JP2009219495A - 抗αＶβ３組換えヒト抗体、これをコードする核酸およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】インテグリンα_ｖβ_３を特異的に認識し、そしてその機能的活性を阻害する抗体を提供すること。
【解決手段】α_ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体またはその機能的フラグメントであって、特定の配列で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；Ｖ_ＨＣＤＲ３；およびＶ_ＬＣＤＲ１からなる群から選択されるＣＤＲを含む、増強されたＬＭ６０９移植抗体。該抗体はインテグリン媒介性疾患の治療的処置を可能にする。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般的に、インテグリン媒介性疾患に関し、そしてより詳細には、α_Ｖβ_３阻害性モノクローナル抗体をコードする核酸およびα_Ｖβ_３媒介性疾患の治療的処置のためのＣＤＲ移植α_Ｖβ_３阻害性抗体に関する。

インテグリンは、細胞−細胞接着事象および細胞−細胞外マトリックス接着事象の両方を媒介する細胞接着レセプターのクラスである。インテグリンは、ヘテロ二量体ポリペプチドからなり、ここでα単鎖ポリペプチドは、非共有結合的にβ単鎖と会合する。現在、細胞接着レセプターのインテグリンファミリーを構成する約１４の別個のα鎖ポリペプチドおよび少なくとも約８個の異なるβ鎖ポリペプチドが存在する。一般的に、異なる結合特異性および組織分布は、α鎖ポリペプチドおよびβ鎖ポリペプチドまたはインテグリンサブユニットの独特の組み合わせに由来する。特定のインテグリンが関連するファミリーは、通常βサブユニットによって特徴付けられる。しかし、インテグリンのリガンド結合活性は、ほとんどαサブユニットにより影響を受ける。例えば、ビトロネクチン結合インテグリンは、α_Ｖインテグリンサブユニットを含む。

現在、ビトロネクチン結合インテグリンは、少なくとも３つの異なるα_Ｖ含有インテグリンから成ることが公知である。これらのα_Ｖ含有インテグリンとしては、α_Ｖβ_３、α_Ｖβ_１およびα_Ｖβ_５が挙げられ、これらの全ては、異なるリガンド結合特異性を示す。例えば、ビトロネクチンに加えて、α_Ｖβ_３は、多種の細胞外マトリックスタンパク質（フィブロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、フォン・ビルブラント因子、コラーゲン、オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質Ｉを含む）に結合する。インテグリンα_Ｖβ_１は、フィブロネクチン、オステオポンチンおよびビトロネクチンと結合するのに対して、α_Ｖβ_５は、ビトロネクチンおよびオステオポンチンと結合することが公知である。

細胞接着レセプターとして、インテグリンは、種々の生理学的プロセス（例えば、細胞接着、細胞移動および細胞増殖を含む）に関与する。異なるインテグリンは、これらの各々の生物学的プロセスにおいて異なる役割を果たし、そしてそれらの機能または活性の不適切な調節は、種々の病理学的状態を導き得る。例えば、腫瘍の新生血管形成の間の不適切な内皮細胞増殖は、ビトロネクチン結合インテグリンを発現する細胞により媒介されることが見出されている。この点について、ビトロネクチン結合インテグリンα_Ｖβ_３の阻害はまた、このプロセスの腫瘍の新生血管形成を阻害する。この同じ判定基準によって、α_Ｖβ_３はまた、例えば、再狭窄に関連する異常な細胞増殖および皮膚創傷における肉芽組織発生を媒介することが示されている。α_Ｖβ_３により媒介または影響を及ぼされるさらなる疾患または病理学的状態としては、例えば、転移、骨粗しょう症、加齢性筋肉変性および糖尿病性網膜症、ならびに炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび乾癬）が挙げられる。従って、ビトロネクチン結合インテグリンを特異的に阻害し得る薬剤は、疾患の治療処置のために役に立つ。

多くのインテグリンは、多数の細胞外マトリックスタンパク質内に見出されるトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を認識することにより、それらの細胞接着機能を媒介する。種々のアプローチが、特定のインテグリン媒介性病理を標的とするこの配列を模倣して、薬剤を設計するために試みられてきた。そのようなアプローチとしては、例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびＲＧＤコアトリペプチド配列に隣接する配列により与えられる特異性に依存するペプチドアナログの使用が挙げられる。いくつかの限定的な成功が存在するが、ほとんどのＲＧＤベースのインヒビターは、よく見て、標的とされたインテグリンに対して選択性であり、それ故、他の標的とされていないインテグリンに対していくらか交叉反応性であるということが示されてきた。従って、そのような交叉反応性インヒビターは、有効な治療物質としての使用のために必要とされる特異性を欠損している。これは、以前に同定された、インテグリンα_Ｖβ_３のインヒビターに対して特に当てはまる。

一方、モノクローナル抗体は、有効な治療物質として使用されるために必要とされる特異性を示す。抗体はまた、それらが本質的に任意の所望の抗原に対して慣用的に産生され得るという点において利点を有する。さらに、組み合わせライブラリーの開発と共に、抗体は現在、当該分野の範囲内で以前に使用されていた方法によってよりも速く、なおかつ効率的に産生される。組み合わせ方法論の使用はまた、重鎖をコードする核酸および軽鎖をコードする核酸の同時単離と共に、所望の抗体の選択を可能にする。従って、さらなる改変が、さらなるクローニング工程を組み入れずに、組み合わせ抗体に対して実施され得る。

治療物質としてのモノクローナル抗体の使用に関連する潜在的利点に関わらず、これらの分子はそれでもやはり、それらが非ヒト哺乳動物生物からほぼ独占的に誘導されるという点において欠点を有する。従って、治療物質としてのそれらの使用は、それらが宿主免疫応答を正常に誘発するという事実によって制限される。非ヒト抗体の抗原結合部位または相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）内で置換するための方法が記載される。そのような方法は、どのアミノ酸残基がＣＤＲとして置換されるべきか、そしてどのフレームワーク残基が結合特異性を維持するように変更されるべきかによって変わる。この点において、βシート構造の適切な方向、重鎖および軽鎖の界面の正確な詰め込み（ｐａｃｋｉｎｇ）およびＣＤＲの適切なコンフォメーションが、移植された抗体内の抗原特異性および親和性を維持するために全て重要であるということが理解される。しかし、これらの方法の全ては、非ヒト抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびに適切に設計されたヒトフレームワークの有効性の知識を必要とする。

従って、ヒトにおける適合性の治療物質として使用され得るインテグリン阻害性抗体をコードする核酸の有効性に対する必要性が存在する。α_Ｖβ_３媒介性疾患について、本発明はこの必要性を満たし、その上、関連する利点を提供する。

（発明の要旨）
本発明は、α_Ｖβ_３またはその機能フラグメントに対して選択的結合親和性を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する。本発明はまた、増強されたＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸分子を提供する。α_Ｖβ_３を増強されたＬＭ６０９移植抗体と接触させることによってα_Ｖβ_３の機能を阻害する方法がさらに提供される。

図１は、抗体Ｖｉｔａｘｉｎの可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。図１Ａは、ビタシキン重鎖可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（Ｇｌｎ１−Ｓｅｒ１１７；それぞれ配列番号１および２） 図１Ｂは、ビタシキン軽鎖可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（Ｇｌｎ１−Ｌｙｓ１０７；それぞれ配列番号３および４）。 図２は、モノクローナル抗体ＬＭ６０９の可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。図２Ａは、ＬＭ６０９重鎖可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号５および６）を示す。可変領域は、アミノ酸Ｇｌｕ１〜Ａｌａ１１７に広がる。 図２Ｂは、ＬＭ６０９軽鎖可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号７および８）。軽鎖の可変領域は、アミノ酸Ａｓｐ１〜Ｌｙｓ１０７に広がる。 図３は、ＬＭ６０９ ＩｇＧ結合の組換えＬＭ６０９Ｆａｂを有するインテグリンα_Ｖβ_３に対する競合阻害を示す。可溶性組換えマウスＬＭ６０９Ｆａｂフラグメントを、Ｍ１３バクテリオファージクローンであるｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２およびｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ ２９の周辺質画分から調製した。周辺質サンプルを連続希釈し、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌのＬＭ６０９ ＩｇＧのいずれかと共に混合し、次いで精製されたα_Ｖβ_３でコーティングされた９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。プレートを洗浄し、そしてアルカリホスファターゼと結合体化されたヤギ抗マウスＦｃ特異的抗体で検出されるＬＭ６０９ ＩｇＧと結合させた。クローンｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２により産生されるＦａｂは、１ｎｇ／ｍｌ ＬＭ６０９ ＩｇＧ結合および５ｎｇ／ｍｌ ＬＭ６０９ ＩｇＧ結合の両方を、１：２７希釈よりも大きな全ての濃度のＦａｂにおいて阻害する。 図４は、Ｖｉｔａｘｉｎ結合特異性の特徴付けを示す。図４Ａは、インテグリンα_ＩＩｂβ_３およびα_Ｖβ_５と比較される、インテグリンα_Ｖβ_３へのＶｉｔａｘｉｎの特異的結合を示す。 図４は、Ｖｉｔａｘｉｎ結合特異性の特徴付けを示す。図４Ｂは、Ｖｉｔａｘｉｎによるα_Ｖβ_３へのＬＭ６０９結合の競合阻害を示す。 図４は、Ｖｉｔａｘｉｎ結合特異性の特徴付けを示す。図４Ｃは、Ｖｉｔａｘｉｎによるα_Ｖβ_３へのフィブリノゲン結合の競合阻害を示す。 図５は、Ｖｉｔａｘｉｎによるα_Ｖβ_３媒介性細胞接着（５Ａ）および細胞移動（５Ｂ）の競合を示す。 図５は、Ｖｉｔａｘｉｎによるα_Ｖβ_３媒介性細胞接着（５Ａ）および細胞移動（５Ｂ）の競合を示す。 図６は、新生血管形成のＶｉｔａｘｉｎ媒介性阻害に起因する腫瘍増殖の減少を示す。図６ＡはＶｉｔａｘｉｎ処理後に、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）上で増殖するα_Ｖβ_３ネガティブＦｇおよびＨＥｐ−３ヒト腫瘍フラグメントの阻害を示す。 図６は、新生血管形成のＶｉｔａｘｉｎ媒介性阻害に起因する腫瘍増殖の減少を示す。図６Ｂは、移植後１日目に２つの異なるＶｉｔａｘｉｎ用量を投与されたウサギに皮下移植されたＶｘ２癌の増殖阻害を示す。 図６は、新生血管形成のＶｉｔａｘｉｎ媒介性阻害に起因する腫瘍増殖の減少を示す。図６Ｃは、４つの異なるＶｉｔａｘｉｎ用量を移植後７日目に最初に投与したことを除いて、図６Ｂの場合と同様に、Ｖｘ２腫瘍増殖阻害を示す。 図７は、ＬＭ６０９移植抗体フラグメントの軽鎖可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ１０７；それぞれ配列番号３１および３２）。軽鎖可変領域の４９位は、少なくともＡｒｇまたはＭｅｔのいずれかであり得る。ＬＭ６０９移植抗体フラグメントの重鎖可変領域のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、図１Ａに示される（それぞれ配列番号１および２）。 図８は、固定化したα_ｖβ_３上のＬＭ６０９グラフト化抗体改変体およびＬＭ６０９グラフト化Ｆａｂの力価測定を示す。ＬＭ６０９グラフト化抗体（黒丸）、一次ライブラリーから単離した親和性が改善されたＬＭ６０９グラフト化抗体改変体（Ｓ１０２、黒四角；Ｙ１００、白四角；およびＹ１０１、白三角）、もしくはコンビナトリアルライブラリーから単離した親和性が改善されたＬＭ６０９グラフト化抗体改変体（黒三角）、または無関係のＦａｂ（白丸）を含有する細菌細胞溶解物を、固定化α_ｖβ_３上で力価測定した。 図９は、複数のアミノ酸置換を含有する増強されたＬＭ６０９グラフト化抗体改変体のコンビナトリアルライブラリーの構築を示す。 図１０は、ＬＭ６０９グラフト化抗体改変体による、α_ｖβ_３に対するフィブリノーゲン結合の阻害を示す。図１０Ａは、固定化α_ｖβ_３に対するフィブリノーゲン結合の阻害を示す。図１０Ｂは、抗体改変体の親和性とフィブリノーゲン結合の阻害との相関を示す。 図１１は、ＬＭ６０９グラフト化抗体改変体によるフィブリノーゲンへのＭ２１ヒト黒色腫細胞接着の阻害を示す。１０μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンをコーティングした基板への細胞結合をＬＭ６０９グラフト化Ｆａｂ（黒三角）または増強したＬＭ６０９グラフト化Ｆａｂ Ｓ１０２（白丸）、Ｇ１０２（黒丸）、もしくはＣ３７（白三角）の種々の濃度の存在下で評価した。

（発明の詳細な説明）
本発明は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＬＭ６０９をコードする核酸に関する。この抗体は、インテグリンα_ｖβ_３を特異的に認識し、そしてその機能的活性を阻害する。本発明はまた、ＬＭ６０９の非マウス移植形態をコードする核酸およびＬＭ６０９の非マウス移植形態を含むポリペプチドに関する。これらの移植抗体は、親マウス抗体ＬＭ６０９の結合特異性および阻害活性を保持する。本発明はさらに、ＬＭ６０９移植抗体の非マウス親形態と比較して、増大された結合親和性および特異性を示すＬＭ６０９移植抗体の最適化された形態に関する。

１つの実施形態において、ＬＭ６０９を発現するハイブリドーマを、ＬＭ６０９をコードするｃＤＮＡを生成し、そしてクローニングするための供給源として使用した。重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを配列決定し、そしてそれらのｃＤＮＡ領域をヒト抗体フレームワーク中に置換して、抗体の非マウス形態を生成した。ＣＤＲの置換または移植を、コドン塩基の変異誘発により行って、特定の位置で別の残基を提示するメンバーからなるコンビナトリアル抗体Ｆａｂライブラリーを生成した。ライブラリーのスクリーニングにより、Ｖｉｔａｘｉｎの単離を生じた。ヒトフレームワーク配列を含む移植抗体として、Ｖｉｔａｘｉｎが宿主免疫応答を誘発する可能性は低く、従って、α_ｖβ_３媒介疾患の処置のために有利に使用され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体ＬＭ６０９」または「ＬＭ６０９」は、Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４７１−６４７５（１９８７）およびＣｈｅｒｅｓｈ ａｎｄ Ｓｐｉｒｏ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７７０３−１７７１１（１９８７）により記載されるインテグリンα_ｖβ_３に特異的なマウスモノクローナル抗体を意味することが意図される。ＬＭ６０９は、Ｍ２１細胞に対して生成された。そしてＬＭ６０９は、現在インテグリンα_ｖβ_３として公知のＭ２１細胞接着レセプターと反応する。ＬＭ６０９は、α_ｖβ_３リガンド（例えば、ビトロネクチン、フィブリノーゲンおよびフォンビルブラント因子（Ｃｈｅｒｅｓｈ ａｎｄ Ｓｐｉｒｏ，前出））に対するＭ２１細胞の結合を阻害し、そしてα_ｖβ_３媒介病理（例えば、腫瘍が誘導する新脈管形成（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ ７９：１１５７−１１６４（１９９４）、皮膚創傷における顆粒化組織の発生（Ｃｌａｒｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１４８：１４０７−１４２１（１９９６）および再狭窄の間に生じるような平滑筋細胞移動（Ｃｈｏｉら，Ｊ．Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇ．，１９：１２５−１３４（１９９４）；Ｊｏｎｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：２４８２−２４８７（１９９６））のインヒビターでもある。

本明細書中で使用される場合、用語「Ｖｉｔａｘｉｎ」は、ＬＭ６０９において見出されるものと実質的に同じ重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を有する非マウス抗体またはその機能的フラグメントをいうことが意図される。重鎖または軽鎖のポリペプチドを参照して使用される場合の用語「Ｖｉｔａｘｉｎ」は、それぞれ、ＬＭ６０９の重鎖または軽鎖において見られるものと実質的に同じ重鎖または軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を有する非マウス重鎖または軽鎖またはその機能的フラグメントをいうことが意図される。機能的フラグメントを参照して使用される場合、全てのＬＭ６０９ ＣＤＲを示す必要はない。むしろ、機能的フラグメントに対応する抗体部分に通常存在するそれらのＣＤＲのみが、Ｖｉｔａｘｉｎ機能的フラグメントにおけるＬＭ６０９ ＣＤＲアミノ酸配列といわれることが意図される。同様に、コード核酸に対する参照における用語「Ｖｉｔａｘｉｎ」の使用は、重鎖および軽鎖のＣＤＲヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する非マウス抗体または機能的フラグメントをコードし、そしてＬＭ６０９において見出されるものと実質的に同じＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸をいうことが意図される。

本明細書中で使用される場合、用語「ＬＭ６０９移植抗体」は、ＬＭ６０９において見出されたものと実質的に同じ重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を有し、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）により規定されるように、ＣＤＲの外側のＬＭ６０９アミノ酸残基の置換がない非マウス抗体またはその機能的フラグメントをいうことが意図される。重鎖または軽鎖のポリペプチドを参照して使用される場合の用語「ＬＭ６０９移植抗体」または「ＬＭ６０９移植」は、それぞれ、ＬＭ６０９の重鎖または軽鎖に見出されるものと実質的に同じ軽鎖または重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を有し、そしてＫａｂａｔら（前出）により規定されるようにＣＤＲの外側のＬＭ６０９残基の置換が存在しない、非マウスの重鎖または軽鎖またはその機能的フラグメントをいうことが意図される。機能的フラグメントを参照して使用される場合、全てのＬＭ６０９ ＣＤＲが示される必要はない。むしろ、機能的フラグメントに対応する抗体部分に通常存在するそれらのＣＤＲのみが、ＬＭ６０９移植機能的フラグメントにおけるＬＭ６０９ ＣＤＲアミノ酸配列といわれることが意図される。同様に、コード核酸に対する参照において使用される用語「ＬＭ６０９移植抗体」または「ＬＭ６０９移植」は、Ｋａｂａｔら（前出）により規定されるように、ＣＤＲの外側のＬＭ６０９アミノ酸の置換が存在しない非マウス抗体もしくは機能的フラグメントをコードし、そして重鎖および軽鎖のＣＤＲヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有し、そしてＫａｂａｔら（前出）により規定されるように、ＬＭ６０９において見出されたものと実質的に同じＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸をいうことが意図される。

重鎖または軽鎖のポリペプチドまたはそれらの機能的フラグメントを参照して使用される場合の用語「移植抗体」または「移植」は、それぞれ、ドナー抗体の実質的に同じ重鎖または軽鎖のＣＤＲを有する重鎖もしくは軽鎖またはそれらの機能的フラグメントをいい、そしてＫａｂａｔら（前出）により規定されるように、ＣＤＲの外側のドナーアミノ酸残基の置換も存在しないことが意図される。機能的フラグメントを参照して使用される場合に、全てのドナーＣＤＲを示す必要はない。むしろ、機能的フラグメントに対応する抗体部分に通常存在するそれらのＣＤＲのみが、機能的フラグメントにおけるドナーＣＤＲアミノ酸配列といわれることが意図される。同様に、コード核酸に対する参照において使用される用語「移植抗体」または「移植」は、Ｋａｂａｔら（前出）により規定されるように、ＣＤＲの外側のドナーアミノ酸の置換が存在しない、抗体または機能的フラグメントをコードし、そして重鎖および軽鎖のＣＤＲヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有し、そしてＫａｂａｔら（前出）により規定されるように、ドナー抗体において見出されたものと実質的に同じＣＤＲアミノ酸配列をコードする核酸をいうことが意図される。

上記の用語の意味は、機能が損なわれないままである限り、抗体の微少な変化および改変を含むことが意図される。機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）など）は、同様に、用語ＬＭ６０９およびＶｉｔａｘｉｎの定義内に含まれる。このような機能的フラグメントは、当業者に周知である。従って、ＬＭ６０９またはＶｉｔａｘｉｎ抗体の機能的フラグメントを記載する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することが意図される。このような用語は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（編），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２２：１８９−２２４（１９９３）；Ｐｌｕｅｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：４９７−５１５（１９８９）およびＤａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）に記載される。

ＬＭ６０９、ＶｉｔａｘｉｎおよびＬＭ６０９移植抗体の機能的フラグメントを記載するために使用される上記の用語が用いられる場合と同様に、他のＬＭ６０９、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体のドメイン、機能的フラグメント、領域、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列ならびにポリペプチドもしくはペプチドを参照する用語の使用は、同様に、当該分野で公知かつ使用されるような各用語の意味の範囲内にあることが意図される。このような用語としては、例えば、「重鎖ポリペプチド」または「重鎖」、「軽鎖ポリペプチド」または「軽鎖」、「重鎖可変領域」（Ｖ_Ｈ）および「軽鎖可変領域」（Ｖ_Ｌ）ならびに用語「祖補性決定領域」（ＣＤＲ）が挙げられる。

当該分野で使用され、そして／または受け入れられている用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書中で使用される場合の用語の定義は、明らかに矛盾して述べられない限り、このような意味の全てを含むことが意図される。特定の例は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合領域を記載するための用語「ＣＤＲ」の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら，前出，およびＣｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）に記載されている。ここで、この定義は、互いに比較した場合に、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも拘わらず、ＬＭ６０９、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体またはそれらの改変体のＣＤＲをいうためにいずれかの定義を適用することは、本明細書中で定義されかつ使用される用語の範囲内にあると意図される。上記で引用された参考文献の各々により定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基は、比較として、以下の表１に記載される。

表１：ＣＤＲの定義

^１残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら（前出）の命名方法に従う。
^２残基の番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａら（前出）の命名方法に従う。
^３残基の番号付けは、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）の命名方法に従う。

本明細書において用いる場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列に対する参照において用いられた場合の用語「実質的に」または「実質的に同じ」とは、このヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、参照配列に比較した場合、かなりの程度、量または範囲の配列同一性を示すことを意味することが意図される。このようなかなりの程度、量または範囲の配列同一性は、さらに、重大でかつ意味があり、従って決定的に認識可能であるかまたは既知である特徴を示すと考えられる。従って、ＬＭ６０９の重鎖または軽鎖、Ｖｉｔａｘｉｎ、またはそのフラグメントを含むＬＭ６０９移植抗体（ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と実質的に同じヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列は、ＬＭ６０９、Ｖｉｔａｘｉｎ、またはＬＭ６０９移植抗体のアミノ酸配列をコードするか、またはそのアミノ酸配列であることが決定的に既知であるか認識可能である特徴を示す配列をいう。そのマイナー改変は、その改変がＬＭ６０９、Ｖｉｔａｘｉｎ、またはＬＭ６０９移植抗体の配列として認識可能である限り、含まれる。同様に、Ｖｉｔａｘｉｎの重鎖または軽鎖、ＬＭ６０９移植抗体、またはその機能的フラグメントと実質的に同じアミノ酸配列であるアミノ酸配列は、Ｖｉｔａｘｉｎ、またはＬＭ６０９移植抗体、およびそのマイナー改変のアミノ酸配列を示すことが決定的に既知であるかまたは認識可能である特徴を示す配列をいう。

ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体と実質的に同じであるか否かを決定する場合、その機能が維持されているか否かとともに、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体に対する変化の数を考慮する。例えば、３アミノ酸ＣＤＲにおける単一アミノ酸変化、または１６アミノ酸のＣＤＲにおけるいくつかの変化は、α_ｖβ_３結合機能が維持されている場合、実質的に同じであると考えられる。従って、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、その配列がＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体およびそのマイナーな改変のヌクレオチドまたはアミノ酸を示すことが決定的に既知であるかまたは認識され得る特徴を示す場合、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体の機能が維持されている限り、実質的に同じである。

本明細書において用いる場合、用語「フラグメント」とは、ＬＭ６０９、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸に対する参照において用いる場合、ＬＭ６０９、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸の一部と実質的に同じ配列を有する核酸を意味することが意図される。この核酸フラグメントは、ＬＭ６０９、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸または（ＬＭ６０９、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸に対して相補的である）ヌクレオチド配列に対して選択的にハイブリダイズするように、長さおよび配列が十分である。従って、フラグメントは、配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプライマー、ならびに核酸ブロッティングまたは溶液ハイブリダイゼーションのためのプローブを含むことが意図される。この用語の意味はまた、ＬＭ６０９ポリペプチドを直接コードしないヌクレオチド配列の領域（例えば、イントロン）、およびＬＭ６０９コード遺伝子の非翻訳領域の配列を含むことが意図される。

本明細書において用いる場合、用語「機能的なフラグメント」とは、Ｖｉｔａｘｉｎに対する参照、ＬＭ６０９移植抗体に対する参照、またはその重鎖もしくは軽鎖のポリペプチドに対する参照において用いられる場合、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体の一部をいうことを意図する。これには、α_ｖβ_３結合活性、α_ｖβ_３結合特異性および／またはインテグリンα_ｖβ_３阻害性活性をある程度または全て維持したままの重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドを含む。このような機能的フラグメントは、例えば、抗体の機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を含み得る。他の機能的フラグメントとしては、以下が挙げられ得る：例えば、重鎖または軽鎖のポリペプチド、可変領域ポリペプチドまたはＣＤＲポリペプチドまたはそれらの部分（このような機能的フラグメントが、結合活性、特異性、または阻害活性を保持する限り）。この用語はまた、例えば、天然に存在するアミノ酸の改変形態を含むポリペプチド、（例えば、Ｄ型、立体異性体、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログおよび模倣物）（このようなポリペプチドが上記に規定されたような機能的活性を保持する限り）を含むことが意図される。

本明細書において用いる場合、用語「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」とは、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、またはその機能的フラグメントに対する参照において用いられる場合、この抗体の機能的特性が、参照抗体に比較して変更または増強され、それによりこの抗体が所望の特性または活性を示すことを意味することを意図する。増強された活性を示す抗体は、参照抗体に比較して、例えば、より高い親和性もしくはより低い親和性の結合、または会合率もしくは分離率の増大もしくは低下を示し得る。増強された活性を示す抗体はまた、特定の生物体において、半減期の延長のような安定性の増大を示し得る。例えば、抗体活性が増強され、タンパク質分解に対する感受性を減少させることにより安定性を増大させ得る。より高い親和性結合または安定性の増大のような活性の増強が所望される場合、変異を、フレームワークまたはＣＤＲアミノ酸残基に導入し得る。そして、ＬＭ６０９移植親抗体のような参照抗体と比べた、α_ｖβ_３に対するより高い親和性結合、または増大した安定性について、この得られた抗体の改変体をスクリーニングし得る。活性の増強を示す抗体はまた、所望の場合、より低い親和性結合（これは、会合率の低下または分離率の増大を含む）を示し得る。より低い親和性結合を示す増強された抗体は、例えば、固形腫瘍を浸透するために、有用である。より高い親和性抗体（腫瘍の末梢領域に結合するが、高い親和性に起因して、腫瘍の内部領域には浸透し得ない）に比較して、より低い親和性抗体は、腫瘍の内部領域に浸透するのに有利である。

本発明は、Ｖｉｔａｘｉｎの重鎖ポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする核酸を提供する。Ｖｉｔａｘｉｎの軽鎖ポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする核酸もまた提供される。この核酸は、図１Ａおよび図１Ｂ（それぞれ、配列番号１および３）に示される配列またはそのフラグメントと実質的に同じ重鎖または軽鎖の可変領域ヌクレオチド配列から構成される。

Ｖｉｔａｘｉｎ（その機能的フラグメントを含む）は、ＬＭ６０９と実質的に同じ、結合活性、結合特異性、および阻害活性を示す非マウス抗体である。このＶｉｔａｘｉｎ Ｆｖフラグメントは、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域ポリペプチド内のＣＤＲをＬＭ６０９由来のＣＤＲで機能的に置換することにより、作製された。ＣＤＲの機能的置換は、当業者に公知の組換え方法により実施された。このような方法は、通常、ＣＤＲ移植（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ）と呼ばれ、そして米国特許第５，２２５，５３９号の主題である。このような方法はまた、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ」、Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｔｉｔｌｅｓ（１９９３）の記載に見出され得る。

簡略には、その重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのそれぞれと、実質的に同じヌクレオチドを有し、そして実質的に同じアミノ酸配列をコードするＬＭ６０９核酸フラグメントを合成し、そしてそれぞれのヒト鎖をコードする核酸のそれぞれ中に置換した。この新しく誘導されたＶｉｔａｘｉｎ抗体の機能性を維持するため、非ＣＤＲフレームワーク領域内で改変を実施した。ＣＤＲ移植した重鎖および軽鎖の可変領域の集団を発生させることによって、これらの個々の変化を作成し（この集団において、ＣＤＲの外側の全ての可能性のある変化が示された）、次いで、結合活性について集団をスクリーニングすることにより、適切な抗体を選択することによって作製した。このスクリーニングによって、本明細書に記載のＶｉｔａｘｉｎ抗体の選択を行った。

Ｖｉｔａｘｉｎの重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を、それぞれ、図１Ａおよび１Ｂに示す。これらの配列は、Ｖｉｔａｘｉｎの重鎖および軽鎖の可変領域ポリペプチドをコードする配列に実質的に対応する。これらのＶｉｔａｘｉｎ核酸は、Ｖｉｔａｘｉｎコード配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むことが意図される。一本鎖および二本鎖核酸も、例えば、この遺伝子のイントロン、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ならびに調節配列のような核酸の非コード部分と同様に、含まれる。

図１Ａに示すように、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖可変領域ポリペプチドは、約３５１ヌクレオチド長の核酸によりコードされる。この核酸は、可変領域のアミノ末端Ｇｌｎ１残基で開始し、Ｓｅｒ１１７までである。このＶｉｔａｘｉｎ重鎖可変領域をコードする核酸を、ヒトＩｇＧ１定常領域に移植し、１４３１ヌクレオチドのコード領域（これは、総アミノ酸４７７の重鎖ポリペプチドをコードする）を作製する。図１Ｂに示すのは、Ｖｉｔａｘｉｎ軽鎖可変領域ポリペプチドである。このポリペプチドは、可変領域のアミノ末端Ｇｌｎ１残基で開始し、Ｌｙｓ１０７までである、約３２１ヌクレオチド長の核酸によりコードされる。このＶｉｔａｘｉｎ軽鎖可変領域核酸は、ヒトκ構築領域に移植し、６４２ヌクレオチドのコード領域（総アミノ酸２１４の軽鎖ポリペプチドをコードする）を生じる。

これらのヌクレオチド配列のわずかな改変は、重鎖および軽鎖Ｖｉｔａｘｉｎコード核酸およびそれらの機能的フラグメントとして含まれることが意図される。このようなわずかな改変としては、例えば、遺伝コードの縮重に起因して、そのコードされるアミノ酸配列を変化させない改変、ならびにそのコードされるアミノ酸配列の保存的置換のみを生じる改変が挙げられる。コードされるアミノ酸の保存的置換としては、例えば、以下のグループ内に属するアミノ酸が挙げられる：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）；ならびに（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＨｉｓ）。他のわずかな改変は、その核酸またはコードされるポリペプチドが、本明細書中に記載されるようなそれらのいくつかまたは全ての機能を保持する限り、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする核酸に含まれる。

従って、本発明はまた、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖またはその機能的フラグメントをコードする核酸を提供し、ここで、この核酸は、図１Ａ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列と実質的に同じＶｉｔａｘｉｎの重鎖可変領域アミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする。同様に、本発明はまた、Ｖｉｔａｘｉｎ軽鎖またはその機能的フラグメントをコードする核酸を提供し、ここで、この核酸は、図１Ｂ（配列番号４）に示されるアミノ酸配列と実質的に同じＶｉｔａｘｉｎの軽鎖可変領域アミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする。

アミノ酸の保存的置換に加えて、アミノ酸の機能的置換を可能にする、Ｖｉｔａｘｉｎコードヌクレオチド配列のわずかな改変もまた、この用語の定義内に含まれることが意図される。このＶｉｔａｘｉｎヌクレオチド配列によってコードされる機能的に等価なアミノ酸の置換は、慣用的であり、当業者に公知の方法によって達成され得る。手短に言うと、機能的に等価なアミノ酸の置換は、変化されることが望まれるアミノ酸を同定し、その変化をそのコード核酸に組み込み、次いで、組換え発現されそして改変されたＶｉｔａｘｉｎポリペプチドの機能を決定することによって、作製され得る。複数の同時の変化を作製およびスクリーニングするための迅速な方法は、当該分野で周知であり、そして全ての可能なまたは全ての所望される変化を含むコード核酸のライブラリーを生成するために使用され得、次いで、機能を保持するＶｉｔａｘｉｎポリペプチドについて、そのライブラリーを発現およびスクリーニングし得る。このような方法としては、例えば、コドン塩基の変異誘発、ランダムオリゴヌクレオチド合成、および部分縮重オリゴヌクレオチド合成が挙げられる。

コドン塩基の変異誘発は、米国特許第５，２６４，５６３号および同第５，５２３，３８８号の主題であり、そして上記の手順に有利である。なぜなら、これは、オリゴヌクレオチド内の任意のおよび全ての特定のコドン位置で、本質的に任意のおよび全ての所望される頻度のコードされるアミノ酸残基の生成を可能にするからである。このような所望の頻度は、例えば、２０個の全てのアミノ酸またはその特定のサブセットの真にランダムな組み込み、ならびに他の組み込まれたアミノ酸残基と比較して、より高いまたはより低い頻度の偏りを有する残基を組み込むための、所定の偏りの１以上の特定のアミノ酸の組み込みを含む。ランダムオリゴヌクレオチド合成および部分縮重オリゴヌクレオチド合成は、機能的に等価なアミノ酸変化を生成およびスクリーニングするために同様に使用され得る。しかし、遺伝コードの縮重に起因して、このような方法は、所望のアミノ酸位置で重複性を組み込む。ランダムオリゴヌクレオチド合成は、コドン内の各ヌクレオチド位置での４つ全てのヌクレオチドのカップリングであり、一方、部分縮重オリゴヌクレオチド合成は、最初の２つのヌクレオチド位置での４つ全てのヌクレオチド配列の等しい部分と、例えば、第３の位置での２つのヌクレオチドの等しい部分とのカップリングである。両方のこれらの後者の合成方法は、例えば、Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２、（１９９０）およびＤｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６、（１９９０）に記載されて見い出され得る。

変化されるべきアミノ酸の同定は、抗体の構造および機能に関して利用可能な現在の情報、ならびにＣＤＲ移植手順の方法を含む利用可能な現在の情報を使用して、当業者によって達成され得る。例えば、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、前出、Ｃｈｏｔｈｉａら、前出および／またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、前出に特定される任意または全ての基準によってドナー抗体内で同定され得、そしてこれらのＣＤＲ配列の外側にある任意または全ての非同一アミノ酸残基が、機能的に等価なアミノ酸に変更され得る。当該分野で公知の上記の方法を使用して、任意または全ての非同一アミノ酸が、単独で、または異なる位置のアミノ酸と組み合わせて変化され、所望の位置の各々で所望の数のアミノ酸置換を組み込み得る。次いで、この所望の置換されたアミノ酸を含むＶｉｔａｘｉｎポリペプチドを産生し、そして非置換Ｖｉｔａｘｉｎポリペプチドと比較した、機能の保持または増強についてスクリーニングする。この置換されたＶｉｔａｘｉｎポリペプチドの産生は、例えば、当業者に公知の方法を使用する組換え発現によって達成され得る。非置換Ｖｉｔａｘｉｎと比較して機能の保持または増強を示すＶｉｔａｘｉｎポリペプチドは、１以上のアミノ酸の機能的置換を生じるコードヌクレオチド配列のわずかな改変を含むと考えられる。

アミノ酸の機能的置換は、ヒトフレームワーク配列を有する移植抗体を産生する場合に有利である。なぜなら、これは、どのアミノ酸残基がドナーから結合機能を首尾よく転移するために置換に考慮すべきかを評価および同定するために必要とされる、構造情報または煩わしい手順を必要とせずに、等価なアミノ酸残基の迅速な同定を可能にするからである。さらに、これは、置換のために同定されたアミノ酸を変更および試験するための、実際の段階的手順を排除する。本質的に、上記の機能的置換アプローチを使用して、ドナーとヒトフレームワークとの間の全ての非同一アミノ酸残基を同定し、そして非同一な位置の各々で、任意または全ての他の可能なアミノ酸残基で置換し、全ての可能なまたは全ての所望される順列および組み合わせを含む置換ポリペプチドの集団を生成し得る。次いで、この置換ポリペプチドの集団を、機能を保持する置換ポリペプチドについてスクリーニングし得る。上記のコドン塩基の変異誘発手順を使用して、置換アミノ酸残基のライブラリーの生成および機能的に置換された残基のスクリーニングが、移植治療抗体の迅速な産生および抗体親和性の迅速な変更に使用されている。このような手順は、例えば、それぞれ、Ｒｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）およびＧｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３（１９９２）に例示される。

フレームワーク残基に加えて、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸を機能的に置換して、増強された活性を有する改変されたＬＭ６０９移植抗体の同定を可能にし得る。フレームワーク残基についての上記の方法を使用して、アミノ酸置換を、ＬＭ６０９移植抗体における１以上のＣＤＲに、同様に導入し得る。この改変されたＬＭ６０９移植抗体を結合活性について試験して、α_Ｖβ_３結合活性が維持されているか否かを決定し得る。この改変されたＬＭ６０９移植抗体をさらに試験して、活性が増強されたか否かを決定し得る。従って、１以上のＣＤＲにおけるアミノ酸残基の機能的置換は、増強された活性のような所望の特性を有する、増強されたＬＭ６０９移植抗体の同定を可能にする。

改変されたＬＭ６０９移植抗体を生成し、そして増強された活性を有する抗体を選択するために、いくつかのアプローチが、ＣＤＲ内の変異させる残基数ならびにＬＭ６０９移植抗体内の改変するＣＤＲの数の選択において使用され得る。ＣＤＲの変異誘発についての選択基準の選択は、その増強される抗体の必要性および所望される適用に依存する。例えば、単一のＣＤＲ内の１つまたは少数のアミノ酸位置が、その位置で選択されたアミノ酸を含むように改変され得る。あるいは、標的化されたアミノ酸位置が、その位置で全ての可能なアミノ酸を含むように改変され得る。次いで、改変された抗体のこの得られた集団を、増強された活性についてスクリーニングし得る。

ＣＤＲ内の全てのアミノ酸位置が、全ての可能なアミノ酸を含むように変異されているか、または複数のＣＤＲ内のアミノ酸位置が、改変体アミノ酸残基を含むように改変されている、改変されたＬＭ６０９移植抗体集団の構築もまたなされ得る。このようにして、２〜１０^７を超える範囲の固有のメンバーの集団が、構築され得る。集団がより大きいほど、その集団内により多数の異なる抗体が存在するので、増強されたＬＭ６０９移植抗体の選択はより効率的である。しかし、改変されたＬＭ６０９移植抗体の小さい集団は、増強されたＬＭ６０９移植抗体の選択のために、作製され得そして首尾よく使用され得る。改変されたＬＭ６０９移植抗体の集団のサイズは、特定の適用の必要性に依存し、そして当業者によって決定され得る。

改変されたＬＭ６０９移植抗体の生成は、ＬＭ６０９移植抗体の１以上のＣＤＲへのアミノ酸置換の導入によって達成され得る。例えば、単一アミノ酸置換が、ＣＤＲ中の所定のアミノ酸を、任意または全てのアミノ酸に変化させることによって、そのＣＤＲに系統的に導入され得る。アミノ酸置換もまた、そのＣＤＲの１以上においてまたはそのＣＤＲの全てにおいて全てのアミノ酸位置に導入され得て、改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体の集団が作製される。単一アミノ酸置換を有する、改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体のこの集団はスクリーニングされて、α_Ｖβ_３結合活性を維持する改変体が同定され得る。α_Ｖβ_３結合活性を有する改変体はさらに特徴付けされて、増強された活性を有する改変体が同定され得る。単一アミノ酸置換を導入し、そしてα_Ｖβ_３に対する高い親和性結合を有する増強されたＬＭ６０９移植抗体についてスクリーニングされるＬＭ６０９移植抗体改変体の集団を作製する、このような系統的なアプローチは、実施例ＶＩに記載される。

改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体の集団を作製することに加えて、特定のＣＤＲまたはＣＤＲにおける特定のアミノ酸は、１以上のアミノ酸置換を導入するように選択され得る。例えば、配列相同性または構造モデルを用いて、アミノ酸置換を導入する特定のアミノ酸位置が同定され得る。この例では、１または数個の改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体しか作製せず、そしてα_Ｖβ_３に対する結合活性についてスクリーニングしていない。当業者は、増強された活性を有する増強されたＬＭ６０９移植抗体をスクリーニングおよび同定するために、改変ＬＭ６０９移植抗体改変体の大きな集団を作製することが所望されるのか、または制限された数の改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体を作製することが所望されるかがわかるかまたはこれを決定し得る。

ＣＤＲに単一アミノ酸置換を有する改変されたＬＭ６０９移植抗体の集団を作製し、そして増強された活性についてスクリーニングすることによって増強されたＬＭ６０９移植抗体を同定することに加えて、増強されたＬＭ６０９移植抗体改変体は、各々が独立して増強された活性をもたらすことが公知の２以上の変異を単一の抗体において組み合わせることによっても作製され得る。２より多くの変異が存在する場合、活性をさらに増強する変異の組み合わせの効率的な同定方法は、全ての可能な組み合わせおよび交換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を構築し、次いでこれらについて増強された活性を選択することである。例えば、１以上のＣＤＲにおける２つの単一の変異は組み合わされて、２つのＣＤＲ変異を有する新たな改変されたＬＭ６０９移植抗体を作製し得、そしてα_Ｖβ_３結合活性が単一変異体のα_Ｖβ_３結合活性を超えて上昇したか否かをスクリーニングして決定し得る。同様に、３つの変異は組合され得、そして得られる改変ＬＭ６０９移植抗体は、増強された結合活性についてスクリーニングされ得る。ＣＤＲ変異を組み合わせるこのようなアプローチを用いて、改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体の新たな集団は、増強された活性をもたらす単一ＣＤＲ変異の全ての組み合わせを新たな改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体に組み込み、そしてスクリーニングして最適に増強されたＬＭ６０９移植抗体を得ることによって作製され得る。

増強されたＬＭ６０９移植抗体を同定する反復的段階的なアプローチは、多数の改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体を作製しそしてスクリーニングする必要性を伴わずに最適な結合活性を有する抗体の同定を可能にする点で有利である。例えば、単一変異体が同定され、そして新たな集団のＬＭ６０９移植抗体改変体へと組み合わされた、実施例ＶＩおよびＶＩＩに記載されるアプローチを用いて、より高い親和性を有する増強されたＬＭ６０９移植抗体が、２５９２個の独特の改変体を作製することによって同定された。対照的に、単一の８アミノ酸残基ＣＤＲの完全なランダム化は、１０^１０個を超える独特の改変体を必要とする。それゆえ、このような反復的アプローチは、比較的少数の独特の改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体を作製し、スクリーニングし、そして高親和性結合を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体改変体を同定することによって、高親和性結合のような増強された活性を有する増強されたＬＭ６０９移植抗体の同定を可能にする。

増強されたＬＭ６０９改変体を同定する反復的段階的なアプローチはまた、さらなる工程を用いて行われ得る。単一アミノ酸変異の全ての組み合わせを作製する代わりに、単一アミノ酸変異が、二重変異体の全ての組み合わせを作製するように対にして組み合わされ、そして活性についてスクリーニングされ得る。増強された活性を有する二重変異体は、任意のまたは全ての単一変異体と組み合わされて、増強された結合活性についてスクリーニングされる三重変異体が作製され得る。改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体を作製する反復的回の各々は、さらなる単一変異を組み込み得、そして得られる改変されたＬＭ６０９移植抗体は、増強された活性についてスクリーニングされ得る。従って、ＬＭ６０９移植抗体改変体の段階的作製を用いて、最適化されたＬＭ６０９移植抗体を同定し得る。さらに、このような反復的アプローチはまた、ある範囲の異なる、増強された結合活性を示す、多数の増強された抗体の同定を可能にする。

最適化されたＬＭ６０９移植抗体は、ＬＭ６０９様移植抗体またはα_Ｖβ_３特異的移植抗体とも呼ばれ得、そして認識され得る。なぜなら、この抗体またはその機能的フラグメントは、ＬＭ６０９の機能的特徴を保持するからである。例えば、増強されたＬＭ６０９移植抗体改変体（これは、単一アミノ酸置換を有し、そして増強された活性を有する）が同定され得、そして特定のアミノ酸置換と相関付けされ得る。これらのアミノ酸置換を組み合わせて、活性について試験される、新たな改変されたＬＭ６０９移植抗体を作製し得る。有利なＣＤＲアミノ酸置換のこのような組み合わせは、複数のＣＤＲが少なくとも１つのアミノ酸置換を有するかまたは単一のＣＤＲが複数のアミノ酸置換を有する、最適化されたＬＭ６０９移植抗体をもたらし得、ここで、改変されたＬＭ６０９移植抗体は増強された活性を有する。

増強されたＬＭ６０９移植抗体（特に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の機能的置換によって最適化されたＬＭ６０９移植抗体）は、上昇した親和性のような、所望の増強された特性を有する。例えば、上昇した親和性を有する、最適化されたＬＭ６０９移植抗体は、アミノ酸の機能的置換を導入するために用いられた親の抗体よりも高い親和性を有する。より高い親和性は、類似の構造を有する参照抗体に対して決定される。例えば、最適化ＬＭ６０９移植抗体が、２つの重鎖および２つの軽鎖を含むインタクトな抗体である場合、より高い親和性が、インタクトな親のＬＭ６０９移植抗体に対して決定される。同様に、最適化されたＬＭ６０９移植抗体がＦａｂである場合、より高い親和性が、親のＬＭ６０９移植抗体のＦａｂに対して決定される。

複数の最適化工程を通して高親和性ＬＭ６０９移植抗体を得ることを進める必要はないとはいえ、一般に、親和性における上昇は、ＣＤＲ内およびＣＤＲ間の改変の数と、ならびに最適化工程の数と相関し得る。それゆえ、ＬＭ６０９移植抗体は、種々の範囲を示す。例えば、増強された親和性を有するＬＭ６０９移植抗体は、参照抗体よりも約２倍まで高い親和性、またはより高い親和性（一般に、約２〜５倍を超えて高い親和性（例えば、約４〜５倍を超えて高い親和性かまたは５〜１０倍を超えて高い親和性））を有する。特に、増強された親和性を有するＬＭ６０９移植抗体は、参照抗体よりも約１０〜５０倍を超えて高い親和性、約５０倍を超えて高い親和性または約１００倍を超えて高い親和性を有する。

上記のように、ＣＤＲアミノ酸残基の機能的置換を用いて、親のＬＭ６０９移植抗体よりも高い親和性を示すＬＭ６０９移植抗体を同定し得る。上記または下記で考察した、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体をコードするヌクレオチド配列に対して、重要でない改変を導入するための方法が同様に使用されて、改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体のライブラリーを作製し得る。このような方法としては、コドン塩基の変異誘発、ランダムオリゴヌクレオチド合成および部分的縮重オリゴヌクレオチド合成のような方法が挙げられる。例えば、コドン塩基の変異誘発を用いて、単一アミノ酸置換を有する改変されたＬＭ０９移植抗体改変体ライブラリーなどを作製している（実施例ＶＩを参照のこと）。

改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体のライブラリーを作製した後に、この改変体は、発現され得、そしてα_Ｖβ_３に対する結合活性についてスクリーニングされ得る。抗体−抗原相互作用を決定することに関する、当業者に周知の方法が、α_Ｖβ_３に対する結合活性を示す、改変されたＬＭ６０９移植抗体についてスクリーニングするために使用される（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出）。例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いて、改変されたＬＭ６０９移植抗体改変体のライブラリーがスクリーングされて、α_Ｖβ_３結合活性を維持する改変体が同定されている（実施例ＶＩを参照のこと）。α_Ｖβ_３結合活性を保持する、改変されたＬＭ６０９移植抗体のみが、さらなる特徴付けのために考慮される。

α_Ｖβ_３結合活性を有する、改変されたＬＭ６０９移植抗体は、さらに特徴付けされて、どの改変ＬＭ６０９移植抗体が増強された活性を有するかが決定され得る。増強された活性を評価するために用いられるアッセイの型は、所望される特定の特徴に依存する。例えば、改変された結合活性が所望される場合、結合親和性の決定を可能にする結合アッセイが用いられる。このようなアッセイとしては、実施例ＶＩに記載されるように、結合アッセイ、競合結合アッセイおよび表面プラスモン共鳴が挙げられる。

ＬＭ６０９移植抗体のＣＤＲへの単一アミノ酸置換の導入を用いて、改変されたＬＭ６０９移植抗体のライブラリーが作製され得、そしてα_Ｖβ_３に対する結合活性についてスクリーニングされ得る。次いで、α_Ｖβ_３に対する結合活性を示す、改変されたＬＭ６０９移植抗体は、さらに特徴付けられて、増強された活性（例えば、より高い結合親和性）を示す、増強されたＬＭ６０９移植抗体が同定され得る。例えば、このようなアプローチを用いて、単一アミノ酸置換を有する多数の増強されたＬＭ６０９移植抗体が、図１ａ（配列番号２）に示される重鎖可変領域および図７（配列番号３２）に示される軽鎖可変領域を用いて作製され、そして親のＬＭ６０９移植抗体に対して２〜１３倍改善された親和性を示すＬＭ６０９移植抗体が同定された（実施例ＶＩを参照のこと）。

１つのアミノ酸置換を有する増大したＬＭ６０９移植抗体の同定後、アミノ酸変異を、さらに活性を増強するために組み合わせ得る。ＣＤＲへ１つのアミノ酸置換を導入するための上記で議論した方法を同様に適用して、アミノ酸置換を組み合わせ得る。例えば、α_ｖβ_３結合親和性の増加をもたらすアミノ酸変異の組み合わせライブラリーを、変性オリゴヌクレオチドおよび実施例ＶＩＩに記載されるような２部位ハイブリダイゼーション変異誘発を使用して作製した。複数のＣＤＲアミノ酸置換を含む増大したＬＭ６０９移植抗体を、図１ａに示される重鎖可変領域（配列番号２）および図７に示される軽鎖可変領域（配列番号３２）を使用して作製し、そして親ＬＭ６０９移植抗体よりも２０倍から９０倍を超えて高い親和性を有するＬＭ６０９移植抗体を同定した。

ＣＤＲアミノ酸置換を組み合わせて、増大したかまたは最適化されたＬＭ６０９移植抗体を作製することに加えて、ＣＤＲアミノ酸置換をまた、ＬＭ６０９移植抗体に所望の性質を与えるフレームワーク変異と組み合わせ得る。従って、ＣＤＲまたは活性を増大するフレームワーク領域における変異を組み合わせて、ＬＭ６０９移植抗体をさらに最適化し得る。

本発明はさらに、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖および軽鎖をコードする核酸のフラグメントを提供し、ここで、このようなフラグメントは、実質的に、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖または軽鎖のポリペプチドの可変領域と同じヌクレオチドまたはアミノ酸配列からなる。Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖ポリペプチドの可変領域は、本質的に、図１Ａのヌクレオチド１〜３５１およびアミノ酸残基Ｇｌｎ１〜Ｓｅｒ１１７（それぞれ、配列番号１および２）からなる。Ｖｉｔａｘｉｎ軽鎖ポリペプチドの可変領域は、本質的に、図１Ｂのヌクレオチド１〜３２１およびアミノ酸残基Ｇｌｕ１〜Ｌｙｓ１０７（それぞれ、配列番号３および４）からなる。このような可変領域をコードする核酸の末端は、意図された目的および機能が同じままである限りは重大ではない。

可変領域の核酸フラグメントに対して付加的なフラグメントが、同様に提供される。このようなフラグメントは、例えば、実質的に、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖または軽鎖ポリペプチドのＣＤＲと同じヌクレオチド配列からなる核酸を含む。Ｖｉｔａｘｉｎ ＣＤＲに対応する配列は、例えば、Ｋａｂａｔら、前出、および／またはＣｈｏｔｈｉａら、前出、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍら、前出によって規定されるような領域を含む。上記の定義の各々についてのＶｉｔａｘｉｎ ＣＤＲフラグメントは、以下の表２に示されるヌクレオチドに対応する。このヌクレオチド配列の番号付けは、図１Ａおよび１Ｂに示される一次配列（配列番号１および３）に由来し、そして表１に以前に示された定義に従う。

（表２：Ｖｉｔａｘｉｎ ＣＤＲヌクレオチド残基）

同様に、上記の定義の各々についてのＶｉｔａｘｉｎ ＣＤＲフラグメントは、以下の表３に示されるアミノ酸残基に対応する。このアミノ酸残基の番号は、図１Ａおよび１Ｂに示される一次配列（配列番号２および４）に由来し、そして表１に以前に示された定義に従う。

（表３：Ｖｉｔａｘｉｎ ＣＤＲアミノ酸残基）

従って、本発明はまた、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖または軽鎖ポリペプチドのＣＤＲと実質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントを提供する。

Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする核酸ならびにそのフラグメントは、種々の診断および治療目的に有用である。例えば、Ｖｉｔａｘｉｎ核酸を使用して、インテグリンα_ｖβ_３に対する結合特異性および阻害活性を有するＶｉｔａｘｉｎ抗体およびその機能的フラグメントを産生し得る。この抗体およびその機能的フラグメントは、α_ｖβ_３媒介性疾患の診断または治療的処置のために使用され得る。Ｖｉｔａｘｉｎおよびその機能的フラグメントを使用して、例えば、α_ｖβ_３媒介性疾患の進行に必要なα_ｖβ_３の結合活性または他の機能的活性を阻害し得る。α_ｖβ_３媒介性疾患の進行に必要な他の機能的活性としては、例えば、α_ｖβ_３の活性化、α_ｖβ_３媒介性シグナル伝達およびアポトーシスのα_ｖβ_３媒介性妨害が挙げられる。しかし都合良く、Ｖｉｔａｘｉｎは、非マウスのフレームワークアミノ酸配列を含み、そしてそれ自体は、宿主の免疫応答の産生に関して、抗原性がより低い。本発明のＶｉｔａｘｉｎ核酸をまた使用して、コードされた重鎖および軽鎖ポリペプチドの機能的等価物をモデリングし得る。

従って、本発明は、Ｖｉｔａｘｉｎ重鎖およびＶｉｔａｘｉｎ軽鎖のポリペプチドまたはその機能的フラグメントを提供する。このＶｉｔａｘｉｎ重鎖ポリペプチドは、図１Ａに示されるアミノ酸配列（配列番号２）またはその機能的フラグメントと実質的に同じアミノ酸配列を示し、一方、Ｖｉｔａｘｉｎ軽鎖ポリペプチドは、図１Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号４）またはその機能的フラグメントと実質的に同じアミノ酸配列を示す。また、Ｖｉｔａｘｉｎ抗体またはその機能的フラグメントが提供される。この抗体は、上記の重鎖および軽鎖ポリペプチド、またはその機能的フラグメントから作製され、そしてα_ｖβ_３に対する選択的な結合親和性を示す。

本発明は、ＬＭ６０９移植抗体についての重鎖ポリペプチドをコードする核酸を提供する。また、ＬＭ６０９移植抗体についての軽鎖ポリペプチドをコードする核酸が提供される。この核酸は、図１Ａに示されるヌクレオチド配列（配列番号１）と実質的に同じ重鎖可変領域のヌクレオチド配列、および図７に示されるヌクレオチド配列（配列番号３１）と実質的に同じ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントからなる。

ＬＭ６０９移植抗体（その機能的フラグメントを含む）は、非マウス抗体であり、この非マウス抗体は、ＬＭ６０９と実質的に同じ結合活性、結合特異性および阻害活性を示す。本明細書中で記載されるＬＭ６０９移植抗体のＦｖフラグメントは、ヒト重鎖および軽鎖可変領域のポリペプチド内のＫａｂａｔらによって規定されるＣＤＲ（今後、「Ｋａｂａｔ ＣＤＲ」という）を、ＬＭ６０９に由来するＫａｂａｔ ＣＤＲで機能的に置換することによって産生される。Ｋａｂａｔ ＣＤＲの機能的置換は、以前に記載されたＣＤＲ移植によって行われ、そしてこれは、米国特許第５，２２５，５３９号、前出の主題である。Ｋａｂａｔ ＣＤＲの外のアミノ酸残基の置換をさらに行い、このようなアミノ酸置換がその特定の位置でドナーアミノ酸に対応しない限り、有利な結合性質を維持するか、または増大し得る。このような置換は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの外の抗体にいかなるマウス配列の特徴をも付与することなく、結合性質の調節を可能にする。このような抗体の産生は、ＬＭ６０９移植抗体を参照して本明細書中に記載されるが、このようなＫａｂａｔ ＣＤＲの外の非ドナーアミノ酸の置換は、本質的に任意の移植抗体の産生に利用され得る。ＬＭ６０９移植抗体の産生は、以下の実施例Ｖにさらに記載される。

ＬＭ６０９移植抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、それぞれ、図１Ａおよび７に示される。これらの配列は、実質的に、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖および軽鎖可変領域のポリペプチドをコードする配列に対応する。これらの核酸は、ＬＭ６０９移植抗体をコードする配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むことが意図される。一本鎖および二本鎖の核酸、ならびに例えばイントロン、５’および３’非翻訳領域、ならびに遺伝子の調節配列のような核酸の非コード部分が同様に含まれる。

ＬＭ６０９移植抗体についてのヌクレオチドおよびアミノ酸残基の境界は、以前に記載されたＶｉｔａｘｉｎについての境界と等しい。例えば、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖可変領域のポリペプチドは、約３５１ヌクレオチド長の核酸によってコードされ、この核酸は、可変領域のアミノ末端Ｇｌｎ１残基で開始し、Ｓｅｒ１１７にわたる（図１Ａ、それぞれ、配列番号１および２）。ＬＭ６０９移植抗体の軽鎖可変領域のポリペプチドは、約３２１ヌクレオチド長の核酸によってコードされ、この核酸は、可変領域のアミノ末端Ｇｌｕ１残基で開始し、Ｌｙｓ１０７にわたる（図７、それぞれ、配列番号３１および３２）。Ｖｉｔａｘｉｎのように、これらのヌクレオチド配列のわずかな改変は、重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸ならびにその機能的フラグメントとして含まれるように意図される。

従って、本発明はまた、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖をコードする核酸を提供し、ここで、この核酸は、図１Ａに示されるアミノ酸配列（配列番号２）と実質的に同じ重鎖可変領域のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする。同様に、本発明はまた、ＬＭ６０９移植抗体の軽鎖をコードする核酸を提供し、ここで、この核酸は、図７に示されるアミノ酸配列（配列番号３２）と実質的に同じ軽鎖の可変領域のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする。

アミノ酸の保存的置換に加えて、アミノ酸の機能的置換を可能にするヌクレオチド配列をコードするＬＭ６０９移植抗体の少しの改変もまた、この用語の定義に含まれることが意図される。変化されるアミノ酸の同定は、当業者によって、抗体の構造および機能に関して現在利用可能な情報、ならびにＣＤＲ移植手順についての方法を含む利用可能な現在の情報を使用して、達成され得る。ＬＭ６０９移植抗体ヌクレオチド配列によりコードされる、機能的に等価なアミノ酸の置換は、慣用的であり、そして当業者に公知の方法によって達成され得る。以前に記載されたように、このような方法としては、例えば、コドンに基づく変異誘発、ランダムオリゴヌクレオチド合成および部分的な変性オリゴヌクレオチド合成が挙げられ、そして移植抗体を生成する場合に有用である。なぜなら、これらは、構造的情報の必要なしに、等価なアミノ酸残基の迅速な同定を可能にするからである。

本発明は、ＬＭ６０９移植抗体の、核酸をコードする重鎖および軽鎖のフラグメントをさらに提供し、ここで、このようなフラグメントは、実質的に、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドの可変領域と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列からなる。Ｖｉｔａｘｉｎの場合と同様に、このような可変領域をコードする核酸の末端は、意図される目的および機能が同じままである限り、重要ではない。

可変領域核酸フラグメントに追加のフラグメントが同様に提供され、そして例えば、ＣＤＲまたはＬＭ６０９移植抗体の重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドと同じヌクレオチド配列から実質的になる核酸が挙げられる。Ｖｉｔａｘｉｎの場合と同様に、ＬＭ６０９移植抗体ＣＤＲに対応する配列としては、例えば、Ｋａｂａｔら、前出、Ｃｈｏｔｈｉａら、前出により定義される領域、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍら、前出により定義される領域が挙げられる。ＬＭ６０９移植抗体ＣＤＲ領域は、Ｖｉｔａｘｉｎに関して以前に記載された領域と類似する。さらに、このような領域は周知であり、そして当業者によって、ＬＭ６０９配列および本明細書中に提供される教示を考慮して、決定され得る。従って、本発明はまた、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのＣＤＲと実質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントを提供する。

Ｖｉｔａｘｉｎの場合と同様に、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド、ならびにこれらのフラグメントをコードする核酸は、種々の診断目的および治療目的のために、有用である。例えば、核酸をコードする、ＬＭ６０９移植抗体を使用して、インテグリンα_ｖβ_３に対する結合特異性および阻害活性を有する、組換え抗体およびその機能的フラグメントを生成し得る。この抗体およびその機能的フラグメントは、α_ｖβ_３により媒介される疾患の診断または治療的処置のために使用され得る。このような疾患および抗α_ｖβ_３抗体の使用の方法は、Ｖｉｔａｘｉｎに関する参考文献に以前に記載されており、そして本明細書中に記載のＬＭ６０９移植抗体と等しく適用可能である。

従って、本発明は、ＬＭ６０９移植抗体の重鎖ポリペプチドおよびＶｉｔａｘｉｎ軽鎖ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを提供する。ＬＭ６０９移植抗体の重鎖ポリペプチドは、図１Ａに示すアミノ酸配列（配列番号２）またはその機能的フラグメントと実質的に同じアミノ酸配列を示し、一方で、ＬＭ６０９移植抗体の軽鎖ポリペプチドは、図７に示すアミノ酸配列（配列番号３２）と実質的に同じアミノ酸配列を示す。また、ＬＭ６０９移植抗体またはその機能的フラグメントが提供される。この抗体は、上記重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド、またはその機能的フラグメントから生成され、そしてα_ｖβ_３に対する選択的な結合親和性を示す。

本発明は、α_ｖβ_３に対する選択的な結合親和性を示す、増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する。この増強されたＬＭ６０９移植抗体は、ＬＭ６０９を移植された重鎖可変領域ポリペプチドまたはＬＭ６０９を移植された軽鎖可変領域ポリペプチドの１つ以上のＣＤＲにおける、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、この増強されたＬＭ６０９移植抗体の、α_ｖβ_３結合親和性は、維持されるかまたは増強される。

増強されたＬＭ６０９移植抗体を同定するために、改変されたＬＭ６０９移植抗体のライブラリーを、上記および実施例ＶＩに記載されるように生成した。最初に、ＬＭ６０９ ＣＤＲを同定し、そして選択して、単一のアミノ酸置換を導入した。Ｋａｂａｔら、前出の番号付けシステムを利用して、変異誘発のために選択したＣＤＲ残基は、以下であった：

変異誘発のために選択されたＣＤＲ残基をコードするヌクレオチド配列は、以下であった：

単一のアミノ酸置換を、ＬＭ６０９を移植した抗体のＣＤＲに導入して、改変されたＬＭ６０９移植抗体の集団を生成し得る。例えば、１つ以上のＣＤＲにおける全てのアミノ酸を、いずれかまたは全てのアミノ酸に変異させて、改変されたＬＭ６０９移植抗体の集団を生成し得、そしてこの集団を、α_ｖβ_３結合活性についてスクリーニングし得る。この集団は、ＣＤＲのアミノ酸を変異させることによって生成されるが、集団はまた、フレームワーク領域の残基またはＣＤＲとフレームワークとの両方において変化がなされる場合に、構築され得る。可変領域におけるこのような変異は、別個に、組み合わせて、または段階的に、なされ得る。従って、本発明はまた、アミノ酸置換がＣＤＲまたはフレームワーク領域においてである、増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する。

本発明は、さらに、増強された結合親和性を示す、増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する。増強された結合親和性を示す、増強されたＬＭ６０９移植抗体としては、単一のアミノ酸置換を有する以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む抗体が挙げられる：

単一のアミノ酸置換を有するＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、以下であった：

単一のアミノ酸置換を有するＣＤＲ、および親のＬＭ６０９移植抗体より高い親和性結合を有する、増強されたＬＭ６０９移植抗体もまた同定され得、ここで、対応するアミノ酸変異が組み合わせられて、新たな改変されたＬＭ６０９移植抗体を生じる。同定は、α_ｖβ_３結合活性についてスクリーニングすることにより、実施される。いくつかの組合せにおいて、ＬＭ６０９移植抗体は、２つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。本発明は、複数のアミノ酸置換を含む、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する：

からなる群から選択される、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３。

複数のアミノ酸置換を有するＣＤＲＳをコードするヌクレオチド配列は、以下であった：

本発明はまた、α_Ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す、増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供し、ここで、この増強されたＬＭ６０９移植抗体は、ＬＭ６０９移植重鎖可変領域ポリペプチドまたはＬＭ６０９移植軽鎖可変領域ポリペプチドの２つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。

ＬＭ６０９移植重鎖可変領域ポリペプチドまたはＬＭ６０９移植軽鎖可変領域ポリペプチドの２つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも一つのアミノ酸置換を含む増強されたＬＭ６０９移植抗体は、以下からなる群から選択されるＣＤＲの組み合わせを含むＬＭ６０９移植抗体を含み得る：Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５２；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５１；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５２；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号５９、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；ならびにＶ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０。

単一のアミノ酸置換を有する２つ以上のＣＤＲを含む増強されたＬＭ６０９移植抗体に加えて、本発明はまた、ＣＤＲの少なくとも一つが２つ以上のアミノ酸置換を有する増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する。

２つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも一つのＣＤＲを含む増強されたＬＭ６０９移植抗体は、以下からなる群から選択されるＣＤＲの組み合わせを含むＬＭ６０９移植抗体を含み得る：Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６３；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６３；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６４；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６３；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６５；ならびにＶ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６６。

本発明はさらに、α_Ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す、高親和性ＬＭ６０９移植抗体を提供する。高親和性ＬＭ６０９移植抗体は、ＬＭ６０９移植重鎖可変領域ポリペプチドまたはＬＭ６０９移植軽鎖可変領域ポリペプチドの１つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、ここで、高親和性ＬＭ６０９移植抗体のα_Ｖβ_３結合親和性が増強される。

高親和性抗体は、以下からなる群から選択されるＣＤＲの組み合わせを含む高親和性抗体を含み得る：Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５２；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５１；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５２；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号５９、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６３；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号５０；Ｖ_ＬＣＤＲ１配列番号５７、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号：４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６３；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６４；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６３；Ｖ_ＬＣＤＲ３配列番号６１およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６５；ならびにＶ_ＬＣＤＲ３配列番号６１、Ｖ_ＨＣＤＲ２配列番号４４およびＶ_ＨＣＤＲ３配列番号６６。

上記のように、増強されたＬＭ６０９抗体は、さらに、一つ以上のＣＤＲまたはフレームワーク残基にさらなる変異を導入することによって改変され得る。本明細書中で記載のように、増強されたＬＭ６０９移植抗体クローン６Ｈ６（表１０）は、さらに、一つ以上のＣＤＲに変異を導入することによって改変された（実施例ＶＩＩＩを参照のこと）。これらの６Ｈ６改変体は、α_Ｖβ_３に対して高い親和性結合を有することが見出され、タンパク質分解に対して耐性があった。

本発明はさらに、以下

を含む増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する。本発明はまた、配列番号１０３、配列番号１０５、および配列番号１０９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

本発明はまた、以下を含む増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する：

本発明はまた、以下を含む核酸分子を提供する：Ｖ_ＨＣＤＲ１をコードする配列番号３３として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ２をコードする配列番号１０１として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ３をコードする配列番号１０５として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ１をコードする配列番号１０７として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ２をコードする配列番号１１１として参照されるヌクレオチド配列；およびＶ_ＬＣＤＲ３をコードする配列番号８９として参照されるヌクレオチド配列。

本発明はさらに、以下を含む増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する：

本発明はさらに、以下を含む核酸分子を提供する：Ｖ_ＨＣＤＲ１をコードする配列番号３３として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ２をコードする配列番号１０１として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ３をコードする配列番号１０５として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ１をコードする配列番号１０９として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ２をコードする配列番号１１１として参照されるヌクレオチド配列；およびＶ_ＬＣＤＲ３をコードする配列番号８９として参照されるヌクレオチド配列。

本発明はさらに、以下を含む増強されたＬＭ６０９移植抗体を提供する：

本発明はさらに、以下を含む核酸分子を提供する：Ｖ_ＨＣＤＲ１をコードする配列番号３３として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ２をコードする配列番号１０３として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ３をコードする配列番号１０５として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ１をコードする配列番号１０９として参照されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ２をコードする配列番号１１１として参照されるヌクレオチド配列；およびＶ_ＬＣＤＲ３をコードする配列番号８９として参照されるヌクレオチド配列。

本発明はさらに、α_Ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す、増強されたＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸を提供する。この核酸によってコードされる増強されたＬＭ６０９移植抗体は、ＬＭ６０９移植重鎖可変領域ポリペプチドまたはＬＭ６０９移植軽鎖可変領域ポリペプチドの１つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、ここで、この増強されたＬＭ６０９移植抗体のα_Ｖβ_３結合親和性が維持されるかまたは増強される。

本発明はさらに、α_Ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す、高親和性ＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸を提供する。この核酸によってコードされる高親和性ＬＭ６０９移植抗体は、ＬＭ６０９移植重鎖可変領域ポリペプチドまたはＬＭ６０９移植軽鎖可変領域ポリペプチドの１つ以上のＣＤＲにおいて少なくとも一つのアミノ酸置換を含み、ここで、この高親和性ＬＭ６０９移植抗体のα_Ｖβ_３結合親和性が増強される。

本発明は、モノクローナル抗体ＬＭ６０９の重鎖ポリペプチドをコードする核酸またはその画分フラグメントを提供する。また、モノクローナル抗体ＬＭ６０９の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸またはその画分フラグメントが提供される。この核酸は、図２Ａおよび２Ｂ（配列番号５および７、それぞれ）に示される配列またはそのフラグメントと実質的に同じ重鎖可変領域ヌクレオチド配列または軽鎖可変領域ヌクレオチド配列からなる。

上記のように、モノクローナル抗体ＬＭ６０９は、インテグリンα_Ｖβ_３に対する結合活性を有することが当該分野で示されている。特異性は原則的に、基本的に任意の標的に対して生成され得るが、ＬＭ６０９は、インテグリンファミリーのうち単一のメンバーに対して実質的な特異性および阻害性活性を示すインテグリン阻害性抗体である。この場合、ＬＭ６０９は、β_３ファミリーのα_Ｖβ_３インテグリンに対して実質的な特異性および阻害性活性を示す。モノクローナル抗体ＬＭ６０９のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、以前に一度も単離および特徴付けされていない。

ＬＭ６０９をコードする核酸の単離および特徴付けを、当業者に公知の技術によって実施し、この技術については、実施例において以下にさらに記載する。簡単には、ハイブリドーマＬＭ６０９由来のｃＤＮＡを、ＬＭ６０９をコードする核酸を単離するための供給源として産生し、そして使用した。単離を、第１に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々のＮ末端アミノ酸配列を決定する工程、次いで、このｃＤＮＡ由来の抗体をコードする配列をＰＣＲによって増幅する工程によって実施した。５’プライマーを、新規に決定されたＮ末端アミノ酸配列に対応するように逆転写させ、一方で、３’プライマーは、抗体定常領域配列と実質的に類似する配列に対応した。この産物の増幅およびクローニングの結果として、ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖をコードする核酸の単離物を得た。

ＬＭ６０９の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列のヌクレオチド配列を、図２Ａおよび２Ｂにそれぞれ示す。これらの配列は、ＬＭ６０９の可変領域の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドをコードする配列と実質的に対応している。Ｖｉｔａｘｉｎ核酸に関して、これらのＬＭ６０９核酸は、ＬＭ６０９をコードする配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むことが意図される。単鎖核酸および二本鎖核酸もまた、同様に、例えば、イントロン、５’−非翻訳領域、３’非翻訳領域および遺伝子の調節配列のような核酸の非コード部分を含む。

図２Ａに示されるように、ＬＭ６０９重鎖可変領域ポリペプチドは、約３５１のヌクレオチド長の核酸によってコードされ、この核酸は、可変領域のアミノ末端Ｇｌｕ１残基で開始し、Ａｌａ１１７までで終わる。マウスのＬＭ６０９抗体重鎖は、ＩｇＧ２ａ定常領域を有する。図２Ｂにおいて、約３２１のヌクレオチド長の核酸によってコードされるＬＭ６０９軽鎖可変領域ポリペプチドを示し、この核酸は、可変領域のアミノ末端Ａｓｐ１残基で開始し、Ｌｙｓ１０７までで終わる。この機能的抗体において、ＬＭ６０９は、κ軽鎖定常領域を有する。

Ｖｉｔａｘｉｎ核酸に関して、これらのＬＭ６０９ヌクレオチド配列の小さい改変が、重鎖および軽鎖ＬＭ６０９をコードする核酸として含まれることが意図される。核酸またはコードされたポリペプチドが、記載されるこれらの機能のいくらかまたは全てを保持する限り、このような小さい改変は、ＬＭ６０９の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドをコードする核酸内に含まれる。

従って、本発明はまた、ＬＭ６０９重鎖または機能的フラグメントをコードする核酸を提供し、ここで、この核酸は、図２Ａに示されるのとモノクローナル抗体ＬＭ６０９の実質的に同一の可変領域アミノ酸配列（配列番号６）またはそのフラグメントをコードする。同様に、本発明はまた、ＬＭ６０９軽鎖または機能的フラグメントをコードする核酸を提供し、ここで、この核酸は、図２Ｂに示されるようなモノクローナル抗体ＬＭ６０９の実質的に同一の可変領域アミノ酸配列（配列番号８）またはそのフラグメントをコードする。

本発明は、ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖をコードする核酸のフラグメントをさらに提供し、ここで、このようなフラグメントは、実質的に、ＬＭ６０９の重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドの可変領域と同一のヌクレオチドまたはアミノ酸配列からなる。このＬＭ６０９の重鎖ポリペプチドの可変領域は、本質的に、図２Ａのヌクレオチド１〜３５１およびアミノ酸残基Ｇｌｕ１〜Ａｌａ１１７（それぞれ、配列番号５および６）からなる。このＬＭ６０９軽鎖ポリペプチドの可変領域は、本質的に、ヌクレオチド１〜３２１および図２Ｂのアミノ酸残基Ａｓｐ１〜Ｌｙｓ１０７（それぞれ、配列番号７および８）からなる。この意図される目的および機能が同じままである限り、核酸をコードするこのような可変領域の末端は重要でない。このような意図される目的および機能としては、例えば、組換えポリペプチドの産生のための使用、または重鎖および軽鎖可変領域配列のためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用が挙げられる。

この可変領域核酸フラグメントのさらなるフラグメントが同様に提供される。このようなフラグメントは、例えば、ＬＭ６０９重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのＣＤＲと実質的に同一のヌクレオチド配列からなる核酸を含む。ＬＭ６０９ＣＤＲに対応する配列は、例えば、Ｋａｂａｔら（前出）によって定義される可変領域内の領域および／またはＣｈｏｔｈｉａら（前出）によって定義される可変領域内の領域、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍら（前出）によって定義される領域を含む。このヌクレオチドに対応する上記定義の各々に関するＬＭ６０９ＣＤＲフラグメントを、以下の表４に記載する。ヌクレオチド配列の番号付けは、図２Ａおよび２Ｂに示される一次配列（配列番号５および７）に由来し、そして表１において先に記載される定義に従う。

（表４：ＬＭ６０９ ＣＤＲヌクレオチド残基）

同様に、アミノ酸残基に対応する上の定義の各々に関するＬＭ６０９ ＣＤＲフラグメントが、以下の表５に示される。このアミノ酸残基の番号付けは、図２Ａおよび２Ｂに示される一次配列（配列番号６および８）に由来し、そして表１において記載される定義に従う。

（表５：ＬＭ６０９ ＣＤＲアミノ酸残基）

ＬＭ６０９重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドならびにそのフラグメントをコードする核酸は、種々の診断目的および治療目的に有用である。例えば、ＬＭ６０９核酸を使用して、インテグリンα_ｖβ_３に対して結合特異性および阻害活性を有する、組換えＬＭ６０９抗体およびその機能的フラグメントを産生し得る。この抗体およびその機能的フラグメントを使用して、α_ｖβ_３媒介疾患の感受性または存在を診断するために、サンプル中のα_ｖβ_３の存在または非存在を決定し得る。あるいは、組換えＬＭ６０９抗体およびその機能的フラグメントは、α_ｖβ_３媒介疾患または病理学的状態の治療的処置に使用され得る。Ｖｉｔａｘｉｎに関して、組換えＬＭ６０９およびその機能的フラグメントを使用して、α_ｖβ_３媒介疾患または病理学的状態の進行に必要である、α_ｖβ_３の結合特性または他の機能的活性を阻害し得る。

本発明のＬＭ６０９核酸を、コードされた重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの機能的等価物のモデルとするためも使用し得る。このような機能的等価物としては、例えば、コードされたポリペプチドまたはその機能的フラグメントの合成アナログまたは模倣物が挙げられ得る。特定の例は、ＬＭ６０９といくらかの結合活性または阻害活性を保持するか、あるいは実質的に同一の結合活性または阻害活性を保持するＬＭ６０９ ＣＤＲのペプチド模倣物を含む。さらに、ＬＭ６０９をコードする核酸を使用して、抗体ＬＭ６０９、その重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドならびにそれらの機能的フラグメントの、改変形態または誘導体をコードする、核酸を操作および産生し得る。上記のように、このような改変形態または誘導体としては、例えば、非マウス抗体、それらの対応する重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドならびにそれらの機能的フラグメントが挙げられ、これらは、ＬＭ６０９と実質的に同一の結合活性および阻害活性を示す。

本発明はまた、α_ｖβ_３媒介疾患を処置する方法を提供する。この方法は、α_ｖβ_３との結合を可能にする条件下で、有効量のＶｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、その増強抗体、またはその機能的フラグメントを投与する工程からなる。また、α_ｖβ_３の機能を阻害する方法が提供される。この方法は、α_ｖβ_３との結合を可能にする条件下で、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、またはその機能的フラグメントとα_ｖβ_３を接触させる工程からなる。

上記のように、ＶｉｔａｘｉｎおよびＬＭ６０９移植抗体は、親のＣＤＲドナー抗体ＬＭ６０９が示すような本質的に全ての結合特性を示す、モノクローナル抗体である。これらの特性は、例えば、インテグリンα_ｖβ_３に対する有意な結合特異性および親和性を含む。以下の実施例は、これらの結合特性を実証し、そしてα_ｖβ_３に対するこのような抗体の結合が、α_ｖβ_３リガンド結合および機能を阻害することをさらに示す。従って、ＶｉｔａｘｉｎおよびＬＭ６０９移植抗体は、α_ｖβ_３機能の阻害に関連する、非常に種々の診断的目的および治療的目的に有用である。

インテグリンα_ｖβ_３は、多数の細胞接着および移動に関連する事象において機能する。このように、このインテグリン、その機能、またはこのインテグリンを発現する細胞の機能不全または調節不全は、非常に多数の疾患状態および病理学的状態に関連している。従って、阻害α_ｖβ_３結合または機能を使用して、このようなα_ｖβ_３媒体病理学的状態の重篤度を処置または減少させ得る。以下に、α_ｖβ_３によって媒介される数種の病理学的状態の例を記載する。なぜなら、少なくともこのインテグリンの阻害により、この状態の重篤度が減少するからである。これらの例は、例示であることを意図し、そして全てのα_ｖβ_３媒介疾患を含有しない。例えば、α_ｖβ_３結合、機能の調節不全またはこのインテグリンを発現する細胞の調節不全を示す、以下に記載の状態に加えて多数の病理学的状態が存在し、そして、ここで、この病理学的状態は、結合α_ｖβ_３を阻害することによって減少され得るか、または減少されることが見出される。この診断基準を示すこのような病理学的状態は、本明細書中で使用される用語の定義内に含まれることが意図される。

新脈管形成、または新生血管形成は、新しい血管が組織内に予め存在する脈管から形成するプロセスである。以下でさらに記載するように、このプロセスは、α_ｖβ_３を発現する内皮細胞により媒介され、そして少なくともこのインテグリンの阻害は、新しい脈管の増殖を阻害する。新しい血管形成または組織新生血管形成を必要とする種々の病理学的状態が存在し、そしてこのプロセスの阻害は、病理学的状態を阻害する。このように、増殖または維持のために新生血管形成を必要とする病理学的状態は、α_ｖβ_３媒介疾患であると考えられる。従って、これらの疾患の処置の範囲、または重篤度の減少は、新生血管形成の阻害の範囲に依存する。これらのα_Ｖβ_３媒介疾患としては、例えば、炎症性障害（例えば、免疫および非免疫炎症）、慢性関節リウマチ、乾癬、不適合または不適当な、脈管の浸潤と関連する障害（例えば、糖尿病網膜症）、血管新生緑内障およびアテローム硬化性斑ならびに癌障害における毛細管増殖が挙げられる。このような癌障害としては、例えば、固体腫瘍、腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポージ肉腫および腫瘍増殖を支持する新生血管形成を必要とする他の癌が挙げられ得る。脈管形成と考えられるさらなる疾患としては、乾癬および慢性関節リウマチならびに網膜疾患（例えば、黄斑変性）が挙げられる。α_Ｖβ_３媒介疾患である、新しい血管を必要とする疾患以外の疾患としては、例えば、再狭窄および骨粗しょう症が挙げられる。

α_Ｖβ_３媒介疾患の処置は、有効量の、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、その増強された抗体、またはその抗体の機能的フラグメントを投与することにより行われ、その結果α_Ｖβ_３に結合し、その機能を阻害し得る。投与は、当該分野で公知の種々の方法を使用して、行われ得る。方法の選択は、特異的なα_Ｖβ_３媒介疾患に依存し、そして例えば、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、またはその抗体の機能的フラグメントの、細胞、組織、器官、および生体への、インビボ、インサイチュおよびエキソビボでの投与が挙げられ得る。さらに、このような抗体または機能的フラグメントが、α_Ｖβ_３媒介疾患を示す個体またはその疾患を示す危険のある個体に投与され得る。α_Ｖβ_３媒介疾患の明確な臨床診断は、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、またはその抗体の機能的フラグメントの投与を保証する。予防的適用は、α_Ｖβ_３媒介疾患メカニズムが、明白な臨床疾患の開始に先行する疾患において保証される。従って、疾患の家族性病歴を有する個体および信頼できる予後の指示薬により危険のあることが予測される個体は、それらの開始前にα_Ｖβ_３媒介メカニズムを阻止するために予防的に処置され得る。

Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、その増強された抗体、またはその抗体の機能的フラグメントを、α_Ｖβ_３媒介疾患の有効的な処置またはα_Ｖβ_３媒介疾患の重篤度の減少のための種々の、処方および薬学的に受容可能な媒質（ｍｅｄｉａ）において投与され得る。このような処方および薬学的に受容可能な媒質は、当業者に周知である。さらに、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、またはその抗体の機能的フラグメントは、α_Ｖβ_３媒介疾患の処置または重篤度の減少を増強または補い得る他の組成物を用いて投与され得る。例えば、腫瘍誘導新生血管形成を阻害するための、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９移植抗体の同時投与および腫瘍増殖を直接阻害するための化学療法薬物は、１つの特定の場合であり、ここで、他の組成物の投与は、α_Ｖβ_３媒介疾患の処置を増強するかまたは補い得る。

Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体または機能的フラグメントは、従来の方法により投与され、投与においてこれは、病理を見てα_Ｖβ_３インテグリン結合の阻害を引き起こすのに十分である。阻害は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、病理の部位のα_Ｖβ_３含有細胞の有病率についてのインサイチュ免疫組織化学）により測定され得、そして阻害は、例えば、α_Ｖβ_３媒介疾患の徴候の重篤度において観察される減少を含み得る。

投与のインビボでの様式としては、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体またはその抗体の機能的フラグメントの、腹腔内、静脈内、および皮下投与が挙げられ得る。抗体療法のための投与量は、公知であるか、または当業者により慣用的に決定され得る。例えば、このような投与量が、代表的に投与され、その結果、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５μｇ／ｍｌおよびより好ましくは約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成する。体重当たりの量の点で見ると、これらの投与量は、代表的に約０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２〜２００ｍｇ／ｋｇおよびより好ましくは約０．５〜２０ｍｇ／ｋｇに対応する。この必要性に依存して、投与量は、処置の経過に対して、単回または複数回投与され得る。一般に、投与量は、年齢、状態、性別および被験体のα_Ｖβ_３媒介病理の範囲により変更し、そして、有害な副作用を引き起こすほど高くなるべきではない。さらに、投与量はまた、処置を増強するかまたは副作用の潜在的な発生を減少させるかのいずれかの処置の過程の間、医師により調節され得る。このような手順は公知であり、そして当業者により慣用的に行われる。

Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９移植抗体、その増強された抗体およびその抗体の機能的フラグメントの、特異性および阻害活性は、多くのα_Ｖβ_３媒介疾患の治療的処置を可能にする。このような疾患としては、例えば、腫瘍増殖、および乾癬のような新生血管形成を必要とする病理状態ならびにα_Ｖβ_３により直接媒介される疾患（例えば、再狭窄および骨粗しょう症）が挙げられる。従って、本発明は、方法ならびにこのような疾患の処置のための組成物を含む、ＶｉｔａｘｉｎおよびＬＭ６０９移植抗体を提供する。

本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない改変もまた、本明細書中に提供される本発明の定義内に含まれることが理解される。従って、以下の実施形態は、本発明を例示するが、限定しないことが意図される。

（実施例Ｉ）
（ＬＭ６０９をコードする核酸の単離および特徴付け）
この実施例は、ＬＭ６０９をコードする核酸のクローニングおよび配列決定を示す。

ＬＭ６０９は、ヒトビトロネクチンレセプター（インテグリンα_Ｖβ_３）に対して指向される。α_Ｖβ_３を、黒色腫、神経膠芽細胞腫、および哺乳動物癌腫において高度に上方制御し、そしてインビトロおよびインビボの両方において、Ｍ２１黒色腫細胞の増殖における役割を果たす。α_Ｖβ_３はまた、新脈管形成、再狭窄および皮膚の創傷における肉芽組織の形成において役割を果たす。ＬＭ６０９は、ビトロネクチンへのＭ２１細胞の接着を阻害し、ならびにインビトロでのＭ２１細胞の増殖を妨害することを示した。従って、ＬＭ６０９の移植は、臨床的に有用な治療剤を生じ得る。

ＬＭ６０９可変領域のｃＤＮＡの合成：ｃＤＮＡの合成について、全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６（１９８７））により記載される方法の改変を使用して、１０^８ ＬＭ６０９ハイブリドーマ細胞から調製した。ＬＭ６０９可変（Ｖ）領域遺伝子を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクローン化し、そしてｃＤＮＡを、ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキットを使用して合成した。簡単には、５ｍｇの全細胞性ＲＮＡ、６５０ｎｇオリゴｄＴおよびＨ_２Ｏを、総量５５ｍｌにした。このサンプルを、７０℃まで、１０分間加熱し、そして氷上で冷却した。反応緩衝液を添加し、そして混合物を、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ｄＮＴＰにし、そして３７℃で２分間加熱した。５ｍｌの（１０００ユニット）逆転写酵素を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートし、ついで氷上で冷却した。

全てのオリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成機でβシアノエチルホスホラミダイト化学により合成した。ＰＣＲ増幅および慣用的な部位特異的変異誘発のために使用されるオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド精製カートリッジを使用して精製した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。正方向ＰＣＲプライマーを、精製されたＬＭ６０９抗体から生成されるＮ末端タンパク質配列データから設計した。この正方向プライマーは、各抗体の可変鎖における最初の６つのアミノ酸をコードする配列（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて配列決定されたタンパク質）を含んだ。軽鎖正方向ＰＣＲプライマー（９９７）の配列は、５’−ＧＣＣ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＣＴＡ ＡＣＴ ＣＡＧ−３’（配列番号１９）であり、これに対して軽鎖逆方向ＰＣＲプライマー（７３４）は、５’−ＡＣ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＧＣ−３’（配列番号２０）を使用した。この逆方向プライマーは、マウス軽鎖κアミノ酸残基１０９〜１１５に対応する。重鎖正方向ＰＣＲプライマー（９９８）の配列は、５’−ＡＣＣ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＡ ＡＡＡ ＧＣＣ ＧＡＡ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ−３’（配列２１）であった。重鎖逆方向ＰＣＲプライマー（７３３）は、５’−ＧＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＧＣ−３’（配列番号２２）であった。ＰＣＲプライマーはまた、免疫発現ベクター内にある特異的な配列と相同の領域を含む。

Ｖ_Ｌ鎖およびＶ_Ｈ鎖を、以下を含む２つの別個の５０ｍｌ反応混合物中で増幅した：２ｍｌのｃＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２重鎖、６６．６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭの各４つのｄＮＴＰ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびそれぞれ、５０ｐｍｏｌの、各プライマー９９７および７３４ならびに９９８および７３３。この混合物をミネラルオイルで覆い、９４℃で３０秒（変性）、５０℃で３０秒（アニール）、および７２℃で３０秒（合成）からなる各サイクルを用いてＰＣＲを２サイクル行った。この反応のあと、直ぐに９４℃で３０秒（変性）、５５℃で３０秒（アニール）、および７２℃で３０秒（合成）からなるＰＣＲを３０サイクル行い、引き続き７２℃で５分間の最終合成反応を行った。この反応産物をプールして、ＣＨＣｌ_３を用いて抽出し、そしてエタノール沈殿した。

増幅産物を、２０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再懸濁し、そして５％ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの予期された分子量で移動するバンドを切り出し、ゲルスライスから化学的に溶出し、有機溶媒で抽出し、そしてエタノール沈殿した。

増幅したＶ_ＨおよびＶ_Ｌの遺伝子の、Ｍ１３ファージ免疫発現ベクターへのクローニング：増幅したＶ領域遺伝子産物を、続いてハイブリダイゼーション変異誘発（Ｎｅａｒ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：８８（１９９２）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００３（１９９５））によってファージ免疫発現ベクターにクローン化した。ハイブリダイゼーション変異誘発による増幅したＶ_ＨおよびＶ_Ｌの配列の導入は、効果的なＦａｂ発現のために必要なＭ１３ベクター中に含まれる調節エレメントとともにインフレームで抗体配列を位置付ける。この技術の１つの利点は、制限エンドヌクレアーゼ部位は、従来のＤＮＡライゲーション法を用いてなされるようなクローニングのためにＶ_ＨまたはＶ_Ｌの遺伝子配列へ組み込む必要がないことである。

クローニングを実施するために、４００ｎｇの２本鎖の増幅産物の各々を、まずポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。リン酸化したＬＭ６０９ Ｖ_Ｌ産物の１００ｎｇを、２５０ｎｇのウリジン化したＢＳ１１ファージ免疫発現ベクターと混合し、９０℃に加熱することによって変性し、そして室温に緩やかに冷却することでアニールした。ＢＳ１１は、Ｍ１３ ＩＸ由来のＭ１３免疫発現ベクターであり、かつマウスＩｇＧ１のＣＨ_１およびマウスκ軽鎖定常ドメインをコードする（Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０３−１２０頁（１９９１））。ＰＣＲ増幅プライマーに含まれるヌクレオチド配列は、一本鎖ＢＳ１１ベクター中に存在する相補的な配列にアニールする。このアニール混合物を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて二本鎖分子に完全に変換し、そしてＴ４リガーゼを用いて連結した。１ｍｌの変異誘発反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポレーションし、ＸＬ−１ Ｅ．ｃｏｌｉのローン（ｌａｗｎ）上に滴下し、そしてプラークが形成されるまでインキュベートした。プラークリフトアッセイを、記載されるようにアルカリホスファターゼに結合体化したヤギ抗マウスκ鎖抗体を用いて実施した（Ｙｅｌｔｏｎら（前出）；Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．（前出））。１５個のマウス軽鎖陽性のＭ１３ファージクローンを単離し、プールし、そしてＰＣＲ増幅ＬＭ６０９Ｖ_Ｈ産物とともにハイブリダイゼーション変異誘発のためのテンプレートとして機能するウリジン化ベクターを調製するために使用した。

機能的なマウスＬＭ６０９Ｆａｂを発現するクローンを、精製ａ_ｖｂ_３に結合させることによってＥＬＩＳＡにより同定した。簡潔には、Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＥＬＩＳＡプレートを、１ｍｇ／ｍｌ（１００ｎｇ／ウェル）のａ_ｖｂ_３を用いて一晩コーティングし、そして非特異的部位を、２７℃で２時間ブロックした。可溶性Ｆａｂを、Ｆａｂを発現するＭ１３ファージクローンに感染させたＥ．ｃｏｌｉ ＭＫ３０−３株（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏ．）の培養物のペリプラズム画分を単離することによって調製した。ペリプラズム画分を、結合緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０２％ ＮａＮ_３、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）と混合し、そして固定したａ_ｖｂ_３とともに２７℃で２時間インキュベートした。このプレートを、結合緩衝液で洗浄し、そして結合したＦａｂを、アルカリホスファターゼに結合体化したヤギ抗マウスκ鎖抗体を用いて検出した。４つのａ_ｖｂ_３反応性クローンを同定した：ｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２、２９、３１および６９。ＭｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２および２９は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて最も強力なシグナルを与えた。ＤＮＡ配列分析は、クローンｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２、３１および６９が、全て同一の軽鎖配列を有することを示し、そして以前に決定された精製ＬＭ６０９軽鎖ペプチドのＮ末端アミノ酸配列を確認した。４つ全てのクローンは、同一のＶ_ＨのＤＮＡ配列を有し、そしてまた、以前に決定された精製ＬＭ６０９重鎖ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を確認した。

各々のクローンの結合活性をさらに特徴付けるために、可溶性Ｆａｂ画分を、クローン１２および２９に感染させたＥ．ｃｏｌｉ ＭＫ３０３−３株の５０ｍｌの培養物から調製し、そしてＬＭ６０９ ＩｇＧを用いる競合ＥＬＩＳＡにおいてａ_ｖｂ_３への結合について評価した。このＥＬＩＳＡの結果を、図３に示す。クローンｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２が、混合なし（ニート）から１：８０までの範囲のペリプラズム力価において、ＬＭ６０９ ＩｇＧのａ_ｖｂ_３への結合を（１ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌのＬＭ６０９ ＩｇＧ濃度で）濃度依存性様式で阻害することを見出した。クローンｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２を、プラーク精製し、そしてＶ領域重鎖ＤＮＡ配列およびＶ領域軽鎖ＤＮＡ配列の両方を再度決定した。最終的なクローン（ｍｕＬＭ６０９Ｍ１３ １２−５）の全ＤＮＡ配列を、図２Ａおよび２Ｂに示す。

（実施例ＩＩ）
（Ｖｉｔａｘｉｎの構築：ＣＤＲ移植ＬＭ６０９機能的フラグメント）
抗体を移植することの１つの目的は、非ヒトＣＤＲをヒト抗体フレームワークに置換する場合に、抗体特異性および親和性を保護することである。別の目的は、ヒト宿主との可能な抗原性を減少させるために外来アミノ酸配列の導入を最少にすることである。本実施例は、所望される抗原に対する最も高い親和性を示す全ての可能なメンバーを示す移植抗体のライブラリーを作製することによってこれらの目的の両方を達成するための手順を記載する。

上記ライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて構築した。ここで可能なＣＤＲおよびフレームワークの変化を、コドン塩基変異誘発（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎら：Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９５．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９５）；Ｒｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２７１：２２６１１−２２６１３（１９９６）））を用いて組み込んだ。これらの手順を用いて、ライブラリーを構築し、そして機能的に活性なヒト化抗ａ_ｖｂ_３抑制抗体を同定した。

ＬＭ６０９の１つの移植形態の構築について、マウスＬＭ６０９ Ｖ領域遺伝子配列に対する同一性の最も高い程度を示すヒトフレームワーク配列を、ＬＭ６０９ ＣＤＲを入手するために選択した。ヒト重鎖Ｖ領域Ｍ７２｀ＣＬ（ＨＨＣ３０Ｑ、ＨＣ サブグループ３、Ｋａｂａｔら（前出））は、ＬＭ６０９重鎖のフレームワーク１、２および３に対して８８％の同一性を有し、そしてヒト軽鎖Ｖ領域ＬＳ１｀ＣＬ（ＨＫＬ３１２、κサブグループ３、Ｋａｂａｔら（前出））は、ＬＭ６０９軽鎖のフレームワーク１、２および３に対して７９％の同一性を有した。Ｋａｂａｔら（前出）によって定義されるマウスＬＭ６０９ＣＤＲ配列をヒトフレームワーク上に移植した。埋もれていると予期される残基は、構造に影響し得、従って可能な変化を設計する場合に本来のマウス結合部位の結合特性を考慮した（Ｓｉｎｇｅｒら（前出）；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１））。このフレームワーク残基の分析は、特異性を保存するために重要であると考えられ、そして結合部位の親和性は、わずかな違いのみを示した。例えば、重鎖配列において、予期される埋もれている残基は、１００％の同一性を示した。特に注目すべきなのは、ヒト重鎖Ｖ領域Ｍ７２｀ＣＬにおけるＡｒｇ１６が、ヒト鎖中の比較的珍しい残基であるということである。しかし、この残基はまた、ＬＭ６０９ Ｖ_Ｈにおいて存在することが見出され、従って保持した。同様に、ＬＭ６０９におけるＡｒｇ１９は、マウス重鎖の中では、比較的まれな残基であるが、Ｍ７２｀ＣＬにおいて存在することが見出されており、従って保持した。軽鎖配列において２つの異なる埋もれている残基を、ＬＭ６０９フレームワーク領域とＬＳ１｀ＣＬフレームワーク領域との間で４９位と８７位において同定した。従って、これらの２つの位置を、ヒト代替物およびマウス代替物の両方とし、移植抗体ライブラリーに組み込んだ。

全長移植Ｖ領域遺伝子を、長い重複オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって合成した。４９位および８７位において混合されたアミノ酸残基を含む軽鎖オリゴヌクレオチドを、Ｇｌａｓｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３（１９９２））において記載され、かつＶ_Ｌオリゴ３およびＶ_Ｌオリゴ４（それぞれ、配列番号１６および１７）として示されるオリゴヌクレオチドにおいて例示されるように合成した。全ての長いオリゴヌクレオチドを、ゲル精製した。

移植ＬＭ６０９重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域を、アニーリングＰＣＲプライマーの存在下でモル等量濃度で５つの重複オリゴヌクレオチドを混合することによって構築した。この重鎖オリゴヌクレオチドを、以下のヌクレオチド位置に位置付けた：Ｖ_Ｈオリゴヌクレオチド１（Ｖ_Ｈオリゴ１）（ヌクレオチド（ｎｔ）１−８４）（配列番号９）；Ｖ_Ｈオリゴ２（ｎｔ ７０−１５３）（配列番号１０）；Ｖ_Ｈオリゴ３（ｎｔ １３８−２２５）（配列番号１１）；Ｖ_Ｈオリゴ４（ｎｔ ２１１−２９１）（配列番号１２）；Ｖ_Ｈオリゴ５（ｎｔ ２７７−３５１）（配列番号１３）。同様に、Ｖｉｔａｘｉｎ軽鎖オリゴヌクレオチドを、以下のヌクレオチド位置に位置付けた：Ｖ_Ｌオリゴヌクレオチド１（Ｖ_Ｌオリゴ１）（ヌクレオチド（ｎｔ）１−８７）（配列番号１４）；Ｖ_Ｌオリゴ２（ｎｔ ７３−１４４）（配列番号１５）；Ｖ_Ｌオリゴ３（ｎｔ １３０−２１３）（配列番号１６）；Ｖ_Ｌオリゴ４（ｎｔ １９９−２７９）（配列番号１７）；Ｖ_Ｌオリゴ５（ｎｔ ２６５−３２１）（配列番号１８）。移植ＬＭ６０９重鎖可変領域および移植ＬＭ６０９軽鎖可変領域を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を、表６に示す。Ｖ_Ｌオリゴ３、およびＶ_Ｌオリゴ４におけるコドン４９位および８７位は、無作為化コドンを示す。アニーリングプライマーは、一本鎖ベクターへの増幅Ｖ領域産物の効果的なアニーリングのためのベクター配列に相補的な少なくとも１８個のヌクレオチド残基を含んだ。このアニール化混合物を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて二本鎖分子に完全に変換し、そしてＴ４リガーゼを用いて連結した。

ライブラリーを作製するために、変異誘発反応物の一部（１μｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株（ＢＲＬ）にエレクトロポレーションし、ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）のローン（ｌａｗｎ）上に滴下し、そしてプラークが形成されるまでインキュベートした。レプリカフィルターリフト（ｒｅｐｌｉｃａ ｆｉｌｔｅｒ ｌｉｆｔ）を調製し、そしてＶ_Ｈ遺伝子配列を含むプラークを、ＬＭ６０９重鎖ＣＤＲ２配列に相補的なジゴキシゲニン標識化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションか、またはベクターＣＨ_１ドメインのカルボキシ末端に付加されたデカペプチド配列Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ（配列番号２８）に対して惹起された７Ｆ１１アルカリホスファターゼ結合体化モノクロナール抗体（Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）との反応性のいずれかによってスクリーニングした。２つとも陽性であった１５個のクローンをプールし、そして増幅した移植ＬＭ６０９Ｖ_Ｌ産物とともにハイブリダイゼーション変異誘発のためのウリジン化テンプレートを調製するために使用した。

（表６：移植したＬＭ６０９の重鎖および軽鎖の可変領域を構築するために使用されるオリゴヌクレオチド）

変異誘発反応を、Ｖ_Ｌオリゴヌクレオチド１〜５（各々配列番号１４〜１８）を使用したことを除いて、Ｖ_Ｈオリゴヌクレオチドを用いて上記のように行った。この反応をＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂへエレクトロポレーションし、そして検出のためにアルカリホスファターゼに結合体化したヤギ抗ヒトκ鎖抗体またはヤギ抗ヒトＦａｂ抗体のどちらかを用い、アルカリフォスファターゼに結合体化したウサギ抗ヤギ二次試薬を使用して、濾過リフトをプロービングした。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子配列の両方を共発現するポジティブクローンを選択し（全部で１６０）、そしてこれを使用して可溶性Ｆａｂフラグメントを調製するためにＥ．ｃｏｌｉ株ＭＫ３０−３に感染させた。

この可溶性Ｆａｂフラグメントを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、α_Ｖβ_３への結合についてスクリーニングした。α_Ｖβ_３に強力に結合することがＥＬＩＳＡから示された４つのクローンを同定し、そしてさらに特徴付けた。これらのクローンを、ｈｕＬＭ６０９Ｍ１３−３４、５４、５５および１４５と称した。４つ全てのクローンをプラーク精製し、そして各クローンからの３つの独立サブクローンを使用して、ＥＬＩＳＡによるさらなるα_Ｖβ_３への結合分析のためのＦａｂフラグメントを調製した。

このさらなるＥＬＩＳＡにおいて、二連プレートをα_Ｖβ_３リガンドでコーティングし、そしてｈｕＬＭ６０９ペリプラズムサンプルと共にインキュベートした。１つのプレートでは、結合ｈｕＬＭ６０９Ｆａｂをアルカリフォスファターゼに結合体化したヤギ抗ヒトκ鎖抗体で検出し、そして他のプレートでは、結合ｈｕＬＭ６０９Ｆａｂを、デカペプチドタグを認識するモノクローナル抗体である７Ｆ１１−アルカリホスファターゼ結合体で検出した。サブクローン（ｈｕＬＭ６０９Ｍ１３−３４−１、２および３）ならびにｈｕＬＭ６０９Ｍ１３−１４５−１、２および３は全て二倍のポジティブシグナルを生じ、これは、Ｆａｂが機能的Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌポリペプチドを含むことを示した。これらの結果を、インテグリンα_Ｖβ_３を発現する細胞株であるＭ２１細胞に対するＥＬＩＳＡアッセイにおいて確認した。

サブクローンｈｕＬＭ６０９Ｍ１３−３４−３およびｈｕＬＭ６０９Ｍ１３−１４５−３のＤＮＡ配列分析は、オリゴヌクレオチド合成に起因するエラーによるか、またはＰＣＲ増幅間に発生するエラーにより、ライブラリー中へ導入された変異を明らかにする。これらの変異を、部位特異的変異誘発によって、クローンｈｕＬＭ６０９ＭＢ−３４−３において補正した。軽鎖配列において、以下の補正がなされた：Ｈｉｓ３６からＴｒｙ３６へ、およびＬｙｓ１８からＡｒｇ１８へ。重鎖配列において、以下の補正がなされた：Ｇｌｕ１からＧｌｎ１へ、Ａｓｎ３からＧｌｎ３へ、およびＬｅｕ１１からＶａｌ１１へ。さらに、ＬＭ６０９の移植分子の構築の間、重鎖に由来する残基２８は、重要でないフレームワーク残基であると考えられ、そしてヒト残基（Ｔｈｒ２８）は、維持された。しかし、引き続いて、残基２８がＣＤＲの重要な部分であり得ることが決定された。従って、残基２８を、オリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＴ ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＧＡ Ｇ−３’（配列番号２９））を有する部位指向性変異誘発を使用して、対応するマウスのその位置（Ａｌａ２８）における残基に変換した。この変化がヒトフレームワークのその部位のスレオニンを超える利点を提供しないことを後から決定し、そしてこのスレオニンは、維持された。最終的な移植ＬＭ６０９クローンをｈｕ６０９Ｍ１３ １１３５−４と命名し、そして本明細書中でＶｉｔａｘｉｎと称する。クローンＶｉｔａｘｉｎのＤＮＡ配列を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。

（実施例ＩＩＩ）
（Ｖｉｔａｘｉｎの機能的特徴付け）
本実施例は、多くのインビトロ結合アッセイおよび細胞接着アッセイにおけるＶｉｔａｘｉｎの結合特異性、親和性および機能活性の特徴付けを示す。

Ｖｉｔａｘｉｎのインテグリンα_Ｖβ_３に対する結合特異性を、α_Ｖβ_３への結合および他のα_Ｖ含有インテグリンまたはβ_３含有インテグリンに対するその交叉反応性を測定することにより初めに評価した。具体的には、α_ＩＩｂβ_３（血小板で発現される主要なインテグリン）およびα_Ｖβ_５（内皮細胞および結合組織細胞型に多く見られるインテグリン）への結合を測定することにより、結合特異性を評価した。

簡単には、交叉反応性を決定するために、インテグリンをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、そして一連の抗体希釈物を、α_Ｖβ_３および他のインテグリンに対するＶｉｔａｘｉｎ結合活性について測定した。インテグリンα_Ｖβ_３およびα_Ｖβ_５を、Ｃｈｅｒｅｓｈ（１９８７）（前出）ならびにＣｈｅｒｅｓｈおよびＳｐｉｒｏ（１９８７）（前出）により開示されるアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。α_ＩＩｂβ_３をＣａｌＢｉｏｃｈｅｍから購入した。簡単には、ＬＭ６０９アフィニティーカラム（ＣｈｅｒｅｓｈおよびＳｐｉｒｏ（１９８７）（前出））を使用して、オクチルグルコシドヒト胎盤溶解物からα_Ｖβ_３を単離し、一方、抗α_Ｖアフィニティーカラムを使用して、α_Ｖβ_３が枯渇したカラムのフロースルーからα_Ｖβ_５を単離した。ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体を使用するＥＬＩＳＡにより、抗体結合活性を評価した。コントロールとして、精製ヒトＩｇＧ_１抗体を使用した。なぜなら、ＶｉｔａｘｉｎはヒトＩｇＧ_１のバックボーンを含むからである。

このアッセイの結果を、図４Ａに示し、そしてこの結果は、Ｖｉｔａｘｉｎが高親和性でα_Ｖβ_３に特異的に結合することを明らかにする。１．０ｍｇ／ｍｌを超える抗体濃度における、他のα_Ｖ含有インテグリンまたはβ_３含有インテグリンへの検出可能な結合は存在しなかった。

さらなる結合研究において、結合の親和性および特異性を、α_Ｖβ_３に対する親ＬＭ６０９抗体を用いる競合結合アッセイにおいて評価した。標識した抗体であるＬＭ６０９を用いて上記のように、競合結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。ＬＭ６０９の結合を、漸増濃度のＶｉｔａｘｉｎ競合物の存在下で決定した。代替的に、コントロール競合抗体は、再びヒトＩｇＧ_１であった。

この競合の結果を図４Ｂに示し、そしてこの結果は、ＬＭ６０９の結合の特定的な阻害が、０．１μｇ／ｍｌを超えるＶｉｔａｘｉｎ濃度で観察され得ることを示す。ほとんど完全なる阻害は、１００μｇ／ｍｌを超えるＶｉｔａｘｉｎ濃度で観察される。競合阻害のこのレベルは、親モノクローナル抗体ＬＭ６０９およびＶｉｔａｘｉｎの移植バージョンが、本質的に同一の特異性を示すことを示す。

フィブリノーゲンへのα_Ｖβ_３結合についてＶｉｔａｘｉｎの阻害活性を測定することにより、結合の親和性および特異性をも評価した。これらの研究にのために、Ｖｉｔａｘｉｎ／α_Ｖβ_３結合研究について上記されるように、ＥＬＩＳＡプレート上にα_Ｖβ_３をプレーティングした。漸増濃度のＶｉｔａｘｉｎまたはコントロール抗体の存在下で、結合ビオチン化フィブリノーゲンの量を測定することにより、Ｖｉｔａｘｉｎの阻害活性を決定した。簡単には、フィブリノーゲンをＣａｌＢｉｏｃｈｅｍから購入し、そして製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により記載されるように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンでビオチン化した。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼを使用して、結合フィブリノーゲンを検出した。

このアッセイの結果を、図４Ｃに示し、そしてこれらの結果は、約０．１μｇ／ｍｌよりも高いＶｉｔａｘｉｎ濃度での特異的結合阻害を明らかにする。これらの結果は、Ｖｉｔａｘｉｎのへα_Ｖβ_３の特異的結合およびＬＭ６０９の競合阻害を示す上記の結果と組み合わせて、親マウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９により示される結合の特徴および特異性の全てを、Ｖｉｔａｘｉｎが基本的に維持することを示す。インビトロ結合アッセイに基づくこれらの結論を実証するさらなる機能研究を、以下に記載する。

さらなる機能研究を行い、Ｖｉｔａｘｉｎ結合の特異性をさらに評価した。これらの研究は、細胞接着アッセイにおけるインテグリンα_Ｖβ_３結合の阻害に関する。内皮細胞接着事象は、血管形成プロセスの重要な構成要素であり、そして、α_Ｖβ_３の阻害が、腫瘍の新脈管形成を減少させ、これにより腫瘍増殖の速度を減少させることが公知である。これらのアッセイにおけるＶｉｔａｘｉｎによるα_Ｖβ_３媒介性細胞付着の阻害は、この抗体をインサイチュまたはインビボで使用する場合を除いて、阻害活性を示す。

簡単には、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖させたα_Ｖβ_３ポジティブＭ２１黒色腫細胞を、細胞結合アッセイに使用した。細胞をトリプシン処理により培養皿から遊離させ、そして４×１０^５細胞／ｍｌの濃度で接着緩衝液中に再懸濁した（以下を参照のこと）。Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９または精製ヒトＩｇＧ_１（コントロール抗体）を、２５０μｌの接着緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２ｍＭ ＭｎＣｌ_２および１％ＢＳＡ（Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中、ｐＨ７．４））中に所望の濃度まで希釈し、そしてフィブリノーゲンでプレコーティングした４８ウェルプレートのウェルに添加した。フィブリノーゲンを上記のように単離した。各ウェルを２００μｌの１０μｌ／ｍｌの濃度のフィブリノーゲンで、１時間３７℃にてコーティングした。アッセイのために、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９またはアイソタイプ一致コントロール抗体を含有する等量の細胞（２５０μｌ）を各々のウェルに添加し、穏やかに振盪することにより混合し、そして２０分間３７℃にてインキュベートした。未結合細胞を、ＢＳＡ単独でコーティングしたコントロールウェルに細胞が残らなくなるまで、接着緩衝液で洗浄することにより除去した。クリスタルバイオレットで染色することにより、接着細胞を視覚化した。引き続き、クリスタルバイオレットを１００μｌの酢酸（１０％）で抽出し、そして５６０ｎｍにて可溶化した色素の吸光度を決定することにより定量した。

このアッセイの結果を図５Ａに示し、そしてこれらの結果は、Ｖｉｔａｘｉｎおよび親抗体ＬＭ６０９の両方が、同じ濃度範囲にわたり、フィブリノーゲンへのＭ２１細胞接着を阻害することを明らかにする。最大接着の５０％に対するこの阻害濃度を、算出したところ約５０ｎｇ／ｍｌであった。Ｖｉｔａｘｉｎの特異性を、コントロールＩｇＧ_１抗体により観察される阻害の欠如により示した。

上記の細胞接着の結果に加えて、Ｖｉｔａｘｉｎの阻害活性をまた、内皮細胞移動アッセイにおいて試験した。この点において、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）細胞移動アッセイを使用し、内皮細胞の移動を阻害するＶｉｔａｘｉｎの能力を評価した（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇ．，１９：１２５−１３４（１９９４）およびＬｅａｖｅｓｌｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２１：１６３−１７０（１９９３））。

簡単には、対数期かつ低い継代数のヒト臍静脈内皮細胞を穏やかなトリプシン処理により収集し、洗浄し、そして１％ＢＳＡを含む３７℃のＨＢＳ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．８ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＫＣｌ、および５ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）中に、２×１０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。抗体（Ｖｉｔａｘｉｎ、ＬＭ６０９、およびＩｇＧ_１コントロール）を、ストック溶液に１０μｇ／ｍｌに希釈した。抗体を、１：１希釈（抗体の最終濃度＝５μｇ／ｍｌ；細胞の最終濃度＝１×１０^６細胞／ｍｌ）で、細胞に添加し、そして氷上で１０〜３０分間インキュベートした。次いで、細胞／抗体懸濁液（各コンパートメントについて２００μｌ）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞培養チャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）の上部コンパートメントに添加し、その底部のコンパートメントは、０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌのビトロネクチン（ＨＢＳ中）のでコーティングされている。ビトロネクチンは、内皮細胞の化学誘引物質として作用する。チャンバーを、３７℃で４時間放置し、細胞の移動を生じさせる。

細胞の移動の可視化を、綿布で上部コンパートメント内の残りの細胞を、まず除去することによって行った。目的の低いサイドに移動した細胞を、クリスタルバイオレットで３０分間染色し、続いて、酢酸に可溶化し、そして色素の吸光度を５５０ｎｍの波長で測定した。吸収の量は、上部チャンバーから底部チャンバーに移動した細胞の数に直接比例する。アッセイの結果を、図７Ｂに示す。Ｖｉｔａｘｉｎおよび親の抗体ＬＭ６０９の両方は、本質的に同じ阻害の結果を生じた。具体的には、ＶｉｔａｘｉｎおよびＬＭ６０９は、ＩｇＧ_１コントロールおよびインヒビターのないサンプルに比較して内皮細胞のビトロネクチン誘導性移動の約６０％を阻害した。

（実施例ＩＶ 動物モデルにおけるα_Ｖβ_３のＶｉｔａｘｉｎ媒介性阻害）
この実施例は、２つの動物モデルにおけるＶｉｔａｘｉｎによる腫瘍増殖の阻害を記載する。腫瘍増殖を、少なくともα_Ｖβ_３媒介性新生血管形成をＶｉｔａｘｉｎで阻害することにより阻害した。

第１のモデルは、ニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）における新脈管形成を測定する。このアッセイは、インビボ新脈管形成に関して十分に認識されるモデルである。なぜなら、全組織の新生血管形成が生じるからである。具体的には、このアッセイは、増殖因子浸透フィルターディスクに向ってか、またはＣＡＭ上で増殖した組織内で増殖するニワトリのＣＡＭ血管の増殖因子誘導性新脈管形成を測定する。新生血管形成の阻害は、新しい血管増殖の量および範囲に基づくか、またはＣＡＭ上の組織の増殖阻害に基づく。このアッセイは、他の者によって詳細に記載されて、そして新生血管形成ならびに腫瘍細胞の新生血管形成を測定するために使用された（Ａｕｓｐｒｕｎｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，７９：５９７−６１８（１９７５）；Ｏｓｓｏｎｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０：２３００−２３０９（１９８０）；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４ａ）およびＢｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ，７９：１１５７−１１６４（１９９４ｂ））。

簡単には、増殖因子誘導性新脈管形成について、フィルターディスクを、皮膚生検穿孔を使用する＃１ Ｗｈａｔｍａｎ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｃｉｒｃｌｅｓより購入する。ディスクを始めに、ＵＶ光に曝露することによって滅菌し、次いで、滅菌条件下（少なくとも１時間）で、異なる濃度のＴＮＦ−αまたはネガティブコントロールとしてのＨＢＳＳで飽和する。新脈管形成を、ＣＡＭ上に飽和フィルターディスクを配置することによって誘導する。

新脈管形成の阻害を、胚を、種々の量のＶｉｔａｘｉｎおよびコントロール（抗体または精製ヒトＩｇＧ_１）を用いて処理することによって行う。処置を、ディスクの配置の約２４時間後、静脈内注入によって行なう。４８時間後、ＣＡＭを解剖し、そして新脈管形成を１〜４の尺度でスコア付けする。ＨＢＳＳ飽和フィルターディスクを、ネガティブコントロール（ＣＡＭを調節する際に組織損傷に応じて生じ得る新脈管形成を表す）として使用し、そしてこれらのＣＡＭについての値を、バックグラウンドとして引く。精製ヒトＩｇＧ_１を、注入についてのネガティブコントロールとして使用する。なぜなら、Ｖｉｔａｘｉｎは、ヒトＩｇＧ_１サブクラスのＶｉｔａｘｉｎであるからである。Ｖｉｔａｘｉｎは、用量依存性の様式でＴＮＦ−α誘導性新脈管形成を阻害することが見出された。最大の阻害は、３００μｇでの単回の用量のＶｉｔａｘｉｎで生じ、それは、ヒトＩｇＧ_１コントロールに比較して８０％よりも大きい阻害を生じた。

増殖因子誘導性新生血管形成を使用する上記のＣＡＭアッセイに加えて、さらなる研究を、腫瘍誘導性新生血管形成を使用して行った。これらのアッセイにおいて、α_Ｖβ_３ネガティブ腫瘍フラグメントをＣＡＭに移植することによって新脈管形成を誘導した。α_Ｖβ_３ネガティブ腫瘍フラグメントは、腫瘍増殖の任意の阻害が、ＣＡＭ誘導性内皮細胞によるα_Ｖβ_３媒介性新生血管形成の阻害に起因し、そして腫瘍細胞上に提示されるα_Ｖβ_３によって媒介される接着事象に起因しないすることを保証する。

腫瘍増殖の阻害を、３０μｌ中のＣＡＭ上に、ＦＧ（８×１０^６細胞、膵臓癌）およびＨＥｐ−３細胞（５×１０^５細胞、咽頭癌）の単一の細胞懸濁液を配置することによって評価した。１週間後、腫瘍を除去し、そして新しいＣＡＭ上に配置する時点に、約５０ｍｇのフラグメントに切断する。この第２回目の配置の２４時間後、胚を、ＶｉｔａｘｉｎまたはネガティブコントロールとしてヒトＩｇＧ_１と共に静脈内に注射する。腫瘍を、約７日間増殖させ、その後除去し、そして重量を測定した。

腫瘍の新生血管形成へのＶｉｔａｘｉｎ処理の結果を、図６Ａに示す。このデータは、腫瘍の重量の平均変化として表され、そしてＶｉｔａｘｉｎは、α_Ｖβ_３ネガティブ腫瘍（例えば、Ｆｇ腫瘍フラグメントおよびＨＥｐ−３腫瘍フラグメント）の増殖を阻害し得ることを実証する。より具体的には、−５．３８のＶｉｔａｘｉｎ処理Ｆｇ腫瘍フラグメントについての平均重量の変化が存在するが、−１１．０の変化が、Ｖｉｔａｘｉｎ処理ＨＥｐ−３腫瘍について観察された。ＩｇＧ_１コントロールは、ＦＧ腫瘍フラグメントおよびＨＥｐ−３腫瘍フラグメントのそれぞれについて、２５．２９および２８．５の正の平均重量の変化を示した。これらの結果を、以下の単回静脈内注入より得た。

第２の動物モデルにおいて、ウサギにおけるＶｘ２癌細胞の阻害を、腫瘍へのＶｉｔａｘｉｎの阻害効果の基準として使用した。Ｖｘ２癌は、ショープウイルス誘導性乳頭腫由来の移植可能な癌である。これは始めに１９４０年に記載され、以来、腫瘍の侵入、腫瘍−宿主相互作用および新脈管形成についての研究において、広く使用されている。Ｖｘ２癌は、本来、線維症性であり、高度に活動的であり、そして退形成型の癌の特性を示す。Ｖｘ２腫瘍の増殖は、ドナーのウサギでの連続した移植を通じて達成される。皮下の移植に続いて、始めの炎症反応の後に、宿主の修復機構が２日目〜４日目の間に起こることが報告された。この修復機構は、新しい結合組織の形成および新しい毛細管の産生によって特徴付けられる。新しく形成された毛細管は、４日目においては修復部位に限定されるが、８日目までには、これらは腫瘍の外側の領域に広がった。ウサギにおけるＶｉｔａｘｉｎのこれらの特徴および薬物速度論は、これらの実験における初めの用量および処理の計画を決定するために使用される。１、５、および１０ｍｇ／ｋｇで、投与された動物血清におけるＶｉｔａｘｉｎの排除半減期は、それぞれ３８．９、６０．３、および５２．１時間であることが見出された。

上記の動物モデルにおけるＶｘ２腫瘍の増殖を、Ｖｘ２癌を皮下に移植されたウサギにおける原発性腫瘍増殖への初期の投与後のＶｉｔａｘｉｎの効果を研究するために使用した。簡単には、Ｖｘ２腫瘍（５０ｍｇ）を、皮膚と筋肉の間の切開を通じてウサギの内腿に移植した。原発性腫瘍の測定を、２５日目までの実験の間にわたって行った。移植の２８日目以後、動物を屠殺し、そして腫瘍を切除し、重量を測定した。２８日目までに、腫瘍は非常に異常な形状になり、その結果、測定が困難になり、それゆえ腫瘍容量を示さなかった。従って、測定は２５日目までのみ評価した。

第１の研究において、ウサギを、腫瘍の移植後１日目から開始して２８日間、５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのＶｉｔａｘｉｎで、４日毎に合計７回の用量で処理した。両方のグループにおいて、腫瘍増殖の阻害を観察した。第２の研究シリーズにおいて、腫瘍の移植後７日目から開始して上記のように、合計５回の用量でウサギを処理した。腫瘍増殖の阻害をまた観察した。

ウサギへの反復投与処理として、移植された抗体を投与することは、Ｖｉｔａｘｉｎに対して中和効果を有し得る免疫応答を産生し得、従って潜在的に効果を備えることに注意すべきである。予備的なデータは、約２５〜５０％の動物がこのような応答を発達させることを示唆する。

上記の各Ｖｉｔａｘｉｎ処理の結果を、図６Ｂおよび６Ｃに示す。１日目で処理を受けるウサギにおいて、腫瘍の増殖の阻害は、コントロールＰＢＳで処理されたコントロールと比較して１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量のグループの両方で観察された。具体的には、平均腫瘍重量によって測定された場合に、約６７％および８０％の増殖阻害を、それぞれ観察した。より低い程度の阻害が、移植後７日目でＶｉｔａｘｉｎ処理を始めた動物において観察された。これらの結果を図６Ｃに示す。すべての場合において、腫瘍増殖の阻害は、０．２ｍｇ／ｋｇより低いＶｉｔａｘｉｎ濃度では観察されなかった。

（実施例Ｖ）
（ＬＭ６０９移植機能抗体フラグメントの構築）
本実施例は、ＣＤＲのみがＬＭ６０９ドナー抗体からヒトアクセプターフレームワークに移されている、機能的ＬＭ６０９移植抗体フラグメントの構築を示す。

機能抗体フラグメントを生成するためのＬＭ６０９のＣＤＲ移植は、以下に示される方法によって達成した。これらの手順は、本質的に任意のドナー抗体のＣＤＲ移植に関して適用可能であり、ここで、ドナー抗体由来のＣＤＲの外側のアミノ酸残基は、最終移植生成物に所望されない。

簡単に言うと、ＬＭ６０９抗体のタンパク質配列を、実施例Ｉに記載されるように、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、そして配列決定することによって決定した。ＬＭ６０９ドナー抗体由来のＣＤＲを、同定し、そしてヒトアクセプターフレームワークの相同性ヒト可変領域に移植した。ＣＤＲ領域の同定は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．によって発行された定義の組合せに基づいた。

ＣＤＲ領域の境界を、上記の２つの刊行物によって累積的に規定し、そして、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について、それぞれ、残基３０〜３５、４７〜６６および９７〜１０６、ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について、それぞれ、残基２４〜３６、４６〜５６、および８９〜９７である。これらの境界内であるがＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって規定されるようなＣＤＲの外側である異なるドナー残基（ｎｏｎ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｄｏｎｏｒ ｒｅｓｉｄｕｅ）を、同定し、そしてアクセプターフレームワークへは置換しなかった。その代わりに、機能的非ドナー（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｏｎ−ｄｏｎｅｒ）アミノ酸残基を同定し、そして、これらの異なる残基の特定のものに置換した。

以下のように、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって規定されるようなＣＤＲの外側であるが上記で規定されるようなＣＤＲ内である唯一の異なる残基は、ＬＭ６０９軽鎖の４９位である。この位置における機能的非ドナーアミノ酸を同定するために、全ての非ドナーアミノ酸を４９位に含む１９個の抗体のライブラリーを構築し、次いで、α_ｖβ_３に対する結合活性についてスクリーニングした。

ヒト免疫グロブリン配列を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ−Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔデータベース（リリース５．０）から同定した。マウスＬＭ６０９可変領域遺伝子の配列に有意な同一性を示すヒトフレームワーク配列を、ＬＭ６０９ ＣＤＲを入手するために選択した。ヒト重鎖可変領域Ｍ７２’ＣＬは、ＬＭ６０９重鎖のフレームワーク１、２および３に対して８８％の同一性を有し、そして、ヒト軽鎖Ｖ領域ＬＳ１’ＣＬは、ＬＭ６０９軽鎖のフレームワーク１、２および３に対して７９％の同一性を有した。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって規定されたＣＤＲの外側の異なる残基を除いて、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．によって規定されたマウスＬＭ６０９ ＣＤＲ配列を、ヒトフレームワーク上に移植した。この移植スキームを用いることによって、最終的な移植生成物は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって規定されたＣＤＲの外側のいずれのアミノ酸残基（これは、対応する位置（以下の残基の外側：重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について、それぞれ、３１〜３５、５０〜６６および９９〜１０６、そして軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について、それぞれ、２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７）においてＬＭ６０９アミノ酸と同一である）も含まない。さらに、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって規定されたＣＤＲの外側のアミノ酸残基（これは、その位置においてＬＭ６０９アミノ酸に対して同一である）を含む中間体は、生成されなかった。ＣＤＲ移植手順を、以下に示す。

全長ＣＤＲ移植可変領域遺伝子を、前に実施例ＩＩに記載されるように、長い重複するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって合成した。重鎖可変領域オリゴヌクレオチドは、配列番号９〜１３として前に記載したものである。軽鎖可変領域オリゴヌクレオチドを、ＣＤＲ移植可変領域および位置４９に終止コドンを含むように合成した。軽鎖ＬＭ６０９移植可変領域のための５つのオリゴヌクレオチドを、配列番号２３〜２７に示し、ここで、このシリーズ中の２番目のオリゴヌクレオチドは、４９位に終止コドンを含む（配列番号２４）。ＬＭ６０９移植軽鎖可変領域を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を、表７に示す。

（表７：ＬＭ６０９移植軽鎖可変領域を構築するために使用されるオリゴヌクレオチド）

全ての長いオリゴヌクレオチドは、ゲル精製した。ＬＭ６０９重鎖可変領域のＣＤＲ移植は、５つの重複するオリゴヌクレオチド（配列番号９〜１３）を、等モル濃度で、アニーリングＰＣＲプライマーの存在下で混合することによって構築した。このアニーリングＰＣＲプライマーは、一本鎖ベクターへの増幅されたＶ領域生成物の効率的なアニーリングのために、ベクター配列に相補的な少なくとも１８ヌクレオチド残基を含む。アニーリングされた混合物を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて二本鎖分子に完全に変換し、そしてＴ４リガーゼを用いて連結させた。変異誘発反応物（１μｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ１０Ｂ（ＢＲＬ）にエレクトロポレーションし、ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）のローン（ｌａｗｎ）上で滴定し、そしてプラークが形成されるまでインキュベートした。レプリカのフィルターリフトを調製し、そしてＶ_Ｈ遺伝子配列を含むプラークを、ＬＭ６０９重鎖ＣＤＲ２配列に相補的なジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってか、またはベクターＣＨ_１ドメイン（Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のカルボキシ末端に付加したデカペプチド配列（Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ（配列番号２８））に対して惹起された、７Ｆ１１アルカリホスファターゼ結合体化のモノクローナル抗体との反応性のいずれかによって、スクリーニングし得る。

二重に陽性であった５０個のクローンをプールし、そして、配列番号２３〜２７に示されるような５つの重複するオリゴヌクレオチドを用いて同様な様式で構築された、増幅ＣＤＲ移植ＬＭ６０９ Ｖ_Ｌ生成物を用いた、ハイブリダイゼーション変異誘発のためのウリジン化テンプレートを調製するために使用した。変異誘発反応物は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ１０Ｂにエレクトロポレーションした。無作為に拾い上げたクローンを配列決定し、４９位における非ドナーライブラリーを構築するための、適切に構築されたテンプレートを同定した。このテンプレートは、ウリジン化テンプレートとして調製され、そしてオリゴヌクレオチド集団の後の配列を、部位指向型変異誘発に使用した。

ＧＧＧＡＡＣＧＡＴＡ−１９ａａ−ＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣ
上記プライマー（配列番号３０）における配列１９ａａは、このプライマーが、１９個の非ドナーアミノ酸の各々をコードする１９個の異なるコドン配列からなる配列集団を特定するという事実を示している。これらのアミノ酸は、ＬＭ６０９の４９位には見出されないアミノ酸であり、そしてＬｙｓ以外の全てのアミノ酸を含む。これらの変異誘発から生じるクローンを、拾い上げ、そしてこれらのクローンによって発現される抗体を調製した。次いで、これらのサンプルを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてα_ｖβ_３に対する結合についてスクリーニングした。４９位にＡｒｇまたはＭｅｔアミノ酸のいずれかを有するクローンを、機能的に同定した。ＬＭ６０９移植重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図１Ａ（それぞれ、配列番号１および２）に示す。ＬＭ６０９移植軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、図７（それぞれ、配列番号３１および３２）に示す。

（実施例ＶＩ）
（増強された活性を有するＬＭ６０９移植抗体の作製）
本実施例は、親ＬＭ６０９移植抗体と比較して、α_ｖβ_３に対する増加した親和性を有する抗体改変体を得るための、ＬＭ６０９移植抗体のインビトロ成熟を示す。

インビトロでのＬＭ６０９移植抗体の親和性を最適化するために、Ｍ１３ファージシステムを使用した。このシステムは、機能抗体フラグメント（Ｆａｂ）のライブラリーの、効率的な合成、発現およびスクリーニングを可能にする。Ｉｇ重鎖およびＩｇ軽鎖の６つのＣＤＲの各々の寄与を、評価した。ＣＤＲは、配列可変性および抗体構造モデルの組み合わせに基づいて広く規定された（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，前出；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，前出）。従って、長さが長いこと（２０アミノ酸）に起因して２つのライブライリーに分離されるＨ２以外は、１つのライブラリーを各ＣＤＲについて構築した。変異ＣＤＲを含む可変領域フレームワークは、図１ａ（配列番号２）に示される重鎖可変領域および図７（配列番号３２）に示される軽鎖可変領域であった。

ＣＤＲを、図１ａ（配列番号２）に示される重鎖可変領域および図７（配列番号３２）に示される軽鎖可変領域から選択した。簡単に言うと、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前出）の番号付けシステムを使用して、ＣＤＲの変異誘発について選択した残基（表９）は、以下であった：軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ１）中のＧｌｎ^２４〜Ｔｙｒ^３６；軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ２）中のＬｅｕ^４６〜Ｓｅｒ^５６；軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ３）中のＧｌｎ^８９〜Ｔｈｒ^９７；重鎖ＣＤＲ１（Ｈ１）中のＧｌｙ^２６〜Ｓｅｒ^３５；重鎖ＣＤＲ２（Ｈ２）中のＴｒｐ^４７〜Ｇｌｙ^６５；および重鎖ＣＤＲ３（Ｈ３）中のＡｌａ^９３〜Ｔｙｒ^ｌ０２。ライブラリーを、各ＣＤＲについて作製し、オリゴヌクレオチドは、各クローンにおいて単一のＣＤＲ残基が変異されるように設計した。Ｈ２の伸長した長さに起因して、残基４７〜５５（Ｈ２ａ）および５６〜６５（Ｈ２ｂ）をそれぞれ変異する２つのライブラリーを、この領域をカバーするように構築した。

軽鎖ＣＤＲ３変異体を作製するためのテンプレートは、９２位にＧｌｙを含んだ。しかし、その後、この軽鎖ＣＤＲ３の９２位が、Ｇｌｙであることが偶然に推察され、ゆえに、この位置にＧｌｙを伴なって構築されるヒト化ＬＭ６０９移植抗体がもたらされることが、決定された。本来のＬＭ６０９配列が９２位にＡｓｎを含むことが、後にわかった。ＬＭ６０９移植抗体のＣＤＲに変異を導入するための本明細書中に記載される方法を用いて、軽鎖ＣＤＲ３の９２位にＡｓｎを有するＬＭ６０９移植抗体が、α_ｖβ_３結合活性を有することが見出され（表９を参照のこと）、これによって、機能的ＬＭ６０９移植抗体としてのＡｓｎ^９２の検証が確認された。従って、９２位にＧｌｙを有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体であっても、Ａｓｎを有する軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体であっても、α_ｖβ_３の結合において活性である。

単一の変異をコードするオリゴヌクレオチドを、以前に記載されたように（Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出）、各ＣＤＲ位置でＮＮ（Ｇ／Ｔ）を導入することによって合成した。この抗体ライブラリーを、以前に記載されたハイブリダイゼーション変異誘発（いくつかの改変を伴う）によってＭ１３１ＸＬ６０４ベクターにおいて構築した（Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９１４−３９２０（１９９２）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７））。手短に言うと、このオリゴヌクレオチドを、ウリジニル化ＬＭ６０９移植抗体テンプレート（これから、対応するＣＤＲが除去される）に対して２０：１のモル比で、８５℃で５分間変性し、５５℃で１時間ランピング（ｒａｍｐｉｎｇ）し、５５℃で５分間保持し、次いで氷上で冷却することによってアニールした。この反応を、重合およびＤＨ１０Ｂへのエレクトロポレーションによって伸長し、そしてＸＬ−１ブルーのローン（ｌａｗｎ）上に滴定した。このライブラリーは改変体のプールからなり、各クローンはＣＤＲ位置の１つに単一アミノ酸変化を含む。コドン塩基の変異誘発を利用して、全てのＣＤＲの全ての位置を同時に変異させ、各ＣＤＲ残基における２０アミノ酸全ての引き続く発現を生じた（Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出）。ＣＤＲライブラリーは、２８８（Ｌ３）〜４１６（Ｌ１）のサイズの範囲の独特のメンバーであり、そして合計２３３６の改変体を含んだ。

初期ライブラリーの効率的なスクリーニングを可能にするために、高度に感受性のプラークリフトアッセイ（捕捉リフト（ｃａｐｔｕｒｅ ｌｉｆｔ）と呼ばれる）を使用する（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６（１９９８））。手短に言うと、ＬＭ６０９移植抗体改変体を発現するファージ発現ライブラリーを、改変したプラークリフトアプローチによって最初にスクリーニングし、ここでファージ感染細菌ローンに適用する前にニトロセルロースをヤギ抗ヒトκ抗体で予めコーティングし、そしてウシ血清アルブミンでブロックした。ファージ発現ＬＭ６０９移植抗体改変体Ｆａｂｓの捕捉に続いて、濾液を、１．０μｇ／ｍｌビオチン標識α_ｖβ_３と共に４℃で３時間インキュベートし、４回洗浄し、２．３μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と共に２５℃で１５分間インキュベートし、そして４回洗浄した。全ての希釈および洗浄を、結合緩衝液中で行った。α_ｖβ_３に結合した改変体を、０．４ｍＭの２，２’−ジ−ｐ−ニトロフェニル−５，５’−ジフェニル−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリドおよび０．３８ｍＭの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシホスフェート モノ−（ｐ−トルイジニウム）塩（ＪＢＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）を含む０．１ＭのＴｒｉｓ，ｐＨ９．５中で濾液を１０〜１５分間インキュベートすることによって同定したビオチン標識したα_ｖβ_３を産生するために、α_ｖβ_３レセプターを、以前に記載されたようにアフィニティークロマトグラフィーによってヒト胎盤から精製した（ＳｍｉｔｈおよびＣｈｅｒｅｓｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１８７２６−１８７３１（１９８８））。α_ｖβ_３をビオチン標識するために、精製したレセプターを、０．１％ ＮＰ−４０（結合緩衝液）を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０ｍＭのＣａＣｌ_２中に透析し、そして１００倍モル過剰のスルホスクシンイミドビオチンと共に４℃で３時間インキュベートした。この反応を、５０ｍＭのエタノールアミンの添加によって終結した。

ＬＭ６０９移植抗体改変体を発現したファージを、ヤギ抗ヒトκ鎖抗体でコートしたニトロセルロースフィルター上に選択的に捕捉し、ビオチン標識α_ｖβ_３で精査し、そしてＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼを用いて検出した。最初に、ビオチン標識α_ｖβ_３を、ＬＭ６０９移植抗体親分子のみを発現するファージを含むリフト上で滴定した。続いて、ビオチン標識α_ｖβ_３の濃度を減少させて、かろうじて認知可能なシグナルを得た。この様式において、より高い親和性改変体を発現するクローンのみが、改変体ライブラリーのスクリーニングの間に容易に同定された。各ライブラリーからの２５００以上のクローンの徹底的な捕捉リフトスクリーニングに続いて、より高い親和性の３００の改変体を同定した（表８を参照のこと）。改善された親和性を示す最大数のクローンを、全てのＣＤＲにおいて同定された改善された親和性を有する改変体を介して、Ｈ３（１８５）およびＬ３（５２）のＣＤＲにおいて同定した。

α_ｖβ_３結合活性を有することが捕捉リフトによって同定されたＬＭ６０９移植抗体改変体を、α_ｖβ_３への結合親和性、他のインテグリンを超えるα_ｖβ_３についての特異性、ならびにα_ｖβ_３会合および解離速度を決定するために、さらに特徴付けた。これらのアッセイについて、ＬＭ６０９移植抗体改変体の精製Ｆａｂを使用した。手短に言うと、Ｆａｂを、以前に記載されたように発現し、そして音響振動によって細胞膜周辺腔から放出した（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，前出，１９９７）。１リットルの培養物から収集した細胞を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０（１０ｍｌ）に溶解した。Ｆａｂを１ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ、これを２５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのグリシン（ｐＨ ８）で平衡化し、同じ緩衝液で洗浄し、そして１００ｍＭのグリシン（ｐＨ ３）の１０ｍｌで溶出して、１／１０の容積の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８）とした。精製Ｆａｂを、以前に記載したように定量化した（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，前出，１９９７）。

ＬＭ６０９移植抗体改変体を、α_ｖβ_３への結合、ならびにα_ｖβ_５およびα_ＩＩｂβ_３と比較したα_ｖβ_３の結合の特異性について試験した。固定化α_ｖβ_３ならびに関連するインテグリンα_ｖβ_５およびα_ＩＩｂβ_３についてのＦａｂのＥＬＩＳＡ滴定のために、Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩマイクロタイタープレートを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２中の１μｇ／ｍｌの精製レセプターでコートし、１回洗浄し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｃａｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２中の３％ ＢＳＡにおいて、２５℃で１時間ブロックした。血小板から精製したヒトα_ＩＩｂβ_３を、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から入手し、そしてα_ｖβ_５を、以前に記載したようにα_ｖβ_３を枯渇した胎盤抽出物から精製した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１００８−１１０１３（１９９０））。使用の直前に、このプレートを２回洗浄し、次いでＦａｂの種々の希釈物を用いて２５℃で１時間インキュベートした。このプレートを５回洗浄し、２０００倍に希釈したヤギ抗ヒトκアルカリホスファターゼを用いて２５℃で１時間インキュベートし、５回洗浄し、そして以前に記載したように展開した（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，前出，１９９７）。全ての希釈および洗浄を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、および１ｍＭ ＭｇＣｌ_２において行った。

表８：ＬＭ６０９移植抗体ＣＤＲライブラリーの捕捉リフトスクリ−ニング

^１ＤＮＡ配列に基づく独特のクローンの数。３２のコドンを使用して、各位置における２０のアミノ酸全てを表した。
^２ファージ発現ライブラリーを、ＸＬ−１ ブルー／寒天ローン上に、１００ｍｍの皿当たり５００〜１００のプラークにてプレーティングした。
^３陽性を、第２の捕捉リフトアッセイにおける最初のスクリーニングにおいて同定され、再 プレーティングされ、そして確認されたクローンとして規定した。
^４溶解性Ｆａｂを、ＥＬＩＳＡ型式において固定化α_ｖβ_３に対して滴定した。滴定プロフィールの変曲点の比較に基づいて、３倍増大した親和性を示すクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。
^５捕捉リフトによって同定された１８５の陽性クローンのうち９８を、固定化α_ｖβ_３への結合についてさらに特徴付けた。

図８は、固定化α_ｖβ_３についての抗体改変体およびＬＭ６０９移植抗体Ｆａｂの滴定を示す。ＬＭ６０９移植抗体を含む細菌細胞溶解物（黒丸）、改善された親和性を有し、一次ライブラリーから単離した改変体（Ｓ１０２、黒四角；Ｙ１００、白四角；およびＹ１０１、白三角）もしくはコンビナトリアルライブラリーから単離した改変体（黒三角）、または無関係のＦａｂ（白丸）を、固定化α_ｖβ_３について滴定した。

固定化α_ｖβ_３について滴定した改変体から得られた結合プロフィールの変曲点の比較は、複数のクローンが３倍より高く改善された親和性を示すことを実証し、これは半定量的な様式における捕捉リフトの利用の有効性を確証する（図８、四角および白三角を、黒丸と比較のこと）。捕捉リフトスクリーニングおよび引き続く固定化α_ｖβ_３への結合の特徴づけに基づいて、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの両方が、α_ｖβ_３のＬＭ６０９移植抗体改変体との相互作用に直接関連することを結論付けた。

ＤＮＡを、３倍より高く増大した結合を示すクローンから単離し、そして配列決定して、高親和性を生じる変異を同定した。ＤＮＡ配列決定を、単離した一本鎖ＤＮＡで行った。重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を、蛍光ジデオキシヌクレオチド終結法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって配列決定した。１０３の改変体の配列分析に基づいて、１４部位で培養された２３の独特の変異を同定した（表９）。有益な変異の部位の大部分を、重鎖ＣＤＲにおいて見出し、４つはＨ３に位置し、そしてＨ２（２ａと２ｂを合わせて）およびＨ１に各３つが位置していた。７つの異なりかつ有益なアミノ酸置換を、Ｈ３、チロシン残基１０２内の単一部位で同定した。この部位の置換の多様な性質は、チロシン残基１０２が、ＬＭ６０９移植抗体のα_ｖβ_３への結合を立体的に妨害し得ることを示唆する。この支持では、残基１０２のチロシンの代わりに他の芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、ヒスチジン、およびトリプトファン）を発現する改変体は、増大した結合についてのスクリーニングに続いて決して単離されなかった。

選択改変体の親和性を、さらに、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）を利用して精製されたＦａｂの固定化されたα_ｖβ_３との会合および分離速度を測定することによって特徴付けた。手短にいえば、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、α_ｖβ_３とＬＭ６０９移植抗体改変体との間の相互作用についての動力学的定数を決定するために使用した。精製されたα_ｖβ_３レセプターを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中の１５μｇ／ｍｌのα_ｖβ_３の３０μｌを注入することによって、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−活性化センサーチップに固定化した。会合速度定数（Ｋ_ｏｎ）を得るために、５つの異なるＦａｂ濃度（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２および１ｍＭのＭｇＣｌ_２中の５〜４０μｇ／ｍｌの範囲）における結合速度を、流速１０μｌ／分にて決定した。分離速度定数（Ｋ_ｏｆｆ）は、流速の増加（４０μｌ／分）における分離相を分析することによって得られた５つの測定結果の平均であった。センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１プログラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて分析した。残渣のＦａｂを、１０ｍＭのＨＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２および１ｍＭのＭｇＣｌ_２を用いる各測定の後に除去した。

表９は、改変体すべてが、ＬＭ６０９移植抗体親分子より低いＫｄを示し、捕捉リフト（ｃａｐｔｕｒｅ ｌｉｆｔ）およびＥＬＩＳＡの両方と一致することを示す。会合および分離速度の分析は、改変された改変体の大部分がより遅い分離速度を有する一方で、同様な会合速度を有することを明らかにした。例えば、ＬＭ６０９移植抗体は、会合速度１８．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１を有する一方で、改変体は、１６．７〜３１．８×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１の範囲であった。対照的に、すべてのクローンは、ＬＭ６０９移植抗体（４．９７×１０^−３ｓ^−１）より遅く分離し、分離速度は、１．６倍（３．０３×１０^−３ｓ^−１）〜１１．８倍（０．４２×１０^−３ｓ^−１）遅い範囲である。

これらの結果は、単一のアミノ酸置換基をＬＭ６０９移植抗体ＣＤＲに導入することが、親ＬＭ６０９移植抗体よりも、α_ｖβ_３について高い親和性を有する改変されたＬＭ６０９移植抗体を同定することを可能にすることを実証する。

（実施例ＶＩＩ）
（高親和性ＬＭ６０９移植抗体の産生）
この実施例は、α_ｖβ_３へのより高い親和性結合を生じる、ＬＭ６０９移植抗体のＣＤＲにおける単一のアミノ酸の変異を組合わせ、高親和性ＬＭ６０９移植抗体を産生し得ることを示す。

ＬＭ６０９移植抗体の有益な変異のすべてのランダムな組み合わせは、＞１０^５改変体を含むコンビナトリアルライブラリーを産生し、これは、有効なスクリーニング方法論を必要とする。したがって、＞１０倍増強された親和性を示すクローンが互いに迅速に区別され得るか否かを決定するために、３〜１３倍の増強された親和性を示す改変体を、低濃度のビオチン化α_ｖβ_３を利用する捕捉リフトによって評価した。広範囲の濃度のα_ｖβ_３を用いて繰り返し試みたにも関わらず、捕捉リフトシグナルにおける一貫した差異は、観測されなかった。このために、より小さいコンビナトリアルライブラリーを構築し、続いて、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。

４つの異なるコンビナトリアルライブラリーを、２つの部位ハイブリダイゼーション変異誘発を利用することによって達成され得る最適数の組み合わせを評価するために構築した（図９）。手短にいえば、コンビナトリアルライブラリーを、野生型および有益な重鎖変異（Ｈ２、Ｌｅｕ^６０→Ｐｒｏ；Ｈ３、Ｔｙｒ^９７→Ｈｉｓ；Ｈ３、Ａｌａ^１０１→Ｔｙｒ；Ｈ３、Ｔｙｒ^１０２→Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ）の両方をコードする変質性オリゴヌクレオチドを合成することによって構築した。上記のように、２つの部位ハイブリダイゼーション変異誘発を利用することによって、オリゴヌクレオチドを、４０：１のモル比にてＬＭ６０９移植抗体および３つの軽鎖変異（図９；Ｌ１、Ｈｉｓ^３２→Ｐｈｅ；Ｌ３、Ｇｌｙ^９２→Ａｓｎ；Ｌ３、Ｈｉｓ^９６→Ｌｅｕ）から調製されたウリジン化テンプレートにアニーリングした。結果として、総２５６改変体を、４つのコンビナトリアルライブラリーサブセットにおいて合成した。

図９は、有益な変異のコンビナトリアルライブラリーの構築を示す。ＬＭ６０９移植抗体および３つの最適な軽鎖改変体（Ｆ３２、Ｎ９２、およびＬ９６）からのウリジン化テンプレートを調製した。２つの部位ハイブリダイゼーションを、２つの変性オリゴヌクレオチドを用いて実行し、これを設計して４つの異なる重鎖残基において有益な変異を導入した。

ＬＭ６０９移植抗体および３つの軽鎖改変体（表９；Ｆ３２、Ｎ９２およびＬ９６）のウリジン化テンプレート、野生型残基をコードする変性オリゴヌクレオチドおよび最も有益な重鎖変異（表９；ｐ６０、Ｈ９７、Ｙ１０１、Ｓ１０２、Ｔ１０２、Ｄ１０２、Ｅ１０２、Ｍ１０２、Ｇ１０２、およびＡ１０２）の以下の調製物を、軽鎖テンプレートにハイブリダイズして、４つのコンビナトリアルライブラリーを提供し、各々は、６４の独自の改変体を含有した。潜在的に、複数の変異の組み合わせは、親和性に対して有害な効果を有し得、従って、有益な組み合わせの同定を妨げ、わずかな部位における変異を生じ得る。この理由のために、ＬＭ６０９移植抗体親分子によって発現されたアミノ酸は、コンビナトリアルライブラリー中の各位置において含まれた。このアプローチを利用することによって、３つのＣＤＲ（Ｈ２およびＨ３と各々組み合わせたＬ１またはＬ３）の同時のコンビナトリアル変異誘発を達成した。配列分析に基づいて、２つの部位ハイブリダイゼーション変異誘発を、約５０％の効率で達成した。

コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために、可溶性Ｆａｂを、発現しかつランダムに選択されたクローンで感染された小スケール（＜１ｍｌ）の細菌培養物のペリプラズムから放出した。可変の発現レベルを観察したが、非精製の改変体の均一な量を、重鎖のカルボキシ末端上に存在するペプチドタグを通してマイクロタイタープレート上で捕捉した。手短にいえば、コンビナトリアルＬＭ６０９移植抗体ライブラリーを、小スケールの細菌培養物で産生された抗体改変体の相対的親和性の決定を可能にするＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（Ｗａｔｋｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：３７−４５（１９９７））。Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を、１０μｇ／ｍｌの７Ｆ１１モノクローナル抗体でコーティングし、これにより、ＬＭ６０９移植抗体改変体重鎖のカルボキシ末端上のペプチドタグを認識する（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５（１９８８））。Ｅ．ｃｏｌｉ．溶解物からのＦａｂの捕捉の後、プレートを０．５〜１μｇ／ｍｌのビオチン化α_ｖβ_３と共に２５℃にて１時間インキュベートした。このプレートを７回洗浄し、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共に２５℃にて１５分間インキュベートし、７回洗浄し、そして上記されるように（Ｗａｔｋｉｎｓら、前出、１９９７）展開した。すべての希釈および洗浄は、結合緩衝液中で行った。

上記されるように（Ｗａｔｋｉｎｓら、前出、１９９７）、このＥＬＩＳＡスクリーニング方法は、ビオチン化α_ｖβ_３およびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼと共のインキュベーションの後、改変体の相対親和性の迅速かつ直接の比較を可能にした。十分なＦａｂ多様性がサンプリングされたことを確実にするために、１０００のランダムに選択されたクローンを各コンビナトリアルライブラリーからスクリーニングした。増強されたＥＬＩＳＡシグナルを示す改変体を、固定化α_ｖβ_３に結合するためにさらに特徴付け（図８、黒三角）、そして変異を同定するために配列決定した（表１０）。

４つのコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより、最初のライブラリーのスクリーニングにおいて同定される個々の変異に対して有意に結合を改善する変異の１４個の独特な組み合わせを同定した。１次スクリーニングからの最も良いクローンは、１２．５倍の親和性の増加を有するが、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることから単離される１４個の独特な組み合わせは、親ＬＭ６０９移植抗体より大きい、１８〜９２倍の範囲の親和性を示した。Ｈ２変異およびＨ３変異からなるこれらの改変の大多数は、Ｌ１変異およびＬ３変異と組み合わせた。野生型軽鎖との重鎖変異の有益な組み合わせもまた同定されるが、他のコンビナトリアル改変体と同じ程度まで改善された親和性を生じなかった。改変体は、主に２〜４の変異を含み、１つのクローン（Ｃ２９）は、５つの変異を含んだ。各改変体における変異の総数と得られた親和性との間に直接の相関を観察しなかった。例えば、クローンＣ３７の結合は、親分子に対して９２倍増強され、そして３つの変異の組み合わせを通じて達成したが、クローンＣ２９は、５つの変異の組み合わせを通じて約５５倍大きい親和性を達成した。わずか２つの変異の組み合わせから得られる、５０倍より大きい増強された親和性を示す複数の改変体を、同定した（２Ｇ４、１７、およびＶ３５７Ｄ）。

改善された親和性を有するコンビナトリアルクローンの全ては、１０倍より遅い解離速度を示し、おそらくスクリーニングにおける長いインキュべーション工程により導入される選択の偏りを反映した。さらに、Ｌ９６軽鎖の変異に基づくライブラリーから単離されるコンビナトリアル改変体の全てはまた、２〜４倍大きい会合速度を示した。以前、抗体レパートリーは、インビボの親和性成熟の間に、より高い会合速度を示す免疫グロブリンに移動することを示した（ＦｏｏｔｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：５３０−５３２（１９９１））。従って、改変体のＬ９６サブセットは、Ｂリンパ球増殖が、速度論的選択に供されるインビボの親和性変異プロセスをより厳密に模倣し得る。

ＬＭ６０９移植抗体は、特異的にα_Ｖβ_３複合体に結合し、そして別々にα_Ｖ鎖またはβ_３鎖のいずれも認識しない。改変体をさらに特徴付けるために、クローンを、関連するインテグリン（α_ＩＩｂβ_３およびα_Ｖβ_５）との反応性についてスクリーニングした。試験される全ての改変体は、α_ＩＩｂβ_３およびα_Ｖβ_５の両方と反応せず、Ｆａｂおよびレセプターの相互作用を実質的に変更しない改善された結合と一致した。

改変体の親和性の増加は、より大きい生物学的活性を生じるかどうかの決定に対する第１の工程として、親和性の範囲を示す改変体を、固定されたα_Ｖβ_３レセプターに対する天然のリガンド、フィブリノゲン、の結合を阻害する能力についてアッセイした。簡単には、ＬＭ６０９移植抗体改変体を、ビオチン化ヒトフィブリノゲンの結合（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、０．５μｇ／ｍｌ ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎアルカリホスファターゼ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２２６７−１２２７１（１９９０））を用いて検出したことを除いて、以前記載されるようにリガンド結合の阻害について試験した。

これらの競合アッセイの結果を、図１０に示す。図１０Ａは、固定されたα_Ｖβ_３に対するフィブリノゲン結合の阻害を示す。固定されたα_Ｖβ_３を、０．１μｇ／ｍｌビオチン化フィブリノゲンおよび種々の濃度の、ＬＭ６０９移植抗体（白丸）、Ｓ１０２（黒丸）、Ｆ３２（白三角）、またはＣ５９（黒三角）と共に、３時間、３７℃でインキュベートした。結合してないリガンドおよびＦａｂを、洗浄により除去し、そして結合したフィブリノゲンを、ＮｅｕｔｒｏＡｖｉｄｉｎアルカリホスファターゼ結合体と共にインキュべーション後、定量した。図１０Ｂは、フィブリノゲン結合の阻害と、改変体の親和性との相関を示す。固定されたα_Ｖβ_３へのフィブリノゲンの結合を５０％まで阻害するのに必要とされる改変体の濃度（ＩＣ_５０）を、親和性（Ｋｄ）の関数としてプロットした。

図１０Ａにおいて示されるように、より高い親和性の改変体は、レセプターのリガンド結合部位をブロックするのにより有効であった（ＬＭ６０９移植抗体（白丸）を任意の改変体と比較する）。０．３〜２７ｎｍの範囲の親和性（Ｋｄ）を示す１０個の改変体の引き続く分析は、親和性と、フィブリノゲンの結合を阻害する能力との間に優れた相関（ｒ^２＝０．９７６）を示した（図１０Ｂ）。さらに、改変体を、レセプターに対するビトロネクチンの結合の阻害について試験した。フィブリノゲンと類似して、改変体は、親分子より相互作用を阻害するのにより有効であった。従って、関連するインテグリンレセプターとの交差反応性研究と一致して、親和性を増加する変異体は、抗体がレセプターと相互作用する様式を実質的に変更するようではなかった。

α_Ｖβ_３レセプターを発現するＭ２１ヒト黒色腫細胞のフィブリノゲンへの接着を阻害する改変体の能力を、試験した。ＬＭ６０９移植抗体改変体によるフィブリノゲンへの４×１０^４ Ｍ２１細胞の接着の阻害を、以前に記載されるように実施した（Ｌｅａｖｅｓｌｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１７：１１０１−１１０７（１９９２））。精製されたフィブリノゲンおよびα_Ｖβ_３レセプターを用いたリガンドの競合研究と類似して、より高い親和性の改変体が、ＬＭ６０９移植抗体であるよりも細胞接着を阻害するのに一般的により有効であった（図１１）。図１１は、フィブリノゲンへのＭ２１ヒト黒色腫細胞接着の阻害を示す。細胞および種々の濃度の、ＬＭ６０９移植抗体Ｆａｂ（黒三角）、Ｓ１０２（白丸）、Ｇ１０２（黒丸）、またはＣ３７（白三角）を、１０μｇ／ｍｌフィブリノゲンを用いてコートされた９６ウェル細胞培養プレートに添加した。３７℃にて３５分間のインキュベーション後、結合されない細胞を、洗浄により除去し、接着細胞を、クリスタルバイオレット染色により定量した。

インタクトなＬＭ６０９移植抗体Ｉｇは細胞接着を阻害するが、Ｆａｂを発現するファージは、１ｍｇ／ｍｌもの高濃度で、細胞接着に影響しなかった（図１１、黒三角）。コンビナトリアルライブラリーから単離され、かつＬＭ６０９移植抗体Ｆａｂより約９０倍高い親和性を示すクローンＣ３７は、細胞接着を完全に阻害した（図１１、白三角）。改変体Ｇ１０２は、中程度に高い親和性（２．２倍増強された）を有し、そして細胞接着を阻害したが、Ｃ３７ほど有効的ではなかった（図１１、黒丸）。驚くべきことに、ＬＭ６０９移植抗体より４．６倍高い親和性を有する、クローンＳ１０２（図１１、白丸）は、細胞接着を阻害するのに有効ではなく、クローンＧ１０２およびＳ１０２は、異なってα_Ｖβ_３レセプターと相互作用することを示唆した。

これらの結果は、α_Ｖβ_３へのより高い結合親和性を示すＬＭ６０９移植抗体を生じる、単一のアミノ酸変異を組み合わせることによって、親ＬＭ６０９移植抗体より９０倍より高い結合親和性を有する高い親和性のＬＭ６０９移植抗体変異体の同定が可能となることを示す。

（実施例ＶＩＩＩ）
（高い親和性の増強されたＬＭ６０９移植抗体の生成）
この実施例は、増大した安定性を有する高い親和性の増強されたＬＭ６０９移植抗体の生成を記載する。

高い親和性のクローン６Ｈ６（実施例ＶＩＩにおける表１０を参照のこと）を、さらに特徴付け、そして、いくつかのタンパク質分解を示すことを見出した。従って、増大した安定性を有する改変体を同定するために、３２個のコドンの改変体を、６Ｈ６の重鎖ＣＤＲ３（配列番号９４）中の、位置Ａｓｎ^９６およびＨｉｓ^９７（Ｋａｂａｔら（前出）に従って番号付けした）の各々で、同時に導入し、そして改変体を、α_Ｖβ_３結合活性についてスクリーニングした。結合活性を保持するこれらの改変体を、配列決定し、次いで、タンパク質分解に対する感受性についてスクリーニングした。改変体６Ｈ６ＬＨを、α_Ｖβ_３結合活性およびタンパク質分解に対する耐性を示すとして同定した（表１１および１５を参照のこと）。高い親和性α_Ｖβ_３結合活性を有する６Ｈ６ＬＨ改変体は、Ａｓｎ^９６の代わりにＬｅｕを有したが、Ｈｉｓ^９７を保持した。

６Ｈ６ＬＨ改変体は、α_Ｖβ_３への高い親和性結合を示したが、この親和性は、６Ｈ６改変体よりいくらか低かった（表１５を参照のこと）。従って、高い親和性結合を与えることが見出されたＣＤＲ変異体を、６Ｈ６ＬＨ改変体を組み合わせた。具体的に、６Ｈ６の軽鎖ＣＤＲ１中のＨｉｓ^３２を、クローンＦ３２（表９を参照のこと）におけるように、Ｐｈｅに変異させて、クローン２２３６／６Ｈ６ＬＨを作製した（表１３を参照のこと）。さらなる改変体において、６Ｈ６の重鎖ＣＤＲ２中のＬｅｕ^６１をまた、クローンＰ６０（表９を参照のこと）におけるように、Ｐｒｏに変異させて、クローン２２３６−３８／６Ｈ６ＬＨ（表１１を参照のこと）を作製した。

表１１および１２には、それぞれ、６Ｈ６の増強された高い親和性改変体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が示される。表１３および１４には、それぞれ、６Ｈ６の増強された高い親和性改変体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が示される。示されるＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ（前出）による。６Ｈ６改変体とは異なるアミノ酸およびコドンを太字で示す。

α_Ｖβ_３結合の速度論を、本質的に実施例ＶＩに記載されるような表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用して、各クローンについて、決定した。これらのクローンの結合速度論および親和性を、表１５に示す。

表１５に示されるように、クローン６Ｈ６ＬＨ、２２３６／６Ｈ６ＬＨ、および２２３６−３８／６Ｈ６ＬＨは、６Ｈ６に類似する親和性を有した。これらの実験における６Ｈ６に対する親和性は、０．６２ｎＭであり、先の実験において観測された０．４ｎＭと比較した（実施例ＶＩＩの表１０を参照のこと）。この差は、観測されたｋ_ｏｎに起因し、これは、実験の変動内である。オン速度は、６Ｈ６、６Ｈ６ＬＨ、２２３６／６Ｈ６ＬＨ、および２２３６−３８／６Ｈ６ＬＨ間で非常に類似した。観測されたｋｄにおける小さな差は、ｋ_ｏｆｆにおける差に、主として起因するようであった。

これらの結果は、α_Ｖβ_３に対する高い親和性および蛋白分解に対する耐性を示す、さらなる増強されたＬＭ６０９移植抗体を記述する。

本出願を通して、種々の刊行物を参照してきた。これらの刊行物の開示は、それらの全体において、本発明が属する技術水準をより完全に記述するために、本出願において、本明細書中で参考として援用される。

本発明を、開示された実施形態を参照して記載してきたが、当業者は、詳述された特定の実施形態が、本発明を例示するのみであることを容易に理解する。種々の改変が、本発明の意図から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、上記の特許請求の範囲によってのみ制限される。

Claims (33)

1. α_ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号１０４で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；および配列番号１１０で示されるＶ_ＬＣＤＲ１からなる群から選択されるＣＤＲを含む、増強されたＬＭ６０９移植抗体。
2. 前記機能的フラグメントが、Ｆ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項１に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
3. 請求項１に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と実質的に同一の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
4. α_ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３４で示されるＶ_ＨＣＤＲ１；配列番号１０２で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；配列番号１０８で示されるＶ_ＬＣＤＲ１；配列番号１１２で示されるＶ_ＬＣＤＲ２；および配列番号９０で示されるＶ_ＬＣＤＲ３を含む、増強されたＬＭ６０９移植抗体。
5. 前記機能的フラグメントがＦ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項４に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
6. 請求項４に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と実質的に同一の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
7. α_ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３４で示されるＶ_ＨＣＤＲ１；配列番号１０２で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；配列番号１１０で示されるＶ_ＬＣＤＲ１；配列番号１１２で示されるＶ_ＬＣＤＲ２；および配列番号９０で示されるＶ_ＬＣＤＲ３を含む、増強されたＬＭ６０９移植抗体。
8. 前記機能的フラグメントがＦ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項７に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
9. 請求項７に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と実質的に同一の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
10. α_ｖβ_３に対して選択的結合親和性を示す増強されたＬＭ６０９移植抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３４で示されるＶ_ＨＣＤＲ１；配列番号１０４で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；配列番号１１０で示されるＶ_ＬＣＤＲ１；配列番号１１２で示されるＶ_ＬＣＤＲ２；および配列番号９０で示されるＶ_ＬＣＤＲ３を含む、増強されたＬＭ６０９移植抗体。
11. 前記機能的フラグメントがＦ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項１０に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
12. 請求項１０に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と実質的に同一の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
13. 請求項１に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸分子。
14. 前記核酸分子が、配列番号１０３、配列番号１０５、および配列番号１０９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸分子。
15. 請求項４に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸分子。
16. 請求項１５に記載の核酸分子であって、該核酸分子が、Ｖ_ＨＣＤＲ１をコードする配列番号３３で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ２をコードする配列番号１０１で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ３をコードする配列番号１０５で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ１をコードする配列番号１０７で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ２をコードする配列番号１１１で示されるヌクレオチド配列；およびＶ_ＬＣＤＲ３をコードする配列番号８９で示されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
17. 請求項７に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸分子。
18. 請求項１７に記載の核酸分子であって、該核酸分子が、Ｖ_ＨＣＤＲ１をコードする配列番号３３で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ２をコードする配列番号１０１で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ３をコードする配列番号１０５で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ１をコードする配列番号１０９で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ２をコードする配列番号１１１で示されるヌクレオチド配列；およびＶ_ＬＣＤＲ３をコードする配列番号８９で示されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
19. 請求項１０に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体をコードする核酸分子。
20. 請求項１９に記載の核酸分子であって、該核酸分子が、Ｖ_ＨＣＤＲ１をコードする配列番号３３で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ２をコードする配列番号１０３で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＨＣＤＲ３をコードする配列番号１０５で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ１をコードする配列番号１０９で示されるヌクレオチド配列；Ｖ_ＬＣＤＲ２をコードする配列番号１１１で示されるヌクレオチド配列；およびＶ_ＬＣＤＲ３をコードする配列番号８９で示されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
21. α_ｖβ_３の機能を阻害する方法であって、α_ｖβ_３を、請求項１に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と接触させる工程を包含する、方法。
22. α_ｖβ_３の機能を阻害する方法であって、α_ｖβ_３を、請求項４に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と接触させる工程を包含する、方法。
23. α_ｖβ_３の機能を阻害する方法であって、α_ｖβ_３を、請求項７に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と接触させる工程を包含する、方法。
24. α_ｖβ_３の機能を阻害する方法であって、α_ｖβ_３を、請求項１０に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体と接触させる工程を包含する、方法。
25. 抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号１０４で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；および配列番号１１０で示されるＶ_ＬＣＤＲ１からなる群から選択されるＣＤＲを含み、そしてＬＭ６０９と比較して、α_ｖβ_３に対する増強された結合親和性を示す、抗体。
26. 前記機能的フラグメントが、Ｆ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項２５に記載の抗体。
27. 抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３４で示されるＶ_ＨＣＤＲ１；配列番号１０２で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；配列番号１０８で示されるＶ_ＬＣＤＲ１；配列番号１１２で示されるＶ_ＬＣＤＲ２；および配列番号９０で示されるＶ_ＬＣＤＲ３を含み、そしてＬＭ６０９と比較して、α_ｖβ_３に対する増強された結合活性を示す、抗体。
28. 前記機能的フラグメントが、Ｆ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項２７に記載の抗体。
29. 抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３４で示されるＶ_ＨＣＤＲ１；配列番号１０２で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；配列番号１１０で示されるＶ_ＬＣＤＲ１；配列番号１１２で示されるＶ_ＬＣＤＲ２；および配列番号９０で示されるＶ_ＬＣＤＲ３を含み、そしてＬＭ６０９と比較して、α_ｖβ_３に対する増強された結合活性を示す、抗体。
30. 前記機能的フラグメントが、Ｆ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項２９に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
31. 抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号３４で示されるＶ_ＨＣＤＲ１；配列番号１０４で示されるＶ_ＨＣＤＲ２；配列番号１０６で示されるＶ_ＨＣＤＲ３；配列番号１１０で示されるＶ_ＬＣＤＲ１；配列番号１１２で示されるＶ_ＬＣＤＲ２；および配列番号９０で示されるＶ_ＬＣＤＲ３を含み、そしてＬＭ６０９と比較して、α_ｖβ_３に対する増強された結合活性を示す、抗体。
32. 前記機能的フラグメントが、Ｆ_Ｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２およびｓｃＦＶからなる群から選択される、請求項３０に記載の増強されたＬＭ６０９移植抗体。
33. 配列番号３３、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、および配列番号１１１からなるヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を有する、核酸分子。

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