KR20010099583A

KR20010099583A - 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법및 그 제제

Info

Publication number: KR20010099583A
Application number: KR1020000049344A
Authority: KR
Inventors: 이희용; 이혜숙; 김정수; 김상범; 이지숙; 최호일; 장승구
Original assignee: 최호일; 주식회사 펩트론
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2001-11-09
Also published as: KR100452752B1

Abstract

본 발명은 펩타이드, 단백질 또는 이를 주요성분으로 하는 약물의 서방성 미세 입자 제형의 제조방법 및 그 제형에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 이온성 작용기를 갖는 생분해성 고분자 또는 이온성 작용기를 갖는 물질과 생분해성 고분자로 이루어진 다공성 미세 입자에 단백질 등의 약물을 이온상호작용에 의하여 합체(incorporation)시킴으로써 기존에 사용되던 봉입과정에서 나타나는 단백질 약물의 변성이나 비가역적 응집(aggregation) 현상 등을 방지할 수 있다. 다공성 미세 입자의 이온성 작용기의 종류는 봉입하고자 하는 단백질의 물리적 특성, 즉 등전점(isoelectric point; pI)에 따라 단백질과 이온 상호작용을 할 수 있도록 양이온성 또는 음이온성으로 조절한다.

Description

단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법 및 그 제제{Preparation Method of sustained release dosage forms of protein or peptide drugs and the drugs prepared by that method}

본 발명은 체내에서 단백질 약물이 생물학적 활성을 유지하면서, 지속적이고 균일하게 체내로 방출될 수 있도록 제제화된 서방성 제형 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 명세서 및 청구범위에서 "단백질 약물"이라 함은 단백질 또는 펩타이드 또는 이를 주요성분으로 함유하는 약물을 포괄하는 의미로, "단백질"이라 함은 단백질 또는 펩타이드를 포괄하는 의미로 사용한다. 단백질 또는 펩타이드 약물은 대다수가 구강 투여시 위의 산성 환경 하에서 활성 구조를 잃게 되거나 효소적 분해로 인하여 파괴되고 또한 위 또는 장 점막에서 흡수되는 비율도 상당히 낮다. 이로 인해 대부분의 단백질 또는 펩타이드 약물은 비경구 투여, 즉 정맥주사, 피하주사, 근육주사 등의 방법으로 투여되는데 이러한 경로로의 투여 후에도 생체 내에서의짧은 반감기로 인해 반복적으로 계속 주사하여야 한다. 특히 단백질 또는 펩타이드 약물의 경우 수개월 동안의 장기간 투여를 필요로 하는 경우가 많아 생분해성 고분자를 이용한 지속성, 서방성 제형 연구가 활발히 진행되고 있다(Heller, J.et al., Controlled release of water-soluble macromolecules from bioerodible hydrogels,Biomaterials,4, 262-266 (1983); Langer, R., New methods of drug delivery,Science, 249, 1527-1533 (1990); Okada, H. and Toguchi, H., Biodegradable microspheres in drug delivery,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12, 1-99 (1995)).

단백질 또는 펩타이드 약물의 서방성 주사 제형은 이들 약물을 생체 분해성 고분자 매트릭스 물질로 둘러싼 형태의 미세 입자로 만들어, 매트릭스 물질이 체내에서 분해되어 천천히 제거되면서 약물이 서서히 방출되도록 한 것이다. 이러한 생체 분해성 고분자로는 폴리락타이드(Polylactide, PLA), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide, PGA), 이들의 공중합체인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(Poly(lactide-co-glycolide), PLGA) 등의 폴리에스테르(Polyester), 폴리오르토에스테르(Poly-ortho-ester), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리하이드록시부티르산(Polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트(Polyalkylcarbonate) 등의 합성고분자를 비롯하여 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린 등의 단백질류, 알긴산, 키틴, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 전분 등의 다당류의 천연 고분자 등이 있다. 이들 고분자 중에서도 PLA, PGA, PLGA 등의 폴리에스테르 계열은 체내에서 가수분해되어 인체에 무해한 젖산과 글리콜산으로 대사되어 생체 적합성과 안정성이 인정된 물질이고, 생체 분해 속도도 고분자의 분자량, 두 단량체의 비율, 물과의 친화성 등에 따라 짧게는 1-2주에서 길게는 1-2년까지 다양하게 조절할 수가 있어 약물의 서방성 제형에 가장 많이 사용되어 왔다(DeLuca, P. P.et al., Biodegradable polyesters for drug and polypeptide delivery, in: El-Nokaly, M. A., Piatt, D. M., and Charpentier, B. A. (Eds.), Polymeric delivery systems, properties and applications,American Chemical Society, pp. 53-79 (1993); Park, T. G., Degradation of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres: effect of copolymer composition,Biomaterials, 16, 1123-1130 (1995); Anderson, J. M. and Shive, M. S., Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres,Adv. Drug. Del. Rev., 28, 5-24 (1997); Tracy, M. A.et al., Factors affecting the degradation rate of poly(lactide-co-glycolide) microspheres in vivo and in vitro,Biomaterials, 20, 1057-1062 (1999)).

약물의 미세 입자(microsphere 또는 microparticle) 내로의 봉입(encapsulation) 방법은 코아세르베이션 또는 유탁액 상분리, 분무 건조에 의한 캡슐화 및 유기 또는 수상 중의 용매 증발법 등이 있는데 이러한 방법이 단백질 약물의 봉입에도 적용되어 연구되어 왔다(McGee, J. P.et al., Zero order release of protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) microparticles prepared using a modified phase separation technique,J. Controlled Rel., 34, 77-86 (1995); Gander, B.et al., Quality improvement of spray-dried, protein-loaded D,L-PLA microspheres by appropriate polymer solvent selection,J. Microencapsul., 12, 83-97 (1995); O'Donnell, P. B. and McGinity, J. W., Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique,Adv. Drug Del. Rel., 28, 25-42 (1997)). 대부분의 단백질 약물은 수용성이기 때문에 상기 방법중 이중 에멀젼 용매 증발법 (W/O/W 또는 double emulsion solvent evaporation)이 단백질 약물 함유 서방성 미세 입자 제조에 많이 이용되어 왔다. 이 방법은 단백질 또는 수용성 약물이 용해되어 있는 수용액상을 PLGA 등이 용해되어 있는 유기용매 상에 가한 후 초음파분쇄기 또는 호모게나이저 등의 기구를 사용하여 일차 에멀젼을 만든 후 이를 폴리비닐알코올 등의 계면 활성제를 함유하는 2차 수용액상에 분산시킴으로써 이차 에멀젼을 만든다. 이 시스템에 가열 또는 감압 조건을 가하여 유기용매를 제거하면 PLGA가 고형화되면서 미세 입자가 되고 이 입자들을 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 회수한 후 동결 건조하여 단백질 약물이 함유된 생분해성 미세 입자를 얻게 된다. 그렇지만, 이러한 미세 입자 제조 과정에서 단백질 약물이 수용액과 유기용매의 경계면에 위치하고 초음파 분쇄 또는 호모게나이제이션 등의 가혹 조건에서 단백질의 변성, 비가역적 응집 현상들이 일어나게 된다. 결과적으로 이렇게 해서 만들어진 미세 입자로부터 단백질은 전체 약물의 수십 %가 초기 과다 방출되고 이어 수 일 내지 수십 일간 거의 방출되지 않다가 후기에 약간 방출량이 증가하는 경향을 보인다(Kim, H. K. and Park, T. G.,Biotechnol. Bioeng., 65, 659-667 (1999); Crotts, G. and Park, T. G.,J. Microencapsul., 15, 699-713 (1998)).

그러므로, 현재 단백질의 서방성 미세 입자 제형 연구는 단백질의 봉입과정 중에 나타나는 변성과 비가역적 응집현상을 최소화하려는 연구에 초점이 맞추어 진행되고 있다.

이중 한가지 방법으로 단백질의 수용성 용액에 안정화제를 첨가하는 방법이 있는데 트리할로오스, 만니톨, 덱스트란, 헤파린, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용함으로써 어느 정도 안정화 효과를 얻은 연구들이 보고되었다(미국 특허 제 5,804,557호; Cleland, J. L. and Jones, A. J. S.,Pharm. Res.,13, 1464-1475 (1996); Cleland, J. L.et al.,Pharm. Res.,14, 420-425 (1997); Pean, J. M.et al.,Pharm. Res., 16, 1294-1299 (1999); Sanchez, A.et al.,Int. J. Pharm.,185, 255-266 (1999); Lavelle, E. C.et al.,Vaccine,17, 516-529 (1999)). 이러한 안정화제들은 단백질 주변에 수화층을 형성함으로써 단백질과 유기용매와의 상호작용을 줄여 단백질의 변성 및 비가역적 응집을 어느 정도 막아준다.

단백질 약물을 수용액에 용해시키는 대신 분말 상태로 바로 유기용매에 균일 상태로 분산시키기도 하는데(Cleland, J. L. and Jones, A. J. S., Stable formulations of recombinant human growth hormone and interferon-γ for microencapsulation in biodegradable microspheres, 13, 1464-1475 (1996); Iwata, M. et al., Particle size and loading efficiency of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) multiphase microspheres containing water soluble substances prepared by the hydrous and anhydrous solvent evaporation methods,J. Microencapsul., 16, 49-58 (1999)), 이 공정에서도 단백질 약물은 이차 에멀젼 과정에서 유기용매 존재 하에서 수용성의 환경에 접하게 되어 어느 정도의 변성을 피할 수 없게 된다. 그러므로, 상기의 두 방법에 의한 단백질 함유 미세 입자의 제조 과정에서 어느 정도의 안정화 효과를 얻을 수는 있지만 단백질 약물의 변성 및 비가역적 응집 현상을 완벽하게 막아줄 수는 없다.

이와는 전혀 다른 시도로 이미 만들어진 다공성의 생분해성 미세 입자를 단순히 단백질 수용액에 담가 두어 흡착(adsorption) 반응에 의해 단백질 약물을 합체시키는 방법이 시도되었다(Duggirala, S.S. et al.,Pharm. Dev. Technol., 1, 11-19 (1996); Duggirala, S. S. et al.,Pharm. Dev. Technol., 1, 165-174 (1996); Schrier, J. A. and DeLuca, P. P.,Pharm. Dev. Technol., 4, 611-621 (1999)). 이러한 방법에서는 단백질 약물의 합체과정중 유기용매를 전혀 사용하지 않기 때문에 단백질 약물의 활성 상태를 그대로 유지할 수가 있다. 상기 방법은 비록 재조합 인간 골형성 촉진 단백질-2 (Bone morphogenetic protein-2) 등의 합체에 성공적으로 적용되었지만 단백질의 함유량이 0.1% 정도 즉, 미세 입자 1g당 단백질 1mg 정도로 함유량이 너무 낮다는 한계가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 문제점들을 극복하고 생체 내에서 단백질 약물이 생물학적 활성을 유지하면서, 지속적이고 균일하게 방출될 수 있도록 제제화된 서방성 제형 및 그 제조방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 단위 중량 미세 입자당의 단백질의 함유량이 획기적으로 높아진 서방성 제형 및 그 제조 방법을 제공하려는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생분해성 미세 입자가 포함하는 이온성 작용기를 다양하게 선별함으로써 물리적 특성, 특히 그의 등전점에 따라 여러가지 pH에서 이온성이 다른 다양한 단백질 약물에 포괄적으로 적용될 수 있는 단백질 함유 서방성 미세 입자 제형을 제공하려는 것이다.

도 1a,b는 본 발명에 의한 단백질 약물을 양이온성 또는 음이온성 작용기를 함유한 생분해성 미세입자와 이온성 상호작용으로 합체하는 원리를 도식화한 도표로서 도 1a는 본 발명의 일 실시예에 의하여 음이온성 작용기를 함유하는 미세 입자에 양이온성 단백질 약물을 합체시키는 것, 도1b는 본 발명의 일 실시예에 의하여 양이온성 작용기를 함유하는 미세 입자에 음이온성 단백질 약물을 합체시키는 것을 도식화한 것이다.

도 2a,b,c는 본 발명에 의해 제조된 다공성의 생분해성 미세 입자의 광학 현미경사진으로서 도 2a는 제형-2의 미세 입자, 도 2b는 제형-7의 미세 입자, 도 2c는 제형-7의 미세 입자에 인간 성장 호르몬(HGH)이 16.83%의 함유율로 합체된 후의 미세 입자.

도 3은 본 발명에 의해 제조된 제형-2의 미세 입자에 모델 단백질인 라이소자임의 합체량에 대한 합체시간 및 반응시의 온도의 영향을 나타내는 도표이다.

도 4는 본 발명에 의해 제조된 제형-2의 미세 입자에 모델 단백질인 라이소자임의 합체량에 대한 반응에 사용된 완충용액의 pH의 영향을 나타내는 도표이다.

도 5는 본 발명에 의해 제조된 제형-2의 미세 입자에 모델 단백질인 라이소자임의 합체량에 대한 반응에 사용된 완충용액에 포함된 염화나트륨 농도의 영향을 나타내는 도표이다.

도 6은 본 발명에 의해 제조된 제형-7의 미세 입자에 모델 단백질인 인간 성장 호르몬을 합체시킨 후 생체외 방출시험 결과를 나타내는 도표이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 단백질 함유 생분해성 미세 입자 제형을 얻기 위해서는 이온성 작용기를 포함하는 생분해성 미세 입자를 제조하는 과정과 이 미세 입자에 단백질 약물을 합체하는 과정이 포함된다. 다공성의 생체 분해성 고분자 미세 입자가 자체로 보유하고 있거나 또는 미세입자에 결합된 이온성 작용기(ionic group)와 단백질과의 이온 상호작용(ionic interaction)을 이용하여 단백질을 합체(incorporation)함으로써 봉입과정 중에 나타나는 단백질의 변성, 비가역적 응집 현상 등을 방지하여 단백질의 구조를 활성 상태로 유지할 수 있는 것이다.

본 발명은 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제의 제조방법에 있어서, 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자를 단백질 약물이 함유된 완충액에서 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해서 합체시키고, 합체된 단백질 함유 미세입자를 회수 및 동결건조하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 음이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질을그의 등전점 이하 pH의 완충액에서 이온 상호작용에 의해 합체시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 양이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질을 그의 등전점 이상 pH의 완충액에서 이온 상호작용에 의해 합체시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 서방성 제제 제조방법에 있어서, 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제의 단백질 또는 펩타이드 약물 함유량이 0.1-90중량%인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 본 발명의 서방성 제제에 있어서, 생분해성 미세입자는 폴리락타이드(Polylactide, PLA), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide, PGA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(Poly(lactide-co-glycolide), PLGA)를 포함하는 폴리에스테르(Polyester), 폴리오르토에스테르(Poly-ortho-ester), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리하이드록시부티르산(Polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트(Polyalkylcarbonate), 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알긴산, 키틴, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 전분 중에서 선택된 1종 이상의 것으로부터 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 생분해성 고분자에 도쿠세이트 소디움, 소디움 라우릴 설페이트 등의 음이온성 계면 활성제, 음이온성 작용기를 갖는 물질 중 1종 이상을 혼합하여 음이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자를 제조하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 생분해성 고분자에 염화 벤즈알코니움, 염화 벤제토니움, 세트리미드 등의 양이온성 계면 활성제, 양이온성 작용기를 갖는 물질 중 1종 이상을 혼합하여 양이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 서방성 제제의 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자는 코아세르베이션, 유탁액 상분리, 분무 건조에 의한 캡슐화, 유기상 ·수상 중의 용매 증발법, 이중 에멀젼 용매 증발법 중의 한 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 생분해성 미세입자를 제조하는 단계에 염화칼슘, 염화나트륨, 암모니움 바이카보네이트를 포함하는 공(pore) 형성물질 중의 1종 이상을 부가하여 다공성이 증가된 생분해성 미세입자를 형성시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

나아가 본 발명은 락트산, 글리콜산, 타르타르산, 시트르산, 퓨마르산, 말릭산을 포함하는 산성화 물질, 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 포타슘 시트르산, 소디움 바이카보네이트, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 마그네슘 트리실리케이트, 소디움 시트르산, 메글루민, 트리에탄올아민을 포함하는 알칼리성화 물질 또는 염을 첨가하여 생분해성 미세입자를 제조하는 것을 특징으로하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질 약물을 합체시키는 단계를 pH 3.0~9.0, 이온강도가 1~500mM인 조건 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명의 제조방법에 있어서, 결합 반응온도는 30∼42℃, 반응시간은 10∼48시간인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질 약물을 합체시키는 단계에서 단백질 방출 조절 물질, 부형제, 동결건조 안정화제를 포함하는 공지의 첨가제를 1종 이상 첨가하여 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 단백질 함유 서방성 제제를 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알부민 중의 1종 이상으로 피복시키는 단계를 부가하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제공한다.

도 1은 본 발명에 의한 단백질 약물을 양이온성 또는 음이온성 작용기를 함유한 생분해성 미세입자와 이온성 상호작용으로 합체하는 원리를 도식화한 도표로서 도 1a는 본 발명의 일 실시예에 의하여 음이온성 작용기를 함유하는 미세 입자에 양이온성 단백질 약물을 합체시키는 것, 도1b는 본 발명의 일 실시예에 의하여 양이온성 작용기를 함유하는 미세 입자에 음이온성 단백질 약물을 합체시키는 것을 도식화한 것이다. 즉, 도 1a의 경우 생분해성 고분자로부터 형성되는 다공성 미세입자(10)의 표면과 공(pore, 20)에는 음이온성 작용기가 존재하여 양이온성 단백질 표면의 양이온성 작용기와 이온결합 또는 이온성 상호작용함으로써 생분해성 미세입자에 합체되어 본 발명의 서방성 제제를 제조하게 되는 것이다. 또한, 도 1b의 경우에는 생분해성 미세입자에 결합되거나 미세입자 자체에 존재하는 양이온성 작용기가 음이온성 단백질 약물 표면의 음이온성 작용기와 이온결합 또는 이온성 상호작용하여 합체됨으로써 본 발명의 서방성 제제를 제조하게 되는 것이다. 이때 바람직하게는 pH를 조절할 수 있는 산성화 물질, 알칼리성화 물질 또는 염(30)을 가하여 생분해성 미세입자를 제조함으로써 본 발명의 서방성 제제가 인체에서 분해될 때 단백질 약물의 방출(release)을 조절하거나 pH의 급격한 변화를 방지할 수 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 생분해성 고분자로는 생체 내에서 어떠한 생리활성을 나타내지 않고 쉽게 분해 및 소멸되는 것이면 가능하나, 특히 폴리락타이드(Polylactide, PLA), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide, PGA), 이들의 공중합체인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(Poly(lactide-co-glycolide), PLGA) 등의 폴리에스테르(Polyester), 폴리오르토에스테르(Poly-ortho-ester), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리하이드록시부티르산(Polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트(Polyalkylcarbonate) 등의 합성 고분자를 비롯하여 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린 등의 단백질류, 알긴산, 키틴, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 전분 등의 다당류의 천연 고분자 등을 들 수 있다.

이온성 작용기를 함유하는 생분해성 고분자에 합체되는 단백질 약제의 함량은 특정되지 않고, 사용하고자 하는 약제의 유형, 원하는 약리효과 및 필요한 방출시간에 따라 변화될 수 있지만, 바람직하게는 단백질 약제가 함유된 생분해성 고분자 미세 입자 제형중 단백질의 함량이 약 0.1∼90중량%, 더욱 바람직하게는 1∼40중량%의 범위이다.

생분해성 미세 입자의 이온성 작용기는 생분해성 고분자 자체가 함유하거나 이러한 작용기를 갖지 않는 생분해성 고분자와 이온성 작용기를 갖는 물질 또는 이온성 작용기를 갖고 있는 생분해성 고분자와 혼합하여 미세 입자를 제조함으로써 도입될 수 있다.

이온성 작용기를 포함하는 생분해성 고분자는 원래 고분자 자체가 이러한 작용기를 갖고 있거나 화학적 방법에 의해서 도입될 수 있다. 본래부터 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 고분자로는 다음과 같은 예가 있다. 폴리락타이드 (Polylactide, PLA), 폴리글리콜라이드 (Polyglycolide, PGA), 이들의 공중합체인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (Poly(lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리안하이드라이드 (Polyanhydride), 폴리하이드록시부티르산 (Polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone) 등에 존재하는 카르복실기, 폴리아미노산 (Polyamino acid)이나 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린 등의 단백질류에 존재하는카르복실기와 아민기, 다당류에 존재하는 음이온성, 및 양이온성 작용기 등이 있다.

생분해성 고분자에 이온성 작용기를 도입하는 것은 통상의 화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어서 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 이들의 공중합체인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 등의 폴리에스테르 계열의 고분자는 2종류의 작용기, 즉 카르복실기와 하이드록실기를 가지고 있으므로 이들 작용기에 아민기를 도입시킴으로써 양이온성 작용기를 가지게 할 수 있다(반응식 1∼4 참조).

이러한 예로서 하기 반응식 1-4와 같이 호프만 리어레인지먼트 반응인 아마이드 말단을 아민화시키는 방법으로 카르복실기에 먼저 아자이드를 도입하고 알코올을 도입하여 아민에스터를 만든 다음 NaOH 하에서 아민을 도입시키는 방법이 있으며(Tetrahedron Letters, 25, 315, 1984, Journal of Organic Chemistry, 51, 3007, 5123, 1986), 로센 반응(Lossen Reaction)으로 카르복실산을 하이드록시아민으로 변형시키고 하이드록시아민을 일차아민으로 전환시키는 방법과 카르복실산기에 디아민기를 도입하는 방법으로 디시클로헥실카보디이미드, 카보닐디이미드, 카스트로 시약 등을 사용하여 카르복실산기를 활성화시킨 후 프로판디아민, 부틸렌디아민, 에틸렌디아민, 비페닐디아민 등의 화합물과 아마이드 축합반응을 시킴으로 아민기의 양이온성 작용기가 도입된 생분해성 고분자를 얻을 수가 있다. 도입될 수 있는 이온성 작용기의 종류로는 카르복실기, 황산기, 포스포릴기 등의 음이온성 작용기와 아민기 등의 양이온성 작용기가 있다.

이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자의 제조는 이온성 작용기를 자체 함유하는 고분자 단독, 혼합 또는 이온성 작용기를 함유하지 않는 고분자와의 혼합으로 제조될 수 있거나 미세 입자 제조시 이온성 작용기를 갖는 물질과 혼합하여 제조함으로써 얻을 수가 있다. 미세 입자 제조시 이온성 작용기 도입을 위해 첨가할 수 있는 물질로는 염화 벤즈알코니움, 염화 벤제토니움, 세트리미드 등의 양이온성 계면 활성제 또는 도쿠세이트 소디움, 소디움 라우릴 설페이트 등의 음이온성 계면 활성제, 카르복실기, 황산기, 포스포릴기등의 음이온성 작용기를 갖거나 아민기의 양이온성 작용기를 갖는 생체 적합한 물질들이 사용될 수 있다.

미세입자의 제조시 상기의 이온성 작용기 뿐만 아니라 산성화 및 알칼리성화 유도 물질 또는 염을 포함하여 제조하게 되면 생체 내에서 미세입자가 분해되면서 이러한 물질이 방출되어 단백질과 미세입자 내의 이온성 작용기와의 이온결합의 강도를 약화시킴으로써 단백질 약물의 생체내 방출 속도를 조절할 수 있다. 이러한 물질로 사용될 수 있는 것으로는 락트산, 글리콜산, 타르타르산, 시트르산, 퓨마르산, 말릭산 등의 산성화 물질과 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 포타슘 시트르산, 소디움 바이카보네이트, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 마그네슘 트리실리케이트, 소디움 시트르산, 메글루민, 트리에탄올아민 등의 알칼리성화 물질, 염화나트륨, 염화칼슘 등의 염이 있다.

미세입자의 제조 방법은 통상의 코아세르베이션 또는 유탁액 상분리, 분무 건조에 의한 캡슐화 및 유기 또는 수상 중의 용매 증발법, 초저온 분무법, 초임계 기체 유동법 등 어느 방법이든 사용할 수 있고, 보다 바람직하게로는 이중 에멀젼 용매 증발법을 사용한다. 이중 에멀젼 용매 증발법에 의하여 미세 입자를 제조할 때 일차 에멀젼에서의 수용액상의 미세한 액적이 최종적으로 고형화된 미세 입자에 다공성의 구조를 제공하게 되고 특히 일차 수용액 상에 염화나트륨, 염화칼슘 등의 염을 첨가하거나 암모니움 바이카보네이트 등의 가스형성물질을 첨가하게 되면 미세입자의 다공성을 증가시킬 수가 있다. 다공성이 증가된 미세 입자는 그 표면적이 상대적으로 커지게 되어 더 많은 양의 단백질 약물을 합체할 수가 있다.

상기와 같은 방법으로 제조된 다공성의 생분해성 미세입자에 합체할 수 있는 약물로는 거의 모든 종류의 단백질 및 펩타이드 약물에 폭넓게 사용할 수 있으나,특히 다음과 같은 단백질 및 펩타이드 약물과 그들의 돌연변이체 또는 유사체 등을 들 수 있다. 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터루킨, 마크로파지 활성 인자, 마크로파지 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 단백질 A, 알러지 억제 인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민과 그 단편 폴리펩타이드, 아포리포단백질-E, 에리트로포이에틴, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 플라즈미노젠 활성 인자, 유로키나제, 스트렙토키나제, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라지나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 오스테오제닉 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 카틸리지 유도 인자, 결합 조직 활성인자, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장 인자, 파라타이로이드 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 조마토메딘, 인슐린-유사 성장 인자, 아드레노코티코트로픽 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 타이로이드 자극 호르몬, 각종 바이러스, 박테리아, 독소 등에 대한 단일클론성 또는 폴리클론성 항체, 각종 바이러스 유래 백신 항원 등이 포함된다.

상기와 같은 방법으로 제조된 다공성의 생분해성 미세 입자에 단백질 약물을 합체하고자 할 때에 고려해야 할 사항은 미세 입자의 작용기의 종류와 합체하고자 하는 단백질 약물의 등전점, 미세 입자와 단백질의 결합에 사용되는 완충 용액의 pH와 이온 강도 및 결합시의 온도와 반응시간 등이다.

일반적으로 카르복실기, 황산기, 포스포릴기 등의 음이온성 작용기를 함유한 미세 입자에 단백질을 합체할 때엔 단백질의 등전점 이하 pH의 완충액에서 합체하고 아민기등의 양이온성 작용기를 함유한 미세 입자에 단백질을 합체하고자 할 때엔 그 단백질의 등전점 이상 pH의 완충액에서 합체한다. 결합 반응에 사용되는 완충 용액의 pH는 3.0∼ 9.0까지 사용될 수 있고 이온 강도는 1∼ 500 mM까지 사용될 수 있지만 바람직하게로는 5∼ 200 mM 정도가 적당하다. 반응 온도와 반응 시간에 따라 미세 입자의 수화 정도와 단백질 약물과의 이온 결합 세기가 다르고 단백질 약물에 따라 안정성에 차이가 있어 이러한 사항을 고려하여 결정한다. 일반적으로 반응 온도는 5∼ 50℃까지 사용될 수 있지만 바람직하게로는 생리적 온도인 30∼ 42℃가 적당하고, 결합 반응 시간은 짧게는 1분에서 길게는 20일까지 가능하지만 반응 온도가 37℃인 경우 10∼ 48시간 정도가 적당하다.

상기 단백질 약물을 합체시키는 단계에 있어서 당업계에서 널리 알려진 단백질 방출조절물질, 부형제 또는 동결건조 안정화제 등을 첨가할 수 있다.

상기의 조건에 따라 단백질 약물이 이온 상호작용에 의해 결합된 다공성의 생분해성 미세입자는 반응액으로부터 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 회수하여 동결 건조함으로써 최종의 단백질 함유 서방성 미세 입자를 얻게 된다.

본 발명에 의하여 얻어지는 서방성 제제의 평균 입자 크기는 0.01 내지 500㎛의 범위이다.

단백질 약물의 초기 방출량이나 초기 방출 속도는 상기 방법에 의해 제조된 단백질 함유 서방성 미세 입자를 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알부민 등으로 피복함으로써 더욱 바람직하게 조절할 수 있다.

본 발명을 다음의 실시예를 통하여 좀더 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 이온성 작용기를 함유한 다공성의 생분해성 미세 입자의 제조.

제형-1: 생분해성 고분자로 락타이드와 글라이콜라이드의 조성비가 50:50인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (Poly(lactide-co-glycolide), PLGA) 중에서, 음이온성 작용기인 카르복실기를 말단에 함유한 분자량 8,600의 PLGA (RG502H, Boehringer Ingelheim)를 사용하여 이중 에멀젼 용매 증발법에 의해 미세 입자를 제조하였다. RG502H 1 g을 2 ml의 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후 증류수 800 ㎕를 가한 후 초음파분쇄기 (Ulsso Hitech, Seoul, Korea)로 30초 동안 초음파 분쇄하여 일차 에멀젼을 만들었다. 이 일차 에멀젼을 중량 백분율로 0.5%의 폴리비닐알코올이 함유된 증류수 200 ml에 가하여 교반기 (Silverson L4RT laboratory mixer, Chesham, England)를 이용하여 2,500 rpm으로 25℃에서 30분간 교반하였다. 이 이차 에멀젼의 온도를 40℃로 증가시킨 후 1시간동안 계속 교반하여 유기용매를 증발시켰다. 온도를 다시 25℃로 내린 후 원심분리하여 고형화된 미세 입자를 얻었고, 증류수로 세척 및 원심분리 과정을 세 번 더 수행한 후 최종적으로 소량의 증류수를 가한 후 동결 건조하였다.

제형-2: 제형-1과 같은 방법으로 제조하였는 바, 1차 수용액에 사용한 증류수 800 ㎕가 0.5 M의 염화나트륨을 함유하도록 하여 미세 입자의 다공성을 증가시키도록 제조하였다.

제형-3: 제형-1과 같은 방법으로 제조하였는 바, 1차 수용액에 사용한 증류수 800 ㎕가 0.5 M의 시트르산 (pH 5.0)을 함유하도록 하여 미세 입자를 제조하였다.

제형-4: 제형-1과 같은 방법으로 제조하였는 바, 1차 수용액에 사용한 증류수 800 ㎕가 0.5 M의 카프릴산 (pH 8.5)을 함유하도록 하여 미세 입자를 제조하였다.

제형-5: 제형-1과 같은 방법으로 제조하였는 바, 1차 수용액에 사용한 증류수 800 ㎕가 0.5 M의 암모니움 바이카보네이드 (pH 7.0)를 함유하도록 하여 미세 입자를 제조하였다.

제형-6: 생분해성 고분자로 락타이드와 글라이콜라이드의 조성비가 50:50인 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (Poly(lactide-co-glycolide), PLGA)중에서, 말단이 도데실기인 이온성 작용기를 함유하지 않은 분자량 11,000의 PLGA (RG502, Boehringer Ingelheim)를 사용하여 제형-2와 같은 방법으로 제조하였는 바, 이차 에멀젼의 교반속도를 3,000 rpm으로 증가시켜 미세 입자를 제조하였다.

제형-7: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502 0.9g과, 양이온성 계면 활성제인 염화 벤즈알코니움을 0.1 g을 첨가하였고, 1차 수용액 800 ㎕에는 0.5M 염화나트륨과 염화 벤즈알코니움이 40 mg이 첨가되었고, 2차 수용액인 0.5% 폴리비닐알코올에도 10 g의 염화 벤즈알코니움을 첨가한 후 제조하였다.

제형-8: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502 0.98 g과, 양이온성 계면 활성제인 염화 벤즈알코니움을 0.02 g을 첨가하였고, 1차 수용액 800 ㎕에는 0.5M 염화나트륨과 염화 벤즈알코니움이 8 mg이 첨가되었고, 2차 수용액인 0.5% 폴리비닐알코올에도 2 g의 염화 벤즈알코니움을 첨가한 후 제조하였다.

제형-9: 제형-2와 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502H 0.9 g과 마그네슘 카보네이트 0.1 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-10: 제형-2와 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502H 0.9 g과 마그네슘 하이드록사이드 0.1 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-11: 제형-2와 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502H 0.95 g과 염화 벤즈알코니움 0.05 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-12: 제형-2와 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502H 0.95 g과 카프릴산 0.05 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-13: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502 0.95 g과 옥틸아민 0.05 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-14: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502 0.9 g과 폴리씨비지라이신(Poly-ξ-CBZ-l-lysine) 0.1 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-15: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 1차 수용액 800 ㎕에는 0.5 M 염화 나트륨, 0.1% 키토산 (w/v), 1% 아세트산 (v/v)을 첨가하여 제조하였다.

제형-16: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에 RG502 0.95 g과 카프릴산 0.05 g을 첨가하여 제조하였다.

제형-17: 제형-6과 같은 방법으로 제조하였는 바, 유기용매상에는 RG502 0.98 g, 1차 수용액 800 ㎕에는 0.5 M 염화 나트륨, 20 mg의 폴리라이신 (Poly-l-lysine)을 첨가하여 제조하였다.

<실시예 2> 이온성 작용기를 함유한 다공성의 생분해성 미세 입자내로의 단백질 약물의 합체.

상기 실시예-1에서 제조된 건조된 미세 입자를 단백질 약물이 용해된 완충 용액에 담가 두어 이온 상호작용에 의해서 단백질 약물이 합체되도록 하였다. 모델 단백질로는 다음 표 1에서와 같이 등전점이 다른 다섯 가지의 단백질을 사용하였다.

건조된 미세 입자 5 mg을 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 넣고 단백질 약물이 용해된 완충용액 500 ㎕를 첨가한 후 튜브를 로테이터 휠 (Rotator wheel)에 넣고 50 rpm의 회전속도로 계속 회전시키면서 항온조에 일정시간 넣어두었다. 완충액으로는 10 mM의 시트르산 (citrate) 과 10 mM의 인산칼슘(photassium phosphate, dibasic)을 섞어서 제조한 pH 3.0∼8.0을 사용하였다. 일정시간이 경과한 후 튜브를 꺼내 원심분리하였고 상층액을 적당한 농도의 생리식염수로 희석한 후 마이크로-BCA 단백질 어세이키트(assay kit) (Pierce)를 이용하여 각 단백질을 표준으로 하여 합체되지 않은 단백질 양을 정량하였다. 미세 입자에 합체되어 미세입자와 같이 침전된 단백질은 0.1 N NaOH, 0.5% SDS로 48시간 37℃에서 생분해성 고분자를 분해시킨 후 역시 마이크로-BCA 단백질 어세이 키트를 이용하여 정량하였다.

합체 반응시의 온도와 반응시간에 따른 단백질 약물의 합체량을 알아보기 위해 제형-2의 미세입자(음이온성 작용기인 카르복실기를 함유한 RG502H로 제조)와 라이소자임을 2 mg/ml 농도로 하여 상기와 같은 방법으로 합체량을 조사한 결과를 도 3에 나타내었다. 저온(4℃)에서는 미세 입자가 거의 수화되지 않아 고온 (37℃)에 비해 라이소자임의 함유율이 10%정도로 낮았고, 반응온도 37℃에서 대략 24시간이 경과하여 평형에 도달하였다.

본 발명에서 합체량이란 일정 중량의 미세입자에 합체된 단백질 약물의 양을 의미하고, 함유율이란 이렇게 해서 얻어진 단백질 함유 미세입자 중량중 단백질의 양을 백분율로 환산한 것을 의미하는 것으로 이후 하기에서도 이러한 의미로 사용하였다.

이후 하기의 모든 실험에서는 합체 반응온도를 37℃로, 합체 반응시간을 24시간으로 고정하여 수행하였다.

합체 반응시 완충액의 pH와 이온 강도의 영향을 보기위해 역시 제형-2의 미세입자와 라이소자임을 2 mg/ml 농도로 하여 완충액의 pH를 3.0-8.0까지 변화시켜 합체량을 조사한 결과를 도 4에 나타내었고, 완충액의 pH 7.0에서 염화나트륨의 양을 0.0-0.5 M까지 변화시켜 합체량을 조사한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 4와 도 5에서 나타나듯이 반응 완충액의 pH와 이온 강도에 따라 라이소자임의 합체량에 크게 차이가 나는 것을 알 수 있다. 특히 완충액의 pH가 3-5로 약산성일 때 (RG502H의 카르복실기의 음이온성 감소), 또한 염화나트륨의 농도가 증가할 때 라이소자임의 합체량이 감소하는 것으로 보아 합체의 주요인은 이온 상호작용(ionic interaction)에 의한 것임을 알 수가 있다.

이후의 단백질 합체 실험은 완충액의 pH를 7.0으로 고정하여 수행하였다.

염화나트륨 또는 암모니움 바이카보네이트 등의 첨가에 따른 미세 입자의 다공성 증가나, 시트르산, 카프릴산등 카르복실기를 함유한 물질 첨가에 따른 라이소자임의 미세 입자에 대한 합체량을 조사하기 위해 제형-1, 2, 3, 4, 5의 미세 입자에 대하여 실험한 결과를 표 2에 나타내었다.

제형	1차 수용액 성분	Lys 함유율(Lys/(Lys+미세입자)*100)
1	증류수	9.20
2	0.5M 염화나트륨	10.58
3	0.5M 시트르산	14.11
4	0.5M 카프릴산	13.76
5	0.5M 암모니움 바이카보네이트	10.84

제형-1에 비해 모든 제형의 미세입자에서 라이소자임의 함유율이 증가되었다. 특히 시트르산, 카프릴산 등의 카르복실기를 가진 물질을 첨가한 제형-3, 제형-4에서 그 함유율이 더 증가된 것으로 보아 단백질 약물과 미세입자 간의 이온상호작용이 증가된 결과로 본 발명의 효과를 알 수가 있다. 제형-1의 미세 입자도기본적으로 이중 에멀젼 용매 증발법에 의해 제조되었으므로 이미 다공성이 상당히 증가된 미세 입자인 것으로 추정된다.

미세 입자의 이온성 작용기의 종류와 단백질 약물의 이온성에 따른 함유율은 표 3에 아주 잘 나타나 있다. 단백질 약물의 농도는 2 mg/ml을 사용하였다.

제형	단백질 약물 함유율 (단백질/(단백질+미세입자)*100)
번호	미세입자주성분	OVA	BSA	HGH	RibA	Lys
2	RG502H	0.75	1.36	0.99	10.00	11.84
6	RG502	<0.20	<0.20	0.46	1.90	<0.20
7	RG502, 염화벤즈알코니움 10%	3.30	9.41	16.83	0.81	<0.20
11	RG502H,염화벤즈알코니움 5%	2.51	<0.20	8.22	7.90	6.03
15	RG502키토산 0.1%	1.91	<0.20	5.61	5.27	0.67

제형-6의 경우와 같이 이온성 작용기가 전혀 없는 미세 입자의 경우에는 양이온성 및 음이온성 단백질 모두 함유율이 상당히 낮았고, 음이온성 작용기인 카르복실기를 갖는 RG502H로 제조된 제형-2나 제형-11의 경우 양이온성 단백질인 라이보뉴클리아제 A와 라이소자임 단백질의 함유율이 상당히 높았다. 양이온성 계면활성제인 염화벤즈알코니움을 함유한 제형-7이나 제형-11의 미세 입자의 경우 음이온성 단백질인 오발부민, 소혈청알부민, 인간성장호르몬 등의 함유율이 크게 증가하였다. 특히 제형-7의 경우 미세 입자의 음이온성 작용기는 없고 양이온성인 염화벤즈알코니움 양이 증가하여 양이온성 단백질은 거의 합체되지 않았고 음이온성 단백질의 함유율은 모두 크게 증가하였다. 제형-15의 양이온성 작용기인 글루코즈아민을 함유하는 생분해성 고분자인 키토산도 그 첨가량에 따라 단백질 약물의 합체량을 증가시킬 수 있음을 시사하고 있다.

특히 인간성장호르몬(HGH)의 경우 제형-7의 미세 입자에 합체된 양이 상당히 증가하였는데 합체시의 단백질 농도를 증가시키면서 합체량의 포화도를 조사하였고 그 결과를 표 4에 나타내었다.

반응액의 HGH 농도(mg/ml)	HGH 함유율(%)(HGH/(HGH+미세입자)*100)	합체효율(%)(합체된 HGH/첨가한 HGH*100)
2.0	16.83	101.2
5.0	31.75	93.0
10.0	49.96	99.8
20.0	63.66	87.6

반응 완충액 내의 인간성장호르몬의 양이 점점 증가하면서 미세 입자의 단백질 함유율도 점점 증가되었는데 20mg/ml 농도에서 87.6%가 합체되어 63.66%의 높은 함유율을 나타내었다. 상기 결과는 미세입자의 이온성 작용기의 종류, 미세입자 내에서의 함량 등을 조절하여 단백질 약물의 함량을 60% 이상으로 크게 증가시킬 수 있음을 보여주는 것으로 본 발명의 신규성, 진보성을 잘 보여주는 예라 하겠다.

<실시예 3> 단백질 함유 생분해성 미세 입자로부터 단백질 약물의 시험관내방출.

본 발명의 실시예 1의 제형-7의 미세 입자에 인간성장호르몬을 실시예 2의 조건(인간성장호르몬 2mg/ml)에서와 같이 합체시킨 후 10 mM 암모니움 바이카보네이트(pH 7.0) 완충액으로 두 번 세척한 후 동결건조하여 인간성장호르몬이 16.83% 함유된 미세 입자를 얻고 다음과 같이 시험관내 방출 실험을 실시하였다. 100mg의 인간성장호르몬 함유 미세 입자를 10mM의 인산완충액 (pH 7.4) 1 ml에 현탁시킨 후 28일동안 37℃에서 방출하였다. 방출 시험 개시일로부터 초기 1일, 4일, 7일, 및 그 이후로는 일주일에 2회 간격으로 하여 미세 입자를 원심분리하여 상층액으로부터 방출된 단백질 양을 정량하고 상층액을 새로운 방출 용액 1 ml로 갈아주면서 총 28일까지 방출된 인간성장호르몬의 양을 결정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었는 바 인간성장호르몬(HGH)이 초기 7일의 래그타임(lag time) 후에 지속적이고 일정하게 방출되어 21일 후에 완전히 방출됨을 보여주고 있다.

본 발명에 의하여 물리적 특성, 즉 등전점이 다양한 단백질 및 펩타이드 약물에 대하여 변성이나 비가역적 응집 현상이 없이 그들의 활성 구조를 유지하면서 60중량% 이상의 높은 함유율로 생분해성 미세 입자로의 합체가 가능하며 이들 약물의 생체 내에서의 방출 속도를 균일하고도 지속적으로 유지시킬 수가 있다.

Claims

단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제의 제조방법에 있어서, 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자를 단백질 약물이 함유된 완충액에서 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해서 합체시키고 합체된 단백질 함유 미세입자를 회수 및 동결건조하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 음이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질을 그의 등전점 이하 pH의 완충액에서 이온 상호작용에 의해 합체시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 양이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질을 그의 등전점 이상 pH의 완충액에서 이온 상호작용에 의해 합체시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제의 단백질 또는 펩타이드 약물 함유량이 0.1-90중량%인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생분해성 미세입자는 폴리락타이드(Polylactide, PLA), 폴리글리콜라이드(Polyglycolide, PGA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(Poly(lactide-co-glycolide), PLGA)를 포함하는 폴리에스테르(Polyester), 폴리오르토에스테르(Poly-ortho-ester), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리하이드록시부티르산(Polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트(Polyalkylcarbonate), 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알긴산, 키틴, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 전분 중에서 선택된 1종 이상의 것으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 음이온성 작용기는 카르복실기, 황산기 또는 포스포릴기인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 생분해성 고분자에 음이온성 계면 활성제, 음이온성 작용기를 갖는 물질 중 1종 이상을 혼합하여 음이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자를 제조하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 음이온성 계면 활성제는 도쿠세이트 소디움, 소디움 라우릴 설페이트 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제3항에 있어서, 양이온성 작용기는 아민기인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제3항에 있어서, 생분해성 고분자에 양이온성 계면 활성제, 양이온성 작용기를 갖는 물질 중 1종 이상을 혼합하여 양이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 양이온성 계면 활성제는 염화 벤즈알코니움, 염화 벤제토니움, 세트리미드 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 펩타이드 약물은 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터루킨, 마크로파지 활성 인자, 마크로파지 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 단백질 A, 알러지 억제 인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민과 그 단편 폴리펩타이드, 아포리포단백질-E, 에리트로포이에틴, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 플라즈미노젠 활성 인자, 유로키나제, 스트렙토키나제, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라지나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 오스테오제닉 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 카틸리지 유도 인자, 결합 조직 활성인자, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장 인자, 파라타이로이드 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 조마토메딘, 인슐린-유사 성장 인자, 아드레노코티코트로픽 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 타이로이드 자극호르몬, 바이러스에 대한 단일클론성 항체 또는 폴리클론성 항체, 박테리아에 대한 단일클론성 항체 또는 폴리클론성 항체, 독소에 대한 단일클론성 항체 또는 폴리클론성 항체, 바이러스 유래 백신 항원, 이들의 돌연변이체 또는 이들의 유사체로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자는 코아세르베이션, 유탁액 상분리, 분무 건조에 의한 캡슐화, 유기상 ·수상 중의 용매 증발법, 초저온 분무법, 초임계 기체 유동법 중의 한 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 생분해성 미세입자를 제조하는 단계에 염화칼슘, 염화나트륨, 암모니움 바이카보네이트를 포함하는 공(pore) 형성물질 중의 1종 이상을 부가하여 다공성이 증가된 생분해성 미세입자를 형성시키는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 락트산, 글리콜산, 타르타르산, 시트르산, 퓨마르산, 말릭산을 포함하는 산성화 물질, 디에탄올아민, 모노에탄올아민, 포타슘 시트르산, 소디움 바이카보네이트, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 마그네슘 트리실리케이트, 소디움 시트르산, 메글루민, 트리에탄올아민을 포함하는 알칼리성화 물질 또는 염을 첨가하여 생분해성 미세입자를 제조하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질 약물을 합체시키는 단계는 pH 3.0~9.0, 이온강도가 1~500mM인 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제16항에 있어서, 결합 반응온도는 30∼42℃, 반응시간은 10∼48시간인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 이온성 작용기를 함유하는 생분해성 미세입자에 단백질 약물을 합체시키는 단계에서 단백질 방출 조절 물질, 부형제, 동결건조 안정화제를 포함하는 공지의 첨가제를 1종 이상 첨가하여 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 함유 서방성 제제를 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알부민 중의 1종 이상으로 피복시키는 단계를 부가하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 함유 서방성 제제는 입경이 0.01-500㎛인 것을 특징으로 하는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제를 제조하는 방법.
제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법으로 제조되는 단백질 또는 펩타이드 함유 서방성 제제.