JP3761594B2 - 徐放性製剤の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤に関する。
【従来の技術】
蛋白質（ポリペプチドとも称する）は生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞、あるいはハムスターなどの生体を用いて大量に生産させ、医薬品としての応用が図られている。これらの蛋白質医薬品の例としてはインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ）、インターロイキン２、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などが挙げられる。しかしながら、これらの蛋白質は一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。この問題を解決するために徐放製剤を開発する種々の試みがなされている。サイトカインに代表される蛋白質の投与は治療効果を判定しながら慎重に投与する必要があるため、１週間から２週間程度の放出期間を有する注射可能な徐放製剤特にマイクロカプセル徐放製剤の開発が望まれている。しかしながら、一般的に蛋白質は熱、有機溶媒，強いせん断力などにより変性し、その生物活性が低下することが知られている。例えば、蛋白質水溶液を６０℃で２０分間加熱することによりその生物活性が急速に失われる場合がある。また、より低い温度である５０℃でも１時間程度加熱することによりその生物活性が低下してしまう場合もある。同様にエタノール、ジクロルメタンなどの有機溶媒によっても蛋白質の生物活性が低下する場合があることが知られている。
【０００２】
ＷＯ９３／０６８７２号公報には骨形成蛋白質の長期間にわたる放出を可能にする生体内分解性ポリマーで作成した空隙のある粒子、骨形成蛋白質、および自己血凝集塊を組み合わせた製剤の技術が開示されている。本技術においては主薬である骨形成蛋白質は投与直前に粒子に吸着させ、さらに自己血を加え凝集塊を形成させることにより放出を制御する手法が取られている。徐放期間は数週間程度である。自己血を使用するために一般的に使用ではない。
ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Journal of Controlled Release），２３巻，１５７頁，（１９９３年）（A. Supersaxo et al.）には、生体内分解性ポリマーを用いて空隙率の大きいマイクロカプセルを作製した後、高分子物質を染み込ませることにより有機溶媒と高分子物質を接触させずにマイクロカプセル内に取り込む技術が記載されている。具体的には使用されるポリ乳酸は疎水性であるため、最初に有機溶媒である５０％エタノールを用いてマイクロカプセルを湿らせた後に水で置換し、さらに高分子物質の溶液で置換する操作を行っている。
特開平５−３２５５９号公報には医薬組成物の構成成分と生理学的活性物質とを有機溶剤中に溶解するか、又は、医薬組成物の構成成分と生理学的活性物質とを有機媒体又は水性媒体中に均一に分散し、これを乾燥することによる医薬組成物の製造方法が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように蛋白質などの生物活性を保持しながら徐放性製剤を製造する種々の試みがなされているものの、薬物のマトリックスへの浸透効率。薬物の初期バーストの抑制、長期間にわたる一定の薬物放出速度等の点で、まだ満足すべきものではない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の問題点を解決するため鋭意研究をおこなったところ、生体内に投与後の消失が約１〜３週間程度の生体内分解性ポリマーで予め微粒子状の生体内分解性マトリックスを製造し、該生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドを水中で浸透させて得られる製剤を生体内に投与することにより、水溶性ポリペプチドの血液中濃度を約１〜２週間持続させることが可能になることを見いだし、これに基づいてさらに研究した結果本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させることを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造される第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（３）脂肪族カルボン酸が脂肪族モノカルボン酸である第２項記載の徐放性製剤の製造法、
（４）金属塩が多価金属塩である第２項記載の徐放性製剤の製造法、
（５）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させ、ついで乾燥する第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（６）乾燥が凍結乾燥である第５項記載の徐放性製剤の製造法、
（７）水溶性ポリペプチドがサイトカインである第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（８）サイトカインがインターフェロンである第７項記載の徐放性製剤の製造法、
（９）生体内分解性マトリックスが微粒子状である第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（１０）生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーから製造される第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（１１）生体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエステルである第１０項記載の徐放性製剤の製造法、
（１２）脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸から誘導される共重合体である第１１項記載の徐放性製剤の製造法、
（１３）共重合体が乳酸−グリコール酸共重合体である第１２項記載の徐放性製剤の製造法、
（１４）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤、
（１５）生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造される第１４項記載の徐放性製剤、および
（１６）注射用である第１４項記載の徐放性製剤に関する。
【０００５】
本発明における水溶性ポリペプチドは、好ましくは分子量約２００〜約５０,０００の水溶性ポリペプチドである。水溶性ポリペプチドは、さらに好ましくは分子量約５,０００〜約４０,０００の水溶性ポリペプチドである。
水溶性ポリペプチドは、ホルモン作用を有し、内分泌されるものであればよい。このような水溶性ポリペプチドとしては、例えばサイトカイン，造血因子，各種増殖因子，酵素などが挙げられる。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン，モノカインなどが挙げられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン（ＩＬ−１），腫瘍壊死因子などが挙げられる。
造血因子としては、例えばエリスロポエチン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ），トロンボポエチン，血小板増殖刺激因子，メガカリオサイトポテンシエーターなどが挙げられる。各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＦＧＦ−９など）〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology），１３巻，７号，４２５１頁（１９９３年）〕，神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー，インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２など），骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリーなどが挙げられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ），ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）などが挙げられる。
また、上記以外にも、例えば成長ホルモン，インスリン，ナトリウム利尿ペプチド，ガストリン，プロラクチン，副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ），モチリン，カリクレイン，膵臓再生に関与するタンパク質であるRegタンパク質〔特公平１−１３２３８８号公報、フェブス・レターズ（FEBS Letters），２７２巻，８５頁（１９９０年）〕なども本発明の水溶性ポリペプチドとして用いられる。
水溶性ポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組み換えにより製造されたものでもよい。
水溶性ポリペプチドは、上記した水溶性ポリペプチドに限定されるものではない。すなわち、水溶性ポリペプチドは、糖鎖を有していても有していなくてもよく、構造の異なる糖鎖を有していてもよい。さらに、水溶性ポリペプチドは、上記した水溶性ポリペプチドの突然変異物質、誘導体（作動性、拮抗性）、またはフラグメントであってもよい。
【０００６】
水溶性ポリペプチドは、好ましくはサイトカインなどである。該サイトカインとしては、例えばリンホカイン，モノカインなどが挙げられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン（ＩＬ−１），腫瘍壊死因子などが挙げられる。
水溶性ポリペプチドは、さらに好ましくはリンホカインである。該リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。
水溶性ポリペプチドは、特に好ましくはインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ）などである。
【０００７】
本発明において、生体内分解性マトリックスは微粒子状であることが好ましい。生体内分解性マトリックスは、通常の皮下あるいは筋肉内注射に使用される注射針を通過するものであればよく、該生体内分解性マトリックスの粒子径は、例えば平均径として約０．１〜３００μm、好ましくは約１〜１５０μm、特に好ましくは約２〜１００μmである。
【０００８】
生体内分解性マトリックスは、例えば生体内分解性ポリマーから自体公知の方法によって製造される。このような方法としては、例えば以下に示す水中乾燥法，相分離法，噴霧乾燥法あるいはこれらに準じる方法などが挙げられる。生体内分解性マトリックスは、好ましくは生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することにより製造される。
（イ）水中乾燥法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法）
内水相として、例えば水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を使用する。該水溶性成分としては、例えば無機塩類（例、食塩，燐酸水素ナトリウム，燐酸水素２ナトリウムなど）、糖類（例、マンニトール，ブドウ糖，イヌリンなど）、有機塩類（例、炭酸ナトリウム，炭酸マグネシウム，酢酸アンモニウムなど）、アミノ酸（例、グリシン，アルギニン，ヒスチジンなど）などが挙げられる。水溶性成分の水溶液中の濃度は、例えば約０.１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０.５〜５％（ｗ／ｖ）である。特に水溶性成分が食塩である場合には、例えば０.９％（ｗ／ｖ）の生理食塩水を使用することが好ましい。また、内水相に上記水溶性成分の代わりに炭酸カルシウムなどを分散させてもよい。好ましくは、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含有する水溶液が内水相として用いられる。該金属塩の水溶液中の濃度は各金属塩の溶解度によって異なるが、例えば約１０〜９０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２０〜８０％（ｗ／ｖ）である。
上記した水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を、α−ヒドロキシカルボン酸から合成される重合体、共重合体などの生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に乳化，分散し、Ｗ／Ｏ型乳化物（エマルション）を作る。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は生体内分解性ポリマーの分子量，有機溶媒の種類によって異なるが、一般的には約０.０１〜９０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、さらに好ましくは約０.１〜８０％（ｗ／ｗ）である。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、特に好ましくは約１〜７０％（ｗ／ｗ）である。
水あるいは水溶性成分を含有する水溶液と生体内分解性ポリマー有機溶媒溶液との比率は１：１,０００（ｖ／ｖ）〜１：１（ｖ／ｖ）、好ましくは１：１００（ｖ／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１：５０（ｖ／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）である。乳化操作は、公知の分散方法が用いられる。該方法は、例えばタービン型攪拌機、ホモジナイザーなどを用いて行われる。
ついで、このようにして調製されたＷ／Ｏ型エマルションをさらに水相中（外水相）に加えて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性マトリックスを調製する。油相溶媒の蒸発は、例えばタービン型攪拌機などを用いて攪拌することにより行う。この際の水相体積は一般的には油相体積の約１〜１０,０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５〜２,０００倍から選ばれる。
【０００９】
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なＯ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は約０.００１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０.０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。前記の内水相に水溶性成分の代わりに炭酸カルシウムを分散させた場合には、外水相に稀塩酸を添加することにより炭酸カルシウムは溶解する。
また、外水相中に、内水相で用いた水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同一または異なった水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度が約０.０１〜２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.１〜１０％（ｗ／ｗ）となるように水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度を変えることにより、生体内分解性マトリックスからの水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の溶出をコントロールすることもできる。
このようにして得られた生体内分解性マトリックスを遠心分離あるいは濾過して分取した後、生体内分解性マトリックスの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
得られた生体内分解性マトリックスの表面は、平滑ではなく、大小様々な穴が存在し、生体内分解性マトリックス内部にまでその穴が通じているものもある。生体内分解性マトリックス中のこれらの穴の容積の占める割合（空隙率）は、例えば水銀圧入法あるいはＢＥＴ法により定量可能である。空隙率は、内水相中の成分、その濃度、内水相溶液と生体内分解性ポリマー有機溶媒溶液との比率、外水相体積と油相体積の比率、外水相の温度などで異なり、また、生体内分解性マトリックス内部での穴の構造は異なる。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。なお、生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として原子吸光法等の方法により金属として定量される。
【００１０】
（ロ）水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法）
本発明において、生体内分解性マトリックスを製造する方法として内水相を用いない方法がある。該方法においては、まず生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を作製する。この際、有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、生体内分解性ポリマーの分子量，有機溶媒の種類などによって異なるが、一般的には約０.０１〜９０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、さらに好ましくは約０.１〜８０％（ｗ／ｗ）である。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、特に好ましくは約１〜７０％（ｗ／ｗ）である。
生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に炭酸カルシウムを添加，分散させてもよい。この際、炭酸カルシウムの添加量は、炭酸カルシウム：生体内分解性ポリマーの重量比が約５：１〜約１：１００，好ましくは約２：１〜約１：１０となるようにする。
好ましくは、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加、分散させる。この際、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の添加量は、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩：生体内分解性ポリマーの重量比が約５：１〜約１：１００，好ましくは約２：１〜約１：５０，さらに好ましくは約１：１〜約１：１０となるようにする。
ついで、このようにして調製された有機溶媒溶液をさらに水相中に加え、タービン型攪拌機などを用いてＯ／Ｗエマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性マトリックスを調製する。この際の水相体積は一般的には油相体積の約１〜１０,０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５〜２,０００倍から選ばれる。
【００１１】
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なＯ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は約０.００１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０.０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。また、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に炭酸カルシウムを添加，分散させる場合には、外水相中に希塩酸を添加する。
また、外水相中に、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に添加、分散した水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同一または異なった水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度が約０.０１〜２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.１〜１０％（ｗ／ｗ）となるように水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度を変えることにより、生体内分解性マトリックスからの水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の溶出をコントロールすることもできる。
さらに、生体内分解性マトリックスを製造する方法として、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含有する外水相に加え、前記と同様にしてＯ／Ｗエマルションを形成させる方法が挙げられる。
このようにして得られた生体内分解性マトリックスを遠心分離あるいは濾過して分取した後、生体内分解性マトリックスの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。
【００１２】
（ハ）相分離法（コアセルベーション法）
相分離法により生体内分解性マトリックスを製造する場合には、上記のＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液にコアセルベーション剤を攪拌下徐々に加え、生体内分解性ポリマーを析出、固化させる。該コアセルベーション剤はｗ／ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液の体積の約０.０１〜１,０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０.０５〜５００倍の体積量である。特に好ましくは、約０.１〜２００倍の体積量である。
コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーの溶媒に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えば、シリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどが挙げられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。
このようにして得られた生体内分解性マトリックスを濾過して分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除去する。さらに、水中乾燥法と同様の方法で洗浄を行い、ついで生体内分解性マトリックスを凍結乾燥する。
溶媒を除去する方法は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、例えばプロペラ型攪拌機あるいはマグネチックスターラーなどで攪拌しながら常圧もしくは徐々に減圧して溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調節しながら溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。
【００１３】
水中乾燥法およびコアセルベーション法での製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩などの水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが挙げられる。
【００１４】
（ニ）噴霧乾燥法
噴霧乾燥法によって生体内分解性マトリックスを製造する場合には、水あるいは水溶性成分を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、微粒状の生体内分解性カプセルを調製する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際、所望によって水あるいは水溶性成分を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液と同時に、生体内分解性マトリックスの凝集防止を目的として前述の凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。生体内分解性マトリックスは、好ましくは、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含む生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を用いて製造される。このようにして得られた生体内分解性マトリックスは、必要であれば、加温・減圧下生体内分解性マトリックス中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
本発明において用いられる生体内分解性マトリックス中の残留有機溶媒量は、約１,０００ppm以下、好ましくは約５００ppm以下、さらに好ましくは２５０ppm以下、特に好ましくは約１００ppm以下である。
【００１５】
本発明における生体内分解性マトリックスに用いられる原料は、好ましくは生体内分解性ポリマーである。生体内分解性ポリマーとしては、水に難溶または不溶である高分子重合物、例えば脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等、バリン酸、ロイシン酸）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）が挙げられる。あるいはこれらの混合物が挙げられる。重合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。
【００１６】
生体内分解性ポリマーは、好ましくは脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕である。
上記した脂肪族ポリエステル中、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成された重合体、共重合体が確実な生体内分解性および生体適合性の観点から好ましい。脂肪族ポリエステルは、さらに好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成された共重合体である。特に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の２種以上から合成された共重合体である。
また、本発明における生体内分解性ポリマーは、公知の方法で製造され、かつ通常の注射針を用いて投与可能な生体内分解性マトリックスに成型された時に、エタノールなどの有機溶媒を使用せずに水が該生体内分解性マトリックスに浸透し、膨潤させることが可能なものが好ましい。
【００１７】
上記α−ヒドロキシカルボン酸類はＤ−体、Ｌ−体、およびＤ、Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜２５／７５の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜３０／７０の範囲のヒドロキシカルボン酸である。
上記α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体の例としては、例えばグリコール酸と他のα−ヒドロキシ酸類との共重合体が挙げられ、該α−ヒドロキシ酸としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、バリン酸、ロイシン酸が好ましい。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体または２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、特に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００１８】
乳酸−グリコール酸共重合体において、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は約１００／０〜４０／６０が好ましい。さらに好ましくは、組成比が約９０／１０〜４５／５５の場合である。特に好ましくはその組成比約６０／４０〜４５／５５である。上記グリコール酸と乳酸の共重合体の重量平均分子量は約３,０００〜１２,０００が好ましい。さらに好ましくは、約４,０００〜１０,０００である。本発明において該共重合体を用いて製造した生体内分解性マトリックスへの水溶性ポリペプチドの浸透および生体内に投与後の生体内分解性マトリックスの消失速度は、組成比および重量平均分子量の組み合わせにより影響を受ける。生体内に投与（皮下投与など）された後の消失期間が約２週間であり、生体内分解性カプセルへの水の浸透に問題が無いものとして、例えば組成比約５０／５０で重量平均分子量が約４,０００〜９,０００、好ましくは約５,０００〜９,０００のものが挙げられる。
本発明において、組成比および重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸共重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、例えば組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約６,０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約４,０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物が挙げられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５から約７５／２５である。
また、乳酸−グリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２から約４.０が好ましい。さらに好ましくは、約１.５から約３.５である。乳酸−グリコール酸共重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法に従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００１９】
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体において、グリコール酸が約１０〜７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましい。さらに好ましくは、グリコール酸が約２０〜７５モル％である場合である。特に好ましくは、グリコール酸が約３０〜７０モル％である場合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、約２,０００〜２０,０００が好ましい。重量平均分子量は、さらに好ましくは約３,０００〜１０,０００である。重量平均分子量は、特に好ましくは約４,０００〜８,０００である。これらのグリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、約１.２〜４.０が好ましい。分散度は、特に好ましくは約１.５〜３.５である。本グリコール酸共重合体は自体公知の製造法、例えば、特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下の脱水重縮合反応による製造方法）に従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００２０】
上記したグリコール酸共重合体は、さらにポリ乳酸と混合して使用されてもよい。該ポリ乳酸としては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでもよいが、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜２０／８０の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜２５／７５の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約５５／４５〜２５／７５の範囲のポリ乳酸である。該ポリ乳酸は、重量平均分子量が約１,５００〜１０,０００のものが好ましい。さらに好ましくは、重量平均分子量が約２,０００〜８,０００の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、重量平均分子量が約３,０００〜６,０００の範囲のポリ乳酸である。また、ポリ乳酸の分散度は約１.２〜４.０が好ましい。ポリ乳酸の分散度は、特に好ましくは、約１.５〜３.５である。
ポリ乳酸の製造法については、乳酸の二量体であるラクタイドを開環重合する方法と乳酸を脱水重縮合する方法が知られている。本発明で使用する比較的低分子のポリ乳酸を得るためには、乳酸を直接脱水重縮合する方法が好ましい。該方法は、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載されている。
グリコール酸共重合体とポリ乳酸を混合して使用する場合、その混合比は、例えば約１０／９０〜９０／１０（重量％）の範囲である。混合比は、好ましくは約２０／８０〜８０／２０（重量％）の範囲である。さらに好ましくは、約３０／７０〜７０／３０（重量％）の範囲である。
【００２１】
本発明において、無触媒脱水重縮合で合成される生体内分解性ポリマーは、末端に遊離のカルボキシル基を有する。
末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーは、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する重合体である。
約１〜３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン（２５ml）とメタノール（５ml）との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で室温での撹拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量 ＝ 20,000 Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液（ml）
以下、これを末端基定量による数平均分子量と表記する。
例えば１種類以上のα−ヒドロキシ酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は末端に遊離カルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００２２】
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対してＧＰＣ測定による数平均分子量は各種分析、解析条件（例えば移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、例えばＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０.５〜２倍の範囲内であることをいう。好ましくは、約０.８〜１.５倍の範囲内であることをいう。また、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回るとは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍を越える場合をいう。
本発明においては、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する重合体が好ましい。
本明細書での重量平均分子量および数平均分子量とは、重量平均分子量が１２０,０００、５２,０００、２２,０００、９,２００、５,０５０、２,９５０、１,０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量および数平均分子量を意味する。測定はＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用、移動相としてクロロホルムを用いた。
また、分散度は、（重量平均分子量／数平均分子量）により算出される。
【００２３】
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩は、水溶性であり、かつ生体に悪影響を及ぼさない脂肪族カルボン酸金属塩であれば特に限定されない。
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩は、好ましくは常温（約２０℃）で水に対する溶解度が約２０mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩、さらに好ましくは溶解度が約１００mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩、特に好ましくは溶解度が約２００mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩である。
水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩において、脂肪族カルボン酸は、好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸である。脂肪族カルボン酸としては、例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。
脂肪族モノカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）が挙げられる。
脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）が挙げられる。
脂肪族トリカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例、トリカルバリル酸、１,２,３−ブタントリカルボン酸等）が挙げられる。
上記した脂肪族カルボン酸は、水酸基を１ないし２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。
脂肪族カルボン酸は、好ましくは脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、さらに好ましくは炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸、特に好ましくは炭素数２ないし３の飽和脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例としては、例えば酢酸等が挙げれる。
【００２４】
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩における金属塩としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）塩、銅（I価）塩等の単価金属塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム等）塩、亜鉛（II価）塩、鉄（II価，III価）塩、銅（II価）塩、スズ（II価，IV価）塩、アルミニウム（II価，III価）塩等の多価金属塩が挙げられる。
金属塩は、好ましくは多価金属塩である。金属塩は、特に好ましくはカルシウム塩、亜鉛塩である。
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の具体例を挙げれば、例えば酢酸ナトリウム，酢酸カリウム，酢酸カルシウム，酢酸亜鉛，プロピオン酸ナトリウム，プロピオン酸カルシウム，グリコール酸ナトリウム，グリコール酸亜鉛，乳酸ナトリウム，乳酸カルシウム，乳酸亜鉛，酒石酸ナトリウム，酒石酸亜鉛，クエン酸ナトリウム等である。水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の特に好ましい具体例を挙げれば、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛等である。
上記した水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同様にして水溶性芳香族カルボン酸金属塩も用いられる。水溶性芳香族カルボン酸金属塩の具体例を挙げれば、例えば安息香酸ナトリウム，安息香酸亜鉛，サリチル酸ナトリウム，サリチル酸亜鉛等である。
生体内分解性マトリックスの製造の際に使用する有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（エタノール、メタノール）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは混合して用いられてもよい。有機溶媒は、好ましくはジクロロメタン、アセトニトリルである。
【００２５】
本発明の徐放性製剤は、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させることにより製造することができる。該徐放性製剤（例、マイクロカプセル）は、例えば以下のような操作によって製造することができる。以下、このようにして製造される徐放性製剤を単にマイクロカプセルと称する場合がある。
１）水溶性ポリペプチドの水溶液を調製する
２）生体内分解性マトリックスを１）の水溶液に接触させ、生体内分解性マトリックス内部に該水溶液を浸透させる
３）必要に応じて生体内分解性マトリックスに浸透されない水溶性ポリペプチドと生体内分解性マトリックスとを分離する（洗浄操作）
４）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤（例、マイクロカプセル）を乾燥させる
上記した水溶性ポリペプチドの水溶液に、水溶性ポリペプチドの溶解度を上げるため、あるいは水溶性ポリペプチドの生物活性を維持するために、生体内に注入しうる塩類、例えば無機塩類（例、食塩，燐酸一水素ナトリウムなど）、有機塩類（例、酢酸アンモニアなど）、アミノ酸（例、グリシン，アルギニン，ヒスチジンなど）などを添加してもよい。
上記した塩類は薬物の至適ｐＨ付近になるように複数組み合わされてもよい。この際、ｐＨは一般的には中性あるいは弱酸性になるように調整されるが、塩基性に調製される場合もある。該塩類の濃度は水溶性ポリペプチドの水溶液の張度が生理食塩水を基準として約１／５０〜５倍になるように調整される。好ましくは約１／２５〜３倍である。また、Tween 80 などの界面活性剤を添加してもよい。該界面活性剤の濃度は約０.０００１〜０.２％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０.００１〜約０.１％（ｗ／ｖ）が使用される。
【００２６】
また、水溶性ポリペプチドの水溶液に血清アルブミンを添加してもよい。血清アルブミンを添加することにより、水溶性ポリペプチドの溶解度が上がり、水溶性ポリペプチドの生物活性を保持できる。血清アルブミンは水溶性ポリペプチドの水溶液に添加してもよく、あるいは水溶性ポリペプチドと予め混合してあってもよい。血清アルブミンは人血清アルブミンが好ましく、人血液から分離精製されてもよくあるいは遺伝子工学的手法で生産されるものでもよい。水溶性ポリペプチドと血清アルブミンの混合比（重量比）は、例えば約１：１,０００〜約１００：１、好ましくは約１：１００〜約１０：１である。
水溶液中の水溶性ポリペプチドの濃度は特に限定されないが、単位重量あたりの生体内分解性マトリックスになるべく多量の水溶性ポリペプチドを浸透させるためには、水溶性ポリペプチドの溶解度以下でなるべく濃い濃度が好ましい。該溶解度は塩濃度、温度、添加物の有無によっても異なる。一般に生体内分解性マトリックスに浸透された水溶性ポリペプチドの濃度により徐放性製剤の水溶性ポリペプチド放出パターンが異なることが知られており、この観点からも水溶性ポリペプチド濃度は選択される。水溶性ポリペプチド濃度は、一般的には約１００μg／ml〜約５００mg／ml，好ましくは約１〜３００mg／ml，さらに好ましくは約５〜１００mg／mlである。
【００２７】
生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することにより製造される場合、生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を浸透させる際の水溶液のｐＨは、生体内分解性マトリックスに含有される水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の種類、水溶性ポリペプチドの等電点等によって異なるので一概には言えないが、好ましくは約３〜９、さらに好ましくは約３〜８である。ｐＨの調整は、例えば無機酸（例、塩酸等）、有機酸（例、酢酸等）等の酸、例えば水酸化アルカリ金属（例、水酸化ナトリウム等）等のアルカリにより適宜行えばよい。ここにおいて、使用される酸またはアルカリの量は、酸またはアルカリの電離度、強度、および目的とするｐＨにより、適宜用いればよい。水溶性脂肪族カルボン酸金属塩として特に酢酸ナトリウム、酢酸亜鉛または酢酸カルシウム等は、中性付近のｐＨで生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を浸透させることができるため好ましい。水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させる操作は、例えば水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとを混合させることにより行われる。
水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとを混合する際の混合順序は水溶性ポリペプチドの生物活性が保持される限り、任意に選択できる。例えば、水溶性ポリペプチドの水溶液に生体内分解性マトリックスを浸漬してもよいし、生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を添加してもよい。
【００２８】
水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスの混合比率は、生体内分解性マトリックスに十分に水溶性ポリペプチドの水溶液が浸透するように、水溶性ポリペプチドの水溶液の過剰量が使用される。すなわち、すべての生体内分解性マトリックスが水溶性ポリペプチドの水溶液に浸るように調製される。
水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとの重量比は、生体内分解性マトリックスの空隙率が異なるために、一概には決められないが、好ましくは約１：１０〜約２０：１、さらに好ましくは約１：５〜約１０：１である。しかし、一般には生体内分解性マトリックスに浸透されない水溶性ポリペプチドは再使用されず、貴重な水溶性ポリペプチドのロスを少なくするため、最小必要限の水溶性ポリペプチドの水溶液が使用される。水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとの混合は、通常、容器を用いて行われる。このような容器としては、水溶性ポリペプチドの吸着が少ないものが好まれ、例えばシリコナイズ（シリコン化処理）したガラスが挙げられる。また、水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわないように表面処理した合金（ステンレスあるいはチタン）なども好まれる。
【００２９】
混合操作としては例えば水溶性ポリペプチドの水溶液に生体内分解性マトリックスを添加し、静置あるいは水溶性ポリペプチドの生物活性を失わない程度の軽い攪拌操作を加えることにより行われる。該操作において、水溶性ポリペプチドの水溶液が過度に起泡しない程度に真空減圧してもよい。該混合操作は水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわないあるいは生体内分解性マトリックスの構成成分である生体内分解性ポリマーが分解しない温度が採用され、通常は室温で行なわれ、好ましくは冷所で行なわれる。混合操作における温度は、具体的には約１〜３０℃，好ましくは約４〜２５℃である。混合操作の時間は生体内分解性マトリックスの量、生体内分解性ポリマーの組成，分子量，温度その他の要因により異なるが、数時間から数十時間である。具体的には、例えば約４℃で約１０〜１００時間，約２５℃で約５〜５０時間が好ましい。この時間は水溶性ポリペプチドの生物活性を失わない範囲および、生体内分解性ポリマーが必要以上に加水分解しない範囲で任意に選択される。
生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することにより製造された場合、混合時間が短縮される。具体的には、混合時間は、例えば約４℃で約０.５〜２４時間，約２５℃で約０.５〜５時間である。
【００３０】
混合操作の後に必要があれば洗浄操作を加えてよい。該洗浄操作により生体内分解性マトリックスに浸透されなかった水溶性ポリペプチドは除去される。洗浄方法としては種々の方法が考えられるが、生体内分解性マトリックスを破壊しない方法、および生体内分解性マトリックスに浸透された水溶性ポリペプチドが生体内分解性マトリックス外に流出せず、かつその生物活性を失わない方法が採用される。例えば混合操作終了後に洗浄液を添加し、遠心分離あるいは濾過によりマイクロカプセルと洗浄液を分離する操作を繰り返す。本操作における洗浄液は蒸留水、あるいは塩（例、リン酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム等）、糖（例、マンニトール等）を含んだ水溶液が使用される。洗浄液は、好ましくはマンニトールを含んだ水溶液である。
このようにして得られたマイクロカプセルは、ついで乾燥される。乾燥方法としては、例えば凍結乾燥，真空乾燥などが挙げられる。乾燥方法としては、特に凍結乾燥が好ましい。また、乾燥操作における粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を含んだ洗浄液を使用してもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）などの水溶性多糖、ヒアルロン酸などのムコ多糖類、グリシン，フィブリン，コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム，リン酸水素ナトリウム等の無機塩類、レシチンなどのリン脂質などが挙げられる。
【００３１】
乾燥操作において乾燥時の温度は水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわず、マイクロカプセルの破壊しない任意の温度が採用される。好ましくは、用いられた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で該マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度に加熱する。ガラス転移温度とは示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用い、加温速度毎分約１０または２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度（Ｔｍｇ）をいう。好ましい加温温度としてはガラス転移温度より、約２〜１０℃程度高い温度が採用される。このような温度は、例えば約２５〜５０℃，好ましくは約３０〜４５℃である。加熱時間は、加熱温度、処理するマイクロカプセル量などにより異なるが、一般的にはマイクロカプセル自体の温度が所定の温度に達した後、数十時間、好ましくは約２４時間以内である。該加熱方法は特に限定されないが、マイクロカプセルが均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。具体例として、例えば恒温槽中で加熱する方法、マイクロ波で加熱する方法などが挙げられる。該乾燥操作によりマイクロカプセルを温血動物に投与後の初期の放出を抑制することが可能になる。
【００３２】
本発明においては、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させる際に有機溶媒を使用せず、また、過度の過熱を行わないため、製剤化過程において水溶性ポリペプチドの生物活性が損なわれることは少ない。ここでいう有機溶媒は、例えばハロゲン化炭化水素，アルコール類，アセトニトリル，氷酢酸などである。
また、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を用いることにより、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックス内に効率よく浸透させることができる。本発明の徐放性製剤は、例えば注射剤として用いる場合、長期間、例えば約１週間〜１カ月にわたり、ほぼ一定速度の徐放性を示す。
本発明の徐放性製剤中の水溶性ポリペプチドの含有量は、例えば徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを適当な溶媒で溶解し、マイクロカプセル中に含有される水溶性ポリペプチドをＨＰＬＣなどのクロマトグラフあるいはエンザイムイミュノアッセイなどの免疫学的測定法により分離定量する方法、あるいは分離された水溶性ポリペプチドの生物活性を測定する方法などで決定される。マイクロカプセル中の生体内分解性ポリマーに対する水溶性ポリペプチドの含有率は、一般的に約０.１〜３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１〜２０％（ｗ／ｗ）である。
【００３３】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
本発明において、徐放性製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを注射剤とするには、マイクロカプセルを分散剤（例、Tween 80、HCO-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の多糖類、硫酸プロタミンなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、局所麻酔剤（塩酸キシロカイン，クロロブタノールなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいは中鎖脂肪酸トリグリセライド〔例、ミグリオール８１２（フルス・アクチエンゲゼルシャフト社）等〕またはこれらにレシチンなどのリン脂質を混合したものと共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００３４】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば粒子径として約０.１から３００μｍの範囲が挙げられる。好ましくは、約１から１５０μｍの範囲の粒子径である。さらに好ましくは、約２から１００μｍの範囲の粒子径である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
本発明の徐放性製剤の適応は、使用する水溶性ポリペプチドにより異なる。本発明の徐放性製剤は、水溶性ポリペプチドが、例えばインターフェロンアルファである場合は、ウィルス性肝炎（例、Ｃ型肝炎，ＨＢｅ抗原陽性Ｂ型慢性活動性肝炎など），癌（例、腎癌，多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチンの場合は貧血（例、腎透析時貧血など）など、Ｇ−ＣＳＦの場合は好中球減少症（例、制癌剤治療時），感染症など、ＩＬ−２の場合は癌（例、血管内皮腫など）、ＦＧＦの場合は消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合は血小板減少症など、ＮＧＦの場合は老人性痴呆，神経病（ニューロパシー）など、ＴＰＡの場合は血栓症など、インスリンの場合は糖尿病など、腫瘍壊死因子の場合は癌などの治療または予防に有効である。
【００３５】
徐放性製剤の投与量は、水溶性ポリペプチドの種類と含量、水溶性ポリペプチド放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、含有される水溶性ポリペプチドの薬理効果が発揮される量であればよい。水溶性ポリペプチドの１回当たりの投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、水溶性ポリペプチドの種類によって異なるが、好ましくは、成人１人当たり約０.０００１〜１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.０００５〜１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の投与量は成人１人，１回当たり好ましくは、約０.０００５〜５０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.００２５〜１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回等、水溶性ポリペプチドの種類と含量、剤型、水溶性ポリペプチド放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。本発明の製剤の保存は常温あるいは冷所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００３６】
【実施例】
以下に参考例、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。以下、％は特記しない限り重量／容量パーセントを示す。
実施例１
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,４００、ＧＰＣ測定による数平均分子量 ２,９００、末端基定量による数平均分子量２,２００、和光純薬工業製）２.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に溶解した液に加えて溶解した。内水相として注射用生理食塩水１mlを加え、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌した。予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液５００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、４,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた後、遠心分離機（05PR-22、日立製作所）を用いて２,０００rpmで捕集した。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された乳酸-グリコール酸共重合体マトリックスは少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末として得られた。
ポリエチレン製試験管にインターフェロンアルファの１.０８×１０9 ＩＵ（人血清アルブミン約２５mgを含有）を秤量し、２００μlの蒸留水で溶解した。これに前記のマイクロカプセル２００mgを添加し、密栓後４〜８℃の冷蔵庫で約４日間静置した。該操作後に５mlの蒸留水を加えて約１分間静かに攪拌する。約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた。この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール４４mgを加え、蒸留水２mlを添加し、ゆっくりと攪拌する。その後、得られる分散液を真空乾燥した（温度；４０℃／６時間）。
【００３７】
実施例２
実施例１と同様にして、乳酸-グリコール酸共重合体マトリックスを粉末として得た。
ポリエチレン製試験管にインターフェロンアルファの１.０８×１０9 ＩＵ（人血清アルブミン約２５mgを含有）を秤量し、２００μlの蒸留水で溶解した。これに前記のマイクロカプセル２００mgを添加し、密栓後４〜８℃の冷蔵庫で約３０時間静置した。該操作後に５mlの蒸留水を加えて約１分間静かに攪拌する。約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた。この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった。得られたマイクロカプセルに０.１％ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１８０万）水溶液を１mlを添加し、ゆっくりと攪拌した。その後、得られる分散液を凍結乾燥した（１６時間）。
【００３８】
実施例３
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に炭酸カルシウム４ｇを添加した後、ボルテックスミキサーで約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。ついで、余剰の炭酸カルシウムを除去するために１Ｎ塩酸１０mlを添加した。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末４mg（約８×１０8ＩＵ（国際単位））を秤量し、１０mＭ塩酸溶液２mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス５０mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に蒸留水４mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった）。得られる分散液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約４８mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））（免疫実験用ブロッキング剤）溶液で抽出し、ついで酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）によりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファ５７０万ＩＵを含有していた。
【００３９】
実施例４
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末６mg（約１.２×１０9ＩＵ（国際単位））を秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール３０mgおよび蒸留水０.５mlを加え、ゆっくりと攪拌した後、得られる懸濁液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約３１０mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））（免疫実験用ブロッキング剤）溶液で抽出し、ついで酵素免疫学的測定法（インターフェロン抗体を用いるサンドイッチ法、以下、ＥＩＡと略す）によりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファ２３０万ＩＵを含有していた。
【００４０】
実施例５
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）８００mg含有水溶液１mlを添加した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を６mg（約１.２×１０9ＩＵ）秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で１０℃にて約１日間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１時間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られるマイクロカプセルを凍結乾燥した。
マイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファ７８万ＩＵを含有していた。
【００４１】
実施例６
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ(４ml) に加えて溶解した。この溶液に酢酸カルシウム（１水和物）０.４ｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％ (w/w) ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を４mg（８×１０8ＩＵ）秤量し、１mＭ塩酸溶液２mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス５０mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に４mlの蒸留水を加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。ついで、得られる分散液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約４８mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファを９４０万ＩＵ含有していた。
【００４２】
実施例７
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた 。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管に生体内分解性マトリックス５０mgを秤量し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムによりｐＨを調整した２mg／mlインターフェロンアルファ溶液（約４.０×１０8ＩＵ）（ｐＨは約２、約４、約５、約８の４段階）を添加した後、４℃で２４時間回転混合することにより、生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させた。約１,０００rpmで遠心分離操作を行い、上清を除去した後、蒸留水４mlで２回洗浄し、蒸留水０.５mlを加えた後、凍結乾燥した。
【００４３】
実施例８
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸カルシウム（１水和物）０.４ｇを添加した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約４.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４４】
実施例９
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸ナトリウム（３水和物）０.２ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４５】
実施例１０
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターロイキン２（２０μg）を含有する水溶液２mlを秤量し、ついで、これに前記の生体内分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約５時間回転混合した。なお、インターロイキン２は、特開昭６１−７８７９９号公報に記載の方法により製造し、特開昭６０−１１５５２８号公報に記載の精製法で精製した、Ｎ末端にメチオニンが結合しているものと結合していないものとの混合物を用いた。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール３０mgを加え、蒸留水０.５mlで溶解し、ゆっくりと撹拌した。その後、得られる懸濁液を凍結乾燥した。
【００４６】
実施例１１
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,８００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,８０５、和光純薬工業製）５.０ｇと安息香酸亜鉛７８２ｍｇをジクロロメタン６.６２５ｇ(５ml)に添加し、室温で３時間振盪し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％ (w/w) ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液１,０００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を２mg（１.７×１０8ＩＵ）秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３０２mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で１５℃にて約５時間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール３０mgを加え、蒸留水０.５mlで溶解し、ゆっくりと撹拌した。その後、得られる懸濁液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約３１０mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファを３６１万ＩＵ含有していた。
実施例１２
安息香酸亜鉛をサリチル酸亜鉛９９５ｍｇとする以外は実施例１１と同様にして、乳酸-グリコール酸共重合体のマトリックスを粉末として得た。ついで、マトリックス３０４mgを用いること以外は実施例１１と同様にして、マイクロカプセルを得た。
マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファを１９３万ＩＵ含有していた。
【００４７】
比較例１
インターフェロンアルファ凍結乾燥粉末２mgを０.５％牛アルブミン含有りん酸緩衝生理食塩水溶液２mlに溶解した（ＥＩＡによる測定で１.７５億ＩＵ／mlの濃度）。
比較例２
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に２ｇ／mlの濃度に調整した塩化亜鉛水溶液０.５mlを添加した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４８】
比較例３
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に炭酸亜鉛０.２ｇを添加した後、ボルテックスミキサーで約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４９】
実験例１
実施例１で得られたマイクロカプセル約４０mgを０.５mlの分散媒（２.５mgのカルボキシメチルセルロース、０.５mgのポリソルベート ８０、２５mgのマンニトールを溶解した蒸留水）に分散して８週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に２２Ｇ注射針で投与した（マイクロカプセルとしての投与量１３３mg／kg）。投与後一定時間毎にラット尾部より採血し、血清中のインターフェロンアルファの濃度を酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）で測定したところほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。
実験例２
実施例２で得られたマイクロカプセル約３０mgを用い、実験例１と同様にして、ラットに投与し、血清中のインターフェロンアルファの濃度を酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）で測定したところほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。
【００５０】
実験例３
実施例４で得られたマイクロカプセル約２２mgおよび実施例５で得られたマイクロカプセル約６４mgをそれぞれ分散媒０.５ml（５mgのカルボキシメチルセルロース、２mgのポリソルベート ８０（界面活性剤）、２５mgのマンニトールを蒸留水１リットルに溶かした溶液）に分散して、８週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に１８Ｇ注射針で投与した（ラット１匹あたり約５,０００万ＩＵのインターフェロンアルファを投与したことになる）。投与後一定時間毎にラット尾部より採血し、血清中のインターフェロンアルファの濃度をＥＩＡで測定した。対照として比較例１で得られたインターフェロンアルファ水溶液をラットに皮下投与した（ラット１匹あたりのインターフェロンアルファ投与量：約５,０００万ＩＵ）。比較例１のマイクロカプセル投与群では投与後３日目の血清中インターフェロンが検出限界程度に低下していたが、実施例４および実施例５のマイクロカプセル投与群では初期の高い血中濃度に引き続きほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。
【００５１】
実験例４
生体内分解性マトリックスへのインターフェロンアルファの浸透効率（マイクロカプセル中のインターフェロン含量）に及ぼすインターフェロンアルファ溶液のｐＨと各種亜鉛塩との関係を調べた。具体的な方法を以下に示す。
実施例７（酢酸亜鉛）、比較例２（塩化亜鉛）および比較例３（炭酸亜鉛）で得られたマイクロカプセルを、１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、図１に示すように、酢酸亜鉛を用いた場合には、インターフェロンアルファが物理的に比較的安定であるｐＨ条件下で、インターフェロンアルファの浸透効率が良好であった。
実験例５
生体内分解性マトリックスへのインターフェロンアルファの浸透効率（マイクロカプセル中のインターフェロン含量）に及ぼすインターフェロンアルファ溶液のｐＨと酢酸カルシウム塩との関係を調べた。以下、実験例３と同様に行った。その結果、図２に示すように、インターフェロンアルファが物理的に比較的安定であるｐＨ条件下で、インターフェロンアルファの浸透効率が良好であった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、水溶性ポリペプチドを有機溶媒に接触させずに生体内分解性マトリックスに浸透させることができ、水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわずに製剤化することが可能である。また、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を用いることにより、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックス内に効率よく浸透させることができる。本発明の徐放性製剤は、例えば注射剤として用いる場合、数日〜１ケ月以内（例えば約１〜２週間）にわたり優れた徐放性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロカプセル中のインターフェロン含量に及ぼすインターフェロン溶液のｐＨと各種亜鉛塩との関係を示す。図中、●は酢酸亜鉛（実施例７）を、○は塩化亜鉛（比較例２）を、△は炭酸亜鉛（比較例３）を示す。
【図２】マイクロカプセル中のインターフェロン含量に及ぼすインターフェロン溶液のｐＨと酢酸カルシウム（実施例８）との関係を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤に関する。
【従来の技術】
蛋白質（ポリペプチドとも称する）は生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、このうちいくつかについては遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞、あるいはハムスターなどの生体を用いて大量に生産させ、医薬品としての応用が図られている。これらの蛋白質医薬品の例としてはインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ）、インターロイキン２、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などが挙げられる。しかしながら、これらの蛋白質は一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。この問題を解決するために徐放製剤を開発する種々の試みがなされている。サイトカインに代表される蛋白質の投与は治療効果を判定しながら慎重に投与する必要があるため、１週間から２週間程度の放出期間を有する注射可能な徐放製剤特にマイクロカプセル徐放製剤の開発が望まれている。しかしながら、一般的に蛋白質は熱、有機溶媒，強いせん断力などにより変性し、その生物活性が低下することが知られている。例えば、蛋白質水溶液を６０℃で２０分間加熱することによりその生物活性が急速に失われる場合がある。また、より低い温度である５０℃でも１時間程度加熱することによりその生物活性が低下してしまう場合もある。同様にエタノール、ジクロルメタンなどの有機溶媒によっても蛋白質の生物活性が低下する場合があることが知られている。
【０００２】
ＷＯ９３／０６８７２号公報には骨形成蛋白質の長期間にわたる放出を可能にする生体内分解性ポリマーで作成した空隙のある粒子、骨形成蛋白質、および自己血凝集塊を組み合わせた製剤の技術が開示されている。本技術においては主薬である骨形成蛋白質は投与直前に粒子に吸着させ、さらに自己血を加え凝集塊を形成させることにより放出を制御する手法が取られている。徐放期間は数週間程度である。自己血を使用するために一般的に使用ではない。
ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Journal of Controlled Release），２３巻，１５７頁，（１９９３年）（A. Supersaxo et al.）には、生体内分解性ポリマーを用いて空隙率の大きいマイクロカプセルを作製した後、高分子物質を染み込ませることにより有機溶媒と高分子物質を接触させずにマイクロカプセル内に取り込む技術が記載されている。具体的には使用されるポリ乳酸は疎水性であるため、最初に有機溶媒である５０％エタノールを用いてマイクロカプセルを湿らせた後に水で置換し、さらに高分子物質の溶液で置換する操作を行っている。
特開平５−３２５５９号公報には医薬組成物の構成成分と生理学的活性物質とを有機溶剤中に溶解するか、又は、医薬組成物の構成成分と生理学的活性物質とを有機媒体又は水性媒体中に均一に分散し、これを乾燥することによる医薬組成物の製造方法が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように蛋白質などの生物活性を保持しながら徐放性製剤を製造する種々の試みがなされているものの、薬物のマトリックスへの浸透効率。薬物の初期バーストの抑制、長期間にわたる一定の薬物放出速度等の点で、まだ満足すべきものではない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の問題点を解決するため鋭意研究をおこなったところ、生体内に投与後の消失が約１〜３週間程度の生体内分解性ポリマーで予め微粒子状の生体内分解性マトリックスを製造し、該生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドを水中で浸透させて得られる製剤を生体内に投与することにより、水溶性ポリペプチドの血液中濃度を約１〜２週間持続させることが可能になることを見いだし、これに基づいてさらに研究した結果本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させることを特徴とする徐放性製剤の製造法、
（２）生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造される第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（３）脂肪族カルボン酸が脂肪族モノカルボン酸である第２項記載の徐放性製剤の製造法、
（４）金属塩が多価金属塩である第２項記載の徐放性製剤の製造法、
（５）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させ、ついで乾燥する第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（６）乾燥が凍結乾燥である第５項記載の徐放性製剤の製造法、
（７）水溶性ポリペプチドがサイトカインである第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（８）サイトカインがインターフェロンである第７項記載の徐放性製剤の製造法、
（９）生体内分解性マトリックスが微粒子状である第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（１０）生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーから製造される第１項記載の徐放性製剤の製造法、
（１１）生体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエステルである第１０項記載の徐放性製剤の製造法、
（１２）脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸から誘導される共重合体である第１１項記載の徐放性製剤の製造法、
（１３）共重合体が乳酸−グリコール酸共重合体である第１２項記載の徐放性製剤の製造法、
（１４）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤、
（１５）生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造される第１４項記載の徐放性製剤、および
（１６）注射用である第１４項記載の徐放性製剤に関する。
【０００５】
本発明における水溶性ポリペプチドは、好ましくは分子量約２００〜約５０,０００の水溶性ポリペプチドである。水溶性ポリペプチドは、さらに好ましくは分子量約５,０００〜約４０,０００の水溶性ポリペプチドである。
水溶性ポリペプチドは、ホルモン作用を有し、内分泌されるものであればよい。このような水溶性ポリペプチドとしては、例えばサイトカイン，造血因子，各種増殖因子，酵素などが挙げられる。
サイトカインとしては、例えばリンホカイン，モノカインなどが挙げられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン（ＩＬ−１），腫瘍壊死因子などが挙げられる。
造血因子としては、例えばエリスロポエチン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ），トロンボポエチン，血小板増殖刺激因子，メガカリオサイトポテンシエーターなどが挙げられる。各種増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＦＧＦ−９など）〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology），１３巻，７号，４２５１頁（１９９３年）〕，神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー，インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２など），骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリーなどが挙げられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ），ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）などが挙げられる。
また、上記以外にも、例えば成長ホルモン，インスリン，ナトリウム利尿ペプチド，ガストリン，プロラクチン，副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ），モチリン，カリクレイン，膵臓再生に関与するタンパク質であるRegタンパク質〔特公平１−１３２３８８号公報、フェブス・レターズ（FEBS Letters），２７２巻，８５頁（１９９０年）〕なども本発明の水溶性ポリペプチドとして用いられる。
水溶性ポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組み換えにより製造されたものでもよい。
水溶性ポリペプチドは、上記した水溶性ポリペプチドに限定されるものではない。すなわち、水溶性ポリペプチドは、糖鎖を有していても有していなくてもよく、構造の異なる糖鎖を有していてもよい。さらに、水溶性ポリペプチドは、上記した水溶性ポリペプチドの突然変異物質、誘導体（作動性、拮抗性）、またはフラグメントであってもよい。
【０００６】
水溶性ポリペプチドは、好ましくはサイトカインなどである。該サイトカインとしては、例えばリンホカイン，モノカインなどが挙げられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン（ＩＬ−１），腫瘍壊死因子などが挙げられる。
水溶性ポリペプチドは、さらに好ましくはリンホカインである。該リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１２）などが挙げられる。
水溶性ポリペプチドは、特に好ましくはインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ）などである。
【０００７】
本発明において、生体内分解性マトリックスは微粒子状であることが好ましい。生体内分解性マトリックスは、通常の皮下あるいは筋肉内注射に使用される注射針を通過するものであればよく、該生体内分解性マトリックスの粒子径は、例えば平均径として約０．１〜３００μm、好ましくは約１〜１５０μm、特に好ましくは約２〜１００μmである。
【０００８】
生体内分解性マトリックスは、例えば生体内分解性ポリマーから自体公知の方法によって製造される。このような方法としては、例えば以下に示す水中乾燥法，相分離法，噴霧乾燥法あるいはこれらに準じる方法などが挙げられる。生体内分解性マトリックスは、好ましくは生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することにより製造される。
（イ）水中乾燥法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法）
内水相として、例えば水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を使用する。該水溶性成分としては、例えば無機塩類（例、食塩，燐酸水素ナトリウム，燐酸水素２ナトリウムなど）、糖類（例、マンニトール，ブドウ糖，イヌリンなど）、有機塩類（例、炭酸ナトリウム，炭酸マグネシウム，酢酸アンモニウムなど）、アミノ酸（例、グリシン，アルギニン，ヒスチジンなど）などが挙げられる。水溶性成分の水溶液中の濃度は、例えば約０.１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０.５〜５％（ｗ／ｖ）である。特に水溶性成分が食塩である場合には、例えば０.９％（ｗ／ｖ）の生理食塩水を使用することが好ましい。また、内水相に上記水溶性成分の代わりに炭酸カルシウムなどを分散させてもよい。好ましくは、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含有する水溶液が内水相として用いられる。該金属塩の水溶液中の濃度は各金属塩の溶解度によって異なるが、例えば約１０〜９０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２０〜８０％（ｗ／ｖ）である。
上記した水あるいは水溶性成分を含有する水溶液を、α−ヒドロキシカルボン酸から合成される重合体、共重合体などの生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に乳化，分散し、Ｗ／Ｏ型乳化物（エマルション）を作る。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は生体内分解性ポリマーの分子量，有機溶媒の種類によって異なるが、一般的には約０.０１〜９０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、さらに好ましくは約０.１〜８０％（ｗ／ｗ）である。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、特に好ましくは約１〜７０％（ｗ／ｗ）である。
水あるいは水溶性成分を含有する水溶液と生体内分解性ポリマー有機溶媒溶液との比率は１：１,０００（ｖ／ｖ）〜１：１（ｖ／ｖ）、好ましくは１：１００（ｖ／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１：５０（ｖ／ｖ）〜１：５（ｖ／ｖ）である。乳化操作は、公知の分散方法が用いられる。該方法は、例えばタービン型攪拌機、ホモジナイザーなどを用いて行われる。
ついで、このようにして調製されたＷ／Ｏ型エマルションをさらに水相中（外水相）に加えて、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性マトリックスを調製する。油相溶媒の蒸発は、例えばタービン型攪拌機などを用いて攪拌することにより行う。この際の水相体積は一般的には油相体積の約１〜１０,０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５〜２,０００倍から選ばれる。
【０００９】
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なＯ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は約０.００１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０.０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。前記の内水相に水溶性成分の代わりに炭酸カルシウムを分散させた場合には、外水相に稀塩酸を添加することにより炭酸カルシウムは溶解する。
また、外水相中に、内水相で用いた水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同一または異なった水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度が約０.０１〜２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.１〜１０％（ｗ／ｗ）となるように水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度を変えることにより、生体内分解性マトリックスからの水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の溶出をコントロールすることもできる。
このようにして得られた生体内分解性マトリックスを遠心分離あるいは濾過して分取した後、生体内分解性マトリックスの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
得られた生体内分解性マトリックスの表面は、平滑ではなく、大小様々な穴が存在し、生体内分解性マトリックス内部にまでその穴が通じているものもある。生体内分解性マトリックス中のこれらの穴の容積の占める割合（空隙率）は、例えば水銀圧入法あるいはＢＥＴ法により定量可能である。空隙率は、内水相中の成分、その濃度、内水相溶液と生体内分解性ポリマー有機溶媒溶液との比率、外水相体積と油相体積の比率、外水相の温度などで異なり、また、生体内分解性マトリックス内部での穴の構造は異なる。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。なお、生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として原子吸光法等の方法により金属として定量される。
【００１０】
（ロ）水中乾燥法（Ｏ／Ｗ法）
本発明において、生体内分解性マトリックスを製造する方法として内水相を用いない方法がある。該方法においては、まず生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を作製する。この際、有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、生体内分解性ポリマーの分子量，有機溶媒の種類などによって異なるが、一般的には約０.０１〜９０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、さらに好ましくは約０.１〜８０％（ｗ／ｗ）である。有機溶媒溶液中の生体内分解性ポリマーの濃度は、特に好ましくは約１〜７０％（ｗ／ｗ）である。
生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に炭酸カルシウムを添加，分散させてもよい。この際、炭酸カルシウムの添加量は、炭酸カルシウム：生体内分解性ポリマーの重量比が約５：１〜約１：１００，好ましくは約２：１〜約１：１０となるようにする。
好ましくは、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加、分散させる。この際、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の添加量は、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩：生体内分解性ポリマーの重量比が約５：１〜約１：１００，好ましくは約２：１〜約１：５０，さらに好ましくは約１：１〜約１：１０となるようにする。
ついで、このようにして調製された有機溶媒溶液をさらに水相中に加え、タービン型攪拌機などを用いてＯ／Ｗエマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ生体内分解性マトリックスを調製する。この際の水相体積は一般的には油相体積の約１〜１０,０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２〜５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５〜２,０００倍から選ばれる。
【００１１】
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なＯ／Ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらの中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は約０.００１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０.０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲で用いられる。また、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に炭酸カルシウムを添加，分散させる場合には、外水相中に希塩酸を添加する。
また、外水相中に、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に添加、分散した水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同一または異なった水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を加えてもよい。この際、外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度が約０.０１〜２０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.１〜１０％（ｗ／ｗ）となるように水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を添加することが好ましい。外水相中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の濃度を変えることにより、生体内分解性マトリックスからの水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の溶出をコントロールすることもできる。
さらに、生体内分解性マトリックスを製造する方法として、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含有する外水相に加え、前記と同様にしてＯ／Ｗエマルションを形成させる方法が挙げられる。
このようにして得られた生体内分解性マトリックスを遠心分離あるいは濾過して分取した後、生体内分解性マトリックスの表面に付着している乳化剤などを蒸留水で数回繰り返し洗浄し、再び蒸留水などに分散して凍結乾燥する。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。
【００１２】
（ハ）相分離法（コアセルベーション法）
相分離法により生体内分解性マトリックスを製造する場合には、上記のＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液にコアセルベーション剤を攪拌下徐々に加え、生体内分解性ポリマーを析出、固化させる。該コアセルベーション剤はｗ／ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液の体積の約０.０１〜１,０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０.０５〜５００倍の体積量である。特に好ましくは、約０.１〜２００倍の体積量である。
コアセルベーション剤としては、生体内分解性ポリマーの溶媒に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、ポリマーを溶解しないものであればよい。具体的には、例えば、シリコン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどが挙げられる。これらは２種以上混合して用いてもよい。
このようにして得られた生体内分解性マトリックスを濾過して分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除去する。さらに、水中乾燥法と同様の方法で洗浄を行い、ついで生体内分解性マトリックスを凍結乾燥する。
溶媒を除去する方法は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、例えばプロペラ型攪拌機あるいはマグネチックスターラーなどで攪拌しながら常圧もしくは徐々に減圧して溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調節しながら溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。
生体内分解性マトリックス中の水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の含量は、金属として好ましくは約０.０１〜１０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０.０５〜７％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０.１〜５％（ｗ／ｗ）である。
【００１３】
水中乾燥法およびコアセルベーション法での製造では、粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）、ヒアルロン酸あるいはこれのアルカリ金属塩などの水溶性多糖、グリシン、フィブリン、コラーゲン等等の蛋白質、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが挙げられる。
【００１４】
（ニ）噴霧乾燥法
噴霧乾燥法によって生体内分解性マトリックスを製造する場合には、水あるいは水溶性成分を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、微粒状の生体内分解性カプセルを調製する。該ノズルとしては、例えば二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。この際、所望によって水あるいは水溶性成分を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液と同時に、生体内分解性マトリックスの凝集防止を目的として前述の凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。生体内分解性マトリックスは、好ましくは、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含む水溶液と生体内分解性ポリマーとを含むＷ／Ｏエマルションあるいは水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を含む生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を用いて製造される。このようにして得られた生体内分解性マトリックスは、必要であれば、加温・減圧下生体内分解性マトリックス中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
本発明において用いられる生体内分解性マトリックス中の残留有機溶媒量は、約１,０００ppm以下、好ましくは約５００ppm以下、さらに好ましくは２５０ppm以下、特に好ましくは約１００ppm以下である。
【００１５】
本発明における生体内分解性マトリックスに用いられる原料は、好ましくは生体内分解性ポリマーである。生体内分解性ポリマーとしては、水に難溶または不溶である高分子重合物、例えば脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等、バリン酸、ロイシン酸）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）が挙げられる。あるいはこれらの混合物が挙げられる。重合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。
【００１６】
生体内分解性ポリマーは、好ましくは脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕である。
上記した脂肪族ポリエステル中、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成された重合体、共重合体が確実な生体内分解性および生体適合性の観点から好ましい。脂肪族ポリエステルは、さらに好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成された共重合体である。特に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の２種以上から合成された共重合体である。
また、本発明における生体内分解性ポリマーは、公知の方法で製造され、かつ通常の注射針を用いて投与可能な生体内分解性マトリックスに成型された時に、エタノールなどの有機溶媒を使用せずに水が該生体内分解性マトリックスに浸透し、膨潤させることが可能なものが好ましい。
【００１７】
上記α−ヒドロキシカルボン酸類はＤ−体、Ｌ−体、およびＤ、Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜２５／７５の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体／Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜３０／７０の範囲のヒドロキシカルボン酸である。
上記α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体の例としては、例えばグリコール酸と他のα−ヒドロキシ酸類との共重合体が挙げられ、該α−ヒドロキシ酸としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸、バリン酸、ロイシン酸が好ましい。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体または２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、特に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００１８】
乳酸−グリコール酸共重合体において、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は約１００／０〜４０／６０が好ましい。さらに好ましくは、組成比が約９０／１０〜４５／５５の場合である。特に好ましくはその組成比約６０／４０〜４５／５５である。上記グリコール酸と乳酸の共重合体の重量平均分子量は約３,０００〜１２,０００が好ましい。さらに好ましくは、約４,０００〜１０,０００である。本発明において該共重合体を用いて製造した生体内分解性マトリックスへの水溶性ポリペプチドの浸透および生体内に投与後の生体内分解性マトリックスの消失速度は、組成比および重量平均分子量の組み合わせにより影響を受ける。生体内に投与（皮下投与など）された後の消失期間が約２週間であり、生体内分解性カプセルへの水の浸透に問題が無いものとして、例えば組成比約５０／５０で重量平均分子量が約４,０００〜９,０００、好ましくは約５,０００〜９,０００のものが挙げられる。
本発明において、組成比および重量平均分子量の異なる２種の乳酸−グリコール酸共重合体を任意の割合で混合して用いてもよい。このような例としては、例えば組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約７５／２５で重量平均分子量が約６,０００の乳酸−グリコール酸共重合体と、組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）が約５０／５０で重量平均分子量が約４,０００の乳酸−グリコール酸共重合体との混合物が挙げられる。混合する際の重量比は、好ましくは約２５／７５から約７５／２５である。
また、乳酸−グリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１.２から約４.０が好ましい。さらに好ましくは、約１.５から約３.５である。乳酸−グリコール酸共重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法に従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００１９】
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体において、グリコール酸が約１０〜７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましい。さらに好ましくは、グリコール酸が約２０〜７５モル％である場合である。特に好ましくは、グリコール酸が約３０〜７０モル％である場合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、約２,０００〜２０,０００が好ましい。重量平均分子量は、さらに好ましくは約３,０００〜１０,０００である。重量平均分子量は、特に好ましくは約４,０００〜８,０００である。これらのグリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、約１.２〜４.０が好ましい。分散度は、特に好ましくは約１.５〜３.５である。本グリコール酸共重合体は自体公知の製造法、例えば、特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法（無触媒下の脱水重縮合反応や無機固体酸触媒下の脱水重縮合反応による製造方法）に従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００２０】
上記したグリコール酸共重合体は、さらにポリ乳酸と混合して使用されてもよい。該ポリ乳酸としては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでもよいが、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約７５／２５〜２０／８０の範囲のものが好ましい。さらに好ましくは、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約６０／４０〜２５／７５の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、Ｄ−体、Ｌ−体（モル％）が約５５／４５〜２５／７５の範囲のポリ乳酸である。該ポリ乳酸は、重量平均分子量が約１,５００〜１０,０００のものが好ましい。さらに好ましくは、重量平均分子量が約２,０００〜８,０００の範囲のポリ乳酸である。特に好ましくは、重量平均分子量が約３,０００〜６,０００の範囲のポリ乳酸である。また、ポリ乳酸の分散度は約１.２〜４.０が好ましい。ポリ乳酸の分散度は、特に好ましくは、約１.５〜３.５である。
ポリ乳酸の製造法については、乳酸の二量体であるラクタイドを開環重合する方法と乳酸を脱水重縮合する方法が知られている。本発明で使用する比較的低分子のポリ乳酸を得るためには、乳酸を直接脱水重縮合する方法が好ましい。該方法は、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載されている。
グリコール酸共重合体とポリ乳酸を混合して使用する場合、その混合比は、例えば約１０／９０〜９０／１０（重量％）の範囲である。混合比は、好ましくは約２０／８０〜８０／２０（重量％）の範囲である。さらに好ましくは、約３０／７０〜７０／３０（重量％）の範囲である。
【００２１】
本発明において、無触媒脱水重縮合で合成される生体内分解性ポリマーは、末端に遊離のカルボキシル基を有する。
末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーは、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する重合体である。
約１〜３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン（２５ml）とメタノール（５ml）との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で室温での撹拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量 ＝ 20,000 Ａ／Ｂ
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量（ｇ）
Ｂ：滴定終点までに添加した０.０５Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液（ml）
以下、これを末端基定量による数平均分子量と表記する。
例えば１種類以上のα−ヒドロキシ酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は末端に遊離カルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００２２】
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対してＧＰＣ測定による数平均分子量は各種分析、解析条件（例えば移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、例えばＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０.５〜２倍の範囲内であることをいう。好ましくは、約０.８〜１.５倍の範囲内であることをいう。また、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回るとは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍を越える場合をいう。
本発明においては、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する重合体が好ましい。
本明細書での重量平均分子量および数平均分子量とは、重量平均分子量が１２０,０００、５２,０００、２２,０００、９,２００、５,０５０、２,９５０、１,０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量および数平均分子量を意味する。測定はＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用、移動相としてクロロホルムを用いた。
また、分散度は、（重量平均分子量／数平均分子量）により算出される。
【００２３】
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩は、水溶性であり、かつ生体に悪影響を及ぼさない脂肪族カルボン酸金属塩であれば特に限定されない。
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩は、好ましくは常温（約２０℃）で水に対する溶解度が約２０mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩、さらに好ましくは溶解度が約１００mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩、特に好ましくは溶解度が約２００mg／ml以上の脂肪族カルボン酸金属塩である。
水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩において、脂肪族カルボン酸は、好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸である。脂肪族カルボン酸としては、例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。
脂肪族モノカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）が挙げられる。
脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）が挙げられる。
脂肪族トリカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例、トリカルバリル酸、１,２,３−ブタントリカルボン酸等）が挙げられる。
上記した脂肪族カルボン酸は、水酸基を１ないし２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。
脂肪族カルボン酸は、好ましくは脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、さらに好ましくは炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸、特に好ましくは炭素数２ないし３の飽和脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例としては、例えば酢酸等が挙げれる。
【００２４】
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩における金属塩としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）塩、銅（I価）塩等の単価金属塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム等）塩、亜鉛（II価）塩、鉄（II価，III価）塩、銅（II価）塩、スズ（II価，IV価）塩、アルミニウム（II価，III価）塩等の多価金属塩が挙げられる。
金属塩は、好ましくは多価金属塩である。金属塩は、特に好ましくはカルシウム塩、亜鉛塩である。
水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の具体例を挙げれば、例えば酢酸ナトリウム，酢酸カリウム，酢酸カルシウム，酢酸亜鉛，プロピオン酸ナトリウム，プロピオン酸カルシウム，グリコール酸ナトリウム，グリコール酸亜鉛，乳酸ナトリウム，乳酸カルシウム，乳酸亜鉛，酒石酸ナトリウム，酒石酸亜鉛，クエン酸ナトリウム等である。水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の特に好ましい具体例を挙げれば、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛等である。
上記した水溶性脂肪族カルボン酸金属塩と同様にして水溶性芳香族カルボン酸金属塩も用いられる。水溶性芳香族カルボン酸金属塩の具体例を挙げれば、例えば安息香酸ナトリウム，安息香酸亜鉛，サリチル酸ナトリウム，サリチル酸亜鉛等である。
生体内分解性マトリックスの製造の際に使用する有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（エタノール、メタノール）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは混合して用いられてもよい。有機溶媒は、好ましくはジクロロメタン、アセトニトリルである。
【００２５】
本発明の徐放性製剤は、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させることにより製造することができる。該徐放性製剤（例、マイクロカプセル）は、例えば以下のような操作によって製造することができる。以下、このようにして製造される徐放性製剤を単にマイクロカプセルと称する場合がある。
１）水溶性ポリペプチドの水溶液を調製する
２）生体内分解性マトリックスを１）の水溶液に接触させ、生体内分解性マトリックス内部に該水溶液を浸透させる
３）必要に応じて生体内分解性マトリックスに浸透されない水溶性ポリペプチドと生体内分解性マトリックスとを分離する（洗浄操作）
４）水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤（例、マイクロカプセル）を乾燥させる
上記した水溶性ポリペプチドの水溶液に、水溶性ポリペプチドの溶解度を上げるため、あるいは水溶性ポリペプチドの生物活性を維持するために、生体内に注入しうる塩類、例えば無機塩類（例、食塩，燐酸一水素ナトリウムなど）、有機塩類（例、酢酸アンモニアなど）、アミノ酸（例、グリシン，アルギニン，ヒスチジンなど）などを添加してもよい。
上記した塩類は薬物の至適ｐＨ付近になるように複数組み合わされてもよい。この際、ｐＨは一般的には中性あるいは弱酸性になるように調整されるが、塩基性に調製される場合もある。該塩類の濃度は水溶性ポリペプチドの水溶液の張度が生理食塩水を基準として約１／５０〜５倍になるように調整される。好ましくは約１／２５〜３倍である。また、Tween 80 などの界面活性剤を添加してもよい。該界面活性剤の濃度は約０.０００１〜０.２％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０.００１〜約０.１％（ｗ／ｖ）が使用される。
【００２６】
また、水溶性ポリペプチドの水溶液に血清アルブミンを添加してもよい。血清アルブミンを添加することにより、水溶性ポリペプチドの溶解度が上がり、水溶性ポリペプチドの生物活性を保持できる。血清アルブミンは水溶性ポリペプチドの水溶液に添加してもよく、あるいは水溶性ポリペプチドと予め混合してあってもよい。血清アルブミンは人血清アルブミンが好ましく、人血液から分離精製されてもよくあるいは遺伝子工学的手法で生産されるものでもよい。水溶性ポリペプチドと血清アルブミンの混合比（重量比）は、例えば約１：１,０００〜約１００：１、好ましくは約１：１００〜約１０：１である。
水溶液中の水溶性ポリペプチドの濃度は特に限定されないが、単位重量あたりの生体内分解性マトリックスになるべく多量の水溶性ポリペプチドを浸透させるためには、水溶性ポリペプチドの溶解度以下でなるべく濃い濃度が好ましい。該溶解度は塩濃度、温度、添加物の有無によっても異なる。一般に生体内分解性マトリックスに浸透された水溶性ポリペプチドの濃度により徐放性製剤の水溶性ポリペプチド放出パターンが異なることが知られており、この観点からも水溶性ポリペプチド濃度は選択される。水溶性ポリペプチド濃度は、一般的には約１００μg／ml〜約５００mg／ml，好ましくは約１〜３００mg／ml，さらに好ましくは約５〜１００mg／mlである。
【００２７】
生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することにより製造される場合、生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を浸透させる際の水溶液のｐＨは、生体内分解性マトリックスに含有される水溶性脂肪族カルボン酸金属塩の種類、水溶性ポリペプチドの等電点等によって異なるので一概には言えないが、好ましくは約３〜９、さらに好ましくは約３〜８である。ｐＨの調整は、例えば無機酸（例、塩酸等）、有機酸（例、酢酸等）等の酸、例えば水酸化アルカリ金属（例、水酸化ナトリウム等）等のアルカリにより適宜行えばよい。ここにおいて、使用される酸またはアルカリの量は、酸またはアルカリの電離度、強度、および目的とするｐＨにより、適宜用いればよい。水溶性脂肪族カルボン酸金属塩として特に酢酸ナトリウム、酢酸亜鉛または酢酸カルシウム等は、中性付近のｐＨで生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を浸透させることができるため好ましい。水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに水中で浸透させる操作は、例えば水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとを混合させることにより行われる。
水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとを混合する際の混合順序は水溶性ポリペプチドの生物活性が保持される限り、任意に選択できる。例えば、水溶性ポリペプチドの水溶液に生体内分解性マトリックスを浸漬してもよいし、生体内分解性マトリックスに水溶性ポリペプチドの水溶液を添加してもよい。
【００２８】
水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスの混合比率は、生体内分解性マトリックスに十分に水溶性ポリペプチドの水溶液が浸透するように、水溶性ポリペプチドの水溶液の過剰量が使用される。すなわち、すべての生体内分解性マトリックスが水溶性ポリペプチドの水溶液に浸るように調製される。
水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとの重量比は、生体内分解性マトリックスの空隙率が異なるために、一概には決められないが、好ましくは約１：１０〜約２０：１、さらに好ましくは約１：５〜約１０：１である。しかし、一般には生体内分解性マトリックスに浸透されない水溶性ポリペプチドは再使用されず、貴重な水溶性ポリペプチドのロスを少なくするため、最小必要限の水溶性ポリペプチドの水溶液が使用される。水溶性ポリペプチドの水溶液と生体内分解性マトリックスとの混合は、通常、容器を用いて行われる。このような容器としては、水溶性ポリペプチドの吸着が少ないものが好まれ、例えばシリコナイズ（シリコン化処理）したガラスが挙げられる。また、水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわないように表面処理した合金（ステンレスあるいはチタン）なども好まれる。
【００２９】
混合操作としては例えば水溶性ポリペプチドの水溶液に生体内分解性マトリックスを添加し、静置あるいは水溶性ポリペプチドの生物活性を失わない程度の軽い攪拌操作を加えることにより行われる。該操作において、水溶性ポリペプチドの水溶液が過度に起泡しない程度に真空減圧してもよい。該混合操作は水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわないあるいは生体内分解性マトリックスの構成成分である生体内分解性ポリマーが分解しない温度が採用され、通常は室温で行なわれ、好ましくは冷所で行なわれる。混合操作における温度は、具体的には約１〜３０℃，好ましくは約４〜２５℃である。混合操作の時間は生体内分解性マトリックスの量、生体内分解性ポリマーの組成，分子量，温度その他の要因により異なるが、数時間から数十時間である。具体的には、例えば約４℃で約１０〜１００時間，約２５℃で約５〜５０時間が好ましい。この時間は水溶性ポリペプチドの生物活性を失わない範囲および、生体内分解性ポリマーが必要以上に加水分解しない範囲で任意に選択される。
生体内分解性マトリックスが生体内分解性ポリマーと水溶性脂肪族カルボン酸金属塩とを混合することにより製造された場合、混合時間が短縮される。具体的には、混合時間は、例えば約４℃で約０.５〜２４時間，約２５℃で約０.５〜５時間である。
【００３０】
混合操作の後に必要があれば洗浄操作を加えてよい。該洗浄操作により生体内分解性マトリックスに浸透されなかった水溶性ポリペプチドは除去される。洗浄方法としては種々の方法が考えられるが、生体内分解性マトリックスを破壊しない方法、および生体内分解性マトリックスに浸透された水溶性ポリペプチドが生体内分解性マトリックス外に流出せず、かつその生物活性を失わない方法が採用される。例えば混合操作終了後に洗浄液を添加し、遠心分離あるいは濾過によりマイクロカプセルと洗浄液を分離する操作を繰り返す。本操作における洗浄液は蒸留水、あるいは塩（例、リン酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム等）、糖（例、マンニトール等）を含んだ水溶液が使用される。洗浄液は、好ましくはマンニトールを含んだ水溶液である。
このようにして得られたマイクロカプセルは、ついで乾燥される。乾燥方法としては、例えば凍結乾燥，真空乾燥などが挙げられる。乾燥方法としては、特に凍結乾燥が好ましい。また、乾燥操作における粒子同士の凝集を防ぐために凝集防止剤を含んだ洗浄液を使用してもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、ブドウ糖、デンプン類（例、コーンスターチ等）などの水溶性多糖、ヒアルロン酸などのムコ多糖類、グリシン，フィブリン，コラーゲン等の蛋白質、塩化ナトリウム，リン酸水素ナトリウム等の無機塩類、レシチンなどのリン脂質などが挙げられる。
【００３１】
乾燥操作において乾燥時の温度は水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわず、マイクロカプセルの破壊しない任意の温度が採用される。好ましくは、用いられた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で該マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度に加熱する。ガラス転移温度とは示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用い、加温速度毎分約１０または２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度（Ｔｍｇ）をいう。好ましい加温温度としてはガラス転移温度より、約２〜１０℃程度高い温度が採用される。このような温度は、例えば約２５〜５０℃，好ましくは約３０〜４５℃である。加熱時間は、加熱温度、処理するマイクロカプセル量などにより異なるが、一般的にはマイクロカプセル自体の温度が所定の温度に達した後、数十時間、好ましくは約２４時間以内である。該加熱方法は特に限定されないが、マイクロカプセルが均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。具体例として、例えば恒温槽中で加熱する方法、マイクロ波で加熱する方法などが挙げられる。該乾燥操作によりマイクロカプセルを温血動物に投与後の初期の放出を抑制することが可能になる。
【００３２】
本発明においては、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックスに浸透させる際に有機溶媒を使用せず、また、過度の過熱を行わないため、製剤化過程において水溶性ポリペプチドの生物活性が損なわれることは少ない。ここでいう有機溶媒は、例えばハロゲン化炭化水素，アルコール類，アセトニトリル，氷酢酸などである。
また、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を用いることにより、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックス内に効率よく浸透させることができる。本発明の徐放性製剤は、例えば注射剤として用いる場合、長期間、例えば約１週間〜１カ月にわたり、ほぼ一定速度の徐放性を示す。
本発明の徐放性製剤中の水溶性ポリペプチドの含有量は、例えば徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを適当な溶媒で溶解し、マイクロカプセル中に含有される水溶性ポリペプチドをＨＰＬＣなどのクロマトグラフあるいはエンザイムイミュノアッセイなどの免疫学的測定法により分離定量する方法、あるいは分離された水溶性ポリペプチドの生物活性を測定する方法などで決定される。マイクロカプセル中の生体内分解性ポリマーに対する水溶性ポリペプチドの含有率は、一般的に約０.１〜３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１〜２０％（ｗ／ｗ）である。
【００３３】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
本発明において、徐放性製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを注射剤とするには、マイクロカプセルを分散剤（例、Tween 80、HCO-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等の多糖類、硫酸プロタミンなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）、局所麻酔剤（塩酸キシロカイン，クロロブタノールなど）等と共に水性懸濁剤とするか、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいは中鎖脂肪酸トリグリセライド〔例、ミグリオール８１２（フルス・アクチエンゲゼルシャフト社）等〕またはこれらにレシチンなどのリン脂質を混合したものと共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００３４】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば粒子径として約０.１から３００μｍの範囲が挙げられる。好ましくは、約１から１５０μｍの範囲の粒子径である。さらに好ましくは、約２から１００μｍの範囲の粒子径である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
本発明の徐放性製剤の適応は、使用する水溶性ポリペプチドにより異なる。本発明の徐放性製剤は、水溶性ポリペプチドが、例えばインターフェロンアルファである場合は、ウィルス性肝炎（例、Ｃ型肝炎，ＨＢｅ抗原陽性Ｂ型慢性活動性肝炎など），癌（例、腎癌，多発性骨髄腫など）など、エリスロポエチンの場合は貧血（例、腎透析時貧血など）など、Ｇ−ＣＳＦの場合は好中球減少症（例、制癌剤治療時），感染症など、ＩＬ−２の場合は癌（例、血管内皮腫など）、ＦＧＦの場合は消化管潰瘍など、ＦＧＦ−９の場合は血小板減少症など、ＮＧＦの場合は老人性痴呆，神経病（ニューロパシー）など、ＴＰＡの場合は血栓症など、インスリンの場合は糖尿病など、腫瘍壊死因子の場合は癌などの治療または予防に有効である。
【００３５】
徐放性製剤の投与量は、水溶性ポリペプチドの種類と含量、水溶性ポリペプチド放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、含有される水溶性ポリペプチドの薬理効果が発揮される量であればよい。水溶性ポリペプチドの１回当たりの投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、水溶性ポリペプチドの種類によって異なるが、好ましくは、成人１人当たり約０.０００１〜１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.０００５〜１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の投与量は成人１人，１回当たり好ましくは、約０.０００５〜５０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.００２５〜１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回等、水溶性ポリペプチドの種類と含量、剤型、水溶性ポリペプチド放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。本発明の製剤の保存は常温あるいは冷所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５〜２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００３６】
【実施例】
以下に参考例、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。以下、％は特記しない限り重量／容量パーセントを示す。
実施例１
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,４００、ＧＰＣ測定による数平均分子量 ２,９００、末端基定量による数平均分子量２,２００、和光純薬工業製）２.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に溶解した液に加えて溶解した。内水相として注射用生理食塩水１mlを加え、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌した。予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液５００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、４,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた後、遠心分離機（05PR-22、日立製作所）を用いて２,０００rpmで捕集した。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された乳酸-グリコール酸共重合体マトリックスは少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末として得られた。
ポリエチレン製試験管にインターフェロンアルファの１.０８×１０9 ＩＵ（人血清アルブミン約２５mgを含有）を秤量し、２００μlの蒸留水で溶解した。これに前記のマイクロカプセル２００mgを添加し、密栓後４〜８℃の冷蔵庫で約４日間静置した。該操作後に５mlの蒸留水を加えて約１分間静かに攪拌する。約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた。この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール４４mgを加え、蒸留水２mlを添加し、ゆっくりと攪拌する。その後、得られる分散液を真空乾燥した（温度；４０℃／６時間）。
【００３７】
実施例２
実施例１と同様にして、乳酸-グリコール酸共重合体マトリックスを粉末として得た。
ポリエチレン製試験管にインターフェロンアルファの１.０８×１０9 ＩＵ（人血清アルブミン約２５mgを含有）を秤量し、２００μlの蒸留水で溶解した。これに前記のマイクロカプセル２００mgを添加し、密栓後４〜８℃の冷蔵庫で約３０時間静置した。該操作後に５mlの蒸留水を加えて約１分間静かに攪拌する。約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた。この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった。得られたマイクロカプセルに０.１％ヒアルロン酸ナトリウム（分子量１８０万）水溶液を１mlを添加し、ゆっくりと攪拌した。その後、得られる分散液を凍結乾燥した（１６時間）。
【００３８】
実施例３
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に炭酸カルシウム４ｇを添加した後、ボルテックスミキサーで約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。ついで、余剰の炭酸カルシウムを除去するために１Ｎ塩酸１０mlを添加した。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末４mg（約８×１０8ＩＵ（国際単位））を秤量し、１０mＭ塩酸溶液２mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス５０mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に蒸留水４mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった）。得られる分散液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約４８mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））（免疫実験用ブロッキング剤）溶液で抽出し、ついで酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）によりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファ５７０万ＩＵを含有していた。
【００３９】
実施例４
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末６mg（約１.２×１０9ＩＵ（国際単位））を秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作を行なった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール３０mgおよび蒸留水０.５mlを加え、ゆっくりと攪拌した後、得られる懸濁液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約３１０mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））（免疫実験用ブロッキング剤）溶液で抽出し、ついで酵素免疫学的測定法（インターフェロン抗体を用いるサンドイッチ法、以下、ＥＩＡと略す）によりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファ２３０万ＩＵを含有していた。
【００４０】
実施例５
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）８００mg含有水溶液１mlを添加した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を６mg（約１.２×１０9ＩＵ）秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で１０℃にて約１日間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１時間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られるマイクロカプセルを凍結乾燥した。
マイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファ７８万ＩＵを含有していた。
【００４１】
実施例６
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ(４ml) に加えて溶解した。この溶液に酢酸カルシウム（１水和物）０.４ｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％ (w/w) ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を４mg（８×１０8ＩＵ）秤量し、１mＭ塩酸溶液２mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス５０mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約１日間回転混合した。該操作後に４mlの蒸留水を加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約１,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を２回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。ついで、得られる分散液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約４８mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファを９４０万ＩＵ含有していた。
【００４２】
実施例７
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた 。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管に生体内分解性マトリックス５０mgを秤量し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムによりｐＨを調整した２mg／mlインターフェロンアルファ溶液（約４.０×１０8ＩＵ）（ｐＨは約２、約４、約５、約８の４段階）を添加した後、４℃で２４時間回転混合することにより、生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させた。約１,０００rpmで遠心分離操作を行い、上清を除去した後、蒸留水４mlで２回洗浄し、蒸留水０.５mlを加えた後、凍結乾燥した。
【００４３】
実施例８
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸カルシウム（１水和物）０.４ｇを添加した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約４.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４４】
実施例９
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸ナトリウム（３水和物）０.２ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４５】
実施例１０
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,１００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,５７０、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に酢酸亜鉛（２水和物）０.４ｇを添加し、２時間振とうした後、これをホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターロイキン２（２０μg）を含有する水溶液２mlを秤量し、ついで、これに前記の生体内分解性マトリックス３００mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で４℃にて約５時間回転混合した。なお、インターロイキン２は、特開昭６１−７８７９９号公報に記載の方法により製造し、特開昭６０−１１５５２８号公報に記載の精製法で精製した、Ｎ末端にメチオニンが結合しているものと結合していないものとの混合物を用いた。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール３０mgを加え、蒸留水０.５mlで溶解し、ゆっくりと撹拌した。その後、得られる懸濁液を凍結乾燥した。
【００４６】
実施例１１
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,８００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,８０５、和光純薬工業製）５.０ｇと安息香酸亜鉛７８２ｍｇをジクロロメタン６.６２５ｇ(５ml)に添加し、室温で３時間振盪し、Ｓ／Ｏエマルションとした。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％ (w/w) ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液１,０００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ガラス製試験管にインターフェロンアルファ凍結乾燥粉末を２mg（１.７×１０8ＩＵ）秤量し、０.５mＭ塩酸溶液３mlで溶解した。これに前記の生体内分解性マトリックス３０２mgを添加し、ロープロファイルローラ（ライフサイエンス社製）上で１５℃にて約５時間回転混合した。該操作後に５％マンニトール水溶液１０mlを加えて約１分間静かに攪拌し、ついで約２,０００rpmで５分間遠心分離操作を行ない、上清を捨てた（この操作を３回繰り返すことにより、洗浄操作をおこなった）。得られたマイクロカプセルにＤ−マンニトール３０mgを加え、蒸留水０.５mlで溶解し、ゆっくりと撹拌した。その後、得られる懸濁液を凍結乾燥し、マイクロカプセル（約３１０mg）を得た。
得られたマイクロカプセル中のインターフェロンアルファ含量を調べるため、マイクロカプセルを１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース（雪印乳業（株））溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファを３６１万ＩＵ含有していた。
実施例１２
安息香酸亜鉛をサリチル酸亜鉛９９５ｍｇとする以外は実施例１１と同様にして、乳酸-グリコール酸共重合体のマトリックスを粉末として得た。ついで、マトリックス３０４mgを用いること以外は実施例１１と同様にして、マイクロカプセルを得た。
マイクロカプセル１mgあたりインターフェロンアルファを１９３万ＩＵ含有していた。
【００４７】
比較例１
インターフェロンアルファ凍結乾燥粉末２mgを０.５％牛アルブミン含有りん酸緩衝生理食塩水溶液２mlに溶解した（ＥＩＡによる測定で１.７５億ＩＵ／mlの濃度）。
比較例２
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に２ｇ／mlの濃度に調整した塩化亜鉛水溶液０.５mlを添加した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＷ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４８】
比較例３
乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸=５０／５０（モル％）、ＧＰＣ測定による重量平均分子量５,９００、ＧＰＣ測定による数平均分子量２,６００、和光純薬工業製）４.０ｇをジクロロメタン５.３ｇ（４ml）に加えて溶解した。この溶液に炭酸亜鉛０.２ｇを添加した後、ボルテックスミキサーで約３０秒間攪拌し、Ｓ／Ｏエマルションを得た。これを予め１８℃に調節しておいた０.１％（w/w）ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ml中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６,０００rpmでＳ／Ｏ／Ｗエマルションとした。このＳ／Ｏ／Ｗエマルションを室温で５時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。約２,０００rpmで遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集された生体内分解性マトリックスに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末（約２.０g）を得た。
ついで、実施例７と同様にして、各種ｐＨで生体内分解性マトリックスにインターフェロンアルファを浸透させ、凍結乾燥を行った。
【００４９】
実験例１
実施例１で得られたマイクロカプセル約４０mgを０.５mlの分散媒（２.５mgのカルボキシメチルセルロース、０.５mgのポリソルベート ８０、２５mgのマンニトールを溶解した蒸留水）に分散して８週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に２２Ｇ注射針で投与した（マイクロカプセルとしての投与量１３３mg／kg）。投与後一定時間毎にラット尾部より採血し、血清中のインターフェロンアルファの濃度を酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）で測定したところほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。
実験例２
実施例２で得られたマイクロカプセル約３０mgを用い、実験例１と同様にして、ラットに投与し、血清中のインターフェロンアルファの濃度を酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）で測定したところほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。
【００５０】
実験例３
実施例４で得られたマイクロカプセル約２２mgおよび実施例５で得られたマイクロカプセル約６４mgをそれぞれ分散媒０.５ml（５mgのカルボキシメチルセルロース、２mgのポリソルベート ８０（界面活性剤）、２５mgのマンニトールを蒸留水１リットルに溶かした溶液）に分散して、８週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に１８Ｇ注射針で投与した（ラット１匹あたり約５,０００万ＩＵのインターフェロンアルファを投与したことになる）。投与後一定時間毎にラット尾部より採血し、血清中のインターフェロンアルファの濃度をＥＩＡで測定した。対照として比較例１で得られたインターフェロンアルファ水溶液をラットに皮下投与した（ラット１匹あたりのインターフェロンアルファ投与量：約５,０００万ＩＵ）。比較例１のマイクロカプセル投与群では投与後３日目の血清中インターフェロンが検出限界程度に低下していたが、実施例４および実施例５のマイクロカプセル投与群では初期の高い血中濃度に引き続きほぼ一定の血中濃度が一週間持続した。
【００５１】
実験例４
生体内分解性マトリックスへのインターフェロンアルファの浸透効率（マイクロカプセル中のインターフェロン含量）に及ぼすインターフェロンアルファ溶液のｐＨと各種亜鉛塩との関係を調べた。具体的な方法を以下に示す。
実施例７（酢酸亜鉛）、比較例２（塩化亜鉛）および比較例３（炭酸亜鉛）で得られたマイクロカプセルを、１０％アセトニトリルを含有する２５％ブロックエース溶液で抽出し、ついでＥＩＡによりインターフェロンアルファを定量した。その結果、図１に示すように、酢酸亜鉛を用いた場合には、インターフェロンアルファが物理的に比較的安定であるｐＨ条件下で、インターフェロンアルファの浸透効率が良好であった。
実験例５
生体内分解性マトリックスへのインターフェロンアルファの浸透効率（マイクロカプセル中のインターフェロン含量）に及ぼすインターフェロンアルファ溶液のｐＨと酢酸カルシウム塩との関係を調べた。以下、実験例３と同様に行った。その結果、図２に示すように、インターフェロンアルファが物理的に比較的安定であるｐＨ条件下で、インターフェロンアルファの浸透効率が良好であった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、水溶性ポリペプチドを有機溶媒に接触させずに生体内分解性マトリックスに浸透させることができ、水溶性ポリペプチドの生物活性を損なわずに製剤化することが可能である。また、水溶性脂肪族カルボン酸金属塩を用いることにより、水溶性ポリペプチドを生体内分解性マトリックス内に効率よく浸透させることができる。本発明の徐放性製剤は、例えば注射剤として用いる場合、数日〜１ケ月以内（例えば約１〜２週間）にわたり優れた徐放性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロカプセル中のインターフェロン含量に及ぼすインターフェロン溶液のｐＨと各種亜鉛塩との関係を示す。図中、●は酢酸亜鉛（実施例７）を、○は塩化亜鉛（比較例２）を、△は炭酸亜鉛（比較例３）を示す。
【図２】マイクロカプセル中のインターフェロン含量に及ぼすインターフェロン溶液のｐＨと酢酸カルシウム（実施例８）との関係を示す。
Claims (13)
- 水溶性ポリペプチドを、生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造された生体内分解性マトリックスに水中で浸透させることを特徴とする徐放性製剤の製造法。
- 脂肪族カルボン酸が脂肪族モノカルボン酸である請求項１記載の徐放性製剤の製造法。
- 金属塩が多価金属塩である請求項１記載の徐放性製剤の製造法。
- 水溶性ポリペプチドを、生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造された生体内分解性マトリックスに水中で浸透させ、ついで乾燥する請求項１記載の徐放性製剤の製造法。
- 乾燥が凍結乾燥である請求項４記載の徐放性製剤の製造法。
- 水溶性ポリペプチドがサイトカインである請求項１記載の徐放性製剤の製造法。
- サイトカインがインターフェロンである請求項６記載の徐放性製剤の製造法。
- 生体内分解性マトリックスが微粒子状である請求項１記載の徐放性製剤の製造法。
- 生体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエステルである請求項１記載の徐放性製剤の製造法。
- 脂肪族ポリエステルがα−ヒドロキシカルボン酸から誘導される共重合体である請求項９記載の徐放性製剤の製造法。
- 共重合体が乳酸−グリコール酸共重合体である請求項１０記載の徐放性製剤の製造法。
- 水溶性ポリペプチドを、生体内分解性ポリマーと水溶性の脂肪族カルボン酸金属塩とを混合して製造された生体内分解性マトリックスに浸透させてなる徐放性製剤。
- 注射用である請求項１２記載の徐放性製剤。
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|---|---|---|---|
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