7회, 5 및 1mg/kg의 비탁신으로 처리하였다. 두 그룹에서, 종양 성장의 억제가 관찰되었다. 두번째 연구에서, 토끼를 종양 이식 7일 후 시작하여 상기에서 기술된 대로 총 5회 처리하였다. 종양 성장의 억제가 또한 관측되었다.
반복 투여 처리로 토끼에 이식 항체를 투여하는 것은 비탁신에 대해 중화 효과를 가질 수 있는 면역 반응을 일으키며, 따라서 잠재적으로 효율성을 감한다. 예비 데이타는 약 25-50%의 동물이 이러한 반응을 일으킨다는 것을 암시한다.
상기에서 기술된 비탁신 처리 각각의 결과는 도 6B 및 6C에 나타낸다. 1일째 되는 날 처리 받은 토끼에서, PBS 처리된 대조구에 비해 1mg/kg 및 5mg/kg의 투여군 양쪽에서 종양 성장의 억제가 관측되었다. 특히, 평균 종양 무게로 측정할 때, 각각 약 67% 및 80%의 성장 억제가 관찰되었다. 이식 후 7일째 되는 날 비탁신 처리가 시작된 동물에서는 그보다 약한 정도의 억제가 관찰되었다. 이들 결과를 도 6C에 나타내었다. 모든 경우에서, 0.2mg/kg 미만의 비탁신 농도에서는 종양 성장의 억제가 나타나지 않았다.
실시예 V
LM609 이식된 기능적 항체 단편의 제조
이 실시예는 LM609 공여체 항체로부터 인간 수용체 프레임워크로 CDR만이 전달된 기능적인 LM609 이식 항체 단편의 제조를 보여준다.
기능적 항체 단편을 제조하기 위한 LM609의 CDR 이식은 하기에서 기술된 방법에 의해 달성되었다. 이들 방법은 공여체 항체로부터의 CDR 이외의 아미노산 잔기는 최종 이식 생성물에서 요구되지 않는 실질적으로 어떠한 공여체 항체의 CDR 이식에도 적용된다.
간단히 설명하면, LM609 항체의 단백질 서열은 실시예 I에서 기술된 대로 H및 L 사슬의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 코딩하고 시퀀싱하여 결정된다. LM609 공여체 항체로부터의 CDR을 확인하고 인간 수용체 프레임워크의 상동성이 있는 인간 가변 영역 중으로 이식하였다. CDR 영역의 확인은 카바트 (Kabat) 등 및 맥칼럼 (MacCallum) 등에 의해 공개된 정의의 조합에 기초한다.
CDR 영역의 경계는 상기 두 문헌에 의해 누적적으로 정의되었고 30-35, 47-66 ALC 97-106 잔기가 각각 H 사슬 가변 영역의 CDR 1, 2 및 3이며 24-36, 46-56 및 89-97 잔기가 각각 L 사슬 가변 영역의 CDR 1, 2 및 3이다. 카바트 등에 의해 정의된 것과 같은 CDR 이외의 이들 경계 내에서 동일하지 않은 공여 잔기를 확인하였으며 수용체 프레임워크 중으로 치환하지 않았다. 그 대신, 기능적 비공여 아미노산 잔기를 확인하고, 이들 동일하지 않은 잔기의 일부 대신 치환하였다.
하기에서 기술된 것과 같이, 상기에서 정의된 것과 같은 CDR 내를 제외한 카바트 등에 의해 정의된 CDR 이외에서의 동일하지 않은 유일한 잔기는 LM609 L 사슬의 위치 49이다. 이 위치에서 기능적인 비공여 아미노산을 확인하기 위해, 위치 49의 모든 비공여 아미노산을 함유하는 항체 19개의 라이브러리를 제조한 후 αVβ3에 대한 결합 활성을 스크린하였다.
이뮤노로지칼 인터레스트 데이타베이스(Immunological Interest database) (5판)의 브루크하벤 프로틴 데이타 뱅크-카바트 시퀀스(Brookhaven Protein Data Bank-Kabat Sequences)로부터 면역 글로블린 서열을 확인하였다. LM609 CDR을 공여받기 위해서 쥐 LM609 가변 영역 유전자 서열과 상당한 동일성을 보이는 인간 프레임워크 서열을 선택하였다. 인간 H 사슬 가변 영역 M72 'CL은 LM609 H 사슬의 프레임워크 1,2 및 3과 88%의 동일성을 가지며, 인간 L 사슬 V 영역 LS1 'CL은 LM609 L 사슬의 프레임워크 1, 2 및 3과 79%의 동일성을 가진다. 카바트 등에 의해 정의된 것과 같은 CDR 이외의 동일하지 않은 잔기를 제외하고, 카바트 등 및 맥칼럼 등에 의해 정의된 것과 같은 쥐 LM609 CDR 서열을 인간 프레임워크 상으로 이식하였다. 이 이식 계획을 이용하면, 최종 이식 생성물은 (H 사슬 가변 영역의 CDR 1 잔기 31-35, CDR 2 잔기 50-66 및 CDR 3 잔기 99-106, 및 L 사슬 가변 영역의 CDR 1 잔기 24-34, CDR 2 잔기 50-56 및 CDR 3 잔기 89-97 이외의) 상응 위치의 LM609 아미노산과 동일한, 카바트 증에 의해 정의된 CDR 이외의 아미노산 잔기를 함유하지 않는다. 더욱이, 그 위치에서 LM609 아미노산과 동일한 카바트 등에 의해 정의된 것과 같은 CDR 이외의 아미노산 잔기를 함유한 어떠한 중간체도 생산되지 않는다. CDR 이식 과정은 하기에서 기술한다.
전장 CDR 이식 가변 영역 유전자를 실시예 II에서 앞서 기술한 바와 같이 중첩하는 긴 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 합성하였다. H 사슬 가변 영역 올리고뉴클레오티드는 앞서 서열 확인 번호:9-13으로 기술된 것들이다. 위치 49에서의 종결 코돈과 아울러 CDR 이식 가변 영역을 포함하도록 L 사슬 가변 영역 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. L 사슬 LM609 이식 가변 영역에 대한 5개의 올리고뉴클레오티드는 서열 확인 번호: 23-27로 나타냈으며, 시리즈 중의 두번째 올리고뉴클레오티드는 위치 49에서 종결 코돈을 포함하였다(서열 확인 번호:24). LM609 이식 L 사슬 가변 영역을 제조하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 표 7에 나타내었다.
표 7: LM609 이식 L 사슬 가변 영역을 제조하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드
긴 올리고뉴클레오티드 전부를 겔에서 정제하였다.
단일 가닥 벡터에 대한 증폭된 V 영역 생성물의 효율적인 어닐링을 위해 벡터 서열에 상보적인 18개 이상의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 어닐링 PCR 프라이머 존재 중에, 등몰 농도로 5종의 중첩하는 올리고뉴클레오디트 (서열 확인 번호:9-13)을 혼합하여 LM609 H 사슬 가변 영역의 CDR 이식을 제조하였다. 어닐링된 혼합물은 T4 DNA 중합효소 + dNTPs에 의해 이중 가닥 분자로 완전히 전환시키고, T4 리가아제에 의해 연결시켰다. 돌연변이 발생 반응물(1㎕)를 이 콜리 균주 DH10B(BRL) 중으로 전기침공하고, XL-1(스트라타진 인크)을 깔아놓은 것 위에서 역가를 측정하고, 플라크가 생성될 때까지 배양하였다. 레플리카 필터 리프트를 제조하고, VH유전자 서열을 함유하는 플라크를 LM609 H 서열 CDR 2 서열에 대해 상보적인 디곡시게닌-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한 혼성화 또는 벡터 CH1도메인의 C-말단에 첨부된 데카펩티드 서열 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser (서열 확인 번호:28)에 대해 생성된 모노클로날 항체인 7F11-알칼라인 포스파타아제의 접합체(캘리포니아주 샌디에고 소재 바이오사이트 인크)와의 반응성 중 하나에 의해 스크리닝하였다.
이중 양성인 50개의 클론을 모으고 서열 확인 번호:23-27에 나타낸 5개의 중첩하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사한 방식으로 제조된 증폭된 CDR 이식 LM609 VL생성물로 혼성화 돌연변이 발생을 위한 우리디닐화된 주형을 제조하는 데 사용하였다. 돌연변이 발생 반응물을 이 콜리 균주 DH10B 중으로 전기침공하였다. 49 위치에서 비공여 라이브러리의 제조를 위한 주형이 적절하게 제조되었는지 확인하기 위해, 랜덤하게 골라낸 클론을 시퀀싱하였다. 이 주형은 우리디닐화된 주형으로 제조되었으며 하기 서열의 올리고뉴클레오티드 집단을 위치 지정 돌연변이 발생용으로 사용하였다.
GGGAACGATA-19aa-GATGAGAAGC
상기 프라이머 (서열 확인 번호 30)의 서열 19aa는 이 프라이머가 19개의 비공여 아미노산 각각을 코딩하는 19개의 상이한 코톤 서열로 구성된 서열 집단을 특정한다는 사실을 나타낸다. 이들 아미노산은 LM609의 49번 위치에서 발견되지 않는 것이며, Lys을 제외한 모든 아미노산을 포함한다. 이 돌연변이 발생으로부터 생성된 클론을 골라내고 이들 클론으로부터 발현되는 항체를 제조하였다. 이후,이들 샘플을 ELISA에서 αVβ3에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 49번 위치에서 Arg 또는 Met 아미노산 중 하나를 가진 클론을 기능적으로 동정하였다. LM609 이식 H 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1A에 나타내었다(각각, 서열 확인 번호 1 및 2). LM609 이식된 L 사슬의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 7에 나타내었다 (각각, 서열 확인 번호 31 및 32).
실시예 VI
증강된 활성을 갖는 LM609 이식 항체의 생산
본 실시예는 LM609 이식 항체를 시험관 내에서 성숙시켜 부모 LM609 이식 항체에 비해 αVβ3에 대해 증가된 친화도를 갖는 항체 변이체를 얻는 것을 나타낸다.
시험관 내에서 LM609 이식 항체의 친화도를 최적화하기 위해, 기능적 항체 단편(Fabs)의 라이브러리의 효과적인 합성, 발현 및 스크리닝을 허용하는 M13 파지 시스템을 사용하였다. Ig H 및 L 사슬의 6개의 CDRs 각각의 기여도를 평가하였다. 서열 가변성 및 항체 구조적 모델의 조합에 기초하여 CDRs를 넓게 규정하였다 (카바트 등, J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977); 코티아 등, 상기 문헌; 맥칼럼 등, 상기 문헌). 따라서, 긴(20개의 아미노산) 길이로 인하여 두 개의 라이브러리로 분리한 H2를 제외하고는, 각 CDR에 대하여 한 개의 라이브러리를 구성하였다. 돌연변이 CDRs를 갖는 가변 영역 프레임 워크는 도 1a에 도시한 H 사슬 가변 영역 (SEQ ID NO: 2) 및 도 7에 도시한 L 사슬 가변 영역(SEQ ID NO: 32)이었다.
도 1a에 도시한 H 사슬 가변 영역 (SEQ ID NO: 2) 및 도 7에 도시한 L 사슬 가변 영역(SEQ ID NO: 32)으로부터 CDRs를 선택하였다. 간단히 설명하자면, 상기 카바트 등의 넘버링 시스템을 사용할 때, CDRs의 돌연변이 발생을 위해 선택된 잔기(표 9)는 L 사슬 CDR1 (L1)의 Gln24-Tyr36, L 사슬 CDR2 (L2)의 Leu46-Ser56, L 사슬 CDR3 (L3)의 Gln89-Thr97, H 사슬 CDR1 (H1)의 Gly26-Ser35, H 사슬 CDR2 (H2)의 Trp47-Gly65, 및 H 사슬 CDR3 (H3)의 Ala93-Tyr102였다. 올리고뉴클레오티드를 각 클론에서 단일 CDR 잔기를 돌연변이시키도록 계획하고, 각 CDR에 대하여 라이브러리를 생성하였다. H2의 연장된 길이로 인하여, 각각 47-55 (H2a) 및 56-65 (H2b) 잔기를 돌연변이시키는 두 개의 라이브러리를 구성하여 이 영역을 커버하였다.
L 사슬 CDR3 돌연변이체를 생산하기 위한 주형은 92번 위치에 Gly를 함유하였다. 그러나, 이어서 L 사슬 CDR3의 92번 위치가 우연하게 Gly라는 것이 결정되었고, 이것은 그 위치에 Gly를 갖도록 구성된 인간화 LM609 이식 항체를 생성하였다. 나중에 최초 LM609 서열이 92번 위치에 Asn을 함유한다는 것을 알았다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 LM609 이식 항체의 CDRs에 돌연변이를 도입하였을 때, L 사슬 CDR3의 92번 위치에 Asn을 갖는 LM609 이식 항체가 αVβ3결합 활성을 갖는 것으로 밝혀졌고 (표 9 참조), 이것은 Asn92가 기능적 LM609 이식 항체라는 것을 입증한다. 따라서, 92번 위치에 Gly 또는 Asn을 갖는 L 사슬 CDR3를 함유하는 항체는 αVβ3결합에 활성을 갖는다.
이미 기술된 대로 (글래이저 등, 상기 문헌), 각 CDR 위치에 NN(G/T)를 도입함으로써 단일 돌연변이를 코딩하는 올리코뉴클레오티드를 합성하였다. 일부 변화를 갖는, 상기 기술한 바와 같은 혼성화 돌연변이 발생에 의해 M131XL604 벡터에서 항체 라이브러리를 구성하였다 (로속 등, J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996); 후즈 등, J. Immunol. 149: 3914-3920 (1992); 쿤켈, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985); 쿤켈 등, Methods Enzymol. 154; 367-382 (1987)). 간단히 설명하면, 85 ℃에서 5분 동안 변성시키고, 55 ℃에서 1시간 동안 가속화하고, 55 ℃에서 5분 동안 방치한 다음, 얼음으로 냉각시킴으로써 올리고뉴클레오티드를 20:1의 몰비로 우리디닐화 LM609 이식 항체 주형에 어닐링하였다. 중합에 의해 반응을 연장시키고, DH10B로 전기영동하고, XL-1 블루 론(lawn) 상에서 역가 측정하였다. 라이브러리는 변이체 풀(pool)로 구성되었고, 각 클론은 CDR 위치 중 한 위치에 단일 아미노산 변화를 함유하였다. 코돈에 기초한 돌연변이 발생을 사용하여, 모든 CDRs의 모든 위치를 한 번에 한 개씩 돌연변이시켜서 각 CDR 잔기에서 20개의 아미노산 모두를 후속적으로 발현시켰다 (글래이저 등, 상기 문헌). CDR 라이브러리의 크기는 288 (L3) 내지 416 (L1)의 고유 멤버 범위였고, 총 2336개의 변이체를 함유하였다.
초기 라이브러리의 효과적인 스크리닝을 위해, 매우 민감성인 플라크 리프트 분석, 소위 캡쳐 리프트 (capture lift)를 사용하였다 (왓킨스 등, Anal. Biochem. 256 (1998)). 간단하게 설명하면, LM609 이식 항체 변이체를 발현하는 파이지 발현 라이브러리를 우선, 니트로셀룰로오스를 염소 항인간 카파 항체로 예비 코팅하고, 소 혈청 알부민으로 차단한 후, 파지 감염된 세균 론에 적용하는 변형된 플라크 리프트 방법에 의해 스크리닝하였다. 파지 발현된 LM609 이식 항체 변이체 Fabs를 캡쳐한 후, 필터를 1.0 ㎍/ml 비오티닐화 αVβ3와 4 ℃에서 3시간 동안 배양시키고, 4회 세척하고, 2.3 ㎍/ml 뉴트르아비딘-알카라인 포스파타아제 (미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce Chemical Co.)와 25 ℃에서 15분 동안 배양하고, 4회 세척하였다. 모든 희석 및 세척은 결합 완충액에서 수행하였다. 필터를 0.4 mM 2,2'-디-p-니트로페닐-5,5'-디페닐-3,3'-(3,3'-디메톡시-4,4'-디페닐렌)디테트라졸리움 클로라이드 및 0.38 mM 5-브로모-4-클로로-3-인독실 포스페이트 모노-(p-톨루이디늄)염을 함유하는 0.1M 트리스 (pH 9.5) (미국 캘리포니아주 산 루이스 오비스포 소재의 JBL Scientific, Inc.)에서 10 내지 15분 동안 배양함으로써, αVβ3에 결합된 변이체를 동정하였다.
비오티닐화 αVβ3를 생산하기 위해, 상기 기술한 바와 같이 (Smith 및 Cheresh, J. Biol. Chem. 263: 18726-18731 (1988)), 친화성 크로마토그래피에 의해 인간 태반으로부터 αVβ3수용체를 정제하였다. αVβ3를 비오티닐화하기 위해, 정제된 수용체를 0.1% NP-40 (결합 완충액)을 함유하는, 50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl 및 1.0 mM CaCl2로 투석하고, 100배 몰 과량의 술포숙신이미도비오틴과 4 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 50 mM 에탄올아민을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
파지 발현된 LM609 이식 항체 변이체를 염소 항인간 카파 사슬 항체로 코팅된 니트로셀룰로오스 필터 상에 선택적으로 캡쳐하고, 비오티닐화 αVβ3로 프로브하고, 뉴트르아비딘-알카라인 포스파타아제로 검출하였다. 일단, 비오티닐화 αVβ3를 LM609 이식 항체 부모 분자만을 발현하는 파지를 함유하는 리프트 상에서 역가 측정하였다. 이어서, 비오티닐화 αVβ3의 농도를 감소시켜 거의 인식할 수 없는 신호를 얻었다. 이 방식으로, 변이체 라이브러리를 스크린하는 동안 더 높은 친화도를 갖는 변이체를 발현하는 클론만을 쉽게 동정하였다. 각 라이브러리로부터 2500개 이상의 클론을 철저히 캡쳐 리프트 스크리닝 한 후에, 300개의 더 높은 친화도를 갖는 변이체를 동정하였다 (표 8 참조). 증가된 친화도를 갖는 변이체가 모든 CDR에서 동정되었으나, H3 (185) 및 L3 (52) CDRs에서 개선된 친화도를 나타내는 클론이 가장 많이 동정되었다.
캡쳐 리프트에 의해 αVβ3결합 활성을 갖는 것으로 동정된 LM609 이식 항체 변이체를 더 특성화하여 αVβ3에 대한 결합 친화도, 다른 인테그린과 비교한 αVβ3에 대한 특이성, 및 αVβ3결합 및 해리 속도를 측정하였다. LM609 이식 항체 변이체의 정제된 Fab을 이 분석에 사용하였다. 간단히 설명하자면, Fab을 상기 기술한 바와 같이 발현시키고, 음파 진동에 의해 원형질막 공간으로부터 유리시켰다 (왓킨스 등, 상기 문헌, 1997). 1 리터 배양물로부터 회수한 세포를 0.05% 트윈 20을 함유하는 50 mM 트리스 (pH 8.0) 10 ml 중에서 용해시켰다. Fab을 250 mM NaCl을함유하는 50 mM 글리신 (pH 8)으로 평형화시킨 1 ml 단백질 A 칼럼(Pharmacia)에 결합시키고, 동일한 완충액으로 세척하고, 100 mM 글리신 (pH 3) 10 ml를 사용하여 1/10 용량의 1M 트리스 (pH 8) 내로 용리하였다. 정제된 Fab을 상기 기술한 바와 같이 정량화하였다 (Watkins et al., supra, 1997).
LM609 이식 항체 변이체를 αVβ3에 대한 결합, αVβ5및 αIIbβ3와 비교한 αVβ3에 대한 결합 특이성에 대해 시험하였다. 고정된 αVβ3및 관련된 인테그린 αVβ5및 αIIbβ3상에서의 Fab의 ELISA 역가 측정을 위해, 이뮬론(Immulon) II 마이크로역가 측정 플레이트를 20 mM 트리스 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2및 1 mM MnCl2중의 1 ㎍/ml 정제된 수용체로 코팅하고, 1회 세척하고, 50 mM 트리스(pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2및 1 mM MgCl2중의 3% BSA에서 25 ℃에서 1시간 동안 차단하였다. 혈소판으로부터 정제된 인간 αIIbβ3는 엔자임 리서치 래보러토리즈, 인크 (Enzyme Research Laboratories, Inc., 미국 일리노이주 사우스 벤드 소재)로부터 입수하였고, αVβ5는 상기 기술한 바와 같이 (Smith et al., J. Biol. Chem. 265: 11008-11013 (1990)), αVβ3가 없는 태반 추출물로부터 정제하였다. 사용하기 직전에, 플레이트를 2회 세척한 다음, Fab의 다양한 희석액과 25 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 5회 세척하고, 200배 희석된 염소 항인간 카파-알카라인 포스파타아제와 25 ℃에서 1시간 동안 배양하고, 5회 세척하고, 상기 기술한 바와 같이 처리하였다 (Watkins et al., supra, 1997). 모든 희석 및 세척은 50 mM 트리스-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2및 1 mM MgCl2중에서 수행하였다.
표 8: LM609 이식 항체 CDR 라이브러리의 캡쳐 리프트 스크리닝
1DNA 서열을 기초로 한 고유 클론의 수. 32개의 코돈을 사용하여 각 위치에서 20개의 아미노산 모두를 발현시켰다.
2파지 발현된 라이브러리를 100 mm 디쉬 당 500 내지 100 플라크로 XL-1 블루/아가 론 상에 플레이팅하였다.
3양성은 최초 스크린에서 동정되고, 재플레이팅되고, 제2 캡쳐 리프트 분석에서 입증된 클론으로 정의된다.
4가용성 Fab을 ELISA 포맷으로 고정된 αVβ3에 대해 역가 측정하였다. 역가 측정 프로파일의 변곡점의 비교를 기초로 하여, ~3배 증가된 친화도를 나타낸 클론을 추가의 특성화를 위해 선택하였다.
5캡쳐 리프트에 의해 동정된 185개의 양성 클론 중에서, 98개를 고정된 αVβ3에 대한 결합을 위해 추가로 특성화하였다.
도 8은 고정된 αVβ3상에서의 항체 변이체 및 LM609 이식 항체 Fab의 역가 측정을 나타낸다. LM609 이식 항체를 포함하는 세균 세포 용균물 (닫힌 원), 조합 라이브러리 (닫힌 삼각형) 또는 초기 라이브러리로부터 단리된 증가된 친화도를 갖는 변이체를 포함하는 세균 용균물 (S102, 닫힌 사각형; Y100, 열린 사각형; 및 Y101, 열린 삼각형), 또는 관련없는 Fab을 포함하는 세균 용균물 (열린 원)을 고정된 αVβ3상에서 역가 측정하였다.
고정된 αVβ3상에서 변이체를 역가 측정하여 얻은 결합 프로파일의 변곡점의 비교로부터, 다수의 클론이 3배를 초과하는 증가된 친화도를 나타낸다는 것이 입증되었고, 이는 캡쳐 리프트를 반 정량적 양식으로 이용하는 것의 유효성을 증명한다 (도 8, 사각형 및 열린 삼각형을 닫힌 원과 비교하라). 캡쳐 리프트 스크리닝 및 후속적인 고정된 αVβ3에 대한 결합의 특성화를 기초로 할 때, H 및 L 사슬 CDRs 모두 αVβ3의 LM609 이식 항체 변이체와의 상호작용에 직접 관련되어 있다고 결론지을 수 있다.
3배를 초과하는 증강된 결합을 나타내는 클론으로부터 DNA를 단리하고, 더 높은 친화도를 가져오는 돌연변이를 동정하기 위해 서열화하였다. DNA 서열화는 단리된 단일 가닥 DNA 상에서 수행하였다. 형광 디데옥시뉴클레오티드 종결법 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Perkin-Elmer)에 의해 H 및 L 사슬 가변 영역 유전자를 서열화하였다. 103개 변이체의 서열 분석에 기초하여, 14개 자리에 집합된 23개의 고유 돌연변이를 동정하였다 (표 9). 유익한 돌연변이 자리의 대부분이 H 사슬 CDRs에서 발견되었고, H3에 4개, 및 H2 (2a 및 2b를 합침) 및 H1에 각각 3개가 위치하였다. 7개의 상이한 유익한 아미노산 치환이 H3 내의 한 자리인 티로신 잔기 102에서 동정되었다. 이 자리에서 치환이 다양하게 일어난다는 것은 티로신 잔기 102가 αVβ3에 대한 LM609 이식 항체 결합을 입체적으로 방해할 수 있다는 것을 암시한다. 증강된 활성에 대한 스크리닝 후, 102 번 잔기에서 티로신 대신 다른 방향족 아미노산(페닐알라닌, 히스티딘 및 트립토판)을 발현하는 변이체가 전혀 단리되지 않았다는 것은 이를 뒷받침한다.
정제된 Fab과 고정된 αVβ3와의 결합 및 해리 속도를 측정하기 위해, 표면 플라스몬 공명(BIAcore)을 사용하여 선택된 변이체의 친화도를 추가로 특성화하였다. 간단히 설명하면, 표면 플라스몬 공명(BIAcore, Pharmacia)을 사용하여 αVβ3과 LM609 이식 항체 변이체 사이의 상호작용에 대한 속도 상수를 측정하였다. 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4) 중의 15 ㎍/ml αVβ330 ㎕를 주입함으로써,정제된αVβ3수용체를 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염)/N-히드록시숙신이미드 활성화 센서 칩에 고정시켰다. 결합 속도 상수(kon)를 얻기 위해, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2및 1 mM MgCl2중의 5 내지 40 ㎍/ml 범위의 5개의 상이한 Fab 농도에서의 결합 속도를 10 ㎕/분의 유동 속도로 측정하였다. 해리 속도 상수(koff)는 증가된 유동 속도(40 ㎕/분)로 해리 상을 분석함으로써 얻어진 5개의 측정값의 평균이었다. 센소르그램 (sensorgram)을 비아이에이이밸루에이션 (BIAevaluation) 2.1 프로그램 (Pharmacia)을 사용하여 분석하였다. 각 측정 후에 10 mM HCl, 2 mM CaCl2및 1 mM MgCl2를 사용하여 잔류 Fab을 제거하였다.
표 9는 모든 변이체가 LM609 이식 항체 모 분자보다 더 낮은 Kd를 나타냈다는 것을 보여주며, 이것은 캡쳐 리프트 및 ELISA 모두와 일치한다. 결합 및 해리 속도의 분석은 개량된 변이체 다수의 해리 속도가 더 느린 반면, 결합 속도는 유사하다는 것을 나타내었다. 예를 들면, LM609 이식 항체의 결합 속도는 18.0 x 104M-1s-1인 반면, 변이체는 16.7-31.8 x 104M-1s-1이었다. 반대로, 모든 클론은 LM609 이식 항체(4.97 x 10-3s-1)보다 더 느리게 해리하였고, 해리 속도는 1.6배(3.03 x 10-3s-1) 내지 11.8배(0.42 x 10-3s-1) 더 느렸다.
이 결과들은 LM609 이식 항체 CDRs에 단일 아미노산 치환을 도입하는 것이부모 LM609 이식 항체보다 αVβ3에 대한 더 높은 친화도를 갖는 변형된 LM609 이식 항체의 동정을 허용한다는 것을 입증한다.
표 9: 일차 라이브러리로부터 증강된 LM609 이식 항체의 동정
실시예 VII
고친화도 LM609 이식 항체의 생산
본 실시예는 αVβ3에 대한 더 높은 친화도의 결합을 가져오는 LM609 이식 항체 CDRs의 단일 아미노산 돌연변이를 조합하여 고친화도 LM609 이식 항체를 생산할 수 있음을 나타낸다.
LM609 이식 항체의 유익한 돌연변이 모두의 무작위 조합은 105개를 초과하는 변이체를 함유하는 조합 라이브러리를 생성시킬 것이며, 이는 효과적인 스크리닝 방법론을 요구한다. 따라서, 10배를 초과하는 증강된 친화도를 나타내는 클론을 다른 것과 쉽게 구별할 수 있을지를 결정하기 위해, 3 내지 13배의 증강된 친화도를 나타내는 변이체를 더 낮은 농도의 비오티닐화 αVβ3를 사용하는 캡쳐 리프트에 의해 평가하였다. 넓은 범위의 농도의 αVβ3를 사용한 반복된 시도에도 불구하고, 캡쳐 리프트 신호의 일관된 차이를 관찰하지 못했다. 이 때문에, 더 작은 조합 라이브러리를 구성하였고, 이어서 ELISA에 의해 스크리닝하였다.
두 자리 혼성화 돌연변이 발생을 사용하여 달성될 수 있는 최적의 수의 조합을 평가하기 위해, 4개의 상이한 조합 라이브러리를 구성하였다 (도 9). 즉, 야생형 및 유익한 H 사슬 돌연변이(H2, Leu60→Pro; H3, Tyr97→His; H3, Ala101→Tyr; H3, Tyr102→Ser, Thr, Asp, Glu, Met, Gly, Ala) 모두를 코딩하는 변성 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 조합 라이브러리를 구성하였다. 상기 기술한 바와 같이, 두 자리 혼성화 돌연변이 발생을 사용하여, 올리고뉴클레오티드를 40:1의 몰 비로 LM609 이식 항체 및 3개의 L 사슬 돌연변이(도 9; L1, His32→Phe; L3, Gly92→Asn; L3, His96→Leu)로부터 제조된 우리디닐화 주형에 어닐링하였다. 그 결과로서, 4개의 조합 라이브러리 서브셋으로부터 총 256개의 변이체를 합성하였다.
도 9는 유익한 돌연변이의 조합 라이브러리의 구성을 나타낸다. LM609 이식 항체 및 3개의 최적 L 사슬 변이체(F32, N92 및 L96)로부터 우리디닐화 주형을 제조하였다. 4개의 상이한 H 사슬 잔기에 유익한 돌연변이를 도입하도록 계획된 두 개의 변성 올리고뉴클레오티드로 두 자리 혼성화를 수행하였다.
LM609 이식 항체 및 3개의 L 사슬 변이체(표 9; F32, N92 및 L96)로부터 우리디닐화 주형을 제조한 후, 야생형 잔기 및 가장 유익한 H 사슬 돌연변이(표 9; P60, H97, Y101, S102, T102, D102, E102, M102, G102 및 A102)를 코딩하는 변성 올리고뉴클레오티드를 L 사슬 주형에 혼성화하여, 각각 64개의 고유 변이체를 함유하는 4개의 조합 라이브러리를 생성하였다. 가능하게는, 다수의 돌연변이의 조합이 친화도에 유해한 영향을 미칠 수 있고, 따라서, 더 적은 자리에서의 돌연변이에 기인하는 유익한 조합의 동정을 방해할 수 있다. 이러한 이유로, LM609 이식 항체 모 분자에 의해 발현된 아미노산을 조합 라이브러리의 각 위치에 포함시켰다. 이 방법을 사용하여, 동시에 3개의 CDRs(H2 및 H3와 혼합된 L1 또는 L3)의 조합 돌연변이 발생을 달성하였다. 서열 분석에 기초할 때, 두 자리 혼성화 돌연변이 발생이 ~50% 효율로 달성되었다.
조합 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 가용성 Fab를 발현시키고, 무작위적으로 선택된 클론으로 감염된 소규모(1 ml 미만) 세균 배양물의 원형질막으로부터 유리시켰다. 비록 다양한 발현 수준이 관찰되었으나, 균일한 양의 비정제된 변이체를 H 사슬의 카르복실 말단에 존재하는 펩티드 태그를 통해 미세역가 측정 플레이트 상에 캡쳐하였다. 간단히 설명하자면, 소규모 세균 배양물에서 생산된 항체 변이체의 상대적 친화도의 결정을 허용하는 ELISA를 사용하여, 조합 LM609 이식 항체 라이브러리를 스크리닝하였다 (Watkins et al., Anal. Biochem. 253: 37-45 (1997)). 이뮬론 II 미세역가 측정 플레이트(미국 버지니아주 칸틸리 소재의 Dynatech Laboratories)를 LM609 이식 항체 변이체 H 사슬의 카르복실 말단의 펩티드 태그를 인식하는 10 ㎍/ml의 7F11 모노클로날 항체로 코팅하였다 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)). 이. 콜리 용균물로부터 Fab을 캡쳐한 후, 플레이트를 25 ℃에서 1시간 동안 0.5-1 ㎍/ml의 비오티닐화 αVβ3와 배양하였다. 플레이트를 7회 세척하고, 25 ℃에서 15분 동안 0.5 U/ml 스트렙트아비딘-알카라인 포스파타아제 (1000 U/ml; 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재의 Boehringer Mannheim)와 배양하고, 7회 세척하고, 상기 기술한 바와 같이 처리하였다 (왓킨스 등, 상기 문헌, 1997). 모든 희석 및 세척은 결합 완충액에서 수행하였다.
상기 기술한 바와 같이 (왓킨스 등, 상기 문헌, 1997), 이 ELISA 스크리닝방법은 비오티닐화 αVβ3및 스트렙트아비딘-알카라인 포스파타아제와 배양한 후 변이체의 상대적 친화도의 신속하고 직접적인 비교를 가능하게 하였다. 충분한 Fab 다양성이 표본화되었는지를 보증하기 위해, 1000개의 무작위로 선택된 클론을 각 조합 라이브러리로부터 스크리닝하였다. 증강된 ELISA 신호를 나타낸 변이체를 고정된 αVβ3에 대한 결합에 대하여 추가로 특성화하였고 (도 8, 닫힌 삼각형), 돌연변이를 동정하기 위해 서열화하였다 (표 10).
4개의 조합 라이브러리의 스크리닝으로부터, 최초 라이브러리의 스크리닝에서 동정된 개별 돌연변이와 비교하여 결합을 크게 증가시킨 14개의 고유 돌연변이의 조합을 동정하였다. 최초 스크린으로부터의 가장 양호한 클론이 12.5배의 친화도 증가를 나타낸 반면, 조합 라이브러리 스크리닝으로부터 단리된 14개의 고유 조합은 부모 LM609 이식 항체보다 18 내지 92배 더 큰 친화도를 나타내었다. 이 변이체들의 대부분은 L1 또는 L3 돌연변이와 조합된 H2 및 H3 돌연변이로 구성되었다. 야생형 L 사슬을 갖는 H 사슬 돌연변이의 유익한 조합도 동정되었으나, 다른 조합 변이체와 동일한 정도의 증강된 친화도를 가져오지 못했다. 변이체들은 주로 2 내지 4개의 돌연변이를 함유하였고, 한 개의 클론(C29)은 5개의 돌연변이를 함유하였다. 각 변이체에서의 돌연변이의 총 수와 생성된 친화도 사이의 직접적인 상호관계는 관찰되지 않았다. 예를 들면, 클론 C37의 결합이 모 분자에 비하여 92배 증가되었고 이는 3개의 돌연변이의 조합을 통해 달성된 반면, 클론 C29는 5개의 돌연변이를 통해 ~55배 더 큰 친화도를 달성하였다. 겨우 2개의 돌연변이의 조합에기인한 50배를 초과하는 증강된 친화도를 나타내는 다수의 변이체가 동정되었다 (2G4, 17 및 V357D).
증강된 친화도를 갖는 조합 클론 모두 10배 넘게 더 느린 해리 속도를 나타내었고, 이것은 스크리닝에서 긴 배양 단계에 의해 도입된 선택 바이어스를 반영하는 것일 것이다. 또한, L96 L 사슬 돌연변이를 기초로 한 라이브러리로부터 단리된 조합 변이체 모두 2 내지 4배 더 큰 결합 속도를 나타내었다. 이미, 생체내 친화 돌연변이 중에 항체 레퍼토리가 더 큰 결합 속도를 나타내는 면역글로불린으로 이동한다는 것이 입증되었다 (Foote 및 Milstein, Nature 352: 530-532 (1991)). 따라서, 변이체의 L96 서브셋은 B-림파구 증식이 속도론적으로 선택되기 쉬운 생체내 친화도 돌연변이 과정을 보다 근접하게 모방할 수 있다.
LM609 이식 항체는 αVβ3복합체에 특이적으로 결합하나, αV또는 β3사슬을 개별적으로 인식하지 못한다. 변이체를 추가로 특성화하기 위해, 클론을 관련된 인테그린인 αVβ5및 αIIbβ3와의 반응성에 대해 스크리닝하였다. 시험한 모든 변이체가 αVβ5및 αIIbβ3와 비반응성이었고, 이것은 증가된 결합이 Fab과 수용체의 상호작용을 실질적으로 변화시키지 않는다는 것과 일치한다.
변이체의 친화도의 증가가 더 큰 생물학적 활성을 가져오는지를 결정하기 위한 첫 번째 단계로서, 일정 범위의 친화도를 나타내는 변이체를 천연 리간드인 피브리노겐의 고정된 αVβ3수용체에 대한 결합을 억제할 수 있는 능력에 대해 분석하였다. 간단히 설명하면, LM609 이식 항체 변이체를 상기 기술한 바와 같은 리간드결합의 억제에 대해 시험하였으나, 비오티닐화 인간 피브리노겐(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 Calbiochem)의 결합은 0.5 ㎍/ml 뉴트르아비딘-알카라인 포스파타아제로 검출하였다 (Smith et al., J. Biol. Chem. 265: 12267-12271 (1990)).
표 10: 최적의 조합 돌연변이의 동정
도 10에 이들 경쟁 분석의 결과를 나타내었다. 도 10A는 고정된 αVβ3에 대한 피브리노겐 결합의 억제를 나타낸다. 고정된 αVβ3를 37 ℃에서 3시간 동안0.1 ㎍/ml 비오티닐화 피브리노겐 및 다양한 농도의 LM609 이식 항체 (열린 원), S102 (닫힌 원), F32 (열린 삼각형) 또는 C59 (닫힌 삼각형)와 배양하였다. 비결합 리간드 및 Fab을 세척에 의해 제거하고, 결합 피브리노겐을 뉴트르아비딘 알카라인 포스파타아제 접합체와 배양한 후 정량화하였다. 도 10B는 변이체 친화도의 피브리노겐 결합 억제와의 상호관계를 나타낸다. 고정된 αVβ3에 대한 피브리노겐의 결합을 50% 억제하는데 요구되는 변이체의 농도(IC50)를 친화도(Kd)의 함수로서 플롯하였다.
도 10A에 나타낸 바와 같이, 더 높은 친화도를 갖는 변이체가 수용체의 리간드 결합 자리를 차단하는데 더 효과적이었다 (열린 원으로 나타낸 LM609 이식 항체를 임의의 변이체와 비교하라). 이어서 0.3 내지 27 nm 범위의 친화도(Kd)를 나타내는 10개의 변이체를 분석한 결과, 친화도와 피브리노겐 결합을 억제할 수 있는 능력 사이의 양호한 상호관계(r2= 0.976)가 입증되었다 (도 10B). 또한, 변이체를 수용체에 대한 비트로넥틴 결합의 억제에 대해 시험하였다. 피브리노겐과 유사하게, 변이체들은 부모 분자보다 상호작용을 억제하는데 더 효과적이었다. 따라서, 관련된 인테그린 수용체를 사용한 교차 반응성 연구와 일치하게도, 친화도를 증가시킨 돌연변이는 항체가 수용체와 상호작용하는 방식을 실질적으로 변화시키지 않는 것으로 보였다.
αVβ3수용체를 발현하는 M21 인간 흑색종 세포의 피브리노겐에 대한 부착을 억제할 수 있는 변이체의 능력을 검사하였다. LM609 이식 항체 변이체에 의한 4 x104개 M21 세포의 피브리노겐에 대한 부착의 억제를 상기 기술한 바와 같이 (Leavesley et al., J. Ce11 Biol. 117: 1101-1107 (1992)) 수행하였다. 정제된 피브리노겐 및 αVβ3수용체를 사용한 리간드 경쟁 연구와 유사하게, 더 높은 친화도를 갖는 변이체가 일반적으로 LM609 이식 항체보다 세포 부착을 방지하는데 더 효과적이었다 (도 11). 도 11은 피브리노겐에 대한 M21 인간 흑색종 세포 부착의 억제를 나타낸다. 세포 및 다양한 농도의 LM609 이식 항체 Fab (닫힌 삼각형), S102 (열린 원), G102 (닫힌 원) 또는 C37 (열린 삼각형)을 10 ㎍/ml 피브리노겐으로 코팅된 96 웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 37 ℃에서 35분 동안 배양한 후, 비결합 세포를 세척에 의해 제거하고, 부착 세포를 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 정량화하였다.
본래의 LM609 이식 항체 Ig는 세포 부착을 억제하나, 파지 발현된 Fab은 1 mg/ml의 높은 농도에서 세포 부착에 영향을 미치지 않았다 (도 11, 닫힌 삼각형). 조합 라이브러리로부터 단리되고, LM609 이식 항체 Fab보다 ~90배 더 큰 친화도를 나타내는 클론 C37은 세포 부착을 완전히 억제하였다 (도 11, 열린 삼각형). 변이체 G102는 중간 정도로 더 높은 친화도(2.2배 증가됨)를 나타내었으며, 또한, 세포 부착을 억제(C37보다 덜 효과적이기는 하지만) 하였다 (도 11, 닫힌 원). 놀랍게도, LM609 이식 항체보다 4.6배 더 높은 친화도를 나타낸 클론 S102 (도 11, 열린 원)는 세포 부착을 억제하는데 비효과적이었고, 이것은 클론 G102 및 S102가 αVβ3수용체와 다르게 상호작용한다는 것을 암시한다.
이 결과들은 αVβ3에 대한 더 높은 결합 친화도를 나타내는 LM609 이식 항체를 가져오는 단일 아미노산 돌연변이를 조합하는 것이 부모 LM609 이식 항체보다 90배를 초과하는 더 높은 결합 친화도를 갖는 고친화도 LM609 이식 항체 돌연변이체의 동정을 허용한다는 것을 나타낸다.
실시예 VIII
고친화도의 증강된 LM609 이식 항체의 생산
본 실시예는 증가된 안정성을 갖는 고친화도의 증강된 LM609 이식 항체의 생산을 설명한다.
고친화도 클론 6H6(실시예 VII의 표 10 참조)을 추가로 특성화하였고, 약간의 단백질 분해를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 증가된 안정성을 갖는 변이체를 동정하기 위해, 32개의 코돈 변이체를 6H6의 H 사슬 CDR3(SEQ ID NO: 94)에 있는 Asn96및 His97(상기 기술한 카베트 등에 의한 넘버링)의 각 위치에 동시에 도입하였고, 변이체를 αVβ3결합 활성에 대하여 스크리닝하였다. 결합 활성을 보유한 변이체를 서열화한 다음, 단백질 분해에 대한 민감성에 대해 스크리닝하였다. 변이체 6H6LH는 αVβ3결합 활성 및 단백질 분해에 대해 내성을 나타내는 것으로 확인되었다 (표 11 및 15 참조). 고친화도 αVβ3결합 활성을 나타낸 6H6LH 변이체는 Asn96이 Leu으로 치환되었으나, His97은 보유하였다.
6H6LH 변이체는 αVβ3에 대해 고친화도 결합을 나타내었으나, 친화도는 6H6 변이체보다 다소 낮았다 (표 15 참조). 따라서, 고친화도 결합을 제공하는 것으로 밝혀진 CDR 돌연변이를 6H6LH 변이체와 조합하였다. 특히, 클론 F32에서처럼 (표 9 참조), 6H6의 L 사슬 CDR1에 있는 His32를 Phe로 돌연변이시켜 클론 2236/6H6LH를 생성하였다 (표 13 참조). 또다른 변이체에서는, 클론 P60에서처럼 (표 9 참조), 6H6의 H 사슬 CDR2에 있는 Leu61을 Pro로 돌연변이시켜 클론 2236-38/6H6LH를 생성하였다 (표 11 참조).
6H6의 증강된 고친화도 변이체의 H 사슬 CDRs의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 표 11 및 표 12에 나타내었다. 6H6의 증강된 고친화도 변이체의 L 사슬 CDRs의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 각각 표 13 및 표 14에 나타내었다. 표시한 CDRs는 상기 기술한 코티아 증의 문헌에 따른 것이다. 6H6 변이체와 상이한 아미노산 및 코돈은 굵게 표시하였다.
표 11: 고친화도의 증강된 6H6 변이체 항체의 H 사슬 CDrs의 아미노산 서열
표 12: 고친화도의 증강된 6H6 변이체 항체의 H 사슬 CDRs의 뉴클레오티드 서열
표 13: 고친화도의 증강된 6H6 변이체 항체의 L 사슬 CDRs의 아미노산 서열
표 14: 고친화도의 증강된 6H6변이체 항체의 L 사슬 CDRs의 뉴클레오티드 서열
본질적으로 실시예 VI에 기술한 바와 같은 표면 플라스몬 공명 (BIACORE)을 사용하여 각 클론에 대한 αVβ3결합의 속도론을 결정하였다. 클론의 결합 속도론 및 친화도를 표 15에 나타내었다.
표 15: 증강된 LM609 이식 항체 클론의 결합 속도론
표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 클론 6H6LH, 2236/6H6LH 및 2236-38/6H6LH는 6H6과 유사한 친화도를 나타내었다. 이전 실험에서 관찰된 6H6에 대한 친화도는 0.4 nM인 것에 비해(실시예 VII의 표 10 참조), 이 실험에서 6H6에 대한 친화도는 0.62 nM이었다. 이러한 차이는 실험의 가변성 내에 있는 관찰된 kon에 기인한다. 결합 속도는 6H6, 6H6LH, 2236/6H6LH 및 2236-38/6H6LH에서 매우 유사하였다. 관찰된 Kd의 작은 차이는 주로 koff의 차이에 기인한 것으로 보인다.
이 결과들은 αVβ3에 대한 높은 친화도를 나타내고, 단백질 분해에 대해 내성이 있는 부가의 증강된 LM609 이식 항체를 설명한다.
본원에 다양한 간행물이 언급되었다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 상태를 보다 충분히 설명하기 위해, 이 간행물들에 개시된 내용을 본원에 참고로 포함시켰다.
본 발명을 기술된 실시태양을 참고하여 설명하였으나, 당업계의 숙련가는 상술한 특정 실험은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이라는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 다양한 변화를 가할 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (33)

  1. 서열 확인 번호 104로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3 및 서열 확인 번호 110으로 지칭되는 VLCDR1으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR을 포함하는, αvβ3에 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증강된 LM609 이식 항체.
  3. 제1항의 증강된 LM609 이식 항체와 실질적으로 동일한 증강된 LM609 이식 항체.
  4. 서열 확인 번호 34로 지칭되는 VHCDR1, 서열 확인 번호 102로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 서열 확인 번호 108으로 지칭되는 VLCDR1, 서열 확인 번호 112로 지칭되는 VLCDR2 및 서열 확인 번호 90으로 지칭되는 VLCDR3을 포함하는 αvβ3에 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증강된 LM609 이식 항체.
  6. 제4항의 증강된 LM609 이식 항체와 실질적으로 동일한 증강된 LM609 이식 항체.
  7. 서열 확인 번호 34로 지칭되는 VHCDR1, 서열 확인 번호 102로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 서열 확인 번호 110으로 지칭되는 VLCDR1, 서열 확인 번호 112로 지칭되는 VLCDR2 및 서열 확인 번호 90으로 지칭되는 VLCDR3을 포함하는 αvβ3에 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증강된 LM609 이식 항체.
  9. 제7항의 증강된 LM609 이식 항체와 실질적으로 동일한 증강된 LM609 이식 항체.
  10. 서열 확인 번호 34로 지칭되는 VHCDR1, 서열 확인 번호 104로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 서열 확인 번호 110으로 지칭되는 VLCDR1, 서열 확인 번호 112로 지칭되는 VLCDR2 및 서열 확인 번호 90으로 지칭되는 VLCDR3을 포함하는 αvβ3에 선택적 결합 친화도를 나타내는 증강된 LM609 이식 항체 또는 이의 기능적 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증강된 LM609 이식 항체.
  12. 제10항의 증강된 LM609 이식 항체와 실질적으로로 동일한 증강된 LM609 이식 항체.
  13. 제1항의 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, 서열 확인 번호 103, 서열 확인 번호 105 및 서열 확인 번호 109로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  15. 제4항의 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, VHCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 33으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VHCDR2를 코딩하는 서열 확인 번호 101으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VHCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 105로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VLCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 107으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VLCDR2를 코딩하는 서열 확인 번호 111로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, 및 VLCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 89로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  17. 제7항의 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서, VHCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 33으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VHCDR2를 코딩하는 서열 확인 번호 101으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VHCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 105로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VLCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 109으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VLCDR2를 코딩하는 서열 확인 번호 111로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, 및 VLCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 89로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제10항의 증강된 LM609 이식 항체를 코딩하는 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, VHCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 33으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VHCDR2를 코딩하는 서열 확인 번호 103으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VHCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 105로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VLCDR1을 코딩하는 서열 확인 번호 109로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, VLCDR2를 코딩하는 서열 확인 번호 111로 지칭되는 뉴클레오티드 서열, 및 VLCDR3을 코딩하는 서열 확인 번호 89로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  21. αvβ3를 제1항의 증강된 LM609 이식 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 αvβ3기능 억제 방법.
  22. αvβ3를 제4항의 증강된 LM609 이식 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 αvβ3기능 억제 방법.
  23. αvβ3를 제7항의 증강된 LM609 이식 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 αvβ3기능 억제 방법.
  24. αvβ3를 제10항의 증강된 LM609 이식 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 αvβ3기능 억제 방법.
  25. 서열 확인 번호 104로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 및 서열 확인 번호 110으로 지칭되는 VLCDR1으로 이루어지는 군으로부터 선택된 CDR을 포함하는, LM609와 비교하여 αvβ3에 증강된 결합 친화도를 나타내는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  26. 제25항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체.
  27. 서열 확인 번호 34로 지칭되는 VHCDR1, 서열 확인 번호 102로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 서열 확인 번호 108로 지칭되는 VLCDR1, 서열 확인 번호 112로 지칭되는 VLCDR2 및 서열 확인 번호 90으로 지칭되는 VLCDR3을 포함하는, LM609와 비교하여 αvβ3에 증강된 결합 친화도를 나타내는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  28. 제27항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체.
  29. 서열 확인 번호 34로 지칭되는 VHCDR1, 서열 확인 번호 102로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 서열 확인 번호 110으로 지칭되는 VLCDR1, 서열 확인 번호 112로 지칭되는 VLCDR2 및 서열 확인 번호 90으로 지칭되는 VLCDR3을 포함하는, LM609와 비교하여 αvβ3에 증강된 결합 친화도를 나타내는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  30. 제29항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체.
  31. 서열 확인 번호 34로 지칭되는 VHCDR1, 서열 확인 번호 104로 지칭되는 VHCDR2, 서열 확인 번호 106으로 지칭되는 VHCDR3, 서열 확인 번호 110으로 지칭되는VLCDR1, 서열 확인 번호 112로 지칭되는 VLCDR2 및 서열 확인 번호 90으로 지칭되는 VLCDR3을 포함하는, LM609와 비교하여 αvβ3에 증강된 결합 친화도를 나타내는 항체 또는 이의 기능적 단편.
  32. 제30항에 있어서, 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab)2및 scFV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체.
  33. 서열 확인 번호 33, 서열 확인 번호 89, 서열 확인 번호 101, 서열 확인 번호 103, 서열 확인 번호 105, 서열 확인 번호 107, 서열 확인 번호 109 및 서열 확인 번호 111로 이루어지는 뉴클레오티드 서열 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자.
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