CZ302177B6 - Anti-alfavbeta3 rekombinantní protilátky, její funkcní fragmenty, molekuly nukleové kyseliny je kódující a jejich použití - Google Patents

Abstract

Rešení se týká protilátky s implantovaným zesíleným LM609 mající zesílenou selektivní vazebnou aktivitu .alfa..sub.V.n..beta..sub.3.n., nebo její funkcní fragment. Rovnež poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující protilátku s implantovaným zesíleným LM609. Dále poskytuje zpusoby inhibice funkce .alfa..sub.V.n..beta..sub.3 .n.kontaktem .alfa..sub.V.n..beta..sub.3 .n.s protilátkou s implantovaným zesíleným LM609.

Description

Αηίί-α_νβ3 rekombinantní protilátky, její funkční fragmenty, molekuly nukleové kyseliny je kódující a jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně vztahuje k nemocem zaviněným integrinem nebo přesněji, k nukIeovým kyselinám kódujícím monoklonální protilátky inhibující α_νβ₃ a k protilátkám s implantovanou oblastí CDR, inhibujícím α_νβ₃, pro terapeutické postupy u chorob zaviněných α_νβ₃·

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou skupinou buněčných adhezních receptorů, které zprostředkovávají adhezi jak buněk s buňkami, tak i buněk s extracelulámí matrix. Integriny sestávají z heterodimemích poly15 peptidů, kde jednoduchý polypeptidový a řetězec je nekovalentně asociován s jednoduchým β řetězcem. Existuje asi 14 odlišných polypeptidových a řetězců a přinejmenším 8 odlišných β polypeptidových řetězců, které dohromady tvoří skupinu integrinů buněčného adhezního receptoru. Obecně platí, že vazebná specifita a specifita tkáňové distribuce je odvozena od jedinečné kombinace a a β polypeptidových řetězců neboli integrinových podjednotek. Skupina, do níž ten či onen integrin patří, je obvykle určována β podjednotkou. Ligandová vazebná specifita je však rozsáhle ovlivňována a podjednotkou. Integriny vázající vitronectin obsahují například a_v integrinovou podjednotku.

Je známo, že integriny vázající vitronectin sestávají přinejmenším ze tří různých integrinů obsa25 hujících a_v podjednotku. Tyto a_v obsahující integriny obsahují α_νβ₃, α_νβι a α_νβ5, které všechny mají různé ligandově vazebné specifity. Například, ve srovnání s vitronectinem, α_νβ₃ se váže k mnoha různým proteinům extracelulámí matrix včetně fibronektinu, fibrinogenu, lamininu, tromspondinu, von Willebrandově faktoru, kolagenu, osteopontinu a kostnímu sialoproteinu I.

Integrin α_νβι se váže k fibronectinu, osteopontinu a vitronectinu, zatímco a_vps se váže k vitronectinu a osteopontinu.

Jako buněčné adhezní receptory jsou integriny zahrnuty v mnoha fyziologických procesech, včetně např., připojení buněk, pohybu a dělení buněk. Různé integriny mají různou úlohu v každém z těchto biologických procesů a nepatřičná regulace jejich funkce nebo jejich aktivity může vést k různým patologickým stavům.

Například, nepatřičná proliferace endoteliálních buněk v průběhu neovaskularizace tumoru je způsobena vitronectin vážícími integriny, vylučovanými buňkami. Inhibice integrinů α_νβ3 vázají40 čího vitronectin v tomto ohledu také inhibuje proces neovaskularizace tumoru. Stejné účinky má ανβ3 způsobující abnormální proliferaci spojenou s restenózou a vývojem granulámí tkáně například při poraněních kůže. Další choroby nebo patologické stavy způsobené nebo ovlivňované α_νβ3 například zahrnují: metastázu, osteoporózu, věkem podmíněnou pigmentaci kůže a diabetickou retinopatii a zánětlivé choroby jako je reumatická artritida a psoriasis. Činidla, která mohou inhibovat integriny vážící vitronectin, mohou být tedy užitečná pro terapeutické ovlivňování chorob.

Mnohé integriny zprostředkují svou buněčně adhezivní funkci rozpoznáním tripeptidové sekvence Arg-Gly-Asp (RGD), která byla nalezena v mnoha extracelulámích matričních proteinech.

Bylo provedeno mnoho pokusů modelovat podle této sekvence činidla zacílená na patologický stav způsobený příslušným integrinem. Takové přístupy zahrnují, například, užití peptidů obsahujících RGD a peptidových analog založených na specifitě způsobené sekvencemi obklopujícími RGD tripeptidovou sekvenci v těchto podjednotkách. I když bylo dosaženo některých omezených úspěchů, většina inhibitorů založených na RGD je většinou selektivní pro cílový integrin

- I CZ 302177 B6 a v důsledku toho křížově reaguje snecílovými integriny. Tyto křížově reagující inhibitory pak postrádají spec i ritu nutnou pro jejich použití jako účinných terapeuti k. Toto platí hlavně pro dříve identifikované inhibitory integrinu α_νβ₃.

Monoklonální protilátky na druhé straně vykazují speciťítu potřebnou pro jejich použití jako účinných terapeutik. Výhodou protilátek je také jejich rutinní výroba proti v podstatě kterémukoliv požadovanému antigenu. Rozvoj kombinačních knihoven podmínil další rychlejší možnosti výroby protilátek s vyšší účinností než předtím používané metody. Použití kombinační technologie umožňuje také, souběžně se selekcí požadované protilátky, izolovat nukleové kyseliny kódu10 jící těžké a lehké řetězce. Lze tudíž kombinační protilátky modifikovat bez použití dalšího kroku klonování.

Nehledě na možné výhody použití monoklonálních protilátek jako léčiv, tyto molekuly mají však komplikaci v tom, že jsou takřka výlučně odvozeny od jiných savčích organizmů než lidských.

Jejich použití jako léčiv je tedy omezeno skutečností, že normálně zvyšují hostitelovu imunitní odpověď. Byly také popsány metody substituce vazebných míst pro antigeny nebo oblastí určujících komplementaritu (CDRs) těchto jiných než lidských protilátek do lidského pozadí v rámci protilátek člověka. Takové metody se liší v tom, které aminokyselinové zbytky mohou být substituovány jako CDR, rovněž tak, jaké zbytky v protilátkách člověka mohou být změněny pro udržení vazebné specifity. V tomto ohleduje známo, že vlastní orientace uspořádání β podjednotky, správné uspořádání povrchu těžké a lehké podjednotky a vhodná konformace CDR jsou všechny důležité pro zachování antigenové specifity a afinity rekonstruované protilátky. Všechny tyto metody však vyžadují znalost sekvence nukleotidů a aminokyselin v jiné než lidské protilátce a dostupnost vhodně modelované lidské protilátky.

Dokument WO 98/33919 popisuje protilátku Vitaxín a protilátku s naroubovaným LM609 vykazující selektivní vazebnou aktivitu α_νβ₃ integrinu. Nárokované protilátky podle tohoto vynálezu se liší od protilátek podle WO 98/33919 pokud jde o V_HCD₃, která je nyní reprezentovaná sekvencí aminokyselin popsanou jako SEQ ID NO: 106.

Existuje zde tedy potřeba dostupných nukleových kyselin kódujících protilátky inhibující integrin, které by byly použity jako odpovídající léčiva u člověka.

Pro choroby zprostředkované α_νβ₃, tento předkládaný vynález zabezpečuje tuto potřebu a také poskytuje spojené výhody.

Podstata vynálezu

Podstatou tohoto vynálezu je protilátka nebo její funkční fragment, obsahující oblast V_H CDR1, popsanou jako SEQ ID NO: 34; V_H CDR2, popsanou jako SEQ ID NO: 102 nebo jako SEQ ID NO: 104; V_H CDR3, popsanou jako SEQ ID NO: 106; V_L CDR1, popsanou jako SEQ ID NO: 108 nebo jako SEQ ID NO: 110; V_L CDR2, popsanou jako SEQ ID NO: 112; a V_L CDR3, popsanou jako SEQ ID NO: 90; přičemž uvedená protilátka nebo její funkční fragment vykazuje vazebnou afinitu k α_νβ₃ integrinu, vazebnou specificitu k ανβ₃ integrinu, nebo inhibiění účinnost k α_νβ₃ integrinu.

Tento vynález poskytuje protilátku s implantovaným LM609 se zesílenou selektivní vazebnou aktivitou α_νβ₃ nebo její funkční fragment. Tento vynález také poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující protilátka implantovaným zesílením LM609. Navíc poskytuje metody inhibice funkce α_νβ₃ kontaktem α_νβ₃ s protilátkou s implantovaným zesíleným LM609.

- ? _

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti protilátky Vitaxinu. Obrázek IA ukazuje nukleotidové a dedukované aminokyselinové sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce Vitaxinu (Glnl—Ser 117; SEQ ID NOS: 1, respektive 2), zatímco obrázek IB ukazuje nukleotidové a dedukované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce Vitaxinu (Glul-Lysl07; SEQ ID NOS: 3, respektive 4).

io Obrázek 2 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti monoklonální protilátky LM609. Obrázek 2A ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce LM609 (SEQ ID NOS: 5, respektive 6). Variabilní oblast se rozprostírá od aminokyseliny Glul až ku Alal 17. Obrázek 2B ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce

LM609 (SEQ ID NOS: 7, respektive 8). Variabilní oblast lehkého řetězce se rozprostírá mezi

Aspl a Lys107.

Obrázek 3 ukazuje kompetitivní inhibici vazby LM609 IgG na integrin a_vp3 rekombinantním LM609 Fab. Fragmenty rekombínantní rozpustné myší LM609 (Fab) byly připraveny zperi20 plazmatické frakce M13 bakteriofága klonu muLM609M13 12 a muLM609M13 29. Vzorky periplazmy byly násobně ředěny, smíseny buď se 1 ng/ml, 5 ng/ml nebo 50 ng/ml LM609IgG a inkubovány v 96 jamkové desce s purifikovaným a_vp3. Desky byly promyty a navázané LM609 IgG detekovány kozí anti-myší Fc specifickou protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou. Fab produkované klonem muLM609M 13 12 inhibuje obě vázané 1 ng/ml i m5 ng/ml

LM609 IgG protilátky při všech koncentracích vyšších než pri ředění 1:27,

Obrázek 4 charakterizuje vazebnou specifitu Vitaxinu. Obrázek 4A ukazuje specifickou vazbu Vitaxinu na integrin a_vp3 pro srovnání s vazbou k integrinům a_vp3 avPs- Obrázek 4B znázorňuje kompetitivní inhibici vazby LM609 na α_νβ3 Vitaxinem. Obrázek 4A ukazuje kompetitivní inhibi30 ci vazby fibrinogenu na a_vp3 Vitaxinem,

Obrázek 5 ukazuje inhibici připojení buňky pomocí α_νβ3 (5A) a migraci (5B) Vitaxinem.

Obrázek 6 znázorňuje redukci růstu tumoru v důsledku Vitaxinem zprostředkované inhibice neo35 vaskularizace. Obrázek 6A ukazuje inhibici a_vp3 - negativní Fg a Hep-3 lidských tumorových fragmentů pěstovaných na kuřecích choří oallantoinových membránách (CAMs) po ovlivnění Vitaxinem. Obrázek 6B ukazuje inhibici růstu Vx2 karcinomů subkutánně implantovaných králíkům při dvou různých podaných dávkách Vitaxinu, 1 den po implantaci. Obrázek 6C podobně ukazuje inhibici růstu Vx2 tumoru jako v případě obrázku 6B, ale s tím, že čtyři různé dávky

Vitaxinu ubyly podány počínaje 7 dní po implantaci.

Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce fragmentu Glul-Lysl07; SEQ ID NOS: 1, respektive 2) protilátky LM609. Na pozici 49 variabilní oblasti lehkého řetězce může být buď Arg nebo Met. Tato nukleotidová a dedukovaná aminokyselinová sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce fragmentu protilátky LM609 je uvedena na obrázku 1A (SEQ ID nos: 1, respektive 2).

Obrázek 8 ukazuje titraci variant protilátky s implantovaným LM609 a Fab implantované LM609 na imobilizované a_vp3. Bakteriální buněčné lyzáty obsahující protilátku s implantovaným

LM609 (plné kroužky), varianty protilátky s implantovaným LM609 se zlepšenou afinitou izolované z primární knihovny (S102, plné čtverečky; Y100, prázdné čtverečky; Y101, prázdné trojúhelníky) nebo z kombinačních knihoven (plné trojúhelníky) nebo nepodstatné Fab (prázdné kroužky) byly titrovány na immobilizované a_vp3- j CZ 302177 B6

Obrázek 9 ukazuje konstrukci kombinačních knihoven variant protilátky s implantovanými zesílenými LM609 obsahujícími násobné aminokyselinové substituce.

Obrázek 10 ukazuje inhibici vazby fibrinogenu na α_νβ₃ pomocí variant protilátky s implantovaným LM609. Obrázek 10A ukazuje inhibici vazby fibrinogenu na immobilizovaný α_νβ?. Obrázek 10B ukazuje korelaci afinity proti látkových variant s inhibici vazby fibrinogenu.

Obrázek 11 ukazuje inhibici adheze buněk lidského melanomu M21 na fibrinogen variantami protilátky s implantovaným LM609. Vazba buněk na lOpg/ml substrátu povlečeného fibrinogenem byla testována v přítomností různých koncentrací Fab implantované LM609 (plné trojúhelníky), Fab S 102 implantované zvýšenou LM609 (prázdné trojúhelníky), G 102 (plné kroužky) nebo C37 (prázdné trojúhelníky).

Podrobný popis vynálezu

Vynález je směrován na nukleové kyseliny kódující monoklonální protilátku (Mab) LM609. Tato protilátka specificky rozpozná integrin α_νβ3 a inhibuje jeho funkční aktivitu. Tento vynález je také směrován k nukleovým kyselinám kódujícím a k polypeptidům obsahujícím jiné než myší formy LM609. Tyto implantované protilátky si zachovávají vazebnou specifitu a inhibiční aktivitu rodičovské myší protilátky LM609. Tento vynález je kromě toho směrován k optimalizovaným formám protilátek s implantovaným LM609, které mají zvýšenou vazebnou afinitu a specifitu ve srovnání s jinými než myšími rodičovskými formami protilátky s implantovaným LM609,

V jednom uspořádání byl hybrídom produkující LM609 použit jako zdroj pro produkci a klonování cDNA kódujících LM609. DNA kódující těžký a lehký řetězec byly sekvenovány ajejich CDR oblasti byly substituovány do pozadí lidské protilátky, aby byla produkována forma této protilátky jiná než myší. Tato substituce neboli implantace CDR byla provedena kodonově založenou mutagenezí generující knihovnu kombinačních Fab protilátek tvořenou členy představujícími alternativní zbytky v určitých pozicích. Skríninkem této knihovny byl izolován Vitaxin. Vzhledem ktomu, že tato implantovaná protilátka obsahuje lidské sekvence pozadí, je nepravděpodobné, že by Vitaxin zvyšoval hostitelskou imunitní odpověď. Je tudíž výhodné jeho použití pro léčbu chorob vyvolaných «νβ^·

Tak jak je zde použit, termín „monoklonální protilátka LM609“ nebo „LM609“ značí myší monoklonální protilátku specifickou vůči integrinů avp3 popsanou Cheresh, D. A, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 6471-6475 (1987) a Cheresh a Spiro J. Biol. Chem. 262: 17703-17711 (1987). LM609 byla produkována proti a reaguje sM21 buněčnými adhezními receptory nyní známými jako integrin α_νβι. LM609 inhibuje připojení buněk M21 na a_vp3 ligandy tak jako vitronectin, fibrinogen a von Willebrandův faktor (Cheresh a Spiro, viz výše) aje také inhibitorem pathologických stavů způsobených α_νβ3, jako je tumorem indukovaná angiogeneze (Brooks et al. Cell 79: 1157-1164 (1994), rozvoj granulace tkání při poraněních kůže (Clark et al., Am. J. pathology, 148: 1407-1421 (1996)) a migraci buněk hladkých svalů jako je tmu v průběhu restenózy (Choi et al., J. Vacular Surg., 19: 125-134 (1994); Jones et al., Pro. Nati. Acad. Sci. 93: 2482-2487(1996)).

Tak jakje zde použit, termín „VITAXIN“ označuje jinou než myší protilátku nebo její funkční fragment, které mají v podstatě stejné CDR aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce jako byly nalezeny u LM609. Termín „Vitaxin“, je-li použit pro označení těžkého nebo lehkého polypeptidového řetězce, označuje jiný než myší lehký nebo těžký polypeptidový řetězec nebo jejich funkční fragment, které mají v podstatě stejnou CDR aminokyselinovou sekvenci těžkého nebo lehkého polypeptidového řetězce, jako byla nalezena v těžkém nebo případně v lehkém řetězci LM609. Je-li použit pro označení funkčního fragmentu, nejsou tím myšleny všechny LM609 CDR. Jsou tím naopak myšleny pouze ty CDR, které by normálně byly přítomné v té

-4CZ 302177 B6 části protilátky, která odpovídá tomuto funkčnímu fragmentu. Podobně je tomu při použití termínu „Vitaxin“ ve vztahu ke kódující nukleové kyselině. Označuje nukleovou kyselinu kódující jinou než myší protilátku nebo její funkční fragment, které mají v podstatě stejnou nukleotidovou sekvenci jako je CDR nukleotidová sekvence a kódující v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako byla nalezena u LM609.

Jak je zde použit, termín „protilátka s implantovaným LM609“ označuje jinou než myší protilátku nebo její funkční fragment, které mají v podstatě stejnou CDR aminokyselinovou sekvenci těžkého a lehkého řetězce jako byla nalezena u LM609 a neobsahují žádné substituce LM609 io aminokyselinových zbytků mimo oblast CDR, jak definuje Kabat et al., U.S. Dept. Of Health and

Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest“ (1983). Termín „protilátka s implantovaným LM609“ nebo „implantovaný LM609“ je-li použit ve vztahu k těžkému nebo lehkému polypeptidovému řetězci nebo jejich funkčnímu fragmentu, označuje jiný než myší lehký nebo těžký polypeptidový řetězec nebo jejich funkční fragment, které mají v podstatě stej15 nou aminokyselinovou sekvenci jako byla nalezena v lehkém, případně těžkém polypeptidovém řetězci LM609, a zároveň neobsahuje žádnou substituci LM609 zbytků mimo oblast CDR, jak definoval Kabat et al„ výše. V případě použití pro označení funkčních fragmentů, nejsou tím myšleny všechny LM609 CDR. Jsou tím myšleny naopak ty CDR, které by byly normálně přítomny v té části protilátky, která odpovídá tomuto funkčnímu fragmentu. Podobně, termín „protilátka s implantovaným LM609“ nebo „implantovaný LM609“ použitý pro označení kódující nukleové kyseliny, označuje nukleovou kyselinu kódující jinou než myší protilátku nebo její funkční fragment a neobsahující žádné LM609 aminokyselinové substituce mimo oblast CDR, jak definuje Kabat et at, viz výše, a která má v podstatě stejnou nukleotidovou sekvenci jako mají těžký a lehký řetězec a kódující v podstatě stejnou CDR aminokyselinovou sekvenci jako byla nalezena u LM609 a jak ji definuje Kabat et al, viz výše.

Termín „implantovaná protilátka“ nebo „protilátka s implantovaným“ nebo „implantovaný“ označuje ve vztahu k lehkému nebo těžkému polypeptidovému řetězci nebo jejich funkčnímu fragmentu, že tento lehký nebo těžký řetězec nebo jejich funkční fragment má v podstatě tu samou oblast CDR jako donorová protilátka a současně neobsahuje žádné substituce donorových aminokyselinových zbytků mimo tuto CDR oblast, jak popisuje Kabat et al„ viz výše. Ve vztahu k funkčním fragmentům, nejsou tímto myšleny všechny donorové oblasti CDR. Naopak, takto označeny jsou pouze ty oblasti CDR, které by normálně byly obsaženy v té oblasti protilátky která odpovídá tomuto funkčnímu fragmentu. Podobně, termíny „implantovaná protilátka“ nebo „implantovaný“ nebo „protilátka s implantovaným“, jsou-li použity ve vztahu k nukleovým kyselinám kódujícím protilátku nebo její funkční fragment, označují nukleovou kyselinu kódující takovou protilátku nebo její funkční fragment, které neobsahují žádné substituce aminokyselin donora mimo oblast CDR, jak definoval Kabat et al, viz výše, a které mají v podstatě stejnou nukleotidovou sekvenci jako jsou nukleotidové sekvence CDR lehkého a těžkého řetězce a kódu40 jící v podstatě tu samou CDR aminokyselinovou sekvenci jaká byla nalezena v donorové protilátce a jaká je definována Kabatem et al„ viz výše.

Význam shora uvedených termínů zahrnuje menší variace a modifikace protilátek, pokud jejich funkce zůstává nezměněna. Funkční fragmenty, jako jsou Fab, F(ab)₂, Fv, jednoduchý řetězec Fv (scFv) a jim podobné, jsou zahrnuty v definici termínů LM609 a Vitaxin. Tyto funkční fragmenty jsou dobře známy osobám vyškoleným v oboru. Tyto termíny jsou popsány, například v:

Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York (1989); Molec, Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (ed.), New York: VCH Publishers, lne.); Huston et al„ Cell Biophysics, 22: 189— 224 _1993); Pluckthun a Skerra, Meth. EnzymoL 178: 497-515 (1989) a in Day, E. D„ Advanced lmmunochemistry. Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990).

Stejně jako u shora uvedených termínů, použitých pro popis funkčních fragmentů LM609, Vita55 xínu a protilátek s implantovaným LM609, použití termínů popisujících jiné domény než LM609,

-5CZ 302177 B6

Vitaxin nebo protilátky s implantovaným LM609, funkční fragmenty oblasti, nukleotidové a aminokyselinové sekvence a polypeptidy nebo peptidy, je zamýšleno tak, aby odpovídalo rozsahu významu každého termínu, tak jak je znám a používán v tomto oboru. Tyto termíny zahrnují např., „těžký polypeptidový řetězec“ nebo „těžký řetězec“, „lehký polypeptidový řetězec“ nebo „lehký řetězec“, „variabilní oblast těžkého řetězce“ (V_H) a „variabilní oblast lehkého řetězce“ (V_L), rovněž jako termín „oblast určující komplementaritu“ (CDR).

V případě, kdy jsou dvě nebo více definic pro nějaký termín používaný, případně akceptovaný v oboru, je definice tohoto termínu zamýšlena zde tak, aby zahrnovala všechny takové významy, io pokud není výslovně uveden opak. Specifickým případem je použití termínu „CDR“ pro popis nesousedních antigenních kombinačních míst nalezených ve variabilní oblasti těžkých i lehkých polypeptidových řetězců. Tato jedinečná oblast byla popsána Kabat et al„ viz výše, a Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) a McCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), kde tyto definice zahrnují překrývající se aminokyselinové zbytky při porovnání jednoho proti druhé15 mu. Použití této definice k popisu CDR od LM609, Vitaxinu protilátek s implantovaným LM609 nebo jejich variant je zamýšleno tak, aby odpovídalo rozsahu významu tohoto termínu, jak je zde definován a používán. Ty aminokyselinové zbytky, které jsou obsaženy v těchto CDR, jak jsou definovány v každé ze shora uvedených citací, jsou uvedeny níže v Tabulce 1 jako srovnání.

Tabulka 1: Definice oblastí CDR

	Kabat1	Chothia2	MacCallum
VH CDR1	31-35	26-32	30-35
VH CDR2	50-65	53-55	47-58
VH CDR3	95-102	96-101	93-101
VL CDR1	24-34	26-32	30-36
VL CDR2	50-56	50-52	46-55
Vl CDR3	89-97	91-96	89-96

¹ Číslování zbytků podle nomenklatury Kabat et al., viz výše, ² číslování zbytků podle nomenklatury Chothia et al., viz výše,³ číslování podle nomenklatury MacCallum et ak, viz výše.

Termín „v podstatě“ nebo „v podstatě stejný“ použitý ve vztahu k sekvenci nukleotidů nebo aminokyselin znamená, že nukleotidové nebo aminokyselinová sekvence vykazuje význačný stupeň, množství nebo rozsah sekvenční identity ve srovnání s referenční sekvencí. Takovýto význačný stupeň, množství nebo rozsah sekvenční identity může být dále považován za signifikantní a významný a tudíž vykazovat charakteristiky, které jsou definitivně poznatelné nebo známé. Nukleotidové sekvence, která je v podstatě stejnou nukleotidovou sekvencí jako lehký nebo těžký řetězec LM609, Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným LM609, včetně jejich fragmentů, je tedy sekvencí, která má charakteristiky, ježjsou definitivně známé nebo poznatelné jako kódující aminokyselinovou sekvenci LM609, Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným LM609. Menší modifikace tohoto stavu jsou zahrnuty, pokud jsou rozpoznatelné jako sekvence LM609, Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným LM609. Podobně, aminokyselinová sekven40 ce, kteráje v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvencí jako těžký nebo lehký řetězec Vitaxinu, protilátka s implantovaným LM609 nebo jejich funkční fragmenty, je sekvencí, která má charakteristiky, jež jsou definitivně známé nebo rozpoznatelné jako aminokyselinové sekvence Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným LM609 a jejich menší modifikace.

-6CZ 302177 B6

Pokud určujeme, jestli nějaká nukleotidové nebo aminokyselinová sekvence je v podstatě stejná jako Vitaxin nebo protilátka s implantovaným LM609, je brán zřetel na počet změn vzhledem k Vitaxinu nebo k protilátce s implantovaným LM609, při současném posouzení, jak je udržena funkce. Například, změna jedné aminokyseliny v tří aminokyselinové CDR nebo několik změn v 16 aminokyselinové CDR jsou posuzovány jako v podstatě stejné, jestliže je udržena schopnost vázat a_vp3. Aminokyselinová nebo nukleotidové sekvence je tedy v podstatě to sama, jestliže má charakteristiky, kterčjsou definitivně známé nebo rozpoznatelné jako reprezentující nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvenci Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným LM609 ajejich menších modifikací, pokud je zachována funkce Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným io LM609.

Termín „fragment“, pokud je použit ve vztahu k nukleovým kyselinám kódujícím LM609, Vitaxin nebo protilátku s implantovaným LM609, značí nukleovou kyselinu, která má v podstatě stejnou sekvenci jako část nukleové kyseliny, která kóduje LM609, Vitaxin nebo protilátku s implan15 tovaným LM609. Tento fragment nukleové kyseliny má dostatečnou délku a sekvenci ktomu, aby selektivně hybridizoval s nukleovou kyselinou kódující LM609, Vitaxin nebo protilátku s implantovaným LM609 nebo s nukleotidovou sekvencí, která je komplementární k nukleové kyselině kódující LM609, Vitaxin nebo protilátku s implantovaným LM609. Fragment je tedy představován tak, aby obsahoval jak příměry pro sekvenování a polymerázovou řetězovou reakci (PCR), tak rovněž i matrice pro blotování nukleových kyselin nebo hybridizaci v roztoku. Tento termín také zahrnuje oblasti nukleotidových sekvencí, které přímo nekódují LM609 polypeptidy, jako jsou introny a netranslatované sekvenční oblasti genu kódujícího LM609.

Tak jak je používáno zde, pokud je termín „funkční fragment“ použit ve vztahu k Vitaxinu, k protilátce s implantovaným LM609 nebo k těžkým nebo lehkým polypeptidovým řetězcům, představuje část Vitaxinu nebo protilátky s implantovaným LM609, včetně těžkých nebo lehkých polypeptidových řetězců, která si stále udržuje některou nebo všechny z α_νβ3 vazebné aktivity, Ctvp3 vazebné spec i fi ty, respektive integrin α_νβ.3 inhibiční aktivity. Takové funkční fragmenty mohou obsahovat, například, funkční fragmenty protilátek, jako jsou Fab, F(ab)i, Fv, jednoduchý řetězec Fv (scFv). Jiné funkční fragmenty mohou obsahovat, například, polypeptidy těžkých nebo lehkých fragmentů, polypeptidy variabilních oblastí nebo CDR polypeptidy nebo jejich části, pokud sí takové funkční fragmenty zachovají vazebnou aktivitu, specifitu nebo inhibiční aktivitu. Tento termín se také vztahuje ne polypeptidy, zahrnující, například, modifikované formy přirozeně se vyskytujících aminokyselin, tak jako D-stereoizomery, přirozeně se nevyskytující amino35 kyseliny, aminokyselinová analoga a mimetika, vše za předpokladu zachování funkční aktivity, jak je popsáno shora.

Termín „zesílený“, jak je zde používán, je-li ve vztahu k Vitaxinu, k protilátce s implantovaným LM609 nebo k jejich funkčním fragmentům, znamená, že funkční charakteristika této protilátky je změněna nebo zvýšena ve srovnání s referenční protilátkou tak, že tato protilátka vykazuje žádoucí vlastnost nebo aktivitu. Nějaká protilátka, která má zesílenou aktivitu, může mít například, vyšší nebo nižší vazebnou afinitu, zvýšenou nebo sníženou rychlost asociace nebo disociace ve srovnání s referenční protilátkou. Protilátka se zesílenou aktivitou může také mít zvýšenou stabilitu jako je zvýšený poločas života v určitém organizmu. Aktivita protilátky může být napří45 klad zesílena zvýšením stability snížením susceptibility k proteolýze. Je-li požadována zesílená aktivita, tak jako je vyšší vazebná afinita nebo zvýšená stabilita, je třeba zavést do oblasti CDR nebo do proti látkového pozadí mutace a výsledné protilátkové varianty skrínovat na vyšší vazebnou afinitu vůči ανβ3 nebo na zvýšenou stabilitu vzhledem k referenční protilátce jako je rodičovská protilátka s implantovaným LM609. Protilátka se zesílenou aktivitou může také mít sníže50 nou vazebnou afinitu, včetně snížené rychlosti asociace a zvýšené rychlosti disociace, je-li to požadováno. Zesílená aktivita protilátky se sníženou vazebnou afinitou je například užitečná pro proniknutí do pevného tumoru. Na rozdíl od protilátek s vyšší vazebnou afinitou, které se váží na periferální oblasti tumoru, ale přitom nejsou schopny proniknout do vnitřních oblastí tumoru v důsledku jejich vysoké afinity, protilátka s nízkou afinitou s výhodou pronikne do vnitřních

5? oblastí tohoto tumoru.

- 7 CZ 302177 B6

Tento vynález poskytuje nukleovou kyselinu kódující polypeptid těžkého řetězce pro Vitaxin nebo jeho funkční fragment. Také poskytuje nukleovou kyselinu kódující polypeptid lehkého řetězce Vitaxinu nebojeho funkční fragment. Tyto nukleové kyseliny sestávají z v podstatě stej5 ných nukleotidových sekvencí pro těžký a lehký řetězec variabilní oblasti, jako jsou uvedené na obrázku 1A a 1B (SEQ id NOS: 1, respektive 3) nebo jejich fragment.

Vitaxin, včetně jeho funkčních fragmentů, je jiná než myší protilátka, která má v podstatě stejnou vazebnou aktivitu, vazebnou specifitu a inhibiční aktivitu jako LM609. Fv fragment Vitaxinu byl io produkován funkční náhradou oblastí CDR polypeptidů variabilní oblasti lidského těžkého a lehkého řetězce oblastmi CDR LM609. Funkční náhrada těchto oblastí CDR byla provedena rekombinantnímí metodami, známými v oboru. Tyto metody jsou obecně označovány jako implantace CDR a jsou předmětem U.S. Patentu 5,2585,539. Tyto metody jsou také popsány v „protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in

Man“, Clark, M. (ed.), Nottingham, England: Academie Titles (1993).

V krátkosti, byly syntezovány fragmenty nukleové kyseliny od LM609, které měly v podstatě tu samou nukleotidovou sekvenci, a které kódovaly tu samou aminokyselinovou sekvenci jako měly oblasti těžkého a lehkého řetězce. Tyto fragmenty byly substituovány do každé z nukleových kyselin kódujících odpovídající lidského řetězce. Pro udržení funkčnosti této nově derivované protilátky Vitaxinu byly učiněny modifikace v rámci pozadí mimo oblasti CDR. Tyto individuální změny byly učiněny generováním populace variabilních oblastí těžkých a lehkých řetězců s implantovanou CDR, přičemž byly zastoupeny všechny možné změny mimo oblasti CDR, a poté selektováním vhodné protilátky skríninkem této populace na vazebnou aktivitu. Výsled25 kem tohoto skríninku byla protilátka Vitaxin, jež je zde popsána.

Tyto nukleotidové sekvence variabilních oblastí těžkých a lehkých řetězců Vitaxinu jsou uvedeny na obrázku 1A a 1B, respektive. Tyto sekvence v podstatě odpovídají sekvencím, které kódují polypeptidy variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce Vitaxinu. Tyto Vitaxinové nukleové .to kyseliny jsou vymyšleny tak, aby zahrnovaly souhlasná i nesouhlasná vlákna Vitaxin kódujících sekvencí. Jedno a dvoj vláknové nukleové kyseliny jsou také zahrnuty, rovněž jako nekódující oblasti nukleové kyseliny jako jsou například introny, 5'- a 3'- netrans lato vane oblasti a regulační sekvence.

Jak je uvedeno na obrázku 1 A, je Vitaxinový polypeptid variabilní oblastí těžkého řetězce kódován nukleovou kyselinou o délce asi 351 nukleotidů, která začíná na amino konci Glnl zbytkem variabilní oblasti až do Serl 17. Tato nukleová kyselina kódující variabilní část Vitaxinového těžkého řetězce je napojena na konstantní oblast lidského IgGI za vzniku kódující oblasti o 1431 nukleotidech, která kóduje polypeptid těžkého řetězce o celkem 477 aminokyselinových zbyt40 cích. Na obrázku 1B je uveden polypeptid variabilní oblasti lehkého řetězce Vitaxinu, který je kódován nukleovou kyselinou o délce asi 321 nukleotidů, počínaje Glul zbytkem variabilní oblasti až do Lysl07. Tato nukleová kyselina pro variabilní oblast lehkého řetězce Vitaxinu je spojena s lidskou kappa oblastí, čímž vznikl kódující region o 642 nukleotidech, který kóduje polypeptid lehkého řetězce o celkem 214 aminokyselinových zbytcích.

Menší modifikace těchto nukleotidových sekvencí jsou zahrnuty do nukleových kyselin kódujících těžký a lehký řetězec Vitaxinu a do jejich funkčních fragmentů. Takové menší modifikace zahrnují například ty, které nemění kódované sekvence aminokyselin v důsledku degenerace genetického kódu, rovněž jako i ty, jejichž výsledkem je pouze konzervativní substituce kódova50 né aminokyselinové sekvence. Konzervativní substituce kódovaných aminokyselin zahrnují například aminokyseliny, které patří do následujících skupin:

(1) nepolární aminokyseliny (Gly, Ala, Val, Leu a Ileu); (2) polámě-neutrální aminokyseliny (Cys, Met, Ser, Thr, Asn a Gin); (3) potámě-kyselé aminokyseliny (Asp a Glu); (4) polámě55 bazické aminokyseliny (Lys, Arg a His); (5) aromatické aminokyseliny (Phe, Trp, Tyr a His).

-8CZ 302177 B6

Jiné minoritní modifikace jsou zahrnuty v nukleových kyselinách kódujících polypeptidy těžkých a lehkých řetězců Vitaxinu, pokud si nukleová kyselina nebo kódovaný polypeptid zachovají některé nebo všechny ze svých funkcí jak je zde popsáno.

Tento vynález tedy také poskytuje nukleovou kyselinu kódující těžký řetězec Vitaxinu nebo jeho funkční fragment, přičemž tato nukleová kyselina kóduje v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce Vitaxinu jaká je uvedena na obrázku IA (SEQ ID NOS:2) nebo její fragment. Tento vynález také obdobně poskytuje nukleovou kyselinu kódující v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci variabilní části lehkého řetězce Vitaxinu jako je ío znázorněno na obrázku IB (SEQ ID NOS: 4) nebo její fragment.

Mimo konzervativní substituci aminokyselin jsou také menší modifikace kódujících nukleotidových sekvencí Vitaxinu, které poskytují funkční náhrady aminokyselin. Tyto změny jsou také v rozsahu definice tohoto termínu. Substituce funkčně ekvivalentních aminokyselin kódovaná is nukleotidovými sekvencemi Vitaxinu je rutinní záležitostí a lze ji realizovat metodami známými v oboru. Ve stručnosti, substituce funkčně ekvivalentních aminokyselin může být provedena identifikací aminokyselin, které je žádoucí změnit inkorporaci těchto změn do kódujících nukleových kyselin a poté určením funkce rekombinantně exprimovaných a modifikovaných polypeptidů nebo polypeptidů, Jsou dobře známy rychlé metody provedení a skríninku násobných součas2o ných změn, které lze použít pro tvorbu knihovny kódujících nukleových kyselin, která obsahuje všechny možné nebo všechny požadované změny, které lze potom použít pro expresi a skříňink polypeptidů Vitaxinu, které si zachovaly funkci. Tyto metody zahrnují například, mutagenezi založenou na kodonu, náhodnou syntézu oligonukleotidů a parciálně degenerovanou syntézu oligonukleotidů.

Mutageneze založená na kodonu je předmětem U.S. Patentů 5,264,563 a 5,523,388 aje výhodná pro shora uvedené účely, protože poskytuje produkci v zásadě libovolných a všech požadovaných frekvencí kódovaných aminokyselinových zbytků na libovolných a na všech požadovaných pozicích kodonu v rámci oligonukleotidů. Tyto požadované frekvence zahrnují, například, opravdu jo náhodnou inkorporaci všech dvaceti aminokyselin nebo specifikované podmnožiny z nich, rovněž jako inkorporaci s předem určeným rozdílem jedné nebo více určitých aminokyselin tak, že jsou inkorporovány s větší nebo menší frekvencí ve srovnání s ostatními inkorporovanými aminokyselinovými zbytky. Náhodná syntéza oligonukleotidů a parciálně degenerovaná syntéza oligonukleotidů mohou být rovněž použity pro produkci a skrínink funkčně ekvivalentních aminokyselinových změn. Tyto metody však v důsledku degenerace genetického kódu budou poskytovat redundantní inkorporace na požadovaných pozicích. Náhodná syntéza nukleotidů je spojování všech čtyř nukleotidů na všech nukleotidových pozicích v rámci kodonu, zatímco parciálně degenerovaná syntéza oligonukleotidů je spojování stejných dílů všech čtyřech nukleotidů na prvních dvou nukleotidových pozicích, například, a stejné díly dvou nukleotidů na třetí pozici. Obě tyto metody syntézy lze nalézt, například, v Cwirla et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, (1990) Devlin et al., Science 249: 404406, (1990).

Identifikace aminokyselin, které je třeba změnit, může být provedena odborníkem při použití současně dostupných informací týkajících se struktury a funkce protilátek, rovněž jako dostupné a současné informace zahrnující metody procedur implantace CDR. CDR může být, například, identifikována donorovou protilátkou na základě libovolného nebo všech kriterií specifikovaných Kabátem et al., viz výše, Chothia et al., viz výše, MacCallum et al., viz výše a libovolný nebo všechny neidentické aminokyselinové zbytky ležící mimo CDR sekvenci mohou být zaměněny funkčně ekvivalentní aminokyselinou. Použitím shora uvedených metod známých v tomto oboru může být libovolná nebo všechny neidentické aminokyseliny zaměněny bud’ samy nebo v kombinaci s aminokyselinami na jiných pozicích inkorporaci požadovaného počtu aminokyselinových substitucí na každé z požadovaných pozic. Tyto Vitaxinové polypeptidy obsahující požadované aminokyselinové zbytky jsou potom produkovány a skrínovány na základě udržení nebo zvýšení funkcí ve srovnání s nesubstituovanými polypeptidy. Produkce těchto substituovaných Vitaxino55 vých polypeptidů může být provedena například rekombinantní expresí metodami známými

-9CZ 302177 B6 v tomto oboru. Takovéto polypeptidy Vitaxinu, které mají zachovanou nebo zvýšenou funkci ve srovnání s nesubstituovaným Vitaxinem, jsou považovány za obsahující menší modifikace kódujících nukleotidových sekvencí, které mají za výsledek funkční náhradu jedné nebo více aminokyselin.

s lato funkční náhrada aminokyselin je užitečná pro produkcí implantovaných protilátek, které mají lidské sekvenční pozadí, protože poskytuje rychlou identifikaci ekvivalentních aminokyselinových zbytků, aniž by bylo třeba mít strukturní informace nebo aniž by bylo nutné pracně získávat informace nezbytné pro určení, které aminokyselinové zbytky mohou být substituovány, aby io byla úspěšně přenesena vazebná funkce zdonoru. Odstraňuje navíc skutečně několikakrokové procedury měnění a testování aminokyselin určených pro substituci. Při použití shora popsaného přístupu funkčního nahrazení mohou být v podstatě všechny neidentické aminokyselinové zbytky donora a lidského pozadí určeny a substituovány libovolnou nebo všemi ostatními možnými aminokyselinovými zbytky na všech neidentických pozicích za vzniku populace substituovaných polypeptidu obsahujících všechny možné nebo všechny požadované permutace a kombinace. Tato populace substituovaných polypeptidú může být skrínována na ty substituované polypeptidy, které si udržely svoji funkci. Pří použití mutageneze založené na kodonu, popsané shora, je tvorba knihovny substituovaných aminokyselinových zbytků a skrínink funkčně nahrazených zbytků použita pro rychlou přípravu implantovaných terapeutických protilátek, rovněž jako pro

2o rychlou změnu afinity protilátek. Tyto postupy jsou uvedeny například v Rosok et al., J, Biol, Chem. 271: 22611-22618 (1996) nebo případně v Glaser et al., J. Immunol. 149: 3903-3913 (1992).

Kromě zbytků pozadí hostitelské molekuly mohou být aminokyseliny funkčně nahrazeny vjed25 nom nebo více CDR, tak, aby umožnily identifikaci protilátky s implantovaným modifikovaným LM609 nesoucím zesílenou aktivitu. Aplikací shora popsaných metod na aminokyselinové zbytky hostitelského pozadí, lze podobně introdukovat aminokyselinové substituce do jedné nebo více CDR v protilátce s implantovaným LM609. Tuto protilátku s implantovaným modifikovaným LM609 lze testovat na vazebnou aktivitu, aby bylo určeno, je-li zachována α_νβ₃ vazebná aktivita. Tuto protilátku s implantovaným modifikovaným LM609 lze dále testovat, aby bylo určeno případné zesílení aktivity. Funkční náhrada aminokyselinových zbytků v jedné nebo ve více oblastech CDR tedy dovoluje určení protilátky s implantovaným zesíleným LM609, která má požadovanou vlastnost jako zesílenou aktivitu.

Pro tvorbu protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 a selekci těch protilátek, které mají zesílenou aktivitu, lze použít několik přístupů pro výběr počtu zbytků v rámci CDR, které mají být mutovány, rovněž jako počtu oblastí CDR v protilátce s implantovaným LM609, které mají být modifikovány. Tento výběr selekčního kriteria pro mutagenezí oblastí CDR bude záviset na potřebě a oblasti použití zesílené protilátky. V rámci jednotlivé CDR může být například modifikováno jedna nebo více aminokyselinových pozic tak, aby obsahovaly na těchto pozicích vybrané aminokyseliny. V opačném případě mohou být tyto cílové aminokyselinové pozice modifikovány tak, že obsahují na těchto pozicích všechny možné aminokyselinové zbytky. Tato výsledná populace může být skrínována na zesílenou aktivitu.

Sestrojení populací protilátky s implantovaným modifikovaným LM609 může být také provedeno tak, že všechny aminokyselinové pozice v rámci CDR jsou mutovány tak, že obsahují všechny možné aminokyseliny a všechny aminokyselinové pozice v násobných oblastech CDR jsou modifikovány tak, aby obsahovaly variantní aminokyselinové zbytky. Tímto způsobem lze konstruovat populace, které obsahují 2 až více než 10⁷ členů. Čím větší je populace, tím účinnější bude so selekce protilátek s implantovaným zesíleným LM609, protože v populaci bude větší počet různých protilátek. Může být však sestrojena i malá populace protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, a přesto může být úspěšně použita pro výrobě protilátky s implantovaným zesíleným LM609. Velikost populace protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 bude záviset na potřebě konkrétního použití a může být určena odborníkem.

- 10CZ 302177 B6

Tvorby modifikace protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 lze dosáhnout zaváděním aminokyselinových substitucí do jedné nebo více oblastí CDR protilátky s implantovaným LM609. Jednoduchou aminokyselinovou substitucí lze například systematicky vnášet do některé oblasti CDR záměnou dané aminokyseliny v této CDR za některou nebo všechny aminokyseliny.

Aminokyselinové substituce lze také vnést do všech aminokyselinových pozic v jedné nebo více oblastech CDR nebo ve všech oblastech CDR vytvářením populace protilátek s implantovaným modifikovaným LM609. Tato populace variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, které mají jednoduché aminokyselinové substituce, může být skrínována pro identifikaci variant, které si zachovaly ανβ3 vazebnou aktivitu. Tyto varianty s ctvp3 vazebnou aktivitou mohou být dále charakterizovány s cílem identifikovat varianty, které mají zesílenou aktivitu. Tento systematický přístup k zavádění jednoduchých aminokyselinových substitucí a tvorbě populace variant protilátky s implantovaným LM609, který umožňuje skřínink variant protilátek s implantovaným zesíleným LM609, které mají vysokou vazebnou aktivitu vůči α_νβ₃ je popsán v příkladu VI.

Kromě tvorby populace variant protilátky s implantovaným modifikovaným LM609, může být vybrána jednotlivá oblast CDR nebo jednotlivá aminokyselina v rámci CDR pro introdukci jedné nebo více aminokyselinových substitucí. Pro určení jednotlivých aminokyselinových pozic pro zavedení aminokyselinových substitucí lze použít například sekvenční homologie nebo strukturální model. V tomto příkladu je vytvořena pouze jedna nebo několik variant protilátky s implantovaným modifikovaným LM609, které jsou skrínovány na vazebnou aktivitu ανβ₃· Odborník v této oblasti bude vědět nebo bude schopen určit, je-li žádoucí vytvořit velkou populaci variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 nebo jestli vytvořit omezený počet variant protilátky s implantovaným modifikovaným LM609 pro skrínink a identifikaci protilátky s implantovaným zesíleným LM609, která má zesílenou aktivitu.

Kromě identifikace protilátek s implantovanou zesílenou LM609 pomocí vytvoření populace protilátek s implantovaným LM609, které mají jednoduché aminokyselinové substituce v oblasti

CDR a skríninku na zesílenou aktivitu, zesílené varianty protilátek s implantovaným LM609 mohou být také vytvářeny kombinací dvou nebo více mutací, z nichž každá vede nezávisle k zesílení aktivity, do jedné jednoduché protilátky. Jsou-li zde více než dvě mutace, pak je účinným způsobem identifikace kombinace mutací s dále zesílenou aktivitou konstrukce všech možných kombinací a permutací a posléze výběr na zesílenou aktivitu. Dvě jednoduché mutace v jedné nebo ve více oblastech CDR mohou být například kombinovány za tvorby protilátky s implantovaným nově modifikovaným LM609, která má dvě mutace v oblasti CDR, a skrínovány na zjištění, jestli tato α_νβ₃ vazebná aktivita je vyšší než u obou jednotlivých mutací. Podobným způsobem lze kombinovat 3 mutace a výsledné protilátky s implantovaným modifikovaným LM609 potom skrínovat na zesílenou vazebnou aktivitu. Použitím takovéto kombinace mutací v CDR může být vytvořena nová populace variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, vzniklá inkorporaci všech kombinací jednoduchých CDR mutací, jejímž výsledkem je zesílení aktivity variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609. Následný výběr vede k získání optimálně zesílené protilátky s implantovaným LM609,

Iterativní, stupňovitý přístup k identifikaci protilátky s implantovaným zesíleným LM609 je výhodný v tom, že umožňuje identifikaci protilátky s optimální vazebnou aktivitou, aniž by bylo třeba vytvářet a skrínovat velké počty variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609. Použití tohoto přístupu, popsaného v příkladech VI a VII, v nichž byly jednoduché mutanty identifikovány a kombinovány za vzniku nové populace variant protilátek s implanto50 váným LM609, vedlo k identifikaci protilátek s implantovaným zesíleným LM609, které mají vyšší afinitu mezi 2592 vytvořenými unikátními protilátkami. Kompletní znáhodnění (randomizace) osmi jednoduchých aminokyselinových zbytků v CDR by vyžadovalo více než 10⁷ unikátních variant. Tento iterativní přístup tudíž umožňuje identifikovat protilátky s implantovanou zesílenou LM609, jako je vysoká vazebná afinita, vytvářením relativně malého počtu unikátních

- 11 CZ 302177 Β6 variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 a skríninkem a identifikací těch variant protilátek s implantovaným zesíleným LM609, které mají vysokou vazebnou afinitu.

Iterativní, stupňovitý přístup k identifikaci variant se zesílenou LM609 může být také proveden použitím dodatečných kroků. Místo vytváření všech kombinací jednotlivých aminokyselinových mutací, mohou být jednoduché aminokyselinové mutace kombinovány do dvojic, čímž vzniknou kombinace všech dvojitých mutantů. Následně proběhne skrínink na aktivitu. Tyto dvojité mutanty se zesílenou aktivitou mohou být kombinovány s některým nebo se všemi jednoduchými mutanty za vzniku trojitých mutantů, které jsou skrínovány na zesílenou vazebnou aktivitu. Každý iterativní cyklus variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 může inkorporovat další jednoduchou mutaci a výsledné protilátky s implantovaným modifikovaným LM609 mohou být skrínovány na zesílenou aktivitu. Stupňovitá tvorba variant protilátek s implantovaným LM609 může být tudíž použita pro identifikaci optimalizované protilátky s implantovaným LM609. Kromě toho takový stupňovitý přístup také poskytuje identifikaci mnoha zesílených protilátek, které mají rozsáhlé různé zesílené aktivity.

Protilátka s implantovaným optimalizovaným LM609 může být také označena jako podobná protilátce s implantovaným LM609 nebo α_νβ₃ specificky implantovaná protilátka a je rozpoznatelná, protože ona nebo její funkční fragment si uchovávají funkční charakteristiku LM609. Například, varianty protilátky s implantovaným zesíleným LM609, které mají substituovánu jednu aminokyselinu a mají zesílenou aktivitu. Mohou být identifikovány a korelovány se specifickými aminokyselinovými substitucemi. Tyto aminokyselinové substituce lze kombinovat za vzniku protilátky s implantovaným nově modifikovaným LM609, která je testována na aktivitu. Taková kombinace výhodné substituce CDR aminokyseliny může vést ke vzniku protilátky s implantovaným optimalizovaným LM609 s násobnými CDR, které mají nejméně jednu aminokyselinovou substitucí nebo jednoduchou CDR, která má násobné aminokyselinové substituce, přičemž tato protilátka s implantovaným modifikovaným LM609 má zesílenou aktivitu.

Zesílené protilátky s implantovaným LM609, hlavně ty, které jsou optimalizovány funkční náhradou aminokyselinových zbytků v oblastech CDR, mají požadované zesílené vlastnosti jakoje zvýšená afinita. Protilátka se zvýšenou afinitou s implantovaným optimalizovaným LM609 bude mít například vyšší afinitu než rodičovská protilátka použitá pro introdukci funkční náhrady aminokyselin. Zvýšení aktivity je stanovováno vzhledem k referenční protilátce o podobné struktuře. Například, jestliže optimalizovanou protilátkou s implantovaným LM609 je intaktní protilátka obsahuj ící dva těžké řetězce a dva lehké řetězce, potom vyšší afinita je stanovena relativně ku intaktní rodičovské protilátce s implantovaným LM609, Obdobně, je-li optimalizovanou protilátkou s implantovaným LM609 Fab, je zvýšená afinita určena vzhledem k Fab rodičovské protilátky implantované LM609.

když není nezbytné projít v průběhu optimalizace mnoha optimalizačními stupni, aby bylo dosaženo vysoké afinity u protilátky s implantovaným LM609, zvýšení afinity může korelovat s počtem optimalizačních kroků. Protilátky s implantovaným LM609 jsou tudíž v různých rozsazích. Například, protilátka s implantovaným LM609 se zesílenou afinitou bude mít až asi dvojnásobně nebo ještě vyšší afinitu, obecně více než asi 2 až 5krát vyšší afinitu, vyšší než asi 4 až 5krát vyšší afinitu nebo asi 5 až 1 Okřát vyšší afinitu než referenční protilátka. V jednotlivých případech bude protilátka s implantovaným LM609 se zesílenou afinitou mít asi 10 až 50krát vyšší afinitu, vyšší asi SOkrát nebo asi lOOkrát vyšší afinitu než referenční protilátka.

Jak je popsáno výše, funkční náhrada aminokyselinových zbytků v CDR může být použita pro identifikaci protilátek s implantovaným LM609, které mají vyšší afinitu než rodičovské protilátky s implantovaným LM609. Shora i níže diskutované metody introdukce menších modifikací do Vitaxinu nebo do nukleotidových sekvencí kódujících protilátky s implantovaným LM609 mohou být použity pro tvorbu knihoven variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, včetně metod jako jsou mutageneze založená na kodonech, náhodná syntéza oligonukleotidů a parciálně degenerovaná syntéza oligonukleotidů. Mutageneze založená na kodonech

- 12CZ 302177 B6 může být například použita pro tvorbu knihovny variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, které mají jednoduché aminokyselinové substituce (viz příklad VI).

Po tvorbě knihovny variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 mohou být varianty exprimovány a skrínovány na vazebnou aktivitu vůči ανββ. Pro skrínink protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, které mají vazebnou aktivitu vůči α_νβ% existují metody dobře známé v daném oboru (Harlow a Lané, viz shora). Pro skrínování knihovny variant protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 s cílem identifikovat varianty, které si udržely vazebnou aktivitu vůči ctvp3, byla použita například ELISA (viz Příklad VI). Do další charakio terizace jsou brány pouze ty protilátky s implantovaným modifikovaným LM609, které uchovávají vazebnou aktivitu vůči a_vpr

Protilátky s implantovaným modifikovaným LM609, které mají vazebnou aktivitu vůči α_νβ3, mohou být dále charakterizovány, aby bylo určeno, která z protilátek s implantovaným modifiko15 váným LM609 má zesílenou aktivitu. Druh metody použité pro zjištění zesílené aktivity závisí na jednotlivých požadovaných charakteristikách. Jestliže je například požadována změněná vazebná aktivita, potom jsou použity metody, které umožňují stanovení vazebné afinity. Takové metody zahrnují vazebné metody, kompetitivní vazebné metody a metodu povrchově plazmonové rezonance, jak je popsáno v příkladu VI.

Introdukce jednoduché aminokyselinové substituce do oblastí CDR nebo do protilátky s implantovaným LM609 může být použita pro tvorbu knihovny protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 a skrínink na vazebnou aktivitu α_νβ3. Tyto protilátky s implantovaným modifikovaným mLM609, které mají vazebnou aktivitu vůči α_νβ3, mohou být dále charakterizovány pro určení protilátek, které mají zesílenou aktivitu, jako např. vyšší vazebnou afinitu. Použitím tohoto postupu bylo na variabilní oblasti těžkého řetězce (obrázek la, SEQ ID NOS: 2) a variabilní oblasti lehkého řetězce (obrázek 7, SEQ ID NOS:32), například vytvořeno mnoho protilátek s implantovaným zesíleným LM609, které měly jednoduché aminokyselinové substituce. Protilátky s implantovaným LM609 byly identifikovány na základě 2 až 13násobně zlepšené afinity vůči rodičovské protilátce s implantovaným LM609 (viz příklad VI).

Po identifikaci protilátek s implantovaným zesíleným LM609, které mají jednoduchou aminokyselinovou substituci, byly aminokyselinové mutace kombinovány pro další zesílení aktivity. Shora diskutované metody pro introdukci jednoduchých aminokyselinových substitucí do oblastí

CDR mohou být podobně použity pro kombinování aminokyselinových substitucí.

Například, kombinační knihovna aminokyselinových mutací měla za výsledek zesílení (ανβ? vazebná afinita byla vytvořena pomocí degenerovaných nukleotidů a dvojmístné hybridizačni mutageneze, jak je popsáno v příkladu VII, Protilátky s implantovaným zesíleným LM609, které obsahují násobné aminokyselinové substituce v oblastech CDR, byly vytvořeny za použití variabilních oblastí těžkých řetězců (viz obrázek la, SEQ ID NO: 2) a variabilních oblastí lehkých řetězců (obrázek 7, SEQ ID NO: 32). Protilátky s implantovaným LM609 byly identifikovány a měly 20násobně až více než 90násobně vyšší afinitu než rodičovská protilátka s implantovaným LM609.

Kromě kombinace aminokyselinových substitucí v oblasti CDR vedoucích ke tvorbě zesílených nebo optimalizovaných protilátek s implantovaným LM609, mohou být substituce aminokyselin v oblasti CDR také kombinovány s mutacemi v oblasti pozadí hostitelské molekuly, což přispívá k žádoucím vlastnostem protilátky s implantovaným LM609. Mutace v oblasti CDR nebo v oblasti pozadí, které zesilují aktivitu, mohou být tudíž spojovány pro další optimalizaci protilátek s implantovaným LM609.

Tento vynález dále poskytuje fragmenty nukleových kyselin kódujících těžké a lehké řetězce Vitaxinu, přičemž tyto fragmenty sestávají v podstatě z těch samých nukleotidů nebo z těch sa- 13 CZ 302177 B6 mých aminokyselinových sekvencí, jako variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců Vitaxinu. Variabilní oblast polypeptidu těžkého řetězce Vitaxinu sestává v zásadě z nukleotidů 1—351 a z aminokyselinových zbytků GInl-Serll7 na obrázku IA (SEQ ID NOS: 1, respektive 2). Variabilní oblast polypeptidu lehkého řetězce Vitaxinu sestává v zásadě z nukleotidů 1-321 ? a z aminokyselinových zbytků Glul-Lysl07 na obrázku IB (SEQ ID NOS: 3, respektive 4). Konce těchto variabilních oblastí kódujících nukleových kyselin nejsou kritické, pokud zamýšlené použití a funkce zůstávají stejné.

Doplňkové fragmenty k fragmentům variabilních oblastí jsou také poskytovány. Tyto fragmenty io zahrnují, například, nukleové kyseliny obsahující v podstatě tu samou nukleotidovou sekvenci jako CDR polypeptidu těžkého nebo lehkého řetězce Vitaxinu. Sekvence odpovídající sekvencím oblastí CDR Vitaxinu obsahují, například, ty oblasti, které definoval Kabat et al., viz výše, nebo případně ony oblasti definované Chothia et al., viz výše, rovněž jako ty, definované MacCallum et al., viz výše. Fragmenty oblastí CDR Vitaxinu pro každou ze shora uvedených definici odpo15 vídají sestavě nukleotidů uvedených dále v tabulce 2. Číslování sekvence nukleotidů je vzato z primární sekvence uvedené v obrázku 1A a 1B (SEQ ID NOS: 1 a 3) a odpovídá definicím již uvedeným v tabulce 1.

Tabulka 2: Vitaxinové CDR nukleotidové zbytky

	Kabat	Chothia	MacCaílum
VH CDR1	91-105	76-96	88-105
VH CDR2	148-198	157-168	139-177
VH CDR3	295-318	298-315	289-315
VL CDR1	70-102	76-96	88-108
VL CDR2	148-168	148-156	136-165
VL CDR3	265-291	271-288	265-288

Podobně, Vitaxinové CDR fragmenty pro každou ze shora uvedených definic odpovídají amino25 kyselinovým zbytkům uvedeným níže v tabulce 3. Číslo aminokyselinového zbytku je převzato z primární sekvence uvedené v obrázku IA a IB (SEQ ID NOS: 2 a 4) a souhlasí s definicemi uvedenými v tabulce 1.

Tabulka 3: Aminokyselinové zbytky oblastí CDR Vitaxinu

	Kabat	Chothia	MacCallum
VH CDR1	Ser31-Ser35	Gly26-Tyr32	Ser3O-Ser35
VH CDR2	Lys50-Gly66	Ser53-Gly56	Trp47-Tyr59
Vh CDR3	His99-Tyrl06	Asnl00-Alal05	AIa97-Alal05
VL CDR1	Gln24-His34	Ser26-His32	Ser30-Tyr36
VL CDR2	Tyr50-Ser56	Tyr50-Ser52	Leu46-Ile55
VL CDR3	Gln89-Thr97	Ser91-His96	GIn89-His96

Tento vynález také poskytuje fragmenty nukleových kyselin kódujících v podstatě tu samou 35 aminokyselinovou sekvenci jako u CDR oblastí polypeptidu těžkých a lehkých řetězců Vitaxinu.

-14CZ 302177 B6

Nukleové kyseliny kódující polypeptidy lehkých a těžkých řetězců Vitaxinu ajejich fragmenty jsou použitelné pro různé diagnostické a terapeutické postupy. Nukleové kyseliny Vitaxinu mohou být použity například pro produkci protilátek proti Vitaxinu ajeho funkčním fragmentům, které mají vazebnou specifitu a inhibiční aktivitu vůči integrinu α_νβΐ. Tato protilátka a její funkční fragmenty mohou být použity pro diagnózu nebo pro léčbu chorob způsobených α_νβί. Vitaxin ajeho funkční fragmenty mohou být použity, například, pro inhibici vazebné aktivity nebo jiných funkčních aktivit ανβ3, které jsou nezbytné pro rozvoj chorob zaviněných α_νβ3· Tyto jiné funkční aktivity nezbytné pro rozvoj chorob způsobených α_νβ₃ zahrnují, například, aktivaci a_vp3, transio dukci signálu zprostředkovanou α_νβ3, α_νβ3 zprostředkovanou prevenci apoptóze. Výhodou však zůstává, že Vitaxin neobsahuje žádné myší sekvence aminokyselinového pozadí a tudíž je málo antigenní, co se týče indukce hostitelské imunitní odpověď. Nukleové kyselinu Vitaxinu dle tohoto vynálezu mohou také být použity pro modelování funkčních ekvivalentů kódovaných polypeptidu těžkých a lehkých řetězců.

Tento vynález tedy poskytuje polypeptidy těžkého řetězce Vitaxinu a lehkého řetězce Vitaxinu nebo jejich funkční fragmenty. Tento polypeptid těžkého řetězce Vitaxinu má v podstatě tu samou sekvenci aminokyselin jako je uvedena na obrázku IA (SEQ ID NO: 2) nebo jeho funkční fragment, zatímco polypeptid lehkého řetězce Vitaxinu má v podstatě tu samou sekvenci amino20 kyselin jako je uvedena na obrázku 1B (SEQ ID NO:4) nebo jeho funkční fragment. Je poskytnuta rovněž protilátka proti Vitaxinu nebo proti jeho funkčnímu fragmentu. Tato protilátka je vytvořena ze shora uvedených lehkých a těžkých řetězců nebo jejich funkčních fragmentů a má selektivní vazebnou afinitu vůči α_νβ3· Tento vynález poskytuje nukleovou kyselinu kódující polypeptid lehkého řetězce protilátky s implantovaným LM609. Tato nukleová kyselina sestává z v podstatě té samé nukleotidové sekvence variabilní oblasti těžkého řetězce, jako je uvedena na obrázku 1A (SEQ ID NO: 1) a z v podstatě té samé nukleotidové sekvence variabilní části lehkého řetězce, jako je uvedena na obrázku 7 (SEQ ID NO: 31) nebo jeho fragmentu.

Protilátky s implantovaným LM609, včetně jejich funkčních fragmentů, jsou jiné než myší proti30 látky, které mají v podstatě tu samou vazebnou aktivitu, vazebnou specifitu a inhibiční aktivitu jako LM609. Zde popsané Fv fragmenty protilátek s implantovaným LM609jsou produkovány funkční náhradou CDR, jak je definováno v Kabat et al., dále jenom „Kabatovy oblasti CDR“, v polypeptidech variabilních oblastí lidských těžkých a lehkých řetězců Kabátovými oblastmi CDR odvozenými od LM609.

Funkční nahrazení Kabátovými oblastmi CDR je provedeno předběžně popsanými metodami implantace CDR, cožje předmětem U.S. Patentu 5,225,539, uvedeného výše. Substituce aminokyselinových zbytků mimo Kabatovy oblasti CDR může být provedena dodatečně, aby byly udrženy nebo zvýšeny užitečné vlastnosti, pokud takové aminokyselinové substituce neodpovída40 jí donorovým aminokyselinám vjednotlivých příslušných pozicích. Takové substituce poskytují ovlivnění vazebných vlastností, aniž by byly zahrnuty jakékoliv myší sekvenční charakteristiky na této protilátce mimo Kabatovy oblasti CDR. Γ když produkce těchto protilátek je zde popsána s odvoláním na protilátky s implantovaným LM609, substituce takovýchto nedonorových aminokyselin mimo rámec Kabátových oblastí CDR může být použita pro produkci v zásadě jakých45 koliv protilátek. Produkce protilátek s implantovaným LM609 je popsána níže v příkladu V.

Nukleotidové sekvence variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátek s implantovaným LM609 jsou uvedeny na obrázku 1 A, respektive 7. Tyto sekvence odpovídají v podstatě sekvencím, které kódují polypeptidy variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátky s implan50 tovaným LM609. Tyto řetězce jsou sestrojeny tak, aby obsahovaly souhlasná i nesouhlasná vlákna sekvencí kódujících protilátky s implantovaným LM609. Jednovláknové i dvouvláknové nukleové kyseliny jsou také zahrnuty, stejně jako například nekódující oblasti nukleových kyselin, jako introny, 5'- a 3'- netranslatované oblastí a regulační oblasti tohoto genu.

- 15CZ 302177 B6

Oblasti nukleotidů a aminokyselinových zbytků pro protilátky s implantovaným LM609 jsou identické stěmi, které byly popsány pro Vitaxin. Polypeptid variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky s implantovaným LM609 je například kódován nukleovou kyselinou o asi 351 nukleotidech délky, která začíná na amino terminálním Glnl zbytku variabilní oblasti a pokračuje do ? Serl 17 (obrázek 1 A, SEQ ID NOS: 1, respektive 2). Polypeptid variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky s implantovaným LM609 je kódován nukleovou kyselinou o délce asi 321 nukleotidů, počínaje amino terminálním zbytkem Glul variabilní oblasti až k Lysí07 (obrázek 7, SEQ ID NOS: 31, respektive 32). Jako v případě Vitaxinu, minoritní modifikace těchto nukleotidových sekvencí jsou brány jako součást nukleových kyselin kódujících variabilní oblasti lehkého a těžio kého řetězce ajejich funkčních fragmentů.

Tento vynález tedy také poskytuje nukleovou kyselinu kódující těžký řetězec protilátky s implantovaným LM609, kde tato nukleová kyselina kóduje v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce, jako je uvedeno na obrázku IA (SEQ ID NOS: 2) nebo jej í fragment.

Tento vynález obdobně také poskytuje nukleovou kyselinu kódující lehký řetězec protilátky s implantovaným LM609, kde tato nukleová kyselina kóduje v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce, jaká je uvedena na obrázku 7 (SEQ ID NOS:

32) nebo její fragment. Tento vynález obdobně také poskytuje nukleovou kyselinu kódující lehký řetězec protilátky s implantovaným LM609, přičemž tato nukleová kyselina kóduje v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci, jako je uvedena na obrázku 7 (SEQ ID NO:32) nebo její fragment.

Kromě konzervativních substitucí aminokyselin, jsou i minoritní modifikace nukleotidových sekvencí kódujících protilátku s implantovaným LM609, které poskytují funkční náhrady aminokyselin, také brány jako součást definice tohoto termínu. Určení aminokyselin, které je třeba změnit, je provedeno odborníky, na základě aktuálních a dostupných informací vztahujících se ke struktuře a funkci protilátek, rovněž jako aktuálních a dostupných informacích zahrnujících meto30 dy implantace CDR. Tato substituce funkčně ekvivalentních aminokyselin kódovaných nukleotidovými sekvencemi pro protilátku s implantovaným LM609 je rutinního charakteru a lze ji provádět metodami známými v tomto oboru. Jak bylo již dříve popsáno, tyto metody zahrnují, například, kodonově založenou mutagenezí, náhodnou syntézu oligonukleotidů a parciálně degenerovanou syntézu oligonukleotidů a jsou užitečné při produkci implantovaných protilátek, protože umožňují rychlou identifikaci ekvivalentních aminokyselinových zbytků bez nutnosti příslušných strukturních informací.

Tento vynález dále poskytuje fragmenty nukleových kyselin kódujících lehký a těžký řetězec protilátky s implantovaným LM609, kde tyto fragmenty sestávají v podstatě ze stejných amino40 kyselinových nebo nukleotidových sekvencí jako variabilní oblast polypeptidů lehkého a těžkého řetězce protilátky s implantovaným LM609. Jako v případě Vitaxinu, koncové části nukleových kyselin kódujících tyto variabilní oblasti nejsou kritické potud, pokud zamýšlený účel a funkce zůstávají stejné.

Přídavné fragmenty k fragmentům nukleových kyselin pro variabilní oblast jsou také poskytovány a obsahují, například, nukleové kyseliny sestávající z v podstatě těch samých sekvencí nukleotidů jako oblast CDR polypeptidu těžkého nebo lehkého řetězce protilátky s implantovaným LM609. Jako u Vitaxinu, sekvence odpovídající oblastem CDR protilátky s implantovaným LM609, obsahují, například, oblasti definované Kabat et al., viz výše, Chothia et al., viz výše, rovněž jako oblasti definované MacCallum et al., viz výše. CDR oblasti u protilátky s implantovaným LM609jsou podobné oblastem popsaným dříve pro Vitaxin. Tyto oblasti jsou navíc velmi dobře známy. Odborník je může snadno stanovit na základě udaných sekvencí LM609 a informací poskytnutých na tomto místě. Tento vynález tedy také poskytuje fragmenty nukleových kyselin kódující v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci jako má oblast CDR polypepti55 du těžkého nebo lehkého řetězce protilátky s implantovaným LM609.

- 16CZ 302177 B6

Jako u Vitaxinu, nukleové kyseliny, kódující polypeptidy těžkého a lehkého řetězce protilátky s implantovaným LM609 a jejich fragmenty, jsou použitelné pro různé diagnostické a terapeutické postupy. Například nukleové kyseliny, kódující protilátku s implantovaným LM609, mohou být použity pro produkci rekombinantních protilátek a jejich fragmentů, které mají vazebnou specifitu a inhibiční aktivitu vůči integrinů α_νβ3· Tato protilátka a její funkční fragmenty mohou být použity pro diagnózu nebo terapii nemoci způsobené ανβ?. Takové choroby a metody použití anti-ttvPs protilátek jsou již popsány v referencích na Vitaxin a jsou rovnocenně použitelné jako zde popsané protilátky s implantovaným LM609.

Tento vynález tedy poskytuje těžký řetězec protilátky s implantovaným LM609 a polypeptidy lehkého řetězce Vitaxinu nebo jejich funkční fragmenty. Polypeptid těžkého řetězce protilátky s implantovaným LM609 má v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci jako je uvedena na obrázku IA (SEQ ID NO: 2) nebojeho funkční fragment, zatímco polypeptid lehkého řetězce protilátky s implantovaným LM609 v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci jako je uvedena na obrázku 7 (SEQ ID NO: 32). Protilátka s implantovaným LM609 nebo její funkční fragment jsou také poskytnuty. Tato protilátka je utvořena ze shora uvedených polypeptidů lehkého a těžkého řetězce nebo z jejich fragmentů a má selektivní vazebnou afinitu vůči α_νβ₃.

Tento vynález poskytuje protilátku s implantovaným zesíleným LM609, která vykazuje selektivní vazebnou afinitu vůči α_νβ3· Tato protilátka s implantovaným zesíleným LM609 obsahuje nejméně jednu aminokyselinovou substituci v jedné nebo více oblastech CDR polypeptidů variabilní části těžkého řetězce implantované LM609 nebo polypeptidů variabilní části lehkého řetězce implantované LM609, přičemž vazebná afinita α_νβ3 této protilátky s implantovaným zesíleným LM609 je zachována nebo zesílena.

Pro identifikaci protilátek s implantovaným zesíleným LM609 byla sestrojena knihovna protilátek s implantovanými modifikovanými LM609, jak je popsáno shora a v příkladu VI.

Oblasti CDR u LM609 byly původně identifikovány a vybrány pro introdukci jednoduchých aminokyselinových substitucí. Při použití systému číslování dle Kabat et al., viz výše, byly pro mutagenezí vybrány tyto zbytky v CDR:

V_H CDR1 Gly-Phe-Thr-Phe-Ser Ser-Tyr-Asp-Met-Ser (SEQ ID NO:

34) (Gly^í6-Ser³⁵); VH CDR2 Trp-Val-Ala-Lys-Val-Ser-Ser-Gly-Giy-Gly (SEQ ID NO: 36) and Ser-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp-Thr-Val-Gln-Gly (SEQ ID NO : 38) (Trp⁴⁷-Gly‘^!) ; VH CDR3 Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser Phe-Ala-Tyr (SEQ ID NO : 40) (Ala’³-Tyr^10J) ; VL CDR1 Gln-Ala Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-His-LeuHis-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 42) (Gln²⁴-Tyr³⁶); VL CDR2 Leu-Leu-Ile-Arg-TyrArg-Ser Gln-Ser-Ile-Ser (SEQ ID NO : 44) (Leu⁴⁶-Ser^5í) a V_u CDR3 Gln-GlnSer-Gly-Ser-Trp-Pro-His-Thr (SEQ ID NO : 46) (Gln”-Thr⁹⁷).

- 17CZ 302177 B6

Nukleotidové sekvence kódující zbytky CDR vybrané pro mutagenezi byly:

V_H CDR1 GGA TŤC ACC TTC AGT AGC TAT GAC ATG TCT (SEQ ID

NO: 33); V_H CDR2 TGG GTC GCA AAA GTT AGT AGT GGT GGT GGT (SEQ ID NO: 35) a AGC ACC TAC TAT TTA GAC ACT GTG CAG GGC (SEQ ID NO: 37); V_H CDR3 GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT TAC (SEQ ID NO: 39); V_L CDR1 CAG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC CAC CTA CAC TGG TAT (SEQ ID NO: 41); V_L CDR2 CTT CTC ATC CGT TAT CGT TCC CAG TCC ATC TCT (SEQ ID NO: 43); and V_L CDR3 CAA CAG AGT GGC AGC TGG CCT CAC ACG (SEQ ID NO; 45).

Jednoduché aminokyselinové substituce mohou být zavedeny do oblastí CDR u protilátky s implantovaným LM609 aby vznikla populace protilátek s implantovaným modifikovaným LM609. Například, každá aminokyselina v jedné nebo více oblastech CDR kteroukoliv nebo všemi aminokyselinami za vzniku populace protilátek s implantovaným modifikovaným LM609 a tato populace může být skrín ována na přítomnost vazebné aktivity vůči ανβ?-1 když tato pop υιό láce vznikla mutováním aminokyselin v oblastech CDR, zrovna tak může být tato populace konstruována změnami učiněnými ve zbytcích v oblasti pozadí molekuly protilátky. Takové mutace v těchto variabilních oblastech mohou být prováděny odděleně, kombinovaně nebo po krocích. Tento vynález tedy také poskytuje protilátku s implantovaným zesíleným LM609, kde je příslušná aminokyselinová substituce provedena v oblasti CDR nebo v oblasti pozadí.

Tento vynález kromě toho poskytuje protilátku s implantovaným zesíleným LM609, která má zesílenou vazebnou afinitu. Tyto protilátky s implantovaným zesíleným LM609 vykazující zesílenou vazebnou afinitu, včetně těch, které obsahují nejméně jednu z následujících oblastí s jednoduchou aminokyselinovou substitucí: V_H CDR1 vybrané ze skupiny sestávající z:

Gly-Thr -Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp-Met-Ser (SEQ ID NO: 48), Gly-Phe -ThrTrp-Ser-Ser-Tyr-Asp-Met-Ser (SEQ ID NO; 50) a Gly-Phe-Thr-Phe-Leu-Ser₂₍₎ Tyr-Asp-Met-Ser (SEQ ID NO: 52);

a V_H CDR2 vybrané ze skupiny sestávající z:

- 18CZ 302177 B6

Trp-Val-Ala-Lys-Val-Lys-SerGly-GIy-Gly (SEQ ID NO: 54), Ser-Thr-Tyr-Tyr-Pro-Asp-Thr-Val-Gln-Gly (SEQ ID NO: 56) a Ser Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp-Thr-VakGIu-Gly (SEQ ID NO:

58); Vh CDR3 vybrané ze skupiny sestávající z: Ala-Arg-His-Asn-His-GlySer-Phe-Ala-Tyr (SEQ ID NO: 60), Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Tyr-Ala-Tyr (SEQ ID NO: 62), Ala-Arg-His-Asn-Tyr-GIy-Ser-Phe-Asp-Tyr (SEQ ID NO:

64), Aía-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Phe-Tyr-Tyr (SEQ ID NO: 66), Ala-Arg His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (SEQ ID NO: 68), Ala-Arg-His-Asn-TyrGly-Ser-Phe-Ala-Thr (SEQ ID NO: 70), Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-PheAla-Asp (SEQ ID NO: 72), Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Phe-AIa-GIu (SEQ ID NO: 74), Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Phe-Ala-Met (SEQ ID NO: 76), Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Phe-Ala-Gly (SEQ ID NO: 78) a Ala-Arg-HisAsn-Tyr-Gly-Ser-Phe-Ala-Ala (SEQ ID NO: 80); V_L CDR1 Gln-Ala-Ser-GlnSer-Ile-Ser-Asn-Phe-Leu-His-Trp-Tyr (SEQ ID NO: 82); V_L CDR2 Leu-LeuIle-Arg-Tyr-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser (SEQ ID NO: 84); Vl CDR3 vybrané ze skupiny sestávající z: Gln-Gln-Ser-Asn-Ser-Trp-Pro-His-Thr (SEQ ID NO: 86), Gln-Gln-Ser-Thr-Ser-Trp-Pro-His-Thr (SEQ ID NO: 88), Gln-Gln-Ser-Gly-SerTrp-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO: 90) Gln-Gln-Ser-Gly-Ser-Trp-Pro-Gln-Thr (SEQ ID NO: 92).

Nukleotidové sekvence kódující jednoduché aminokyselinové substituce v těchto oblastech CDR jsou:

V_H CDR1 GGA ACT ACC TTC AGT AGC TAT GAC ATG TCT (SEQ ID NO: 47), GGA TTC ACC TGG AGT AGC TAT GAC ATG TCT (SEQ ID NO: 49) a GGA TTC ACC TTC CTG AGC TAT GAC ATG TCT (SEQ ID NO: 51); V_H CDR2 TGG GTC GCA AAA GTT AAA AGT GGT

GGT GGT (SEQ ID NO: 53), AGC ACC TAC TAT CCT GAC ACT GTG CAG GGC (SEQ ID NO: 55) a AGC ACC TAC TAT TTA GAC ACT GTG GAG GGC (SEQ ID NO: 57); V_H CDR3 GCA AGA CAT AAC CAT GGC AGT TTT GCT TAC (SEQ ID NO: 59), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TAT GCT TAC (SEQ ID NO: 61), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GAT TAC (SEQ ID NO: 63), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT TAT TAC (SEQ ID NO: 65), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT TCT (SEQ ID NO: 67), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT ACT (SEQ ID NO: 69), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT GAT (SEQ ID NO: 71),

- 19CZ 302177 B6

GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT GAG (SEQ ID NO: 73), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT ATG (SEQ ID NO: 75), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT GGG (SEQ ID NO: 77) a GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT GCT GCT (SEQ ID NO: 79); V_L CDR1 CAG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC TTT CTA CAC TGG TAT (SEQ ID NO: 81); V_L CDR2 CTT CTC ATC CGT TAT TCT TCC CAG TCC ATC TCT (SEQ ID NO: 83) a V_LCDR3 CAA CAG AGT AAT AGC TGG CCT CAC ACG (SEQ ID NO: 85),

CAA CAG AGT ACT AGC TGG CCT CAC ACG (SEQ ID NO: 87), CAA CAG AGT GGC AGC TGG CCT CTG ACG (SEQ ID NO: 89) a CAA CAG AGT GGC AGC TGG CCT CAG ACG (SEQ ID NO: 91).

Protilátky s implantovaným zesíleným LM609 obsahující oblasti CDR s jednoduchými aminokyselinovými substitucemi a s vyšší vazebnou afinitou než má rodičovská protilátka s implanto5 váným LM609 mohou být také identifikovány, přičemž jsou spojením odpovídajících aminokyselinových mutací vytvořeny protilátky s implantovaným nově modifikovaným LM609. Identifikace je provedena skríninkem na vazebnou aktivitu α_νβ3· V některých kombinacích budou tyto protilátky s implantovaným LM609 obsahovat nejméně jednu oblast CDR, která má jednu nebo více aminokyselinových substitucí. Tento vynález poskytuje protilátku s implantovaným zesílelo ným LM609, která obsahuje nejméně jednu z následujících oblastí CDR obsahujících násobné aminokyselinové substituce: V_H CDR3 vybraná ze skupiny sestávající z: AlaArg-His-Asn-His-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (SEQ ID NO: 94); Ala-Arg-His-AsnHis-Gly-Ser-Phe-Tyr-Ser (SEQ ID NO: 96); Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-SerPhe-Tyr-Glu (SEQ ID NO: 98) a Ala-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Ser-Phe-Tyr-Ser (SEQ ID NO: 100).

Nukleotidové sekvence kódující oblasti CDR s násobnými aminokyselinovými substitucemi jsou:

V_H CDR.3 GCA AGA CAT AAC CAT

GGC AGT TTT GCT TCT (SEQ ID NO: 93), GCA AGA CAT AAC CAT GGC AGT TTT TAT TCT (SEQ ID NO: 95), GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT TAT GAG (SEQ ID NO: 97) a GCA AGA CAT AAC TAC GGC AGT TTT TAT TCT (SEQ ID NO: 99).

Tento vynález poskytuje také protilátku s implantovaným zesíleným LM609, která má selektivní vazebnou afinitu vůči α_νβ.3, přičemž tato protilátka s implantovaným zesíleným LM609 obsahuje nejméně jednu aminokyselinovou substituci ve dvou nebo více oblastech CDR polypeptidů variabilní oblasti těžkého řetězce implantovaného LM609 nebo polypeptidů variabilní části lehkého řetězce implantovaného LM609.

Protilátka s implantovaným zesíleným LM609, která obsahuje nejméně jednu aminokyselinovou substituci ve dvou nebo více oblastech CDR polypeptidů variabilní oblasti těžkého řetězce implantovaného LM609 nebo polypeptidů variabilní oblasti lehkého řetězce implantovaného

-20CZ 302177 B6

LM609, může zahrnovat protilátku s implantovaným LM609 obsahující kombinaci oblastí CDR vybraných ze skupiny sestávající z:

V_L CDR1 SEQ ID NO: 57 a V_H

CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDR1 SEQ ID NO : 57, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDRI SEQ ID NO: 57, V_H CDR2 SEQ ID NO : 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO : 52; V_L CDRI SEQ ID NO: 57, V_H CDR2 SEQ ID NO : 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO : 51; V_L CDRI SEQ ID NO : 57 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 52; V_L CDR3 SEQ ID NO: 59, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDR3 SEQ ID NO : 61 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50 a V_L CDR3 SEQ ID NO: 61, V_H CDR2 SEQ ID NO : 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50.

Kromě protilátek s implantovaným zesíleným LM609 obsahujících dvě nebo více oblasti CDR sjednoduchými aminokyselinovými substitucemi, poskytuje tento vynález také protilátky s implantovaným zesíleným LM609, kde nejméně jedna z oblastí má dvě nebo více aminokyselinových substitucí.

io Protilátky s implantovaným zesíleným LM609, které mají nejméně jednu oblast CDR se dvěma nebo více aminokyselinovými mutacemi, mohou zahrnovat také ty protilátky, které obsahují tuto kombinaci oblastí CDR vybraných ze skupiny sestávající z:

V_L CDRI SEQ ID NO: 57, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 63; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 63; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61,

V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 64; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 63; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 65 a V_L CDR3 SEQ ID NO: 61, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 66.

Tento vynález kromě toho poskytuje protilátku s implantovaným LM609 s vysokou afinitou, která má selektivní afinitu vůči α_νβ3· Tato protilátka s implantovaným LM69 s vysokou afinitou obsahuje nejméně jednu aminokyselinovou substituci v jedné nebo více oblastech CDR polypeptidu variabilní oblasti těžkého řetězce implantované LM609 nebo polypeptidu variabilní oblasti lehkého řetězce implantované LM609, přičemž vazebná afinita této protilátky s implantovaným

LM609 s vysokou afinitou vůči ανβ3 je zesílena.

Protilátky s vysokou afinitou mohou zahrnovat také ty protilátky, které obsahují tuto kombinaci oblastí CDR vybraných ze skupiny sestávající z: V_L

CDRI SEQ ID NO: 57 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDRI SEQ ID NO: 57, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDRI SEQ ID NO: 57, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 52;

V_L CDRI SEQ ID NO : 57, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO : 51; V_L CDRI SEQ ID NO: 57 a V_H CDR3 SEQ ID NO : 52; V_L CDR3 SEQ

-21 C7. 302177 B6

ID NO : 59, V_H CDR2 SEQ ID NO : 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDR3 SEQ ID NO : 61, V_H CDR2 SEQ ID NO : 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 63; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61, V_H CDR2 SEQ ID NO : 44, V_H CDR3 SEQ ID NO: 50; V_L CDR1 SEQ ID NO : 57, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 63; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO : 64; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61 a V_H CDR3 SEQ ID NO : 63; V_L CDR3 SEQ ID NO: 61 a V» CDR3 SEQ ID NO: 65 a V_L CDR3 SEQ ID NO: 61, V_H CDR2 SEQ ID NO: 44 a V_H CDR3 SEQ ID NO: 66.

Jak je popsáno shora, protilátky se zesílenou LM609 mohou být dále modifikovány zaváděním dodatečných mutací do jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v jedné nebo více oblas5 těch CDR nebo v pozadí. Jak je zde uveřejněno, klon 6H6 protilátky s implantovaným zesíleným

LM609 (tabulka 10) byl dále modifikován zavedením mutace do jedné nebo více oblastí CDR (viz příklad VIN). U těchto 6H6 variant byla nalezena vysoká vazebná afinita vůči α_νβ₃ a rezistence proti proteolyze.

in Tento vynález dále poskytuje protilátky s implantovaným zesíleným LM609 obsahující

Vh CDR2 Lys-Val-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Pro-Asp-Thr-ValGln-Gly (SEQ ID NO: 104); V_H CDR3 His-Leu-His-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (SEQ ID NO : 106) nebo Vl CDR1 Gln-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-Phe-Leu-His (SEQ ID NO :

110).

Tento vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z: SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105 a SEQ ID NO: 109.

Tento vynález také poskytuje protilátku s implantovaným zesíleným LM609 obsahující

V_H CDR1 Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp-Met-Ser (SEQ ID NO: 34); V_H

CDR2 Lys-Val-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp-Thr-ValGlnGly (SEQ ID NO: 102);

V_H CDR3 His-Leu-His-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (SEQ ID NO: 106); V_L CDR1 Gln-AIa-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-His-Leu-His (SEQ ID NO: 108); V_L CDR2 Tyr-Arg-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser (SEQ ID NO: 112) a V_L CDR3 Gln-Gln-Ser-GlySer-Trp-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO: 90).

Tento vynález také poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci 20 označovanou jako SEQ ID NO: 33 kódující V_H CDR1; nukleotidovou sekvenci označenou jako

SEQ ID NO: 101 kódující V_H CDR2; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 105 kódující V_H CDR3; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 107 kódující V_L CDR1; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 111 kódující Vl CDR2 nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 89 kódující V_L CDR3.

-22CZ 302177 B6

Tento vynález kromě toho poskytuje protilátku s implantovaným zesíleným LM609, která obsa· huje

V_H CDR1 Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-TyrAsp-Met-Ser (SEQ ID NO : 34);

Vh CDR2 Lys-Val-Ser-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp-Thr-ValGln-Gly (SEQ ID NO : 102); V_H CDR3 His-Leu-His-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (SEQ ID NO : 106); V_L CDR1 Gln-AIa-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-Phe-Leu-His (SEQ ID NO: 110); V_L CDR2 Tyr-Arg-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser (SEQ ID NO : 112) a V_L CDR3 Gln-Gln-Ser-Gly-Ser-Trp-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO: 90).

Tento vynález kromě toho poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEQ ID NO: 33 kódující Vh CDR1; nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEQ ID NO: 101 kódující V_H CDR2; nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEQ ID NO: 105 kódující V_H CDR3; nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEQ ID NO: 109 kódující V_L CDR1; nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEQ ID NO: 111 kódující V_L CDR2 a nukleoio tidovou sekvenci popsanou jako SEQ ID NO: 89 kódující V_L CDR3.

Tento vynález dále poskytuje protilátku s implantovaným zesíleným LM609 obsahujícím:

V_H CDR1 Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp-Met-Ser (SEQ ID NO: 34); V_H CDR2 Lys-Val-Ser-Ser-Gly-Gly-GIy-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Pro-Asp-Thr-Val-GlnGly (SEQ ID NO: 104); V_H CDR3 His-Leu-His-Gly-Ser-Phe-Ala-Ser (SEQ ID NO: 106); V_L CDR1 Gln-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser-Asn-Phe-Leu-His (SEQ ID NO: 110); V_L CDR2 Tyr-Arg-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser (SEQ ID NO: 112) a V_L CDR3 Gln-Gln-Ser-Gly-Ser-Trp-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO: 90).

ís Tento vynález dále poskytuje molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidové sekvence označené jako: SEQ ID NO: 33 kódující V_H CDR1; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 103 kódující V_H CDR2; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 105 kódující V_H CDR3; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 109 kódující V_L CDR1; nukleotidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 111 kódující V_L CDR2 a nukleo20 tidovou sekvenci označenou jako SEQ ID NO: 89 kódující V_L CDR3.

Tento vynález kromě toho poskytuje nukleovou kyselinu kódující protilátku s implantovaným zesíleným LM609, která má selektivní vazebnou afinitu k α_νβ₃. Tato protilátka s implantovaným zesíleným LM609, kódovaná touto nukleovou kyselinou, obsahuje nejméně aminokyselinovou substituci v jedné nebo ve více oblastech CDR polypeptidu variabilní oblastí těžkého řetězce implantované LM609 nebo polypeptidu variabilní oblasti lehkého řetězce implantované LM609. přičemž vazebná afinita této protilátky s implantovaným zesíleným LM609 vůči α_νβ₃ zůstává zachována nebo je zesílena.

Tento vynález dále poskytuje nukleovou kyselinu kódující protilátku s implantovaným LM609 s vysokou afinitou, která má selektivní vazebnou afinitu vůči α_νβ₃. Tato protilátka s implantovanou LM609 s vysokou afinitou, kódovaná touto nukleovou kyselinou, obsahuje nejméně jednu aminokyselinovou substituci v jedné nebo více oblastech CDR polypeptidu variabilní oblasti těžkého řetězce implantovaného LM609 nebo polypeptidu variabilní oblasti lehkého řetězce implan35 tovaného LM609, přičemž má aktivitu vůči integrinů α_νβ₃ z rodiny β₃. Žádná aminokyselinová

-23CZ 302177 B6 nebo nukleotidová sekvence monoklonální protilátky LM609 nebyla nikdy předtím izolována ani charakterizována.

Tato izolace a charakterizace nukleové kyseliny kódující LM609 byla provedena pomocí technik s známých v tomto oboru, které jsou popsány dále v příkladech. Jenom ve stručnosti, byla vytvořena cDNA zhybridomu LM609 a byla použita jako zdroj, vůči kterému byly izolovány nukleové kyseliny kódující LM609. Izolace byla provedena nejprve určením N-terminální aminokyselinové sekvence pro každý z polypeptidů lehkého i těžkého řetězce a potom zesílením sekvencí cDNA, které kódují protilátku, pomocí PCR. 5' primeiy byly reverzně přeloženy, aby odpovídaly in nově určeným N-terminálním aminokyselinovým sekvencím zatímco 3 primery odpovídaly sekvencím v podstatě stejným se sekvencemi konstantní oblasti protilátky. Zesílení a klonování těchto produktů mělo za výsledek izolaci nukleových kyselin kódujících těžké a lehké řetězce

LM609.

i? Tyto nukleotidové sekvence odpovídající aminokyselinovým sekvencím variabilních oblastí lehkých a těžkých řetězců LM609 jsou uvedeny na obrázku 2A, respektive 2B. Tyto sekvence v podstatě odpovídají těm sekvencím, které kódují tyto variabilní oblasti polypeptidů těžkých a lehkých řetězců LM609. Jako o nukleových kyselin Vitaxinu, do těchto nukleových kyselin LM609 jsou také zahrnuty obě, souhlasná i nesouhlasná, vlákna sekvencí kódujících LM609.

2o Jednovláknové i dvouvláknové nukleové kyseliny jsou také zahrnuty, rovněž jako například nekódující části těchto nukleových kyselin, takjako cistrony, nepřeložené 5-' a 3- oblasti a regulační sekvence tohoto genu.

Jak je uvedeno na obrázku 2A, je polypeptid variabilní oblasti těžkého řetězce LM609 kódován nukleovou kyselinou délky asi 351 nukleotidů, která začíná na amino terminálním zbytku Glul až zbytku Alal 17. Těžký řetězec této myší LM609 protilátky má lgG2a konstantní oblast. Polypeptid variabilní oblasti lehkého řetězce LM609, který je znázorněn na obrázku 2B je kódován nukleovou kyselinou o délce asi 321 nukleotidů, která začíná na amino koncovém Aspl variabilní oblasti až Lysí 07. Ve funkční protilátce má LM609 konstantní oblast v kappa lehkém řetěz30 Cl.

Takjako v případě Vitaxinu, minoritní modifikace těchto LM609 nukleotidových sekvencí jsou také chápány jako nukleové kyseliny kódující lehký a těžký řetězec. Takové minoritní modifikace jsou zahrnovány a chápány jako nukleové kyseliny kódující polypeptidy lehkých a těžkých řetězců potud, pokud tyto nukleové kyseliny nebo kódované polypeptidy zachovávají některé nebo všechny ze svých popsaných funkcí.

Tento vynález tedy také poskytuje nukleovou kyselinu kódující těžký řetězec LM609 nebo funkční fragment, přičemž tato nukleová kyselina kóduje v podstatě tu samou aminokyselinovou to sekvenci variabilní oblasti monoklonální protilátky LM609, jako je uvedena na obrázku 2A (SEQ

ID NO: 6) nebo její fragment. Tento vynález obdobně také poskytuje nukleovou kyselinu kódující lehký řetězec LM609 nebo jeho funkční fragment, přičemž tato nukleová kyselina kóduje v podstatě tu samou aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti monoklonální protilátky, jako je uvedena na obrázku 2B (SEQ ID NO: 8) nebo jejího fragmentu.

Tento vynález dále poskytuje fragmenty nukleových kyselin kódujících lehký a těžký řetězec

LM609, přičemž tyto fragmenty obsahují v podstatě tu samou nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvenci jako variabilní oblast polypeptidů lehkého nebo těžkého řetězce LM609. Tato variabilní oblast tohoto polypeptidu těžkého řetězce LM609 sestává v podstatě z nukleotidů 150 351 a z aminokyselinových zbytků GIul-Alal 17 na obrázku 2A (SEQ ID NOS: 5, respektive 6).

Variabilní oblast polypeptidu lehkého řetězce sestává v zásadě z nukleotidů 1-321 a z aminokyselinových zbytků Aspl až Lys 107 na obrázku 2B (SEQ ID NOS: 7, respektive 8). Konec těchto nukleových kyselin kódujících tyto variabilní oblasti není rozhodující, pokud zamýšlené postupy a funkce zůstávají stejné. Tyto zamýšlené postupy a funkce zahrnují, například, použití

-24CZ 302177 B6 pro produkci rekombinantních polypeptidů nebo hybrid izačn ich oček pro sekvence variabilních oblastí těžkých a lehkých řetězců.

Jsou také poskytovány fragmenty doplňkové k fragmentům nukleových kyselin variabilních 5 oblastí. Tyto fragmenty zahrnují, například, nukleové kyseliny obsahující v podstatě tu samou nukleotidovou sekvenci jako má oblast CDR polypeptidů těžkého nebo lehkého řetězce LM609.

Sekvence odpovídající těmto CDR oblastem LM609, zahrnují například ty oblasti, které jsou uvnitř variabilních oblastí definovaných Kabat et al., viz výše; eventuelně oblastí definovaných Chothia et al., viz výše; rovněž tak jako uvnitř oblastí definovaných MacCallum et ak, viz výše. io Tyto fragmenty CDR LM609 pro každou ze shora uvedených definic odpovídají nukleotidům uvedeným v tabulce 4. Použité číslování nukleotidových sekvencí je převzato z primárních sekvencí uvedených na obrázku 2A a 2B (SEQ ID NOS: 5 a 7) a souhlasí s definicemi uvedenými dříve v tabulce 1.

Tabulka 4: LM609 CDR nukleotidové zbytky

	Kabat	Chothia	MacCallum
VH CDR1	91-105	76-96	88-105
VH CDR2	148-198	157-168	139-177
VH CDR3	295-318	298-315	288-315
VL CDR1	70-102	76-96	88-108
VL CDR2	148-168	148-156	136-165
VL CDR3	265-291	271-288	265-288

Fragmenty LM609 CDR pro každou ze shora uvedených definici odpovídají obdobně aminokyselinovým zbytkům uvedeným níže v tabulce 5. Číslování aminokyselinových zbytků je převzato z primárních sekvencí uvedených na obrázku 2A a 2B (SEQ ID NOS: 6 a 8) a souhlasí s definicemi uvedenými v tabulce 1.

Tabulka 5: LM609 CDR aminokyselinové zbytky

	Kabat	Chothia	MacCallum
VH CDR1	Ser31-Ser35	Gly26-Tyr32	Ser30-Ser35
VH CDR2	Lys50-Gly66	Ser53-Gly56	Trp47-Tyr59
VH CDR3	His99-TyrlO6	AsnlO0-Alal05	Ala97-AlalO5
VL CDR1	Gln24-His34	Ser26-His32	Ser30-Tyr36
VL CDR2	Tyr50-Ser56	Tyr50-Ser52	Leu46-Ile55
VL CDR3	Gln89-Thr97	Ser91-His96	Gln89-His96

Nukleové kyseliny kódující polypeptidy těžkého a lehkého řetězce ajejich fragmenty jsou použitelné pro různé diagnostické a terapeutické účely. Například nukleové kyseliny LM609 mohou být použity pro produkci rekombinantních LM6Ó9 protilátek ajejich funkčních fragmentů, které mají vazebnou specifitu a inhibiční aktivitu vůči integrinu α_νβ.3. Tato protilátka a její funkční

-25CZ 302177 B6 fragmenty mohou být použity pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti α_νβί ve vzorku pro diagnosu možnosti nebo výskytu choroby podmíněné α_νβ3·

Na druhé straně lze rekombinantní LM609 protilátky a jejich funkční fragmenty použít pro léčbu chorob nebo pathologických stavů způsobených ανβ?. Jako u Vitaxinu, mohou být rekombinantní LM609 a jejich funkční fragmenty použity pro inhibici takové vazebné aktivity nebo jiných funkčních aktivit ct_vp3, které jsou nezbytné pro rozvoj choroby nebo patologického stavu způsobených a_vp3.

io Nukleové kyseliny kódující LM609 podle tohoto vynálezu mohou být také použity pro modelování funkčních ekvivalentů kódovaných polypeptidů těžkého a lehkého řetězce. Takové funkční ekvivalenty mohou, například, zahrnovat syntetická analoga nebo mimetika kódovaných polypeptidů nebo jejich funkčních fragmentů. Specifický příklad může zahrnovat peptidová mimetika oblastí CDR LM609, které si zachovávají poněkud nebo v podstatě úplně stejnou vazebnou i? a inhibiční aktivitu jako má LM609. Nukleové kyseliny kódující LM609 mohou být kromě toho použity pro konstrukci a produkci nukleových kyselin, které kódují modifikované formy nebo deriváty protilátek LM609, polypeptidy jejich těžkých a lehkých řetězců a jejich funkční deriváty. Jak bylo již dříve popsáno, takovéto modifikované formy nebo deriváty obsahují, například, jiné než myší protilátky, polypeptidy jejich odpovídajících těžkých a lehkých řetězců a jejich

2o funkčních fragmentů, které mají tu samou vazebnou a inhibiční aktivitu jako LM609.

Tento vynález také poskytuje metodu léčby choroby způsobené ct_vp3. Tato metoda sestává z podání účinného množství Vitaxinu, protilátky s implantovaným LM609, protilátky s implantovaným zesíleným LM609 nebo jejich funkčních fragmentů za podmínek dovolujících vazbu k a_vp3- Také poskytuje metodu inhibice funkce α_νβ3· Tato metoda sestává ze styku α_νβ3 s Vitaxinem, s protilátkou s implantovaným LM609 nebo s jejich funkčním fragmentem, za podmínek, které dovolují vazbu na a_vp3.

Jak bylo již popsáno, Vitaxin a protilátky implantovaným LM609 jsou monoklonální protilátky, io které mají v zásadě všechny vazebné charakteristiky jako jejich rodičovská CDR-donorová protilátka LM609. Tyto charakteristiky zahrnují, například, průkaznou vazebnou specifitu a afinitu vůči integrinu a_vp3. Níže uvedený příklad prokazuje tyto vazebné vlastnosti a dále ukazuje, že vazba těchto protilátek k a_vp3 inhibuje vázání a funkci ligandu a_vp3- Vitaxin a protilátky s implantovaným LM609 jsou tedy použitelné pro mnoho diagnostických léčebných postupů směrovaných k inhibici ctyps funkce.

Integrin a_vp3 účinkuje v mnoha dějích spojených s adhezi a migrací buněk. Poruchy funkce nebo regulace integrinu, jeho funkce, nebo poruchy buněk exprimujících integrin, jsou spojeny s velkým počtem chorob nebo patologických stavů. Uvedená inhibice vazby nebo funkce ανβί může být tedy použita k léčbě nebo ke snížení různých patologických podmínek způsobených α_νβ3·

Dále jsou popsány příklady několika patologických stavů podmíněných ανβι, protože inhibice přinejmenším tohoto integrinu snižuje počet těchto stavů. Tyto příklady jsou myšleny jako reprezentativní a nikoliv jako výčet všech chorob podmíněných a_vp3. Existuje mnoho patologických stavů kromě těch, které jsou dále diskutovány, při kterých je porušena regulace vazby nebo funkce α_νβ3 neboje porušena regulace buněk, které exprimují tento integrin, a při kterých mohou být patologické stavy zlepšeny, případně budou zlepšeny, inhibováním vazby a_vp3- Ty patologické stavy, které vykazují tato kriteria, jsou v tomto vynálezu zahrnovány do tohoto termínu, tak jak je zde užíván.

Angiogenese neboli neovaskularizace, je proces, při kterém jsou formována nová krevní řečiště z preexistujících řečišť v tkáních. Jak je popsáno dále, tento proces je podmíněn endoteliálními buňkami, které exprimují α_νβ3, přičemž inhibice přinejmenším tohoto integrinu inhibuje růst nových řečišť. Je mnoho patologických stavů, které vyžadují tvorbu nových krevních řečišť nebo

-26CZ 302177 B6 neovaskularizaci tkání a inhibice tohoto procesu inhibuje tento patologický stav. Takové patologické stavy, které potřebují neovaskularizaci pro růst nebo zachování, jsou označovány jako α_νβ₃ podmíněné choroby. Rozsah léčby nebo zmenšení účinku těchto chorob, bude tudíž závislé na rozsahu inhibice neovaskularizace. Tyto choroby, způsobované α_νβ₃, zahrnují například, zánětlívé poruchy jako jsou imunitní a neimunitní záněty, chronický kloubový reumatismus, psoriáza, poruchy spojené s nepatřičným nebo neodpovídajícím porušením řečiště, jako je diabetická retinopathie, neovaskulámí glaukom a proliferace kapilár v aterosklerotických plátech, rovněž jako u rakovinných poruch. Tyto rakovinné poruchy mohou zahrnovat, například, pevné tumory, tumorové metastázy, angiofibrom, retrolental, fibroplasii, hemangiom, Kaposiho sarkom a jiné rakoviny, které vyžadují neovaskularizaci pro podporu růstu tumoru. Kromě těchto chorob jsou za angiogenní pokládány psoriasis a reumatická artritida, rovněž jako retinální choroby, jako maculámí degenerace. Mezi jiné choroby, než které vyžadují nová krevní řečiště, ale jsou závislá na α_νβ₃. patří například restenóza a osteoporóza.

Léčba chorob způsobených α_νβ₃ může být provedena podáváním účinného množství Vitaxinu, protilátky s implantovaným LM609 nebo s implantovaným zesíleným LM609 nebo jejich funkčními fragmenty, tak aby došlo k vazbě na α_νβ₃ a inhibici jeho funkce. Podání léku může být provedeno různými způsoby, známými v oboru.

Výběr metody bude záviset na specifické chorobě způsobené α_νβ₃ a může, například, zahrnovat in vivo, in šitu a ex vivo podání Vitaxinu, protilátky s implantovaným LM609 nebo jeho funkčního fragmentu, do buněk, tkání, orgánů a organizmů. Tyto protilátky nebo funkční fragmenty mohou být navíc podány jedinci, který vykazuje příznaky nebo při riziku objevení se choroby zaviněné α_νβ₃. Definitivní klinická diagnosa choroby způsobené α_νβ₃ zaručuje podání Vitaxinu, protilátky s implantovaným LM609 nebo jejich funkčního fragmentu. Profylaktická aplikace je zaručena v případech, kde mechanismy chorob způsobených α_νβ₃ předcházejí vystoupení zjevných klinických příznaků choroby. Jedinci s rodinnou zátěží choroby nebo s věrohodně předpovězeným rizikem mohou být léčeni proíylakticky, aby bylo zabráněno mechanizmům působení α_νβ₃ ještě před jejich příznaky.

Vitaxin, protilátky s implantovaným LM609, případně s implantovaným zesíleným LM609 mohou být podávány v různých formulacích a farmaceuticky přijatelných nosičích pro účinnou léčbu nebo redukci rozsahu choroby způsobené α_νβ₃. Tyto formulace a farmaceuticky přijatelné nosiče jsou odborníkům dobře známa. Kromě toho mohou být Vitaxin, protilátka s implantovaným LM609 nebo jejich funkční fragmenty podávány s jinými kompozicemi, které mohou zesilovat nebo podporovat léčbu nebo snížení rozsahu choroby způsobené α_νβ₃. Současné podání Vitaxinu a protilátky s implantovaným LM609 pro inhibici tumorově indukované neovaskularizace a chemoterapeutických léčiv pro přímou inhibici růstu tumoru, je specifický případ, kdy podání jiné kompozice může zesílit nebo podpořit léčbu choroby způsobené α_νβ₃.

Vitaxin, protilátka s implantovaným LM609 nebo funkční fragmenty jsou podávány konvenčními metodami, v dávkách, které jsou dostatečné způsobit inhibici vazby integrinu α_νβ₃ z hlediska patologie. Inhibici lze měřit různými metodami známými v oboru, jako je imunohistochemie in šitu pro prevalenci buněk obsahujících α_νβ₃ v místě choroby, rovněž jako, například, pozorované zmenšení rozsahu symptomů choroby způsobené α_νβ₃. Způsoby podání in vivo mohou zahrnovat intraperitoneální, íntravenózní a subkutánní podání Vitaxinu, protilátky s implantovaným LM609 nebo jejich funkčního fragmentu. Dávky protilátkových léčiv jsou známy nebo mohou být odborníkem rutinně určeny. Typické podávané dávky jsou, například, tak vysoké, aby bylo dosaženo jejich koncentrace v plazmě od asi 0,01 pg/ml do asi 100 pg/ml, lépe asi Ιό pg/ml a ještě lépe asi 5 pg/ml. Při vyjádření na kg hmotnosti těla, tyto dávky typicky odpovídají asi 0,1 - 300 mg/kg, lépe asi 0,2 - 200 mg/kg a ještě lépe asi 0,5 - 20 mg/kg. Podle potřeby mohou být dávky podávány jednou nebo vícekrát v průběhu léčby. Dávka se obecně mění s věkem, stavem, pohlavím a rozsahem patologického stavu způsobeného α_νβ₃ a neměla by být tak vysoká, aby způsobila nežádoucí postranní efekty. Dávka může být dále ovlivňována lékařem

-27CZ 302177 B6 v průběhu léčby buď pro zesílení léčby nebo pro omezení možného rozvoje postranních efektů.

Tyto postupy jsou známy a odborníky rutinně používány.

Specifita a inhibiční aktivita Vitaxinu, protilátek s implantovaným LM609, případně s implanto5 váným zesíleným LM609 jejich funkčním i fragmenty poskytuje možnost terapeutického účinku na četné choroby způsobené ανβ.υ Tyto choroby zahrnují, například, patologické stavy vyžadující neovaskularizaci, tak jako růst tumoru, psoriasis, rovněž jako choroby, které α_νβ3 přímo způsobuje, jako je restenóza a osteoporóza. Tento vynález tedy poskytuje metody, rovněž jako kompozice, obsahující Vitaxin a protilátku s implantovaným LM609 pro léčbu takových chorob.

Rozumí se, že modifikace, které podstatně nezasahují do činnosti těchto různých uspořádání tohoto vynálezu, spadají rovněž do vymezení tohoto, zde předkládaného vynálezu. V souhlase stím, jsou následující příklady uvedeny pro znázornění, nikoliv jako omezení tohoto předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace a charakterizace nukleových kyselin kódujících LM609

Tento příklad předvádí klonování a určení sekvence nukleových kyselin kódujících LM609.

LM609je směrován proti lidskému receptoru pro vitronectin, integrín ανβ?. α_νβί je nadměrně syntezován v melanomu, glioblastomu a karcinomu prsu a účastní se proliferace buněk melanomu M21 jak in vitro, tak in vivo. α_νβ3 se účastní při angiogenezi, restenóze a tvorbě granulozní tkáně při kožních poraněních. LM609 byl popsán jako je inhibitor adheze M21 buněk na vitro30 necti n, rovněž jako inhibitor proliferace M21 buněk in vitro. Implantování LM609 by mohlo tedy vyústit v klinicky cenné terapeutické činidlo.

Syntéza cDNA variabilních oblastí LM609: pro syntézu cDNA byla připravena úplná RNA z buněk hybridomu 108 LM609 použitím modifikované metody popsané Chomczynskim a Sac35 chim (Chomczynski a Sacchi, Analyt. Biochem. 162: 156 (1987)). Geny variabilní (V) oblasti LM609 byly klonovány pomocí reverzní transkripce a polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) a cDNA byla syntezována použitím BRL Superscript kitu. V krátkosti, 5 mg celkové buněčné RNA, 650 ng oligo dT byly smíseny s vodou a doplněny vodou do celkového objemu 55 ml. Vzorek byl zahříván na 70 °C po dobu 10 minut a poté ochlazen na ledu. Byl přidán reakční pufr a směs byla nastavena 10 mM DTT a 1 mM dNTPs a zahřívána při 37 °C po dobu 2 minut. Bylo přidáno 5 ml (1000 jednotek) reverzní transkriptázy, inkubováno po 1 hodinu při 37 °C a poté ochlazeno na ledu.

Všechny oligonukleotidy byly syntezovány pomocí (chloro(diisopropylamino)-p-kyanoethoxy45 fosfinu na syntezátoru AB1 394 DNA. Oligonukleotidy použité pro zesílení PCR a rutinní, místně směrovanou mutagenezi, byly purifikovány použitím purifikační oligonukleotidové patrony (Applied Biosystems, Foster City, CA). Počáteční PCR primery odpovídaly údajům o koncové N-sekvenci získaným u vyčištěných LM609 protilátek. Počáteční PCR primery obsahovaly sekvence kódující prvních šest aminokyselin ve variabilních řetězci každé protilátky (proteiny byly sekvenovány na San Diego State University). Sekvence počátečního příměru lehkého řetězce (997) byla: 5'-GCC CAA CCA GCC ATG GCC GAT ATT GTG CTA ACT CAG-3' (SEQ ID NO: 20), přičemž byla použita reverzní sekvence PCR primeru (734) 5'-AC AGT TGG TGG AGC ATC AGC-3' (SEQ ID NO: 20). Tento reverzní primer odpovídá aminokyselinovým zbytkům myšího lehkého řetězce kappa (109—115). Sekvence tohoto reverzního PCR primeru těžkého řetězce (998) byla 5'AXX CCT GTG GCA AAA BCC GAA GTG CAG CTG TGT

-28CZ 302177 B6

GAG-3' (SEQ ID NO: 21). Reverzní primer 733 těžkého řetězce: 5 -GA TGG GGG TGT DGT TTT GGC-3' (SEQ ID NO: 22). Tyto PCR primery také obsahovaly homologní oblasti se specifickými sekvencemi uvnitř imunoexpresního vektoru.

V_La V_H řetězce byly zesíleny ve dvou oddělených 50 ml směsích obsahujících 2 ml cDNA-RNA heteroduplexu, 66,6 mM Tris.HCl pH 8,8, 1,5 mM MgCL, 0,2 ml každého ze čtyř dNTP, 10 mM 2-merkaptoethanolu, 0,25 jednotek Taq polymerázy (Boehringer-Mannheim, Indianopolis, IN) a 50 pmol každého z primerů 997, 734, 998 a 773. Tyto směsy byly převrstveny minerálním olejem a dvakrát cyklovány PCR, přičemž každý cyklus sestával ze 30 sekund při 94 °C (denaturaio ce), 30 sekund při 50 °C (spojování) a 30 sekund při 72 °C (syntéza). Tato reakce byla bezprostředně následována 30 cykly PCR sestávajícími z 30 sekund při 94 °C (denaturace), 30 sekund při 55 °C (spojení) a 30 sekundami při 72 °C (syntéza), následovanými koncovou syntetickou reakcí po 5 minut při 72 °C. Reakční produkty byly spojeny, extrahovány CHCb a precipitovány ethanolem.

Zesílené produkty byly resuspendovány ve 20 ml TE pufru (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) a elektroforezovány na 5% polyakryl amidové gelu. Pásy odpovídající očekávaným molekulárním hmotnostem V_H a V_L byly vystřiženy, chemicky eluovány z gelových řezů, extrahovány organickými rozpouštědly a precipitovány ethanolem.

Klonování zesílených V_H a V_L genů v M13 fágovém imunoexpresním vektoru: Tyto zesílené V (variabilní) oblasti produktů genu byly sekvenčně klonovány ve fágovém imunoexpresním vektoru pomocí hybridizační mutageneze (Near, R. Biotechniques 12: 88 (1992); Yelton et al., J. ImmunoL 155: 1994-2003 (1995)). Introdukce zesílených V_L a V_H sekvencí pomocí hybridi25 začni mutageneze umísťuje tyto protilátkové sekvence do pozadí spolu s regulačními prvky obsaženými ve M13 vektoru, potřebnými pro účinnou expresi Fab. Výhodou této techniky je, že do sekvencí V_L a V_H genů pro klonování nemusí být zabudovávána žádná štěpná místa pro restrikční endonukleázy, jako je tomu u konvenčních DNA ligačních metod.

Pro realizaci tohoto kolonování bylo nejprve 400 ng od každého dvouvláknového produktu nejprve fosforylováno pomocí polynukleotid kinázy. 100 ng tohoto fosforylovaného LM609 produktu bylo smíseno s 250 ng urid iny lovaného BS11 fágového imunoexpresního vektoru, denaturováno zahřátím na 90 °C a spojeno postupným ochlazením na teplotu laboratoře. BS11 je imunoexpresní vektor M13 odvozený od M13 IX a kódující CH1 od myšího IgGl a konstantní doménu myšího lehkého řetězce kappa (Huse, E. D. In; Antibody Engineering: A Practical Guide. C. A. K. Borrebaeck, ed. W. H. Freeman a Co., Publishers, New York, pp. 103-120 (1991)), Nukleotidové sekvence obsažené v PCR amplifikačních primerech se spojují s komplementárními sekvencemi přítomnými v jednovláknovém BS11 vektoru. Tato směs byla úplně konvertována na dvojvláknovou molekulu pomocí T4 DNA polymerázy a dHTP a připojena pomocí T4 ligázy. 1 ml této mutagenezní reakční směsi byl elektroporován E. coli kmene DH1OB, titrován na XL-l E. coli a inkubován, pokud se tvořily plaky. Plaky byly sejmuty popsaným postupem za použití kozí protilátky vůči myšímu kappa řetězci, konjugovanou s alkalickou fosfatázou. (Yelton et al, viz výše). Bylo izolováno 15 M13 fágových klonů, pozitivních na myší lehký řetězec, spojeno a použito k přípravě urid i nyl ováného vektoru, jako templátu pro hybridizační mutagenezí s LM609 Vh produktem zesíleným PCR.

Klony syntezující funkční myší LM609 Fab byly identifikovány podle vazby k purifikovanému a_vp3 pomocí ELISA. V krátkosti, Immulon II ELISA desky byty potaženy přes noc roztokem 1 mg/ml (100 ng/jamku) α_νβ3 a nespecifická místa byla blokována po dvě hodiny při 27 °C. Roz50 pustné Fab byly připraveny izolováním periplazmatických frakcí kultur E. coli kmene MK3O-3 (Boehringer Mannheim Co.) infikovaných Ml3 fágovými klony syntezujícími Fab. Periplazmatické frakce byly smíseny s vazebným pufrem 100 mM NaCI, 50 mM Tris pH 7,4, 2 mM CaCI₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM MNC1₂, 0,02% NaN₃, 1 mg/ml BSA a inkubovány s imobilizovaným a_vp3 po dvě hodiny při 27 °C. Desky byly promyty s vazebným pufrem a navázané Fab byly detekovány kozí protilátkou vůči myšímu kappa řetězci konjugovanou s alkalickou fosfatázou.

-29CZ 302177 B6

Byly identifikovány čtyři reaktivní klony: muLM609M13 12,29,31 a 69. MuLM609M13 12 a 29 poskytovaly nejsilnější signál v ELISA testu. DNA sekvenční analýzy ukázaly, že klony MuLM60913 12, 31 a 69 měly všechny identickou sekvenci lehkého řetězce a potvrzovaly dříve určenou N-terminální aminokyselinovou sekvenci polypeptidu lehkého řetězce LM609. Všechny čtyři klony měly identickou V_N DNA sekvenci a také potvrzovaly tuto předběžně určenou Nterminální aminokyselinovou sekvenci purifikovaného polypeptidu těžkého řetězce LM609.

Pro další charakterizaci vazebné aktivity každého klonu byly připraveny rozpustné frakce Fab z 50 ml kultur E. coli kmenu MK.30-3 infikovaných klony 12 a 29 a vyhodnocených na vazebnou io aktivitu vůči a_vb₃ kompetitivním ELISA testem s LM609 IgG. Výsledky tohoto ELISA testu jsou uvedeny na obrázku 3. U klonu muLM609M13 12 byla zjištěna inhibice vazby LM609 IgG (při koncentracích LM609 IgG 1 ng/ml a 5 mg/ml) k a_vb₃, způsobem závislým na koncentraci při periplazmatickém titru pohybujícím se v rozmezí těsně ku 10:80. Klon muLM609M13 12 byl purifikován a u obou variabilních oblastí lehkého i těžkého řetězce byly opět určeny DNA sekvence. Kompletní DNA sekvence tohoto výsledného klonu, muLM609MI3 12-5, je uvedena na obrázcích 2A a 2B.

Příklad II

Sestrojení Vitaxinu: Funkční fragment oblasti CDR implantované LM609

Jedním z cílů u implantovaných protilátek je zachovat protilátkovou specifitu a afinitu při substituování jiných než lidských oblastí CDR do pozadí lidské protilátky. Dalším z cílů je mínimalizo25 vat zavedení cizích aminokyselinových zbytků, aby byla redukována možná antigenicita v lidském hostiteli. Tento příklad popisuje postupy dosažení obou těchto cílů pomocí produkce knihoven implantovaných protilátek představujících všechny možné členy s nej vyšším i afinitami pro požadovaný antigen.

Shora uvedená knihovna byla konstruována v E. coli, přičemž případné uměny oblasti CDR í pozadí byly začleněny použitím mutageneze založené na kodonu (Kristensson et aL, In: Vaccines 95. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY (1995); Rosok et al., J, Biol. Chem. (271: 22611-22613 (1996)). Použitím těchto postupů byla konstruována knihovna a byla identifikovány funkčně aktivní humanizované anti-ανβη -inhibiční protilátky.

Pro konstrukci implantované formy LM609 byly vybrány sekvence lidského protilátkového pozadí s nej vyšším stupněm identity se sekvencemi genu pro variabilní oblast myší LM609, aby přijaly tyto oblasti CDR. Variabilní oblast lidského těžkého řetězce M72 CL (HHC30Q, HC Subgroup 3, Kabat et al., viz výše) měla 88% identitu s pozadím 1, 2 a 3 těžkého řetězce LM609 a variabilní oblasti 'CL LSI lidského lehkého řetězce (HKL312, Kappa subgroup, Kabat et al., viz výše) a 79% identitu s pozadím 1, 2 a 3 lehkého řetězce LM609. Sekvence oblastí myší LM609, jakjsou definovány Kabat et al., viz výše, byly implantovány do lidského pozadí.

Zbytky, které byly určeny k zakrytí, a které mohou ovlivňovat strukturu a tudíž i vazebné vlast45 nosti původního myšího kombinačního místa, byly vzaty do úvahy při označování možných změn (Singer et al., viz výše; Padlan, E. A. Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991)). Tato analýza zbytků pozadí lidské protilátky, které jsou považovány za důležité při udržení specifity a afinity kombinačních míst, zjistila pouze několik málo rozdílů. Například, v sekvenci těžkého řetězce byla identita předpovězených odstraněných zbytků 100%. Značně významné je, že zbytek Arg 16 ve variabilní oblasti M72 'CL lidského těžkého řetězce je relativně neobvyklý zbytek v lidských řetězcích. Tento zbytek byl však také nalezen v 609 VH a tudíž byl zachován. Podobně tomu, Arg 19 v LM609 je také relativně vzácný zbytek v myších těžkých řetězcích, byl však nalezen v M72 CL a byl tudíž zachován. V sekvencích lehkého řetězce byly identifikovány dva neidentické nalezené zbytky mezi oblastí LM609 a LYSÍ CL oblasti pozadí v pozicích 49 a 87. Tyto

-30CZ 302177 B6 dvě pozice byly tudíž zahrnuty do knihovny implantovaných protilátek jak v lidské, tak i v myší alternativě.

Geny variabilních oblastí byly v celé délce syntezovány pomocí PCR použitím dlouhých, překrý5 vajících se oligonukleotidů. Oligonukleotidy lehkého řetězce, obsahující aminokyseliny v pozicích 49 a 78, byly syntezovány jak popisuje Glaser et al. (J. Immunol. 149: 3903-393 (1992)) a jak je znázorněno v oligonukleotidech uvedených jako V_L oligo3 a V_L oligo4. (SEQ ID NOS: 16, respektive 17). Všechny dlouhé oligonukleotidy byly purifikovány na gelu.

io Variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce LM609 byly sestrojeny smísením 5 překrývajících se oligonukleotidů v ekvimolámích koncentracích v přítomnosti spojovacích PCR příměrů. Tyto oligonukleotidy těžkého řetězce mapují následující nukleotidové pozice: V_H oligonukleotid 1 (V_H oligol), nukleotidy (nt) 1 - 84; (SEQ ID NO: 9); V_H oligo2, nt 70 - 153, (SEQ ID NO: 10); V_H ologo3, nt 138 - 225 (SEQ ID NO: 11); V_H oligo4, nt 211-291 (SEQ ID NO: 12); V_H oligo5, nt

277-651 (SEQ ID NO: 13). Oligonukleotidy lehkého řetězce Vitaxinu mapují obdobně následující nukleotidové pozice: V_L oligonukleotid 1 (V_L oligol), nukleotidy (nt) 1-87; (SEQ ID NO: 14); V_L oligo 2, nt 73-144, (SEQ ID NO: 15); V_L oligo 3, nt 130-213 (SEQ ID NO: 16); V_L oligo 4, nt 199-279 (SEQ ID NO: 17); V_L oligo 5, nt 265-321 (SEQ ID NO: 18). Tyto nukleotidové sekvence použité pro sestrojení variabilních oblastí lehkých a těžkých řetězců implantované LM609 jsou uvedeny v tabulce 6. Kodonové pozice 49 a 87 v V_L oligo3 a V_L oligo4 představují znáhodněné kodony. Spojovací primery obsahující nejméně 18 nukleotidové zbytky komplementární k sekvenacím vektoru pro účinné spojení zesílených produktů variabilních oblastí do jedno vláknového vektoru. Tato spojovací směs byla plně konvertována na dvoj vláknovou molekulu pomocí T4 DNA polymerázy a dNTP a ligována s T4 ligázou.

Pro tvorbu knihovny byla část mutagenezní reakční směsi (1 μί) elektroporována do DH10B (BRL) kmene E. coli, titrována na XL-1 (Stratagene, Inc). a inkubována do tvorby plaků. Byly připraveny oddělené replikované sběry obsahující V_H genové sekvence, skrínovány buď na jejich hybridizací s digoxigeninem značeným oligonukleotidem komplementárním k sekvenci oblasti jo CDR 2 těžkého řetězce LM609 nebo podle reaktivity skonjugátem alkalické fosfatázy s 7F11, což je monoklonální protilátka, proti dekapeptidové sekvenci Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Ap Tyr

Ala Ser (SEQ ID NO: 28), připojené ke karboxylovému konci CH1 domény tohoto vektoru (Biosite, Inc., San Diego, CA). Padesát dvojmo pozitivních klonů bylo spojeno a použito pro přípravu uridinylovaného templátů pro hybridizační mutagenezi s tímto amplifikovaným V_L pro35 duktem implantovaného LM609.

-31 CZ 302177 B6

Tabulka 6: Oligonukleotidy použité pro sestrojení variabilních oblastí lehkého a těžkého řetězce implantované LM09

CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTTGTGCAGC CTGGAAGGTC CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACC SEQ ID NO: 9

AACTTTTGCG ACCCACTCCA GACCCTTGCC CGGAGCCTGG CGAACCCAAG ACATGTCATA GCTACTGAAG GTGAATCCAG AGGC SEQ ID NO: 10

TGGGTCGCAA AAGTTAGTAG TGGTGGTGGT AGCACCTACT ATTTAGACAC TGTGCAGGGC CGATTCACCA TCTCCAGAGA CAATAGT SEQ ID NO: 11

TGCACAGTAA TACACGGCTG TGTCCTCGGC TCTCAGAGAG TTCATTTGCA GGTATAGGGT GTTCTTACTA TTGTCTCTGG A SEQ ID NO: 12

GTGTATTACT GTGCAAGACA TAACTACGGC AGTTTTGCTT ACTGGGGCCA AGGGACTACA GTGACTGTTT CTAGT SEQ ID NO: 13

GAGATTGTGC TAACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTCTCA GCCCAGGAGA AAGGGCGACT CTTTCCTGCC AGGCCAGCCA AAGTATT SEQ ID NO: 14

GATGAGAAGC CTTGGGGCTT GACCAGGCCT TTGTTGATAC CAGTGTAGGT GGTTGCTAAT ACTTTGGCTG GC SEQ ID NO: 15

CCAAGGCTTC TCATCWASTA TCGTTCCCAG TCCATCTCTG GGATCCCCGC CAGGTTCAGT GGCAGTGGAT CAGGGACAGA TTTC SEQ ID NO: 16

GCTGCCACTC TGTTGACAGW AATAGACTGC AAAATCTTCA GGCTCCAGAC TGGAGATAGT GAGGGTGAAA TCTGTCCCTG A SEQ ID NO: 17

CAACAGAGTG GCAGCTGGCC TCACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGGTGGA AATTAAG SEQ ID NO: 18

Tato mutagenetická reakce byla provedena jak je popsáno výše, s V_H oligonukleotidy s výjimkou, že byly využity V_H oligonukleotidy 1 - 5 (SEQ ID NOS: 14, respektive až 18). Tato reakce byla elektroporována do kmene DH10B E. coli a oddělené sběry byly testovány buď kozí protilátkou

-32CZ 302177 B6 vůči lidskému kappa řetězci konjugovanou s alkalickou protilátkou nebo kozí protilátkou proti lidskému Fab za použití alkalické fosfatázy konjugované s králičím sekundárním anti kozím činidlem pro detekci. Ty klony, které vylučovaly obě sekvence V_H a V_L genových sekvencí byly vybrány (celkem 160) a použity pro infekci kmene MK3O-3 E.coli pro přípravu rozpustných fragmentů Fab.

Tyto rozpustné Fab fragmenty byly skrínovány na vazbě α_νβ₃ postupu ELIS A. Čtyři klony, které při ELISA testu silně vázaly α_νβ₃, byly identifikovány a dále charakterizovány. Tyto klony byly nazvány jako huLM609M 13-34, 54, 55 a 145. Všechny čtyři klony byly kultivačně purifikovány io a tri nezávislé subklony od každého klonu byly použity pro přípravu fragmentů Fab pro dodatečnou vazebnou analýzu vůči ανβ3 ELISA.

Při tomto dodatečném ELISA testu byly duplikáty kultivačních desek pokryty α_νβ₃ ligandem a inkubovány periplazmatickými vzorky huLM609. Na jedné desce byla navázaná huLM609 Fab i5 detekována kozí protilátkou proti lidskému kappa řetězci konjugovanou s alkalickou fosfatázou a a druhé desce konjugátem 7F11 s alkalickou fosfatázou, monoklonální protilátkou rozpoznávající dekapeptidový markér. Subklony huLM609M 13-345-1, 2 a 3 a huLM609Ml 3-145-1, 2 a 3 všechny poskytovaly dvojitý pozitivní signál, svědčící, že tyto Fab obsahují funkční V_H i Vi. polypeptidy. Tyto výsledky byly potvrzeny ELISA testem na buňkách M21 a buněčných liniích, vylučujících integrin α_νβ3·

Sekvenční analýza DNA subklonů huLM609M 13-34-3 a huLM609M 13-145-3 odhalila mutace zavedené do této knihovny omyly při oligonukleotidové syntéze nebo omyly vzniklými při amplifikací v PCR. Tyto mutace byly v klonu huLM609M 13-34-3 opraveny místně směrovanou mutagenezí. V sekvenci příslušného lehkého řetězce byly učiněny tyto následující korekce: His36 zaměněn za Tyr36 a Lysí 8 za Argl8. V sekvenci odpovídajícího těžkého řetězce byly učiněny tyto následující korekce: Glul za Glnl, Asn3 za Gln3 a Leul 1 za Valí 1. Kromě toho, v průběhu sestrojování implantovaných molekul LM609, byl zbytek 28 u těžkého řetězce zjištěn jako nepodstatný (irelevantní) zbytek pozadí a lidský aminokyselinový zbytek (Thr28) byl zachován.

Následně bylo však zjištěno, že tento zbytek 28 může být částí oblasti CDR. Zbytek 28 byl tudíž zaměněn za odpovídající myši zbytek na této pozici (Ala28) použitím místně směrované mutageneze s oligonukleotidem 5'-GCT ACT GAA GGC GAA TCC AGA G-3' (SEQ ID NO:29). Tato změna byla později popsána jako neužitečná a threonin byl v této pozici zachován. Tento výsledný klon implantované LM609 byl označen huLM609M13 1135-4 aje na tomto místě označován jako Vitaxin. Odpovídající DNA sekvence klonu Vitaxinu je uvedena na obrázku 2A a2B.

Příklad III

Funkční charakteristika Vitaxinu

Tento příklad předvádí charakterizaci Vitaxinové vazebné specifity, afinity a funkční aktivity na základě různých in vitro vazebných a buněčně adhezních postupů.

Vazebná specifita Vitaxinu vůči integrinů α_νβ₃ byla původně určována měřením vazby k α_νβ3 a jeho křížové reakce sjinými integriny obsahujícími αν- nebo β3- Vazebná specifita byla určována měřením vazby k an_bp3, hlavního integrinů syntezovaného na destičkách a a_vp5, integrinů, který je převážně nacházen na endoteliálních buňkách a buněčných typech vazivových tkání.

V krátkosti, pro určení křížové reaktivity byly integriny povlečeny na ELISA desky a sériová ředění protilátek byla testována na vazbu Vitaxinu k α_νβ3 a k jiným integrinům. Integriny ανβ₃ αα_νβ5 byly izolovány afinitní chromatografií, jak popisuje Cheresh (1987), viz výše a Cheresh a Spiro (1987), viz výše. «ιικβ^ byl zakoupen u CalBiochetn. Jenom v krátkosti, LM609 afinitní

-33 CZ 302177 B6 kolona (Cheresh a Spiro) (1987), viz výše, byla použita k izolaci α_νβ₃ z oktylglukozidu lidského placentámího lyzátu, zatímco antí-a_v afinitní kolona byla použita pro izolaci α_νβί z roztoku protékajícího kolonou. Vazebná aktivita pro protilátku byla určena pomocí ELISA za použití kozí protilátky vůči lidskému IgG konjugované s alkalickou fosfatázou. Jako kontrola byla použita lidská IgGl lidská protilátka, protože Vitaxin obsahuje kostru lidského IgG.

Výsledky těchto stanovení jsou uvedeny na obrázku 4A a znázorňují specifickou vazbu Vitaxinu k α_νβ₃ s vysokou afinitou. Nebyla zde žádná detekovatelná aktivita k jiným integrinům obsahujícím ay- nebo β₃- při koncentracích protilátky nad 1,0 mg/ml.

V další sérii vazebných studií byla vazebná spécifita a afinita určována pomocí kompetitivní vazebné metody s rodičovskou LM609 protilátkou vůči α_νβ₃. Kompetitivní vazba byla měřena pomocí ELISA, jakje popsáno shora, s LM609 jako značenou protilátkou. Vazba LM609 byla stanovena v přítomnosti stoupající koncentrace Vitaxinového kompetitoru. Kontrolní kompetitorovou protilátkou byl opět lidský IgGj.

Výsledky této kompetice jsou uvedeny na obrázku 4B a ukazují, že specifická inhibice vazby LM609 může být pozorována při koncentraci Vitaxinu vyšší než 0,1 pg/ml. Takřka úplná inhibice je však pozorována při koncentracích Vitaxinu vyšších než 100 pg/ml. Tato hladina kompetitivní inhibice naznačuje, že rodičovská monoklonální protilátka LM609 a implantovaná verze Vitaxin mají původně stejnou specifitu.

Vazebná afinita a specifita byla také určovány měřením inhibiční aktivity Vitaxinu při vazbě ανβ₃ na fibrinogen. Při těchto studiích byly ELISA desky potaženy α_νβ₃ tak, jak je popsáno výše pro νίΐ3χίη/ανβ3 vazebných studiích. Inhibiční aktivita Vitaxinu byla stanovena měřením množstvím vázaného biotinylovaného fibrinogenu v přítomnosti zvyšujících se koncentrací Vitaxinu nebo kontrolní protilátky. V krátkosti, fibrinogen byl zakoupen u CalBiochem a byl biotinylován s N-hydroxysukciniminobiotinem, jak popisuje výrobce (Pierce Life Science and Analytical Research). Streptavidin alkalická fosfatáza byla použita pro detekci vázaného fibrinogenu.

Výsledky tohoto stanovení jsou uvedeny na obrázku 4C a popisují specifickou inhibici vazby při koncentracích Vitaxinu vyšších než 0,1 pg/ml. Tyto výsledky ve spojení s výsledky popsanými shora, ukazujícími specifickou vazbu Vitaxinu k α_νβ₃ a kompetitivní inhibici LM609, demonstrují, že Vitaxin si udržuje v zásadě všechny vazebné charakteristiky a specifity vykazované rodičovskou myší monoklonální protilátkou LM609. Níže jsou popsány doplňující funkční studie, které podporují tyto závěry, které jsou založeny na in vitro vazebných stanoveních.

Doplňující funkční studie byly provedeny pro další určení specifity vazby Vitaxinu. Tyto studie byly směrovány na inhibici vazby integrinu α_νβ₃ při buněčně adhezních studiích. Endoteliální buněčné adhezní děje jsou významnou složkou angiogenního procesu a o inhibici α_νβ₃je známo, že redukuje neovaskularizaci tumorů a tím snižuje rychlost růstu tumorů. Takováto inhibice spojování buněk zprostředkovaného α_νβ₃ Vitaxinem, je tudíž projevem inhibiční aktivity očekávané při použití této protilátky in šitu nebo in vivo.

V krátkosti, α_νβ₃-ροζίίίνπί buňky M21 melanomu, pěstované v RPMI obsahujícím 10% FBS, byly použity pro tyto buněčné vazebné testy. Buňky byly uvolněny z kultivačních misek trypsinizací, resuspendovány v adhezním pufru při koncentraci 4 x 10⁵ buněk/ml (viz níže). Vitaxin, LM609 nebo purifikovaný lidský IgGi (kontrolní protilátka), byly ředěny na požadovanou koncentraci v 250 μΙ adhezního pufru (10 mM Hepes, 2 mM MgCL, 2 mM CaCl₂, 0,2 mM MnCL a 1% BSA v Herpes pufrovaném fyziologickém roztoku při pH 7,4) a přidány do jamek 48 jamkových desek, povlečených předem fibrinogenem. Tento fibrinogen byl izolován, jak je popsáno shora. Každá jamka byla povlečena 200 μΐ fibrinogenu pri koncentraci 10 pg/ml po 1 hodinu při 37 °C. Pro tento test byl do každé zjamek přidán stejný objem (250 μΐ) obsahující Vitaxin, LM609 nebo izotypovou chráněnou kontrolní protilátku, obsah byl šetrně promísen a inkubován

-34CZ 302177 B6 minut při 37 °C. Nenavázané buňky byly odstraněny promýváním adhezním pufrem tak dlouho, pokud byly buňky přítomny v kontrolní jamce povlečené pouze samotným BSA. Navázané buňky byly vizualízovány obarvením krystalovou violetí, jež byla následně extrahována 100 μΐ kyseliny octové (10%) a k kvantitativně stanoveny měřením absorbance solubilizovaného barviva při 560 nm.

Výsledky těchto testů jsou uvedeny na obrázku 5A a říkají, že Vitaxin i rodičovská LM609 protilátka inhibují adhezi M21 buněk na fibrinogen ve stejném koncentračním rozmezí. Koncentrace inhibující 50% maximální adheze byla vypočtena na asi 50 mg/ml. Specifita Vitaxinu byla to demonstrována nepřítomností inhibice u kontrolní IgGi protilátky.

Kromě shora popsaných výsledků adheze buněk, byla inhibiČní aktivita Vitaxinu testována také v migračním testu endoteliálních buněk. Za tímto účelem byla použita metoda jamkové buněčné migrace pro určení schopnosti Vitaxinu inhibovat migraci endoteliálních buněk (Choi et al.,

J. Vascular Surg., 19: 125-134(1994) a Laevesly et al., J. Cell Bioi., 121:163-170 (1993)).

V krátkosti, lidské endoteliální buňky z pupečníkové cévy v log fázi a při nízkém počtu pasáží byly odebrány trypsinizací, promyty a resuspendovány při koncentraci 2 x l⁶ buněk/ml při 37 °C v HBS obsahujícím 1% BSA (20 mM HEPES, 150 mM Nal, 1,8 mM CaCE, 1,8 mM MgCl₂,

2o 5 mM KCL a 5 mM glukózy, pH 7,4). Protilátky (Vitaxin, LM609 a IgG! kontrola) byly ředěny na 10 pg/ml ze zásobního roztoku. Protilátky byly přidány k buňkám v ředění 1:1 (výsledná koncentrace buněk je 1 x 10⁶ buněk/ml; výsledná koncentrace protilátek je 5 pg/ml) a inkubovány na ledu po dobu 10 až 30 minut. Tyto suspenze buněk s protilátkou (200 pl na každý kompartment buněčného kultivátoru (Transwell cell culture culture chám ber, Corning Costar), jehož dolní kompartmenty byly povlečeny 0,5 ml roztoku vitronectinu 10 pg/ml v HBS. Vitronectin slouží jako chemoatraktant pro endoteliální buňky. Komůrky byly ponechány po 4 hodiny při 37 °C, aby mohla proběhnout migrace.

Vizualizace migrace buněk byla provedena nejprve odstraněním zbývajících buněk v horním kompartmentu pomocí bavlněné stěrky. Buňky, které migrovaly na spodní stranu vložky, byly barveny krystalovou violetí po 30 minut, poté solubilizovány v kyselině octové a absorbance barviva byla měřena při vlnové délce 550 nm. Velikost této absorbance je přímo úměrná počtu buněk, které migrovaly z homí komůrky do spodní. Výsledky této metody jsou popsány na obrázku 7B. Jak Vitaxin, tak i rodičovská protilátka LM609 poskytly v zásadě identické inhibiČní výsledky. Vitaxin a LM609 inhibovaly asi 60% vitronectinem indukované migrace endoteliálních buněk ve srovnání s IgG_t kontrolou a se vzorkem bez inhibitoru.

Příklad IV

Inhibice a_vp3 u živočišných modelů zprostředkovaná Vitaxinem

Tento příklad popisuje inhibici růstu tumoru Vitaxinem u dvou živočišných modelů. Růst tumoru byl inhibován inhibováním alespoň α_νβ3 zprostředkované neovaskularizace Vitaxinem.

Tento první model měří angiogenezi v kuřecí chorioalantoinové membráně (CAM). Tento způsob je dobře známý model pro angiogenezi in vivo, protože probíhá neovaskularizace celé tkáně. Tato metoda v podstatě měří růstovým faktorem indukovanou angiogenezi krevního řečiště kuřecího CAM, rostoucího na filtračním kotouči nasyceném růstovým faktorem nebo v této tkáni rostoucí na CAM. Inhibice neovaskularizace je založena na množství a rozsahu růstu nového řečiště nebo na inhibici růstu tkáně na CAM. Tento postup je detailně popsán jinými autory a je používán k měření neovaskularizace tumorových tkání (Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597-618 (1975); Ossonski et al, Cancer Res., 40: 2300-2309 (1980); Brooks et al. Science, 264: 569-571 (1994a) a Brooks etal. Cell, 79: 1157-1164 (1994b).

-35cz 302177 B6

V krátkosti, pro indukci angíogeneze růstovými faktory jsou filtrační kotouče vyražené z chromatografického papíru (#1 Whatman Qualitative Circles) použitím razidla pro odběr vzorků kůže. Disky se nejdříve sterilují účinkem UV světla a potom se nasytí různými koncentracemi TBF-a nebo HBSS jako negativní kontrolou (nejméně jednu hodinu) za sterilních podmínek. Angiogeneze je indukována umístěním nasycených filtračních kotoučů na CAM.

Inhibice angíogeneze je provedena ovlivňováním embryí různými množstvími Vitaxinu a kontrol (protilátka nebo purifikovaný lidský lgG|). Toto ovlivnění je provedeno intravenózní injekcí asi io 24 hodin po umístění kotouče. Po 48 hodinách jsou CAM vyříznuty a angíogeneze je ohodnocena ve škále 1 až 4. Kotouče nasycené HBSS jsou použity jako negativní kontrola, reprezentující angiogenezi, která může být jako důsledek poranění tkáně při preparaci CAM a její hodnoty jsou odečteny jako hodnota pozadí. Purifikovaný lidský IgG) je použit jako negativní kontrola pro injekce, protože Vitaxin je z podtřídy IgGj-. Bylo zjištěno, že Vitaxin inhibuje angiogenezi indu15 kovanou TNF-α způsobem závislým na dávce. Maximální inhibice byla pozorována s jednoduchou dávkou Vitaxinu 320 pg, což mělo za výsledek 80% inhibici ve srovnání s lidskou IgG] kontrolou.

Kromě shora popsané metody CAM používající neovaskularizaci indukovanou růstovými fakto20 ry, byly provedeny doplňující studie využívající neovaskularizaci indukovanou tumorem. Pro tyto metody, byla angíogeneze indukována transplantací fragmentů ανβι-negativního tumoru do CAM. Použití těchto fragmentů civP^-negativních tumorů zajišťuje, že inhibice růstu tumoru je v důsledku inhibice neovaskularizace způsobené α_νβ₃ a nikoliv adhezních dějů způsobených α_νβ₃ přítomnými na tumorových buňkách.

Inhibice růstu tumoru byla provedena aplikací suspenze jednotlivých buněk FG (8x10⁶ buněk, pankreatický karcinom) a Hep-3 buněk (5x10⁵ buněk, laiyngální karcinom) na CAM v 30 μί. Po týdnu byly tumory vyjmuty, rozřezány na přibližně 50 mg fragmenty, které byly ihned umístěny na nové CAM. Po 24 hodinách od druhého umístění fragmentů na CAM byla embrya intra30 venózně injikována Vitaxinem nebo lidským IgGj jako negativní kontrolou. Tumory byly ponechány 7 dní růstu a poté byly vyjmuty a zváženy.

Výsledky tohoto účinku Vitaxinu na neovaskularizaci tumoru jsou uvedeny na obrázku 6A. Data jsou vyjádřena jako průměrná změna hmotnosti a demonstrují, že Vitaxin je schopen inhibovat růst ανβι-negativních tumorů jako jsou fragmenty FG a HEp-3 tumorů. Přesněji řečeno, průměrná změna hmotnosti fragmentů tumoru FG léčených Vitaxinem byla -5,38, zatímco u tumorů Hep-3 léčených Vitaxinem byla změna -11,0. Kontroly IgG| vykazovaly pozitivní průměrnou hmotnostní změnu 25,29 pro FG, respektive 28,5 pro fragmenty tumoru Hep-3. Tyto výsledky byly získány po jedné intravenózní injekci.

V druhém živočišném modelu, byla použita inhibice buněk Vx2 karcinomu u králíků jako míra inhibičního vlivu Vitaxinu na tumory. Vx2 karcinom je transplantační karcinom, odvozený od Shope-ho virem indukovaného papillimu. Byl popsán teprve v roce 1940 a od té doby je široce používán ve studiu tumorových invazí, interakce tumor-hostitel a angíogeneze. Tento Vx2 karci45 nom je ve své podstatě fibrotický, vysoce agresivní a je představitelem anaplastického typu karcinomu. Propagace Vx2 tumoru je provedena násobnou transplantací na donorových králících. Po subkutánní transplantaci probíhá počáteční zánětlivá reakce, následovaná hostitelskými opravnými mechanizmy mezi dnem 2 a 4. Tato hostitelská opravná reakce je charakterizována tvorbou nových pojivových tkání a nových kapilár. Do dne 4 jsou tyto nové kapiláry omezeny na oprav50 nou zónu, ale v den 8 byly rozšířeny do vnějších oblastí tumoru. Tyto charakteristiky a farmakokinetika Vitaxinu byly použity pro určení počáteční dávky a rozvrh léčebného postupu v těchto experimentech. Poločas eliminace Vitaxinu v živočišném séru byl při dávkách 1, 5 a 10 mg/kg nalezen jako 38,9, 60,3, respektive 52,1 hodiny.

-36CZ 302177 B6

Růst Vx2 tumorů ve shora popsaném živočišném tumoru byl použit pro studium vlivu včasného podání. Vitaxinu na primární růst tumoru u králíků se subkutánně implantovaným Vx2 karcinomem. V krátkosti, Vx2 tumory (50 mg) byly transplantovány na vnitřní straně stehna králíků incizí mezi kůži a sval. Měření primárního tumoru byla v průběhu experimentu až do dne 25.

V den 28 byla zvířata utracena, tumory byly vyjmuty a zváženy. V den 28, nabyly tumory extrémně nepravidelného tvaru, výsledkem čehož se měření stalo obtížným a výsledky neodpovídaly objemům tumoru. Proto byla měření prováděna pouze do dne 25.

V první studii byli králíci léčeni počínaje dnem 1 po implantaci tumoru dávkami Vitaxinu 5 io a 1 mg/kg každé čtyři dny po 28 dnů (celkem 7 dávek). U obou skupin byla pozorována inhibice růstu tumoru. V druhé sérií pokusů byli králíci léčeni počínaje dnem 7 po implantaci tumoru, jak je popsáno výše, celkem 5 dávkami. Inhibice růstu tumoru byla také pozorována.

Je třeba poznamenat, že podávání protilátky králíkům v opakovaných dávkách může vyvolat imunitní odpověď, která může mít neutralizační účinek na Vitaxin. Předběžná data nasvědčují, že asi u 25 až 50% zvířat k takové odpovědi dochází.

Výsledky každého ze shora uvedených postupů s Vitaxinem jsou popsány na obrázku 6B a 6C. U králíků, kteří byli léčeni v den 1, byla pozorována inhibice jak u koncentrace 1 mg/kg, tak u 5 mg/kg, ve srovnání s kontrolou léčenou pufrovaným fyziologickým roztokem. Konkrétně byly pozorovány inhibice ve výši asi 67, respektive 80%, jak bylo zjištěno na základě střední hmotnosti tumorů. Menší rozsah inhibice byl pozorován u zvířat, u kterých bylo započato s léčbou v den 7 po implantaci. Tyto výsledky jsou uvedeny na obrázku 6C. Ve všech případech nebyla inhibice Vitaxinem pozorována při koncentracích nižších než 0,2 mg/kg,

Příklad V

Sestrojení funkčních fragmentů protilátky s implantovaným LM609

Tento příklad ukazuje sestrojení funkčních fragmentů protilátky s implantovaným LM609, v nichž byly přeneseny pouze oblasti CDR z donorové LM609 protilátky na akceptorové pozadí lidské protilátky.

Implantace oblasti CDR z LM609 z důvodu získání funkčního fragmentu protilátky byla umožněna metodami, které jsou uvedeny dále. Tyto postupy byly použitelné pro implantaci CDR z v podstatě jakékoliv donorové protilátky, kde nejsou požadovány aminokyselinové zbytky vně těchto oblastí CDR z donorové protilátky ve výsledném implantovaném produktu.

V krátkosti, sekvence proteinu protilátky LM609 byla určena klonováním a sekvenováním cDNA, která kóduje variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců, jak je popsáno v příkladu I. Oblasti CDR z této donorové protilátky byly identifikovány a implantovány do homologních lidských variabilních oblastí akceptorového pozadí. Identifikace oblastí CDR byly založeny na definicích popsaných Kabat et al., a MacCallum et al.

Hranice těchto CDR oblastí jsou kumulativně definovány shora uvedenými dvěmi publikacemi ajsou to následující zbytky 30-35, 47-66 a 97-106 pro oblasti CDR 1,2, respektive 3, variabilní oblasti těžkého řetězce a zbytky 24—36, 46-56 a 89-97 pro oblasti CDR 1,2, respektive 3, variabilní oblasti lehkého řetězce. Neidentické donorové zbytky v rámci těchto hranic, ale mimo oblastí CDR, definovaných Kabat et al. byly identifikovány a nebyly substituovány do pozadí akceptoru. Místo toho, byly funkční nedon ořové aminokyselinové zbytky identifikovány a substituovány za určitý z těchto neidentických zbytků.

Jakje popsáno níže, je jediný neidentický aminokyselinový zbytek mimo oblast CDR, jak je defí55 nována Kabat et al., ale uvnitř této oblasti, jak je definována výše, na pozici 49 lehkého řetězce

-37CZ 302177 B6

LM609. Pro identifikaci funkčních nedonorových aminokyselin na této pozici byla vytvořena knihovna devatenácti protilátek obsahujících všechny nedonorové aminokyseliny na pozici 49, která byla poté skrínována na vazebnou aktivitu vůči ανβ?.

Lidské imunoglobulinové sekvence byly identifikovány podle Brookhaven Protein Data BankKabat Sequences of Proteins of Immunological (nterest database (verze 5.0). Sekvence lidského pozadí, průkazně identické s genovými sekvencemi myší variabilní oblasti LM609 byly vybrány jako příjemci oblastí CDR LM609. Variabilní oblasti M72 CL lidského těžkého řetězce měly 88% identitu s pozadími 1, 2 a 3 těžkého řetězce LM609 a variabilní oblast LSI CL lidského io lehkého řetězce měla 79% identitu s pozadími 1, 2 a 3 lehkého řetězce LM609. S výjimkou neidentického zbytku ležícího mimo oblastí CDR, jak jsou definovány Kabat et ak, byly sekvence oblastí CDR LM609 implantovány do lidského pozadí. Použitím tohoto implantačního schématu, výsledný implantační produkt neobsahuje žádné aminokyselinové zbytky ležící mimo oblasti CDR definované Kabat et al., které by byly identické s aminokyselinami LM609 v odpovídajících pozicích (mimo těchto zbytků: 31-35, 50-66 a 99-106 pro oblasti CDR 1, 2 respektive 3, variabilní oblasti těžkého řetězce a zbytků 24-34, 50-56 a 89-97 pro oblasti CDR 1, 2, respektive 3, variabilní oblasti lehkého řetězce). Nejsou produkovány ani žádné interinediáty obsahující aminokyselinové zbytky mimo těchto oblastí CDR, jak jsou definovány Kabat ct al., identické s aminokyselinovými zbytky v odpovídajících pozicích LM609. CDR implan20 tační postupy jsou uvedeny dále.

Geny variabilní oblasti implantované LM609 byly v celé délce syntezovány pomocí PCR použitím oligonukleotidů s dlouhými přesahy, jak je popsáno v příkladu II. Oligonukleotidy variabilní oblasti těžkého řetězce jsou ty, kteréjsou popsány jako SEQ ID NOS:9-13. Oligonukleotidy variabilní oblasti lehkého řetězce byly syntezovány tak, aby obsahovaly implantovanou variabilní oblast a také stop kodon na pozici 49. Pět oligonukleotidů pro variabilní oblast lehkého řetězce implantované LM609 je uvedeno pod sekvencemi SEQ ID NOS: 23-27, kde druhý oligonukleotid v této sérii obsahuje na pozici 49 stop kodon (SEQ ID NO:24). Nukleotidové sekvence oligonukleotidů použitých pro konstrukci variabilní oblasti lehkého řetězce implantované LM609

3o jsou uvedeny v tabulce 7.

Tabulka 7: Oligonukleotidy použité pro konstrukci variabilní oblasti lehkého řetězce implantované LM609

GAGATTGTGC TAACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTCTCA GCCCAGGAGA AAGGGCGACT CTTTCCTGCC AGGCCAGCCA AAGTATT SEQ ID NO: 23

TTAGATGAGA AGCCTTGGGG CTTGACCAGG CCTTTGTTGA TACCAGTGTA GGTGGTTGCT AATACTTTGG CTGGC SEQ ID NO: 24

CCAAGGCTTC TCATCTAATA TCGTTCCCAG TCCATCTCTG GGATCCCCGC CAGGTTCAGT GGCAGTGGAT CAGGGACAGA TTTC SEQ ID NO: 25

GCTGCCACTC TGTTGACAGT AATAGACTGC AAAATCTTCA GGCTCCAGAC TGGAGATAGT GAGGGTGAAA TCTGTCCCTG A SEQ ID NO: 26

-38 CZ 302177 B6

CAACAGAGTG GCAGCTGGCC TCACACGTTC GGAGGGGGGA

CCAAGGTGGA AATTAAG

SEQ ID NO: 27

Všechny dlouhé oligonukleotidy byly purifikovány gelovou chromatografií. Oblast CDR implantovaná z variabilní oblast těžkého řetězce LM609 byla sestrojena smísením 5 překrývajících se oligonukleotidů (SEQ ID NOS: 9-13), v ekvimolámích koncentracích, v přítomnosti spojovacích primerů PCR, obsahujících nejméně 18 nukleotidových zbytků komplementárních k sekvencím vektoru, pro účinné spojení amplifikovaných produktů variabilní oblasti do jednovláknového vektoru. Tato směs byla kompletně převedena na dvojvláknovou molekulu s T4 DNA polymerázou a dNTP a ligována T4 ligázou. Tato mutagenezní reakční směs (1 μί) byla elektroporována io do CH10B (BRL) kmene E. coli, titrována na XL-1 (Stratagene. Inc.) a inkubována do tvorby plaků. Byly připraveny opakované filtrátové sběry a plaky obsahující V_H genové sekvence byly skrínovány buď pomocí hybridizace s oligonukleotidem komplementárním k sekvencím oblasti CDR2 těžkého řetězce LM609 konjugovaným s digoxigeninem nebo na základě reaktivity s konjugátem alkalické fosfatázy s monoklonální protilátkou 7F11 proti dekapeptidové sekvenci Tyr

Po Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser (SEQ ID NO: 28) připojené ke karboxylovému konci vektoru CHI oblasti (Biosite, Inc., San Diego, CA).

Padesát dvojitě pozitivních klonů bylo spojeno a použito pro přípravu uridinylovaného templátů pro hybridizační mutagenezi s amplifikovaným produktem V_L CDR implantované LM609, kon20 strnovaným podobným způsobem za použití pěti překrývajících se oligonukleotidů uvedených v SEQ ID NOS:23-27. Mutagenezní reakční směs byla elektroporována do DH10B kmene E, coli. Náhodně vybrané klony byly sekvenovány pro identifikaci správně konstruovaného templátu pro konstrukci nedonorové knihovny na pozici 49. Tento templát byl připraven jako uridinylovaný templát a pro místně směrovanou mutagenezi byla použita oligonukleotidová populace nás25 ledující sekvence.

GGGAACGATA-19aa-GATGAGAAGC

Sekvence 19aa ve shora uvedeném primeru (SEQ ID NO:30) reprezentuje skutečnost, že tento primer specifikuje sekvenční populaci sestávající z 19 různých kodonových sekvencí, které kódují každou z 19 nedonorových aminokyselin. Tyto aminokyseliny jsou ty, které nebyly nalezeny na pozici 49 LM609 a zahrnují všechny aminokyseliny s výjimkou Lys. Klony, které byly výsledkem této mutageneze, byly vybrány a byly připraveny protilátky syntezované těmito klony. Tyto vzorky byly poté skrínovány na přítomnost vazby ot_vp3 pomocí ELISA. Klony, které měly

Arg nebo Met v pozici 49, byly shledány funkčními. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence variabilní oblasti implantovaného těžkého řetězce LM609 jsou uvedeny na obrázku 1A (SEQ ID NOS:1, respektive 2). Nukleotidové a aminokyselinové sekvence variabilní oblasti lehkého řetězce implantované LM629 jsou uvedeny na obrázku 7 (SEQ ID NOS:31, respektive 32).

Příklad VI

Tvorba protilátek s implantovaným LM609, které mají zesílenou aktivitu

Tento příklad ukazuje in vitro přípravu protilátky s implantovaným LM609 pro získání variant protilátek, se zvýšenou afinitou vůči ανβι vzhledem k rodičovské protilátce s implantovaným LM609.

Pro optimalizaci afinity protilátky s implantovaným LM609 in vitro byl použit Ml3 fágový systém zaručující účinnou syntézu, expresi a skrínink knihovny funkčních fragmentů protilátky (Fabs). Byl zjištěn příspěvek každé ze šesti oblastí CDR lehkých a těžkých řetězců. Tyto oblasti

-39CZ 302177 B6

CDR byly široce definovány na základě kombinace sekvence variability a proti látkových strukturních modelů (Kabat et al., J. Biol. Chem., 252: 6609-6616 (1977); Chothia et al., viz výše; MacCallum et al., viz výše). Pro každou CDR byla tedy sestrojena jedna knihovna, s výjimkou H2, která byla rozdělena do dvou knihoven v důsledku její délky (20 aminokyselin). Pozadími variabilních oblastí, přijímajícími mutované oblasti CDR, byla variabilní oblast těžkého řetězce uvedená na obrázku la (SEQ ID NO:2) a variabilní oblast lehkého řetězce uvedená na obrázku 7 (SEQ IDNO.32).

Oblasti CDR byly vybrány z variabilní oblasti těžkého řetězce uvedeného na obrázku la (SEQ IDNO:2) a variabilní oblasti lehkého řetězce uvedeného na obrázku 7 (SEQ IDNO:32).

V krátkosti, při použití číslovacího systému dle Kabat et al., viz výše, vybrané zbytky pro mutagenezí oblastí CDR (tabulka 9) byly: Gln²⁴-Tyr³⁶ v lehkém řetězci CDR1 (Ll); Leu^4ť>-Ser^5fl v lehkém řetězci CDR2 (L2); Gln^s9-Thr⁹⁷ v lehkém řetězci CDR3 (L3); Gly²⁶-Ser³⁵ v těžkém řetězci CDR1 (Hl); Trp⁴⁷-Gly⁶⁵ v těžkém řetězci CDR2 (H2) a Ala⁹³-Tyr‘ ² v těžkém řetězci CDR3 (H3). Pro každou oblast byly vytvořeny knihovny s oligonukleotidy určenými pro mutování jednotlivých aminokyselinových zbytků v CDR v každém klonu. V důsledku prodloužené délky H2, byly pro pokrytí této oblasti vytvořeny dvě knihovny mutující zbytky 47-55 (H2a), respektive 56-65 (H2b).

Tem plát pro generování mutantů lehkého řetězce oblasti CDR3 obsahoval Gly na pozici 92. Následně bylo však deduktivně určeno, že tato pozice 92 lehkého řetězce CDR3 by měla být Gly, což vedlo k sestrojení protilátek s humanizovaným implantovaným LM609, které obsahovaly na této pozici Gly. Později bylo zjištěno, že originální LM609 sekvence obsahovaly na pozici 92 Asn. Použitím zde popsaných metod zavádění mutací do CDR u protilátky s implantovaným LM609, bylo zjištěno, že protilátka s implantovaným LM609, která má na pozici 92 lehkého řetězce CDR3 Asn, má vazebnou aktivitu vůči α_νβ3 (viz tabulka 9), což potvrzuje funkčnost Asn⁹² v protilátce s implantovaným LM609. Protilátky obsahující oblast CDR3 lehkého řetězce, která má na pozici 92 Gly nebo Asn, jsou aktivní při vazbě α_νβ3Oligonukleotidy kódující jednoduché mutace byly syntezovány zavedením NN(G/T) do každé pozice CDR, jak je popsáno výše (Glaser et al., viz výše). Tyto protilátkové knihovny jsou konstruovány do M131XL604 vektoru pomocí hybridizační mutageneze, jak je popsáno výše, s určitými modifikacemi (Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996); Huse et al., J. Immunol. 149:3914-3920 (1992); Kunkel, Pro. Nati. Acad. Sci. USA 82; 488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-39-82 (1987)). V krátkosti, oligonukleotidy byly spojovány při molámím poměru 20:1 ku uridinylovanému templátu (ze kterého byly odstraněny odpovídající CDR) protilátky s implantovaným LM609 denaturaci při 85 °C po 5 minut, spojováním při 55 °C po 1 hodinu, udržováním při 55 °C po 5 minut a posléze zmrazením na ledu. Tato reakční směs byla polymerována a elektroporována do DH 10B a titrována na XL-1 Blue. Tyto knihovny sestávaly ze zásoby variant, kde každý klon obsahoval změnu jedné aminokyseliny na jedné z pozic CDR. Použitím kodonově založené mutageneze, byla mutována vždy jedna ze všech CDR pozic, což vyústilo v následném vyjádření všech dvaceti aminokyselin ve všech zbytcích CDR (Glaser et al., viz výše). Tyto CDR knihovny měly velikosti v rozsahu od 288 (L3) do 416 (Ll) unikátních členů a obsahovaly celkem 1336 variant.

Pro zajištění účinného skříňinku těchto původních knihoven, byla použita vysoce citlivá metoda sběru plaků, nazývaná shromažďovacím sběrem (Watkins et al., Anal. Biochem. 256 (1998)).

V krátkosti, knihovny syntézo váné fágem, které syntezují varianty protilátek s implantovaným LM609, byly původně skrínovány modifikovaným přístupem ke sběru plaků, při kterém byla nitrocelulóza předem povlečena kozí anti - lidská kappa protilátkou a blokována hovězím sérum albuminem, dříve než byla položena na bakterie povrchy infikované fágem. Po zachycení variant Fab protilátky s implantovaným LM609, byly filtry inkubovány 3 hodiny při 4 °C s 1,0 pg/ml biotinylovaného a_vp3, promyty čtyřikrát, inkubovány s 2,3 pg/ml NeutrAvidinu s konjugovanou alkalickou fosfatázou (Pierce Chemicals Co.; Rockford, IL) po 15 minut při 25 °C a posléze čtyřikrát promyty. Ke všem ředěním a promýváním byl použit vazebný pufr. Varianty, které

-40CZ 302177 B6 vázaly α_νβ3, byly identifikovány v průběhu inkubace filtrů po 15 minut v OJ M Tris, pH 9,5, obsahujícím 0,4 mM 2,2'-di-p-nitrofenyl-5,5'-dÍfenyl-3,3'-(3,3^?-dimethoxy^,4'-difenylen)ditetrazolium chlorid a 0,38 mM 5-bromo-4-chloro-3-indoxylfosfát mono-(p-toluidinium) sůl (JBL Scientific, lne.; San Luis Obispo, CA).

Pro tvorbu biotinýtovaného α_νβ3 byl purifikován ανβ3 receptor z lidské placenty pomocí afinitní chromatografie, jak je popsáno dříve (Smith a Cheresh, J. Biol. Chem. 263: 18726-18731 (1988)). Biotinylace α_νβ3 byla provedena dialýzou α_νβ3 receptoru v 50 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM CaCl₂, obsahujícím 0,1% NP-40 (vazebný pufr) a inkubací se 100 násobným molámím nadbytkem sulfosukcinimidobiotinu po 3 hodiny při 4 °C. Reakce byla zastavena přidáním 50 mM ethanolaminu.

Fágem syntezované varianty protilátky s implantovaným LM609 identifikované při sběru dat jako aktivní při vazbě α_νβ3 byly dále charakterizovány, aby byla určena vazebná afinita vůči α_νβ3, specifita k α_νβ3 ve srovnání s ostatními integriny a rychlost asociace a disociace s ανβι* Pro tyto metody byl použit purifikovaný fragment variant protilátky s implantovaným LM609. V krátkosti, Fab byl syntezován, jak je popsáno dříve a uvolněn z periplazmatického prostoru ultrazvukem (Watkins et al., viz výše, 1997). Buňky sebrané zjednoho litru kultury byly lyžovány v 10 ml 50 mM Tris, pH 8,0, obsahujícím 0,05% Tween 20. Fab byl navázán na 1 ml sloupec s navázaným proteinem A (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM glycinem, pH 8,0, obsahujícím 250 mM NaCl, promyt tím samým pufrem a eluován 10 ml 100 mM glycinu, pH 3, dojedná desetiny objemu 1 M Tris, pH 8. Purifikovaný Fab byl kvantitativně stanoven, jak je popsáno (Watkins et al., viz výše, 1997).

Varianty protilátky s implantovaným LM609 byty testovány na vazbu α_νβ3 vzhledem k vazbě na α_νβ5 a (Χιπ,β3· Pro ELISA titrací Fab na imobilizovaném α_νβ3 a příbuzných integrinech α_νβ5 a ctj^3₅ byly mikrotitrační desky Immunol II povlečeny s 1 pg/ml purifikovaným receptorem v 20 mM Tris, pH 7,4, 150mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, promyty a blokovány 3% BSA v 50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ po 1 hodinu při 25 °C, Lidský α_ΠΙϊβ3 purifikovaný, izolovaný z destiček, byl získán u Enzyme Research Laboratories, lne. SouthBend, IN) a α_νβί byl purifikován z placentámího extraktu zbaveného α_νβ3, jak je obvykle popisováno (Smith et al, J. Biol. Chem. 265: 11008-11013 (1990)). Těsně před použitím byly desky dvakrát promyty a potom inkubovány s různými koncentracemi Fab. Desky byly dvakrát promyty a potom inkubovány s různými koncentracemi Fab. Desky byly pětkrát promyty, 1 hodinu inkubovány pri 25 °C s kozí anti-human kappa protilátkou, konjugovanou s alkalickou fosfatázou, ředěnou 2000x, pět krát promyty a vyvíjeny, jak je obvykle popsáno (Watkins et al., viz výše). Pro roztoky všech koncentrací i promývání byl použit 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ a 1 mM MgCl₂.

-41 CZ 302177 B6

Tabulka 8: Skrínink zachycovacího sběru oblastí CDR protilátky s implantovaným LM609

Knihovna	Velikost* 1	Skrínováno2	Pozitivních3	Zesílená afinita'
Hl	320	2500	16	8
H2a	320	5000	26	7
H2b	320	5000	2	1
H3	320	5000	185	785
Ll	416	2500	12	1
L2	352	3250	7	1
L3	288	5000	52	41

¹ Počet unikátních klonů založených na sekvenci DNA. Pro expresi všech dvaceti aminokyselin byly použity třicetdva kodony.

² Knihovny exprimované fágem byly vysety na XI-1 Blue/agar při 500 až 100 plaků na 100 mm io misky.

¹ Klony jsou deklarovány jako pozitivní, byly-li označeny při počátečním skrtninku, přesety a ověřeny při druhém zachycovacím sběru.

⁴ Rozpustný Fab byl titrován proti imobilizovanému α_νβ₃ ve formátu ELISA. Na základě srovnání inflexního bodu příslušných titračních křivek, byly klony s trojnásobně zesílenou afinitou selektovány a dále charakterizovány.

⁵Ze 185 pozitivních klonů, označených při zachycovacím sběru, bylo 98 dále charakterizováno pro vazbu α_νβ₃.

Obrázek 8 ukazuje titraci variant protilátek a fragmentu (Fab) protilátky s implantovaným LM609 na imobilizovaném α_νβ₃. Bakteriální buněčné lyzáty obsahující protilátku s implantovaným LM609 (plné kroužky), varianty se zlepšenou afinitou izolované z primárních knihoven (SI02, plné čtverečky); Y100, prázdné čtverečky a Y101, prázdné trojúhelníky) nebo kombinačních knihoven (plné trojúhelníky) nebo irrelevantní Fab (prázdné kroužky) byly titrovány na imobilizovaném α_νβ?·

Srovnání inflexních bodů vazebných křivek, získaných u titračních variant na imobilizovaném οίνβ₃, dokazuje, že násobné klony mají větší než trojnásobně zlepšenou afinitu, potvrzující účinnost použití zachycovacího sběru v sem i kvantitativním provedení (obrázek 8, srovnej čtverečky a prázdné trojúhelníky s plnými kroužky). S ohledem na skrínink zachycovacím sběrem a následující charakterizaci vazby k imobilizovaným α_νβ3> lze konstatovat, že oba lehké i těžké řetězce CDR jsou bezprostředně zahrnuty v interakci α_νβ3 s variantami protilátky s implantovaným

LM609.

Z klonů vykazujících více než trojnásobné zesílení vazby byla izolována a sekvenována DNA, aby mohly být identifikovány mutace, které vedly k vyšší afinitě. Sekvenování DNA bylo provedeno na izolovaných jednovláknových DNA. Tyto geny variabilních oblastí lehkého a těžkého řetězce byly sekven ovány fluorescenční dideoxy nukleotidovou term i načni metodou (PerkinElmer; Foster City, CA). Na základě sekvenčních analýz 103 variant bylo identifikováno 23 unikátních mutací, tvořících klastry na 14 místech (tabulka 9). Většina z těchto míst přízni-42CZ 302177 B6 vých mutací byla nalezena v CDR těžkého řetězce, z toho, čtyři v H3 a po třech v H2 (2a a 2b dohromady) a H1. Sedm odlišných užitečných aminokyselinových substitucí bylo identifikováno v jednom místě v H3, tyrosinovém zbytku 102. Odlišná povaha substitucí na tomto místě nasvědčuje, že tyrosinový zbytek 102 může stericky zabraňovat vazbě protilátky s implantovaným

LM609 k α_νβ3· Na podporu této domněnky lze uvést, že při skríninku na zesílenou vazbu nebyly nikdy izolovány varianty exprimující ostatní aromatické aminokyseliny (fenylalanin, histidin a tryptofan) místo tyrosinu na pozici 102,

Afinity selektovaných variant byly dále charakterizovány použitím povrchové plazmonové rezolo nance (BlAcore) pro měření rychlosti asociace a disociaee purifikovaných Fab s imobilizovaným a_vp> V krátkosti, povrchová plazmonová rezonance (BlAcore; Pharmacia) byla použita pro určení kinetických konstant interakce mezi a_vp3 a variantami protilátky s implantovaným

LM609. Purifikovaný receptor pro ανβ3 byl imobilizován na (1—ethy 1—3—(3—dimethylaminopropyl)-karbodiimidhydrochlorid)/N-hydroxysukcinimidem aktivovaný senzorový čip injekcí

30 pl 15 pg/ml ανβ3 v 10 mM octanu sodném, pH 4. Pro získání asociačních rychlostních konstant (kon) byla určena vazebná rychlost při pěti různých koncentracích Fab, v rozsahu 540 pg/ml v 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, obsahujícím 100 mM NaCI, 2 mM CaCb a 1 mM MgCL, při rychlosti toku 10pl/min. Disociační rychlostní konstanty (k_?ty) byly průměrem pěti měření získaných analýzou disociační fáze při zvýšené rychlosti toku (40 pl/min.). Sensorogramy byly analyzovány pomocí programu BIAevaluation 2.1 program (Pharmacia), Reziduální Fab byla odstraněna po každém měření s 10 mM HCI, 2 mM CaCl₂ a 1 mM MgCl₂.

Tabulka 9 ukazuje, že všechny tyto varianty vykazují menší Kd než molekula protilátky s implantovaným rodičovským LM609, jak při zachycovacím sběru, tak i při ELISA. Analýzy rychlostí asociace a disociaee ukázaly, že většina zlepšených variant měla menší rychlost disociace, přičemž měly podobnou rychlost asociace. Například, protilátka s implantovaným LM609 měla asociační rychlost 18,0x 10⁴M“’s“¹, přičemž příslušné varianty kolísaly od 16,7-31,8 x 10⁴ M^s“¹. Naopak, všechny klony disociovaly pomaleji než protilátky s implantovaným LM609 (4,97 x 10 ³ s¹) s disociačními rychlostmi v rozsahu od 1,6 x (3,03 x 10*³ s^_l) do 11,8 x (0,42 x

10 ³ s“¹) pomalejšími.

Tyto výsledky demonstrují, že zavedení jednoduchých aminokyselinových substitucí do CDR oblastí protilátky s implantovaným LM609 dovoluje identifikaci protilátek s implantovaným modifikovaným LM609, které mají vyšší afinitu vůči α_νβ3 ve srovnání s protilátkou s implanto35 váným rodičovským LM609.

-43CZ 302177 B6

Tabulka 9: Identifikace protilátek s implantovaným zesíleným LM609 z primárních knihoven

£	27,6	* - » * Ό o (** * * rs = c c	12,2	*» -6 1Λ c	Η. r* o oo tri “Ϊ rn Č Ό Ά c c 2 *	V) ÍN	n.d.	<\ o -d Ά B o’ B
«Λ O X fa o S4		T3 TJ TI c C tí	2,18	1,85 n.d.	· — r- O *Λ -φ Tt -ř O; T> ° rs ri ri C o O Ε B ri ri	rs o	n.d.	«> ia · m A3 cm T> _· B fi «=
1 kon (x!04) (M-ls-1 )	o 00	T3 O TS “ č e β	00	-a Ía 6	OA-«r»OM5'_;-un * A- * w n *CJ λ κ (Nl·· · — τ- τ- r** « so r- rs — β es rs es rs c c ~ rs	r* '•O	T5 d	© ia . . -o - T3 <A -T ' (Ν O o, B
O u c O > O W		GFTFSSYDMS T w L	WVAKVSSGGG K	STYYLDTVQC P E	v> (- Q ui 5 O < > < Q> IX. ΕΛ O > χ 2 X SX <	QASQSISNHLHWY F	LLIRYRSQSIS S	QQSGSWPHT N T L Q
A a > 0 js '5	Protilátka s implantovaným LM609	S * 2 ° ΐ (N « r-i gl-jř-.	a K in O tz υ	CDR2b P60 E64	*Ώ f, © — — f-J M Ct μ A μ ϊ^ξξξξξξξ~ξξ Sx>Q>«HQwŠo<	CDR1 F32	CDR2 S51	2 n tS Ό Ό ~ O\ 0\ o c* gZf-UCX
+ u u N O V		X	X	X	X		j	hJ

Příklad VII

Vytváření protilátek s implantovaným LM609 s vysokou afinitou

Tento příklad ukazuje, že mutace jednotlivých aminokyselin v oblastech CDR implantovaného LM609, které mají za důsledek vyšší vazebnou afinitu k a_vp3, lze kombinovat, aby vznikly protilátky, které mají implantovanou LM609 s vysokou afinitou.

Náhodná kombinace všech užitečných mutací LM609 implantované do protilátky by vytvořila io kombinační knihovnu obsahující více než IQ⁵ variant, vyžadující účinnou metodologii skríninku.

Aby tedy bylo možno určit, zda klony, které mají více než desetinásobně zesílené afinity, mohou být rychle odlišeny od ostatních variant, byly varianty s troj až desetinásobně zesílenou afinitou vyhodnoceny pomocí zachycovacího sběru používajícího malé koncentrace biotinylovaného α_νβ₃. Pres opakované pokusy se širokým rozsahem koncentrací α_νβ?, nebyly pozorovány žádné ís konzistentní rozdíly mezi signály zachycovacího sběru. Proto byly sestrojeny a následně pomocí

ELISA skrínovány následující menší kombinační knihovny.

Aby bylo možno vyhodnotit optimální počet kombinací, které mohou být úspěšně zpracovány pri použití dvojmístné hybridizační mutageneze, byly konstruovány čtyři odlišné kombinační kni20 hovny (obrázek 9). Jenom v krátkosti, tyto kombinační knihovny byly konstruovány syntézou degenerovaných oligonukleotidů, které kódují divoké typy i užitečné mutace těžkého řetězce (H2, Leu“ Pro; H3 Tyr” -> His; H3, Ala¹⁰¹ -> Tyr; H3, Tyr¹⁰² -> Ser, Thr, Asp, Glu, Met, Gly, Ala). Použitím dvojmístné hybridizační mutageneze, jak je popsáno výše, jsou oligonukleotidy spojeny v molámím poměru 40:1 ku uřídí nyl ovánému templátu připravenému z protilátky s implantovaným LM609 a tří mutací lehkého řetězce (obrázek 9; LI, His³² -> Phe; L3, Gly⁹² -> Asn; L3, His⁹⁶ -> Leu). Výsledkem bylo celkem 256 syntezovaných variant ve čtyřech kombinačních knihovních podsouborech.

Obrázek 9 ukazuje sestrojení kombinační knihovny užitečných mutací. Byl připraven uridinylo30 váný temp lát z protilátky s implantovaným LM609 a tří optimalizovaných variant lehkého řetězce (F32, N92 a L96). Byla provedena dvojmístná hybridizace se dvěma degenerovanými oligonukleotidy, o kterých bylo známo, že zavedou užitečné mutace ve čtyřech různých zbytcích těžkého řetězce.

Po přípravě uridínylovaných templátů protilátky s implantovaným LM609 a tří variant lehkého řetězce, (tabulka 9; F32, N92 a L96), byly degenerované nukleotidy, kódující zbytky v divokém typu a nejužitečnější mutace těžkého řetězce (tabulka 9; P60, H97, Y10, S102, TI 02, Dl02, El02, Ml02, G102 a A102), hybridizovány na templáty lehkého řetězce, při vzniku čtyřech kombinačních knihoven, obsahujících každá po 64 unikátních variantách. Kombinace násobných mutací může mít potenciálně škodlivý vliv na afinitu, a tudíž může zabraňovat identifikaci užitečných kombinací vznikajících mutacemi na několika místech. Z tohoto důvodu, byly v kombinační knihovně obsaženy v každé pozici aminokyseliny exprimované rodičovskou molekulou protilátky s implantovaným LM609. Použitím tohoto způsobu, byla provedena simultánní kombinační mutageneze u tří oblastí CDR (LI nebo L3, vždy v kombinaci s H2 a H3). Na základě sekvenční analýzy dosáhla dvojmístná hybridizační mutageneze přibližně 50% účinnosti.

Aby mohly být skrínovány uvedené kombinační knihovny, byl v malém měřítku (méně než 1 ml) syntezován a uvolněn z periplazmy fragment protilátky (Fab), který byl infikován náhodně selektovanými klony. I když byly pozorovány různé hladiny exprese, na mikrotitračních deskách byla zachycena uniformní množství nepurifi kovaných variant na základě peptidového markéru přítomného na karboxylovém konci těžkého řetězce. V krátkosti, kombinační knihovny protilátek s implantovaným LM609 byly skrínovány pomocí ELISA, což zaručuje určení relativních afinit variant protilátky produkovaných v maloměřítkových bakteriálních kulturách (Watkins et al., Anal. Biochem. 253: 37-45 (1997)). Immulon II mikrotitrační deska (Dynatech Laboratories;

-45CZ 302177 B6

Chantilly, VA) byla povlečena s 10 pg/ml 7F11 monoklonální protilátky, která rozpoznává peptidový markér na karboxylovém konci těžkých řetězců variant protilátky s implantovaným LM609 (Field et al., Mol. Cell Biol. 8: 2159-2165 (1988)). Po zachycení Fab z lyzátu E. coli, byla deska inkubována s 0,5 až I pg/ml biotinylovaného α_νβ₃ po 1 hodinu pri 25 °C, sedmkrát promytá a vyvíjena jak je již dříve popsáno (Watkins et al., viz výše, 1997). Všechna ředění a proplachy byly ve vazebném pufru.

Jak bylo již dříve popsáno Watkins et al., viz výše, 1997), ELISA skríninková metoda umožňuje rychlou a přímou metodu srovnání relativních afinit variant po inkubaci s biotinylovaným α_νβ₃ a streptavidinem s navázanou alkalickou fosfatázou. Pro zajištění využití úplné různosti Fab bylo skrínováno tisíc náhodně vybraných klonů od každé kombinační knihovny. Varianty, které vykazovaly zesílený ELISA signál, byly dále charakterizovány na vazbu k imobilizovanému α_νβ₃ (obrázek 8, plné trojúhelníky) a byly sekvenovány pro identifikaci těchto mutací (tabulka 10).

Skrínink těchto čtyř kombinačních knihoven označil čtrnáct unikátních kombinací mutací, které průkazně zlepšují vazbu ve srovnání sjednotlivými mutacemi, které byly identifikovány při skríninku první knihovny. Zatímco nejlepší klon z prvního skríninku měl 12,5 násobné zvýšení afinity, oněch čtrnáct unikátních kombinací, izolovaných pri skríninku kombinačních knihoven, mělo afinity v rozsahu osmnácti až devadesátidva násobného zvýšení vůči protilátce s implantovanou rodičovskou LM609. Většina z těchto variant sestávala z H2 a H3 mutací, kombinovaných s Ll nebo L3 mutacemi. Užitečné kombinace mutací těžkého řetězce s divokými typy lehkého řetězce byly také identifikovány, neměly však afinitu zlepšenou v takovém rozsahu, jako jiné kombinatoriální varianty. Tyto varianty převážně obsahovaly 2 až 4 mutace, s výjimkou klonu C29, který měl 5 mutací. Nebyla pozorována žádná přímá korelace mezi celkovým počtem mutací ve variantě a výslednou afinitou. Například, zatímco vazba u klonu C37 byla dvaadevadesáti násobně zesílena vůči rodičovské molekule a tohoto zvýšení bylo dosaženo kombinací tři mutací, měl klon C29 přibližně padesátpětkrát vyšší afinitu při kombinaci 5 mutací. Byly identifikovány mnohočetné varianty vykazující asi padesátinásobně zesílenou afinitu jako výsledek kombinace tak málo, jako dvou mutací (2G4, 17 a V357D).

Všechny kombinační klony se zlepšenou afinitou měly více než desetinásobně nižší disociační rychlost, což možná odpovídá selekčnímu rozdílu, zavedenému dlouhými inkubačními kroky při skríninku. Kromě toho, všechny tyto kombinační varianty byly izolovány z knihovny založené na mutaci lehkého řetězce L96 a současně měly dva až čtyřnásobně vyšší rychlosti asociace. Předběžně bylo ukázáno, že spektrum protilátek se posunuje proti imunoglobulinům, které mají vyšší asociační rychlosti v průběhu zrání afinity in vivo (Foote a Milstein, Nátuře 352: 350-352 (1991)). Podskupina variant od L96 může proto být mimicky bližší in vivo procesu zrání (posttranslačních modifikací) afinity, kde je proliferace B-lymfocytů subjektem kinetické selekce.

Protilátka s implantovaným LM609 váže specificky komplex αγβ₃ a nerozpozná ani samotný a_v, ani β₃ řetězec. Pro další charakterizaci těchto variant, byly klony skrínovány na reaktivitu vůči příbuzným integrinům, αηβ₃ a a_vp5. Všechny testované varianty byly nereaktivní vůči αιιβ₃ a ctvps, v souhlase se zlepšenou vazbou, v podstatě neměnící interakci Fab a receptoru.

Jako první krok směřující k určení, jestli zvýšení afinity u těchto variant mělo za výsledek zvětšenou biologickou aktivitu, byly varianty, vykazující rozsah afinit, testovány na jejich schopnost inhibovat vazbu přirozeného ligandu, fibrinogenu, k imobilizovanému receptoru α_νβ₃. V krátkosti, varianty protilátky s implantovaným LM609 byly testovány na inhibici vazby ligandu, jak bylo předběžně popsáno, s tou výjimkou, že vazba biotinylovaného lidského fibrinogenu (Calbiochem, La Jolla, CA) byla detekována s 0,5 pg/ml NeutrAvidinu s navázanou alkalickou fosfatázou (Smith etal.. J. Biol. Chem. 265: 12267-12271 (1990)).

-46CZ 302177 B6

Tabulka 10: Identifikace optimálních kombinačních mutací

Kd(nM)

Ό Λ t— CM

Xl o

CM Xl Π Λ — o

Os pb o

os θ'

Xl Pb O

»r> 1—4

SO Xl f. *. o o

Tí- * o

<3- «s o

m Tt η p. O o

θ'

07

00

\O Xl

r-

CM

o

SO

O ro

Os

Γ-

Γ- 00

o

os

ro

ro ro

m

Os

M-

t—<

00 Tt

CM

ΟΟ

Tt Xl

oo

X —

(M

CM —«

i—<

w

i—4

m

CM rn

CM

·—1 <

CM

Tt

o

p. ·> o o

o

o*

O

P> o

θ' «Γ

O

Pb O

n Pb O o

*S o

sjie

o

Tt so

Xl

Xl

os

Xlft

Xl Xl

rn

Tt

00 C3

OS

00

xf

θ' Md

\o

CM

-3“

t-7 t-7

o

o

Tf r-i

00

CM

CM CM

CM

CM

CM

CM

Tt SO

so

X

Tt Tt

m

m X

CM O ^“4

>

ΪΛ

Ol W

QHQ

CZJ

cn «

UQ

to

W cc

C/3

ro X

1—4 O

<

> >

c-

o S c

Os

>

SC

X X

o > CM

λ

X

ac w ζΛ ro

SO so

CU CU

Ci

CU

cu

cu cu

cu

CU

U

σ*.

X

kJ hJ

u

u u

i-3

m -4

CM Os

C

2

CM m

33

(i

ti ti

til

ti

ti

z

c

Os

SC fM-

Q r-

os

Os Os

M-

sC

r—· —

o

Xl

Γ'·

XI

1-^

ti CM

O X rn Q O

3

O

o

ro >

o

oo (J

CM

so

UJ SO

sO

* «3

α

>

o

o

O, >»

CM ro

CM OS

so Os

'5

·>

w

ti

z

-3

3

-47CZ 302177 B6

Výsledky těchto kompetitivních postupů jsou uvedeny na obrázku 10. Obrázek 10 ukazuje inhibici vazby fibrinogenu k imobilizovanému ανβί- Imobilizovaný α_νβ₃ byl inkubován s 0,1 pg/ml biotinylovaného fibrinogenu a s různými koncentracemi protilátky s implantovaným LM609 (prázdné kroužky), S102 (plné kroužky), F32 (prázdné trojúhelníky) nebo C59 (plné trojúhelní5 ky) po 3 hodiny při 37 °C. Nenavázaný ligand a Fab byly odstraněny promytím a vázaný fibrinogen byl stanoven po inkubaci s NeutrAvidinem s navázanou alkalickou fosfatázou. Obrázek 10 ukazuje korelaci afinity variant s inhibici vazby fibrinogenu. Koncentrace těchto variant, potřebná pro 50% inhibici vazby fibrinogenu na imobilizovaný α_νβ₃, byla vynesena jako funkce afinity (Kd).

io

Jak je uvedena na obrázku 10A, varianty s vyšší afinitou byly efektivnější při blokování vazebných míst receptoru (srovnej protilátky s implantovaným LM609, prázdné kroužky, s kteroukoliv z variant). Následné analýzy deseti variant, vykazujících afinity (Kd) v rozsahu od 0,3 do 27 nm, předvedly dobrou korelaci (r² = 0,976) mezi afinitou a schopností inhibovat vazbu fibrinogenu i? (obrázek Ι0Β). Kromě toho, byly varianty testovány na inhibici vazby vitronectinu k receptoru.

Podobně jako u fibrinogenu, byly varianty mnohem účinnější při inhibici této interakce, než rodičovská molekula. V souhlasu se studiemi krizových reakcí s receptory příbuzných integrinů, se zdá, že mutace zvyšující afinitu nemění nijak podstatně způsob, jakým tyto protilátky reagují s receptorem.

Byla také vyzkoušena schopnost těchto variant inhibovat adhezi M2I buněk lidského melanomu, které exprimují α_νβ₃ receptory pro fibrinogen. Inhibice adheze 4 x ΙΟ⁴ M21 buněk na fibrinogen protilátkami s implantovaným LM609 byla realizována popsaným způsobem (Leavesley et al., J. Cell Biol. 117: 1101-1107 (1992)). Podobně jako u ligandových kompetičních studií s purifi25 kovaným fibrinogenem a α_νβ3 receptorem, byly varianty s vyšší afinitou obecně účinnější při bránění buněčné adhezi než protilátka s implantovaným LM609 (obrázek 11). Obrázek 11 ukazuje inhibici adheze buněk lidského M21 melanomu na fibrinogen. Buňky a různé koncentrace Fab protilátky s implantovaným LM609 (plné trojúhelníky), S102 (prázdné kruhy), G102 (plné kruhy) nebo C37 (prázdné trojúhelníky), byly přidány do 96 jamkových kultivačních desek, které w byly potaženy s 10gg/ml fibrinogenem. Po 35 minutové inkubaci při 37 °C byly nenavázané buňky odstraněny promytím a adherzované buňky byly kvantitativně stanoveny barvením krystalovou violetí.

Zatímco intaktní Ig protilátky s implantovaným LM609 inhibují adhezi buněk, fragmenty Fab, syntezované fágem, neovlivňují buněčnou adhezi při koncentracích do 1 mg/ml (obrázek 11, plné trojúhelníky). Klon C37, izolovaný z kombinační knihovny a vykazující devadesáti násobě vyšší afinitu než Fab protilátky s implantovaným LM609, inhiboval buněčnou adhezi kompletně (obrázek 11, prázdné trojúhelníky). Varianta G102 měla mírně vyšší afinitu (2,2-násobné zesílení) a také inhibovala adhezi buněk, i když s menší účinností než C37 (obrázek 11, plné kroužky).

Klon S102 (obrázek 11, plné kroužky), který měl 4,6 násobně vyšší afinitu než protilátka s implantovaným LM609, byl překvapivě neúčinný při inhibici adheze buněk, což nasvědčuje, že klony G102 a S102 interagují s receptory pro ανβ3 různým způsobem.

Tyto výsledky ukazují, že kombinování jednoduchých aminokyselinových mutací, jehož výsled45 kem byly protilátky s implantovaným LM609 s vyšší vazebnou afinitou vůči ανβ3, dovoluje identifikaci mutantů protilátek s implantovaným LM609 s vysokou afinitou, které mají více než devadesátinásobně vyšší vazebnou afinitu než protilátka s implantovaným rodičovským LM609.

-48CZ 302177 B6

Příklad Vlil

Vytváření protilátek s implantovaným zesíleným LM609 s vysokou afinitou

Tento příklad popisuje vytvoření protilátek s implantovaným zesíleným LM609 s vysokou afinitou, které mají zvýšenou stabilitu.

Klon 6H6 s vysokou afinitou (viz tabulku 10 v příkladu VII) byl dále charakterizován a bylo zjištěno, že ovlivňuje proteolýzu. Pro identifikaci variant se zvýšenou stabilitou, bylo 32 kodonoio vých variant současně zavedeno do každé z pozic Asnm⁹⁶ a His⁹⁷ (číslování dle Kabat et al., viz výše) v těžkém řetězci CDR3 nebo 6H6 (SEQ ID NO:94) a tyto varianty byly skrínovány na vazebnou aktivitu vůči α_νβ3· Ty varianty, které si zachovaly vazebnou aktivitu, byly sekvenovány a potom skrínovány na suceptibilitu vůči proteolýze. Tato varianta 6H6LH byla identifikována ve smyslu vazebné aktivity k α_νβ₃ a současně rezistence vůči proteolýze (viz tabulky 11 a 15). ts Varianta 6H6LH, která měla vysokou afinitu k α_νβ3, měla Leu substituovaný Asn⁹⁶, ale zachovala si His⁹⁷.

I když tato varianta 6H6LH vykazovala vysokou vazebnou afinitu vůči αγβ?, tato afinita byla poněkud nižší, než u varianty 6H6 (viz tabulka 15). Mutace oblastí CDR, u které byla zjištěna vysoká vazebná afinita, byla tedy kombinována s variantou 6H6LH. Přesněji řečeno, His³² v CDR1 u lehkého řetězce 6H6 byl mutován na Phe, jako v klonu F32 (viz tabulku 9), aby vznikl klon 2236/6H6LH (viz tabulku 13). V jedné dodatečné variantě, byl Leu⁶² v CDR2 lehkém řetězci u 6H6 také mutován na Pro, jako v klonu P60 (viz tabulka 9), aby vznikl klon 2236-38/6H6LH (viz tabulka 11),

V tabulkách 11 a 12 jsou uvedeny aminokyselinové, respektive nukleotidové sekvence oblastí CDR těžkého řetězce variant 6H6 se zesílenou vysokou afinitou. V tabulkách 13 a 14 jsou také uvedeny aminokyselinové, respektive nukleotidové sekvence oblastí CDR lehkého řetězce variant 6H6 se zesílenou vysokou afinitou. Uvedené oblasti CDR jsou v souhlasu s Chothia et al., viz výše. Aminokyseliny a kodony, které se liší od variant 6H6, jsou vytištěny tučně.

-49CZ 302177 B6

Tabulka 11: Aminokyselinové sekvence oblastí CDR těžkého řetězce u variant 6H6 protilátek se zesílenou vysokou afinitou

Těžký řetězec CDR1 Klon

6H6LH	GFTF SSYDMS	SEQ ID NO. 34
2236/6H6LH	GFTF SSYDMS	SEQ ID NO. 34
2236-38/6H6LH	GFTF SSYDMS	SEQ ID NO. 34

Těžký řetězec CDR2 Klon

6H6LH	KVSSGGGSTY Y L D T V Q G	SEQ ID NO.	102
2236/6H6HLH	KVSSGGGSTY YLDTVQG	SEQ ID NO.	102
2236-38/6h6LH	KVSSGGGSTY Y P D T V Q G	SEQ ID NO.	102
Těžký řetězec CDR3
6H6LH	HLHGSFAS	SEQ ID NO:	106
2236/6H6LH	HLHGSFAS	SEQ ID NO:	106
2236-38/6H6LH	HLHGSFAS	SEQ ID NO:	106

- 50CZ 302177 B6

Tabulka 12: Nukleotidové sekvence oblastí CDR těžkého řetězce variant 6H6 protilátek se zesílenou vysokou afinitou

Těžký řetězec CDR1 6H6LH

2236/6H6LH

2236-3 8/6H6

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GAC

ATG TCT SEQ ID NO: 33

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GAC

ATG TCT SEQ ID NO: 33

GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GAC

ATG TCT SEQ ID NO: 33

Těžký řetězec CDR2 6H6LH

2236/6H6LH

2236-38/6H6LH

AAA GTT AGT AGT GGT GGT GGT AGC ACC TAC TAT TTA GAC ACT GTG CAG GGC SEQ ID NO: 101

AAA GTT AGT AGT GGT GGT GGT AGC ACC TAC TAT TTA GAC ACT GTG CAG GGC SEQ ID NO: 101

AAA GTT AGT AGT GGT GGT GGT AGC ACC TAC TAT CCA GAC ACT GTG CAG GGC SEQ ID NO: 103

Těžký řetězec CDR3

6H6LH

2236/6H6LH

2236-38/6H6LH

CAT CTT CAT GGC AGT TTT GCT TCT

SEQ ID NO: 105

CAT CTT CAT GGC AGT TTT GCT TCT

SEQ ID NO: 105

CAT CTT CAT GGC AGT TTT GCT TCT

SEQ ID NO: 105

-51 CZ 302177 B6

Tabulka 13: Aminokyselinové sekvence oblastí CDR lehkého řetězce variant protilátek se zesílenou vysokou afinitou

Lehký řetězec CDR1
6H6LH	QASQSISNHLH	SEQ ID NO: 108
2236/6H6LH	QASQSISNFLH	SEQ ID NO: 110
2236-38/6H6LH	QASQSISNFLH	SEQ ID NO: 110
Lehký řetězec CDR2
6H6LH	YRSQSIS	SEQ ID NO: 112
2236/6H6LH	Y R S Q S I S	SEQ ID NO: 112
2236-38/6H6LH	YRSQSIS	SEQ ID NO: 112
Lehký řetězec CDR3
6H6LH	QQSGSW PLT	SEQ ID NO: 90
2236/6H6LH	QQSGSWPLT	SEQ ID NO: 90
2236-38/6H6LH	QQSGSW PLT	SEQ ID NO: 90

- 52 CZ 302177 B6

Tabulka 14: Sekvence nukleotidů oblastí CDR lehkého řetězce 6H6 variant protilátek se zesílenou vysokou afinitou

Lehký řetězec CDR1

6H6LH CAG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC

	CAG CTA CAC	SEQ ID NO: 107
2236/6H6LH	CAG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC
	TTT CTA CAC	SEQ ID NO: 109
2236-38/6H6LH	CAG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC
	TTT CTA CAC	SEQ ID NO: 109
Lehký řetězec CDR2
6H6LH	TAT CGT TCC CAG TCC ATC TCT	SEQ ID NO: 111
2236/6H6LH	TAT CGT TCC CAG TCC ATC TCT	SEQ ID NO: 111
2236-3 8/6H6LH	TAT CGT TCC CAG TCC ATC TCT	SEQ ID NO: 111
Lehký řetězec CDR3
6H6LH	CAA CAG AGT GGC AGC TGG CCT CTG
	ACG	SEQ ID NO: 89
2236/6H6LH	CAA CAG AGT GGC AGC TGG CCT CTG
	ACG	SEQ ID NO: 89
2236-38/6H6LH	CAA CAG AGT GGC AGC TGG CCT CTG
	ACG	SEQ ID NO: 89

Kinetika vazby α_νβ₃ byla určena pro každý klon použitím povrchové plazmonové rezonance (BIACORE), původně popsané v příkladu VI. Kinetika vazby a afinity těchto klonů jsou uvedeny tabulce 15.

-53CZ 302177 B6

Tabulka 15: Kinetika vazby klonů protilátky s implantovaným zesíleným LM609

Označení klonu	kon	kOff	kd
6H6	2,59E+05	l,60E-04	0,62 nM
2236/6H6LH	2,59E+05	l,48E-04	0,66 nM
6H6LH	3.01E+05	5.48E-04	1,82 nM
2236-38/6H6LH	2,76E+05	2,49E-04	0,90 nM

Jak je uvedeno v tabulce 15 mají klony 6H6LH, 2236/6H6LH a 2236-38/6H6LH podobné afinity jako klon 6H6. Afinita klonu 6H6 v těchto experimentech byla 0,62 nM, ve srovnání s 0,4 nM zjištěných v předešlém experimentu (viz tabulku 10 v příkladu VII). Tento rozdíl je důsledkem pozorované k_on, který je v rámci variability těchto experimentů. Co se týče rychlostí, byly 6H6, io 6H6LH, 2236/6H6LH a 2236-38/6H6LH velmi podobné. Malé diference pozorované v k_d jsou zřejmě důsledkem primárních rozdílů v k_off.

Tyto výsledky popisují protilátky s implantovaným dodatečně zesíleným LM609, které mají vysokou afinitu vůči α_νβ₃ a rezistenci vůči proteolýze.

V celé této přihlášce jsou odkazy na různé publikace. Zveřejnění těchto publikací v jejich úplnosti je tímto postoupeno k začlenění do této přihlášky, aby byl ve větší úplnosti popsána oblast, do níž tento vynález patří.

2o 1 když tento vynález je popsán s odvoláním na tato uveřejněná uspořádání, osoby zběhlé v tomto oboru lehce zjistí, že tyto konkrétní, podrobně popsané experimenty, jsou zde pouze pro ilustraci tohoto vynálezu. Je třeba si uvědomit, že mohou být učiněny různé modifikace, aniž by bylo vybočeno ze záměru tohoto vynálezu. V souhlase s tím, je tento vynález ohraničen pouze následujícími patentovými nároky.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protilátka nebo její funkční fragment, obsahující oblast V_H CDR1, popsanou jako SEQ ID NO: 34; V_H CDR2, popsanou jako SEQ ID NO: 102 nebo jako SEQ ID NO: 104; V_H CDR3, popsanou jako SEQ ID NO: 106; Vl CDR1, popsanou jako SEQ ID NO: 108 nebo jako SEQ ID

   35 NO: 110; V_L CDR2, popsanou jako SEQ ID NO: 112; a V_L CDR3, popsanou jako SEQ ID NO: 90; přičemž uvedená protilátka nebo její funkční fragment vykazuje vazebnou afinitu k α_νβ? integrinu, vazebnou specifltu k α_νβ₃ integrinu, nebo inhibiční účinnost k α_νβ₂ integrinu.
2. 2. Fragment protilátky podle nároku I, kde uvedený funkční fragment je vybrán ze skupiny

   40 sestávající z Fv, Fab, F(ab)₂ a scFV.
3. 3. Molekula nukleové kyseliny kódující protilátka podle nároku 1.

   -54CZ 302177 B6
4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde uvedená molekula nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci, popsanou jako SEQ ID NO: 33, kódující oblast V_H CDR1; nukleotidovou sekvenci, popsanou jako SEQ ID NO: 101 nebo SEQ ID NO: 103, kódující oblast V_H CDR2; nukleotidovou sekvenci, popsanou jako SEQ ID NO: 105, kódující oblast V_H CDR3;
5. 5 nukleotidovou sekvenci, popsanou jako SEQ ID NO: 107 nebo SEQ ID NO: 109, kódující oblast V_L CDR1; nukleotidovou oblast, popsanou jako SEQ ID NO: lil, kódující oblast V_L CDR2 a nukleotidovou sekvenci, popsanou jako SEQ ID NO: 89, kódující oblast V_L CDR3.

   5. Molekula nukleové kyseliny, která má nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny nukleoío tidových sekvencí sestávající z SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO:

   103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109 a SEQ ID NO: 111.
6. 6. Metoda inhibování funkce ανβ₃ in vitro, zahrnující kontakt α_νβ₃ s protilátkou podle nároku 1 nebo 2.
7. 7. Použití protilátky nebo funkčního fragmentu podle nároku 1 nebo 2 pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení patologické neovaskularizace.
8. 8. Použití podle nároku 7, kde uvedená patologická neovaskularizace zahrnuje diabetickou reti20 nopathii, neovaskulámí glaukom, makulámí degeneraci, restenózu a prolíferaci kapilár v aterosklerotických destičkách, zánětlivé poruchy jako jsou imunitní a neimunitní záněty, chronický kloubový reumatismus, reumatickou artritidu, psoriázu a osteoporózu.
9. 9. Použití protilátky nebo funkčního fragmentu podle nároku 1 nebo 2 pro přípravu farmaceu25 tické kompozice pro léčení rakoviny.
10. 10. Použití podle nároku 9, kde uvedená rakovina je vybrána z melanomu, glioblastomu, karcinomu prsu, angiofibromu, retrolentálního nádoru, fibroplasie, hemangiomu, a Kaposiho sarkomu.

    30
11. 11. Použití podle nároku 9, kde uvedená rakovina zahrnuje metastázu.
12. 12. Použití podle nároku 9, kde uvedená rakovina zahrnuje pevné nádory.
13. 13. Použití protilátky nebo funkčního fragmentu podle nároku 1 nebo 2 pro přípravu farmaceu35 tické kompozice pro léčení nádoru exprimuj ícího α_νβ₃.