ES2293745T3 - Vacuna de peptidasa de c5a estreptococal. - Google Patents

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Abstract

Una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de un péptido aislado y purificado que comprende una Peptidasa C5a Estreptococal (SCP) enzimáticamente inactiva, cuya cantidad es eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Estreptococos a-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, en donde la SCP es una variante de SCP natural en la que la SCP variante presenta una sustitución en los residuos de aminoácido correspondientes a los aminoácidos 130 y 512 de la SEQ ID NO: 1.

Description

Vacuna de peptidasa de C5a estreptococal.
Antecedentes de la invención
Existen varias especies estreptococales \beta-hemolíticas diferentes que han sido identificadas. El Streptococcus pyogenes, también denominado estreptococo de grupo A, es un patógeno bacteriano común en humanos. Principalmente una enfermedad de niños, provoca una variedad de infecciones que incluyen faringitis, impétigo y sepsis en humanos. Este patógeno también causa enfermedades agudas severas tales como la fiebre escarlata, la fascitis necrotizante y el choque tóxico.
El dolor de garganta provocado por estreptococos de grupo A, denominado comúnmente "amigdalitis", es el responsable de al menos el 16% de todas las llamadas oficiales en la práctica de la medicina general, dependiendo de la época del año. Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975", J. Hyg. Camb., 87: 109-129 (1981). Esta especie también es la causa del reciente resurgimiento en Norte América y otros cuatro continentes de choques tóxicos asociados a la fascitis necrotizante. Stevens, D. L., "Invasive group A streptococcus infections", Clin. Infect. Dis., 14: 2-13 (1992). Los grupos C y G de estreptococos también están implicados en la generación de dolor de garganta y, ocasionalmente, de choque tóxico. Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975", J. Hyg. Camb., 87: 109-129 (1981).
Los estreptococos de grupo B, también conocidos como Streptococcus agalactiae, son responsables de la sepsis neonatal y de la meningitis. T. R. Martin y col., "The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect. Dis., 165: 306-314 (1992). Aunque frecuentemente es un miembro de la flora de la mucosa vaginal de las hembras adultas, entre 0,1 y 0,5/1000 recién nacidos desarrollan una enfermedad grave después de una infección durante el parto. A pesar de la elevada mortalidad de las infecciones de estreptococos de grupo B, los mecanismos de patogenicidad son poco comprendidos. Martin, T. R., y col., "The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect. Dis., 165: 306-314 (1992).
Las infecciones estreptococales se tratan actualmente mediante terapia con antibióticos. Sin embargo, el 25-30% de los tratados presentan recurrencia de la enfermedad y/o se mudan del organismo en secreciones de mucosa. Actualmente no existe disponible ningún modo de prevenir las infecciones estreptococales. Históricamente, el desarrollo de una vacuna estreptococal se ha centrado en la proteína M de la superficie celular de la bacteria. Bessen, D., y col., "Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci", Infect. Immun., 56: 2666-2672 (1988); Bronze, M. S., y col., "Protective immunity evoked by locally administered group A streptococcal vaccines in mice", Journal of Immunology, 141: 2767-2770 (1988).
Dos problemas principales limitarán el uso, la comercialización y, posiblemente, la aprobación de la FDA, de una vacuna de proteína M. En primer lugar, existen más de 80 serotipos diferentes de M de S. pyogenes y continuamente aparecen nuevos serotipos. Fischetti, V. A., "Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior", Clin. Microbiol. Rev., 2: 285-314 (1989). Por tanto, la inoculación con una proteína M específica de un serotipo probablemente no será eficaz en la protección frente a otros serotipos de M. El segundo problema está relacionado con la seguridad de una vacuna de proteína M. Varias regiones de la proteína M contienen epítopos antigénicos que son inmunológicamente reactivos con tejidos humanos, particularmente con tejido cardíaco. Los extremos N de las proteínas M son altamente variables en su secuencia y en su especificidad antigénica. Se necesitaría la inclusión de más de 80 péptidos diferentes, que representan dicha secuencia variable, en una vacuna para lograr una amplia protección contra la infección por estreptococos de grupo A. Seguirían apareciendo nuevas proteínas M variantes, lo que requeriría un control continuo de la enfermedad estreptococal y cambios en la composición de la vacuna. Por el contrario, los extremos carboxilo de las proteínas M tienen una secuencia conservada. Esta región de la proteína M, sin embargo, contiene una secuencia de aminoácidos que es inmunológicamente reactiva con el tejido cardíaco humano. Se cree que esta propiedad de la proteína M es responsable del daño de válvula cardíaca asociado a la fiebre reumática. P. Fenderson y col., "Tropomyosinsharies immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins", J. Immunol. 142: 2475-2481 (1989). En un ensayo anterior, niños que habían sido vacunados con proteína M en 1979 tuvieron una incidencia diez veces mayor de fiebre reumática y del daño de válvula cardíaca asociado. Massell, B. F., y col., "Rheumatic fever following streptococcal vaccination", JAMA, 207: 1115-1119 (1969).
Otras proteínas bajo consideración para el desarrollo de una vacuna son las toxinas eritrogénicas, la exotoxina A pirogénica estreptococal y la exotoxina B pirogénica estreptococal. Lee, P. K., y col., "Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness", J. Clin. Microb., 27: 1890-1892 (1989). La inmunidad a estas proteínas podría prevenir los síntomas mortales del choque tóxico, pero puede que no prevenga la colonización mediante estreptococos.
El documento WO 97/26008 describe vacunas para su uso frente a colonización de Estreptococos \beta-hemolíticos que comprende peptidasa C5a estreptococal o fragmentos o mutantes de la misma. Stafslien y Cleary (Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology, 1998, Vol. 98, página 59) describen que se usó el método de megacebador de mutagénesis dirigida a posición para introducir una mutación en el gen scpA49 que cambió el supuesto centro activo de serina de la proteasa por una alanina. Esta mutación no afectó a la capacidad de la proteína para unirse a anticuerpo policlonal, según se observó mediante transferencia Western y ELISA competitivo. Sin embargo, la mutación eliminó la capacidad de la enzima para romper C5a in vitro, según se determinó usando un ensayo de adherencia PMN.
Por tanto, sigue existiendo una necesidad de obtener un medio eficaz de prevenir o paliar las infecciones estreptococales. Más específicamente, existe una necesidad de desarrollar composiciones útiles en vacunas para prevenir o paliar la colonización por estreptococos de tejidos hospedantes, reduciendo con ello la incidencia de la amigdalitis y del impétigo. La eliminación de secuelas tales como la fiebre reumática, la glomerulonefritis aguda, la sepsis, el choque tóxico y la fascitis necrotizante sería una consecuencia directa de la reducción de la incidencia de la infección aguda y del transporte en el organismo. También existe la necesidad de desarrollar composiciones útiles en vacunas para prevenir o paliar infecciones causadas por las especies estreptococales \beta-hemolíticas, a saber, los grupos A, B, C y G.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una vacuna, eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Streptococcus \beta-hemolíticos. El mamífero susceptible podría ser un humano o un animal doméstico tal como un perro, una vaca, un cerdo o un caballo. Dicha inmunización prevendría, paliaría o reduciría la incidencia de la colonización de Streptococcus \beta-hemolíticos en el mamífero. La vacuna comprende una cantidad inmunogénica de un péptido aislado y purificado que comprende una Peptidasa C5a Estreptococal (SCP) enzimáticamente inactiva, cuya cantidad es eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Streptococcus \beta-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, en donde la SCP es una variante de la SCP natural que presenta una sustitución en los residuos de aminoácido que corresponde a los aminoácidos 130 y 512 de la SEQ ID No: 1.
Una "variante" de SCP es un polipéptido u oligopéptido de SCP que no es completamente idéntico a la SCP nativa. Dicha variante de SCP se puede obtener alterando la secuencia de aminoácidos mediante inserción, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína se modifica, mediante sustitución, para crear un polipéptido que tiene sustancialmente las mismas, o mejoradas, cualidades en comparación con el polipéptido nativo. La sustitución puede ser una sustitución conservada. Una "sustitución conservada" es una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Una sustitución conservada sería una sustitución por un aminoácido que introdujera el menor cambio posible en la carga del aminoácido o en el tamaño de la cadena lateral del aminoácido (de forma alternativa, en el tamaño, carga o tipo del grupo químico de la cadena lateral) de tal modo que el péptido global mantenga su conformación espacial pero tenga una actividad biológica alterada. Por ejemplo, los cambios conservados más comunes podrían ser Asp a Glu, Asn ó Gln; His a Lys, Arg ó Phe; Asn a Gln, Asp ó Glu; y Ser a Cys, Thr ó Gly. Normalmente se usa alanina para sustituir por otros aminoácidos. Los 20 aminoácidos esenciales se pueden agrupar de la siguiente manera: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina, que tienen cadenas laterales no polares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina y glutamina, que tienen cadenas laterales polares no cargadas; aspartato y glutamato, que tienen cadenas laterales ácidas; y lisina, arginina e histidina, que tienen cadenas laterales básicas. L. Stryer, Biochemistry (2ª ed.) pág. 14-15; Lehninger, Biochemistry, pág. 73-75.
Los cambios de aminoácidos se consiguen cambiando los codones de la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos. Se sabe que dichos polipéptidos se pueden obtener en base a la sustitución de determinados aminoácidos por otros aminoácidos en la estructura del polipéptido con el fin de modificar o de mejorar la actividad antigénica o inmunogénica. Por ejemplo, mediante la sustitución de aminoácidos alternativos, se pueden realizar pequeños cambios conformacionales en un polipéptido que dan como resultado un aumento en la actividad o en la respuesta inmune. De forma alternativa, se pueden usar sustituciones de aminoácidos en determinados polipéptidos para proporcionar residuos que a continuación pueden ligarse a otras moléculas para proporcionar conjugados péptido-molécula que retienen suficientes propiedades antigénicas del polipéptido de partida como para ser útiles para otros propósitos.
Se puede usar el índice hidropático de aminoácidos para conferir función biológica interactiva a un polipéptido, en donde se descubre que determinados aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan índices hidropáticos similares y mantener todavía una actividad biológica similar. Alternativamente, la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar en base a la hidrofilicidad, particularmente cuando la función biológica deseada en el polipéptido que se va a generar está destinada al uso en realizaciones inmunológicas. Cuanto mayor es la hidrofilicidad media local de una "proteína", regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, mayor es su inmunogenicidad. Patente de EE.UU. 4.554.101. Por consiguiente, cabe destacar que se pueden realizar sustituciones en base a la hidrofilicidad asignada a cada aminoácido.
Cuando se usa tanto el índice de hidrofilicidad como el índice hidropático, que asigna valores a cada aminoácido, se prefiere realizar sustituciones de aminoácidos en los que dichos valores sean \pm2, siendo las de \pm1 particularmente preferidas, y siendo las de \pm0,5 las sustituciones más preferidas.
La SCP variante comprende al menos siete residuos de aminoácido, preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.500 residuos, y más preferiblemente de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.200 residuos, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.180 residuos, en donde la SCP variante tiene al menos un 50%, preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, pero menos del 100%, de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contiguos con la secuencia de aminoácidos de una SCP nativa correspondiente.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido de SCP variante corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácidos de SCP nativa. Tal como se usa en la presente memoria, "corresponde esencialmente a" se refiere a una secuencia de polipéptido que provocará una respuesta inmunológica protectora sustancialmente igual que la respuesta generada por la SCP nativa. Dicha respuesta puede ser de al menos el 60% del nivel generado por la SCP nativa, e incluso puede ser de al menos el 80% del nivel generado por la SCP nativa. Una respuesta inmunológica a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedante de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos al polipéptido o vacuna de interés. Normalmente, dicha respuesta consiste en que el sujeto produce anticuerpos, células B, células T colaboradoras, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés.
La SCP puede ser una variante de la SCP de Streptococcus de grupo A (SCPA), de Streptococcus de grupo B (SCPB), de Streptococcus de grupo C (SCPC) o de Streptococcus de grupo G (SCPG).
Una variante de la invención puede incluir residuos de aminoácido no presentes en la correspondiente SCP nativa o eliminaciones relativas a la correspondiente SCP nativa. Una variante también puede ser un fragmento "truncado" en comparación con la correspondiente SCP nativa, es decir, sólo una porción de una proteína de longitud completa. Por ejemplo, la SCP variante puede variar de la SCP nativa en que no contiene un injerto de pared celular. Las variantes de SCP también incluyen péptidos que tienen al menos un aminoácido D.
La SCP variante de la vacuna puede expresarse a partir de una secuencia de ADN aislado que codifica la SCP variante. Por ejemplo, la SCP variante puede variar de la SCP nativa en que no contiene una secuencia señal o un injerto de pared celular. El ADN puede codificar la hendidura de especificidad o el dominio catalítico. En particular, el ADN puede codificar el residuo de aminoácido 193 o el 295 del dominio catalítico, o los residuos de aminoácido 260, 261, 262, 415, 416 ó 417 de la hendidura de especificidad, o codificar modificaciones en dichos residuos. La SCP de la vacuna carece de actividad enzimática de C5asa o de peptidasa. La vacuna también puede contener un adyuvante inmunológico. La vacuna se puede usar para prevenir la infección por Streptococcus de grupo A, Streptococcus de grupo B, Streptococcus de grupo C o Streptococcus de grupo G. La vacuna también comprende la peptidasa C5a conjugada o ligada a un péptido inmunogénico o a un polisacárido inmunogénico. Se define "recombinante" como un péptido o ácido nucleico producido mediante procesos de ingeniería genética. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria.
La vacuna de peptidasa C5a estreptococal se puede administrar mediante inyección subcutánea o intramuscular. Alternativamente, la vacuna puede administrarse mediante ingestión oral o mediante inoculación intranasal.
En la solicitud también se describen otros péptidos de SCP aislados y purificados, en los que la SCP es una variante de la SCP natural, y otros polinucleótidos aislados y purificados que codifican una SCP variante. Dichas SCPs pueden incluir los residuos de aminoácido 130, 193, 295 ó 512 del dominio catalítico, o los residuos de aminoácido 260, 261, 262, 415, 416 ó 417 de la hendidura de especificidad. Dichas SCPs pueden ser SCPA49D130A, SCPA49H193A,
SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H139A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A,
SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A ó \DeltaSCPA49.
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Breve descripción de las figuras
Figura 1. Arquitectura de peptidasa C5a de estreptococos \beta-hemolíticos. D indica un residuo de ácido aspártico; H indica histidina; S indica serina; L indica leucina; P indica prolina; T indica treonina; y N indica asparagina. R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} indican secuencias repetidas. Los números indican la posición del residuo de aminoácido en la peptidasa.
Figura 2. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de SCP de estreptococos de grupo A serotipo 49 (SEQ ID NO: 1), de estreptococos de grupo A serotipo 12 (SEQ ID NO: 2), de estreptococos de grupo B (SEQ ID NO: 3) y de estreptococos de grupo A serotipo 1 (SEQ ID NO: 23). Las secuencias son idénticas excepto por las posiciones de aminoácidos indicadas. El triángulo (\nabla) indica el punto de ruptura predicho para la peptidasa señal. Los aminoácidos predichos para la posición de centro activo de la enzima están marcados con asteriscos. Las eliminaciones de la secuencia de aminoácidos están indicadas mediante puntos y están recuadradas. Los asteriscos (*) indican los residuos de aminoácido del dominio catalítico.
Figura 3. Construcción de mutantes de inserción y de eliminación de SCP. La caja negra indica una región eliminada.
Figura 4. Análisis FACS de color sencillo. Los datos de fluorescencia fueron analizados fijando la puerta sobre PMNs. Se fijó una segunda puerta para contabilizar las células de tinción superiores definidas por la primera puerta. Se inocularon sacos de aire con 1 X 10^{6} CFU.
Figura 5. Persistencia de serotipo M49 natural y de tipo SCPA^{-} de estreptococos después de infección nasal.
Figura 6. Comparación de la capacidad de mutantes SCPA^{-} de serotipo M6 de estreptococos de Grupo A para colonizar ratones después de infección intranasal. Compara ratones BALB/c (diez en cada grupo experimental) inoculados con 2 X 10^{7} CFU de M6 de estreptococos. Se cultivaron muestras de garganta cada día sobre placas de agar de sangre que contenían estreptomicina. Los ratones fueron considerados positivos cuando las placas contenían una colonia \beta-hemolítica. Los datos fueron analizados estadísticamente mediante el ensayo \chi^{2}.
Figura 7. Construcción de vacuna \DeltaSCPA49 y protocolo de inmunización.
Figura 8. El anticuerpo de conejo neutraliza la actividad de SCPA asociada a diferentes serotipos. La Barra 1 es un control positivo y contenían rhC5a que no había sido preincubado antes de la exposición a PMNs. La Barra 10 es un control que carece de rhC5a. Se incubaron con 20 \muL de rhC5a 5 \muM durante 45 minutos bacterias enteras intactas, preincubadas con suero normal de conejo (barra 2, M1 90-131; barra 4, M6 UAB200; barra 6, M12 CS24; barra 8, M49 CS101) o preincubadas con suero de conejo anti-SCPA49 (barra 3, M1 90-131; barra 5, M6 UAB200; barra 7, M12 CS24; barra 9, M49 CS101). El rhC5a residual se evaluó a través de su capacidad para activar PMNs para adherirse a pocillos de placas de microtitulación recubiertas con BSA. Los PMNs adherentes se tiñeron con violeta cristal.
Figura 9. Respuestas de IgG de suero y de IgA secretor después de inmunización intranasal de ratones con la proteína \DeltaSCPA49 purificada. Los niveles de IgG específico de SCPA49 en suero y en saliva fueron determinados mediante ELISA indirecto. Los sueros procedentes de cada ratón fueron diluidos a 1:2.560 en PBS; la saliva fue diluida 1:2 en PBS. La Figura 9A muestra los resultados experimentales de IgA; la Figura 9B muestra los resultados experimentales de IgG.
Figura 10. Comparación de la capacidad del serotipo M49 de estreptococo para colonizar ratones CD1 hembras inmunizados y no inmunizados. Cada grupo experimental contenía 13 ratones que fueron infectados intranasalmente (i.n.) con 2,0 X 10^{8} CFU. Los datos se analizaron estadísticamente mediante el ensayo \chi^{2}. Las Figuras 10A y 10B muestran los resultados del experimento repetido.
Figura 11. Comparación de ELISA competitivo de SCP natural y variante en la unión a anticuerpo policlonal. El antígeno de placa es SCPA49 natural recombinante (100 ng/pocillo). El antígeno competidor está indicado en la leyenda.
Figura 12. Comparación de ELISA competitivo de SCPA1, SCPA49 y SCPB en la unión a anticuerpo policlonal. El antígeno de placa es SCPA49 natural recombinante (100 ng/pocillo). El antígeno competidor está indicado en la leyenda. El SCPA1 y el SCPA49 usados en los experimentos presentados en esta Figura comprendían desde Asn^{32} hasta His^{1139}. El SCPB usado en los experimentos presentados en esta Figura se fabricó de acuerdo con Chmouryguina, I. y col., "Conservation of the C5a Peptidasa Gene in Group A and B Streptococci", Infect. Immun., 64: 2387-2390 (1996).
Descripción detallada de la invención
Una primera línea importante de defensa contra la infección provocada por muchos patógenos bacterianos es la acumulación de leucocitos polimorfonucleares fagocíticos (PMNs) y de células mononucleares en la zona de la infección. La atracción de dichas células está mediada por estímulos quemotácticos, tales como los factores del hospedante o los factores segregados por el organismo invasor. El quemoatractor C5a es básico en la estimulación de esta respuesta inflamatoria en mamíferos. El C5a es un glicopéptido de 74 residuos separado del quinto componente (C5) de complemento. Las células fagocíticas responden de un modo directo a un gradiente de C5a y se acumulan en la zona de la infección. El C5a puede ser el atractor más inmediato de fagotitos durante la inflamación. Cuando los PMNs se infiltran en una lesión inflamatoria segregan otras quemoquinas, tales como IL8, que intensifican aún más la respuesta inflamatoria.
La peptidasa C5a estreptococal (SCP) es una enzima proteolítica localizada sobre la superficie de estreptococos patogénicos donde destruye C5a, según se va produciendo localmente el C5a. La SCP ataca específicamente la quemotaxina C5a en la posición de unión de PMN (entre los residuos His^{67} y Lys^{68} del C5a) y elimina los siete residuos del extremo C del C5a. Esta eliminación de la posición de unión de PMN elimina la señal quemotáctica. Cleary, P., y col., "Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase", Infect. Immun., 60: 5219-5223 (1992); Wexler, D. E., y col., "Mechanism of action of the group A streptococcal C5a inactivator", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 82: 8144-8148 (1985).
La SCP de estreptococos de grupo A es una serina proteasa de tipo subtilisina con un M_{r} de 124.814 da y con una estructura de anclaje a pared celular que es común muchas proteínas superficiales de bacterias Gram positivas. La arquitectura de peptidasa de C5a se presenta en la Figura 1. La secuencia completa de nucleótidos del gen de peptidasa de C5a estreptococal de Streptococcus pyogenes ha sido publicada. Chen, C., y Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265: 3161-3167 (1990). Al contrario que las subtilisinas, la SCP presenta una especificidad de sustrato muy estrecha. Esta estrecha especificidad es sorprendente a la luz de las marcadas similitudes entre sus dominios catalíticos. Cleary, P., y col., "Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase", Infect. Immun., 60: 5219-5223 (1992). Los residuos implicados en la transferencia de carga se conservan, así como los residuos a ambos lados del bolsillo de unión. Sin embargo, el resto de la secuencia de aminoácidos de la SCP no está relacionada con la de la subtilisinas. Se descubrió que más de 40 serotipos de estreptococos de Grupo A producen proteína SCP o alojan el gen. Cleary, P., y col., "A streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A streptococci", en Recent Advances in Streptococci and Streptococcal Disease pág. 179-180 (S. Komani y Y. Shiokawa, ed.; Reedbooks Ltd., Berkshire, Inglaterra,; 1984); Podbielski, A., y col., "The group A streptococcal virR49 gene controls expresion of tour structural vir regulon genes", Infect. Immun., 63: 9-20 (1995).
El dominio catalítico o el centro activo de la SCP se componen del sistema de transferencia de carga y de la hendidura de especificidad. El sistema de transferencia de carga, que es parte del dominio catalítico, contiene los residuos Asp^{130}, His^{193}, Asn^{295} y Ser^{512} (Figuras 1 y 2). Cualquier modificación, es decir, una eliminación, inserción o sustitución, de uno cualquiera de estos aminoácidos desactivará la enzima. Por otro lado, se predice que la hendidura de especificidad está formada por Ser^{260}, Phe^{261}, Gly^{262}, Ile^{415}, Tyr^{416} y Asp^{417}. La modificación mediante sustitución de dichos aminoácidos podría cambiar la especificidad de sustrato de la enzima o eliminar a la vez la actividad proteolítica. La modificación mediante eliminación de dichos aminoácidos también desactivaría la enzima. El dominio catalítico depende de la estructura terciaria de la proteína que se crea cuando la enzima madura de pliega en sus estado activo. Este dominio no se forma a partir de un conjunto lineal contiguo de residuos de aminoácidos. Alternativamente, la modificación también puede reducir la unión de SCP variante con el sustrato. La unión se puede reducir en un 50%, un 70% o incluso un 80%.
También se ha identificado una enzima peptidasa de C5a asociada a estreptococos de grupo B. Hill, H. R., y col., "Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement", J. Immunol. 141: 3551-3556 (1988). El mapeo de restricción y la finalización de la secuencia de nucleótidos scpB demostraron que scpB es similar en un 97-98% a scpA. Véase la Figura 2 para una comparación de la secuencia de aminoácidos de SCP procedente de estreptococos de grupo A de serotipo 49, de estreptococos de grupo A de serotipo 12, de estreptococos de grupo B y de estreptococos de grupo A de serotipo 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 23, respectivamente). Más de 30 cepas, que representan todos los serotipos de estreptococos de grupo B, portan el gen scpB. Cleary P. P., y col., "Similarity between the Group B and A streptococcal C5a Peptidase genes", Infect. Immun. 60: 4239-4244 (1992); Suvorov A. N., y col., "C5a peptidase gene from group B streptococci", en Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci y Enterococci, pág. 230-232 (G. Dunny, P. Cleary y L. McKay (ed.); American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 1991).
Los elementos aislados de estreptococos de los grupos G y C también alojan genes del tipo scpA. Se demostró que algunas cepas de grupo G expresan actividad de proteasa específica de C5a sobre su superficie. Cleary, P. P. y col., "Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci", Infect. Immun., 59: 2305-2310 (1991). Por lo tanto, todos los serotipos (>80) de estreptococos de grupo A, de estreptococos de grupo B, de estreptococos de grupo C y de estreptococos de grupo G producen la enzima SCP.
La SCP asiste a los estreptococos a colonizar una zona de infección potencial, tal como la mucosa nasofaríngea, mediante la inhibición del influjo de células blancas fagocíticas hacia la zona de infección. Esto impide la eliminación inicial de los estreptococos del hospedante. El impacto de la SCP en la inflamación, la quemotaxis de leucocitos C5a y la virulencia estreptococal se examinaron usando cepas estreptococales con mutaciones bien definidas en el gen estructural de proteasa. Las variantes de SCP se construyeron usando inserción de plásmido dirigida y reemplazamiento del gen natural por scpA que contiene una eliminación interna específica. Las variantes carecieron de actividad de proteasa C5a y no inhibieron la respuesta quemotáctica de PMNs de humano o de ratón a C5a in vitro.
Se usó un modelo de bolsa de aire de tejido conectivo de ratón para confirmar que la SCP retrasa el influjo de células fagocíticas y la eliminación de estreptococos de la zona de infección. Se genera una bolsa de aire de tejido conectivo inyectando una pequeña cantidad de aire y de PBS (con o sin estreptococos) con una aguja indicadora 25 bajo la piel en la espalda del ratón. Boyle, M. D. P. y col., "Measurement of leukocyte chemotaxis in vivo", Meth. Enzymol., 162: 101-115 (1988). Al final del experimento, los ratones fueron sometidos a eutanasia mediante dislocación cervical, se diseccionaron las bolsas de aire y se homogeneizaron en tampón. Una ventaja del modelo de bolsa de aire es que la bolsa de aire permanece inflada durante varios días y libre de inflamación, a menos que se inyecte un irritante. De este modo, las bacterias inyectadas y la respuesta inflamatoria resultante permanecen localizadas en periodos cortos de la infección.
El modelo de bolsa de aire se modificó para comparar la eliminación de estreptococos SCP^{+} y SCP^{-} naturales (es decir, estreptococos de grupo A que portaban una forma de SCP variante no funcional), y para analizar el infiltrado celular en una etapa inicial de la infección. Se evaluaron suspensiones de tejido para determinar la presencia de estreptococos viables sobre placas de agar de sangre, y el infiltrado celular se analizó mediante clasificación celular fluorescente (FACS). En el análisis FACS, las células individuales en suspensión son marcadas con monoanticuerpos fluorescentes específicos. Se inyectan alícuotas de células marcadas en un flujocitómetro FAC-Scan, o clasificador de células fluorescentes, que contabiliza células en función de su fluorescencia característica. Los experimentos realizados usando el modelo de bolsa de aire indicaron que los estreptococos que eran SCP^{+} eran más virulentos que los estreptococos que eran SCP^{-}.
Se realizó un estudio para medir la producción de anticuerpos humanos, tanto IgG como IgA, contra SCP en sueros y saliva humanos. O'Connor, S. P., y col., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase", J. Infect. Dis. 163: 109-16 (1991). Generalmente, los sueros y la saliva de niños jóvenes no infectados carecían de anticuerpos contra la SCP. Por el contrario, la mayoría de los especimenes de suero y de saliva de adultos saludables presentaron niveles mensurables de IgG anti-SCP y de IgA secretor específico de SCP (sIgA anti-SCP). Los sueros convalescentes y agudos emparejados de pacientes con faringitis estreptococal poseían niveles significativamente mayores de IgG anti-SCP que los sueros procedentes de individuos saludables. Los sueros que contenían altas concentraciones de inmunoglobulina anti-SCP fueron capaces de neutralizar la actividad de SCP. La detección de este anticuerpo en >90% de los especímenes de saliva obtenidos de niños que habían experimentado recientemente faringitis estreptococal demostró que los niños pueden producir una respuesta de anticuerpos.
Incluso aunque los sujetos humanos produjeron IgG e IgA contra SCP en respuesta a una infección estreptococal natural, no se sabía si la inmunoglobulina anti-SCP proporciona alguna protección contra la infección. Además, no se sabía si la proteína SCP podría actuar como una vacuna contra la colonización o la infección estreptococal \beta-hemolítica. En primer lugar, se realiza un estudio para examinar el papel de la SCP en la colonización de la nasofaringe. Después de la infección intranasal con estreptococos vivos de grupo A, se tomaron cultivos de garganta a diario durante hasta diez días. Se compararon los estreptococos naturales y los mutantes deficientes en SCP en términos de capacidad para persistir en la garganta a lo largo de dicho periodo de diez días. Como era de esperar, los estreptococos mutantes deficientes en SCP fueron eliminados de la nasofaringe más rápidamente.
Se usó el mismo modelo intranasal de ratón para evaluar la capacidad de SCP para inducir inmunidad que prevenga la colonización. Se clonó una forma variante del gen recombinante scpA49 comenzando en el nucleótido que codifica Thr^{63}. Dicha variante se denomina \DeltaSCPA49, y tiene una longitud de 2908 pb (véase el Ejemplo 4 más adelante). La proteína SCP variante fue purificada a partir de un E. coli recombinante mediante cromatografía de afinidad. Los sueros de conejos vacunados intradermalmente con esta preparación de proteína neutralizaron la actividad de SCP in vitro. La proteína purificada (40 \mug) se administró intranasalmente a ratones a lo largo de un periodo de cinco semanas. Los ratones inmunizados eliminaron los estreptococos en 1-2 días; mientras que los cultivos de garganta de ratones no inmunizados permanecieron positivos hasta 10 días. El experimento se repitió con tres conjuntos de ratones, vacunados con tres preparaciones de proteína SCP separadas.
Se llevaron a cabo más experimentos para determinar si la inmunización de un animal con un único antígeno evitaría la colonización de varios serotipos. Se clonó el \DeltaSCPA49 en un vector de expresión y se expresó en E. coli. La proteína \DeltaSCPA49 variante purificada por afinidad demostró ser altamente inmunogénica en ratones y en conejos. Aunque el inmunógeno \DeltaSCPA49 variante purificado carecía de actividad enzimática, indujo elevados títulos de anticuerpos de conejo que fueron capaces de neutralizar la actividad de peptidasa asociada a estreptococos M1, M6, M12 y M49 in vitro. Esto confirmó que los anticuerpos antipeptidasa carecen de especificidad de serotipo. A continuación se inmunizaron intranasalmente cuatro conjuntos de ratones con la \DeltaSCPA49 variante purificada y fueron expuestos a diferentes serotipos de estreptococos de grupo A. La inmunización de ratones con proteína \DeltaSCPA49 estimuló niveles significativos de anticuerpos sIgA específicos de saliva y anticuerpos IgG de suero, y redujo el potencial de colonización de los estreptococos naturales M1, M2, M6, M11 y M49. Estos experimentos confirman que la inmunización con vacuna de peptidasa de C5a estreptococal es eficaz en la prevención de la colonización de la nasofaringe.
También se realizaron experimentos para desarrollar SCPs variantes a partir de una cepa OF^{-} de M1 y de una cepa OF^{+} de M49. Puesto que la SCP activa podría ser dañina para el hospedante, era importante que las proteínas variantes carecieran de actividad enzimática. Los aminoácidos requeridos para la actividad catalítica fueron reemplazados por aquellos de los que se esperaba que desactivaran la enzima.
Se evaluaron dos propiedades de las proteínas variantes. En primer lugar, se determinaron las actividades específicas de las proteínas naturales y variantes mediante el ensayo de adherencia de PMN. Estos experimentos indicaron que los aminoácidos sustituidos reducían la actividad enzimática en más del 90%. En segundo lugar, también se compararon las proteínas variantes con la proteína natural en cuanto a su capacidad para unirse a anticuerpos dirigidos contra la enzima natural. Se usaron ensayos ELISA competitivos para este propósito. Los resultados indicaron que las sustituciones de aminoácidos no alteraron la capacidad de los anticuerpos para unirse a las proteínas variantes.
Todos los estudios previos de protección se habían llevado a cabo administrando la proteína \DeltaSCPA49 purificada por afinidad intranasalmente sin adyuvante. Sin embargo, la inyección intramuscular o subcutánea (SQ) de antígenos es históricamente un método aceptado preferido para suministrar vacunas. Por tanto, se llevaron a cabo experimentos para evaluar si las inyecciones SQ de \DeltaSCPA con lípido de monofosforilo A (MPL) y con alumbre (AlPO_{4}) inducían una respuesta inmune protectora y si dicha respuesta reducía la colonización cuando la cepa de estreptococos de grupo A usada para la exposición difería en el serotipo con respecto a la fuente de vacuna SCPA. Se evaluó la capacidad de ratones inmunizados para eliminar los estreptococos de la mucosa oral-nasofaríngea mediante cultivos de garganta o tomando muestras de tejido nasal diseccionado.
El número de estreptococos asociados al tejido nasal disminuyó con el tiempo, tal como era de esperar, y el descenso fue más rápido y completo en los ratones inmunizados con antígeno de SCPA. Los resultados confirmaron que un único antígeno de SCPA induce protección contra serotipos heterólogos. La protección la proporciona un anticuerpo que neutraliza la actividad de peptidasa sobre la superficie bacteriana. Esto aumenta el influjo de fagocitos en las primeras horas desde el momento en que los estreptococos son depositados en el tejido mucoso. Se sospecha que la rápida eliminación de estreptococos por acción de los fagocitos evita la posterior multiplicación y persistencia de las bacterias. Por tanto, la inyección SQ de antígeno de SCPA con adyuvante indujo consistentemente una vigorosa respuesta inmune. De este modo, la presente invención proporciona una vacuna para usarse para proteger mamíferos frentes a la colonización o la infección de Streptococcus \beta-hemolíticos, comprendiendo dicha vacuna una cantidad inmunogénica de un péptido purificado y aislado que comprende una Peptidasa de C5a Estreptococal (SCP) desactivada enzimáticamente, cantidad que es eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Estreptococos \beta-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, en donde la SCP es una variante de la SCP natural que tiene una sustitución en los dos residuos de aminoácido correspondientes a los aminoácidos 130 y 512 de la SEQ ID No: 1. Las vacunas de la presente invención también pueden incluir cantidades eficaces de adyuvantes inmunológicos, conocidos porque potencian la respuesta inmune.
La SCP se puede conjugar o ligar a otro péptido o a un polisacárido. Por ejemplo, se pueden emplear proteínas inmunogénicas bien conocidas en la técnica, también denominadas "vehículos". Las proteínas inmunogénicas útiles incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), ovoalbúmina, albúmina de suero humano, globulina gamma humana, inmunoglobulina G de pollo y globulina gamma bovina. Los polisacáridos inmunogénicos útiles incluyen polisacáridos Estreptococales de grupo A, polisacáridos C de Estreptococos de grupo B, o los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae o Streptococci B. Alternativamente, los polisacáridos o las proteínas de otros patógenos que se usan como vacunas se pueden conjugar, unir o mezclar con la SCP.
La solicitud proporciona además moléculas de ácido nucleico purificadas, por ejemplo, moléculas de ADN, que comprenden un segmento de ácido nucleico preseleccionado que codifica al menos una porción de un peptidasa de C5a Estreptococal, es decir, codifican SCP o una variante de la misma tal como se describe en la presente memoria, por ejemplo SCPA49S512A, SCPA49D130A, SCPA49N295A, SCPA1S512A, SCPA1D130A, SCPA1N295A, \DeltaSCPA49, SCPBS512A, SCPBD130A, SCPBH193A ó SCPBN295A, o cualquier combinación de dichas mutaciones. La solicitud además describe una casete de expresión que comprende un segmento de ADN preseleccionado que codifica una molécula de ARN que es sustancialmente idéntica (sentido) a todo o a una parte de un ARN mensajero (mARN "diana"), es decir, un mARN de SCP endógeno o "nativo". El segmento de ADN preseleccionado en la casete de expresión está ligado operativamente a un promotor. Tal como se emplea en el presente documento, "sustancialmente idéntico" en secuencia significa que dos secuencias de ácidos nucleicos presentan al menos aproximadamente un 65%, preferiblemente aproximadamente un 70%, más preferiblemente aproximadamente un 90%, e incluso más preferiblemente aproximadamente un 98%, de identidad de secuencia de nucleótidos contiguos una respecto a la otra. Preferiblemente, el segmento de ADN preseleccionado se hibrida en condiciones de hibridación, preferiblemente en condiciones de hibridación severas, con una molécula de ácido nucleico que codifica la correspondiente SCP nativa.
Tal como se usa en la presente memoria, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en base molar es más abundante que cualquier otra especie individual de la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente un 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% y aproximadamente el 99%. Lo más preferible es que la especie objeto esté purificada hasta homogeneidad esencial (que las especies contaminantes no puedan ser detectadas en la composición empleando métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "ácido nucleico recombinante" o "ácido nucleico preseleccionado", por ejemplo, "secuencia o segmento de ADN recombinante" o "secuencia o segmento de ADN preseleccionado" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo a un ADN, que ha sido derivado o aislado a partir de cualquier fuente apropiada, que posteriormente puede ser alterado químicamente in vitro, de tal modo que su secuencia no existe de forma natural, o que corresponde a secuencias naturales que no se encuentran posicionadas del modo en que lo estarían en un genoma que no ha sido transformado con ADN exógeno. Un ejemplo de ADN preseleccionado "derivado" de una fuente sería una secuencia de ADN que se identifica como fragmento útil dentro de un organismo dado, y que a continuación puede sintetizarse químicamente en una forma esencialmente pura. Un ejemplo de dicho ADN "aislado" a partir de una fuente sería una secuencia de ADN útil que es separada o eliminada de dicha fuente empleando medios químicos, por ejemplo mediante el uso de endonucleasas de restricción, de tal modo que puede seguir siendo manipulada, por ejemplo, amplificada, para su uso en la invención, mediante la metodología de la ingeniería
genética.
La recuperación o el aislamiento de un fragmento dado de ADN a partir de una digestión de restricción pueden emplear la separación de los elementos digeridos sobre gel de poliacrilamida o de agarosa mediante electroforesis, identificación del fragmento de interés mediante comparación de su movilidad frente a la fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, eliminación de la sección de gel que contiene el fragmento deseado y separación del gel y el ADN. Véase Lawn y col., Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981), y Goeddel y col., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980). Por tanto, "ADN preseleccionado" incluye secuencias de ADN completamente sintéticas, secuencias de ADN semi-sintéticas, secuencias de ADN aisladas de fuentes biológicas, y secuencias de ADN derivadas de ARN, así como mezclas de las mismas.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "derivado" con respecto a una molécula de ARN significa que la molécula de ARN tiene una identidad de secuencia complementaria con una molécula de ADN concreta.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencias de aminoácidos de una SCP se preparan usando una serie de métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitación, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos naturales) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a posición), mutagénesis PCR, y mutagénesis de casete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante de la SCP.
Para inmunizar a un sujeto, la variante SCP se administra parenteralmente, normalmente mediante inyección intramuscular o subcutánea en un vehículo apropiado. Sin embargo, también son aceptables otros modos de administración tales como la administración oral o la intranasal. Las formulaciones de vacuna contendrán una cantidad eficaz del ingrediente activo en un vehículo. La cantidad eficaz es suficiente para prevenir, paliar o reducir la incidencia de una colonización de Streptococcus \beta-hemolítico en el mamífero objetivo. El especialista en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad eficaz. El ingrediente activo puede oscilar típicamente entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 95% (p/p) de la composición, o incluso más o menos si es apropiado. La cantidad a administrar depende de factores tales como la edad, el peso y la condición física del animal o del sujeto humano considerado para la vacunación. La cantidad también depende de la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección deseado. El especialista en la técnica puede establecer fácilmente las dosis eficaces mediante ensayos rutinarios que establezcan las curvas dosis-respuesta. El sujeto se inmuniza mediante la administración de la SCP en una o más dosis. Se pueden administrar dosis múltiples si se requieren para mantener un estado de inmunidad frente a estreptococos.
Las formulaciones intranasales pueden incluir vehículos que no causan irritación en la mucosa nasal ni afectan significativamente a la función ciliar. Con la invención se pueden emplear diluyentes tales como agua, disolución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tale como clorobutanol y cloruro de benzalconio, pero sin limitarse a ellos. Puede haber presente un tensioactivo para potenciar la absorción de las proteínas sujeto por la mucosa nasal.
Las preparaciones líquidas orales pueden encontrarse en la forma, por ejemplo, de suspensión, disolución, emulsión, jarabe o elixir, acuosos u oleaginosos, o puede presentarse en seco en forma de comprimido o como un producto para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsificantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), o conservantes.
Para preparar una vacuna, se puede aislar, liofilizar y estabilizar la SCP purificada. El péptido de SCP se puede ajustar a continuación hasta una concentración apropiada, combinado opcionalmente con un adyuvante de vacuna adecuado, y se puede empaquetar para su uso. Los adyuvantes adecuados incluyen, aunque sin limitación, tensioactivos, por ejemplo hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-N'-N-bis(2-hidroxietil-propano-di-amina), metoxihexadecil-glicerol, y polioles pluronic; polianiones, por ejemplo pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; péptidos, por ejemplo dipéptido de muramilo, MPL, aimetilglicina, tuftsina, emulsiones en aceite, alumbre, y mezclas de los mismos. Otros adyuvantes potenciales incluyen las subunidades de péptido B de la toxina termolábil de E. coli o de la toxina del cólera. McGhee, J. R., y col., "On vaccine development", Sem. Hematol. 30: 3-15 (1993). Finalmente, el producto inmunogénico se puede incorporar en liposomas para su uso en una formulación de vacuna, o puede conjugarse con proteínas tales como la hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) o la albúmina de suero humano (HSA) u otros polímeros.
La aplicación de SCP para la vacunación de un mamífero contra la colonización ofrece ventajas sobre otros candidatos a vacuna. La prevención de la colonización o de la infección mediante inoculación con una única proteína no sólo reducirá la incidencia de los problemas habituales del dolor de garganta y del impétigo, sino que también eliminará secuelas tales como la fiebre reumática, la glomerulonefritis aguda, la sepsis, el choque tóxico y la fascitis necrotizante.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención sin limitarla.
Ejemplo 1 Construcción y Análisis In Vitro de Mutantes de Inserción y de Eliminación en scpA49 y scpA6
a)
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. La cepa CS101 de S. pyogenes es una cepa de serotipo M49, y de de opacidad de suero positiva (OF^{+}). El CS159 es un elemento clínico aislado con una eliminación que se extiende a través del grupo del gen M y de scpA. Se seleccionó un derivado espontáneo resistente a estreptomicina de la cepa CS101, denominado CS101Sm, mediante colocación en placa de estreptococos procedentes de un cultivo de fase estacionaria sobre agar de sangre de triptosa que contiene estreptomicina (200 \mug/mL). Las cepas estreptococales CS210 y CS463 son derivados espontáneos resistentes a estreptomicina de cepas OF^{+}, clase II, serotipo M2 y M11, respectivamente. Las cepas estreptococales 90-131 y UAB200 son derivados espontáneos resistentes a estreptomicina de elementos aislados humanos OF^{-}, clase I, serotipo M1 y M6 de estreptococos de grupo A, respectivamente.
\quad
La CS 101::pG^{+}host5 es la cepa CS 101 con pG^{+}host5 integrado en el cromosoma en una posición conocida, pero fuera de scpA y del grupo de genes emm. La cepa ER1821 de Escherichia coli (de New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) se usó como receptor del vector suicida, el plásmido pG^{+}host5. El plásmido pG^{+}host5 se obtuvo en Appligene, Inc. Pleasanton, CA. Los estreptococos fueron cultivados en caldo de Todd-Hewitt suplementado con un 2% de neopeptona o con un 1% de extracto de levadura, o sobre placas de agar de triptosa con un 5% de sangre de oveja. La cepa ER1821 de E. coli que contiene el plásmido pG^{+}host5 se cultivó en caldo LB con eritromicina (300 \mug/mL). Los estreptococos con plásmido pG^{+}host5 se cultivaron en caldo de Todd-Hewitt con un 1% de extracto de levadura (THY) que contiene 1 \mug/mL de eritromicina (Erm).
\quad
SCP se refiere a peptidasa de C5a estreptococal de Streptococcus \beta-hemolítico generalmente. SCPA1, SCPA12, SCPA49 y SCPA6 son las peptidasas específicas de las cepas de Streptococcus de grupo A de serotipo M 1, 12, 49 y 6, respectivamente. El término scpA se refiere al gen que codifica SCP procedente de estreptococos de grupo A. ScpA1, scpA12, scpA49 y scpA6 son los genes que codifican las peptidasas SCPA1, SCPA12, SCPA49 y SCPA6. SCPB y scpB se refieren a la peptidasa y al gen procedentes de estreptococos de grupo B. Las secuencias de aminoácido correspondientes a SCPA49 (SEQ ID NO: 1), a SCPA12 (SEQ ID NO: 2), a SCPA1 (SEQ ID NO: 23) y a SCPB (SEQ ID NO: 3) se muestran en la Figura 2.
b)
Construcción del mutante de inserción scpA49. Se construyeron mutantes de inserción bien definida de scpA49 usando métodos de inserción de plásmidos y de sustitución de genes. Un fragmento interno de scpA49 BgIII - BamHI, la diana de inserción, se ligó en el vector lanzadera termosensible pG^{+}host5 para formar el plásmido pG::acpA1.2 y se transformó en E. coli ER1821 (Figura 3). El vector pG^{+}host5 contiene un origen de replicación de E. coli que es activo a 39ºC, un origen de replicación Gram positivo sensible a la temperatura (activo a 30ºC e inactivo a 39ºC en los estreptococos), y un gen de resistencia a eritromicina para selección. Las temperaturas elevadas fuerzan al plásmido a integrarse en el ADN cromosomal de estreptococos de grupo A mediante recombinación homóloga a frecuencias que varían entre 10^{-2} y 10^{-3}.
\quad
El ADN de plásmido recombinante pG::scpA1.2 se sometió a electroporación en células receptoras CS101. Los transformantes fueron seleccionados en placas de agar-THY que contenían 1 \mug/mL de eritromicina a 30ºC. Los integrantes cromosomales resultantes de la recombinación entre el injerto de plásmido y el scpA49 cromosomal fueron seleccionados por su resistencia a eritromicina a 39ºC. Se analizaron dos mutantes de inserción, M14 y M16. Los revertidos de EmrS de las cepas M14 y M16 fueron obtenidos haciéndolos pasar por THY sin antibióticos a 30ºC, y finalmente fueron llevados a placa a 37ºC sin selección Erm. Las colonias que habían perdido el plásmido fueron aisladas para confirmar que el fenotipo mutante resultó de la inserción del plásmido en scpA49, en lugar de una mutación simultánea no relacionada.
c)
Construcción de los mutantes de inserción de \underbar{scpA6}. El mutante de inserción de scpA6 AK1.4 se construyó tal como se ha descrito en la anterior sección (b). El ADN plásmido recombinante, pG::acpA1.2, contiene un fragmento interno BglII-BindIII de gen scpA. Este plásmido se sometió a electroporesis en células receptoras UAB200 y se seleccionaron los transformantes sobre placas de agar THY que contenían eritromicina a 30ºC. Se seleccionó un integrante cromosomal de pG::scpA1.2, cepa AK1.4, que resultó de la recombinación entre el injerto de plásmido y el scpA6 cromosomal, mediante crecimiento sobre medio de agar que contenía eritromicina a 39ºC. La inserción en scpA6 se confirmó mediante transferencia Southern usando scpA como sonda, y PCR con un cebador universal M13 (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (SEQ ID NO: 6), específico del plásmido, y un cebador For835 de scpA (5'-AAGGACGACACATTGCGTA-3') (SEQ ID NO: 7), específico del scpA cromosomal de GAS.
d)
Introducción de una eliminación definida en \underbar{scpA} (Figura 3). Se construyó una cepa mutante con una eliminación definida interna a scpA49 para eliminar la posibilidad de que las inserciones en scpA49 pudieran ser polares y reducir la expresión por debajo de los genes, genes desconocidos que también podrían contribuir a la virulencia del organismo. En primer lugar, se produjo una eliminación definida en fragmento BgIII-HindIII mediante PCR de dentro a fuera con el cebador 1 (5'-GGGGGGGAATTC\underbar{GTAGCGGGTATCAT} \underbar{GGGAC-3}'), SEQ ID NO: 4, y el cebador 2 (5'-GGGGGGGAATTC\underbar{GGGTGCTGCAATATCTGGC-3}'), SEQ ID NO: 5. Los nucleótidos subrayados corresponden a secuencias de scpA con las coordenadas 2398 y 2322, respectivamente, y los nucleótidos en negrita corresponden a una posición de reconocimiento EcoRI. Los cebadores fueron seleccionados para producir una eliminación en marco en el gen scpA. Dichos cebadores copian ADN plásmido en direcciones opuestas y definen las fronteras de la eliminación. Innis, M.A., y col., eds., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990). Como molde se usó plásmido de ADN de pG::scpA1.2.
\quad
El producto amplificado fue digerido con EcoRI y ligado a plásmido pG^{+}host5. El plásmido resultante pG::\DeltascpA1.1 contenía una eliminación de 76 pb dentro del scpA. Esta eliminación en marco eliminó 25 aminoácidos, que incluyen la serina que forma parte del centro catalítico predicho de las serina proteasas. Chen, C., y Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265: 3161-3167 (1990). Se creó una posición EcoRV en el punto de eliminación. Se secuenció el ADN que solapa con la eliminación para confirmar las fronteras de la eliminación.
\quad
El plásmido pG::\DeltascpA1.1, que contiene la eliminación, se transformó en ER1821 de E. coli. Se seleccionaron colonias para ErmR y a continuación se escrutaron para buscar la eliminación de scpA apropiada usando una minipreparación de ADN plásmido restringido mediante EcoRI. Las fronteras precisas de la eliminación fueron confirmadas mediante secuenciamiento de ADN.
e)
Efectos \underbar{in vitro} de las mutaciones de SCP. El impacto de inserciones y eliminaciones sobre la expresión de antígeno de SCP y sobre la actividad de peptidasa se determinó mediante ensayo de transferencia Western y ensayos de adherencia de PMNs. Los estreptococos fueron incubados en 100 mL de THY a 37ºC durante una noche. La partícula de cultivo fue lavada dos veces en 5 mL de Acetato de Na 0,2 M frío (pH 5,2), a continuación se suspendió en 1 mL de tampón de TE-sacarosa (20% de sacarosa, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0) y 40 \muL de Mutanolisina. La mezcla se rotó a 37ºC durante 2 h, y continuación se centrifugó 5 minutos a 4.500 rpm. Los sobrenadantes contenían el inhibidor de proteasa, fluoruro de sulfonilo de fenilmetilo 100 mM (PMSF). Los métodos de electroforesis y de transferencia Western se llevaron a cabo tal como se describe en Laemmli, U.K., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227: 680-685 (1970). El antisuero primario usado para detectar proteína SCP en las manchas Western y de colonia se preparó mediante inmunización de un conejo con proteína SCP recombinante purificada. La unión se detectó mediante conjugado de fosfatasa alcalina y anticuerpo anti-conejo.
Se midió la actividad de peptidasa C5a usando un ensayo de adherencia de PMN. Booth, S.A. y col., "Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil adherent function", J. Invest. Dermatol. 98: 135-140 (1992). Tras la incubación de C5a (Sigma, St. Louis, MO) con extractos estreptococales o con proteasa purificada, la C5a residual puede activar PMNs para que se hagan adherentes a los pocillos recubiertos con BSA. En primer lugar, los pocillos de microtitulación fueron recubiertos con BSA al 0,5% en PBS e incubados durante 1 h a 37ºC. Se aislaron PMNs humanas mediante centrifugación en Ficoll Hypaque (Sigma, St. Louis, MO). Se incubaron 40 \muL de estreptococos intactos o de extractos de proteína con 20 \muL de C5a 5 \muM en 340 \muL de PBS con un 1% de glucosa y un 0,1% de CaCl_{2} a 37ºC durante 45 minutos. Los pocillos recubiertos con BSA fueron lavados con PBS, y se añadieron a los pocillos PMNs resuspendidas y C5a residual. La mezcla se incubó durante 45 minutos a 37ºC en un 7% de CO_{2}. Finalmente, se lavaron los pocillos para eliminar las PMNs no adherentes. Las PMNs adherentes fueron teñidas con violeta de cristal y se leyó la DO_{570nm} en un lector ELISA. La densidad óptica es proporcional a la cantidad de C5a residual, o inversamente proporcional a la cantidad de actividad de SCP.
Se analizaron los extractos de mutanolisina de proteínas de la superficie celular y de cultivos mutantes mediante transferencia Western usando un suero específico de SCPA. Se confirmó que los mutantes carecían de SCPA. Los extractos de SCPA-mutantes AK1.4 y MJ3-15 no reaccionaron con suero anti-SCPA. Se observaron proteínas SCPA del tamaño esperado en los extractos procedentes de las cepas naturales CS101 y UAB200. La incapacidad de las cepas mutantes AK1.4 y MJ3-15 para producir actividad de peptidasa C5a se verificó comparando su capacidad para destruir rhC5a. La exposición de PMNs aisladas a rhC5a las indujo a volverse adherentes a pocillos de microtitulación recubiertos con BSA. La incubación con estreptococos o con SCPA purificada produjo la ruptura específica de rhC5a y alteró su potencial para activar PMNs. Las PMNs que respondieron al rhC5a residual y se unieron a los pocillos recubiertos con BSA fueron teñidas, y a continuación fueron evaluadas espectrofotométricamente. La incubación de rhC5a con cultivos parentales de UAB200 y CS101 destruyó la rhC5a, lo que inhibió la adherencia de PMN en un 58,8% y en un 54,5%, respectivamente. Al contrario que los mutantes SCPA^{-}, el AK1.4 y el MJ3-15 no alteraron la rhC5a o la adherencia de las PMNs a los pocillos recubiertos con BSA (Tabla 1). Este experimento confirmó los ensayos de transferencia Western y demostró que los cultivos de SCPA^{-} carecen de otras proteasas que puedan degradar rhC5a.
TABLA 1 Ensayo de fagocitosis y ensayo de adherencia de PMN de cepas naturales y mutantes
1
Aunque no se esperaba que la expresión de proteína M estuviera influenciada por las mutaciones en scpA, se realizaron ensayos para determinar si los estreptococos mutantes SCPA- todavía expresaban proteína M y tenían la capacidad de resistir fagocitosis. El crecimiento de estreptococos en sangre humana fresca durante 3 horas de incubación es indicativo de proteína M antifagocítica sobre su superficie. R. C., Lancefield, "Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test", J. Exp. Med., 106, pág. 525-685 (1957). Tal como era de esperar, los estreptococos parentales UAB200 y CS101 aumentaron su número en 40 y 49 veces, respectivamente (Tabla 1). Los cultivos M^{+}SCPA^{-}, las cepas AK1.4 y MJ3-15, aumentaron 37,5 y 14 veces, respectivamente, confirmando que las mutaciones de scpA tenían poco efecto sobre la expresión de proteína M o sobre la resistencia a la fagocitosis en sangre humana entera. El crecimiento algo menor de ambas cepas mutantes en sabre rotada fue reproducible e inesperado. Las tasas de crecimiento de los cultivos mutantes y parentales en plasma humano fueron indistinguibles. Es posible que la activación de SCPA permitiera que la C5a se acumulara en la sangre rotada, lo que a su vez activaría PMNs. Las PMNs activadas son más fagocíticas y más capaces de eliminar estreptococos M^{+}. Los extractos de proteína superficial contienen antígeno M6 y M49, cuando se analizan mediante transferencia Western usando antisueros anti-M49 y anti-M6, lo que confirma que las mutaciones de SCPA no alteraron la expresión de proteína M.
Ejemplo 2 Reclutamiento de retrasos SCP de Fagocitos y Eliminación de Estreptococos de Posiciones Subdermales de Infección
Con el fin de verificar que la SCP era responsable de la desactivación de C5a, se construyeron los mutantes de inserción y de eliminación de scpA49 tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, y se evaluó su actividad. Cuando se introdujeron inserciones o eliminaciones en el scpA49, la SCP variante no fue capaz de destruir la adherencia de las PMNs a las placas de microtitulación activada por C5a.
Se evaluó el impacto de las mutaciones en el scpA49 sobre la virulencia usando un modelo animal en el que los estreptococos permanecían localizados, y en el que pudiera analizarse el influjo de células inflamatorias. Para evaluar la hipótesis de que la SCP actúa rápidamente para retardar la eliminación inicial del organismo, se comparó el destino de estreptococos SCP^{+} y SCP^{-} 4 horas después de la inoculación de sacos de aire de tejido conectivo. Además, también se determinó la diseminación de estreptococos a los nodos y bazos linfáticos después de este corto periodo de tiempo.
Para todos los experimentos se usaron ratones criados CD 1 machos (25 g) obtenidos del Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MA. Se generó un saco de aire de tejido conectivo inyectando 0,9 mL de aire y 0,1 mL de estreptococos de grupo A diluidos en PBS con una aguja de medida 25 bajo la piel del dorso del ratón. En algunos experimentos se usó el SCP^{+} CS101 :: pG^{+}host5 como control positivo. En otros experimentos se usó la cepa CS101Sm como control positivo. Los ratones fueron sometidos a eutanasia mediante dislocación cervical 4 horas después de la infección. En donde se indica, en los cuatro nodos linfáticos inguinales, el bazo y el saco de aire fueron diseccionados de los animales y homogeneizados en PBS. Se evaluaron las unidades de formación de colonia (CFU) viables de las suspensiones de tejido en placas de agar sanguíneo que contenían 1 \mug/mL de eritromicina o 200 \mug/mL de estreptomicina.
En un experimento preliminar se fijaron los sacos de aire sobre portaobjetos, se tiñeron con tinte de Wright y se examinaron microscópicamente. Aunque el conteo de granulocitos con este método no es fiable, parecía haber significativamente menos SCP^{-} residuales que estreptococos naturales en el tejido fijado. Se llevaron a cabo experimentos adicionales en un intento de medir esta diferencia. Las poblaciones celulares dispersas de los sacos de aire se prepararon moliendo el saco de aire en PBS y haciéndolos pasar a través de tamiz de monofilamento de Nylon (TETKO Co. Nueva York).
Las células fueron paletizadas mediante centrifugación durante 5 minutos a 300 x g, y resuspendidas a 5 x 10^{6}/mL en tampón FACS (disolución salina equilibrada de Hank sin rojo de fenol, NaN_{3} al 0,1%, fracción V de BSA al 1,0%). Las células (1,0 x 10^{6}) fueron teñidas directamente con 1 \mug de FITC anti-ratón Mac-1, o indirectamente con 1 \mug de Biotina conjugada anti-ratón Gr-1 seguida de 1 \mug de Estreptavidina marcada con fluorescencia o con FITC. Los anticuerpos monoclonales, Mac-1 y Gr-1, se obtuvieron de Pharmingen, Inc. CA. Las células marcadas se fijaron en paraformaldehído al 1,0%. Se generaron los perfiles de fluorescencia usando un flujocitómetro FAC-Scan y software Consort (Becton Dickinson). Se purificaron PMNs de ratón a partir de sangre entera mediante centrifugación de gradiente de densidad Ficoll Hypaque y se usaron como patrón para PMNs definidas en poblaciones mixtas. Para la medida de células marcadas específicamente, se determinó la fluorescencia media de cada marcador de anticuerpo y se fijaron puertas para reflejar células intensamente marcadas. Los controles incluyeron células no teñidas y células expuestas únicamente a FITC de estreptavidina.
Se realizaron dos experimentos. El primero comparó el mutante M16 de inserción del scpA49 con su cultivo SCP^{+} parental, la cepa CS101. El segundo comparó el mutante MJ3-15 de eliminación del scpA49 con el original, la cepa CS101Sm. (Tabla 2). En ambos experimentos los sacos de aire de ratones inoculados con estreptococos de SCP contenían un menor número de estreptococos después de 4 horas que los sacos de aire inoculados con estreptococos naturales. El primer experimento presentó una reducción a la mitad y el segundo presentó una reducción a un cuarto. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas a P<0,05 y P<0,001, respectivamente, usando un ensayo t no emparejado. También se observó que había estreptococos SCP^{+} naturales en homogenatos de bazo en 7 de 8 ratones y en 6 de 8 ratones; mientras que raramente se encuentran mutantes SCP^{-} en el bazo. Para los homogenatos de nodos linfáticos se obtiene el resultado opuesto. Los nodos de 10 de 16 ratones infectados con estreptococos SCP^{-} alojaron estreptococos viables; mientras que sólo 4 de 16 nodos de ratones infectados con estreptococos naturales contenían bacterias viables. Se determinó que esta diferencia era estadísticamente significativa a P<0,05 usando el ensayo exacto de Fisher.
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TABLA 2 Distribución de estreptococos SCP^{+} y SCP^{-} 4 horas después de la infección de sacos de aire
2 
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La eliminación más rápida de estreptococos de sacos de aire se obtuvo en el reclutamiento más intenso de PMNs. Se comparó la población total de células en sacos de aire, el porcentaje de granulocitos Mac-1 positivos (Springer, G. y col., "Mac-1: macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody", Eur. J. Immunol. 9: 301-306 (1979)), y el porcentaje de PMN Gr-1 positivo (Brummer, E. y col., "Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for fungal killing: Studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in vitro", L Leuko. Bio, 36: 505-520 (1984)) mediante análisis FACS de color sencillo. Clark, J. M., "A new method for quantification of cell-mediated immunity in the mouse", J. Reticuloendothel. Soc. 25: 255-267 (1979). En resumen, en un análisis FACS, se marcan células individuales en suspensión con monoanticuerpos fluorescentes específicos. Se inyectan alícuotas de células marcadas en un flujocitómetro FAC-Scan o en un clasificador de células fluorescentes que contabiliza las células en base a su fluorescencia característica.
Los sacos de aire infectados con el mutante de eliminación SCP^{-} contenían el doble de células inflamatorias que los inoculados con estreptococos SCP^{+} (Figura 4). Un aumento de 100 veces en el tamaño del inóculo no alteró esta diferencia. Los sacos de aire infectados con 1 x 14^{6} células SCP^{-}, cepa MJ3-15, contenían tres veces más células Gr-1 positivas que aquellos inoculados con el cultivo de SCP^{+}. En los sacos de aire inoculados con estreptococos SCP^{+} aproximadamente el 6% de las células eran PMNs y el 21% eran otros tipos de granulocitos Mac-1^{+}, incluyendo PMNs. Por el contrario, los sacos de aire inoculados con estreptococos SCP^{-} contenían predominantemente PMNs. Las células Gr-1 positivas estaban presentes en números iguales o superiores a los de las células Mac-1 positivas. Se fijaron las puertas de citómetro de flujo para medir únicamente granulocitos de alta tinción. El resto de células no teñidas con ningún anticuerpo, el 70-80%, eran probablemente granulocitos de baja tinción, células sanguíneas rojas o linfocitos. Microscópicamente se observaron grandes números de linfocitos en preparaciones de sacos de aire sometidos a tinción Wright.
Las colonias SCP^{+} de estreptococos que emergieron de homogenatos de bazo eran altamente encapsuladas, asemejándose a gotas de agua. Por el contrario, las pocas colonias SCP^{-} que surgieron de nodos linfáticos fueron más parecidas al inóculo. Eran mezclas de colonias no mucoides y moderadamente mucoides. Estos datos sugieren que los estreptococos M^{+}SCP^{+} encapsulados se pueden adaptar, multiplicar e invadir la corriente sanguínea en las 4 horas siguientes a la infección. La base de las diferencias en el tráfico de estreptococos mutantes y naturales puede ser el influjo más vigoroso de células fagocíticas en respuesta a bacterias SCP^{-}. Los macrófagos y/o las células dendríticas pueden atrapar más rápidamente estreptococos SCP y llevarlos a los nodos linfáticos. La reducción de estreptococos mutantes en relación a los naturales es un descubrimiento inesperado, debido a que los estreptococos SCP^{-} son M^{+} y resistentes a la fagocitosis por neutrófilos humanos in vitro.
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Ejemplo 3 Se Requiere SCP para la Colonización de la Nasofaringe de Ratón
Se inocularon ratones intranasalmente para evaluar la capacidad relativa de estreptococos naturales (SCP^{+}) y SCP^{-} para colonizar la nasofaringe. En estos experimentos se usaron la cepa de M49 resistente a estreptomicina, CS101, y el mutante de eliminación MJ3-15. Los cultivos no se expusieron a ratones con el fin de evitar la selección de variantes que pudieran ser virulentas únicamente para ratones, pero que ya no dependieran de la proteína M y/o de SCP para su persistencia en el animal.
Se administraron intranasalmente cultivos de dieciséis horas de exposición a cepas estreptococales (1 x 10^{8} - 9 x
10^{8} CFU), cultivados en caldo de Todd-Hewitt que contiene un 20% de suero de conejo normal y resuspendidos en 10 \muL de PBS, a CD1 hembra de 25 g (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA) o a ratones BALB/c (Sasco, Omaha NE). Los conteos viables se determinaron llevando diluciones de los cultivos a placas de agar sanguíneo. Se tomaron diariamente muestras de garganta de ratones anestesiados durante de 6 a 10 días después de la inoculación y se llevaron a placas de agar sanguíneo que contenían 200 \mug/mL de estreptomicina. Tras una incubación de una noche a 37ºC, se contabilizó el número de colonias \beta-hemolíticas en las placas. Todas las cepas de exposición fueron marcadas mediante resistencia a estreptomicina para distinguirlas de las bacterias \beta-hemolíticas que pueden persistir en la flora normal. Se cultivaron muestras de garganta sobre agar sanguíneo que contenía estreptomicina. La presencia de una colonia \beta-hemolítica se consideró un cultivo positivo.
Ratones CD1 criados fueron inoculados intranasalmente con 2 x 10^{8} CFU de fase estacionaria. Se tomaron muestras diarias de las nasofaringes de los ratones anestesiados durante 8-10 días y se llevaron a agar sanguíneo que contenía estreptomicina. Las diferencias entre SCP^{+} y SCP^{-} fueron evidentes en el día 1, sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas hasta los días 3 y 4 (Figura 5). Para el cuarto día, 9/18 ratones infectados con estreptococos M^{+}SCP^{+} produjeron cultivos de garganta positivos, mientras que únicamente 2/18 ratones infectados con la cepa M^{+}SCP^{-} retuvieron estreptococos en sus gargantas. Cuatro de 18 ratones murieron como consecuencia de la infección con estreptococos SCP^{+}. Ninguno de los ratones sometidos a infección con bacterias SCP^{-} sucumbieron a la infección. El número de colonias en las placas de agar sanguíneo también fue consistente con una eliminación más rápida de estreptococos SCP^{-}. Por ejemplo, al tercer día los cultivos de siete ratones contenían > 100 CFU de SCP^{+}, mientras que sólo un ratón inoculado con estreptococos SCP^{-} contenía > 100 CFU.
Debido a que los estreptococos M49 se asocian más a menudo a infecciones de la piel, los anteriores experimentos se repitieron con una cepa M6, un serotipo asociado más a menudo a infecciones de garganta. Se construyó un mutante de inserción, la cepa AK1.4, usando la UAB200 de cepa M6 y la estrategia descrita previamente en el Ejemplo 1. La cepa AK1.4 también se eliminó más rápidamente de la nasofaringe que el cultivo natural de M6. (Figura 6). Los anteriores experimentos confirman que los estreptococos de grupo A dependen de SCP para su persistencia en la nasofaringe de ratones. Todas las variantes SCP^{-} usadas en los anteriores experimentos fueron M^{+}, es decir, resistieron la fagocitosis por sangre humana fresca. Aún así, fueron eliminados de la mucosa nasofaríngea.
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Ejemplo 4 Inmunización Intranasal de Ratones con Bloques de SCPA49 Recombinante Purificada. Colonización tras Exposición Intranasal
a)
Construcción de vacuna recombinante \DeltaSCPA49 que codifica de Thr^{63} hasta His^{1031} (Figuras 2 y 7). Se clonó un fragmento PCR que corresponde a una forma truncada del gen scpA49 a partir de estreptococos CS101 M49 de grupo A (\DeltaSCPA49). Este fragmento se amplificó mediante PCR usando un cebador delantero que comienza en el nucleótido 1033 y un cebador inverso que empieza en el nucleótido 3941 (numeración correspondiente a la de Chen, C., y Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", L Biol. Chem., 265: 3161-3167 (1990)). El fragmento se ligó a la posición de unión de trombina del gen de glutationa transferasa sobre el vector de alta expresión pGex-4T-1 de Pharmacia Inc. El plásmido que contenía el fragmento scpA recombinante, designado pJC6, ha sido depositado en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, bajo las condiciones del Tratado de Budapest, y se le ha asignado el número de acceso ATCC 98225.
\quad
El \DeltaSCPA49, un fragmento de 2908 pb del scpA49, se amplificó mediante PCR usando un cebador delantero de scpA49 que contiene una secuencia de reconocimiento BamHI (5'-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3') (SEQ ID NO: 9). Las secuencias que codifican las regiones de péptido señal y de anclaje de membrana de la proteína SCPA fueron eliminadas del producto PCR resultante. Los productos PCR fueron digeridos con BamHI y ligados a posiciones de restricción de BamHI y de SmaI en la zona de reconocimiento de trombina del gen de glutationa S-transferasa del vector de alta expresión pGEX-4T-1 de Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ). El plásmido recombinante se transformó en DH5\alpha de E. coli. La proteína de fusión \DeltaSCPA49 de un transformante, E. coli (pJC6), se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de glutationa Sepharose 4B. Todos los métodos han sido descritos por el fabricante (Pharmacia). El \DeltaSCPA49 fue separado de la proteína híbrida mediante digestión de trombina. La trombina fue eliminada de la SCP eluida mediante cromatografía en una columna de benzamidina Sepharose 6B (Pharmacia). Después de la digestión con trombina, se eliminó la trombina mediante cromatografía en una columna Sepharose 6B de benzamidina. Los métodos de expresión y de purificación han sido descritos por el fabricante. Se confirmó que la proteína purificada por afinidad era \DeltaSCPA49 mediante SDS-PAGE y mediante ensayo de transferencia Western. Esta proteína \DeltaSCPA49 truncada, purificada por afinidad, carecía de actividad de peptidasa cuando se evaluó mediante el ensayo de adherencia de PMN (descrito en el anterior Ejemplo 1). Se preparó antisuero hiperinmune, dirigido contra \DeltaSCPA49 purificada, en conejos.
b)
Protocolo de inmunización y de exposición. Se inmunizaron ratones CD1 criados hembra de cuatro semanas de edad mediante administración de 20 \mug de \DeltaSCPA49 purificada por afinidad en 10 \muL de PBS en cada fosa nasal. Los ratones fueron inmunizados 3 veces en días alternativos y estimulados de nuevo tres veces después de la tercera inmunización. Tras un descanso de dos semanas, los ratones fueron estimulados otra vez. D. Bessen y col., "Influence of Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci", Infect. Immun., 56, pág. 2666-2672 (1988). Los ratones de control únicamente recibieron PBS. Antes de la infección, se determinó mediante ELISA que todos los ratones que fueron inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 tenían títulos elevados de anticuerpos contra antígeno \DeltaSCPA49 en su suero y saliva. Se usaron estreptococos de grupo A, cepa CS101 (2,0 x 10^{8} CFU), CS210 (3,6 x 10^{8} CFU), CS463 (7,8 x 10^{8} CFU), 90-131 (3,4 x 10^{8} CFU) y UAB200 (9,6 x 10^{8} CFU) para exponer nasalmente a los ratones 7 días después de la estimulación de la última vacuna. Los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las guías de los Institutos Nacionales de Salud.
c)
Toma de muestra y ELISA. Se tomaron muestras de sangre y de saliva de los ratones anestesiados después de la inmunización. En todos los sueros se evaluó la presencia de anticuerpos SCPA49 mediante ELISA, tal como se ha descrito previamente. S. P. O'Connor y col., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase", J. Infect. Dis., 163, pág. 109-116 (1990). Se unió proteína SCPA49 purificada a pocillos de microtitulación mediante adición de 500 ng de proteína purificada en tampón de bicarbonato 0,05 M (pH 9,6). Después de una incubación de una noche a 4ºC los pocillos fueron lavados, y entonces bloqueados con BSA al 0,5% en PBS durante 1 hora. Se estimuló la salivación en los ratones mediante inyección de 100 \muL de una disolución de pilocarpina al 0,1% (Sigma) subcutáneamente. Se tomaron muestras de saliva y se giraron a 14.000 rpm durante 5 minutos en una microcentrífuga Eppendorf. Se evaluó la presencia en los sobrenadantes de proteína \DeltaSCPA49 contra IgA secretora mediante ELISA. Los títulos de ELISA representan la mayor dilución de suero y saliva de individuo que presentaba una OD_{405}\geq0,1.
d)
Evaluación de la Respuesta de Anticuerpos a \DeltaSCPA49
\quad
Se evaluó la inmunogenicidad de la vacuna de subunidad \DeltaSCPA49. Se inmunizaron conejos con \DeltaSCPA49 purificada. Los conejos desarrollaron niveles elevados de anticuerpos contra proteína \DeltaSCPA49, determinados mediante ELISA. Aunque el inmunógeno \DeltaSCPA49 purificado carecía de actividad funcional, el antisuero de conejo hiperinmune pudo neutralizar la actividad de peptidasa de enzima SCPA49 natural purificada in vitro. Además, el antisuero de conejo sin diluir contra proteína \DeltaSCPA49 fue capaz de neutralizar la actividad de peptidasa C5a asociada a diferentes serotipos (Figura 8). La actividad de peptidasa C5a asociada a estreptococos M1, M6 y M12 intactos fue inhibida por este antisuero, confirmando que el anticuerpo contra proteína \DeltaSCPA49 carece de especificidad de serotipo.
\quad
Asimismo, se obtuvieron muestras de suero y de saliva de diez ratones inmunizados y de diez ratones de control para determinar la inmunogenicidad de la proteína \DeltaSCPA49 cuando se administra a través de la ruta intranasal sin adyuvantes. Los ratones que estaban inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 purificada desarrollaron títulos elevados de IgG específico de \DeltaSCPA49 en sus sueros, en comparación con los ratones de control inmunizados con PBS (Figura 9). Los títulos de IgG en suero dirigido contra \DeltaSCPA49 oscilaron entre 1:10.240 y 1:20.480. Por el contrario, el título de IgG específico de \DeltaSCPA49 de los ratones de control no fue detectable en suero. Los ratones inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 purificada también mostraron un aumento significativo en el sIgA salivar específico de \DeltaSCPA49 comparados con los ratones de control. Los títulos de sIgA específicos en saliva de los ratones inmunizados fueron mayores de 1:16. Por el contrario, el sIgA dirigido contra \DeltaSCPA49 en la saliva de los ratones de control no era detectable. Las concentraciones relativas de IgG y de sIgA en suero diluido 1/2560 y en saliva diluida 1/2, respectivamente, se muestran en la Figura 9. Estos resultados demuestran que la proteína \DeltaSCPA49 purificada es un inmunógeno eficaz para la inducción de respuestas sistémicas específicas y de segregación de anticuerpos en ratones cuando se administra intranasalmente.
e)
Impacto de la vacuna de \DeltaSCPA49 sobre la Eliminación de Estreptococos de Ratones Infectados
\quad
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si la inmunización con la peptidasa C5a potenciaría la eliminación de estreptococos de la nasofaringe. Los sueros humano y de conejo hiperinmunes que contienen ambos altos niveles de anticuerpos anti-SCPA pueden neutralizar la actividad de SCPA in vitro. S. P. O'Connor y col., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase", J. Infect. Dis., 163, pág. 109-116 (1990). El hecho de que la SCPA facilite significativamente la colonización de la mucosa oral sugiere que la inmunización de ratones con \DeltaSCPA49 purificada podría reducir la capacidad de los estreptococos para colonizar la nasofaringe. Los ratones fueron inmunizados intranasalmente con SCPA purificada por afinidad, desactivada genéticamente, para evaluar esta posibilidad. La proteína truncada, \DeltaSCPA49, fue administrada intranasalmente sin adyuvantes o vehículos. La colonización faríngea de los ratones vacunados por los estreptococos naturales M^{+} SCPA^{+} difirió significativamente de los inmunizados con PBS en tres experimentos independientes usando ratones vacunados con dos preparaciones diferentes de proteína \DeltaSCPA49 purificada (Tablas 3 y 4; Figura 10). Únicamente uno de los 13 ratones inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 dio positivo en el cultivo de estreptococos diez días después de la inoculación (Tabla 4; Figura 10). Por el contrario, el 30-58% de los controles no vacunados permaneció con cultivos positivos durante seis días, y algunos todavía daban positivo diez días después de la infección. El número de coloniza \beta-hemolíticas, resistentes a estreptomicina sobre placas de agar sanguíneo también mostró una diferencia significativa entre los ratones vacunados con \DeltaSCPA49 y los de control. Diferentes grupos de ratones inmunizados eliminaron los estreptococos de serotipo M49 significativamente más rápidamente de sus nasofaringes que los ratones de control no inmunizados.
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TABLA 3 Cultivos de garganta para estreptococos después de exposición intranasal de ratones vacunados intranasalmente con PBS o con SCP expresada en DH5\alpha de E. coli (CFU después de la vacuna)
4
5 
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TABLA 4 Cultivos de garganta para estreptococos después de exposición intranasal de ratones vacunados intranasalmente con PBS o con SCP expresada en DH5\alpha de E. coli (CFU después de la vacuna)
6
7
Por último, se examinó si la SCP de un serotipo vacunaría a los animales contra la infección de otros serotipos. Existen más de 80 serotipos diferentes de estreptococos de grupo A. Una vacuna eficaz debería prevenir la infección de más de un serotipo estreptococal. Se produjo una protección cruzada frente a la colonización por los serotipos estreptococales OF^{+} M2 y M11, y frente a los serotipos OF^{-} M1 y M6. El hecho de que el suero de conejo dirigido contra proteína \DeltaSCPA49 procedente de estreptococos de serotipo M49 neutralizase la actividad de peptidasa asociada a varios serotipos sugirió que la inmunización intranasal con una vacuna de subunidad sencilla podría reducir o eliminar la colonización faríngea de esos serotipos. Para explorar esta posibilidad se inmunizaron cuatro grupos de veinte ratones mediante inoculación intranasal con proteína \DeltaSCPA49 purificada mediante afinidad tal como se ha descrito anteriormente. Los ratones de control recibieron PBS. Antes de ser expuestos a estreptococos, se evaluó la presencia de anticuerpos anti-SCPA en muestras de suero y de saliva de ratones inmunizados y de control seleccionados aleatoriamente. Todos los ratones inmunizados evaluados habían desarrollado una fuerte respuesta de suero y de anticuerpos mensurables en saliva. La colonización faríngea de ratones inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 por cepas de los cuatro serotipos se redujo en relación a los controles no inmunizados. Las diferencias fueron más significativas en los días 3 y 5 después de la inoculación (Tabla 5).
TABLA 5 La protección inmune depende del serotipo
8
Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los ratones inmunizados y los de control inoculados con las cepas de serotipos M2, M11 y M1. Sin embargo, los serotipos OF^{+} M2 y M11 fueron eliminados más eficazmente por los ratones inmunizados que las cepas OF^{-}, M1 y M6. La colonización de estreptococos M1 de ratones inmunizados se vio significativamente reducida en comparación con los ratones de control. Únicamente el 10,5% de los ratones inmunizados dieron cultivos positivos en el día 5 después de la infección. Por el contrario, el 37% de los ratones de control dieron cultivos positivos con esta cepa. Aunque los ratones inmunizados parecían eliminar más rápidamente los estreptococos M6, las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Como en experimentos previos, el número de colonias estreptococales \beta-hemolíticas sobre placas de agar sanguíneo fue significativamente menor en las muestras tomadas de ratones vacunados que en las tomadas de los animales de control. Por tanto, la proteína \DeltaSCPA49 fue una vacuna eficaz que proporcionó una protección cruzada contra otros serotipos estreptococales.
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Ejemplo 5 Mutagénesis de SCPA49 dirigida a posición
Los serotipos estreptococales de grupo A pueden dividirse en dos grupos principales, las cepas OF^{+} y las OF^{-}. Las últimas se asocian más a menudo a fiebre reumática y a choque tóxico, mientras que las cepas OF^{+} son una causa común de impétigo y de glomerulonefritis aguda. Aunque las proteínas SCPA de estos grupos son idénticas en un 95-98%, es posible que la respuesta inmune contra ellas pueda ser algo diferente. Esta incertidumbre hizo que se dedicaran esfuerzos a desarrollar SCPAs variantes definidas a partir de una cepa M1 OF^{-} y a partir de una cepa M49 OF^{+} en paralelo. Los aminoácidos requeridos para la actividad catalítica fueron sustituidos por otros que se esperaba desactivaran la enzima (Figura 1). Las fronteras de aminoácidos N y C-terminales de la SCPA49, expresaron los subclones pGEX-4T-1, fueron Asn^{32} e His^{1139}, respectivamente (Figuras 1 y 8). Ser^{512} (SCPA49SS12A), Asn^{295} (SCPA49N295A) y Asp^{130} (SCPA49D130D) en la proteína SCPA49 fueron sustituidos por Ala, y Asn^{295} (SCPA49N295R) fue sustituido por Arg (Deborah Stafslien, M. S. Tesis, Universidad de Minnesota).
El método usado para introducir mutaciones en el gen scpA49 de la cepa CS101 de Estreptococos fue el método de "megacebador" de mutagénesis dirigida a posición. Barik, S., "Site directed mutagenesis in vitro megaprimer PCR", en: Methods in Molecular Biology, Vol. 57: In Vitro Mutagenesis Protocols, Humana Press, Inc. Totowa, NJ (1996). La mutación de serina se introdujo usando los cebadores scpFor940 (5'-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAA
GACACTCC-3'), SEQ ID NO: 10, y scpmutrev1883 (5'-TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3'), SEQ ID NO: 11, para amplificar un producto de PCR de doble cadena de 1450 pb. Este primer producto de PCR, un "megacebador", fue purificado usando el Kit de Extracción de Gel Qiagen Qiaquick, usado a continuación en una segunda reacción PCR asimétrica para amplificar el gen scpA49 de 3,3 kb que contiene la mutación deseada. Se llevaron a cabo cinco ciclos de desnaturalización (93ºC, 1 minuto) y de extensión (72ºC, 5 minutos) antes de la adición del cebador inverso scpRev4263, (3'-CCCCCCCT-CGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG-3'), SEQ ID NO: 12. Durante el quinto ciclo a 72ºC, se añadió el cebador inverso a una concentración de 1 mM. Se completó la amplificación usando 25 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2-3,5 minutos. Las concentraciones de reactivos fueron las mismas descritas en la sección previa, excepto que no se añadió un cebador delantero y que el megacebador se añadió en una concentración de 4-6 \mug por cada 100 \muL de reacción. Este proceso dio lugar a una proteína variante SCPA49S512A (véase la Tabla 6 mostrada a continuación).
Las variantes de aspartato y de asparagina se construyeron aproximadamente del mismo modo, usando los cebadores inversos scpmutrev717 (5'-CAGTGATTGATG-CTGGTTTTGATAA-3') SEQ ID NO: 13 y scpmutrev1214 (5'-AGCTACTATCAGCAC-CAG-3') SEQ ID NO: 14 para construir megacebadores de 311 pb y de 805 pb, respectivamente. El cebador scpmutrev717 se usó para generar la proteína variante SCPA49D130A, y el cebador scpmutrev1214 se usó para generar la proteína variante SCPA49N295A (véase la Tabla 6 mostrada a continuación). Tras purificación con Qiaquick, sin embargo, el megacebador fue tratado con 0,1 U de nucleasa de soja verde (por cada 4 \mug de ADN) e incubado a 30ºC durante 10 minutos. Se eliminó la nucleasa mediante extracción con fenol/cloroformo, y el megacebador se recuperó en la fase acuosa mediante precipitación con etanol. Se resuspendió la partícula en 80 \muL agua esterilizada destilada doblemente, y se usaron 37 \muL de ésta en cada 100 \muL de reacción PCR asimétrica. A continuación se clonó el gen mutado en pGEX 4T-1 como se ha descrito previamente. Se llevó a cabo el secuenciamiento de las variantes usando dATP marcado con ^{35}S y el kit Sequenase (Stratagene), o usando secuenciamiento fluorescente en la Instalación Microquímica de la Universidad de Minnesota.
TABLA 6 Comparación de la secuencia de aminoácidos de proteínas variantes
9 
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El vector de expresión de E. coli pGEX 4T-1 se usó para sobreexpresar SCPA variantes como proteínas de fusión GST. Se purificó SCPA variante de acuerdo con le protocolo proporcionado en el GST Gene Fusion System Handbook (Pharmacia), anterior a este trabajo. El antígeno de proteína SCPA se purificó mediante cromatografía de afinidad tal como se ha descrito anteriormente.
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Ejemplo 6 Construcción de las Variantes SCPA1 y SCPB
Se amplificó el gen natural scpA1 mediante PCR a partir del serotipo M1 de S. pyogenes (cepa 90-226) de la siguiente manera. Se diseñaron cebadores de tal modo que sólo un fragmento del gen completo fuera expresado. Este fragmento corresponde al inicio de la proteína madura y termina justo antes del dominio asociado a la pared celular, del residuo Asn^{32} al Asp^{1038} (Figura 2). El cebador delantero 5'-CCCCCCGAATTCATTACTGTG ACA
GAAGACACTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 15) se templa comenzando en el número de base 940 (numeración correspondiente a la de Chen, C., y Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265: 3161-3167 (1990). El opuesto, el cebador de PCR inversa, 5'-CCCCCCGGATCCTTATTGTTCTGGTTTATT-AGA GTGGCC-3' (SEQ ID NO: 16) se templa en el número de base 3954 justo por encima de una región de repeticiones de ADN. Se predice que esta región de repetición de la proteína es la parte que pasa y se une al peptidoglicano de la pared celular. La región en cursiva de cada cebador es secuencia adicional que se ha añadido a la secuencia de S. pyogenes para permitir el proceso de clonación. La región subrayada del cebador delantero incorpora una posición de restricción EcoRI, y la porción subrayada del cebador inverso una posición BamHI. El cebador inverso también incorpora un codón de parada (TAA) en la estructura del gen que termina la traducción.
El producto PCR resultante correspondiente a las bases 940-3954 se clonó en un vector intermedio pCR2.1 (Invitrogen, Inc.) y se transformó en células Top10F de E. coli (Invitrogen, Inc.). Se restringió con EcoRI y BamHI ADN de plásmido procedente de un transformante apropiado. El fragmento de 3018 bases, que contiene el fragmento de scpA1, fue purificado en gel siguiendo procedimientos estándar y fue ligado en el vector de expresión pTrc99a (Pharmacia) restringido con las mismas enzimas. Dicha ligación se transformó en células DH5\alpha de E. coli y se seleccionó un transformante que contenía la construcción de plásmido deseada. El plásmido resultante coloca al fragmento de PCR de scpA1 detrás de una secuencia Shine-Dalgamo y de la posición de inicio ATG, y está bajo el control transcripcional del Promotor trc, que es inducible con el análogo IPTG de alolactosa.
Las variantes genéticas específicas de posición del scpA1 natural fueron construidas siguiendo un procedimiento descrito por C. L. Fisher y G. K. Pei, "Modification of a PCR-based site-directed mutagenesis method", BioTechniques, 23: 570-574 (1997). Se predijeron los residuos de aminoácido apropiados dentro de SCPA1 que son importantes para la actividad de proteasa mediante comparaciones de secuencia con la familia de serina proteasas de tipo subtilisina. Siezen, R. J. y col., "Homology modeling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases", Protein Engineering, 4: 719-737 (1991); Chen, C. y Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265: 3161-3167 (1990). Tres residuos, conservados en esta familia, están implicados en la formación del centro activo. En la SCPA1, corresponden a Asp^{130}, His^{193} y Ser^{512}. Se designaron tres conjuntos de oligonucleótidos no solapados para su uso en PCR para alterar cada uno de estos residuos de aminoácido. Dichos oligonucleótidos fueron diseñados para amplificarse por separado en cepas opuestas de ADN. En cada conjunto, el extremo 5' de uno de los cebadores contendría el codón que codifica uno de estos aminoácidos para la mutación, y dicho codón sería alterado para codificar una alanina. Estos tres conjuntos de cebadores se enumeran a continuación; los codones cambiados se presentan en
cursiva.
\newpage
D130A:
Delantero (SEQ ID NO: 17)
5' - ATT GCT GCT GGT TTT GAT AAA AAT CAT GAA GCG - 3'
El cambio de codón GAT por GCT corresponde a un cambio de aminoácido de aspartato por alanina.
Inverso (SEQ ID NO: 18)
5' - CAC TGC AAC AAC AGT CCC - 3'
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H193A:
Delantero (SEQ ID NO: 19)
5' - GAG GCC GGC ACA CAC GTG - 3'
El cambio de codón CAC por GCC corresponde a un cambio de aminoácido de histidina por alanina.
Inverso (SEQ ID NO: 20)
5' - TTG ATC GAC AGC GGT TTT ACC - 3'
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S512A:
Delantero (SEQ ID NO: 21)
5' - ACT GCT ATG TCT GCT CCA TTA G - 3'
El cambio de codón ACT por GCT corresponde a un cambio de aminoácido de serina por alanina.
Inverso (SEQ ID NO: 22)
5' - TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C
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Estos conjuntos de cebadores PCR fueron usados en tres reacciones separadas. El ADN de molde fue pLP605, que contenía la secuencia de scpA1 natural. Los productos PCR fueron auto-ligados posteriormente y transformados en la cepa de E. coli Top10F' (Invitrogen, Inc.). Se escrutó los transformantes para encontrar el tamaño y el patrón de restricción apropiados. El cambio de secuencia en la variante S512A destruye una posición de restricción SpeI única de tal modo que esta mutación podría ser identificada directamente mediante análisis de restricción. Todas las variantes potenciales fueron confirmadas mediante secuenciamiento de ADN. Posteriormente, la mutación D130A se combinó con la mutación S512A para formar una variante doble utilizando una posición PstI única entre estas dos regiones de la proteína. La alteración final fue cambiar la selección antibiótica de ampicilina a canamicina moviendo los genes de scpA 1 variantes a un vector pTRC99a alterado previamente (Pharmacia, Inc.) que contiene el gen de canamicina.
Se construyó una variante de la proteína SCPB usando el método antes descrito para los mutantes de SCPA1. El gen SCPB natural se clonó a partir de estreptococos de grupo B 78-471 (Tipo II^{a+}).
Ejemplo 7 Análisis de Proteínas Variantes
Se analizaron las proteínas expresadas a partir de cada una de las construcciones variantes mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. El tamaño esperado para la proteína es de 121 kD, sin embargo, el dominio rico en prolina que se extiende por la pared celular en el extremo carboxi de la enzima provoca que la proteína avance ligeramente más despacio durante el análisis SDS-PAGE. Por lo tanto, el peso molecular aparente es de 130 kD cuando se determina con SDS-PAGE. Puesto que la SCP activa podría ser dañina para el hospedante, era importante que las proteínas variantes carecieran de actividad enzimática. Se evaluaron dos propiedades de las proteínas variantes. Las actividades específicas de las proteínas naturales y variantes, determinadas mediante el ensayo de adherencia de PMN, se comparan en la Tabla 7. Estos experimentos indicaron que los aminoácidos sustituidos redujeron la actividad enzimática en más de un 90%.
TABLA 7 Determinación de la actividad de proteasa variante mediante el ensayo de adherencia PMN 
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10 
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Las proteínas variantes también se compararon con la proteína natural en cuanto a su capacidad para unirse a anticuerpos dirigidos contra la enzima natural. Se usaron ensayos competitivos ELISA para este fin. Los ELISAs competitivos midieron la inhibición de anticuerpos que se unen a antígeno inmovilizado mediante antígeno soluble. Se unió una cantidad constante de antígeno natural a los pocillos de la placa de microtitulación. Se añade una cantidad constante de anticuerpos al mismo tiempo con cantidades variables de antígeno soluble competitivo. La pendiente de las curvas de inhibición porcentual frente a concentración de antígeno estima la afinidad de unión relativa del antígeno soluble por el anticuerpo. Aunque las constantes de unión no pueden calcularse sin conocer la concentración exacta de anti-SCPA en el antisuero, se compararon las afinidades de unión relativas de varias proteínas (Figura 11). Puesto que las pendientes de las curvas de inhibición porcentual frente a concentración son iguales para las proteínas naturales y variantes, se concluyó que la sustitución de aminoácidos no alteró la capacidad del anticuerpo para unirse a las proteínas variantes.
También se determinó que las proteínas SCPA1, SCPA49 y SCPB se unen igual de bien a anticuerpos anti-SCP (Figura 12). En este experimento el antígeno de placa fue SCPA49 y el anticuerpo fue anti-SCPA49 de conejo. Las afinidades relativas de este anticuerpo por estos antígenos, indicadas por la pendiente de las curvas, son muy similares. Estos resultados demuestran que la proteína SCPA de Estreptococos de grupo A M49 OF^{+} y OF^{-}, y de estreptococos de grupo B, son equivalentes respecto al reconocimiento de anticuerpos y pueden usarse indistintamente en una preparación de vacuna.
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Ejemplo 8 La Administración Subcutánea (SQ) de Antígeno de SCPA Induce Protección en Ratones
Todos los anteriores estudios de protección fueron realizados administrando intranasalmente sin adyuvante proteína SCPA49 purificada por afinidad. Históricamente, la inyección intramuscular o SQ de antígenos es un método preferido y más aceptado de administración de vacunas. Por tanto, se realizaron experimentos para evaluar si las inyecciones SQ de SCPA con MPL/alumbre inducían una respuesta inmune protectora y si dicha respuesta reducía la colonización cuando se exponía a una cepa de estreptococos de grupo A de serotipo diferente al de la fuente de SCPA de la vacuna. Se evaluó la capacidad de ratones inmunizados para eliminar estreptococos de la mucosa faríngea oral-nasal mediante cultivos de garganta o tomando muestras de tejido nasal diseccionado. Los datos de cultivos de garganta más representativos se muestran en la Tabla 8.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 8 Vacunación subcutánea de ratones
11
Los ratones inmunizados mediante inyección SQ de cada una de las tres formas diferentes de antígeno de SCPA indujeron una protección moderada. La inmunización con ASCPA49 protegió simultáneamente contra las cepas M1 OF^{-} y M49 OF^{+}. Para el siguiente estudio se seleccionaron la SCPA49S512A y la SCPA1S512A.
También se determinó la persistencia de los estreptococos después de la exposición intranasal mediante un ensayo más cuantitativo. Este método implicó el sacrificio de grupos de ratones a diferentes tiempos después de la infección, y la disección del tejido nasal (NT), que a continuación fue evaluado para determinar los estreptococos viables (CFU). Se homogeneizaron cantidades estándar de NT en un tampón y se determinó el número de CFU/mg de tejido mediante conteo viable.
Se inmunizaron SQ tres grupos de ratones con SCPA49S512A, con SCPA1S512A o con toxoide del tétanos. Todas las vacunas se mezclaron con adyuvantes de MPL/alumbre como anteriormente. Los ratones recibieron cuatro inyecciones de 5 \mug de antígeno de proteína y entonces fueron expuestos a infección dos semanas después de la última inyección. Se recolectó el tejido nasal 16 horas después de la exposición a la cepa CS101 de M49 OF^{+}. En la Tabla 9 se muestran las medias geométricas de CFU/mg de tejido.
TABLA 9 Medias geométricas de CFU/mg de tejido nasal
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El número de estreptococos asociado a tejido nasal disminuyó con el tiempo, tal como era de esperar, y el descenso fue más rápido y completo en los ratones inmunizados con antígeno de SCPA. Todos los grupos de ratones que habían sido inmunizados con SCPA retuvieron menos estreptococos que los ratones de control. En este experimento, la inmunización con SCPA1S512A fue la más eficaz e indujo una respuesta de protección cruzada, ya que la cepa de exposición CS101 es M49 OF^{+} y la fuente de proteína de la vacuna es SCPA1S512A procedente de una cepa M1 OF^{-}. Estos resultados confirman que un único antígeno de SCPA puede inducir protección contra serotipos heterólogos. La protección la proporcionan los anticuerpos que neutralizan la actividad de peptidasa sobre la superficie bacteriana. Esto incrementa el influjo de fagocitos en unas pocas horas a partir del momento en que se depositan los estreptococos sobre el tejido mucosal. Se supone que la rápida eliminación de estreptococos por acción de fagocitos evita la posterior multiplicación y persistencia de las bacterias. Los ratones presentaron uniformemente títulos en suero de IgG de 1:32.000 o superiores cuando se evaluaron mediante ELISA, lo que indica que la inyección SQ de antígeno de SCPA con adyuvante indujo consistentemente una vigorosa respuesta de anticuerpos.
Ejemplo 9 La Peptidasa C5a de Estreptococos de Grupo B es Prácticamente Idéntica en Secuencia a la de los Estreptococos de Grupo A M12 y M49
Se clonó el gen de peptidasa C5a de estreptococos de grupo B (SCPB), se secuenció y se comparó con el de los estreptococos de grupo A, M12 y M49. El gen scpB completo se amplificó mediante PCR usando cebadores que correspondían a las porciones de la secuencia de scpA12 usando el método descrito antes. El gen SCPB codifica un marco de lectura abierto (ORF, del inglés "open reading frame") de 3450 pb, que especifica una proteína de 1150 aminoácidos con Mr de 126.237 Da. La secuencia de aminoácidos de SCPB se muestra en la Figura 2. La comparación del nucleótido de scpB y de la secuencia de aminoácidos deducida para los de estreptococos de grupo A M12 y M49 mostró grandes similitudes, del 98% y del 97%, respectivamente. El scpB contenía una eliminación de 50 pb que solapaba con dos de las repeticiones C-terminales, y que presentaba otras varias diferencias menores en relación a los genes scpA. El alineamiento de las secuencias demostró que el scpA12 en realidad está más próximo filogenéticamente al scpB que al scpA49. Treinta cepas, que representan los serotipos III, III/R, II, Ia/c, NT/c, NT/c/R1, portan una copia de scpB.
La SCP recombinante se expresó en E. coli usando el vector plásmido de expresión pGEX-4T-1 (número de acceso ATCC 98225) y se demostró que es idéntica a la enzima extraída de la cepa 78-471 estreptococal parenteral de grupo B (Tipo II a+ b). El análisis de transferencia Western sugirió que la SCP recombinante es idéntica a la enzima C5asa purificada previamente a partir de estreptococos de grupo B.
<110> Regents of the University of Minnesota et al.
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<120> Vacuna de Peptidasa de C5a Estreptococal
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<130> 600.450WO1
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<160> 23
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<170> FastSEQ para Version de Windows 3.0
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<210> 1
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<211> 1164
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<212> PRT
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<213> Streptococcus pyogenes 
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<400> 1
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13
14
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16
17 
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<210> 2
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<211> 1167
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18
19
20
21
22 
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23
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26 
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gggggggaat tcgtagcggg tatcatggga c 
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gggggggaat tcgggtgctg caatatctgg c 
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aaggacgaca cattgcgta 
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ccccccggat ccaatactgt gacagaagac actcc 
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tttctggaac tagtatgtct gcgcc 
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ccccccctcg agatgtaaac gatttgtatc cttgtcatta g 
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41 
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cagtgattga tgctggtttt gataa 
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ccccccgaat tcattactgt gacagaagac actcctgc 
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tccagaaagt ttggcatact tgttgttagc c 
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<400> 23
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Claims (13)

1. Una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de un péptido aislado y purificado que comprende una Peptidasa C5a Estreptococal (SCP) enzimáticamente inactiva, cuya cantidad es eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Estreptococos \beta-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, en donde la SCP es una variante de SCP natural en la que la SCP variante presenta una sustitución en los residuos de aminoácido correspondientes a los aminoácidos 130 y 512 de la SEQ ID NO: 1.
2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que la SCP se expresa a partir de una secuencia de ADN aislada que codifica SCP.
3. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la SCP presenta una cavidad de especificidad de residuos de aminoácido contiguos correspondiente aproximadamente a los residuos entre el residuo 260 y el residuo 417 de la SEQ ID NO: 1, o un dominio catalítico de residuos de aminoácido contiguos correspondiente aproximadamente a los residuos entre el residuo 130 y el residuo 512 de la SEQ ID NO: 1.
4. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la sustitución es una sustitución conservada.
5. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la SCP variante varía adicionalmente de la SCP natural en que no contiene una secuencia señal y/o un injerto de pared celular.
6. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la SCP es una variante de SCP procedente de Estreptococos de grupo A, de Estreptococos de grupo B, de Estreptococos de grupo C o de Estreptococos de grupo G.
7. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende una cantidad eficaz de un adyuvante inmunológico.
8. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el mamífero es humano, perro, bovino, porcino o equino.
9. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el Estreptococo \beta-hemolítico es un Estreptococo de grupo A, un Estreptococo de grupo B, un Estreptococo de grupo C o un Estreptococo de grupo G.
10. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la SCP se conjuga o se une a un péptido o a un polisacárido.
11. La vacuna de la reivindicación 10, en la que el péptido o polisacárido conjugado o unido a la SCP es de otro patógeno.
12. La vacuna de la reivindicación 11, en la que el polisacárido de otro patógeno es un polisacárido estreptococal de grupo A, un polisacárido-C de Estreptococos de grupo B o un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae o de Estreptococos de grupo B.
13. El uso de la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para la protección contra la colonización o la infección de Estreptococos \beta-hemolíticos.
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