KR20010082326A - 연쇄상구균 Ｃ5ａ 펩티다제 백신 - Google Patents
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Abstract
β-용혈성 연쇄상구균 전이증식 또는 감염에 대항하여 사용하기 위한 신규의 백신이 개시되어 있다. 백신은 연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCP)의 변형체를 면역원성 양으로 함유한다. 또한, 이러한 백신을 투여함으로써, β-용혈성 연쇄상구균 전이증식 또는 감염에 대해 감수성 포유동물을 보호하는 방법이 개시되어 있다. 효소적으로 불활성인 SCP, 및 이러한 SCP 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 개시되어 있다.
Description
본 출원은 1996년 1월 22일에 출원된 미국 출원 08/589,756의 일부계속출원이다. 미국 출원 08/589,756은 본 명세서에 언급됨으로써 도입된다.
여러 상이한 β-용혈성 연쇄상구균 종이 동정되어있다. 군 A 연쇄상구균이라 불리는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)는 인간의 일반적인 세균 병원체이다. 이것은 인간에서의 인두염, 농가진 및 패혈증을 포함한 각종 감염, 주로 소아의 질병을 유발한다. 감염에 이어서, 인간에서의 류머티스열 및 급성 사구체신증과 같은 자기면역 합병증이 일어날 수 있다. 이러한 병원체는 또한 성홍열, 괴사성 근막염 및 독소 쇼크와 같은 심각한 급성 질병을 유발한다.
보통 "스트렙 인후염(Strep throat)"라고 불리는 군 A 연쇄상구균에 의해 유발된 인후염은, 계절에 따라, 내과 의업의 모든 진료의 16 % 이상에 달한다. 문헌 [호프-심프슨 이.(Hope-Simpson, E.), "인후염에서의 스트렙토코커스 피오게네스: 소 집단 연구 (Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population), 1962-1975,"J.Hyg.Camb, 87:109-129 (1981)]. 이러한 종은 또한 최근 북미 및 다른 4개 대륙에서 괴사성 근막염과 관련된 독소 쇼크가 부활한 원인이 된다. 문헌 [스티븐스 디.엘.(Stevens, D.L.), "침입하는 군 A 연쇄상구균 감염(Invasive group A streptococcus infections),"Clin.Infect.Dis., 14:2-13 (1992)]. 또한, 스트렙 인후염의 유발에 연루되고 때때로 독소 쇼크를 유발하는 것은 군 C 및 G 연쇄상구균이다. 문헌 [호프-심프슨, 이. "인후염에서의 스트렙토코커스 피오게네스: 소 집단 연구 (Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population), 1962-1975,"J.Hyg.Camb., 87:109-129 (1981)].
스트렙토코커스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae)로 또한 공지된 군 B 연쇄상구균은 신생아 패혈증 및 뇌막염의 원인이 된다. 문헌 [티.알.마틴(T.R.Martin) 등, "유년 및 성장 래트의 폐로부터 군B 연쇄상구균의 제거에 미치는 유형-특이성 다당류 캡슐의 영향 (The effect of type-specific polysaccahride capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats)",J.Infect Dis., 165:306-314 (1992)]. 종종 성인 여성의 질 점막 균상의 요소이긴 하지만, 1000명의 신생아당 0.1 내지 0.5명이 분만 동안에 감염에 따른 심각한 질병을 나타낸다. 군 B 연쇄상구균 감염으로부터의 높은 치사율에도 불구하고, 병원성에 대한 메카니즘의 이해가 빈약하다. 문헌 [마틴.티.알, 등. "유년 및 성장 래트의 폐로부터 군B 연쇄상구균의 제거에 미치는 유형-특이성 다당류 캡슐의 영향 (The effect of type-specific polysaccaride capsule on the clearance of Group B Streptococci from the lung of infant and adult rats)",J.Infect.Dis., 165:306-314 (1992)].
연쇄상구균 감염은 항생물질 요법에 의해 현재 치료되고 있다. 그러나, 치료자의 25~30 %가 재발하는 질병을 갖고/갖거나 점막 분비물에 세균을 방출한다.현재, 연쇄상구균 감염을 방지하기 위해 이용할 수 있는 수단은 없다. 종래, 연쇄상구균 백신 개발은 세균의 세포 표면 M 단백질에 촛점을 맞추었다. 문헌 [베슨, 디.(Bessen,D) 등, "M 단백질의 보존 에피토프에 상응하는 합성 펩티드를 사용한 비내 면역화가 군A 연쇄상구균에 의한 점막 정착에 미치는 영향 (Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci),"Infect.Immun., 56:2666-2672 (1988); 브론즈,엠.에스. (Bronze,M.S.) 등, "생쥐에서 국소 투여된 군A 연쇄상구균 백신에 의해 유발된 보호 면역성 (Protective immunity evoked by locally administered group A streptococcal vaccines in mice)",Journal of Immunology, 141:2767-2770 (1988)].
2가지 주요한 문제들이 M 단백질 백신의 이용, 시판, 및 가능하면 FDA 승인을 제한한다. 먼저, 에스.피오게네스의 80개 이상의 상이한 M 혈청형이 존재하고 새로운 혈청형이 계속 생겨난다. 문헌 [피스체티(Fischetti), V.A., "연쇄상구균 M 단백질: 분자 구조 및 생물학적 반응 (Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior),Clin.Microbiol.Rev., 2:285-314 (1989)]. 따라서, 하나의 혈청형-특이적 M 단백질로 접종하는 것은 다른 M 항원형에 대한 보호에 거의 효과가 없다. 두번째 문제는 M 단백질 백신의 안전성에 관한 것이다. M 단백질의 몇가지 영역은 인간 조직, 특히 심장 조직과 면역학적으로 교차-반응하는 항원 에피토프를 함유한다. M 단백질의 N-말단은 서열 및 항원 특이성에서 매우 변화하기 쉽다. 군 A 연쇄상구균 감염에 대해 넓은 보호를 달성하기 위해서는, 이러한 변화가능한 서열을 나타내는 80개 이상의 상이한 펩티드가 백신에 포함되는 것이 요구된다. 새로운 변형체 M 단백질이 여전히 계속하여 생기고, 이는 연쇄상구균 질병의 계속되는 감시 및 백신 조성물에서의 변화를 필요로 한다. 반대로, M 단백질의 카르복실-말단은 서열내에 보존된다. 그러나, M 단백질의 이러한 영역은 인간 심장 조직과 면역학적으로 교차-반응되는 아미노산 서열을 함유한다. M 단백질의 이러한 성질은 류마티스열과 연관된 심장판막 손상의 원인이 되는 것으로 생각된다. 문헌 [피.펜더슨 (P.Fenderson) 등, "Tropomyosinsharies immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins",J.Immunol. 142:2475-2481 (1989)]. 초기의 시도에서, 1979 년에 M 단백질로 백신접종된 소아들은 류머티스열의 10배 높은 출현율을 가졌으며 심장 판막 손상과 관련되었다. 문헌 [마셀,비.에프(Massell, B.F.) 등, "연쇄상구균 백신접종후의 류머티스 열 (Rheumatic fever following streptococcal vaccination),JAMA, 207:1115-1119 (1969)].
백신 개발을 위한 고려하에 있는 다른 단백질들은 적혈구생성 독소, 연쇄상구균 발열성 외독소 A 및 연쇄상구균 발열성 외독소 B이다. 문헌 [리. 피.케이(Lee, P.K.)등, "독소-쇼크 증후군-유사 질병의 동물 모델에서 군 A 연쇄상구균 발열성 외독소의 정량 및 독성 (Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness),"J.Clin.Microb., 27: 1890-1892 (1989)]. 이러한 단백질에 대한 면역은 독소 쇼크의 치명적인 증상을 막을 수 있지만, 연쇄상구균에 의한 전이증식은 막을 수 없다.
따라서, 연쇄상구균 감염을 막거나 개선하기 위한 효과적인 수단이 여전히 계속적으로 요구되고 있다. 더욱 구체적으로, 연쇄상구균에 의한 숙주 조직의 전이증식을 막거나 개선시키고, 그에 의해 스트렙 인후염 및 농가진의 출현을 감소시키기 위하여, 백신에 유용한 조성물을 개발하는 필요성이 여전히 존재한다. 류머티스열, 급성 사구체신증, 패혈증, 독소 쇼크 및 괴사성 근막염과 같은 속발증들의 제거는 유기체의 급성 감염 및 보균의 발생을 감소시킨 직접적인 결과가 된다. 또한, 모든 β-용혈성 연쇄상구균 종, 즉 군 A, B, C 및 G에 의해 유발되는 감염을 막거나 개선시키기 위해 백신에서 유용한 조성물을 개발하는 것이 여전히 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 β-용혈성 연쇄상구균에 대해 감수성있는 포유동물을 면역시키기 위해 효과적인 백신 및 백신접종 방법을 제공한다. 감수성있는 포유동물은 인간, 또는 개, 소, 돼지 또는 말과 같은 가축일 수 있다. 이러한 면역화는 포유동물에서 β-용혈성 연쇄상구균 전이증식의 발생을 방지, 개선 또는 감소시킬 수 있다. 백신은 생리학적으로 허용가능한 비-독성 부형제와 조합된 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP)의 면역원성 양을 함유하고, 여기에서 SCP는 야생형 SCP의 변형체이다.
SCP의 "변형체"는 천연의 SCP와 완전히 동일하지 않는 폴리펩티드 또는 올리고펩티드 SCP이다. 이러한 변형체 SCP는 아미노산 서열을 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경시킴으로써 수득될 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 예를들면 치환에 의해 변이되어, 천연의 폴리펩티드에 비해 실질적으로 동일하거나 개선된 품질을 가진 폴리펩티드를 생성한다. 치환은 보존적 치환 (conserved substitution)일 수도 있다. "보존적 치환"이란 아미노산을 유사한 측쇄를 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존적 치환은 아미노산의 전하 또는 아미노산의 측쇄의 크기 (대안적으로, 측쇄내의 화학 기의 크기, 전하 또는 종류)에서 가능한 가장 작은 변화를 일으키는 아미노산으로 치환하는 것이며, 그 결과 전체 펩티드가 그의 공간 구조를 유지하지만 생물학적 활성을 변경시킨다. 예를들면, 통상의 보존적 변화는 Asp에서 Glu, Asn 또는 Gln으로; His에서 Lys, Arg 또는 Phe로; Asn에서 Gln, Asp 또는 Glu로; 및 Ser에서 Cys, Thr 또는 Gly로의 변화일 수 있다. 알라닌은 다른 아미노산에 대한 치환물로서 통상 사용된다. 20개의 필수 아미노산은 다음과 같이 분류될 수 있다: 비극성 측쇄를 가진 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 비전하 극성 측쇄를 가진 글리신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 산성 측쇄를 가진 아스파테이트 및 글루타메이트; 및 염기성 측쇄를 가진 리신, 아르기닌 및 히스티딘. 문헌 [엘. 스트라이어(L.Stryer),Biochemistry(2d Ed.), p.14-15; Lehninger, Biochemistry, p.73-75].
아미노산 변화는 상응하는 핵산 서열의 코돈을 변화시킴으로써 달성된다. 항원성 또는 면역원성 활성을 변이 또는 개선시키기 위하여, 폴리펩티드 구조내의 다른 아미노산을 특정한 아미노산으로 대체하는 것에 의해 이러한 폴리펩티드를 수득할 수 있음이 공지되어 있다. 예를들면, 대안적인 아미노산의 치환을 통해, 작은 구조적 변화가 폴리펩티드에 부여될 수도 있으며, 그 결과 활성이 증가되거나면역 반응이 향상된다. 대안적으로, 출발 폴리펩티드의 충분한 항원성 성질이 다른 목적을 위해서도 유용하게 유지되는 펩티드-분자 접합체를 제공하기 위하여, 특정한 폴리펩티드내의 아미노산 치환을 사용하여 다른 분자에 연결될 수 있는 잔기를 제공할 수도 있다.
상호작용하는 생물학적 기능을 폴리펩티드에 부여하는데 있어서 아미노산의 수치료적 지수를 사용할 수 있으며, 여기에서 특정한 아미노산을 유사한 수치료적 지수를 갖는 다른 아미노산으로 대체할 수도 있고 이것이 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것을 알아내었다. 대안적으로, 특히 폴리펩티드에서 요망되는 생물학적 기능이 면역학적 구현양태에서의 사용을 위해 발생되는 경우에, 친수성을 근거로 하여 유사한 아미노산의 치환을 행할 수도 있다. "단백질"의 가장 큰 국소적인 평균 친수성은, 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 그의 면역원성과 서로 연관된다. 미국 특허 제4,554,101호 참조. 따라서, 각각의 아미노산에 부여된 친수성을 근거로 하여 치환을 행할 수 있음이 주목된다.
각각의 아미노산에 대해 값을 부여하는 친수성 지수 또는 수치료적 지수를 사용함에 있어서, 이러한 값이 ±2가 되도록 아미노산의 치환을 수행하는 것이 바람직하고, ±1이 특히 바람직하며, ±0.5가 가장 바람직한 치환이다.
변형체 SCP는 7개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 100 내지 약 1500 잔기, 더욱 바람직하게는 약 300 내지 약 1200 잔기, 더욱 더 바람직하게는 약 500 내지 약 1180 잔기를 포함하며, 이때 변형체 SCP는 상응하는 천연 SCP의 아미노산 서열에 대해 50 % 이상, 바람직하게는 약 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 90 %이상 100 % 미만의 인접한 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다.
변형체 SCP 폴리펩티드의 아미노산 서열은 필수적으로 천연 SCP 아미노산 서열에 상응한다. 본 명세서에서 사용된 "필수적으로 상응하는"이란, 천연 SCP에 의해 발생된 반응과 실질적으로 동일한 보호 면역학적 반응을 끌어내는 폴리펩티드 서열을 말한다. 이러한 반응은 천연 SCP에 의해 발생된 수준의 60 % 이상일 수도 있으며, 심지어는 천연 SCP에 의해 발생된 수준의 80 %이상일 수도 있다. 조성물 또는 백신에 대한 면역학적 반응은, 당해 폴리펩티드 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-조정 면역 반응의 숙주에서 발현된다. 보통, 이러한 반응은, 당해 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지정된 항체를 생성하는 주체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포로 구성된다.
SCP는 군 A 연쇄상구균 (SCPA), 군 B 연쇄상구균 (SCPB), 군 C 연쇄상구균 (SCPC) 또는 군 G 연쇄상구균 (SCPG)로부터의 SCP의 변형체일 수도 있다.
본 발명의 변형체는 상응하는 천연 SCP에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수도 있거나 상응하는 천연 SCP에 대한 결실을 포함할 수도 있다. 변형체는 또한 상응하는 천연 SCP에 비해 끝을 절취한 "단편", 다시말해서 완전한 길이 단백질의 단지 일부일 수도 있다. 예를들면, 변형체 SCP는 세포벽 삽입물을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 다를 수도 있다. SCP 변형체는 또한 하나 이상의 D-아미노산을 가진 펩티드를 포함한다.
백신의 변형체 SCP는 변형체 SCP를 암호화하는 단리된 DNA 서열로 부터 발현될 수도 있다. 예를들면, 변형체 SCP는 시그날 서열 또는 세포벽 삽입물을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이할 수도 있다. DNA는 특이성 크레비스(crevice) 또는 촉매적 도메인을 암호화할 수도 있다. 특히, DNA는 촉매적 도메인의 아미노산 잔기 130, 193, 295 또는 512, 또는 특이성 크레비스의 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417을 암호화할 수도 있거나 또는 이러한 잔기에서의 변이를 암호화한다. 특히, DNA는 SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A 또는 ΔSCPA49를 암호화할 수도 있다. 상기 기재된 SCPA49H193A에 대해서 이것은 잔기 번호 193에서의 His이 Ala로 대체된 군 A 연쇄상구균 항원형 49로부터의 SCP를 의미한다. 백신의 SCP는 효소적 C5아제 또는 펩티다제 활성을 소실할 수도 있다. 백신은 또한 면역학적 보조제를 함유할 수도 있다. 백신은 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균에 의한 감염을 막기위해 사용될 수 있다. 백신은 면역원성 펩티드 또는 면역원성 다당류에 접합 또는 연결된 면역원성 재조합 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 포함할 수도 있다. "재조합"이란 유전 공학의 방법에 의해 생성된 펩티드 또는 핵산으로 정의된다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환되어 사용된다.
연쇄상구균 C5a 펩티다제 백신은 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 백신은 경구 섭취 또는 비내 접종에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, SCP가 야생형 SCP의 변형체인, 단리되고 정제된 SCP 펩티드및 변형체 SCP를 암호화하는 단리되고 정제된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 예를들면, SCP는 촉매적 도메인의 아미노산 잔기 130, 193, 295 또는 512, 또는 특이성 크레비스의 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417을 포함할 수도 있다. SCP는 SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A 또는 ΔSCPA49일 수도 있다.
도 1. β-용혈성 연쇄상구균으로부터의 C5a 펩티다제의 구조. D는 아스파르트산 잔기를 나타낸다; H는 히스티딘을 나타낸다; S는 세린을 나타낸다; L은 로이신을 나타낸다; P는 프롤린을 나타낸다; T는 트레오닌을 나타낸다; N은 아스파라긴을 나타낸다. R1, R2, R3및 R4는 반복된 서열을 나타낸다. 숫자는 펩티다제내의 아미노산 잔기 위치를 나타낸다.
도 2. 군 A 연쇄상구균 항원형 49 (서열 1), 군 A 연쇄상구균 항원형 12 (서열 2), 군 B 연쇄상구균 (서열 3) 및 군 A 연쇄상구균 항원형 1 (서열 23)으로부터의 SCP의 아미노산 서열의 정렬. 서열은 나타낸 아미노산 위치를 제외하고는 동일하다. 삼각형(∇ )은 시그날 펩티다제의 예측된 절단 점을 나타낸다. 효소의 활성 부위내에 있는 것으로 예측되는 아미노산들은 *로 표시한다. 아미노산 서열에서의 결실은 점으로 나타내고 박스표시를 하였다. 애스테리크(*)는 촉매 도메인의 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 3. SCP 삽입 및 결실 변이체의 구축. 검은색 박스는 결실된 영역을 나타낸다.
도 4. 단색 FACS 분석. PMNs상에서의 게이팅에 의해 형광 데이타를 분석하였다. 두번째 게이트는 첫번째 게이트에 의해 한정된 높은 염색 세포를 계수하기 위해 설정되었다. 기낭을 1×106CFU로 접종하였다.
도 5. 비내 감염 이후에 야생형 및 SCPA-항원형 M49 연쇄상구균의 지속성
도 6. 비내 감염 이후에 생쥐에 전이증식되는 항원형 M6 군A 연쇄상구균의 SCPA-변이주의 능력 비교. M6 연쇄상구균의 2×107CFU으로 접종한 BALB/c 생쥐 (각각의 실험군에서 10 마리)를 비교한다. 스트렙토마이신을 함유하는 혈액 한천 플레이트에서 매일 인두 스와브를 배양하였다. 플레이트가 하나의 β-용혈성 콜로니를 함유한다면 포지티브로 간주되었다. 데이타를 χ2시험에 의해 통계적으로 분석하였다.
도 7. ΔSCPA49 백신 및 면역 프로토콜의 구축
도 8. 토끼 항체는 상이한 항원형과 연관된 SCPA 활성을 중화시킨다. 막대 1은 포지티브 대조군이고 PMNs에 노출전에 예비배양되지 않은 rhC5a를 함유하였다. 막대 10은 rhC5a가 결여된 대조군이다. 정상 토끼 혈청으로 예비배양되거나 (막대 2, M190-131; 막대 4, M6 UAB200; 막대 6, M12 CS24; 막대 8, M49 CS101) 또는 토끼 항-SCPA 49 혈청으로 예비배양된 (막대 3, M1 90-131; 막대 5, M6 UAB200; 막대7, M12 CS24; 막대 9, M49 CS101) 전체의 원상태의 세균을 20 ㎕의 5 μM rhC5a와 함께 45 분동안 배양하였다. BSA-코팅된 마이크로티터 플레이트 웰에 부착되는 PMNs를 활성화시키는 능력에 의해 잔류 rhC5a를 분석하였다. 부착된 PMNs를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
도 9a 및 9b. 정제된 ΔSCPA49 단백질로 생쥐를 비내 면역화한 후 혈청 IgG 및 분비 IgA 반응. SCPA49 특이적 IgG의 혈청 및 타액 수준을 간접적인 ELISA에 의해 결정하였다. 각각의 생쥐로부터의 혈청을 PBS중에 1:2,560으로 희석하고, 타액을 PBS중에 1:2로 희석하였다. 도 9a는 sIgA 실험 결과를 나타내고 도 9b는 IgG 실험 결과를 나타낸다.
도 10a 및 도 10b. 면역화 및 비-면역화 CD1 암컷 생쥐에 전이증식되는 항원형 M49 연쇄상구균의 능력 비교. 각각의 실험 군은 2.0 × 108CFU로 비내 감염된(i.n.) 13 마리의 생쥐를 함유하였다. 데이타를 χ2시험에 의해 통계적으로 분석하였다. 도 10a 및 10b는 반복된 실험의 결과를 나타낸다.
도 11. 폴리클로날 항체에 결합하는 야생형 및 변형체 SCP의 경쟁적 ELISA 비교. 플레이트 항원은 재조합 야생형 SCPA 49 (100 ng/웰)이다. 경쟁 항원은 기호일람표로 나타낸다.
도 12. 폴리클로날 항체에 대한 SCPA1, SCPA49 및 SCPB 결합의 경쟁적 ELISA 비교. 플레이트 항원은 재조합 야생형 SCPA49 (100 ng/웰)이다. 경쟁 항원은 기호일람표로 나타낸다. 이 도면에 나타낸 실험에서 사용된 SCPA1 및 SCPA49는Asn32내지 His1139를 포함하였다. 이 도면에 나타낸 실험에서 사용된 SCPB는 문헌 [크모리지니아,아이. (Chmouryguina, I.) 등, "군 A 및 B 연쇄상구균에서의 C5a 펩티다제 유전자의 보존 (Conservation of the C5a Peptidase Gene in Group A and B Streptococci)",Infect.Immun., 64:2387-2390 (1996)]에 따라 만들어졌다.
많은 세균성 병원체에 의한 감염에 대항하는 가장 중요한 방어선은, 감염 부위에서 식작용 다핵형백혈구 (PMNs) 및 단핵 세포를 축적하는 것이다. 이러한 세포의 유인은 주화성자극, 예컨대 숙주 인자 또는 침입 유기체에 의해 분비되는 인자에 의해 중개된다. C5a 화학주성인자는 포유동물에서의 이러한 염증 반응을 자극하는데 중추적인 역할을 한다. C5a는 보체의 다섯번째 성분 (C5)으로부터 절단된 74개 잔기 글리코펩티드이다. 식작용 세포는 C5a의 증감율에 직접적인 방식으로 반응하며 감염 부위에 축적된다. C5a는 염증 동안에 식세포의 가장 직접적인 유인인자일 수도 있다. PMNs가 염증 병변을 침윤할 때, 이들은 IL8과 같은 다른 케모킨을 분비하고, 이는 염증 반응을 더욱 증대시킨다.
연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCP)는 병원성 연쇄상구균의 표면에 위치한 단백질분해 효소이며, C5a가 국소적으로 생성될 때 C5a를 파괴한다. SCP는 PMN 결합 부위 (C5a의 His67-Lys68잔기 사이)에서 C5a 주화성인자를 특이적으로 분열시키며, C5a의 7개의 제일 끝의 C-말단 잔기를 제거한다. 이러한 PMN 결합 부위의 분열은 주화성 시그날을 제거한다. 문헌 [클레어리,피.(Cleary,P.) 등, "연쇄상구균 C5a펩티다제는 고 특이적 엔도펩티다제이다 (Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase),"Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992); 웩슬러,디.이. (Wexler, D.E.), 등, "군A 연쇄상구균 C5a 불활성인자의 작용 메카니즘 (Mechanism of action of the group A Streptococcal C5a inactivator),"Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82;8144-8148 (1985)].
군A 연쇄상구균으로부터의 SCP는 124,814da의 Mr을 갖고 많은 그람 양성 세균 표면 단백질에 공통적인 세포벽 앵커 모티프를 가진 섭틸리신-유사 세린 프로테아제이다. C5a 펩티다제의 구조는 도 1에 나타낸다. 스트렙토코커스 피오게네스의 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열은 공고되어 있다. 문헌 [첸.씨 (Chen,C.), 및 클레어리,피(Cleary,P.) "스트렙토코커스 피오게네스의 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열 (Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes),"J.Biol.Chem., 265:3161-3167(1990)]. 섭틸리신과는 반대로, SCP는 매우 좁은 기질 특이성을 갖는다. 이러한 좁은 특이성은 그들의 촉매적 도메인 사이의 현저한 유사성의 관점에서 놀라운 것이다. 문헌 [클레어리,피. 등, "연쇄상구균 C5a 펩티다제는 고 특이성 엔도펩티다제이다 (Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase)."Infect.Immun., 60:5219-5223 (1992)]. 결합 포켓의 양측 상의 잔기와 같이 전하 전달에 관련된 잔기가 보존된다. 그러나, SCP의 잔류 아미노산 서열은 섭틸리신의 아미노산 서열과는 관련이 없다. 군A연쇄상구균의 40개 이상의 항원형이 SCP 단백질을 생성하거나 또는 유전자를 포함하고 있음이 밝혀졌다. 문헌 [클레어리,피. (Cleary,P.) 등, "주화성의 연쇄상구균 불활성화제: 군A 연쇄상구균에 특이적인 새로운 병원성 인자 (A Streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A Streptococci),"Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Diseasep.179-180 (S.Kotami 및 Y.Shinokawa ed.; Reedbooks Ltd., Berkshire, England; 1984); 포드비엘스키,에이. (Podbielski,A.) 등, "군A 연쇄상구균 virR49 유전자는 4개의 구조적 vir 레귤론 유전자의 발현을 조절한다 (The group A Streptococcal virR49 gene controls expression of four structual vir regulon genes),"Infect. Immun., 63:9-20 (1995)].
SCP의 촉매적 도메인 또는 활성 부위는 전하 전달 계 및 특이성 크레비스로 이루어진다. 촉매적 도메인이라고도 불리우는 전하 전달 계는 잔기 Asp130, His193, Asn295및 Ser512(도 1 및 도 2)을 함유한다. 이러한 아미노산의 어느 하나의 변이, 다시말해서 결실, 삽입 또는 치환은 효소를 불활성화할 수도 있다. 다른 한편, 특이성 크레비스는 Ser260, Phe261, Gly262, Ile415, Tyr416및 Asp417에 의해 형성되는 것으로 예측된다. 이러한 아미노산의 치환에 의한 변이는 효소의 기질 특이성을 변화시키거나 단백질분해 활성을 완전히 제거할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실에 의한 변이는 또한 효소를 불활성화시킨다. 촉매적 도메인은 성숙한 효소가 그의 활성 상태로 감겨질 때 생성되는 단백질의 3차 구조에 의존된다. 이러한 도메인은아미노산 잔기의 인접한 선형 배열로부터 형성되지 않는다. 대안적으로, 변이는 기질에 대한 변형체 SCP의 결합을 감소시킬 수도 있다. 결합은 50%, 70%, 또는 심지어 80%로 감소될 수도 있다.
군B 연쇄상구균과 관련된 C5a 펩티다제 효소가 또한 동정되었다. 문헌 [힐(Hill),H.R.등, "군 B 연쇄상구균은 보체의 다섯번째 성분의 주화성 활성을 억제한다 (Group B Streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement),"J.Immunol. 141:3551-3556 (1988)]. scpB 뉴클레오티드 서열의 제한효소 지도작성 및 완성은 scpB가 scpA와 97~98% 유사함을 나타내었다. 군A 연쇄상구균 항원형 49, 군A 연쇄상구균 항원형 12, 군B 연쇄상구균 및 군A 연쇄상구균 항원형 1로부터 SCP의 아미노산 서열의 비교를 위해서는 도 2를 참조한다 (각각, 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 23). 군B 연쇄상구균의 모든 항원형을 나타내는 30개 이상의 균주는 scpB 유전자를 보유하고 있다. 문헌 [클레어리 피.피. 등 "군B 및 A 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자 사이의 유사성 (Similarity between the Group B and A streptococcal C5a Peptidase genes),"Infect. Immun. 60:4239-4244 (1992); 수보로브(Suvorov) A.N., 등 "군 B 연쇄상구균으로부터의 C5a 펩티다제 유전자 (C5a peptidase gene from group B streptococci),"Genetics and molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococcip.230-232 (G. Dunny, P.Cleary 및 L.McKay (ed.); American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 1991).
군 G 및 C 연쇄상구균의 인체 단리물은 또한 scpA-유사 유전자를 포함한다.일부 군G 균주는 그들의 표면상에서 C5a 특이적 프로테아제 활성을 발현하는 것으로 나타났다. 문헌 [클레어리, 피. 등, "군 G 연쇄상구균의 병원성 인간 균주는 군 A 연쇄상구균에 의해 생성되는 것과 유사한 C5a 펩티다제 효소를 발현한다 (Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci),"Infect. Immun., 59:2305-2310 (1991)]. 따라서, 군A 연쇄상구균, 군B 연쇄상구균, 군C 연쇄상구균 및 군G 연쇄상구균의 모든 항원형 (>80)은 SCP효소를 생성한다.
SCP는, 감염 부위에 대한 식작용 백혈구의 유입을 억제함으로써, 연쇄상구균이 비인두 점막과 같은 잠재적인 감염 부위에 전이증식하는 것을 돕는다. 이는 숙주에 의한연쇄상구균의 초기 제거를 방해한다. 염증, C5a 백혈구 주화성 및 연쇄상구균 병발력에 대한 SCP의 영향은 프로테아제 구조 유전자내에 한정된 돌연변이를 가진 연쇄상구균 균주를 사용하여 시험되었다. SCP 변형체는 표적화된 플라스미드 삽입에 의하여, 그리고 특이적인 내부 결실을 함유하는 scpA로 야생형 유전자를 대체함으로써 구축되었다. 변형체는 C5a 프로테아제 활성을 소실하였으며, 시험관내에서 C5a에 대한 인간 또는 생쥐 PMNs의 주화성 반응을 억제하지 않았다.
SCP가 식작용 세포의 유입 및 감염 부위로부터 연쇄상구균의 제거를 지연시킨다는 것을 확인하기 위하여 생쥐 결합 조직 기낭(air sac) 모델을 사용하였다. 결합 조직 기낭은 소량의 공기 및 PBS (그 안에 연쇄상구균을 갖거나 갖지 않음)를 25-게이지 바늘로 생쥐의 등 피부 아래에 주입함으로써 생성된다. 문헌 [보일(Boyle), M.D.P. 등, "생체내에서 백혈구 주화성의 측정(Measurement ofleukocyte chemotaxis in vivo),"Meth. Enzymol., 162:101:115 (1988)]. 실험 마지막에, 생쥐를 경추 탈구에 의해 안락사시키고, 동물로부터 기낭을 해부하고, 기낭을 완충액에 균질화시켰다. 기낭 모델의 장점은, 자극제를 주입하지 않는다면, 기낭이 수일 동안 팽창상태로 염증이 없이 유지된다는 것이다. 따라서, 주입된 세균 및 그 결과의 염증 반응이 단 기간의 감염에 걸쳐 국소적으로 유지된다.
야생형 SCP+및 SCP-연쇄상구균 (다시말해서, SCP의 변형 비-기능 형태를 보유하는 군A 연쇄상구균)의 제거를 비교하고, 감염 초기 단계에서 세포 침윤물을 분석하기 위하여 기낭 모델을 변이시켰다. 혈액 한천 플레이트상에서 생존 연쇄상구균에 대해 조직 현탁액을 분석하였으며, 형광 세포 선별법(FACS)에 의해 세포 침윤물을 분석하였다. FACS 분석에서, 현탁액내의 각각의 세포들을 특정한 형광 단일항체로 표지화하였다. 표지화된 세포의 분할량을 FAC-스캔 유동세포계측기 (Scan flowcytometer) 또는 독특한 형광성을 근거로 하여 세포를 계수하는 형광 세포 선별기내에 주입하였다. 기낭 모델을 사용하는 실험은, SCP+인 연쇄상구균이 SCP_인 연쇄상구균에 비해 더욱 병원성인 것을 나타내었다.
인간 혈청 및 타액내의 SCP에 대항하여, 인간 항체 IgG 및 IgA의 생성을 측정하기 위하여 연구를 수행하였다. 문헌 [오코너(O'Connor), SP, 등, "연쇄상구균 C5a 펩티다제에 대한 인간 항체 반응 (The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase),"J.Infect.Dis.163:109-16 (1991)]. 일반적으로, 어리고 비감염된 소아로부터의 혈청 및 타액은 SCP에 대한 항체가 부족하였다.반대로, 건강한 성인으로부터의 대부분의 혈청 및 타액 견본은 상당한 수준의 항-SCP IgG 및 SCP-특이적 분비 IgA (항-SCP sIgA)를 갖고 있었다. 연쇄상구균 인두염에 걸린 환자로부터의, 한쌍의 급성 및 회복기 혈청은 건강한 개인들로부터의 혈청에 비해 상당히 높은 수준의 항-SCP IgG를 갖고 있다. 고 농도의 항-SCP 면역글로불린을 함유하는 혈청은 SCP 활성을 중화시킬 수 있었다. 최근 연쇄상구균 인두염을 앓은 경험이 있는 소아로부터 수득된 타액 견본의 90% 이상에서 이러한 항체가 검출되는 것은, 소아가 항체 반응을 생성할 수 있음을 증명하였다.
인간 피검자가 자연 연쇄상구균 감염에 대한 반응에서 SCP에 대해 IgG 및 IgA를 생성할 수 있긴 하지만, 항-SCP 면역글로불린이 감염에 대항하여 보호를 제공하는지의 여부는 공지되어 있지 않았다. 또한, SCP 단백질이 β-용혈성 연쇄상구균 전이증식 또는 감염에 대한 백신으로서 작용할 수 있는지도 공지되어 있지 않았다. 먼저, 비인강의 전이증식에서 SCP의 역할을 알아보기 위한 연구를 수행하였다. 생균 군A 연쇄상구균으로 비내 감염후에, 인두 배양물을 10일 이하 동안 매일 채취하였다. 10일 기간에 걸쳐 인두에서 지속되는 능력에 대하여 야생형 및 동질유전자 SCP-결여 변이주 연쇄상구균을 비교하였다. 예측된 바와 같이, 비인강으로부터 더욱 빠르게 SCP-결핍 변이주 연쇄상구균이 제거되었다.
전이증식을 방지하는 면역을 유발하는 SCP의 능력을 시험하기 위하여 동일한 비내 생쥐 모델을 사용하였다. Thr63을 암호화하는 뉴클레오티드에서 시작하는 재조합 scpA49 유전자의 변형 형태를 클론화하였다. 이러한 변형체를 ΔSCPA49라고일컫고, 길이는 2908 bp (하기 실시예 4 참조)이다. 친화성 크로마토그래피에 의해 이.콜리 재조합체로부터 변형체 SCP 단백질을 정제하였다. 이러한 단백질 제제로 피내 백신접종된 토끼로부터의 혈청은 시험관내에서 SCP 활성을 중화시켰다. 정제된 단백질 (40 ㎍)을 5 주일의 기간에 걸쳐 생쥐에 비내 투여하였다. 면역된 생쥐는 1 내지 2 일내에 연쇄상구균을 제거하였다; 반면, 비-면역화된 생쥐의 인두 배양물은 10 일 이하동안 포지티브로 유지되었다. 실험을 3개 집단의 생쥐에서 반복하고, SCP 단백질의 3개의 별개의 제제로 백신접종하였다.
단일 항원을 가진 동물의 면역화가 여러 항원형에 의한 전이증식을 방지할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여 추가의 실험을 수행하였다. ΔSCPA49를 발현 벡터내에 클론화하고, 이.콜리내에서 발현하였다. 친화성 정제된 변형체 ΔSCPA49 단백질은 생쥐 및 토끼에서 높은 면역원성을 갖는 것으로 입증되었다. 정제된 변형체 ΔSCPA49 면역원은 효소적 활성을 소실하긴 하지만, 시험관내에서 M1, M6, M12 및 M49 연쇄상구균과 관련된 펩티다제 활성을 중화시킬 수 있는 고 역가의 토끼 항체를 유도하였다. 이는 항-펩티다제 항체가 항원형 특이성을 갖고 있지 않음을 입증하였다. 이어서, 4개 집단의 생쥐를 정제된 변형체 ΔSCPA49으로 비내 면역화하고, 각각을 군A 연쇄상구균의 상이한 항원형으로 공격감염시켰다. ΔSCPA49 단백질로 생쥐를 면역화하면 상당한 수준의 특이적 타액 sIgA 및 혈청 IgG 항체를 자극하였으며, 야생형 M1, M2, M6, M11 및 M49 연쇄상구균이 전이증식하는 가능성을 감소시켰다. 이러한 실험들은 연쇄상구균 C5a 펩티다제 백신으로의 면역이 비인강의 전이증식을 방지하는데 효과적임을 증명한다.
또한, M1 OF-균주 및 M49 OF+균주로부터 변형체 SCP를 발생시키기 위하여 실험을 수행하였다. 활성 SCP는 숙주에 해로울 수 있기 때문에, 변형체 단백질이 효소적 활성을 소실하는 것이 중요하였다. 촉매적 활성을 위해 필요한 아미노산을 효소를 불활성화시키는 것으로 기대되는 아미노산으로 대체하였다.
변형체 단백질의 2개의 성질을 평가하였다. 먼저, 야생형 및 변형체 단백질의 특이적 활성을 PMN 부착성 분석에 의해 결정하였다. 이 실험들은 치환된 아미노산이 90 % 이상으로 효소적 활성을 감소시켰음을 나타내었다. 둘째, 야생형 효소에 대해 지정된 항체를 결합하는 능력에 대하여, 변형체 단백질을 야생형 단백질과 비교하였다. 그 결과는, 아미노산 치환이 변형체 단백질에 결합하는 항체의 능력을 변경시키지 않았음을 나타내었다.
모든 선행 보호 연구들은 친화성 정제된 ΔSCPA49 단백질을 보조제 없이 비내 투여함으로써 수행되었다. 그러나, 항원의 근육내 또는 피하 (SQ) 주사가 전통적으로 바람직하고 더욱 허용되는 백신 전달 방법이다. 따라서, ΔSCPA49를 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 알룸 (AlPO4)으로 SQ 주사하는 것이 보호 면역 반응을 유도하는지의 여부와, 군 A 연쇄상구균의 공격감염 균주가 SCPA 백신의 원천으로부터의 항원형과 상이할 경우 반응이 전이증식을 감소시키는지의 여부를 시험하기 위해 실험을 수행하였다. 경구-비측 인두 점막으로부터 연쇄상구균을 제거하기 위한 면역화된 생쥐의 능력을, 인두 배양물에 의해 또는 해부된 코 조직의 샘플링에 의해 평가하였다.
코 조직과 관련된 연쇄상구균의 수는 예측된 바와 같이 시간에 따라 저하되었으며, 저하는 SCPA 항원으로 면역화된 생쥐에서 더욱 빠르고 완벽하였다. 결과는, 단일 SCPA 항원이 이종 항원형에 대항하여 보호를 유도할 수 있음을 증명하였다. 세균 표면상에서의 펩티다제 활성을 중화시키는 항체에 의해 보호가 부여된다. 이는 연쇄상구균이 점막 조직상에 부착되는 시간으로 부터 수 시간내에 식세포의 유입을 증가시킨다. 식세포에 의한 연쇄상구균의 빠른 제거는 이후의 세균의 증식 및 지속을 막는 것으로 예측된다. 따라서, 보조제와 함께 SCPA 항원의 SQ 주입은, 격렬한 항체 반응을 지속적으로 유발하였다.
따라서, 본 발명은 β-용혈성 연쇄상구균 전이증식 또는 감염에 대항하여 포유동물을 보호하기 위해 사용되는 백신을 제공한다. 본 발명의 한가지 구현양태에서, 백신에 대해 통상적인 것과 같이, 변형체 연쇄상구균 C5a 펩티다제는 약리학적으로 허용가능한 부형제중에서 포유동물에 전달될 수 있다. 본 발명의 백신은 면역 반응을 향상시키는 것으로 공지된 효과적인 양의 면역원성 보조제를 포함할 수 있다.
SCP는 다른 펩티드 또는 다당류에 접합 또는 결합될 수 있다. 예를들면, 당 기술분야에 공지된 면역원성 단백질 (또한, "담체"로서 공지됨)이 사용될 수 있다. 유용한 면역원성 단백질은 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 난알부민, 인간 혈청 알부민, 인간 감마 글로불린, 닭 면역글로불린 G 및 소 감마 글로불린을 포함한다. 유용한 면역원성 다당류는 군 A 연쇄상구균 다당류, 군 B 연쇄상구균으로부터의 C-다당류, 또는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcuspneumoniae) 또는 군B 연쇄상구균의 캡슐 다당류를 포함한다. 대안적으로, 백신으로 사용되는 기타 병원체의 다당류 또는 단백질을 SCP와 접합시키거나 연결시키거나 혼합할 수 있다.
또한, 단리되고 정제된 핵산 분자, 예를들어 적어도 일부의 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 암호화하는 미리 선택된 핵산 단편을 포함하는 DNA 분자가 제공되며, 다시말해서 이는 본 명세서에 기재된 SCP 또는 그의 변형체, 예를들어 SCPA49S512A, SCPA49D130A, SCPA49N295A, SCPA1S512A, SCPA1D130A, SCPA1N295A, ΔSCPA49, SCPBS512A, SCPBD130A, SCPBH193A 또는 SCPBN295A, 또는 이들 변형체의 조합을 암호화한다. 예를들면, 본 발명은 메신저 RNA ("표적"mRNA)의 전부 또는 일부와 실질적으로 동일한 (의미) RNA 분자, 다시 말해서 내인성 또는 "천연"SCP mRNA를 암호화하는 미리 선택된 DNA 단편을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 발현 카세트내의 미리 선택된 DNA 단편은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 서열내의 "실질적으로 동일한"이란, 2개의 핵산 서열이 약 65 % 이상, 바람직하게는 약 70 %, 더욱 바람직하게는 약 90 %, 더욱 더 바람직하게는 약 98 %의 연속적인 뉴클레오티드 서열 상호 동일성을 갖고 있음을 의미한다. 바람직하게는, 미리 선택된 DNA 단편을 하이브리드형성 조건하에서, 바람직하게는 엄격한 하이브리드형성 조건하에서, 상응하는 천연 SCP를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드형성시킨다.
본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한"은, 객체 종이 존재하는 우세한 종이고 (다시말해서, 몰 기준으로, 조성물내의 기타 개별적인 종에 비해 더욱 풍부하다), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50 % (몰 기준)가 객체 종인 조성물임을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 85 % 이상, 약 90 %, 약 95 % 및 약 99 %을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 객체 종을 필수적으로 균일하게 정제하고 (이 조성물중에서 통상의 검출 방법으로는 오염 종을 검출할 수 없다), 이때 조성물은 필수적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 핵산" 또는 "사전 선택된 핵산", 예를들어 "재조합 DNA 서열 또는 단편" 또는 "사전 선택된 DNA 서열 또는 단편"이란, 적절한 원천으로부터 유래 또는 단리되고, 시험관내에서 연속적으로 화학적 변경될 수 있으며, 그 결과 그 서열이 천연 발생된 것이 아니거나 또는 외인성 DNA로 형질전환되지 않은 게놈내에 위치시킬 때 위치결정되지 않은 천연 발생 서열에 상응하는 핵산, 예를들어 DNA를 말한다. 원천으로부터 "유래된" 사전 선택된 DNA의 예는 주어진 유기체내에서 유용한 단편으로서 동정되어진 DNA 서열이며, 이어서 이는 필수적으로 순수한 형태로 화학적으로 합성된다. 원천으로부터 "단리된" DNA의 예는, 화학적 수단, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제의 사용에 의해 상기 원천으로부터 잘라내거나 제거된 유용한 DNA 서열이며, 그 결과 이것은 유전 공학 방법에 의하여 본 발명에서 사용하기 위해 더욱 조작, 예를들어 증폭될 수 있다.
제한 소화물로부터 소정의 DNA 단편을 회수 또는 단리하기 위해서는, 전기영동에 의해 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔 상에서 소화물의 분리, 공지된 분자량의 마커 DNA 단편의 이동성에 대해 그의 이동성을 비교함에 의한 해당 단편의 동정, 목적하는 단편을 함유하는 겔 분획의 제거, 및 DNA로부터 겔의 분리를 사용할 수 있다. 문헌 [로운(Lawn) 등,Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981) 및 고에델(Goeddel) 등,Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980)]. 따라서, "사전 선택된 DNA"는 완전 합성 DNA 서열, 반-합성 DNA 서열, 생물학적 원천으로부터 단리된 DNA 서열, 및 RNA로부터 유래된 DNA 서열 뿐만 아니라 이들의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 RNA 분자에 대해 "유래된"이란 용어는, RNA 분자가 특정 DNA 분자에 대해 상보적인 서열 동일성을 갖고 있음을 의미한다.
SCP의 아미노산 서열 변형체를 암호화하는 핵산 분자는 당 기술분야에 공지된 여러 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법들은 천연 원천 (자연 발생 아미노산 서열 변형체의 경우)으로부터의 단리, 또는 올리고뉴클레오티드-중개 (또는 부위-특이적) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 초기 제조된 변형체 또는 SCP의 비-변형 형태의 카세트 돌연변이유발을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
피검자를 면역화하기 위하여, 변형체 SCP를 통상 적절한 부형제내에서 근육내 또는 피하 주사함으로써 비경구 투여한다. 그러나, 경구 전달 또는 비내 전달과 같은 다른 방식의 투여도 허용될 수 있다. 백신 제제는 부형제내에 유효한 양의 활성 성분을 함유한다. 유효한 양은 표적 포유동물에서 β-용혈성 연쇄상구균 전이증식의 발생을 방지, 경감 또는 감소시키기에 충분한 양이다. 유효한 양은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 활성 성분은 전형적으로 조성물의 약 1 % 내지 약 95 % (w/w)의 범위이거나, 또는 적절한 경우 그 보다 높거나 낮다. 투여되는 양은 백신접종을 위한 동물 또는 인간 피검자의 연령, 체중 및 물리적 상태와 같은 요인에 의존된다. 양은 또한 항체를 합성하는 동물의 면역계의 능력 및 목적하는 보호 정도에 의존된다. 효과적인 투여량은 투여량 반응 곡선을 설정하는 일상적인 시도를 통해 당업자에 의해 쉽게 설정될 수 있다. 피검자는 한번 이상의 투여량으로 SCP를 투여함으로써 면역화된다. 연쇄상구균에 대한 면역 상태를 유지하기 위해 필요한 경우, 다중 투여량이 투여될 수도 있다.
비내 제제는 코 점막에 대한 자극을 일으키지 않거나 섬모 기능을 심각하게 방해하지 않는 부형제를 포함할 수도 있다. 물, 염수 또는 기타 공지된 물질과 같은 희석제를 본 발명에서 사용할 수도 있다. 코 제제는, 이에 한정되지는 않지만 클로로부탄올 및 벤즈알코늄 클로라이드와 같은 보존제를 함유할 수도 있다. 계면활성제는 코 점막에 의해 주제 단백질의 흡수를 향상시키기 위해 존재할 수도 있다.
경구 액체 제제는 예를 들면 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르의 형태일 수도 있거나, 또는 사용 전에 물 또는 기타 적절한 부형제와의 재구성을 위한 정제 형태 또는 제품으로 건조상태로 존재할 수도 있다. 액체 제제는 현탁제, 유화제, 비-수성 부형제 (식용유를 포함할 수도 있다), 또는 보존제와 같은 통상의 첨가제를 함유할 수도 있다.
백신을 제조하기 위하여, 정제된 SCP를 단리, 동결건조 및 안정화할 수 있다. 이어서, SCP 펩티드를 적절한 농도로 조절하고, 임의로 적절한 백신 보조제와 조합하고, 사용을 위해 포장할 수 있다. 적절한 보조제는 계면활성제, 예를들어헥사데실아민, 옥타데실아민, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N'-N-비스(2-히드록시에틸-프로판 디-아민), 메톡시헥사데실-글리세롤, 및 플루론 폴리올; 폴라니온, 예를들어 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산, 카르보폴; 펩티드, 예를들어 뮤라밀 디펩티드, MPL, 아이메틸글리신, 터프트신, 오일 에멀젼, 알룸 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 기타 가능한 보조제들은 이.콜리 열 불안정 독소 또는 콜레라 독소의 B-펩티드 소단위를 포함한다. 문헌 [맥그히(McGhee), J.R. 등, "백신 개발에 대하여 (On vaccine development)",Sem.Hematol., 30:3-15 (1993)]. 마지막으로, 면역원성 생성물을 백신 제제중에 사용을 위해 리포좀내에 혼입할 수 있거나, 또는 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 또는 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 기타 중합체와 같은 단백질에 접합시킬 수도 있다.
전이증식에 대항하여, 포유동물의 백신접종을 위해 SCP를 사용하는 것은 기타 다른 백신 후보들에 비해 장점을 제공한다. 단일 단백질로의 접종에 의해 전이증식 또는 감염을 예방하는 것은, 스트렙 인두염 및 농가진의 매우 일반적인 문제의 발생을 감소시킬 뿐만 아니라, 류머티스열, 급성 사구체신증, 패혈증, 독소 쇼크 및 괴사성 근막염과 같은 속발증을 제거한다.
하기 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것이지만 이를 한정하지 않는다.
실시예 1
scpA49 및 scpA6에서 삽입 및 결실 변이체의 구축 및 시험관내 분석
a) 세균 균주 및 배양 조건
에스.피오게네스 균주 CS101은 항원형 M49이고, 혈청 유백도 포지티브(OF+) 균주이다. CS159는 M 유전자 집괴 및 scpA를 통해 뻗은 결실을 가진 임상 단리물이다. CS101Sm이라 불리는, 균주 CS101의 자발적인 스트렙토마이신 내성 유도체는 정지기 배양물로부터의 연쇄상구균을, 스트렙토마이신 (200 ㎍/ml)을 함유하는 트립토스 혈액 한천상에 평판배양함으로써 선택하였다. 연쇄상구균 균주 CS210 및 CS463은 각각 OF+, 부류 II, 항원형 M2 및 M11 균주의 자발적인 스트렙토마이신 내성 유도체이다. 연쇄상구균 균주 90-131 및 UAB 200은 각각 군A 연쇄상구균의 OF_, 부류 I, 항원형 M1 및 M6 인간 단리물의 자발적인 스트렙토마이신 내성 유도체이다.
CS101::pG+호스트5는 비공지된 위치에서, 그러나 scpA 및 emm 유전자 집괴의 밖에서, 염색체내에 통합된 pG+호스트5를 가진 균주 CS101이다. 에스케리키아 콜리 균주 ER1821 (미국 매사츄세츠 버버리의 뉴 잉글랜드 바이오랩, 인코포레이티드 (New England Biolabs, Inc)로 부터 수득됨)을 자살 벡터, 플라스미드 pG+호스트5를 위한 수용체로서 사용하였다. 플라스미드 pG+호스트5를 미국 캘리포니아 플리산톤의 아플리겐 인코포레이티드 (Appligene, Inc.)로부터 수득하였다. 연쇄상구균을 2% 네오펩톤 또는 1% 효모 추출물로 보충된 토드-헤위트(Todd-Hewitt) 브로쓰, 또는 5% 양 혈액을 가진 트립토스 한천 플레이트에서 생육시켰다. 플라스미드 pG+호스트5를 함유하는 이.콜리 균주 ER1821을 에리트로마이신 (300 ㎍/ml)을 가진 LB 브로쓰에서 생육시켰다. 플라스미드 pG+호스트5를 가진 연쇄상구균을 1 ㎍/ml의 에리트로마이신(Erm)을 함유하는 1% 효모 추출물(THY)를 가진 토드-헤위트 브로쓰에서 배양하였다.
SCP란 일반적으로 β-용혈성 연쇄상구균으로부터의 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 말한다. SCPA1, SCPA12, SCPA49, SCPA6은 각각 군 A 연쇄상구균 M 항원형 1, 12, 49 및 6 균주로부터의 특정한 펩티다제이다. 용어 scpA란 군 A 연쇄상구균으로부터 SCP를 암호화하는 유전자를 말한다. scpA1, scpA12, scpA6 및 scpA49는 SCPA1, SCPA12, SCPA49 및 SCPA6 펩티다제를 암호화하는 유전자이다. SCPB 및 scpB란 군 B 연쇄상구균으로부터의 펩티다제 및 유전자를 말한다. SCPA49 (서열 1), SCPA12 (서열 2), SCPA1 (서열 23) 및 SCPB (서열 3)에 대한 아미노산 서열을 도 2에 나타낸다.
b) scpA49 삽입 변이체의 구축
scpA49의 한정된 삽입 변이체를 플라스미드 삽입 및 유전자 치환 방법을 사용하여 구축하였다. 삽입 표적인 내부 scpA49 BglII-BamHI 단편을 열감수성 셔틀 벡터 pG+호스트5내에 결찰시켜 플라스미드 pG::scpA1.2를 형성하고, 이.콜리 ER1821내에 형질전환시켰다 (도 3). pG+호스트5 벡터는 39 ℃에서 활성인 이.콜리 복제개시점, 온도 민감성 그람 양성 복제 개시점 (연쇄상구균에서 30 ℃에서 활성 및 39 ℃에서 불활성), 및 선별을 위한 에리트로마이신 내성 유전자를 함유한다. 높은 온도는, 플라스미드가 10-2내지 10-3범위의 빈도로 동종 재조합체에 의해 군 A 연쇄상구균의 염색체 DNA내에 통합되도록 한다.
재조합 플라스미드 DNA pG::scpA1.2를 CS101 수용체 세포내에 엘렉트로포레이트하였다. 형질전환체를 30 ℃에서 1 ㎍/ml 에리트로마이신을 함유하는 THY-한천 플레이트상에서 선별하였다. 플라스미드 삽입물과 염색체 scpA49 사이의 재조합으로부터 얻어진 염색체 통합물을 39 ℃에서 에리트로마이신 내성에 의해 선별하였다. 2개의 삽입 변이체 M14 및 M16을 분석하였다. 30 ℃에서 항생물질을 갖지 않은 THY중에 통과시키고, 마지막으로 Erm 선별 없이 37 ℃에서 평판배양함으로써, 균주 M14 및 M16의 EmrS 복귀돌연변이체를 수득하였다. 변이주 표현형이, 동시적인 관련없는 돌연변이로부터 보다는, scpA49내에 플라스미드의 삽입으로부터 얻어진다는 것을 확인하기 위하여, 플라스미드를 소실한 콜로니를 단리하였다.
c) scpA6 삽입 변이체의 구축
상기 b)에서 기재된 바와 같이 scpA6 삽입 변이체 AK1.4를 구축하였다. 재조합 플라스미드 DNA, pG::scpA1.2는 scpA 유전자의 내부 BglII-HindIII 단편을 함유한다. 이러한 플라스미드를 UAB200 수용체 세포내에 엘렉트로포레이트하고, 30 ℃에서 에리트로마이신을 함유하는 THY 한천 플레이트상에서 형질전환체를 선별하였다. 플라스미드 삽입물과 염색체 scpA6 사이의 재조합으로부터 얻어진pG::scpA1.2, 균주 AK1.4의 염색체 통합물을, 39 ℃에서 에리트로마이신을 함유하는 한천 배지상에 생육시킴으로써 선별하였다. scpA6내로의 삽입은, 프로브로서 scpA를 사용하는 서던 블롯팅 방법, 및 플라스미드에 대해 특이적인 M13 만능 프라이머 (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')(서열 6) 및 GAS의 염색체 scpA에 대해 특이적인 scpA For835 프라이머 (5'-AAGGACGACACATTGCGTA-3')(서열 7)를 사용하는 PCR에 의해 확인되었다.
d) scpA내로의 한정된 결실 도입 (도 3)
scpA49내의 삽입이 극성이 될 수 있고, 유기체의 병원성에 기여할 수 있는 비공지된 유전자인 하류 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 가능성을 제거하기 위하여, scpA49 내부에 한정된 결실을 가진 변이 균주를 구축하였다. 먼저, 프라이머 1 (5'-GGGGGGGAATTC GTAGCGGGTATCATGGGAC-3'), 서열 4 및 프라이머 2 (5'-GGGGGGGAATTC GGGTGCTGCAATATCTGGC-3'), 서열 5를 사용한 인사이드-아웃 PCR에 의해 scpA의 BalII-HindIII 단편에서의 한정된 결실을 생성하였다. 밑줄그은 뉴클레오티드는 각각 동등물 2398 및 2322를 가진 scpA 서열에 상응하고, 굵은 글씨로 나타낸 뉴클레오티드는 EcoRI 제한효소 부위에 상응한다. scpA 유전자내의 프레임내 결실을 생성하기 위하여 프라이머를 선택하였다. 이러한 프라이머들은 반대 방향에서 플라스미드 DNA를 복제하며 결실의 경계를 한정한다. 문헌 [인니스 (Innis),M.A. 등, eds.,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Academic Press, 1990)]. 플라스미드 pG::scpA1.2DNA를 주형으로서 사용하였다.
증폭된 생성물을 EcoRI으로 소화시키고, 플라스미드 pG+호스트5에 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드 pG::ΔscpA1.1은 scpA의 내부의 76bp 결실을 함유하였다. 이러한 프레임내 결실은, 세린 프로테아제의 예측된 촉매 중심의 일부를 형성하는 세린을 포함하여 25개의 아미노산을 제거하였다. 문헌 [첸, 시. 및 클레어리,피. "스트렙토코커스 피오게네스의 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열 (Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes),"J.Biol.Chem., 265:3161-3167 (1990)]. EcoRV 부위가 결실 지점에서 형성되었다. 결실의 경계를 확인하기 위하여 결실에 겹쳐 이어진 DNA를 서열결정하였다.
결실을 함유하는 플라스미드 pG::ΔscpA1.1을 이.콜리 ER1821내로 형질전환하였다. ErmR에 대해 콜로니를 선택한 다음, EcoRI에 의해 제한된 미니프레프 플라스미드 DNA를 사용하여 적절한 scpA 결실에 대해 검색하였다. DNA 서열결정에 의해 결실의 정확한 경계를 확인하였다. 플라스미드 pG::ΔscpA1.1을 상기 기재된 바와 같이 균주 CS101Sm내로 엘렉트로포레이트하고, 통합물을 39 ℃에서 Erm상에서의 생육에 의해 선택하였다. 고온 선별법을 사용하여 M49 균주 CS101sm의 염색체내에 플라스미드의 통합을 선별하였다. 이러한 삽입 위치를 PCR에 의해 확인하였다. 에리트로마이신 선별없이 저온에서 CS101Sm (pG::ΔscpA1.1)을 생육시키면, 랜덤한 결실에 의하여 또는 삽입에 의해 생성된 중복 scpA 서열 간의 재조합에 기인한 절제에 의하여, 플라스미드를 소실한 ErmS 복귀돌연변이체가 높은 빈도로 분리된다. 2개의 결실 변이주 MJ2-5 및 MJ3-15를 동정하고 더욱 연구하였다. 플라스미드 pG::ΔscpA1.1의 재조합 절제에 의해 남겨진 염색체 결실을, EcoRV 소화된 DNA에 대한 PCR 및 서던 하이브리드형성에 의해 한정하였다.
e) SCP상의 돌연변이의 시험관내 효과
SCP 항원 및 펩티다제 활성의 발현에 대해 미치는 삽입 및 결실의 영향을 웨스턴 블롯 및 PMNs 부착성 분석에 의해 평가하였다. 연쇄상구균을 100 ml THY중에서 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 배양물 펠릿을 5 ml 냉 0.2 M Na아세테이트 (pH5.2)중에서 2회 세척한 다음, 1 ml TE-슈크로스 완충액 (20 % 슈크로스 10mM 트리스, 1mM EDTA, pH 7.0) 및 40 ㎕ 뮤타놀리신중에 현탁하였다. 혼합물을 37 ℃에서 2 시간동안 회전시킨 다음, 4500 rpm에서 5 분동안 원심분리하였다. 상층액은 프로테아제 억제제, 100 mM 페닐메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)를 함유하였다. 문헌 [램리(Laemmli),U.K., "박테리오파지 T4의 헤드의 구축 동안에 구조 단백질의 분열 (Cleavage of Structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4,"Nature227:680-685 (1970)]에 기재된 바와 같이 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 방)법을 수행하였다. 웨스턴 및 콜로니 블롯에서 SCP 단백질을 검출하기 위해 사용된 1차 항혈청은, 정제된 재조합 SCP 단백질로 토끼를 면역화함으로써 제조되었다. 항-토끼 항체 알칼리성 포스파타제 접합물에 의해 결합을 검출하였다.
PMN 부착성 분석을 사용하여 C5a 펩티다제 활성을 측정하였다. 문헌 [부스(Booth), S.A. 등, "다프손은 인테그린-조정 호중구 부착 기능을억제한다(Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil adherence function),"J.Invest.Dermatol. 98:135-140 (1992)]. 연쇄상구균 추출물 또는 정제된 프로테아제와 함께 C5a (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)의 배양후에, 잔류 C5a는 PMNs를 활성화시켜 BSA 코팅된 웰에 부착되도록 할 수 있다. 먼저, 마이크로티터 웰을 PBS중에서 0.5 % BSA로 코팅하고, 37 ℃에서 1시간동안 배양하였다. 인간 PMNs를 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque) (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)중에서 원심분리에 의해 단리하였다. 40 ㎕의 자연그대로의 연쇄상구균 또는 단백질 추출물을, 1 % 글루코스 및 0.1 % CaCl2를 가진 340 ㎕의 PBS중의 5 μM C5a 20 ㎕와 함께 37 ℃에서 45 분동안 배양하였다. BSA-코팅된 웰을 PBS로 세척하고, PMNs를 재현탁시키고, 잔류 C5a를 웰에 첨가하였다. 혼합물을 7 % CO2중에서 37 ℃에서 45 분동안 배양하였다. 마지막으로, 웰을 세척하여 부착되지 않은 PMNs를 제거하였다. 부착 PMNs를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, ELISA 판독기에서 OD570mm를 판독하였다. 광학 밀도는 잔류 C5a의 양에 비례하거나, 또는 SCP 활성의 양에 반비례한다.
친주 배양액 및 변이주 배양액으로부터 세포 표면 단백질의 뮤타놀리신 추출물을 SCPA 특이적 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 변이주는 SCPA를 소실한 것으로 확인되었다. SPCA-변이주 AK1.4 및 MJ3-15의 추출물은 항-SCPA 혈청과 반응하지 않았다. 기대된 크기의 SCPA 단백질이 야생형 균주 CS101 및 UAB200으로부터의 추출물에서 관찰되었다. rhC5a를 파괴하는 능력을 비교함으로써, 변이주 AK1.4 및 MJ3-15의 C5a 펩티다제 활성을 생성하는 능력의 결핍을 입증하였다. 단리된 PMNs를 rhC5a에 노출시키면, 이들이 BSA 코팅된 마이크로티터 웰에 부착되도록 유도되었다. 연쇄상구균 또는 정제된 SCPA와의 배양은 특이적으로 rhC5a를 절단하며 PMNs를 활성화시키는 가능성을 변경시킨다. 잔류 rhC5a에 반응하고 BSA 코팅된 웰에 결합하는 PMNs를 염색한 다음, 분광광도계에 의해 측정하였다. 친주 배양액 UAB200 및 CS101와 rhC5a를 배양하면 rhC5a를 파괴시키고, 이는 각각 58.8 % 및 54.5 %로 PMN 부착성을 억제한다. SCPA-변이주와는 반대로, AK1.4 및 MJ3-15는 BSA 코팅된 웰에 대한 PMNs의 부착성 또는 rhC5a를 변경시키지 않았다 (표 1). 이러한 실험은 웨스턴 블롯을 확인하였으며, SCPA-배양액이 rhC5a를 붕괴시킬 수도 있는 기타 프로테아제를 갖고 있지 않음을 증명하였다.
| 야생형 및 변이 균주의 식작용 분석 및 PMN 부착성 분석 | |||||
| 균주 | 표시 | 콜로니 형성 단위 (cfu)/ml | 홀드 증가(cfu/ml) | C5a 유도된 PMN 부착성의 % 억제율* | |
| 시간 = 0 h | 시간 = 3h | ||||
| UAB200 | M6+, SCPA+ | 1.8 ×103 | 7.2 ×104 | 40 | 58.8 |
| AK 1.4 | M6+, SCPA- | 1.2 ×103 | 4.5 ×104 | 37.5 | 0 |
| CS101 | M49+, SCPA+ | 1.0 ×104 | 4.9 ×105 | 49 | 54.5 |
| MJ3-15 | M49+, SCPA- | 1.5 ×104 | 2.1 ×105 | 14 | 0 |
| * % 억제율 = [(C5a 단독에 의해 활성화된 PMN의 OD570nm- 세균과 예비배양된 C5a에 의해 활성화된 PMN의 OD570nm/C5a 단독에 의해 활성화된 PMN의 OD570nm)] x 100 % |
M 단백질 발현이 scpA 내의 돌연변이에 의해 영향을 받지 않는 것으로 기대되긴 하지만, SCPA-변이주 연쇄상구균이 M 단백질을 여전히 발현하고 식작용에 저항하는 능력을 갖고 있는지의 여부를 평가하기 위하여 분석을 수행하였다. 3시간 배양 동안에 새로운 인간 혈액중에서의 연쇄상구균의 생육은, 그들의 표면상에 항식작용 M 단백질이 존재하는 지표가 된다. 문헌 [R.C.랑스필드(Lancefield), "살균 시험을 참조로 하여, 공통적인 R 항원을 가진 군 A 연쇄상구균의 3개 항원 형태로의 분별 (Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test),"J.Exp.Med., 106, pp.525-685 (1957)]. 기대된 바와 같이, 친주 연쇄상구균 UAB200 및 CS101은 각각 40 및 49 배 증가하였다 (표 1). M+SCPA_배양액, 균주 AK1.4 및 MJ3-15는 각각 37.5 배 및 14 배 증가하였으며, 이는 scpA 돌연변이가 전체 인간 혈액내에서 M 단백질 발현이나 식작용에 대한 내성에 거의 영향을 미치지 않음을 입증한다. 순환된 혈액내에서 변이 균주의 다소 불량한 생육은 재현가능하였으며 뜻밖의 일이다. 인간 혈장내에서 변이주 및 친주 배양액의 생육 속도는 구별될 수 없었다. SCPA의 불활성화에 의해 순환된 혈액내에서 C5a가 축적될 수 있으며, 이는 다시 PMNs를 활성화시킨다. 활성화된 PMNs는 더욱 활발한 식작용을 가지며, M+연쇄상구균을 더욱 양호하게 사멸시킬 수 있다. 표면 단백질 추출물은, 항-M49 및 항-M6 항혈청을 사용하는 웨스턴-블롯에 의해 분석시에, M6 및 M49 항원을 함유하며, 이는 SCPA내의 돌연변이가 M 단백질 발현을 변경시키지 않았음을 증명하는 것이다.
실시예 2
SCP는 식세포의 점증 및 감염의 피하 부위로부터 연쇄상구균의 제거를 지연시킨다.
SCP가 C5a의 불활성화의 원인이 된다는 것을 입증하기 위하여, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 scpA49의 삽입 및 결실 변이주를 구축하고 활성을 시험하였다. 삽입 또는 결실이 scpA49내에 도입될 때, 변형체 SCP는 마이크로티터 플레이트에 대한 PMNs의 C5a-활성화된 부착을 파괴시킬 수 없었다.
연쇄상구균이 국소적으로 유지되고 염증 세포의 유입이 분석될 수 있는 동물 모델을 사용하여, scpA49에서의 돌연변이가 병원성에 대해 미치는 영향을 시험하였다. SCP가 매우 초기에 유기체의 초기 제거를 방해하는 작용을 한다는 가정을 시험하기 위하여, 결합 조직 기낭의 접종 후 4시간째에 SCP+및 SCP_연쇄상구균의 발육을 비교하였다. 또한, 짧은 감염 기간 후에 림프 절 및 비장으로의 연쇄상구균의 전염을 평가하였다.
미국 매사츄세츠 윌밍톤의 챨스 리버 브리딩 래브러토리 (Charles River Breeding Laboratory)로부터 수득되는 CD1 수컷 이계교배된 생쥐(25 g)를 모든 실험에서 사용하였다. 공기 0.9 ml 및 PBS에 희석된 군 A 연쇄상구균 0.1 ml를 25 게이지 바늘을 사용하여 생쥐 등의 피부아래에 주입함으로써 결합 조직 기낭을 발생시켰다. 일부 실험에서, SCP+CS101::pG+호스트5를 포지티브 대조로서 사용하였다. 다른 실험에서, 균주 CS101Sm을 포지티브 대조로서 사용하였다. 주입 4 시간후에 경추 탈구에 의해 생쥐를 안락사시켰다. 지시된 경우에, 모든 4개의 서혜부림프절, 비장 및 기낭을 동물로부터 해부하고, PBS중에 균질화시켰다. 1 ㎍/ml 에리트로마이신 또는 200 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 혈액 한천 플레이트상에서 생존 콜로니 형성 유니트(CFU)에 대하여 조직 현탁액을 분석하였다.
예비 실험에서, 기낭을 슬라이드상에 고정시키고, 라이트(Wright)의 염색제로 염색하고 현미경으로 관찰하였다. 이 방법에 의한 과립구의 계수는 신뢰할 수 없긴 하지만, 고정된 조직내의 야생형 연쇄상구균에 비하여 상당히 적은 잔류 SCP-가 존재하는 것으로 보인다. 이러한 차이를 측정하기 위하여 추가의 실험들을 수행하였다. 기낭을 PBS중에서 분쇄한 다음 나일론 단일필라멘트 메쉬 (미국 뉴욕 테트코 컴퍼니(TETKO Co.))를 통해 통과시킴으로써 기낭의 분산된 세포 집단을 제조하였다.
300 ×g에서 5 분간 원심분리하고 FACS 완충액 (페놀 레드, 0.1% NaN3, 1.0% BSA 분획 V를 갖지 않은 행크스 균형화 염 용액)중에 5 ×106/ml로 재현탁함으로써 세포를 펠릿화하였다. 세포(1.0 ×106)를 1 ㎍ FITC 항-생쥐 Mac-1로 직접적으로 염색하거나, 또는 1 ㎍ 바이오틴 접합된 항-생쥐 Gr-1에 이어서 형광 또는 FITC로 표지된 1 ㎍ 스트렙타비딘으로 간접적으로 염색한다. 단일클론성 항체, Mac-1 및 Gr-1은 미국 캘리포니아의 파르밍겐 인코포레이티드 (Pharmingen Inc.)로부터 수득되었다. 표지된 세포를 1.0% 파라포름알데히드에 고정시켰다. FAC-스캔 유동세포계측기 및 콘소트(Consort) 32 소프트웨어 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 형광 프로파일을 발생시켰다. 전체 혈액으로부터 피콜 하이파크(Ficoll Hypaque) 밀도 구배 원심분리에 의하여 생쥐 PMNs를 정제하고, 혼합된 집단내의 한정된 PMNs에 대한 표준으로서 사용하였다. 특이적으로 표지된 세포를 측정하기 위하여, 각각의 항체 마커에 대한 평균 형광을 결정하고, 강하게 표지화된 세포를 반사시키기 위하여 게이트를 고정시켰다. 대조군은 비염색된 세포 및 단지 스트렙타비딘 FITC에 노출된 세포를 포함하였다.
2개의 실험을 수행하였다. 먼저, scpA49 삽입 변이주 M16을 그의 SCP+친주 배양액 균주 CS101에 비교하였다. 두번째로, scpA49 결실 변이주 MJ3-15를 그의 친주 균주 CS101Sm에 비교하였다 (표 2). 양쪽 실험에서, SCP-연쇄상구균으로 접종된 생쥐로부터의 균질화된 기낭은 야생형 연쇄상구균으로 접종된 기낭에 비해 4 시간후에 적은 수의 연쇄상구균을 함유하였다. 처음의 실험은 2배의 감소를 나타내었으며 두번째 실험은 4-배 감소를 나타내었다. 이러한 차이들은 쌍을 이루지않은 t-시험을 사용할때 각각 P<0.05 및 P<0.001에서 통계적으로 중요하였다. 또한, 야생형 SCP+연쇄상구균이 8마리 생쥐중 7 마리 및 8 마리 생쥐중 6 마리로 부터의 비장 균질물에서 발견되는 것으로 관찰되었으며; 반면 SCP-변이주는 비장에서 거의 발견되지 않았다. 림프 절 균질물에 대해서는 그 반대였다. SCP-연쇄상구균으로 감염된 16 마리 생쥐중 10마리로부터의 림프절은 생존가능한 연쇄상구균을 포함하였다; 반면, 야생형 연쇄상구균으로 감염된 생쥐로부터의 16개 림프절중 단지4개만이 생존가능한 세균을 함유하였다. 이러한 차이는 피셔(Fisher)의 실제 시험을 사용할 때 P<0.05로 통계적으로 중요한 것으로 결정되었다.
| 기낭 감염후 4시간에 SCP+및 SCP-연쇄상구균의 분포 | ||||
| 균주 | 생쥐의 수a | 양성 배양의 수 | 균질화된 기낭c | |
| 비장b | 림프절 | |||
| CS101pG (SCP+) | 8 | 7 | 2 | 1.3×108±2.2×107 |
| M16 (SCP-) | 8 | 0 | 5 | 6.0×107±1.3×107 |
| CS101Sm (SCP+) | 8 | 6 | 2 | 1.6×108±2.6×107 |
| MJ3-15(SCP-) | 8 | 1 | 5 | 3.7×107±1.5×107 |
| a 각각의 생쥐를 3 ×108CFU의 정지상 연쇄상구균으로 접종하였다.b SCP-연쇄상구균에 비하여 비장으로부터의 SCP+연쇄상구균의 단리 빈도에서의 차이는, 피셔의 실제 시험에 의한 각각의 실험에서 통계적으로 의미있다 (P<0.05).c 쌍을 이루지 않은 t 시험에 의한 각각의 실험에서, 균주 CS101pG (SCP+) 및 M16 (SCP-) 및 MJ3-15 (SCP-) (P<0.001)에서 균질화된 기낭으로부터 단리된 CFU에서의 차이(평균 ±SEM)는 중요하였다. |
기낭으로부터 연쇄상구균이 더욱 빠르게 제거되는 것은 PMNs의 더욱 강력한 점증으로부터 기인하였다. 전체 세포 집단, Mac-1 포지티브 과립구의 퍼센트 (스프링거(Springer), G. 등, "Mac-1:모노클론 항체에 의해 동정된 마크로파지 분화 항원 (macropharge differentiation antigen identified by monoclonal antibody),"Eur.J.Immunol.9:301-306 (1979)), 및 기낭 내의 Gr-1 포지티브 PMN의 퍼센트 (브루머(Brummer),E. 등, "진균 사멸을 위한 다형핵 호중구의 면역학적 활성화: 시험관내에서 쥐 세포 및 블라스토마이세스 더마티티디스를 사용한 연구 (Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for fungal killing: studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in vitro),"J.Leuko.Bio.36:505-520 (1984))를 단색 FACS 분석에 의해 비교하였다. 문헌 [클락(Clark), J.M., "생쥐에서 세포-조정 면역성의 신규 정량화 방법 (A new method for quantitation of cell-mediated immunity in the mouse),"J.Reticuloendothel.Soc.25:255-267 (1979)]. 간단하게, FACS 분석에서, 현탁액내의 각각의 세포들을 특정한 형광 단일항체로 표지화한다. 표지화된 세포의 분할량을 FAC-스캔 유동세포계측기 또는 형광 세포 분별기내에 주입하여, 그들의 독특한 형광을 기초로 하여 세포를 계수하였다.
SCP-결실 변이주로 감염된 기낭은 SCP+연쇄상구균으로 접종된 것보다 2배 많은 염증 세포를 함유하였다 (도 4). 접종물 크기에서의 수백배 증가는 이러한 차이를 변경시키지 않았다. 1 ×106SCP-세포, 균주 MJ3-15로 감염된 기낭은, SCP+배양물로 접종된 것에 비해 3배 더욱 많은 Gr-1 포지티브 세포를 함유하였다. SCP+연쇄상구균으로 접종된 기낭에서 약 6 %의 세포가 PMNs이었으며 21 %는 PMN을 포함하여 다른 종류의 Mac-1+과립구이었다. 반대로, SCP-연쇄상구균으로 접종된 공기낭은 대부분 PMNs를 함유하였다. Gr-1 포지티브 세포는 Mac-1 포지티브 세포의 수와 동일하거나 그보다 많았다. 단지 고 염색 과립구를 측정하기 위하여 유동세포계측기 게이트를 설정하였다. 유사하게, 어떠한 항체로도 염색되지 않은 세포의 남은 70-80%는 저 염색 과립구, 적혈구 또는 림프구이었다. 다수의 림프구는 라이트 염색된 기낭 제제에서 현미경에 의해 관찰되었다.
비장 균질물로부터 출현된 연쇄상구균의 SCP+콜로니는 매우 캡슐화되었으며, 물 방울과 유사하였다. 림프절로부터 기인된 수 개의 SCP-콜로니와는 반대로, 이들은 접종물에 더욱 유사하였다. 이들은 비-점성 또는 중간 점성 콜로니의 혼합물이었다. 이러한 데이타는 M+SCP+캡슐화된 연쇄상구균이 감염 후 4 시간이내에 적응되고, 증대되고, 혈류를 공격감염할 수 있음을 시사하는 것이다. 변이주 및 야생형 연쇄상구균의 차별적인 교환의 근거는, SCP_세균에 대한 반응에서 식세포의 더욱 격렬한 유입에 기인할 수도 있다. 마크로파아지 및/또는 피부 수지상 세포는 더욱 빠르게 SCP 연쇄상구균을 빨아들이고, 이들을 림프절로 전달할 수 있다. 야생형에 비하여 변이주 연쇄상구균의 감소는 뜻밖의 발견이며, 이는 SCP-연쇄상구균이 M+이고 시험관내에서 인간 호중구에 의한 식작용에 대해 내성을 갖기 때문이다.
실시예 3
생쥐 비인강의 전이증식을 위해 SCP가 요구된다
야생형 (SCP+) 및 SCP-연쇄상구균이 비인강에 전이증식하는 상대적 능력을 평가하기 위하여, 생쥐를 비내 접종하였다. 스트렙토마이신 내성 M49 균주 CS101 및 결실 변이주 MJ3-15를 이 실험에서 사용하였다. 특유하게 생쥐 병원성일 수도 있는 변형체의 선별을 피하기 위하여, 배양물을 생쥐 계대접종하지 않았으며, 더이상 동물내에서의 지속을 위해서 M 단백질 및/또는 SCP에 의존하지 않는다.
20 % 정상적인 토끼 혈청을 함유하는 토드-헤위트 브로쓰중에서 생육되고 10 ㎕의 PBS에 재현탁된 공격감염 연쇄상구균 균주 (1 ×108- 9 ×108CFU)의 16 시간 배양물을 25 g 암컷 CD1 (미국 메사츄세츠 윌밍톤의 챨스 리버 브리딩 래브러토리즈, 인코포레이티드) 또는 BALB/c 생쥐 (미국 네브라스카 오마하의 사스코(Sasco))에 비내 투여하였다. 혈액 한천 플레이트상에 배양물의 희석액을 평판배양함으로써 생존가능한 계수를 결정하였다. 접종 후 6 내지 10일동안 마취된 생쥐로부터 인두 스와브를 매일 채취하고, 200 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 혈액 한천 플레이트상에 도말하였다. 37 ℃에서 밤새 배양한 후에, 플레이트상의 β-용혈성 콜로니의 수를 계수하였다. 모든 공격감염 균주들을, 정상 세균총에서 지속될 수 있는 β-용혈성 세균과 구별하기 위하여, 스트렙토마이신 내성으로 표지화하였다. 인두 스와브를 스트렙토마이신 함유 혈액 한천상에서 배양하였다. 하나의 β-용혈성 콜로니의 존재를 포지티브 배양액으로서 간주하였다.
CD1 이계교배된 생쥐를 2 ×108정상기 CFU로 비내 접종하였다. 마취된 생쥐의 비인강을 8 내지 10일 동안 매일 면봉채취하였으며, 스트렙토마이신을 함유하는 혈액 한천상에 도말하였다. SCP+와 SCP_간의 차이는 1일째에 명백하였으나, 통계적으로 중요한 차이는 3 일 및 4일 까지 관찰되지 않았다 (도 5). 4일 째에, M+SCP+연쇄상구균으로 감염된 18 마리 생쥐중 9마리가 포지티브 인두염 배양물을생성한 반면, M+SCP-균주로 감염된 18 마리 생쥐중 2 마리 만이 그들의 인두에서 연쇄상구균을 보유하였다. SCP+연쇄상구균으로 감염후에 18 마리 생쥐중 4 마리가 사멸하였다. SCP-세균으로 감염후에는 생쥐의 어느 것도 감염때문에 죽지 않았다. 혈액 한천 플레이트상의 콜로니의 수는 SCP-연쇄상구균의 더욱 빠른 제거와 일치하였다. 예를들면, 3일 째에, 7마리 생쥐로부터의 배양물은 >100의 SCP+CFU를 함유한 반면, SCP-연쇄상구균으로 접종된 단지 1마리의 생쥐만이 >100의 CFU를 함유하였다.
M49 연쇄상구균이 더욱 종종 피부 감염과 연관되기 때문에, 상기 실험들을 인두 감염와 관련된 항원형인 M6 균주를 사용하여 반복하였다. M6 균주 UAB200을 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 방식에 따라 삽입 변이주 균주 AK1.4를 구축하였다. 균주 AK1.4는 야생형 M6 배양액에 비하여 비인강으로부터 더욱 빠르게 제거되었다 (도 6). 상기 실험들은, 군 A 연쇄상구균이 생쥐 비인강에서의 지속을 위해 SCP에 의존함을 증명하고 있다. 상기 실험에서 사용된 모든 SCP-변형체들은 M+이고, 다시말해서 새로운 인간 혈액에 의한 식작용에 내성을 갖고 있다. 그러나,이들은 비인강 점막으로부터 제거되었다.
실시예 4
정제된 재조합 SCPA49에 의한 생쥐의 비내 면역화는 비내 공격감염후의 전이증식을차단한다.
a) Thr 63 내지 His 1031 을 암호화하는 재조합 백신ΔSCPA49의 구축 (도 2 및 7).
scpA49 유전자의 끝을 절취한 형태에 상응하는 PCR 단편을 CS101 M49 군A 연쇄상구균 (ΔSCPA49)으로부터 클로닝하였다. 이 단편을 뉴클레오티드 1033에서 출발하는 순방향 프라이머 및 뉴클레오티드 3941에서 출발하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (번호매김은 문헌 [첸,씨. 및 클레어리,피. "스트렙토코커스 피오게네스의 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열 (Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes),"J.Biol.Chem., 265:3161-3167 (1990)]에서의 번호매김에 상응한다). 단편을 파르마시아 인코포레이티드 (Pharmacia Inc.)로부터의 pGex-4T-1 고 발현 벡터상의 글루타티온 트랜스퍼라제 유전자의 트롬빈 결합 부위에 결찰시켰다. pJC6으로 명명된, 재조합 scpA 단편을 함유하는 플라스미드는 부다페스트 조약 규정하에서 미국 매릴랜드 록빌의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 ATCC 수탁 번호 98225로 기탁되었다.
scpA49의 2908 bp 단편인 ΔSCPA49을, BamHI 인식 서열 (5'-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3') (서열 8) 을 함유하는 scpA49 순방향 프라이머 및 scpA 역방향 프라이머 (5'-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3') (서열 9)를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 시그날 펩티드 및 SCPA 단백질의 막 고정 영역을 암호화하는서열을 PCR 생성물로부터 결실시켰다. PCR 생성물을 BamHI으로 소화시키고, 파르마시아 인코포레이티드 (미국 뉴저지 피스카타웨이)로부터의 pGEX-4T-1 고 발현 벡터상에서 글루타티온 S-트랜스퍼라제 유전자의 트롬빈 인식 부위에 있는 BamHI 및 SmaI 제한효소 부위에 결찰시켰다. 재조합 플라스미드를 이.콜리 DH5α내에 형질전환시켰다. 하나의 형질전환체 이.콜리(pJC6)으로부터의 ΔSCPA49 융합 단백질을 글루타티온 세파로스 4B 컬럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이.콜리 클론으로부터 트랜스퍼라제-SCP 융합 단백질을 발현시키고, 글루타티온 세파로스 4b 컬럼상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 모든 방법들은 제조업자 (파르마시아)에 의해 설명된다. 트롬빈 소화에 의해 하이브리드 단백질로부터 ΔSCPA49를 절단하였다. 벤즈아미딘 세파로스 6B 컬럼 (파르마시아)상에서의 크로마토그래피에 의해 용출된 SCP로부터 트롬빈을 제거하였다. 트롬빈으로 소화후에, 벤즈아미딘-세파로스 6B 컬럼상에서의 크로마토그래피에 의해 트롬빈을 제거하였다. 발현 및 정제 방법은 제조업자에 의해 설명된다. 친화성 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 및 웨스턴 블롯에 의해 순수한 ΔSCPA49인 것으로 확인되었다. 이러한 친화성 정제되고 끝이 절단된 ΔSCPA49 단백질은, PMN 부착성 분석 (상기 실시예 1에 기재됨)에 의해 시험될 때, 펩티다제 활성을 소실하였다. 정제된 ΔSCPA49에 대해 지정된 고도면역 항혈청이 토끼에서 제조되었다.
b) 면역화 및 공격감염 프로토콜
10 ㎕ PBS중의 친화성 정제된 ΔSCPA49 20㎍을 각각의 비공내에 투여함으로써, 생후 4주일된 이계교배 CD1 암컷 생쥐를 면역화하였다. 생쥐를 격일로 3회 면역화하고, 세번째 번역 후에 3 주일동안 다시 추가면역시켰다. 2주일 휴지후에, 생쥐를 다시 추가면역시켰다. 문헌[D.벤슨(Bessen) 등, "M 단백질의 보존 에피토프에 상응하는 합성 펩티드로의 비내 면역화가 군 A 연쇄상구균에 의한 점막 전이증식에 미치는 영향 (Influence of Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci),",Infect.Immun., 56, pp.2666-2672 (1988)]. 대조군 생쥐는 단지 PBS만을 수용하였다. 감염 전에, ΔSCPA49 단백질로 면역화시킨 모든 생쥐들을, 그들의 혈청 및 타액중에 ΔSCPA49 항원에 대한 높은 역가의 항체를 갖고 있는지에 대하여, ELISA에 의해 결정하였다. 군A 연쇄상구균 균주 CS101 (2.0 ×108CFU), CS210 (3.6 ×108CFU), CS463 (7.8 ×108CFU), 90-131 (3.4 ×108CFU) 및 UAB200 (9.6 ×108CFU)을 사용하여, 마지막 백신 추가접종후 7일 째에 생쥐를 비내 공격감염하였다. 내셔날 인스티튜트 오브 헬스 가이드라인(National Institutes of Health guidelines)에 따라서, 동물 연구를 수행하였다.
c) 샘플 수집 및 ELISA
면역후에 마취된 생쥐로부터 혈액 및 타액 샘플을 수집하였다. 상기 기재된 바와 같이, ELISA에 의하여 모든 혈청을 SCPA49의 존재에 대해 시험하였다. 문헌 [S.P.오코너(O'Connor) 등, "연쇄상구균 C5a 펩티다제에 대한 인간 항체 반응 (The Human Antibody Response to Strpetococcal C5a Peptidase),"J.Infect.Dis., 163,pp.109-116 (1990)]. 정제된 SCPA49 단백질을 0.05 M 중탄산염 완충액 (pH 9.6)중에 500 ng의 정제된 단백질을 첨가함으로써 마이크로티터 웰에 결합시켰다. 4 ℃에서 밤새 배양한 후에, 웰을 세척한 다음, PBS중의 0.5 % BSA로 1 시간동안 봉쇄시켰다. 100 ㎕의 0.1% 피코카르핀 (시그마) 용액을 피하 주사함으로써 생쥐에서 타액분비를 자극하였다. 타액 샘플을 수집하고, 에펜도르프 마이크로원심분리에서 5 분동안 14,000 rpm으로 회전시켰다. ELISA에 의해, ΔSCPA49 단백질에 대한 분비 IgA의 존재에 대하여 상층액을 시험하였다. ELISA 역가는, 각각의 혈청 및 타액의 매우 높은 희석액이 OD405≥ 0.1을 갖고 있음을 나타낸다.
d) ΔSCPA49에 대한 항체 반응의 평가
소단위 ΔSCPA49 백신의 면역원성을 평가하였다. 토끼를 정제된 ΔSCPA49로 면역화하였다. 토끼는 ELISA에 의해 측정시에 ΔSCPA49 단백질에 대해 고도의 항체를 발현하였다. 정제된 ΔSCPA49 면역원은 기능 활성을 소실하였지만, 고도면역 토끼 항혈청이 시험관내에서 정제된 야생형 SCPA49 효소의 펩티다제 활성을 중화시킬 수 있었다. 또한, ΔSCPA49단백질에 대해 희석되지 않은 토끼 항혈청은 상이한 항원형과 연관된 C5a 펩티다제 활성을 중화시킬 수 있었다 (도 8). 자연그대로의 M1, M6 및 M12 연쇄상구균과 관련된 C5a 펩티다제 활성은 이러한 항혈청에 의해 억제되었으며, 이는 ΔSCPA49 단백질에 대한 항체가 항원형 특이성을 소실함을 증명하는 것이다.
또한, 보조제 없이 비내 경로를 통해 투여시에 ΔSCPA49 단백질의 면역원성을 평가하기 위하여, 10마리의 면역화된 생쥐와 10 마리의 대조 생쥐로부터 혈청 및 타액 샘플을 수득하였다. 정제된 ΔSCPA49단백질로 면역화된 생쥐는, PBS로 면역화된 대조 생쥐에 비하여, 그들의 혈청에서 고 역가의 ΔSCPA49-특이적 IgG를 발현하였다 (도 9a 및 9b). ΔSCPA49에 대해 지정된 혈청 IgG의 역가는 1:10,240 내지 1:20,480의 범위이었다. 반대로, 대조 생쥐의 ΔSCPA49-특이적 IgG 역가는 혈청에서 검출될 수 없었다. 정제된 ΔSCPA49 단백질로 면역화된 생쥐는 또한 대조 생쥐에 비하여 ΔSCPA49-특이적 타액 sIgA에서 상당한 증가를 나타내었다. 면역화된 생쥐의 타액에서 특이적 sIgA 역가는 1:16보다 컸다. 반대로, 대조 생쥐의 타액에서 ΔSCPA49에 대해 지정된 sIgA는 검출될 수 없었다. 1/2560으로 희석된 혈청 및 1/2로 희석된 타액에서 각각 IgG 및 sIgA의 상대 농도를 도 9a 및 9b에 나타낸다. 이러한 결과들은, 정제된 ΔSCPA49 단백질이 비내 투여시에 생쥐에서의 특이적인 전신 및 분비 항체 반응을 유도하기 위한 효과적인 면역원임을 증명하는 것이다.
e) 감염된 생쥐로부터 연쇄상구균의 제거에 대한 백신 ΔSCPA49의 영향
C5a 펩티다제로의 면역이 비인강으로부터 연쇄상구균의 제거를 촉진시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 높은 수준의 항-SCPA 항체를 함유하는 고도면역 토끼 및 인간 혈청은 모두 시험관내에서 SCPA 활성을 중화시킬 수 있다. 문헌 [S.P.오코너(O'Connor) 등, "연쇄상구균 C5a 펩티다제에 대한 인간 항체 반응 (The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase),"J.Infect.Dis., 163, pp.109-116 (1990)]. SCPA가 경구 점막의 전이증식을 상당히촉진시킨다는 사실은, 생쥐를 정제된 ΔSCPA49로 면역화하면 연쇄상구균이 비인강에 전이증식하는 능력을 상당히 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, 생쥐를 친화성 정제되고 유전적으로 불활성화된 SCPA로 비내 면역화하였다. 끝을 절취한 단백질 ΔSCPA49을 보조제 또는 담체 없이 비내 투여하였다. 백신접종된 생쥐의 인두에서 야생형 M+SCPA+연쇄상구균에 의한 전이증식은, 정제된 ΔSCPA49 단백질의 2개의 상이한 제제로 백신접종된 생쥐를 사용하는 3개의 독립적인 실험에서, PBS로 면역화된 것과는 상당히 상이하였다 (표 3 및 4; 도 10a 및 10b). ΔSCPA49 단백질로 면역화된 13 마리의 생쥐중 단지 1 마리만이 접종후 10일에 연쇄상구균에 대해 배양 양성이었다 (표 4; 도 10a 및 10b). 반대로, 비-백신접종된 대조군의 30 내지 58 %가 6 일동안 배양 양성으로 유지되었으며, 일부는 감염후 10일동안 여전히 양성이었다. 혈액 한천 플레이트상에서 β-용혈성, 스트렙토마이신 내성 콜로니의 수는, ΔSCPA49 백신접종된 생쥐와 대조군 생쥐 사이에서 상당히 차이를 나타내었다. 상이한 집단의 면역화된 생쥐는, 비-면역화된 대조군에 비해, 그들의 비인강으로부터 더욱 빠르게 항원형 M49 연쇄상구균을 제거하였다.
마지막으로, 하나의 항원형의 SCP가 다른 항원형으로부터의 감염에 대해 동물을 예방접종할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 80 종 이상의 상이한 항원형의 군 A 연쇄상구균이 존재한다. 효과적인 백신은 하나 이상의 연쇄상구균 항원형에대한 감염을 방지해야 한다. 연쇄상구균 OF+항원형 M2 및 M11과 OF-항원형 M1 및 M6에 의한 전이증식에 대하여 교차-보호가 생성되었다. 항원형 M49 연쇄상구균으로부터의 ΔSCPA49 단백질에 대해 지정된 토끼 혈청이 여러 개의 항원형과 연관된 펩티다제 활성을 중화시킨다는 사실은, 하나의 소단위 백신으로의 비내 면역화가 이러한 항원형에 의한 인두 전이증식을 감소 또는 제거시킬 수도 있음을 시사하였다. 이러한 가능성을 설명하기 위하여, 20마리의 생쥐의 4개 군을, 상기 기재된 바와 같이 친화성 정제된 ΔSCPA49 단백질로 비내 접종에 의해 면역화하였다. 대조군 생쥐는 PBS를 수용하였다. 연쇄상구균으로 공격감염하기에 앞서, 무작위로 선택된 면역화된 생쥐와 대조군 생쥐로부터의 혈청 및 타액 샘플을 항- SCPA 항체에 대해 분석하였다. 시험되는 모든 면역화된 생쥐는 강력한 혈청 및 측정가능한 타액 항체 반응을 발현하였다. ΔSCPA49 단백질로 면역화된 생쥐의 인두에서 모든 4개의 항원형의 균주에 의한 전이증식은, 비-면역화된 대조군에 비해 감소되었다. 접종후 3 일 및 5일에서 차이가 가장 뚜렷하였다 (표 5).
| 면역 보호성은 항원형에 의존되지 않는다 | ||||
| 접종후 3일 | 접종후 5일 | |||
| 비면역(+/전체) % | 면역(+/전체) % | 비면역(+/전체) % | 면역(+/전체) % | |
| M2 | 10/19 52.6 | 2/19*10.5 | 3/19 15.8 | 1/19 5.2 |
| M11 | 17/20 85 | 11/20*55 | 8/20 40 | 2/20*10 |
| M1 | 16/19 84.2 | 11/19 57.9 | 7/19 37 | 2/19*10.5 |
| M6 | 14/20 70 | 12/19 63.2 | 8/20 40 | 4/19 21.1 |
| +는 배양 양성 생쥐를 의미한다.* 면역화된 생쥐 및 비-면역화된 생쥐에서의 차이는 통계적으로 중요하다 (P<0.05). P값은 x2분석에 의해 계산되었다. |
항원형 M2, M11 및 M1 균주로 접종된 면역화된 생쥐와 대조군 생쥐 사이에서 통계적으로 중요한 차이가 관찰되었다. 그러나, OF+항원형 M2 및 M11은 OF-균주, M1 및 M6에 비하여, 면역화된 생쥐에 의해 더욱 효율적으로 제거되었다. 면역화된 생쥐의 M1 연쇄상구균 전이증식은 대조군 생쥐에 비해 현저히 감소되었다. 면역화된 생쥐의 단지 10.5% 만이 감염후 5일에 배양 양성이었다. 반대로, 대조군 생쥐의 37 %가 이러한 균주에 의해 배양 양성이었다. 면역화된 생쥐는 M6 연쇄상구균을 더욱 빠르게 제거하는 것으로 보이지만, 차이는 통계적으로 중요하지 않았다. 상기 실험에서와 같이, 혈액 한천 플레이트상에서 β-용혈성 연쇄상구균 콜로니의 수는, 대조군 동물로부터 채취된 것에 비하여, 백신접종된 생쥐로 부터 채취된 샘플에서 훨씬 적었다. 따라서, ΔSCPA49 단백질은 다른 연쇄상구균 항원형에 대해 교차-보호를 제공하는 효과적인 백신이었다.
실시예 5
SCPA49의 부위 특이적 돌연변이유발
군 A 연쇄상구균 항원형을 2개의 주요 군 OF+및 OF 균주로 나눌 수 있다. 후자는 류머티스 열 및 독소 쇼크와 더욱 종종 연관되는 반면, OF+균주는 농가진 및 급성 사구체신증의 공통적인 원인이 된다. 이러한 군의 SCPA 단백질은 95 - 98 % 동일하긴 하지만, 이들에 대한 면역 반응은 다소 상이할 수도 있다. 이와 관련하여, M1 OF-균주로부터의 한정된 변형체 SCPA와 M49 OF+균주로부터의 한정된 변형체 SCPA를 병렬로 발현시키기 위해 노력하였다. 촉매적 활성을 위해 요구되는 아미노산을 효소를 불활성화하는 것으로 기대되는 아미노산으로 대체하였다 (도 1). pGEX-4T-1 서브클론을 발현하는 SCPA49의 N 및 C-말단 아미노산 경계는 각각 Asn32및 His1139이었다 (도 1 및 8). SCPA49 단백질에서의 Ser512(SCPA49S512A), Asn295(SCPA49N295A) 및 Asp130(SCPA49D130A)를 Ala로 대체하고, Asn295(SCPA49N295R)을 Arg으로 대체하였다 (유니버서티 오브 미네소타, 데보라 스타프슬렌(Deborah Stafslien), 석사논문).
연쇄상구균 균주 CS101로부터 scpA49 유전자내에 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 방법은 부위 특이적 돌연변이유발의 "메가프라이머(megaprimer)" 방법이었다. 문헌 [베이직 에스.(Basik, S.), "부위 특이적 돌연변이 유발 시험관내 메가프라이머 PCR (Site directed mutagenesis in vitro megaprimer PCR)",Methods in Molecular Biology, Vol.57: In Vitro Mutagenesis Protocols, Humana Press, Inc. Totowa, NJ (1996)]. 1450 bp 이중 가닥 PCR 생성물을 증폭시키기 위하여, 프라이머 scpFor940 (5'-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC-3'), 서열 10, 및 scpmutrev1883 (5'-TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3'), 서열 11을 사용하여 세린 돌연변이를 도입하였다. 이러한 처음의 PCR 생성물 "메가프라이머"를 키아겐 키아퀵 겔 추출 키트 (Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit)를 사용하여 정제한 다음, 목적하는 돌연변이를 함유한 3.3 kb scpA49 유전자를 증폭시키기 위하여 두번째 비대칭 PCR 반응에서 사용하였다. 역방향 프라이머 scpRev4263, (3'-CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG-3') 서열 12의 첨가 전에, 변성 (93 ℃, 1 분) 및 연장 (72 ℃, 5 분)의 5회 순환을 수행하였다. 72 ℃에서 다섯번째 순환 동안에, 역방향 프라이머를 1 mM의 농도로 첨가하였다. 94 ℃에서 1 분, 58 ℃에서 2 분 및 72 ℃에서 2-3.5 분의 25 회 순환을 사용하여 증폭을 완결하였다. 순방향 프라이머를 첨가하지 않고 메가프라이머를 100 ㎕ 반응 당 4-6 ㎍의 농도로 첨가하는 것 이외에는, 반응물 농도는 상기에 기재된 것과 동일하였다. 이 방법에 의해 변형체 단백질 SCPA49S512A (하기 표 6 참조)이 얻어졌다.
각각 311 bp 및 805 bp 메가프라이머를 구축하기 위해, 역방향 프라이머 scpmutrev 717 (5'-CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA-3') 서열 13 및 scpmutrev1214 (5'-AGCTACTATCAGCACCAG-3') 서열 14를 사용하여 동일한 방식으로 아스파테이트 및 아스파라긴 변형체을 구축하였다. 변형 단백질 SCPA49D130A을 발생시키기 위해 프라이머 scpmutrev717을 사용하고, 변형 단백질 SCPA49N295A을 발생시키기 위하여 프라이머 scpmutrev 1214를 사용하였다 (하기 표 6 참조). 그러나, 키아퀵 정제후에, 메가프라이머를 0.1U 녹두(mung bean) 뉴클레아제 (4 ㎍DNA 당)로 처리하고, 30 ℃에서 10분동안 배양하였다. 뉴클레아제를 페놀/클로로포름 추출에 의해 제거하고, 메가프라이머를 에탄올 침전에 의해 수성상에 회수하였다. 펠릿을 80 ㎕ 무균 이중 증류 수에 재현탁하고, 이것의 37 ㎕를 각각의 100 ㎕ 비대칭 PCR 반응에서 사용하였다. 돌연변이된 유전자를 상기 기재된 바와 같이 pGEX 4T-1내로 클로닝하였다.35S-표지화된 dATP 및 시퀘나제 키트(Sequenase Kit) (스트라타겐(Stratagene))을 사용하거나 유니버서티 오브 미네소타의 마이크로케미칼 시설에 있는 자동화 형광 서열결정을 사용하여, 변형체의 서열결정을 수행하였다.
| 변형체 단백질의 아미노산 서열 비교 | ||||
| 야생형 SCPA49 | 127AVIDAG132 | 291TSAGNDS297 | 508LSGTSGT514 | 876STLGSRF883 |
| SCP S512A49 | AVIDAG | TSAGNDS | LSGTAGT | STLGSRF |
| SCP D130A49 | AVIAAG | TSAGNDS | LSGTSGT | STLGSRF |
| SCP N295A49 | AVIDAG | TSAGADS | LSGTSGT | STLGSRF |
이. 콜리 발현 벡터 pGEX 4T-1을 사용하여 GST 융합 단백질로서의 변형체 SCPA를 과다발현하였다. 이 작업 이전에 GST 유전자 융합 시스템 편람 (파르마시아 (Pharmacia))에 제시된 프로토콜에 따라서 재조합 SCPA를 정제하였다. 상기 기재된 친화성 크로마토그래피에 의해 SCPA 단백질 항원을 정제하였다.
실시예 6
SCPA1 및 SCPB 변형체의 구축
하기 방식으로 에스.피오게네스 (균주 90-226)의 M1 항원형으로부터 PCR에 의해 야생형 scpA1 유전자를 증폭시켰다. 전체 유전자의 단지 단편만이 발현되도록 프라이머를 설계하였다. 이러한 단편은 성숙한 단백질의 출발에 상응하고, 세포벽에 관련된 도메인 잔기 Asn32내지 Asp1038직전에 종결된다 (도 2). 순방향 프라이머 5'-CCCCCC GAATTC ATTACTGTGACAGAAGACACTCCTGC-3' (서열 15)는 염기 번호 940 (문헌 [첸,씨. 및 클레어리,피. "스트렙토코커스 피오게네스의 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열 (Complete nucleotide sequence of thestreptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes),"J.Biol.Chem., 265:3161-3167 (1990)]에 상응하는 번호매김)에서 출발하여 어닐링된다. 반대쪽의 역방향 PCR 프라이머 5'-CCCCCC GGATCC TTATTGTTCTGGTTTATTAGAGTGGCC-3' (서열 16)는, DNA의 영역이 반복되는 바로 상류인 염기 번호 3954에서 어닐링된다. 단백질의 이러한 반복 영역은 통과된 다음 세포벽의 펩티도글리칸에 부착되는 일부인 것으로 예측된다. 각각의 프라이머의 이탤릭체로 나타낸 영역은 클로닝 과정을 가능하게 하기 위해 에스.피오게네스 서열에 첨가되어진 추가의 서열이다. 순방향 프라이머의 밑줄친 영역은 EcoRI 제한효소 부위를 포함하며, 역방향 프라이머의 밑줄 친 부위는 BamHI 부위를 포함한다. 역방향 프라이머는 또한 유전자의 프레임에서 번역을 종료하는 정지 코돈 (TAA)을 포함한다.
염기 940-3954에 상응하는 얻어진 PCR 생성물을 중간 벡터 pCR2.1 (인비트로겐, 인코포레이티드 (Invitrogen, Inc.))내에 클로닝하고, 이.콜리 Top10F 세포 (인비트로겐 인코포레이티드)내로 형질전환시켰다. 적절한 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 EcoRI 및 BamHI으로 제한하였다. scpA1의 단편을 함유하는 3018 염기 단편을 표준 절차에 따라 겔 정제하고, 동일한 효소로 제한된 발현 벡터 pTrc99a (파르마시아)내에 결찰시켰다. 이러한 결찰을 이.콜리 DH5α 세포내에 형질전환시키고, 목적하는 플라스미드 구조를 함유하는 형질전환체를 선택하였다. 얻어진 플라스미드는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 및 ATG 출발 부위 뒤에 scpA1의 PCR 단편이 위치하고, 이는 trc 프로모터의 전사 조절하에 있으며, 이는 알로락토스 유사체 IPTG로 유도될 수 있다.
문헌 [C.L.피셔(Fisher) 및 G.K.페이(Pei), "PCR-기본 부위특이적 돌연변이유발 방법의 변형 (Modification of a PCR-based site-directed mutagenesis method),"BioTechniques, 23:570-574 (1997)]에 기재된 절차에 따라서 야생형 scpA1의 부위-특이적 유전자 변형체를 구축하였다. 프로테아제 활성을 위해 중요한 SPCA1 내의 적절한 아미노산 잔기는 섭틸리신- 유사 세린 프로테아제의 계에 대한 서열 비교에 의해 예측되었다. 문헌 [시에젠(Siezen), R.J. 등, "섭틸리신-유사 세린 프로테인아제의 계인 섭틸라제의 상동성 모델링 및 단백질 엔지니어링 방법 (Homology modeling and protein engineering strategy of subyilases, the family of subtilisin-like serine protease),"Protein Engineering, 4:719-737 (1991); 첸,씨. 및 클레어리,피., "스트렙토코커스 피오게네스의 연쇄상구균 C5a 펩티다제 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열 (Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes),"J.Biol.Chem., 265:3161-3167 (1990)]. 이러한 계 중에서 보존된 3개의 잔기가 활성 부위의 형성에 관련된다. SCPA1에서, 이들은 Asp130, His193및 Ser512에 상응한다. 이들 아미노산 잔기의 각각의 하나를 변경시키기 위하여 PCR에서 사용하기 위해, 비-중복된 올리고뉴클레오티드의 3개 집합이 설계되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 DNA의 반대쪽 가닥 위에서 상호 떨어져 증폭되도록 설계되었다. 각각의 집합에서, 프라이머의 하나의 5' 말단은 돌연변이를 위한 아미노산의 하나를 암호화하는 코돈을 함유하며, 이러한 코돈은 알라닌을 암호화하기위해 변경될 수도 있다. 이러한 3개집합의 프라이머를 이하에 기재하며; 변화된 코돈을 이탤릭체로 나타낸다.
D130A:
순방향 (서열 17)
5'-ATTGCTGCT GGT TTT GAT AAA AAT CAT GAA GCG-3'
GCT로의 GAT 코돈 변화는 아스파테이트의 알라닌으로의 아미노산 변화에 상응한다.
역방향 (서열 18)
5'-CAC TGC AAC AAC AGT CCC-3'
H193A:
순방향 (서열 19)
5'-GAGGCCGGC ACA CAC GTG-3'
GCC로의 CAC 코돈 변화는 히스티딘의 알라닌으로의 아미노산 변화에 상응한다.
역방향 (서열 20)
5'-TTG ATC GAC AGC GGT TTT ACC-3'
S512A:
순방향 (서열 21)
5'-ACTGCTATG TCT GCT CCA TTA G-3'
GCT로의 ACT 코돈 변화는 세린의 알라닌으로의 아미노산 변화에 상응한다.
역방향 (서열 22)
5'-TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C
이러한 PCR 프라이머의 집합을 3개의 별개의 반응에서 사용하였다. 주형 DNA는 pLP605이었으며, 이것은 야생형 scpA1 서열을 함유하였다. 이어서, PCR 생성물을 자기-결찰시키고, 이.콜리 균주 Top10F'(인비트로겐, 인코포레이티드)내에 형질전환시켰다. 형질전환체를 적절한 크기 및 제한 패턴에 대해 선별하였다. S512A 변형체내의 서열 변화는 유일한 SpeI 제한효소 부위를 파괴하며, 그 결과 이러한 돌연변이는 제한효소 분석에 의해 직접적으로 동정될 수 있다. 모든 가능한 변형체들을 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 이어서, D130A 돌연변이를 S512A 돌연변이와 조합하여, 2개의 단백질 영역 사이에 유일한 PstI 부위를 이용하는 이중 변형체를 형성하였다. 마지막 변경은, 변형체 scpA1 유전자를 카나마이신 유전자를 함유하는 미리 변경된 pTRC99a 벡터 (파르마시아, 인코포레이티드)로 이동시킴으로써, 항생물질 선별을 암피실린으로부터 카나마이신으로 변화시키는 것이다.
상기 SCPA1 변이주에 대해 기재된 방법을 사용하여 SCPB 단백질의 변형체를 구축하였다. 야생형 SCPB 유전자를 군 B 연쇄상구균 78-471 (유형 IIa+)으로부터 클로닝하였다.
실시예 7
변형체 단백질의 분석
각각의 변형체 구축물로부터 발현된 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 단백질의 예측된 크기는 121 kD이지만, 효소의 카르복시말단에서 프롤린-풍부한 세포벽에 있는 도메인은 SDS-PAGE 동안에 단백질이 다소 느리게 진행되도록 한다. 따라서, 겉보기 분자량은 SDS-PAGE에 의해 결정시에 130kD이다. 활성 SCP가 호스트에 해로울 수 있기 때문에, 변형체 단백질은 효소 활성을 소실하는 것이 중요하다. 변형체 단백질의 2개의 특성을 평가하였다. PMN 부착성 분석에 의해 결정된 야생형 및 변형체 단백질의 특이한 활성을 표 7에서 비교한다. 이러한 실험들은, 치환된 아미노산이 효소 활성을 90 % 이상으로 감소시켰음을 나타내었다.
| 변형체 프로테아제 활성의 PMN 부착성 분석 결정 | |
| 단백질 | 활성 (U/mg*10-3) |
| 야생형 | 170 |
| SCPA49D130A | <20 |
| SCPA49N295A | <20 |
| SCPA49S512A | <20 |
야생형 효소에 대해 지정된 항체를 결합하는 능력에 대하여, 변형체 단백질들을 야생형 단백질과 비교하였다. 경쟁 ELISA 분석을 이 목적을 위해 사용하였다. 경쟁적 ELISA는, 가용성 항원에 의하여 고정화된 항원에 결합하는 항체의 억제율을 측정하였다. 일정량의 야생형 항원을 마이크로티터 플레이트의 웰에 결합시켰다. 다양한 양의 가용성 경쟁 항원과 함께 일정량의 항체를 동시에 첨가하였다. % 억제율 대 항원 농도 곡선의 기울기는, 항체에 대한 가용성 항원의 상대적인 결합 친화성을 평가한다. 항혈청내의 항-SCPA의 실제 농도를 알지 못한채로 결합 상수를 계산할 수는 없지만, 다수의 단백질의 상대적인 결합 친화력을 비교하였다 (도 11). % 억제율 대 농도 곡선의 기울기가 야생형 및 변형체 단백질에 대해 동일하기 때문에, 아미노산 치환이 변형체 단백질에 결합하는 항체의 능력을 변경시키지 않았다는 결론이 내려졌다.
항-SCP 항체에 대해 동일하게 잘 결합하는지에 대하여 재조합 SCPA1, SCPA49 및 SCPB 단백질을 또한 결정하였다. 이 실험에서, 플레이트 항원은 SCPA49이었고, 항체는 토끼 항-SCPA49이었다. 곡선의 기울기로 표시된, 이러한 항원에 대한 항체의 상대적 친화성은 매우 유사하였다. 이러한 결과는, M49 OF+및 M1 OF-군 A 연쇄상구균으로부터의 SCPA 단백질 및 군 B 연쇄상구균으로부터의 SCPA 단백질이 항체 인식에 있어서 동등하고, 백신 제조에서 상호교환하여 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예 8
SCPA 항원의 피하 (SQ) 투여는 생쥐에서의 보호를 유도한다
보조제 없이 친화성 정제된 SCPA49 단백질을 비내 투여함으로써, 모든 초기의 보호 연구를 수행하였다. 항원의 근육내 또는 SQ 주사가 전통적으로 바람직하고 더욱 허용되는 백신 전달 방법이다. 따라서, MPL/알룸과 함께 SCPA의 SQ 주사가 보호 면역 반응을 유도하는지의 여부와, 군 A 연쇄상구균의 공격감염 균주가 항원형에 있어서 SCPA 백신 원천과 상이한 경우 반응이 전이증식을 감소시키는지의 여부를 시험하기 위하여 실험을 수행하였다. 면역화된 생쥐가 경구-비 인강 점막으로부터 연쇄상구균을 제거하는 능력을, 인두 배양액에 의해 또는 해부된 비 조직의 샘플링에 의해 평가하였다. 대표적인 인두 배양액 데이타를 표 8에 나타낸다.
| 생쥐의 피하 백신접종 | |||
| 백신a | 공격감염 세균b | 전이증식된 %c | |
| 대조 생쥐 | SCPA-면역화된 생쥐 | ||
| SCPA49S512A | OF+M49 | 64% (3) | 36% |
| ΔSCPA49 | OF+M49 | 64% (3) | 20% |
| ΔSCPA49 | OF-M1 | 33% (5) | 8% |
| SCPA1S512A | OF-M49 | 23% (5) | 8% |
| a 백신은 보조제 MPL 및 알룸과 함께 혼합된 표시된 항원 10㎍을 함유하였다. 실험군들은 각각 13 내지 20마리 생쥐를 함유하였다. 대조 생쥐는 동일한 보조제와 혼합된 파상풍 톡소이드로 면역화하였다.b 생쥐를 비내 접종에 의해 감염시켰다.c 인두 배양액에 의해 전이증식을 평가하였다. 괄호안의 숫자는 배양액이 채취된 날짜를 나타낸다. |
3개의 상이한 형태의 SCPA 항원의 각각을 SQ 주사함으로써 면역화된 생쥐는 적당한 보호를 유도하였다. ΔSCPA49로의 면역화는 OF-M1 및 OF+M49 균주 모두에 대해 보호작용을 나타내었다. SCPA49S512A 및 SCPA1S512A를 이후의 연구를 위해 선택하였다.
비내 공격감염 이후에 연쇄상구균의 지속성을 추가의 정량 분석에 의해 평가하였다. 이 방법은 감염 후에 상이한 시간에서 생쥐의 군을 희생시키고, 비 조직 (NT)을 해부한 다음, 생존 연쇄상구균 (CFU)을 분석하는 것과 관련된다. NT의 표준 양을 완충액에 균질화하고, CFU/mg 조직의 수를 생존 총계에 의해 결정하였다.
생쥐의 3개 군을 SCPA49S512A, SCPA1S512A 또는 파상풍 톡소이드로 SQ 면역화하였다. 모든 백신들을 사용 전에 MPL/알룸 보조제와 혼합하였다. 생쥐에게 5 ㎍ 단백질 항원을 4회 주사한 다음, 마지막 주사후에 2주일 동안 공격감염하였다.OF+M49 균주 CS101로 공격감염 후에 비 조직을 16 시간동안 수집하였다. CFU/mg 조직의 기학학적 평균을 표 9에 나타낸다.
| CFU/mg 비 조직의 기하학적 평균 | |
| 백신 항원 | 16 시간a |
| 파상풍 | 5.71b |
| SCPA49S512A | 2.27 |
| SCPA1S512A | 1.60 |
| a 생쥐의 비내 감염후에 NT가 채취된 시간b 값은 로그 값이다. |
비 조직과 관련된 연쇄상구균의 수는 예상된 바와 같이 시간에 따라 감소되었으며, SCPA 항원으로 면역화된 생쥐에서 감소가 더욱 빠르고 완벽하였다. SCPA으로 면역화된 모든 생쥐 군은 대조군 생쥐에 비해 매우 적은 연쇄상구균을 보유하였다. 이 실험에서, 공격감염 균주 CS101이 OF+M49이고 백신 단백질 SCPA1S512A의 원천이 OF-M1 균주로부터 유래하기 때문에, SCPA1S512A로의 면역화가 가장 효과적이고 교차-보호 반응을 유도하였다. 이러한 결과는, 단일 SCPA 항원이 이종 항원형에 대한 보호를 유도할 수 있음을 입증하는 것이다. 세균 표면상에서 펩티다제 활성을 중화시키는 항체에 의해 보호가 부여된다. 이는 연쇄상구균이 점막 조직상에 부착되는 시간으로부터 수 시간내에 식세포의 유입을 증가시킨다. 식세포에 의한 연쇄상구균의 빠른 제거는 이후의 세균 증식 및 지속을 방지하는 것으로 추측된다. 생쥐는 ELISA에 의해 분석시에 1:32,000 또는 그 이상의 혈청 IgG 역가를 가지며, 이는 보조제와 함께 SCPA 항원의 SQ 주입이 격렬한 항체 반응을 지속적으로유도함을 나타낸다.
실시예 9
군 B 연쇄상구균으로부터의 C5a 펩티다제는 M12 및 M49 군 A 연쇄상구균으로부터의 것과 서열이 거의 동등하다
군 B 연쇄상구균 C5a 펩티다제 (SCPB) 유전자를 클로닝하고, 서열결정하고, 항원형 군A 연쇄상구균 M12 및 M49로부터의 것과 비교하였다. 상기 기재된 방법을 사용하여, scpA12 서열의 일부에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 전체 scpB 유전자를 증폭시켰다. SCPB 유전자는 3450 bp의 개방 판독 프레임 (ORF)을 암호화하며, 이는 126,237 da을 가진 1150개 아미노산의 단백질을 특정한다. SCPB의 아미노산 서열을 도 2에 나타낸다. scpB 뉴클레오티드와 M12 및 M49 군 A 연쇄상구균으로부터의 뉴클레오티드에 대해 추정된 아미노산 서열을 비교하면, 각각 98 % 및 97 %의 높은 유사성을 나타내었다. scpB은 C-말단 반복 단위의 2개를 중복하는 50bp 결실을 함유하였으며, scpA 유전자에 비해 여러 개의 다른 작은 차이점을 갖고 있다. 서열의 정렬은, scpA12가 scpA40에 대한 것보다 scpB에 실제로 계통발생학적으로 근접하다는 것을 나타내었다. 항원형 III, III/R, II, Ia/c, NT/c, NT/c/R1을 나타내는 30개의 균주는 scpB의 복제를 보유한다.
발현 벡터 플라스미드 pGEX-4T-1 (ATCC 수탁 번호 98225)을 사용하여 재조합 SCP를 이.콜리내에서 발현시켰으며, 이는 친주 군 B 연쇄상구균 균주 78-471 (유형 II a+b)으로부터 추출된 효소와 동일한 것으로 나타났다. 웨스턴 블롯 분석은, 재조합 SCP가 군 B 연쇄상구균으로부터 미리 정제된 C5아제 효소와 동일함을 시사하였다.
모든 공보, 특허 및 특허 서류들이 개별적으로 참고문헌으로 인용되었으나, 이들 모두는 본 명세서에서 참고 문헌으로 포함된 것이다. 본 발명은 여러 특정하고 바람직한 구현양태 및 기술을 참조하여 설명되었다. 그러나, 본 발명의 범위내에서 유지하면서, 여러 변형 및 수정을 가할 수 있음을 이해해야 한다.
Claims (98)
- 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP)가 야생형 SCP의 변형체이고, 생리적으로 허용가능한 비-독성 부형제와 조합하여 β-용혈성 연쇄상구균에 대해 감수성있는 포유동물을 면역화하는 데 효과적인 양인, SCP의 면역원성 양을 포함하는 백신.
- 제 1 항에 있어서, SCP가 SCP를 암호화하는 단리된 DNA 서열로부터 발현되는 백신.
- 제 2 항에 있어서, DNA가 특이성 크레비스 또는 촉매 도메인을 암호화하는 백신.
- 제 3 항에 있어서, DNA가 특이성 크레비스를 암호화하는 백신.
- 제 4 항에 있어서, DNA가 잔기 대략 260 내지 잔기 417의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 백신.
- 제 4 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417의 하나 이상을 암호화하는 백신.
- 제 1 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에 변이를 갖고 있는 백신.
- 제 7 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에 치환을 갖고 있는 백신.
- 제 8 항에 있어서, 치환이 보존적 치환인 백신.
- 제 3 항에 있어서, DNA가 촉매 도메인을 암호화하는 백신.
- 제 10 항에 있어서, DNA가 약 잔기 130 내지 잔기 512의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 백신.
- 제 10 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상을 암호화하는 백신.
- 제 2 항에 있어서, SCP가 SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A,SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A 또는 ΔSCPA49인 백신.
- 제 13 항에 있어서, SCP가 SCPA1S512A인 백신.
- 제 2 항에 있어서, DNA가 시그날 서열을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 SCP를 암호화하는 백신.
- 제 2 항에 있어서, DNA가 세포벽 삽입물을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 SCP를 암호화하는 백신.
- 제 1 항에 있어서, SCP가 효소 활성을 나타내지 않는 백신.
- 제 1 항에 있어서, 백신이 야생형 SCP에 비해 감소된 결합 활성을 가진 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 백신.
- 제 1 항에 있어서, 유효한 양의 면역학적 보조제를 더욱 포함하는 백신.
- 제 1 항에 있어서, 포유동물이 인간, 개, 소, 돼지 또는 말인 백신.
- 제 20 항에 있어서, 포유동물이 인간인 백신.
- 제 1 항에 있어서, β-용혈성 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균인 백신.
- 제 22 항에 있어서, β-용혈성 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균인 백신.
- 제 1 항에 있어서, SCP가 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균으로부터의 SCP의 변형체인 백신.
- 제 24 항에 있어서, 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균인 백신.
- 제 1 항에 있어서, 펩티드에 접합 또는 연결된 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 재조합 변형체를 포함하는 백신.
- 제 1 항에 있어서, 다당류에 접합 또는 연결된 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 백신.
- SCP가 야생형 SCP의 변형체인 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 면역원성 양을 포함하고, 그 양이 생리적으로 허용가능한 비-독성 부형제와 조합하여 연쇄상구균에 대해 감수성인 포유동물을 면역화하기에 효과적인 양인 유효 량의 백신을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, β-용혈성 연쇄상구균 전이증식 또는 감염에 대해 감수성 포유동물을 보호하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 효소 활성을 나타내지 않는 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 야생형 SCP에 비해 감소된 결합 활성을 가진 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, SCP가 SCP를 암호화하는 단리된 DNA 서열로부터 발현되는 방법.
- 제 31 항에 있어서, DNA가 특이성 크레비스 또는 촉매 도메인을 암호화하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, DNA가 특이성 크레비스를 암호화하는 방법.
- 제 33 항에 있어서, DNA가 대략 잔기 260 내지 잔기 417의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 방법.
- 제 33 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417의 하나 이상을 암호화하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, DNA가 촉매 도메인을 암호화하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, DNA가 대략 잔기 130 내지 잔기 512의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상을 암호화하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417의 하나 이상에서 변이를 갖는 방법.
- 제 39 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에서 치환을 갖는 방법.
- 제 40 항에 있어서, 치환이 보존적 치환인 방법.
- 제 31 항에 있어서, SCP가 SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A 또는 ΔSCPA49인 방법.
- 제 42 항에 있어서, SCP가 SCPA1S512A인 방법.
- 제 31 항에 있어서, DNA가 시그날 서열을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 SCP를 암호화하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, DNA가 세포벽 삽입물을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 SCP를 암호화하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 면역학적 보조제의 유효량을 더 포함하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여되는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 경구 섭취에 의해 투여되는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 비내 투여되는 방법.
- 제 28 항에 있어서, β-용혈성 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균인 방법.
- 제 28 항에 있어서, β-용혈성 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균인 방법.
- 제 28 항에 있어서, SCP가 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균으로부터의 SCP의 변형체인 방법.
- 제 52 항에 있어서, 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균인 방법.
- 제 28 항에 있어서, 포유동물이 인간, 개, 소, 돼지 또는 말인 방법.
- 제 54 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 펩티드에 접합 또는 연결된 재조합 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 백신이 다당류에 접합 또는 연결된 재조합 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 방법.
- 제 22 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에서 변이를 갖는 방법.
- 제 22 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에서 치환을 갖는 방법.
- 효소적으로 불활성인 SCP를 포함하는 단리되고 정제된 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, 백신이 야생형 SCP에 비해 감소된 결합 활성을 가진 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, SCP가 SCP를 암호화하는 단리된 DNA 서열로부터 발현되는 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, SCP가 특이성 크레비스 또는 촉매 도메인을 갖는 펩티드.
- 제 63 항에 있어서, SCP가 특이성 크레비스를 포함하는 펩티드.
- 제 64 항에 있어서, DNA가 대략 잔기 260 내지 잔기 417의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한 SCP를 암호화하는 펩티드.
- 제 64 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417의 하나 이상을 암호화하는 펩티드.
- 제 63 항에 있어서, SCP가 촉매 도메인을 갖는 펩티드.
- 제 67 항에 있어서, DNA가 대략 잔기 130 내지 잔기 512의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 펩티드.
- 제 67 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상을 암호화하는 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에서 변이를 갖는 펩티드.
- 제 70 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에서 치환을 갖는 펩티드.
- 제 71 항에 있어서, 치환이 보존적 치환인 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, SCP가 SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A 또는 ΔSCPA49인 펩티드.
- 제 73 항에 있어서, SCP가 SCPA1S512A인 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, 펩티드가 시그날 서열을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, 펩티드가 세포벽 삽입물을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 펩티드.
- 제 60 항에 있어서, SCP가 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균으로부터의 SCP의 변형체인 펩티드.
- 제 77 항에 있어서, 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균인 펩티드.
- 효소적으로 불활성인 SCP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되고 정제된 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제 79 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA인 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제 79 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 RNA인 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제 80 항에 있어서, DNA가 특이성 크레비스 또는 촉매 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제 82 항에 있어서, DNA가 특이성 크레비스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제 83 항에 있어서, DNA가 대략 잔기 260 내지 잔기 417의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 83 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416 또는 417의 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 82 항에 있어서, DNA가 촉매 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
- 제 86 항에 있어서, DNA가 대략 잔기 130 내지 잔기 512의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 SCP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 86 항에 있어서, DNA가 아미노산 잔기 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 79 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512에서 변이를 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 제 89 항에 있어서, SCP가 야생형 SCP의 변형체이고, 변형체 SCP가 아미노산 잔기 260, 261, 262, 415, 416, 417, 130, 193, 295 또는 512의 하나 이상에서 치환을 갖는 폴리뉴클레오티드.
- 제 90 항에 있어서, 치환이 보존적 치환인 폴리뉴클레오티드.
- 제 80 항에 있어서, 핵산 서열이 SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A 또는 ΔSCPA49인 폴리뉴클레오티드.
- 제 92 항에 있어서, 핵산 서열이 SCPA1S512A를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 80 항에 있어서, DNA가 시그날 서열을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 SCP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 80 항에 있어서, DNA가 세포벽 삽입물을 함유하지 않는다는 점에서 천연 SCP와는 상이한 SCP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 79 항에 있어서, SCP가 군 A 연쇄상구균, 군 B 연쇄상구균, 군 C 연쇄상구균 또는 군 G 연쇄상구균으로부터의 SCP의 변형체인 폴리뉴클레오티드.
- 제 96 항에 있어서, 연쇄상구균이 군 A 연쇄상구균인 폴리뉴클레오티드.
- 제 80 항에 있어서, 백신이 야생형 SCP에 비해 감소된 결합 활성을 가진 연쇄상구균 C5a 펩티다제의 변형체를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
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