PT1137785E - Vacina estreptocócica de peptidade c5a - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "VACINA ESTREPTOCÓCICA DE PEPTIDADE C5a"
Antecedentes de Invenção
Existem várias espécies de estreptococos β-hemolíticas diferentes que foram identificadas. 0 Streptococcus pyogenes, também denominada streptococci do grupo A, é um patogénio bacteriano comum de humanos. Principalmente uma doença de crianças, provoca uma variedade de infecções, incluindo faringite, impetigo e sepsia em humanos. Subsequentemente à infecção, podem ocorrer em humanos complicações auto-imunitárias, tais como febre reumática e glomerulonefrite aguda. Este patogénio também provoca doenças agudas graves, tais como escarlatina, fascite necrozante e choque tóxico. A garganta irritada, provocada por um streptococci de grupo A, normalmente denominado "garganta strep" é responsável por, pelo menos, 16% de todas as chamadas ao domicílio na prática médica, dependendo da estação. Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975," J. Hyg. Camb., 87:109-129 (1981). Esta espécie é também a causa do recente ressurgimento, na América do Norte e quatro outros continentes, de choque tóxico associado a fascite necrozante. Stevens, D. L., "Invasive group A streptococcus infections," Clin. Infect. Dis., 14:2-13 (1992). Também implicados em provocar garganta strep e, ocasionalmente em provocar choque tóxico, estão os grupos streptococci C e G. Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the throat: A study 1 J. Hyg. Camb., 87:109-129 in a small population, 1962-1975," (1981) .
Os streptococci do Grupo B, também conhecidos como Streptococcus agalactiae, são responsáveis por sepsia neonatal e meningite. T.R. Martin et al., "The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats", J. Infect Dis., 165:306-314 (1992). Embora frequentemente um membro da flora da mucosa vaginal de fêmeas adultas, desde 0,1 até 0,5/1000 recém-nascidos desenvolvem doença séria após infecção durante o parto. Apesar da mortalidade elevada devido a infecções com streptococci do grupo B, os mecanismos da patogenicidade são mal conhecidos. Martin, T. R., et al., "The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats," J. Infect Dis., 165:306-314 (1992).
As infecções estreptocócicas são frequentemente tratadas por terapêutica com antibiótico. Todavia, 25-30% das tratadas têm doença recorrente e/ou eliminam o organismo nas secreções da mucosa. Presentemente não existem meios disponíveis para prevenir infecções estreptocócicas. Historicamente, o desenvolvimento de vacina estreptocócica focou-se na proteína M da superfície da célula da bactéria. Bessen, D., et al., "Influence of intranasal imunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of protein M on mucosal colonization by group A streptococci," Infect. Immun., 56:2666-2672 (1988); Bronze, M. S., et al., "Protective immunity evoked by locally administered group A streptococcal vaccines in mice," Journal of Immunology, 141:2767-2770 (1988). 2
Dois problemas principais limitarão a utilização, divulgação e, possivelmente aprovação pela FDA, de uma vacina de proteína M. Em primeiro lugar, existem mais de 80 serotipos diferentes de M de S. pyogenes e surgem continuamente novos serotipos. Fischetti, V. A., "Streptococcal M protein: molecular design and biological behaviour", Clin. Microbiol. Rev., 2:285-314 (1989).
Assim, a inoculação com uma proteína M específica para o serotipo não será provavelmente eficaz na protecção contra outros serotipos Μ. O segundo problema refere-se à segurança de uma vacina de proteína M. Algumas regiões da proteína M contêm epitopos antigénicos que reagem imunologicamente de forma cruzada com tecido humano, particularmente tecido cardíaco. O terminal N de proteínas M são bastante variáveis em sequência e especificidade antigénica. Será necessária a inclusão de mais do que 80 péptidos diferentes, representando esta sequência variável, numa vacina, para atingir uma vasta protecção contra infecção estreptocócica do grupo A. Novas variantes da proteína M continuarão a surgir, com necessidade de vigilância constante de doença estreptocócica e alterações na composição da vacina. Em contraste, os terminais carboxilo da proteína M são conservados na sequência. Esta região da proteína M, contém contudo, uma sequência de aminoácidos que reage imunologicamente de forma cruzada com tecido cardíaco humano. Pensa-se que esta propriedade da proteína M contribui para danos na válvula cardíaca associados com a febre reumática. P. Fenderson et al., "Tropomyosinsharies immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins", J. Immunol. 142:2475-2481 (1989). Num ensaio precoce, crianças que foram vacinadas com proteína M em 1979 apresentaram uma incidência dez vezes superior de febre reumática e danos associados na válvula cardíaca. Massell, B. F., et al., "Rheumatic fever following streptococcal vaccination, JAMA, 207:1115-1119 (1969). 3
Outras proteínas em consideração para o desenvolvimento de vacinas são as toxinas eritrogénicas, a exotoxina A pirogénica estreptocócica e a exotoxina B pirogénica estreptocócica. Lee, P.K., et al., "Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness," J. Clin. Microb., 27:1890-1892 (1989). A imunidade contra estas proteínas pode prevenir os sintomas mortais do choque tóxico, mas não pode prevenir a colonização por streptococci. O documento WO 97/26008 divulga vacinas para utilização contra a colonização de Streptococcus β-hemolíticos que compreendem a peptidase C5a estreptocócica ou fragmentos ou mutantes desta. Stafslien e Cleary (Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology, 1998, Vol 98, página 59) divulgam que o método de megainiciador de mutagénese dirigida a um sítio foi utilizado para introduzir uma mutação no gene scpA49 que alterou o sítio activo de serina presumido da protease para uma alanina. Esta mutação não afectou a capacidade da proteína para se ligar a anticorpo policlonal, como determinado por transferência de Western e ELISA competitiva. A mutação, todavia, eliminou a capacidade da enzima para clivar C5a in vitro como determinado utilizando um ensaio de aderência de PMN.
Assim, permanece uma necessidade continuada para um meio eficaz para prevenir ou melhorar infecções estreptocócicas. Mais especificamente, existe uma necessidade para desenvolver composições úteis em vacinas para prevenir ou melhorar a colonização de tecidos hospedeiros por streptococci, reduzindo
desse modo a incidência de garganta strep e impetigo. A 4 eliminação de sequelas, tais como febre reumática, glomerulonefrite aguda, sepsia, choque tóxico e fascite necrozante seria uma consequência directa da redução da incidência de infecção aguda e transporte do organismo. Existe também uma necessidade para desenvolver composições úteis em vacinas para prevenir ou melhorar infecções provocadas por todas as espécies estreptocócicas β-hemolíticas, nomeadamente os grupos A, B, C e G.
Sumário da Invenção A presente invenção proporciona uma vacina, eficaz para imunizar um mamifero susceptivel contra Streptococcus β-hemolítica. 0 mamífero susceptivel pode ser um humano ou um animal doméstico, tal como um cão, uma vaca, um porco ou um cavalo. Essa imunização pode prevenir, melhorar ou reduzir a incidência da colonização por Streptococcus β-hemolítica no mamífero. A vacina compreende uma quantidade imunogénica de um péptido isolado e purificado, compreendendo uma Peptidase C5a estreptocócica enzimaticamente inactiva (SCP), cuja quantidade é eficaz para imunizar um mamífero susceptivel contra
Streptococcus β-hemolítica, em combinação com um veículo não tóxico fisiologicamente aceitável, em que a SCP é uma variante da SCP tipo selvagem em que a variante de SCP possui uma substituição nos resíduos de aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 130 e 512 da SEQ ID N°: 1.
Uma "variante" de SCP é um polipéptido ou oligopéptido de SCP que não é completamente idêntico à SCP nativa. Uma tal variante de SCP pode ser obtida alterando a sequência de aminoácidos por inserção, deleção ou substituição de um ou mais 5 aminoácidos. A sequência de aminoácidos da proteína é modificada, por substituição, para criar um polipéptido possuindo substancialmente as mesmas qualidades, ou melhoradas, em comparação com o polipéptido nativo. A substituição pode ser uma substituição conservada. Uma "substituição conservada" é uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. Uma substituição conservada seria uma substituição com um aminoácido que produz a menor alteração possível na carga do aminoácido ou no tamanho da cadeia lateral do aminoácido (alternativamente, no tamanho, carga ou tipo de grupo químico na cadeia lateral), de modo a que o péptido global retenha a sua conformação espacial, mas possua actividade biológica alterada. Por exemplo, alterações conservadas comuns podem ser Asp por Glu, Asn ou Gin; His por Lys, Arg ou Phe; Asn por Gin, Asp ou Glu e Ser por Cys, Thr ou Gly. A alanina é normalmente utilizada para substituir por outros aminoácidos. Os 20 aminoácidos essenciais podem ser agrupados como se segue: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina possuindo cadeias laterais não polares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina e glutamina possuindo cadeias laterais polares não carregadas; aspartato e glutamato possuindo cadeias laterais acídicas; e lisina, arginina e histidina possuindo cadeias laterais básicas. L. Stryer, Biochemistry (2a ed.) p. 14-15; Lehninger, Biochemistry, p. 73-75.
As alterações de aminoácidos são alcançadas alterando os codões da sequência de ácidos nucleicos correspondente. É conhecido que esses polipéptidos podem ser obtidos com base na substituição de certos aminoácidos por outros aminoácidos na estrutura do polipéptido de modo a modificar ou melhorar, a actividade antigénica ou imunogénica. Por exemplo, através da 6 substituição de aminoácidos alternativos, podem ser conferidas pequenas alterações conformacionais num polipéptido que resultam em actividade aumentada ou resposta imunitária aumentada. Alternativamente, as substituições de aminoácidos em certos polipéptidos podem ser utilizadas para proporcionar resíduos que podem então ser liqados a outras moléculas para proporcionar conjugados péptido-molécula que retêm propriedades antigénicas suficientes do polipéptido de partida para serem úteis para outros objectivos.
Pode utilizar-se o índice hidropático de aminoácidos para conferir função biológica interactiva num polipéptido, em que se observa que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos possuindo índices hidropáticos semelhantes e ainda assim reter uma actividade biológica semelhante. Alternativamente, a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser realizada com base na hidrofilicidade, particularmente em que a função biológica desejada no polipéptido a ser gerada se destina a utilização em formas de realização imunológicas. A hidrofilicidade média local mais elevada de uma "proteína", como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade. Patente U.S. 4554101. Consequentemente, observa-se que as substituições podem ser realizadas com base na hidrofilicidade atribuída a cada aminoácido.
Utilizando o índice de hidrofilicidade ou o índice hidropático, que atribui valores a cada aminoácido, é preferido realizar as substituições de aminoácidos em que estes valores são ± 2, sendo ± 1 particularmente preferido, e sendo aqueles com ± 0,5 as substituições muito preferidas. 7 A SCP variante compreende, pelo menos, sete resíduos de aminoácidos, de um modo preferido cerca de 100 até cerca de 1500 resíduos e, de um modo mais preferido, cerca de 300 até cerca de 1200 resíduos e, de um modo ainda mais preferido, cerca de 500 até cerca de 1180 resíduos, em que a SCP variante possui pelo menos 50%, de um modo preferido pelo menos cerca de 80%, e de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90%, mas menos do que 100% de homologia ou identidade de sequências de aminoácidos contíguas com a sequência de aminoácidos de uma SCP nativa correspondente. A sequência de aminoácidos do polipéptido da SCP variante corresponde essencialmente à sequência de aminoácidos da SCP nativa. Como aqui utilizado "corresponde essencialmente a" refere-se a uma sequência de polipéptidos que irá induzir uma resposta imunológica protectora, substancialmente igual à resposta gerada pela SCP nativa. Uma tal resposta pode ser, pelo menos, 60% do nível gerado pela SCP nativa e pode mesmo ser, pelo menos, 80% do nível gerado pela SCP nativa.
Uma resposta imunológica a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imunitária celular e/ou mediada por anticorpo ao polipéptido ou vacina de interesse. Normalmente, uma tal resposta consiste em o indivíduo produzir anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas dirigidas especificamente contra um antigénio ou antigénios incluídos na composição ou vacina de interesse. A SCP pode ser uma variante de SCP de Streptococcus do grupo A (SCPA), Streptococcus de grupo B (SCPB), Streptococcus do grupo C (SCPC) ou Streptococcus do grupo G (SCPG).
Uma variante da invenção pode incluir resíduos de aminoácidos não presentes na SCP nativa correspondente ou deleções em relação à SCP nativa correspondente. Uma variante pode ser também um "fragmento" truncado, em comparação com a SCP nativa correspondente, i. e., apenas uma porção de uma proteína de comprimento total. Por exemplo, a SCP variante pode variar da SCP nativa na medida em que não contém uma inserção na parede celular. As SCP variantes também incluem péptidos possuindo, pelo menos, um D-aminoácido. A SCP variante da vacina pode ser expressa a partir de uma sequência de ADN isolada que codifica a SCP variante. Por exemplo, a SCP variante pode variar da SCP nativa na medida em que não contém uma sequência sinal ou uma inserção na parede celular. 0 ADN pode codificar a especificidade da fenda ou o domínio catalítico. Em particular, o ADN pode codificar os resíduos de aminoácidos 193 ou 295 do domínio catalítico, ou os resíduos de aminoácidos 260, 261, 262, 415, 416 ou 417 da especificidade da fenda, ou codificar modificações nesses resíduos. A SCP da vacina não tem actividade enzimática de C5ase ou actividade de peptidase. A vacina pode também conter um adjuvante imunológico. A vacina pode ser utilizada para prevenir a infecção por Streptococcus do grupo A, Streptococcus do grupo B, Streptococcus do grupo C ou Streptococcus do grupo G. A vacina pode compreender a peptidase C5a estreptocócica conjugada ou ligada a um péptido imunogénico ou a um polissacárido imunogénico. "Recombinante" é definido como um péptido ou ácido nucleico produzido pelos processos de engenharia genética. Os termos "proteína," "péptido" e "polipéptido" são aqui utilizados indistintamente. 9 A vacina da peptidase C5a estreptocócica pode ser administrada por injecção subcutânea ou intramuscular. Alternativamente, a vacina pode ser administrada por ingestão oral ou inoculação intranasal. São revelados no pedido outros péptidos de SCP isolados e purificados, em que a SCP é uma variante de SCP de tipo selvagem e polinucleótidos isolados e purificados codificando uma SCP variante. Estas SCP podem incluir os resíduos de aminoácido 130, 193, 295 ou 512 do domínio catalítico, ou resíduos de aminoácidos 260, 261, 262, 415, 416 ou 417 da fenda de especificidade. Estas SCP podem ser SCPA49D130A, SCPA49H193A, SCPA49N295A, SCPA49S512A, SCPA1D130A, SCPA1H193A, SCPA1N295A, SCPA1S512A, SCPBD130A, SCPBH193A, SCPBN295A, SCPBS512A ou ASCPA49.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1. Arquitectura da peptidase C5a de streptococci β-hemolitica. D indica um resíduo de ácido aspártico; H indica histidina; S indica serina; L indica leucina; P indica prolina; T indica treonina; e N indica asparagina. Ri, R2, R3 e R4 indicam sequências repetidas. Os números indicam a posição do resíduo de aminoácido na peptidase.
Figura 2. Alinhamento da sequência de aminoácidos de SCP de streptococci de grupo A serotipo 4 9 (SEQ ID N°:l), streptococci de grupo A serotipo 12 (SEQ ID N°:2), streptococci de grupo B (SEQ ID N°:3) e streptococci de grupo A serotipo 1 (SEQ ID N°:23). As sequências são idênticas, excepto em relação às posições de aminoácido 10 indicadas. 0 triângulo (V) indica o ponto de clivagem previsto da peptidase sinal. Os aminoácidos previstos para estarem no sitio activo da enzima estão marcados com asteriscos. As deleções na sequência de aminoácidos estão indicadas por pontos e estão em caixas. Os asteriscos (*) indicam os resíduos de aminoácidos do domínio catalítico.
Figura 3. Construção de mutantes de SCP por inserção e deleção. As caixas pretas indicam a região removida.
Figura 4. Análise de FACS de cor única. Os dados de fluorescência foram analisados por PMN à saída. Foi estabelecida uma segunda saída para contar as células de coloração elevada definida pela primeira saída. Os sacos de ar foram inoculados com 1 X 106 CFU.
Figura 5. Persistência de streptococci de tipo selvagem e SCPA“ serotipo M49 após infecção intranasal.
Figura 6. Comparação da capacidade de mutantes SCPA" de streptococcus do Grupo A serotipo M6 para colonizar murganhos após infecção intranasal. Compara murganhos BALB/c (dez em cada grupo experimental) inoculados com 2 X 107 CFU de streptococci M6. Foram cultivadas zaragatoas da garganta em cada dia em placas de agar sangue contendo estreptomicina. Os murganhos foram considerados positivos se as placas continham uma colónia β-hemolítica. Os resultados foram analisados estatisticamente pelo teste χ2.
Figura 7. Construção da vacina ASCPA49 e protocolo de imunização. 11
Figura 8. Anticorpo de coelho neutraliza a actividade de SCPA associada com diferentes serotipos. A barra 1 é um controlo positivo e continha rhC5a que não foi pré-incubado antes de desafio a PMN. A barra 10 é um controlo que não tem rhC5a. Bactérias inteiras, intactas, pré-incubadas com soro de coelho normal (barra 2, Ml 90-131; barra 4, M6 UAB200; barra 6, M12 CS24; barra 8, M49 CS101) ou pré-incubadas com soro de coelho anti-SCPA49 (barra 3, Ml 90-131; barra 5, M6 UAB200; barra 7, M12 CS24; barra 9, M49 CS101), foram incubadas com 20 pL de rhC5a a 5 μΜ durante 45 minutos. O rhC5a residual foi ensaiado pela sua capacidade para activar PMN para aderir aos poços da placa de microtitulação revestidos com BSA. Os PMN aderentes foram corados com violeta cristal.
Figura 9. Respostas de IgG do soro e IgA secretora após imunização intranasal de murganhos com a proteína ASCPA49 purificada. Os níveis de IgG específicos para SCPA49 no soro e saliva foram determinados por ELISA indirecta. Os soros de cada murganho foram diluídos para 1:2560 em PBS; a saliva foi diluída 1:2 em PBS. A Figura 9A apresenta os resultados experimentais de IgA; a Figura 9B apresenta os resultados experimentais de IgG.
Figura 10. Comparação da capacidade de streptococci de serotipo M49 para colonizar fêmeas de murganho CD1 imunizadas e não imunizadas. Cada grupo experimental continha 13 murganhos que foram infectados intranasalmente (i.n.) com 2,0 x 108 CFU. Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste χ2. As figuras 10A e 10B apresentam os resultados da experiência repetida. 12
Figura 11. Comparação, por ELISA Competitiva da ligação da SCP de tipo selvagem e variante ao anticorpo policlonal. 0 antigénio da placa é SCPA49 de tipo selvagem recombinante (100 ng/poço). O antigénio de competição é indicado pela legenda.
Figura 12. Comparação de ELISA Competitiva da ligação de SCPA1, SCPA49 e SCPB ao anticorpo policlonal. O antigénio da placa é SCPA49 de tipo selvagem recombinante (100 ng/poço). O antigénio de competição é indicado pela legenda. SCPAl e SCPA49 utilizados nas experiências apresentados nesta Figura compreenderam Asn32 até His1139. O SCPB utilizado nas experiências apresentadas nesta Figura foi produzido de acordo com Chmouryguina, I. et al.r "Conservation of the C5a Peptidase Gene in Group A and B Streptococci", Infect. Immun., 64:2387-2390 (1996).
Descrição Detalhada da Invenção
Uma primeira linha de defesa importante contra infecção por muitos patogénios bacterianos é a acumulação de leucócitos fagociticos polimorfonucleares (PMN) e células mononucleares no local da infecção. A atracção destas células é mediada por estímulos quimiotácticos, tais como factores do hospedeiro ou factores secretados pelo organismo invasor. O quimioatraente C5a é um pivot para a estimulação desta resposta inflamatória em mamíferos. C5a é um glicopéptido de 74 resíduos clivado a partir do quinto componente (C5) do complemento. As células fagocíticas respondem de um modo indirecto a um gradiente de C5a e acumulam-se no sítio da infecção. C5a pode ser o agente de atracção mais imediato de fagócitos durante a inflamação. À medida que os PMN 13 se infiltram numa lesão inflamatória eles segregam outras quimiocinas, tal como IL8, que intensificam ainda mais a resposta inflamatória. A peptidase C5a estreptocócica (SCP) é uma enzima proteolitica localizada na superfície de streptococci patogénicos onde destrói C5a, na medida em que a C5a é produzida localmente. A SCP cliva especificamente a quimiotaxina C5a no sítio de ligação a PMN (entre os resíduos His67-Lys68 de C5a) e remove os sete resíduos mais C-terminais de C5a. Esta clivagem do sítio de ligação a PMN elimina o sinal quimiotáctico. Cleary, P., et al., "Streptococcal C5a Peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992); Wexler, D. E., et al., "Mechanism of action of the group A streptococcal C5a inactivator," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:8144-8148 (1985) . SCP de streptococci do grupo A é uma protease da serina do tipo subtilisina com um Mr de 124814 da e com um motivo de âncora da parede celular que é comum a muitas proteínas de superfície bacterianas Gram positivas. A arquitectura da peptidase C5a é dada na Figura 1. A sequência de nucleótidos completa do gene da peptidase C5a estreptocócica de Streptococcus pyogenes foi publicada. Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Em contraste com as Subtilisinas, a SCP possui uma especificidade para o substrato muito estreita. Esta especificidade estreita é surpreendente à luz das semelhanças acentuadas entre os seus domínios catalíticos. Cleary, P., et al., "Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase," Infect. Immun., 60:5219-5223 (1992). Os resíduos envolvidos na transferência de 14 carga são conservados, como o são os resíduos em ambos os lados da bolsa de ligação. Todavia, a sequência restante de aminoácidos de SCP não está relacionada com a das Subtilisinas. Verificou-se que mais de 40 serotipos de streptococci de Grupo A produzem proteína SCP ou contêm o gene. Cleary, P., et al., "A streptococcal inactivator of chemotaxis: a new virulence factor specific to group A streptococci," em Recent Advances in Streptococci and. Streptococcal Disease p. 179-180 (S. Kotami e Y. Shiokawa ed.; Reedbooks Ltd., Berkshire, Inglaterra; 1984); Podbielski, A., et al., "The group A streptococcal virR49 gene Controls expression of four structural vir regulon genes," Infect. Immun., 63:9-20 (1995). O domínio catalítico ou sítio activo de SCP é composto pelo sistema de transferência de carga e a fenda de especificidade. O sistema de transferência de carga, que é parte do domínio catalítico, contém os resíduos Asp130, His193, Asn295 e Ser512 (Figs. 1 e 2) . Uma modificação, í. e., uma deleção, inserção ou substituição, de qualquer um destes aminoácidos irá inactivar a enzima. Prevê-se que a fenda de especificidade, por outro lado, seja formada por Ser260 , Phe261, Gly262 , Ile415, Tyr416 e Asp417. A modificação por substituição destes aminoácidos pode alterar a especificidade da enzima para o substrato ou eliminar a actividade proteolítica completamente. A modificação por deleção destes aminoácidos também pode inactivar a enzima. O domínio catalítico depende da estrutura terciária da proteína que é criada quando a enzima madura se dobra no seu estado activo. Este domínio não é formado por uma sequência linear contígua de resíduos de aminoácidos. Alternativamente, a modificação pode também reduzir a ligação da SCP variante ao substrato. A ligação pode ser reduzida em 50%, 70% ou mesmo 80%. 15 A enzima peptidase C5a associada com streptococci do grupo B também foi identificada. Hill, H.R., et al., "Group B streptococci inhibit the chemotactic activity of the fifth component of complement," J. Immunol. 141:3551-3556 (1988). 0 mapeamento de restrição e a totalidade da sequência de nucleótidos de scpB demonstrou que scpB é 97-98% semelhante a scpA: Ver Figura 2 para comparação da sequência de aminoácidos de SCP de streptococci do grupo A serotipo 4 9, streptococci grupo A serotipo 12, streptococci do grupo B e streptococci do grupo A serotipo 1 (SEQ ID N°:l, SEQ ID N°:2, SEQ ID N°:3 e SEQ ID N°:23, respectivamente) . Mais de 30 estirpes, que representam todos os serotipos de streptococci do grupo B comportam o gene scpB. Cleary P.P., et al. "Similarity between the Group B and A streptococcal C5a peptidase genes," Infect. Immun. 60:4239-4244 (1992); Suvorov A.N., et al., "C5a peptidase gene from group B streptococci," in Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and Enterococci p. 230-232 (G. Dunny, P. Cleary e L. McKay (ed.); American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 1991).
Isolados humanos de streptococci dos grupos G e C também contêm genes do tipo scpA. Algumas estirpes do grupo G demonstraram expressar actividade de protease especifica para C5a na sua superfície. Cleary, P. P., et al., "Virulent human strains of group G streptococci express a C5a peptidase enzyme similar to that produced by group A streptococci," Infect. Immun., 59: 2305-2310 (1991). Por isso, todos os serotipos (>80) de streptococci do grupo A, streptococci do grupo B, grupo C streptococci e grupo G streptococci produzem a enzima SCP. SCP auxilia na colonização de streptococci para colonizar um sitio de infecção potencial, tais como a mucosa da nasofaringe, 16 inibindo o influxo de glóbulos brancos fagociticos para o sitio de infecção. Isto impede a eliminação inicial de streptococci pelo hospedeiro. 0 impacto de SCP na inflamação, a quimiotaxia do leucócito C5a e a virulência estreptocócica foi examinada utilizando estirpes estreptocócicas com mutações bem definidas no gene estrutural da protease. As SCP variantes foram construídas por inserção de plasmídeo direccionada e por substituição do gene selvagem com scpA contendo uma deleção interna especifica. As variantes não possuíam actividade de protease C5a e não inibem a resposta quimiotáctica de PMN humanas ou de murganho para C5a in vitro.
Foi utilizado um modelo de saco de ar de tecido conjuntivo de murganho para confirmar que a SCP retarda o influxo de células fagocíticas e a eliminação de streptococci do sítio de infecção. Um saco de ar de tecido conjuntivo é criado injectando uma pequena quantidade de ar e PBS (com ou sem streptococci dentro dele) com uma agulha de calibre 25 sob a pele nas costas de um murganho. Boyle, M.D.P. et al., "Measurement of leukocyte chemotaxis in vivo," Meth. Enzymol., 162:101:115 (1988). No final da experiência, os murganhos foram sujeitos a eutanásia por deslocação cervical, os sacos de ar foram dissecados dos animais, e os sacos de ar homogeneizados no tampão. Uma vantagem do modelo de saco de ar é aquele em que o saco de ar permanece insuflado durante vários dias e livre de inflamação, a menos que seja injectado um irritante. Assim, as bactérias injectadas e a resposta inflamatória resultante permanecem localizadas durante curtos períodos de infecção. O modelo do saco de ar foi modificado para comparar a eliminação de SCP+ de tipo selvagem e streptococci SCP" (i. e., streptococci do grupo A que comportava uma variante de forma não 17 funcional de SCP), e para analisar o infiltrado celular num estádio precoce da infecção. As suspensões de tecido foram ensaiadas para streptococci viáveis em placas de agar sangue e o infiltrado celular foi analisado por separação de células por fluorescência (FACS). Na análise de FACS, as células individuais em suspensão são marcadas com monoanticorpos fluorescentes específicos. As fracções de células marcadas são injectadas num citómetro de fluxo FAC-Scan, ou separador de células por fluorescência, que conta as células com base na sua fluorescência única. As experiências utilizando o modelo de caso de ar indicam que os streptococci que eram SCP+ eram mais virulentos do que os streptococci que eram SCP“.
Foi realizado um estudo para medir a produção de anticorpo humano, tanto IgG como IgA, contra SCP em soro e saliva humanos. 0'Connor, SP, et al., "The Human Antibody Response to streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Dis. 163:109-16 (1991). Geralmente, os soros e a saliva de crianças jovens, não infectadas não tinham anticorpo contra SCP. Em contraste, a maioria dos espécimes de soros e saliva de adultos saudáveis possuía níveis mensuráveis de IgG anti-SCP e IgA de secreção específico para SCP (slgA anti-SCP). Soros agudos e de convalescência emparelhados de doentes com faringite estreptocócica possuíam níveis significativamente mais elevados de IgG anti-SCP do que soros de indivíduos saudáveis. Soros contendo concentrações elevadas de imunoglobulina anti-SCP foram capazes de neutralizar a actividade de SCP. A detecção deste anticorpo em >90% dos espécimes de saliva obtidos de crianças que tinham sofrido recentemente faringite estreptocócica demonstraram que as crianças podem produzir uma resposta de anticorpo. 18
Muito embora os indivíduos humanos tivessem produzido IgG e IgA contra SCP em resposta a uma infecção estreptocócica natural, não era conhecido se a imunoglobulina anti-SCP proporciona qualquer protecção contra a infecção. Além disso, não era conhecido se a proteína de SCP podia actuar como uma vacina contra a colonização ou infecção estreptocócica β-hemolítica. Em primeiro lugar, foi realizado um estudo para examinar o papel da SCP na colonização da nasofaringe. Após infecção intranasal com streptococci vivos do grupo A, foram realizadas culturas diárias da garganta durante até dez dias. Os streptococci de tipo selvagem e mutantes isogénicos deficientes em SCP foram comparados quanto à capacidade para persistir na garganta durante este período de dez dias. Como previsto, os streptococci mutantes deficientes em SCP foram eliminados da nasofaringe mais rapidamente. 0 mesmo modelo de murganho intranasal foi utilizado para testar a capacidade de SCP para induzir a imunidade que irá prevenir a colonização. Uma forma variante do gene scpA49 recombinante começando no nucleótido que codifica Thr63 foi clonado. Esta variante é referida como ASCPA49, e tem 2908 pb de comprimento (ver Exemplo 4 abaixo). A proteína SCP variante foi purificada a partir de uma E. coli recombinante por cromatografia de afinidade. Soros de coelhos foram vacinados intradermicamente com esta preparação de proteína com a actividade de SCP neutralizada in vitro. A proteína purificada (40 pg) foi administrada intranasalmente a murganhos durante um período de cinco semanas. Os murganhos imunizados eliminaram streptococci em 1-2 dias; uma vez que, as culturas de murganhos não imunizados permaneceram positivos durante até 10 dias. A experiência foi repetida em três conjuntos de murganhos, vacinados com três preparações separadas de uma proteína SCP. 19
Foram realizadas outras experiências para determinar se a imunização de um animal com um único antigénio deve prevenir a colonização por vários serotipos. ASCPA49 foi clonado num vector de expressão e expresso em E. coli. A proteína ASCPA49 variante purificada por afinidade demonstrou ser altamente imunogénica em murganhos e coelhos. Embora o imunogénio ASCPA49 variante purificado não tivesse actividade enzimática, induziu títulos elevados de anticorpos de coelho que foram capazes de neutralizar a actividade de peptidase associada a streptococci Ml, Μβ, M12 e M49 in vitro. Isto confirmou que os anticorpos antipeptidase não têm especificidade para o serotipo. Foram então imunizados intranasalmente quatro conjuntos de murganhos com a ASCPA4 9 variante purificada e cada um foi exposto a um streptococcus de grupo A de serotipo diferente. A imunização de murganhos com a proteína ASCPA49 estimulou níveis significativos de anticorpos slgA salivares e IgG de soro específicos e reduziu o potencial de streptococci Ml, M2, Μβ, Mil e M49 de tipo selvagem para colonizar. Estas experiências confirmam que a imunização com vacina de peptidase C5a estreptocócica é eficaz na prevenção da colonização da nasofaringe.
Também foram realizadas experiências para desenvolver SCP variantes de uma estirpe Ml OF" e da estirpe M49 0F+. Uma vez que a SCP activa pode ser prejudicial para o hospedeiro, foi importante que as proteínas variantes não tivessem actividade enzimática. Os aminoácidos que são necessários para actividade catalítica foram substituídos por aqueles que se espera que inactivem a enzima.
Foram avaliadas duas propriedades das proteínas variantes.
Primeiro, as actividades específicas das proteínas de tipo 20 selvagem e variante foram determinadas por ensaio de aderência a PMN. Estas experiências indicaram que os aminoácidos substituídos reduziram a actividade enzimática em mais de 90%. Segundo, as proteínas variantes foram também comparadas com a proteína de tipo selvagem quanto à sua capacidade para ligar o anticorpo dirigido contra a enzima de tipo selvagem. Foram utilizados ensaios de ELISA competitiva para este efeito. Os resultados indicaram que as substituições de aminoácido não alteraram a capacidade do anticorpo para se ligar às proteínas variantes.
Todos os estudos de protecção anteriores foram realizados por administração intranasalda proteína ASCPA49 purificada por afinidade sem adjuvante. A injecção intramuscular ou subcutânea (SQ) de antigénios, todavia, é historicamente um método preferido, mais aceite de distribuição de vacina. Por isso, foram realizadas experiências para testar se as injecções SQ de ASCPA com monofosforil lípido A (MPL) e alúmen (A1P04) induziram uma resposta imunitária protectora e se essa resposta reduziu a colonização quando a estirpe de desafio de streptococcus do grupo A diferiu no serotipo da fonte da vacina SCPA. A capacidade dos murganhos imunizados para eliminar streptococci da mucosa faríngea oral-nasal foi avaliada por cultura da garganta ou por amostragem de tecido nasal dissecado. O número de streptococci associados com tecido nasal diminuiu com o tempo, como esperado, e a diminuição foi mais rápida e completa em murganhos imunizados com antigénio SCPA. Os resultados confirmaram que um antigénio SCPA único pode induzir protecção contra serotipos heterólogos. A protecção é produzida pelo anticorpo que neutraliza a actividade de peptidase na superfície bacteriana. Isto aumenta o fluxo de fagócitos dentro 21 de algumas horas a partir do momento em que os streptococci são depositados no tecido da mucosa. Presume-se que a eliminação rápida de streptococci por fagócitos previna a multiplicação subsequente e persistência das bactérias. Assim, a injecção SQ do antigénio SCPA com adjuvante induziu consistentemente uma resposta de anticorpo vigorosa. A presente invenção proporciona assim uma vacina para utilização para proteger mamíferos contra a colonização ou infecção com Streptococcus β-hemolítica, compreendendo a referida vacina uma quantidade imunogénica de um péptido isolado e purificado compreendendo uma Peptidase C5a estreptocócica (SCP) enzimaticamente inactiva, cuja quantidade é eficaz para imunizar um mamífero susceptível contra
Streptococcus β-hemolítica em combinação com um veículo não tóxico fisiologicamente aceitável, em que a SCP é uma variante de SCP de tipo selvagem em que a variante SCP possui uma substituição em ambos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 130 e 512 de SEQ ID N°: 1. As vacinas da presente invenção também podem incluir quantidades eficazes de adjuvantes imunológicos, conhecidos por aumentarem uma resposta imunitária. A SCP pode ser conjugada ou ligada a outro péptido ou a um polissacárido. Por exemplo, podem ser empregues proteínas imunogénicas bem conhecidas na técnica, também conhecidas como "veículos". Proteínas imunogénicas úteis incluem hemorragia de lapa (KLH), albumina de soro bovino (BSA), ovalbumina, albumina de soro humano, globulina gama humana, imunoglobulina G de galinha e globulina gama de bovino. Polissacáridos imunogénicos úteis incluem o polissacárido estreptocócico do grupo A, polissacárido C de streptococci do grupo B, ou os polissacáridos capsulares de Streptococcus pnuemoniae ou streptococci do grupo B. Alternativamente, os polissacáridos ou proteínas de outros 22 patogénios que são utilizados como vacinas podem ser conjugados a, ligados a, ou misturados com SCP. A aplicação proporciona ainda moléculas de ácido nucleico isolado e purificado, e. g., moléculas de ADN, compreendendo um segmento de ácido nucleico pré-seleccionado que codifica pelo menos uma porção de uma peptidase C5a estreptocócica, i. e., que codificam SCP ou uma variante desta, como aqui descrito, e. g., SCPA49S512A, SCPA49D130A, SCPA49N295A, SCPA1S512A, SCPA1D130A, SCPA1N295A, ASCPA49, SCPBS512A, SCPBD130A, SCPBH193A ou SCPBN295A, ou qualquer combinação destas mutações. 0 pedido revela ainda uma cassete de expressão compreendendo um segmento de ADN pré-seleccionado que codifica para uma molécula de ARN que é substancialmente idêntica (de sentido) à totalidade, ou uma porção, de um ARN mensageiro (ARNm "alvo"), i. e., um ARNm de SCP endógena ou "nativa". 0 segmento de ADN pré-seleccionado na cassete de expressão está ligado operacionalmente a um promotor. Como aqui utilizado, "substancialmente idêntico" na sequência significa que duas sequências de ácido nucleico possuem pelo menos cerca de 65%, de um modo preferido cerca de 70%, de um modo mais preferido cerca de 90%, e de um modo ainda mais preferido cerca de 98%, de identidade da sequência de nucleótidos contíguas, uma em relação à outra. De um modo preferido, o segmento de ADN pré-seleccionado híbrida em condições de hibridação, de um modo preferido em condições de hibridação de restringência, com uma molécula de ácido nucleico codificando a SCP nativa correspondente.
Como aqui utilizado, "substancialmente puro" significa que uma espécie objecto é a espécie predominante presente (i. e., numa base molar está mais abundante do que quaisquer outra espécie individual na composição) e, de um modo preferido, uma 23 fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objecto compreende pelo menos cerca de 50 porcento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.
Geralmente, uma composição substancialmente pura irá compreender mais do que cerca de 80 porcento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, de um modo mais preferido, mais de cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, e cerca de 99%. De um modo muito preferido, a espécie objecto é purificada até, essencialmente, a homogeneidade (a espécie contaminante não pode ser detectada na composição através de métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente numa espécie macromolecular única.
Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico recombinante" ou "ácido nucleico pré-seleccionado," e. g., "sequência ou segmento de ADN recombinante" ou "sequência ou segmento de ADN pré-seleccionado" refere-se a um ácido nucleico, e. g., a ADN, que foi derivado ou isolado de qualquer fonte apropriada, que pode ser subsequentemente alterada quimicamente in vitro, de modo a que a sua sequência não ocorra naturalmente, ou corresponda a sequências que ocorram naturalmente que não estão posicionadas como estariam posicionadas num genoma que não foi transformado com ADN exógeno. Um exemplo de ADN pré-seleccionado "derivado" de uma fonte, seria uma sequência de ADN que está identificada como um fragmento útil num dado organismo, e que é depois sintetizado quimicamente na forma essencialmente pura. Um exemplo desses "isolados" de ADN de uma fonte seria uma sequência de ADN útil que é excisada ou removida da referida fonte por meio químico, e. g., através da utilização de endonucleases de restrição, de modo a que possa ser 24 posteriormente manipulada, e. g., amplificada, para utilização na invenção, através da metodologia de engenharia genética. A recuperação ou isolamento de um dado fragmento de ADN de uma digestão de restrição pode empregar a separação da digestão em gel de poliacrilamida ou agarose por electroforese, identificação do fragmento de interesse por comparação da sua mobilidade versus a dos fragmentos de ADN marcador de peso molecular conhecido, remoção da secção do gel que contém o fragmento desejado, e separação do gel do ADN. Ver Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981), e Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980). Por isso, "ADN pré-seleccionado" inclui sequências de ADN completamente sintéticas, sequências de ADN semissintéticas, sequências de ADN isoladas de fontes biológicas, e sequências de ADN derivadas de ARN, assim como as suas misturas.
Como aqui utilizado, o termo "derivado", em relação a uma molécula de ARN significa que a molécula de ARN possui identidade de sequência complementar a uma molécula particular de ADN.
Moléculas de ácido nucleico codificando sequência de aminoácidos variantes de uma SCP são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de sequências de aminoácidos variantes que ocorrem naturalmente) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida a um sitio), mutagénese por PCR, e mutagénese por cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante da SCP. 25
Para imunizar um indivíduo, a variante SCP, é administrada parentericamente, normalmente por injecção intramuscular ou subcutânea num veículo apropriado. São também aceitáveis outros modos de administração, todavia, tais como distribuição oral ou distribuição intranasal. As formulações de vacina conterão uma quantidade eficaz do ingrediente activo num veículo. A quantidade eficaz é suficiente para prevenir, melhorar ou reduzir a incidência da colonização de Streptococcus β-hemolítica no mamífero alvo. A quantidade eficaz é rapidamente determinada por um especialista na técnica. 0 ingrediente activo pode variar tipicamente desde cerca de 1% até cerca de 95% (p/p) da composição, ou mesmo superior ou inferior, de apropriado. A quantidade a ser administrada depende de factores, tais como a idade, peso e condição física do animal ou o indivíduo humano considerado para vacinação. A quantidade também depende da capacidade do sistema imunitário do animal para sintetizar anticorpos, e o grau de protecção desejado. As dosagens eficazes podem ser rapidamente estabelecidas por um especialista na técnica, através de ensaios de rotina estabelecendo curvas de resposta à dose. 0 indivíduo é imunizado por administração da SCP em uma ou mais doses. As doses múltiplas podem ser administradas como é necessário para manter um estado de imunidade a streptococci.
Formulações intranasais podem incluir veículos que nem provocam irritação à mucosa nasal nem perturbam significativamente a função ciliar. Podem ser empregues diluentes, tais como água, soro fisiológico aquoso ou outras substâncias conhecidas, com a invenção presente. As formulações nasais podem também conter conservantes, tais como, mas não limitados a, clorobutanol e cloreto de benzalcónio. Pode estar 26 presente um tensioactivo para aumentar a absorção das proteínas do indivíduo pela mucosa nasal.
As preparações líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas secas na forma de comprimidos ou um produto para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Essas preparações líquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podem incluir óleos alimentares), ou conservantes.
Para preparar uma vacina, a SCP purificada pode ser isolada, liofilizada e estabilizada. 0 péptido de SCP pode ser então ajustado para uma concentração apropriada, opcionalmente combinada com um adjuvante de vacina adequado, e embalado para utilização. Adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a tensioactivos, e. g., hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamónio, N,N-dioctadecil-N'-N-bis(2- hidroxietil-propano di-amina), metoxi-hexadecil-glicerol, e polióis plurónicos; polaniões, e. g., pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, carbopol; péptidos, e. g., dipéptido de muramilo, MPL, aimetilglicina, tuftsina, emulsões de óleo, alúmen e as suas misturas. Outros adjuvantes potenciais incluem as subunidades do péptido B da toxina lábil ao aquecimento de E. coli ou da toxina da cólera. McGhee, J.R., et al., "On vaccine development," Sem. Hematol., 30:3-15 (1993). Finalmente, o produto imunogénico pode ser incorporado em lipossomas para utilização numa formulação de vacina, ou pode ser conjugado com proteínas, tais como hemocianina de lapa (KLH) ou albumina de soro humano (HSA) ou outros polímeros. 27 A aplicação de SCP para vacinação de um a mamífero contra colonização oferece vantagens sobre outros candidatos a vacina. A prevenção da colonização ou infecção por inoculação com uma única proteína irá não apenas reduzir a incidência dos problemas muito comuns de garganta strep e impetigo, mas irá também eliminar sequelas, tais como febre reumática, glomerulonefrite aguda, sepsia, choque tóxico e fascite necrozante.
Os exemplos seguintes pretendem ilustrar, mas não limitar, a invenção. EXEMPLO 1
Construção e Análise In Vitro de Mutantes de Inserção e Deleção em scpA49 e scpA6 a) Estirpes bacterianas e condições de cultura. A estirpe CS101 de S. pyogenes é um serotipo M49, e estirpe positiva para opacidade de soro (0F+) . A CS159 é um isolado clínico com uma deleção que se estende através do agrupamento de genes M e scpA. Um derivado da estirpe CS101 espontâneo, resistente à estreptomicina, denominado CSlOlSm, foi seleccionado por plaqueamento de streptococci a partir de uma cultura em fase estacionária em triptose agar sangue contendo estreptomicina (200 pg/mL). As estirpes estreptocócicas CS210 e CS463 são derivados espontâneos, resistentes à estreptomicina, das estirpes OF+, classe II, serotipo M2, e Mil, respectivamente. As estirpes estreptocócicas 90-131 e UAB200 são derivados espontâneos resistentes à estreptomicina de isolados humanos OF", classe 28 I, serotipo Ml e M6 de streptococci do grupo A, respectivamente. CS 101: :pG+host5 é a estirpe CS 101 com pG+host5 integrado no cromossoma numa localização desconhecida, mas fora do aglomerado de genes scpA e emm. A estirpe de Escherichia coli ER1821 (de New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) foi utilizada como o recipiente para o vector suicida, plasmideo pG+host5. O plasmideo pG+host5 foi obtido de Appligene, Inc. Pleasanton, CA. Os streptococci foram cultivados em caldo de Todd-Hewitt suplementado com neopeptona a 2% ou extracto de levedura a 1%, ou em placas de triptose agar com sangue de ovelha a 5%. A estirpe de E. coli ER1821 contendo o plasmideo pG+host5 foi cultivada em caldo LB com eritromicina (300 pg/mL). Streptococci com o plasmideo pG+host5 foram cultivados em caldo Todd-Hewitt com extracto de levedura a 1% (THY) contendo 1 pg/mL de eritromicina (Erm) . SCP refere-se, geralmente, a peptidase C5a estreptocócica de Streptococcus β-hemolitica. SCPA1, SCPA12, SCPA49, SCPA6 são as peptidases especificas de Streptococcus M de grupo A serotipo 1, 12, 4 9 e 6 estirpes, respectivamente. O termo scpA refere-se ao gene codificando SCP de streptococci do grupo A. ScpAl, scpAl2, scpA6 e scpA49 são os genes que codificam as peptidases SCPA1, SCPA12, SCPA49 e SCPA6. SCPB e scpB referem-se à peptidase e ao gene de streptococci do grupo B. A sequência de aminoácidos para SCPA49 (SEQ ID N°:1), SCPA12 (SEQ ID N°:2), SCPAl (SEQ ID N°:23 e SCPB (SEQ ID N°:3) são apresentados na Figura 2. 29 b) Construção do mutante de inserção de scpA49. Mutantes de inserção bem definidos de scpA49 foram construídos utilizando métodos de plasmídeo de inserção e substituição de gene. Um fragmento interno scpA49 BglII - BamRI, o alvo de inserção, foi ligado no vector vai-vém termossensível pG+host5 para formar o plasmídeo pG::acpA1.2 e transformado em E. coli ER1821 (Figura 3) . 0 vector pG+host5 contém uma origem de replicação de E. coli que é activa a 39 °C, uma origem de replicação sensível à temperatura Gram positiva (activa a 30 °C e inactiva a 39 °C em streptococci) , e um gene de resistência a eritromicina para selecção. A temperatura elevada força o plasmídeo a integrar-se no ADN cromossómico de streptococci do grupo A por recombinante homólogo a frequências variando desde 10~2 até 10~3. O plasmídeo recombinante de ADN pG::scpA1.2 foi sujeito a electroporação em células de recipientes CS101. Os transformantes foram seleccionados em placas de THY-agar contendo 1 pg/mL de eritromicina a 30 °C. Os integrantes cromossómicos que resultaram da recombinação entre a inserção do plasmídeo e o scpA49 cromossómico foram seleccionados por resistência a eritromicina a 39 °C. Foram analisados dois mutantes de inserção, Ml 4 e M16. Os revertentes EmrS da estirpe Ml4 e M16 foram obtidos pela passagem em THY sem antibiótico a 30 °C e finalmente plaqueados a 37 °C sem selecção de Erm. As colónias que tinham perdido o plasmídeo foram isoladas para confirmar que o fenótipo mutante resultou da inserção do plasmídeo em scpA49, em vez de a partir de uma mutação simultânea não relacionada. 30 c) Construção de mutantes de inserção de scpA6. 0 mutante de inserção de scpA6 AK1.4 foi construído como descrito na secção (b) acima. 0 plasmídeo recombinante de ADN, pG:acpA1.2, contém um fragmento interno BglII-BindIII do gene scpA. Este plasmídeo foi sujeito a electroporação em células recipientes UAB200 e os transformantes foram seleccionados em placas de THY agar contendo eritromicina a 30 °C. Um integrante cromossómico de pG::scpA1.2, estirpe AK1.4, que resultou da recombinação entre a inserção do plasmídeo e o scpA6 cromossómico, foi seleccionado por cultura em meio de agar contendo eritromicina, a 39 °C. A inserção em scpA6 foi confirmada por transferência de Southern utilizando scpA como sonda e PCR, utilizando um iniciador de M13 universal (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (SEQ ID N°:6), específico para o plasmídeo e um iniciador de scpA For835 (5'-AAGGACGACACATTGCGTA-3') (SEQ ID N° : 7), específico para o scpA cromossómico de GAS. d) Introdução de uma deleção definida em scpA (Figura 3) .
Uma estirpe mutante com uma deleção interna definida para scpA49 foi construída para eliminar a possibilidade de as inserções em scpA49 poderem ser polares e reduzir a expressão de genes a jusante, genes desconhecidos que também podem contribuir para a virulência do organismo. Primeiro, uma deleção definida no fragmento BglII-HindIII de scpA foi produzida por PCR de dentro para fora com o iniciador 1 (5'-GGGGGGGAATTCGTAGCGGGTATCATGGGAC-3'), SEQ ID N°:4, e o iniciador 2 (5'-GGGGGGGAATTCGGGTGCTGCAATATCTGGC-3'), SEQ ID N°:5. Os nucleótidos sublinhados correspondem às sequências scpA com as coordenadas 2398 e 2322, respectivamente, e os nucleótidos a cheio correspondem a um sítio de reconhecimento de EcoRI. Os iniciadores foram 31 seleccionados para produzir uma deleção em grelha no gene scpA. Estes iniciadores copiam o ADN do plasmideo em direcções opostas e definem as fronteiras da deleção. Innis, M.A., et al., eds., "PCR Protocols A Guide to Methods and Applications" (Academic Press, 1990). O ADN do plasmideo pG::scpA1.2 foi utilizado como molde. O produto amplificado foi digerido com EcoRI e ligado ao plasmideo pG+host5. O plasmideo resultante pG::AscpAl.1 continha uma deleção interna de 7 6 pb para scpA. Esta deleção em grelha foi removida em 25 aminoácidos, incluindo a serina que forma parte do centro catalítico previsto das proteases serínicas. Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990) . Foi criado um sítio EcoRV no ponto da deleção. O ADN que se sobrepõe à deleção foi sequenciado para confirmar as fronteiras da deleção. 0 plasmideo pG::AscpAl.1, que contém a deleção, foi transformado em E. coli ER1821. As colónias foram seleccionadas para ErmR e depois rastreadas para a deleção de scpA apropriada utilizando ADN de plasmideo de miniprep restringido por EcoRI. As fronteiras precisas da deleção foram confirmadas por sequenciação de ADN. O plasmideo pG::AscpAl.1 foi sujeito a electroporação para a estirpe CSlOlSm, como descrito acima, depois os integrantes foram seleccionados cultivando em Erm a 39 °C. A integração do plasmideo no cromossoma da estirpe M49 CSlOlsm utilizando selecção a temperatura elevada. A localização da inserção foi confirmada por PCR. O crescimento de CSlOlSm (pG::AscpAl.1) a temperatura baixa sem selecção com 32 eritromicina resultou em segregação de frequência elevada de revertentes ErmS que perderam o plasmídeo por evento de deleção aleatória ou por excisão devido a recombinação entre as sequências de scpA duplicadas criadas pela inserção. Foram identificados dois mutantes de deleção, MJ2-5 e MJ3-15, e foram estudados em maior detalhe. A deleção cromossómica deixada para trás pela excisão de recombinação do plasmídeo pG::AscpAl. foi definida por PCR e hibridação de Southern para ADN digerido com EcoRV. e) Efeitos in vitro de mutações em SCP. 0 impacto de inserções e deleções na expressão de antigénio de SCP e actividade de peptidase foi avaliado por transferência de Western e ensaios de aderência de PMN. Os streptococci foram incubados em 100 mL de THY a 37 °C durante a noite. O sedimento da cultura foi lavado duas vezes em 5 mL de Acetato de Na a 0,2 M (pH 5,2), depois suspenso em 1 mL de tampão TE-sacarose (20% de sacarose, Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,0) e 40 pL de Mutanolisina. A mistura foi rodada a 37 °C durante 2 h, depois centrifugada 5 min a 4500 rpm. Os sobrenadantes continham inibidor de protease, fluoreto de sulfonilo de fenilmetilo (PMSF) a 100 mM. Os métodos de electroforese e transferência de Western foram realizados como descrito em Laemmli, R.U., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4," Nature 227:680-685 (1970). O primeiro anti-soro utilizado para detectar a proteína SCP em transferências de Western e de colónias foi preparado por imunização de um coelho com proteína de SCP purificada recombinante. A ligação foi detectada por conjugado de fosfatase alcalina com anticorpo anti-coelho. 33 A actividade de peptidase C5a foi medida utilizando um ensaio de aderência de PMN. Booth, S.A. et al., "Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil adherence function," J. Invest. Dermatol. 98:135-140 (1992). Após incubação de C5a (Sigma, St. Louis, MO) com extractos estreptocócicos ou protease purificada, a C5a residual pode activar PMN para se tornarem aderentes a paredes revestidas com BSA. Primeiro, os poços de microtitulação foram revestidos com BSA a 0,5% em PBS e incubados durante 1 h a 37 °C. Os PMN humanos foram isolados por centrifugação em Ficoll Hypaque (Sigma, St. Louis, MO). Foram incubados 40 pL de streptococci intactos ou extractos de proteína com 20 pL de C5a a 5 pM em 340 pL de PBS com glucose a 1% e CaCl2 a 0,1% a 37 °C durante 45 min. Os poços revestidos com
BSA foram lavados com PBS, e foram adicionados aos poços os PMN ressuspensos e C5a residual. A mistura foi incubada durante 45 min a 37 °C em C02 a 7%. Finalmente, os poços foram lavados para remover os PMN não aderentes. Os PMN aderentes foram corados com violeta cristal e a DOs70nm foi lida num leitor de ELISA. A densidade óptica é proporcional à quantidade de C5a residual ou inversamente proporcional à quantidade de actividade de SCP.
Extractos de mutanolisina de proteínas da superfície celular de culturas parentais e mutantes foram analisados por transferência de Western utilizando soro específico para SCPA. Os mutantes foram confirmados como não tendo SCPA. Os extractos de mutantes SCPA- AK1.4 e MJ3-15 não reagiram com soro anti-SCPA. As proteínas de SCPA do tamanho esperado foram observadas nos extractos das estirpes de tipo selvagem CS101 e UAB200. A incapacidade de estirpes mutantes AK1.4 e MJ3-15 para produzirem actividade de peptidase C5a foi verificada comparando a sua capacidade para destruir rhC5a. Desafio de PMN isolados a rhC5a induziu-os a tornarem-se aderentes a poços de microtitulação 34 revestidos com BSA. A incubação com streptococci ou SCPA purificado cliva especificamente rhC5a e alterou o seu potencial para activar PMN. Os PMN que responderam a rhCSa residual e se ligaram a poços revestidos com BSA, foram corados, depois medidos espectrofotometricamente. A incubação de rhC5a com culturas parentais de UAB200 e CS101 destruíram rhC5a, que inibiu a aderência de PMN por 58,8% e 54,5%, respectivamente. Em contraste os mutantes SCPA", AK1.4 e MJ3-15, não alteraram rhC5a ou a aderência de PMN aos poços revestidos com BSA (Tabela 1) . Esta experiência confirmou as transferências de Western e demonstrou que as culturas SCPA" não têm outras proteases que podem degradar rhC5a.
Tabela 1. Ensaio de fagocitose e ensaio de aderência de estirpes de tipo selvagem e mutante
Estirpe Descrição Unidades de de colónias formação (cfu)/mL Aumento em vezes de cfu/mL Percentagem de inibição de aderência a PMN induzida por C5a* Tempo=0 h Tempo=3 h UAB200 M6+, SCPA+ 1,8xl03 7,2xl04 40 58,8 AK1.4 M6+, SCPA- 1,2xl03 4,5xl04 37,5 0 CS101 M49+, SCPA+ 1,OxlO4 4,9xl05 49 54,5 MJ3-15 M49+, SCPA" 1,5xl04 2,lxlO5 14 0 *Percentagem de inibição = [ (D057onm de PMN activados por C5a isoladamente -DO570nm PMN activados por C5a pré-incubada com bactérias/DC^onm de PMN activados com C5a isoladamente)]x!00%. 35
Embora não seja esperado que a expressão da proteína M seja influenciado por mutações em scpA, foram realizados ensaios para avaliar se os streptococci mutantes SCPA” ainda expressam proteína M e possuíam a capacidade para resistir a fagocitose. A cultura de streptococci em sangue humano fresco durante 3 horas de incubação é indicadora de proteína M antifagocítica na sua superfície. R.C. Lancefield, "Differentiation of Group A Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal Test," J. Exp. Med., 106, pp. 525-685 (1957). Como esperado, os streptococci parentais UAB200 e CS101 aumentaram 40 e 49 vezes, respectivamente (Tabela 1). As culturas M+ SCPA”, estirpes AK1.4 e MJ3-15, aumentaram 37,5 e 14 vezes, respectivamente, confirmando que as mutações de scpA tinham pouco efeito na expressão da proteína M ou resistência a fagocitose em todo o sangue humano. 0 crescimento algo menor de ambas as estirpes mutantes em sangue em rotação foi reprodutível e inesperado. As taxas de crescimento de culturas mutantes e parentais em plasma humano foram indistinguíveis. É possível que a inactivação de SCPA tenha permitido que C5a se acumule em sangue em rotação que, por sua vez, activou PMN. Os PMN activados são mais fagocíticos e mais capazes de matar streptococci M+. Os extractos de proteína de superfície contêm o antigénio M6 e M49 quando analisados por transferência de Western utilizando anti-soros anti-M49 e anti-M6, confirmando que as mutações em SCPA não alteram a expressão da proteína M. 36 EXEMPLO 2 SCP Atrasa o Recrutamento de Fagócitos e Eliminação de Streptococci dos Sitios Subdérmicos da Infecção
De modo a verificar que SCP foi responsável pela inactivação de CSa, os mutantes de inserção e deleção de scpA49 foram construídos como descritos no Exemplo 1 acima, e testados quanto à actividade. Quando foram introduzidas inserções ou deleções no scpA49, a SCP variante não foi capaz de destruir a aderência activada por C5a de PMN a placas de microtitulação. 0 impacto das mutações em scpA49 na virulência foi testado utilizando um modelo animal em que os streptococci permaneceram localizados, e em que o influxo de células inflamatórias pode ser analisado. Para testar a hipótese de que SCP funciona muito precocemente para retardar a eliminação inicial do organismo, foi comparado o destino de streptococci SCP+ e SCP” apenas 4 horas após a inoculação de sacos de ar de tecido conjuntivo. Além disso, a disseminação de streptococci para os nódulos linfáticos e baços após este período curto de infecção também foi avaliado.
Murganhos machos CD1 exogâmicos (25 g) obtidos de Charles River Breeding Laboratory, Wilmington, MA foram utilizados para todas as experiências. Foi criado um saco de ar de tecido conjuntivo injectando 0,9 mL de ar e 0,1 mL de streptococci do grupo A diluídos em PBS, com uma agulha de calibre 25 sob a pele no dorso do murganho. Em algumas experiências, foi utilizado o SCP+ CS101: :pG+host5 como um controlo positivo. Noutras experiências, foi utilizada a estirpe CSlOlSm como o controlo positivo. Os murganhos foram sujeitos a eutanásia por deslocação 37 cervical 4 horas após infecção. Quando indicado, todos os quatro nódulos linfáticos inguinais, baço e saco de ar foram dissecados dos animais e homogeneizados em PBS. As suspensões de tecido foram ensaiadas para as unidades de formação de colónias viáveis (CFU) em placas de agar sangue contendo 1 pg/mL de eritromicina ou 200 pg/mL de estreptomicina.
Numa experiência preliminar os sacos de ar foram fixados em lâminas, corados com coloração de Wright e examinados microscopicamente. Embora as contagens de granulócitos por este método sejam falíveis, pareceram ser significativamente menos residuais SCP~ do que os streptococci tipo selvagem em tecido fixado. Foram realizadas experiências adicionais numa tentativa para medir esta diferença. Foram preparadas populações de células dispersas de sacos de ar moendo o saco de ar em PBS e passando-os através de malha de monofilamento de Nylon (TETKO Co. Nova Iorque).
As células foram sedimentadas por centrifugação 5 min a 300 X g e ressuspensas a 5 X 106/mL em tampão FACS (solução salina equilibrada de Hank sem fenol vermelho, NaN3 a 0,1%, BSA a 1,0% fracção V). As células (1,0 X 106) foram coradas directamente com 1 pg de Mac-1 anti-murganho FITC ou indirectamente com 1 ug de Gr-1 anti-murganho conjugado com Biotina seguido por 1 pg de estreptavidina marcada com fluorescência ou FITC. Os anticorpos monoclonais, Mac-1 e Gr-1, foram obtidos de Pharmingen, Inc. CA. As células marcadas foram fixadas em paraformaldeído a 1,0%. Os perfis de fluorescência foram criados utilizando um citómetro de fluxo FAC-Scan e software Consort 32 (Becton Dickinson). Os PMN de murganho foram purificados a partir de sangue total por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll Hypaque e utilizados como um 38 padrão para PMN definidos em populações mistas. Para a medição de células especificamente marcadas, a fluorescência média para cada marcador de anticorpo foi determinada, e as saidas foram estabelecidas para reflectir intensamente as células marcadas. Os controlos incluíram células não coradas, e células expostas a apenas FITC com estreptavidina.
Foram realizadas duas experiências. A primeira comparou o mutante de inserção de scpA49 Ml6 com a sua cultura parental de SCP+, estirpe CS101. A segunda comparou o mutante de deleção de scpA49 MJ3-15, com o seu parente, estirpe CSlOISm. (Tabela 2) . Em ambas as experiências os sacos de ar homogeneizados de murganhos inoculados com streptococci SCP“ continham menores números de streptococci após 4 horas do que os sacos de ar inoculados com streptococci de tipo selvagem. A primeira experiência apresentou uma redução de duas vezes e a segunda apresentou uma redução de quatro vezes. Estas diferenças foram estatisticamente significativas a P<0,05 e P<0,001, respectivamente, utilizando um teste t não emparelhado. Foi também observado que SCP+ de streptococci tipo selvagem foram encontrados em homogenatos de baço de 7 dos 8 murganhos e 6 de 8 murganhos; enquanto que, os mutantes SCP" foram raramente encontrados no baço. 0 oposto foi verdadeiro para homogenatos do nódulo linfático. Nódulos de 10 dos 16 murganhos infectados com streptococci SCP" continham streptococci viáveis; enquanto que, apenas 4 dos 16 nódulos de murganhos infectados com streptococci de tipo selvagem continham bactérias viáveis. Esta diferença foi determinada como sendo estatisticamente significativa a P<0,05 utilizando o teste exacto de Fisher. 39
Tabela 2: Distribuição de streptococci SCP+ e SCP" 4 horas após infecção com saco de ar
Estirpes N° de murganhos® N° de culturas positivas Saco de ar Homogeneizad° baçoD nódulo linfático CSlOlpG (SCP+) 8 7 2 1,3xl0“±2,2x10' Ml 6 (SCP-) 8 0 5 6,0xl0'±l, 3x10' CSlOlSm (SCP+) 8 6 2 1,6xl0“±2,6x10' MJ3-15 (SCP-) 8 1 5 3,7xl0'±l,5x10' aCada murganho foi inoculado com 3x10“ CFU de streptococci de fase estacionária. bDiferença na frequência de isolamento de streptococci SCP+ de baços em relação a streptococci SCP foi estatisticamente significativa (P<0,05) para cada experiência pelo teste exacto de Fisher. cDiferenças em CFU isolados de sacos de ar homogeneizado (média ± SEM) foram significativas, estirpes CSlOlpG (SCP+) e M16 (SCP-) e MJ3-15 (SCP-) (P<0,001) para cada experiência pelo teste t não emparelhado. A eliminação mais rápida de streptococci de sacos de ar resultou do recrutamento mais intenso de PMN. A população total de células, a percentagem de granulócitos Mac-1 positivos (Springer, G. et al., "Mac-1:macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody," Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979)), e a percentagem de PMN Gr-1 positivos (Brummer, E. et al., "Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for fungai killing: studies with murine cells and blastomyces dermatitidis in vitro," L Leuko. Bio, 36:505-520 (1984)) em sacos de ar foi comparada por análise de FACS de cor única. Clark, J. Μ., "A new method for quantitation of cell-mediated immunity in the mouse," J. Reticuloendothel. Soc. 25:255-267 (1979). Resumidamente, numa análise de FACS, as células individuais em suspensão são marcadas com monoanticorpos específicos fluorescentes. São injectadas fracções de células 40 marcadas num citómetro de fluxo FAC-Scan ou seleccionador de células fluorescentes que contam as células com base na sua fluorescência única.
Os sacos de ar infectados com o mutante de deleção SCP’ continham o dobro das células inflamatórias como os inoculados com streptococci SCP+ (Figura 4) . Um aumento de cem vezes no tamanho do inoculo não alterou esta diferença. Os sacos de ar infectados com 1 x 146 células SCP’, estirpe MJ3-15, continha três vezes mais células Gr-1 positivas do que os inoculados com a cultura SCP+. Nos sacos de ar inoculados com streptococci SCP+ aproximadamente 6% das células foram PMN e 21% foram de outro género de granulócitos Mac-1+, incluindo PMN. Em contraste, sacos de ar inoculados com streptococci SCP’ continham predominantemente PMN. As células Gr-1 positivas foram iguais ou superiores ao número de células positivas Mac-1. As saídas de citometria de fluxo foram ajustadas para medir apenas granulócitos fortemente corados. As restantes 70-80% de células não coradas com qualquer dos anticorpos foram provavelmente ou granulócitos fracamente corados, eritrócitos ou linfócitos. Foi observado microscopicamente um grande número de linfócitos em preparações de Wright de sacos de ar corados.
As colónias de streptococci SCP+ que emergiram a partir dos homogenatos de baço eram amplamente encapsuladas, lembrando gotas de água. Em contraste, as poucas colónias SCP’ provenientes dos nódulos linfáticos, eram mais parecidas com o inoculo. Estas foram misturas de colónias não mucóides e moderadamente mucóides. Estes dados sugerem que os streptococci M+SCP+ encapsulados podem adaptar-se, multiplicar e invadir a corrente sanguínea em 4 horas após infecção. A base para o transporte diferencial dos streptococci mutantes e do tipo selvagem pode 41 ser devida ao fluxo mais vigoroso de células fagociticas em resposta a bactérias SCP". Os macrófagos e/ou células dendriticas da pele podem mais rapidamente engolir os streptococci SCP e distribui-los pelos nódulos linfáticos. A redução de streptococci mutantes relativamente ao tipo selvagem é uma observação inesperada, porque os streptococci SCP" são M+ e resistentes a fagocitose por neutrófilos humanos in vitro. EXEMPLO 3 SCP é Necessária para Colonização da Nasofaringe de Murganho
Os murganhos foram inoculados intranasalmente para avaliar a capacidade relativa de streptococci do tipo selvagem (SCP+) e SCP" para colonizar a nasofaringe. A estirpe CS101 M49 resistente a estreptomicina e o mutante de deleção MJ3-15 foram utilizados nestas experiências. As culturas não foram passadas pelos murganhos de modo a evitar a selecção de variantes que pudessem ser unicamente virulentas para o murganho, mas que não dependem mais da proteína M e/ou SCP para a persistência no animal.
Culturas de dezasseis horas de estirpes de estreptocócicas de desafio (1 x 108 - 9 x 108 CFU) , cultivadas em meio Todd-Hewitt contendo soro normal de coelho a 20% e ressuspensas em 10 pL de PBS, foram administradas intranasalmente a fêmeas CDl de 25 g (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, MA.) ou murganhos BALB/c (Sasco, Omaha NE). As contagens de viáveis foram determinadas por plaqueamento de diluições das culturas em placas de agar sangue. Foram retiradas diariamente zaragatoas da garganta a partir de murganhos anestesiados durante 6 a 10 dias após inoculação e semeadas em placas de agar 42 sangue contendo 200 pg/mL de estreptomicina. Após incubação de um dia para o outro, a 37 °C, foi contado o número de colónias β-hemoliticas nas placas. Todas as estirpes de desafio foram marcadas pela resistência a estreptomicina para as distinguir de bactérias β-hemoliticas que podem persistir na flora normal. As zaragatoas da garganta foram cultivadas em agar sangue contendo estreptomicina. A presença de uma colónia β-hemolitica foi tomada como uma cultura positiva.
Os murganhos exogâmicos CDl foram inoculados intranasalmente com 2 x 108 CFU em fase estacionária. As nasofaringes dos murganhos anestesiados foram sujeitos a zaragatoa diariamente durante 8-10 dias que foram semeadas em agar de sangue contendo estreptomicina. As diferenças entre SCP+ e SCP’ foram evidentes no dia 1, contudo, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas até aos dias 3 e 4 (Figura 5) . Pelo quarto dia, 9/18 murganhos infectados com streptococci M+SCP+ produziram culturas na garganta positivas, embora apenas 2/18 murganhos infectados com a estirpe M+SCP“ tenham retido streptococci nas suas gargantas. Quatro de 18 murganhos morreram da infecção com streptococci SCP+. Nenhum dos murganhos após infecção com bactérias SCP’ sucumbiu à infecção. Os números de colónias nas placas de agar de sangue foram também consistentes com a eliminação mais rápida de streptococci SCP’. Por exemplo, no terceiro dia, as culturas a partir de sete murganhos continham >100 CFU de SCP+, enquanto, apenas um murganho inoculado com streptococci SCP’ continha > 100 CFU.
Porque os streptococci M49 são mais frequentemente associados com infecções de pele, as experiências acima foram repetidas com uma estirpe M6, um serotipo mais frequentemente associado com infecções da garganta. Um mutante de inserção, a 43 estirpe AK1.4, foi construído utilizando a estirpe M6 UAB200 e a estratégia previamente descrita no Exemplo 1. A estirpe AK1.4 foi também eliminada mais rapidamente da nasofaringe do que a cultura do tipo selvagem M6. (Figura 6). As experiências acima confirmam que os streptococci do grupo A são dependentes da SCP para a persistência na nasofaringe de murganhos. Todas as variantes SCP" utilizada nas experiências acima foram M+, i. e. resistiam a fagocitose por sangue fresco humano. No entanto, foram eliminados da mucosa nasofaríngea. EXEMPLO 4
Imunização Intranasal dos Murganhos com SCPA49 Purificada Recombinante Bloqueia a Colonização após Desafio Intranasal a) Construção de vacina recombinante ASCPA49 codificando de Thr63 a His1031 (Figuras 2 e 7) .
Um fragmento de PCR que corresponde a uma forma truncada do gene scpA49 foi clonado a partir de streptococci do grupo A M49 CS101 (ASCPA49). Este fragmento foi amplificado por PCR utilizando um iniciador directo com início no nucleótido 1033 e um iniciador reverso com início no nucleótido 3941 (numeração correspondente à de Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes," L Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990)). O fragmento foi ligado ao sítio de ligação da trombina do gene da transferase de glutationa no vector de expressão elevada pGex-4T-l de Pharmacia Inc. O plasmídeo contendo o fragmento recombinante scpA, designado pJC6, foi depositado na American Type Culture Collection, 44
Rockville, MD, de acordo com as condições do Tratado de Budapeste, e com o número de acesso ATCC 98225. A ASCPA49, um fragmento de 2908 pb de scpA49, foi amplificado por PCR utilizando um iniciador directo de scpA49 contendo uma sequência de reconhecimento BamRI e (5' -CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3') (SEQ ID N°:8) e um iniciador reverso de scpA (5'-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3') (SEQ ID N°:9). As sequências que codificam para o péptido sinal e regiões de âncora na membrana da proteína SCPA foram removidas do produto de PCR resultante. Os produtos de PCR foram digeridos com BamEI e ligados aos sítios de restrição BamRI e Smal no sítio de reconhecimento da trombina do gene da S-transferase de glutationa no vector de expressão elevada pGEX-4T-l de Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ) . O plasmídeo recombinante foi transformado em E. coli DH5a. A proteína de fusão ASCPA49 de um transformante, E. coli (pJC6), foi purificada por cromatografia de afinidade numa coluna Sepharose 4B de glutationa. A proteína de fusão transf erase-SCP de um clone de E. coli foi expressa e purificada por cromatografia de afinidade numa coluna de Sepharose 4b de glutationa. Todos os métodos são descritos pelo fabricante (Pharmacia). A ASCPA49 foi clivada a partir da proteína híbrida por digestão com trombina. A trombina foi removida da SCP eluída através de cromatografia numa coluna de Sepharose 6B de benzamidina (Pharmacia). Após a digestão com trombina, a trombina foi removida por cromatografia em coluna de Sepharose 6B de benzamidina. Os métodos de expressão e purificação são descritos pelo fabricante. A proteína purificada por afinidade foi confirmada como ASCPA49 pura por SDS-PAGE e por transferência de Western. Esta proteína ASCPA49 purificada 45 por afinidade, truncada sem actividade de peptidase quando testada pelo Ensaio de aderência de PMN (descrito no Exemplo 1 acima). 0 anti-soro hiperimune, dirigido contra a ASCPA49 purificada foi preparado em coelhos. b) Imunização e protocolo de desafio. Murganhos fêmeas CD1 de quatro semanas de idade, exogâmicos, foram imunizados por administração de 20 pg de ASCPA49 purificada por afinidade em 10 pL de PBS em cada narina. Os murganhos foram imunizados 3 vezes em dias alternados e reforçados de novo três semanas após a terceira imunização. Após duas semanas de descanso, os murganhos foram de novo reforçados. D. Bessen et al., "Influence of Intranasal Imunization with Synthetic Peptides Corresponding to Conserved Epitopes of M protein on Mucosal Colonization by Group A Streptococci," Infect Immun., 56, pp. 2666-2672 (1988). Os murganhos controlo receberam apenas PBS. Antes da infecção, para todos os murganhos que foram imunizados com proteína ASCPA49 determinou-se, por ELISA, que possuírem títulos elevados de anticorpos contra o antigénio ASCPA49 no seu soro e saliva. As estirpes de streptococci do grupo A CS101 (2,0 x 108 CFU), CS210 (3,6 x 108 CFU), CS463 (7,8 x 108 CFU), 90-131 (3,4 x 108 CFU), e UAB200 (9,6 x 108 CFU) foram utilizadas para o desafio intranasal de murganhos 7 dias após o último reforço da vacina. Os estudos em animais foram efectuados de acordo com as directivas dos National Institutes of Health. c) Recolha de amostras e ELISA. As amostras de soro e saliva foram recolhidas a partir de murganhos anestesiados após imunização. Todos os soros foram testados quanto à presença de anticorpos SCPA49 por ELISA, como previamente descrito. S.P. 0'Connor et al.r "The Human Antibody Response to 46
Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Dis., 163, pp. 109-116 (1990). A proteína SCPA49 purificada foi ligada a poços de placas de microtitulação por adição de 500 ng de proteína purificada em 0,05 M de tampão bicarbonato (pH 9,6). Após incubação de um dia para o outro a 4 °C, os poços foram lavados, depois bloqueados com BSA a 0,5% em PBS durante 1 hora. A salivação foi estimulada em murganhos por injecção de 100 pL de uma solução a 0,1% de pilocarpina (Sigma) subcutaneamente. As amostras de saliva foram recolhidas e centrifugadas a 14000 rpm durante 5 min numa microcentrífuga Eppendorf. Os sobrenadantes foram testados para a presença de IgA secretória contra a proteína ASCPA49 por ELISA. Os títulos de ELISA representam a diluição mais elevada de soro e saliva individuais que possuíam uma DO405^0,l. d) Avaliação da Resposta de Anticorpo a ASCPA49. A imunogenicidade da subunidade ASCPA49 vacina foi avaliada. Foram imunizados coelhos com ASCPA49 purificada. Os coelhos desenvolveram níveis elevados de anticorpos contra a proteína ASCPA49 como determinado por ELISA. Embora o imunogénio ASCPA49 purificado não possua actividade funcional, anti-soro hiperimune de coelho pode neutralizar a actividade de peptidase da enzima SCPA49 do tipo selvagem purificada in vitro. Além disso, anti-soro de coelho não diluído contra a proteína ASCPA49 foi capaz de neutralizar a actividade de peptidase C5a associada com diferentes serotipos (Figura 8) . A actividade de peptidase C5a associada com os streptococci intactos Ml, M6 e M12 foi inibida por este anti-soro, confirmando que o anticorpo contra a proteína ASCPA49 não possui especificidade para o serotipo. 47
Também foram obtidas amostras de soro e de saliva a partir de dez murganhos imunizados e de dez de controlo para avaliar a imunogenicidade da proteina ASCPA49 quando administrada através da via intranasal sem adjuvantes. Os murganhos que foram imunizados com proteina ASCPA49 purificada desenvolveram titulos elevados de IgG especifica para ASCPA49 nos seus soros, comparado com murganhos controlo imunizados com PBS (Figura 9). Os titulos de IgG no soro dirigido contra ASCPA49 variaram desde 1:10 240 a 1:20 480. Em contraste, o titulo de IgG especifico para ASCPA49 de murganhos controlo não foi detectável no soro. Os murganhos imunizados com proteina ASCPA49 purificada também apresentaram um aumento significativo na slgA salivar especifica para ASCPA49 em relação aos murganhos controlo. Os titulos de slgA especifica na saliva de murganhos imunizados foram superiores a 1:16. Em contraste, slgA dirigida contra ASCPA49 na saliva de murganhos controlo não foi detectável. A concentração relativa de IgG e slgA no soro diluida 1/2560 e saliva diluída 1/2, respectivamente, são apresentados na Figura 9. Estes resultados demonstram que a proteína ASCPA49 purificada é um imunogénio eficaz para a indução de respostas de anticorpo sistémicas e secretórias específicas em murganhos quando administrados intranasalmente. 48 e) Impacto da vacina ASCPA49 na Eliminação de Streptococci de Murganhos Infectados.
Foram efectuadas experiências para determinar se a imunização com a peptidase C5a estimulava a eliminação de streptococci da nasofaringe. Tanto o soro de coelho hiperimune como o humano que contém niveis elevados de anticorpo anti-SCPA podem neutralizar a actividade de SCPA in vitro. S.P. 0'Connor et al., "The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase," J. Infect. Dis., 163, pp. 109-116 (1990) . O facto de SCPA facilitar significativamente a colonização da mucosa oral mucosa sugere que a imunização de murganhos com ASCPA49 purificada pode reduzir a capacidade dos streptococci colonizarem a nasofaringe. Os murganhos foram imunizados intranasalmente com SCPA purificada por afinidade, geneticamente inactivada para testar esta possibilidade. A proteina truncada, ASCPA49, foi administrada intranasalmente sem adjuvantes ou veículos. A colonização faríngea de murganhos vacinados por streptococci do tipo selvagem M+ SCPA+ diferiu significativamente da dos imunizados com PBS em três experiências independentes utilizando murganhos vacinados com duas diferentes preparações de proteína ASCPA49 purificada (Tabelas 3 e 4; Figura 10). Apenas um de 13 murganhos imunizados com proteína ASCPA49 foi positivo para a cultura de streptococci dez dias após inoculação (Tabela 4; Figura 10) . Em contraste, 30-58% dos controlos não vacinados permaneceram positivos para a cultura durante seis dias, e alguns foram ainda positivos dez dias após a infecção. Os números de colónias β-hemolíticas, resistentes a estreptomicina em placas de agar sangue mostrou também uma diferença significativa entre os vacinados com ASCPA49 e murganhos 49 controlo. Diferentes conjuntos de murganhos imunizados eliminaram o serotipo M49 de streptococci significativamente mais rapidamente da sua nasofaringe do que os controlos não imunizados. 50
Tabela 3: Culturas na garganta de streptococci após desafio intranasal de murganhos vacinados intranasalmente com PBS ou SCP expressa em E. coli DH5a.(CFU após vacina)
Dias após inoculação
Murganhos* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PBSCT-II 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 3 0 0 0 0 0 0 70 0 3 77 >200 150 4 11 3 0 51 97 53 4 9 >200 >200 3 11 3 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 4 6 45 47 3 >200 29 >200 83 70 7 15 194 >200 9 172 10 5 3 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 32 4 4 0 0 0 0 0 0 10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 127 4 0 0 0 0 0 0 0 0 N° de 8 6 5 5 4 4 2 3 2 2 positivos SCPAD-II 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N° de 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 positivos 51
Tabela 4: Culturas na garganta de streptococci após desafio intranasal de murganhos vacinados intranasalmente com PBS ou SCP expressa em E. coli DH5a.(CFU após vacina)
Dias após inoculação
Murganhos* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PBSCT-I 1 112 143 85 16 0 0 0 0 0 0 2 127 27 18 89 3 7 7 7 70 3 3 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 108 >200 66 4 31 200 4 2 0 0 0 0 0 0 5 4 0 0 3 3 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 >200 >200 120 125 91 145 >200 >200 >200 166 8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 37 >200 194 16 >200 47 >200 101 >200 >200 N° de 8 6 6 7 5 4 4 4 4 4 positivos SCPAD-I 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 105 41 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 9 0 11 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 19 0 0 5 57 0 0 21 91 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 N° de 7 2 1 0 1 1 0 0 1 1 positivos 'Murganhos foram inoculados duas vezes, porque a dose de bactérias foi : muito baixa na primeira inoculação. 52
Por último, foi examinado se SCP de um serotipo vacinava animais contra infecção de outros serotipos. Existem mais de 80 serotipos diferentes de streptococci de grupo A. Uma vacina eficaz deve evitar a infecção a mais do que um serotipo estreptocócico. A protecção cruzada foi produzida contra a colonização pelos serotipos estreptocócicos OF+ M2 e Mil e os serotipos OF" Ml e M6. O facto do soro de coelho dirigido contra a proteína ASCPA49 do serotipo M49 de streptococci ter neutralizado a actividade de peptidase associada com vários serotipos sugeriu que a imunização intranasal com uma única vacina de subunidade pode reduzir ou eliminar a colonização faríngea por estes serotipos. Para explorar esta possibilidade, quatro grupos de vinte murganhos foram imunizados através de inoculação intranasal com proteína ASCPA49 purificada por afinidade como descrito acima. Os murganhos controlo receberam PBS. Antes de serem desafiados com streptococci, foram ensaiados amostras de soro e saliva de murganhos controlo e imunizadas, escolhidas aleatoriamente para anticorpo anti SCPA os murganhos testados desenvolveram uma resposta forte no soro e de anticorpo salivar mensurável. A colonização faríngea de murganhos imunizados com proteína ASCPA49 por estirpes de todos os quatro serotipos foi reduzida relativamente aos controlos não imunizados. As diferenças foram mais significativas nos dias 3 e 5 após inoculação (Tabela 5). 53
Tabela 5. Protecção imunitária é independente do serotipo
Dia 3 após a inoculação Dia 5 após a inoculação Não imune Imune Não imune Imune (+/totai; 1 % (+/total ) % (+/total) 0 "o (+/total) 0. 0 M2 10/19 52,6 2/19* 10,5 3/19 15,8 1/19 5,2 Mil 17/20 85 11/20* 55 8/20 40 2/20* 10 Ml 16/19 84,295 11/19 57 7/19 37 2/19* 10 M6 14/20 70 12/19 63,2 8/20 40 4/19 21,1 + significa murganhos positivos para a cultura. *Diferenças entre imunizados e murganhos não imunizados são estatisticamente significativas (P<0,05) . Valores de P foram calculados por análise χ2.
Foram observadas diferenças estatisticamente significativas observadas entre imunizados e murganhos controlo inoculados com estirpes dos serotipos M2, Mil e Ml. Contudo, os serotipos M2 e Mil 0F+ foram mais eficientemente eliminados por murganhos imunizados do que foram as estirpes OF', Ml e M6. A colonização estreptocócica Ml de murganhos imunizados foi significativamente reduzida relativamente a murganhos controlo. Apenas 10,5% dos murganhos imunizados foram positivos para a cultura no dia 5 após a infecção. Em contraste, 37% dos murganhos controlo foram positivos para a cultura com esta estirpe. Embora os murganhos imunizados parecerem eliminar os streptococci M6 mais rapidamente, as diferenças não foram estatisticamente significativas. Como em experiências anteriores, o número de colónias estreptocócicas β-hemolíticas em placas de agar sangue foi significativamente inferior em amostras retiradas de murganhos vacinados do que nas retiradas de animais de controlo. Assim, a proteína ASCPA 49 foi uma vacina eficaz que proporcionou protecção cruzada contra outros serotipos estreptocócicos. 54 EXEMPLO 5
Mutagénese dirigida ao sitio de SCPA49
Os serotipos estreptocócicos do Grupo A podem ser divididos em dois grupos principais, estirpes 0F+ e 0F~. Os últimos estão mais frequentemente associados com febre reumática e choque tóxico, em que as estirpes 0F+ são uma acusa comum de impetigo e glomerulonefrite aguda. Embora as proteínas SCPA destes grupos sejam 95-98% idênticas, é possível que a resposta imunitária a estas possa ser de algum modo diferente. Esta preocupação desenvolveu esforços para desenvolver variantes de SCPAs definidas a partir de uma estirpe Ml 0F“ e a partir de uma estirpe M4 9 0F+ em paralelo. Os aminoácidos que são necessários para a actividade catalítica foram substituídos com os esperados para inactivar a enzima (Figura 1) . Os aminoácidos das extremidades N e C-terminais de SCPA49, expressos pelos subclones pGEX-4T-l, foram Asn32 e His1139, respectivamente (Figuras 1 e 8) . Ser512 (SCPA49SS12A) , Asn295 (SCPA49N295A) e Asp130 (SCPA49D130A) na proteína SCPA49 foram substituídos com
Ala, e Asn295 (SCPA49N295R) foi substituído por Arg (Deborah Stafslien, M.S. Tese, Universidade de Minnesota). 0 método utilizado para introduzir mutações no gene scpA49 da estirpe de CS101 de Streptococcus foi o do "megainiciador" método de mutagénese dirigida ao sítio. Barik, S., "Site directed mutagenesis in vitro megaprimer PCR," Em: Method in Molecular Biology, Vol. 57: In Vitro Mutagenesis Protocols,
Humana Press, Inc. Totowa, NJ (1996). A mutação da serina foi introduzida utilizando iniciadores scpFor940 (5'-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC- 3'), SEQ ID N°:10, e scpmutrev!883 (5'- TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3' ) , SEQ ID N°:ll, 55 para amplificar um produto de PCR de cadeia dupla de 1450 pb. Este produto de PCR, um "megainiciador," foi purificado utilizando o Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit, depois utilizado numa segunda reacção de PCR assimétrica para amplificar o gene scpA49 de 3,3 kb contendo a mutação desejada. Cinco ciclos de desnaturação (93 °C, 1 min) e extensão (72 °C, 5 min) foram efectuados antes da adição do iniciador reverso scpRev4263, {3' -CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG-3') SEQ ID N°: 12. Durante o quinto ciclo a 72 °C, o iniciador
reverso foi adicionado a uma concentração de 1 mM. A amplificação foi completada utilizando 25 ciclos a 94 °C durante 1 min, 58 °C durante 2 min, e 72 °C durante 2-3,5 minutos. As concentrações dos reagentes foram as mesmas conforme descrito na secção anterior, excepto que um iniciador directo não foi adicionado e o megainiciador foi adicionado a uma concentração de 4-6 pg por 100 pL de reacção. Este processo produziu uma a proteina variante SCPA49S512A (ver Tabela 6 a seguir).
As variantes de aspartato e asparagina foram construídos essencialmente da mesma forma, utilizando os iniciadores reversos scpmutrev717 (5' - CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA- 3') SEQ ID N° : 13 e scpmutrevl214 (5' - AGCTACTATCAGCACCAG - 3') SEQ ID N°: 14 para construir megainiciadores de 311 pb e 805 pb, respectivamente. O iniciador scpmutrev717 foi utilizado para produzir a proteína variante SCPA49D130A, e o iniciador scpmutrevl214 foi utilizado para produzir a proteína variante SCPA49N295A (ver Tabela 6 a seguir). Após purificação com Qiaquick, contudo, o megainiciador foi tratado com 0,1 U de mung bean nuclease (por 4 pg de ADN) e incubada a 30 °C durante 10 minutos. A nuclease foi removida por extracção por fenol/clorofórmio, e o megainiciador recuperou na fase aquosa por precipitação com etanol. O precipitado foi ressuspendido em 56 80 pL de água estéril duplamente destilada, e 37 pL destes foram utilizados em cada 100 pL de reacção de PCR assimétrico. O gene mutado foi então clonado em pGEX 4T-1 como previamente descrito. A sequenciação das variantes foi efectuada utilizando dATP marcado com 35S e o kit da Sequenase (Stratagene) ou utilizando sequenciação automática fluorescente na University of Minnesota Microchemical Facility.
Tabela 6: Comparação da sequência de aminoácidos das proteínas variantes 127 132 291 297 508 514 876 883
Tipo selvagem SCPA49 AVIDAG TSAGNDS LSGTSGT STLGSRF SCP S512A49 AVIDAG TSAGNDS LSGTAGT STLGSRF SCP D130A49 AVIAAG TSAGNDS LSGTSGT STLGSRF SCP N295A49 AVIDAG TSAGADS LSGTSGT STLGSRF O vector de expressão de E. coli pGEX 4T-1 foi utilizado para sobre-expressar a variante SCPA como proteína de fusão com GST. A SCPA recombinante foi purificada de acordo com o protocolo fornecido no GST Gene Fusion System Handbook (Pharmacia) antes deste trabalho. A proteína antigénio SCPA foi purificada por cromatografia de afinidade como descrito acima. 57 EXEMPLO 6
Construção das Variantes SCPA1 e SCPB 0 gene scpAl do tipo selvagem foi amplificado por PCR a partir do serotipo Ml de S. pyogenes (estirpe 90-226) da seguinte maneira. Os iniciadores foram concebidos de modo que apenas um fragmento do gene completo pudesse ser expresso. Este fragmento corresponde ao inicio da proteína madura e termina mesmo antes do domínio associado à parede celular, do resíduo Asn32 ao Asp1038 (Figura 2) . O iniciador directo 5' - CCCCCCGAATTCATTACTGTG ACAGAAGACACTCCTGC - 3' (SEQ ID N° : 15) emparelha desde a base número 940 (numeração correspondente à de Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal peptidase C5a gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). 0 oposto, iniciador reverso de PCR, 5' - CCCCCCGGATCCTTATTGTTCTGGTTTATTAGA GTGGCC - 3' (SEQ ID N°: 16) emparelha na base número 3954 mesmo a montante de uma região repetições do ADN. Esta região de repetições da proteína é prevista como sendo a parte que passa através de, e depois se liga ao, peptidoglicano da parede celular. A região em itálico de cada iniciador é a sequência adicional que foi adicionada à sequência de S. pyogenes para permitir o processo de clonagem. A região sublinhada do iniciador directo incorpora um sítio de restrição EcoRI, a porção sublinhada do iniciador reverso um sítio BamEI. 0 iniciador reverso também incorpora um codão de paragem (TAA) na grelha do gene que termina a tradução.
O produto de PCR resultante correspondente às bases 940-3954 foi clonado num vector pCR2.1 intermediário (Invitrogen, Inc.) e transformado em células E. coli ToplOF (Invitrogen, Inc.). O ADN
plasmídico de um transformante apropriado foi digerido com EcoRI 58 e BamRI. 0 fragmento de 3018 bases, contendo o fragmento de scpAlr foi purificado a partir do gel seguindo procedimentos convencionais e ligado a um vector de expressão pTrc99a (Pharmacia) restringido com as mesmas enzimas. Esta ligação foi transformada em células E. coli DH5a e foi seleccionado um transformante que continha a construção de plasmideo desejada. O plasmídeo resultante coloca o fragmento de PCR de scpAl atrás de uma sequência de Shine-Dalgamo e um sitio de iniciação ATG, e está sob o controlo de transcrição do Promotor trc, que é indutivel com o análogo de IPTG alolactose.
As variantes genéticas especificas para um sitio da scpAl de tipo selvagem foram construídas após um processo descrito por C. L. Fisher e G. K. Pei, "Modification of a PCR-based site-directed mutagenesis method," BioTechniques, 23:570-574 (1997).
Os resíduos de aminoácidos apropriados na SCPA1 importantes para actividade de protease foram previstos por comparação de sequências para a família de protease de serina do tipo subtilisina. Siezen, R. J., et al., "Homology modeling and protein engineering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases," Protein Engineering, 4:719-737 (1991) ; Chen, C., e Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the streptococcal peptidase C5a gene of Streptococcus pyogenes," J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990).
Três resíduos, conservados nesta família, estão envolvidos na formação do sítio activo. Na SCPA1, estes correspondem a Asp130, His193, e Ser512. Foram concebidos três conjuntos de oligonucleótidos não sobreponíveis para utilização em PCR para alterar cada um destes resíduos de aminoácidos. Estes oligonucleótidos foram concebidos para amplificar para fora de cada um em cadeias opostas de ADN. Em cada conjunto, a extremidade 5' de um dos iniciadores continha o codão 59 codificando um destes aminoácidos para mutação e este codão seria alterado para codificar uma alanina. Estes três conjuntos de iniciadores são listados a seguir; os codões que são alterados estão em itálico. D130A:
Directo (SEQ ID N°:17) 5' - ATT GCT GCT GGT TTT GAT AAA AAT CAT GAA GCG - 3'
Codão GAT alterado para GCT corresponde a uma alteração de aminoácidos de aspartato para alanina.
Inverso (SEQ ID N°: 18) 5' - CAC TGC AAC AAC AGT CCC - 3' H193A: Directo (SEQ ID N°:19) 5' - GAG GCC GGC ACA CAC GTG - 3'
Codão CAC alterado para GCC corresponde a uma alteração de aminoácidos de histidina para alanina.
Reverso (SEQ ID N°:20) 5 TTG ATC GAC AGC GGT TTT ACC - 3' S512A:
Directo (SEQ ID N°:21) 5' - ACT GCT ATG TCT GCT CCA TTA G -3'
Codão ACT alterado para GCT corresponde a uma alteração de aminoácidos de serina para alanina.
Inverso (SEQ ID N°:22)
5' - TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C 60
Estes conjuntos de iniciadores de PCR foram utilizados em três reacções separadas. 0 ADN molde foi pLP605, que continha a sequência do tipo selvagem scpAl. Os produtos de PCR foram subsequentemente auto-ligadas e transformadas na estirpe de E. coli ToplOF' (Invitrogen, Inc.). Os transformantes foram rastreados para o tamanho e perfil de restrição apropriados. A alteração da sequência na variante S512A destrói um sitio de restrição Spe I único de modo que esta mutação pode ser identificada directamente por análise de restrição. Todas as potenciais variantes foram confirmadas por sequenciação de ADN. Subsequentemente, a mutação D130A foi combinada com a mutação S512A para formar uma variante dupla utilizando um sitio único PstI entre estas duas regiões da proteina. A alteração final foi alterar o antibiótico de selecção da ampicilina para canamicina movendo os genes da variante scpA 1 para um vector pTRC99a previamente alterado (Pharmacia, Inc.) contendo o gene da canamicina.
Foi construída uma variante de proteína SCPB utilizando o método descrito acima para os mutantes SCPA1. 0 gene de SCPB do tipo selvagem foi clonado a partir dos estreptococos 78-471 do grupo B (Tipo IIa+) . EXEMPLO 7
Análise de Proteínas Variantes
As proteínas expressas a partir de cada uma das construções variantes foram analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida e SDS. 0 tamanho esperado da proteína é 121 kD, 61 contudo, o domínio que atravessa a parede celular rico em prolina no terminal carboxilo da enzima faz com que a proteína migre ligeiramente mais lentamente durante a SDS-PAGE. Deste modo, o peso molecular aparente é 130 kD quando determinado por SDS-PAGE. Uma vez que a SCP activa pode ser prejudicial para o hospedeiro, foi importante que as proteínas variantes não contivessem actividade enzimática. Foram avaliadas duas propriedades das proteínas variantes. As actividades específicas do tipo selvagem e proteínas variantes como determinado por Ensaio de aderência de PMN são comparadas na Tabela 7. Estas experiências indicaram que os aminoácidos substituídos reduziam a actividade enzimática em mais de 90%.
Tabela 7: Ensaio de aderência de PMN de determinação da actividade de protease das variantes
Proteína Actividade (U/mg* 10’3) Tipo selvagem 170 SCPA49D130A <20 SCPA49N295A <20 SCPA49S512A <20
As proteínas variantes foram também comparadas com a proteína do tipo selvagem quanto à sua capacidade de se ligar ao anticorpo dirigido contra a enzima do tipo selvagem. Foram utilizados ensaios de ELISA competitiva para este propósito. As ELISA competitivas mediram a inibição da ligação do anticorpo ao antigénio imobilizado, através de um antigénio solúvel. Uma quantidade constante de antigénio do tipo selvagem foi ligada aos poços da placa de microtitulação. Uma quantidade constante 62 de anticorpo é adicionada ao mesmo tempo com quantidades variáveis de antigénio solúvel competitivo. 0 declive das curvas da percentagem de inibição versus concentração de antigénio estima a afinidade de ligação relativa do antigénio solúvel para o anticorpo. Embora as constantes de ligação não possam ser calculadas sem conhecer a concentração exacta de anti-SCPA no anti-soro, foram comparadas as afinidades de ligação relativas de várias proteínas (Figura 11) . Uma vez que os declives das curvas da percentagem de inibição versus concentração são as mesmas para o tipo selvagem e proteínas variantes, foi concluído que a substituição de aminoácidos não alterou a capacidade do anticorpo se ligar às proteínas variantes.
Foi também determinado que as proteínas recombinantes SCPA1, SCPA49 e SCPB se ligavam igualmente bem ao anticorpo anti-SCP (Figura 12) . Nesta experiência o antigénio da placa foi SCPA49 e o anticorpo foi anti-SCPA49 de coelho. As afinidades relativas deste anticorpo para estes antigénios, indicadas pelo declive das curvas são bastante semelhante. Estes resultados demonstram que a proteína SCPA de M49 0F+ e Ml 0F“ dos Streptococci do grupo A, e dos streptococci do grupo B são equivalentes, em relação ao reconhecimento pelo anticorpo e podem ser utilizados independentemente numa preparação de vacinas. EXEMPLO 8
Administração Subcutânea (SQ) de Antigénio SCPA Induz Protecção em Murganhos
Todos os estudos de protecção anteriores foram efectuados por administração de proteína SCPA49 purificada por afinidade 63 intranasalmente sem adjuvante. A injecção intramuscular ou SQ de antigénios é historicamente um método mais aceite, preferido, de distribuição de vacinas. Deste modo, as experiências foram efectuadas para testar se as injecções SQ de SCPA com MPL/alúmen induziram uma resposta imunitária protectora e se essa resposta reduziam a colonização quando a estirpe de desafio do streptococcus do grupo A diferia no serotipo da fonte da vacina SCPUA. A capacidade de murganhos imunizados eliminarem streptococci da mucosa faringea oral-nasal foi avaliada por cultura na garganta ou por amostragem de tecido nasal dissecado. Os dados representativos da cultura na garganta são apresentados na Tabela 8. 64
Tabela 8: Vacinação Subcutânea de murganhos
Vacina3 Bactéria de desafio13 Percentagem de colonizados13
Murganhos Murganhos
Controlo Imunizados
SCPA SCPA49S512A OF+M4 9 64% (3) 36% ASCPA49 OF+M4 9 64% (3) 20% ASCPA49 0F"M1 33% (5) 8% SCPA1S512A OF’M49 23% (5) 8% aVacinas continham 10 pg ' dos antigénios indicados misturados com os adjuvantes MPL e alúmen. Os grupos experimentais continham cada um 13-20 murganhos. Os murganhos controlo foram imunizados com toxóide do tétano misturado com o mesmo adjuvante. bMurganhos foram infectados por inoculação intranasal. cColonização foi avaliada através de cultura na garganta. Os números entre parênteses indicam o dia em que as culturas foram recolhidas.
Os murganhos imunizados por injecção SQ de cada uma das três formas diferentes de antigénio SCPA induziram protecção moderada. A imunização com ASCPA49 protegeu contra as estirpes OF" Ml e 0F+ M49. SCPA49S512A e SCPA1S512A foram seleccionados para estudos subsequentes. A persistência dos streptococci após desafio intranasal foi também avaliada através de um ensaio mais quantitativo. Este método envolveu grupos de sacrifício de murganhos em diferentes tempos após infecção, e dissecação do tecido nasal (NT), que foi 65 então ensaiado para streptococci viáveis (CFU). As quantidades padrão de NT foram homogeneizadas em tampão e o número de CFU/mg de tecido foi determinado por contagem de viáveis.
Foram imunizados SQ três grupos de murganhos com SCPA49S512A, SCPA1S512A ou toxóide do tétano. Todas as vacinas foram misturadas com adjuvantes MPL/Alúmen como antes. Os murganhos receberam quatro injecções de 5 pg de antigénio proteico e depois desafiados durante duas semanas após a última injecção. Tecido nasal foi recolhido 16 horas após desafio à estirpe CS101 0F+ M4 9. As médias geométricas de CFU/mg de tecido estão apresentadas na Tabela 9.
Tabela 9: Média geométrica de CFU/mg de tecido nasal Antigénio da vacina 16 horasa Tétano 5,7113 SCPA4 9S512A 2,27 SCPA1S512A 1,60 aAltura em que NT foi tirada após murganhos. bValores são valores log. infecção intranasal de 0 número de streptococci associados com o tecido nasal decresceu com o tempo, como esperado e o decréscimo foi mais rápido e completo em murganhos imunizados com antigénio SCPA.
Todos os grupos de murganhos que foram imunizados com SCPA retiveram menos streptococci do que os murganhos controlo. Nesta experiência a imunização com SCPA1S512A foi mais eficaz e induziu uma resposta cruzada protectora, uma vez que a estirpe de desafio CS101 é 0F+ M49 e a fonte de proteína SCPA1S512A da vacina é de uma estirpe OF" Ml. Estes resultados confirmam que um 66 único antigénio SCPA pode induzir protecção contra serotipos heterólogos. A protecção é conseguida pelo anticorpo que neutraliza a actividade de peptidase na superfície bacteriana. Isto aumenta o influxo de fagócitos em poucas horas desde a altura em que os streptococci são depositados no tecido da mucosa. Presume-se que a eliminação rápida de streptococci por fagócitos evita a subsequente multiplicação e persistência das bactérias. Os murganhos possuem uniformemente títulos de IgG no soro de 1:32 000 ou superior quando ensaiados por ELISA, indicando que a injecção SQ de antigénio SCPA com adjuvante induziu consistentemente uma vigorosa resposta de anticorpo. EXEMPLO 9
Peptidase C5a de Streptococci do Grupo B É Praticamente Idêntica em Sequência às dos Streptococci do Grupo A Ml2 e M49 O gene da peptidase C5a de streptococci do grupo B (SCPB) foi clonado, sequenciado e comparado com o do serotipo streptococci do grupo A M12 e M49. Todo o gene scpB foi amplificado por PCR utilizando iniciadores que correspondem às porções da sequência scpA12 utilizando o método descrito acima. O gene SCPB codifica uma grelha de leitura aberta (ORF) de 3450 pb que especifica uma proteína de 1150 aminoácidos com Mr de 126237 da. A sequência de aminoácidos de SCPB é apresentada na Figura 2. A comparação da sequência de nucleótidos e de aminoácidos deduzida de scpB com as dos streptococci do grupo A Ml 2 e M49, apresentou semelhanças elevadas, 98% e 97%, respectivamente. O ScpB continha uma deleção de 50 pb que se sobrepuseram em duas das repetições C-terminais, e possuíam
várias outras diferenças menores em relação aos genes scpA. O 67 alinhamento das sequências mostrou que scpA12 é actualmente filogeneticamente mais próxima de scpB do que de scpA49. Trinta estirpes, representando os serotipos III, Ill/R, II, Ia/c, NT/c, NT/c/Rl possuem uma cópia de scpB. A SCP recombinante foi expressa em E. coli utilizando o plasmideo vector de expressão pGEX-4T-l (número de acesso ATCC 98225) e verificou-se ser idêntica à enzima extraída a partir da estirpe estreptocócica parental do grupo B 78-471 (Tipo II a+ b) . A análise de Western sugeriu que a SCP recombinante é idêntica à enzima C5ase previamente purificada a partir de streptococci do grupo B. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Regentes da University of Minnesota et al. <120> Vacina de peptidase C5a estreptocócica <130> 600.450W01 <150> US 09/206 898 <151> 1998-12-07 <150> US 08/589756 <160> 23 <170> FastSEQ para Windows Version 3.0 68
<210 > 1 <211> 1164 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <4 Ο 0> 1
LfcVs Arg Lys lys Uln hys leu Fro Pfce Asp Lys Leu Ala Xle Ala Leu 1 5 10 IS Mefc Ser Thr Ser Ile LifôU leu Asa Ala Gin Ser Asp Sle Lys Ala Asa 20 25 30 TLr Vai Thr Glu .Âep Thr Fro Ala Thr Glu G1k Ala vai Glu Thr Fro 35 40 45 01η Fro Thr Tàr Vai Ser Glu Glv vai Fro Ser Ser Lys· Gltt Thr Lys SO SS 50 Τ$ΜΓ iro ÊlK Thr Fro Mp Asp Al a G Ití Gin Thr Vai Ala Asp Asp Ala 6S ___ 70 ___________ ____________75... __ m ΑΗΪΙ Asp leu Ala Fro Gin Ala Fro Ala Lys Thr Fro Asp Thr Ser Ala 85 $ú 55 Tfer ser lys Ala Thr Xle Arf Asp Leu Asn Asp Fro Ser Gle V*1 Lys 1ÔÔ 105 1X0 Thr Leu Gl» Glu Lys Ais Oly Lys GTy Ala Gly Thr Vai vai Ala Vai 115 130 125 69 11« Asp Ala Gly Pise Asp t»ye Asrt 130 135 Lys Ala Lys Ais Atg Tyr Olh Se» 145 1$S Lys tàlu »ia Gly Ile T.hr Tyr Gly i€$ tyr tyr Hls Asp Tyr Ser Lys Asp 150 His Gly Thr Mis Vai Ser Gly Ile U$ 200 Th* Lya <31«. Prs Tyr Arg Leu Glu 210 21S Leu Leu Êtet Arg Vai Gly Ile Yal 235 33? Asa Tyr Ai® GIb Ala ile Arg Asp 345 Ile Asn Mefc Ser Pb* Gly Asn Ala 2S0 Asp ôlu Thr Lys í*ya Pro Phe Vai 27S 200 Xle vai fhr Thr Ala Gly &sn Asp 250 335 li®U Pro Leu Ala Asp Ui 8 Pr© Mp 30$ 310 Ala Ala Asp ser Thr Leu Thr vsl 325 Leu Thr CIu Thr Ala Mefc Vai lys 340 Met Pr© Vai Leu Ser Thr Asn Arg 335 3$0 Tyr Ala Tyr Ala Aan Arg Sly Mst 379 3?5 Lys Siy Lye Ile Ala Leu lie Glu 385 300 Lyá lie Ala, Aso Ala Lys Lys Ala 405 Asp Asn Gin Asp Lys Sly ?he Pr o 420 Met Pr© Ala Ala Phe 11« Ser Arg 435 440
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Lys Glu Asp Leu Glu Lys Ala Lys
1S5 ISO
Giu Trp Vsl Asn Asp Lys Vai Ala 170 175
Gly Lys Thr Alã Vai Asp Gin Glu 185 ISO
Leu Ser Gly Aa» Ala Pr o Ss.r Gin 20$
Qly Ala Met Pr© Olu Ala Gin Leu 220
Asa Gly Leu Ala Asp Tyr Ala Arg 235 240
Ala ¥al Asa Leu Gly Ala Lys Vai 250 .255
Alã Léu Ala Tyr Ala Asa Leu Pro 255 2?0
Tyr Ala Lys Ser Lys Gly vai Arg 285
Ser Ser Phe Gly Gly Lys Thr Arg 300
Tyr Gly vai Vai Gly Thr Pr© Ala 31$ 330
Ala Ser Tyr Ser Fr© Asp Asn Gin 330 335
Thr Asp Asp Gin Gin Asp Lys <Slu 345 350
Ahs elu Pr© Asa Lys Ala ‘Tyr Asp 385
Lys Glu Asp Asp Phe Lys Asp Vai 380
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Ala Leu Lys Asa Asp The Thr Ala 755 7Ê0 71
Thr Ile Ile Asn Vai Vai Lys Glu Gly Vai Glu' Asn Ile Glu Asp Ile 770 775 780
Glu Ser Ser Glu Ile Thr Glu Thr Ile Phe Ala Gly Thr Phe Ala Lys 785 790 795 800
Gin Asp Asp Asp Arg His Tyr Tyr Ile His Arg His Ala Asn Gly Lys 805 810 815
Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Pro Asn Gly Asp Gly Asn Arg Asp Tyr Vai 820 825 830
Gin Phe His Gly Thr Phe Leu Arg Asn Ala Lys Asn Leu Vai Ala Glu 835 840 845
Vai Leu Asp Lys Glu Gly Asn Vai Vai Trp Thr Ser Glu Vai Thr Glu 850 855 860
Gin Vai Vai Lys Asn Tyr Asn Asn Asp Leu Ala Ser Thr Leu Gly Ser 855 870 875 880
Thr Arg Phe Glu Ile Ser Arg Trp Asp Gly Lys Asp Lys Asp Ala Lys 885 890 895
Vai Vai Ala Asn Gly Thr Tyr Thr Tyr Arg Vai Arg Tyr Thr Pro Ile 900 905 910
Ser ser Gly Ala Lys Glu Gin His Thr Asp Phe Asp Vai Ile Vai Asp 915 920 925
Asn Thr Thr Pro Glu Vai Ala Thr Ser Ala Thr Phe Ser Thr Glu Asp 930 935 940
Arg Arg Leu Thr Leu Ala Ser Lys Pro Gin Thr Ser Gin Pro Vai Tyr 945 950 955 960
Arg Glu Arg Ile Ala Tyr Thr Tyr Met Asp Glu Asp Leu Pro Thr Thr 965 970 975
Glu Tyr Ile Ser Pro Asn Glu Asp Gly Thr Phe Thr Leu Pro Glu Glu 980 985 990
Ala Glu Thr Met Glu Gly Ala Thr Vai Pro Leu Lys Met Ser Asp Phe 995 1000 1005
Thr Tyr Vai Vai Glu Asp Met Ala Gly Asn Ile Thr Tyr Thr Pro Vai 1010 1015 1020
Thr Lys Leu Leu Glu Gly His Ser Asn Lys Pro Glu Gin Asp Gly Ser 1025 1030 1035 1040
Asp Gin Ala Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Glu Gin Asp Gly 1045 1050 1055
Ser Asp Gin Ala Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Gly Gin Asp 1060 1065 1070
Gly Ser Gly Gin Thr Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Glu Lys 1075 1080 1085 72
Asp Ser Ser eiy gin Thr Pr© Gly Lys TiM? Pr© 01«. Lys Qly Glii Pia 1090 10.9S 1100
Ser Arg Thr Leu 01« Lys Arg Ser Ser Lys Arg Ala Leu Ala Thr Lys iiOS 111D 1115 112 Õ
Ala Ser Thr Arg Asp 01a. Leu Pro Thr Thr âíí« Asp Lys: Asp Thr Asa. 1135 1130 1135
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Vai Ala sis Ile Phe Lys Thr Lys Arg Thr 01« Asp 1155 USO .
<210> 2 <211> 1167 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 2 73
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Val Asp Gly i^ya Eis Fhe Ala .Leu 635 640
Ser Trp Glu ty® lie Th,r He pro 650 658
Val Pr© II© Asp Ala Ser Arg lhe 665 670
Lys M» Gly Tyr Ptse Leu Glu Gly 685
Thr Lys sl« Gl« Leu «et ser ile 700
Phe Gly As» Leu Ser Ala Val Glu 715 720
Gly Ser Ser Tyr Tyr His Glu Ala 710 73.5
Asp Gly Asp Gly Leu SI» Phe tyr 745 7S0
Leu Thr Thr Glu Ser M» Pr© Trp 766
Gly-vai Glu Aan lie Glu Asp lie 780 xie Phe Ala. Gly Thr Phe Ala Lys 785 800 n« His Arg His Ala Asn Gly Glu 818 815
Gly Aãp Gly àm. Arg Asp Tyr Val 76 82 Ο 82 S 830
Bis Phe Gin Gly Sfer Phe Leu Arg As» Ma X»y* Asa Leu Vai Ala Glu 835 840 845 val Leu Asp Lys 01« Gly Asa Vai Vai Trp Uar Ser Glu Vai Th» 81« 850 855 858
Gin Val Vai Lys Asn Tyr ASIS Asn Asp Leu &jL<3. Ser Thr Leu Gly Ser 86$ i?8 875 380 Thr Arg Fhe 61« Lys Thr Arg Trp Asp Gly Lyr> As-p Lys Asp Gly Lys 885 800 895 Val Val Ala Mn Gly Thr Tyr Thr Tyr Arg vai Arg Tyr Thr Pro Ile 500 SOS 010 Ser ser Gly Ala Lys Glu Gin His Thr Asp Phe Asp Vãl lie Val Asp 515 520 925 &3Ϊ1 Thr Th*· Pro Glu Vai Ala Thr ser Ala Thr Phe Ser Thr Glu Asp 930 53$ 948 Arg Arg Leu Thr Leu Al.3 Ser Lys Pro Lys Thr Ser 8ln Pro Val Tyr MS 950 955 960 Arg Glu Are lie Ala Tyr Thr Tyr Mat Asp Glu Asp Leu Pro Thr Thr MB 570 97$ Gin Tyr He Ser Pre Asn Glu ASp Gly Thr Phe Thr Leu Pro Glu: Glu 880 98$ 988 Ala 81« Thr Mefc Glu Gly Ais. Thr Val Pro Leu Lys Meft· Ser Asp Phé 5:35 1000 1005 Thr Tyr Val Val Glu ASp Met AX.S: feiy Asn lie Thr Tyr Thr Pró val 1010' 1815 .102 í ) Thr Lyê Lev Leu Oiu Gly His Ser Asn Ly® Pro Glu. Gin. Asp Gly Ser 1025 1030 1035 1048 Gly Gin T&r Pro Asp Lys Lys Pro Glu Ala Lys 5xo Glu Gin Asp Gly 1045 10$í ? iOSi Ser Asp Gin Ala PfG Asp lys Lys Pro Glu Ala Lys Pro Glu Gin Asp 1050 ίο e; ! 1.078 Gly Ser Giy Gin Thr Aro Asp Lys Lys Pro 83.U Thr Lys Pro fílu Lya 107* > 1380 1085 Asp- Ser ser Gly Slxs Thr Fre Giy Lys Thr Pro 61» Lys Gly OXíl Fro 1058 1051 ϊ 1100 Ser Arg Thr Leu GlU Lys Arg ser Ser Lya Arg Ala Leu Ala Thr Lys nos y 1118 ms 1120 Ala Ser Thr Arg Asp Gin LUU Pro Thr Thr Asn ASp iLys Mp Thr Asn nas nsc ) ms Arg Leu Eis Leu Leu Lys Leu Val Met Thr Thr Phe Phe Phe Gly Leu 77 ms uso
Vai Alá Híe lie Phe Ijys Ttir £>ye Arg G&& Lye Glu Tàr Lys Lys 1155 1150 11.65
<210> 3 <211> 1150 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 3 78
Leu Ãrg Lys Lys Gin Lys Leu Fr o Phe Asp Lys Leu Ala Ile Ala Leu 5 10 15 «et ser Thr Ser lie Leu Leu Asa ALíi Gin Ser Asp ile Lys Ala Am 20 30 Thr vai Thr Glu Asp Thr Prc· Aià Thr Glu Gin Thr Vai Glu Thr Pr© Gin 4.3' Pr© Thr Al& Vai Ssr *é w Glu Glu Ala Pr© Ser Ser Lys Glu Thr Lys S« ss 50 Thr Pr© Gin Thr Pr© Ser Asp Alá 31y Glu Thr Vai Alá Asp Asp Alá ss 70 75 80 Assft Asp LâU AXâ Pr© Gin Ala Pro Ala Lys Thr Ala Asp Thr Pr© Alt 65 ss 05 Thr Ser Lys Ala Thr Ile Arg Asp Leu Asa Asp Pr© Ser Gin Vai Ly® 100 105 110 Thr Leu <s lií Glu Lys Ala. Gly Lys Gly Ala Gly Thr Vai Vai Ala Vai 115 120 125 Ile Asp Ala Gly Phe Asp Lys Asn His Glu Ala Trp Arg Leu Thr Asp 130 lis 140 Lys Thr Lys Ala Mg Tyr Gin Ser Lya Glu Asp Leu Glu Lys Alá Lys 145 ISO 185 100 Lys Giu Ris Gly lie Thr Tyr Gly Glu Trp Vai Asa Asp Lys Vai Ala ies 170 175 Tyr Tyr His Asp Tyr Ser Lys Asp Gly Lys Thr Ala Vai Asp Gls Glu ISO • · — 185 ISO his Gly Thr His Vai Ser' Gly lis LSU Ser Gly As» Ala Pr© Ser Glu iss 200 205 Thr Lys Glu Pro Tyr Arg Leu Glu õly Ala «et Pt© Glu Alá ala Leu 218 215 220 Leu Léu «et Arg Vai Glu ile vai Asa Gly Leu Ala Asp Tyr Ala Arg 228 230 238 240 79 Μη Tyr Ala Gin Ala II* Arg Asp Ala Ile Asn Leu Gly Ala Lys Val 345 250 355 Ile Am Met Ser Phe Gly Asft Ala Ala Lèii Ala Tyr Ala Asn Leu Pro 280 2ÊS 270 Asp «lu Thr Lys Lys Ala Phe Asp Tyr Ãl® Lys Ser Lys Gly Val Ser 275 280 265 Ile Vai Thr Ser Ala Gly Asa Asp Ser Ser The Gly Gly Lys Thr Arg 238 235 300 Leu FXO seu Ala Asp Mas Pro Asp Tyr Gly val val Gly Thr Pro Ala 385 310 31S 328 Ala Ala Asp ser Thr Leu Thr Vai A-U Ser Tyr Ser Pro Asp Lys Gls. 125 330 335 Leu Thr Glu Thr Vai Arg Val Lys Thr Ala A$sp Glu Gin Asp Lys Glu 348 .345 350 Mefe Pre Vai .Leu Se.r Thr Asa Arg Phe Glu Pro Aan Lys «5 jÉE Ala 'Tyr Asp Tyr Ala Tyr Ala Asa Arg Gly (* *3 M1 Thr Lys Glu Asp Asp «r* U ? Phe Lys Asp Val 378 375 380 Lys Giy Lys Ile Ala Leu Ile Glu Ar 9 Gly &sp lie Aep Phe Lys Asp 385 300· 335 488 Lys Xle Ala Lys Ala Lys Lya Alá. Gly Ala Val Gly Val Leu lie Tyr 405 410 415 Asp A§n Gin Asp Lys Gly Phe Pro IIs Glu Leu Pra Asn Val Aãp Gin 428 425 430 Met Pr» Ala Ala Phe lie Ser Arg Lys Asp Gly Leu Leu Leu Lys Asp 435 440 445 Aí3R Pro Gin Lys Thr Ile Thr Phe Asn Ala Thr &ZQ Lys Val Leu pro 4S0 4SS 450 Thr Ar® Ser Gly Thr Lys Leu Ser Arg Phe Ser Ser Trp Gly Leu Thr 48S 470 475 408 Ma Asp «ly Asn Ile Lys Wta Aãp Ile Ala Ala Pro Gly Gin Asp lis 4SS 450 45S Leu Ser Ser Vai Ala Asa hm Lys Tyr .Ala Lys Lsu ser Gly Thr ser 588 -- ..... SOS - 510 Met Ser Ala Prp Leu Vai Ala Gly xre Met Gly Leu Leu Gin Lys Gin 515 520 525 Tyr Slu Thr Gin Tyr Pro Asp Ket Thr Tro Ser Glu Arg Leu Asp Leu 530 535 540 Ala hys Lys Vai Le« «et Ser Ser Ala Thr Ara Leu Tyr Asp Glu Asp 545 558 §55 558 80 01« Lys Ala Tyr The Ser Fr o Arg ses Ala Ly# Lys Ala i«r Ala Ais thr 580 Thr Ser Ser Lys Vai His Leu Asn sss soa Thr Vai Asn vai His Asn Lys Ser 610 SIS Gin Ala Thr Vai Gin Thr Aep Lys §25 «30 Ala fto Lys Vai Leu Tyr Olu Ala «5 Ala Asjx Ser Ser Lys Oiti Vai Thr 560' Ser Lys Asp Leu Leu Ala Gin Mefc 675 680 phe vai arg Vh© Lys Glu Asp pro g$0 605 Pr o Tyr XI e Oly »he Arg Gly Asp 705 710 Lys Pro XI© Tyr Asp Ser Lys Asp 73.5 Asn Ser Asp Ala Lys Asp Gin Leu 740
Gin, Gin Gly Ala Oly Ala Vai Asp 570 575
Met Tyr Vai Thr Asp Lys Asp Asn 585 500
Asn Vai Ser Asp Lys Phe Olu Vai 685
Asp Lys Pr£> Gin 61a Léu Tyr Tyr 620
Vai Asp Gly Lys His The Ala Leu 635 640
Ser Trp 31a Lys Ile Thr lie Pro 650 655
Vai Fro Ilè Asp Ala Ser Arg The 665 670
Lys Asn Gly Tyr The Leu 31« Oly 685
Lys Lys 31« 01« Leu mt ser il« 700
Phe Gly Am Leu 3er Ala Leu Olu 71.5 720
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Asp Oly Asp Oly Leu 01« Phe Tyr 745 750
Ala Leu Lys Asn Asa Phe Thr Ala Leu Thr Thr Olu Ser Asn Pro Trp 75$ 7«0 765
Thr ilè He Lye Ala Vai Lys 01« Oly Vai Olu Asn 11« Olu Asp Ile 770 775 ?80:
Olu se*· ser Glu ile Thr 01« Thr Ile Leu Ala Gly Thr Phe Ala Lys 785 780 7PS 5&8
Gin Asp Asp Asp Ser Hie Tyr Tyr lia His &rg Hl* Ala Aen Gly Lys SOS. eis 815
Pro Tyr Ala Ala lie Ser Pro Asn Oly Asp Gly Asn Axg Asp Tyr vai §20 835 830
Olii Phè Gin Gly Thr 3Phe LéU Arg Ai» Al* Lys Asn. Leu Vâl Alá Olu 83$ 840 845
Vai Leu Asp Lys Glu Gly Asa Vai Vai Trp Thr Ser Glu Vai Thr Olu 850 855 860 GXn Vai vai Lys Asn Tyr Asn, Asn Asp Leu Ala Ser Thr Leu Oly Ler 865 870 873 880 81
Thr Arg phe ¢31¾ l»y* Thr Arg Tsp Asg Gly Lys Asp Ly* Asp Gly Lys ess 850 895
Vai Vai Alá Má Gly Thr Tyr Thr Tyr Mg Vai Mg Tyr TM Prò Ile 9©C SOS 510
Ser Ser Gly Ála Lys Glu Gla lis Thr Asp Phe Asp Vai lie Vai Asp 515 S2Q 92S
Asn Thr Thr Pr© Olu Vai Alã Thr Sãr Ala Thr Fha Ser TM Glu Asp 530 535 340
Arg Arg Leu Thr Leu Ala Ser Lys Pro Lys Tfer Ser ôl» Pro vai Tyr 545 550 555 9ÈÔ
Arg Glu Arg fie Ala Tyr Thr Tyr Met Asp Glu Asp Leu Pr o Thr Thr 5€5 570 375
Glu Tyr lie Ser Pro Asa Glu Asp Gly Thr Pite Thr Leu Pr© Glu Glu 980 S85 330
Ala sitt TM Thr Glu Gly Ala Thr Vai Pro Leu Lys «ao ser Asp Phe 595 1000 1003
Thr Tyr vai vai Glu Asp «et Ala Gly Ma ile Thr Tyr Thr Pr© Vai 1010 1015 1020
Thr Ly» Leu Leu Glu Gly His Ser Asn Ly» Pro Glu Glu Asp Gly Ser 1023 1030 1035 104©
Asp Qla Ala Fr© Asp Lys Lys Pr© Glu Ala Lys Fr© Glu Gin Asp Gly 1045 1050 1055
Ser Gly Gla 'Thr Pro Asp Lys Lys Thr Glu Thr Lys Pro Glu Lys Asp 1060 1065 1070
Ser Ser Gly Gla Thr Pr© Gly Lys Thr pro Glu Lys Gly Gin Pro Ser 1075 1050 1085
Arg Thr Leu Glu Lys Arg Ser Ser Lys Arg Ala Leu Ala. Thr Ly* Ala 1090 1095 U00
Ser Thr Arg Asp Gla Leu pro Thr Thr hm Asp Lys Asp Thr Asa Arg nos mo ms 1120
Leu His Leu Leu Lys· Leu Vai Het Thr Thr Phe Phe Leu Gly Leu Yal 1125 1130 1135
Ala Vis 11a Phe Lys Thr Lys &rg Gla Lys Glu Thr Lys Lys 114© U4S 1150· 82
<210> 4 <211> 31 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes < 4 Ο Ο > 4
gggggggaat tegagcçgg íaícaíggga c 31 <210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes <400> 5 gggggggast tcggçfgelg casáaSctgg c 31
<210> 6 <211> 17 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes <4O0> 6 gtasaacgae ggccagt 17
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<211> 18 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes < 4 Ο Ο > 18 csctgcasea acagtax 18
<210> 19 <211> 18 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes < 4 O O > 19 gaggecggca cacssçttg
<210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes <400> 20 SSgalcgaca gcçgíRiac c
<210> 21 <211> 22 <212> ADN 87 <213> Streptococcus pyogenes <4Ο0> 21 actgctaigt cfèdccaÊÍ ag
<210> 22 <211> 31 <212> ADN <213> Streptococcus pyogenes <4 O O> 22 íccsgaaagí tíggcatact *S$gftagc e 31
<210> 23 <211> 1181 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 23
Leu Atg Lys1 tye Qln Lys Leu Fro Ph* Mp Lys tau ala Ala tea 1 IS 11« Lys Ala Asti SQ Vai GlU Thr Fro 4S bys GlU Thr Lys 12
Hec Ser Thr ser Xle Leu Leu Asn Ala Gin Sar Asp 25 25
Thr Vai Thr· Óiti Asp Tfcr Pre Ala Thr Glu Gin Ala 35 40 ela. Fro Thr Ala V«1 Ser Glu Glu Ala Pro Ser Ser 88
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50 SS
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Am Asp L8« Ma Frp Gin Ala Pro 85
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Thr Leu <31w Q&u Ly# Ala Gly fcy* 115 120 XU Mp Ala Gly Phe Asp Lys Asn 130 135
Lys Tkr Ay» Ala Arg IV» SU Ser 145 ISO
Lys Glu Kl» Gly Xle Thr fyx Gly 1.5 S
Tyr Tyr HXs A»p Tyr Ser !*y« Asp ISO·
Hls Gly Thr Ris Vai Ser Gly lis iss aoo
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Asp Glu Thr Lys Lys Ala Phe Asp 275 280 lis Vai Thr 8ar Ala Gly Asn Asp 290 295
Leu Pr© Leu AU Asp His P«J Asp 385 310
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Tyr Ais. Tyr Ais Asn Arg Gly Mefc 370 37S 380
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Asp Asa Gin Asp Lys ¢1/ Píj« Pro lie Olu Leu Pro a$s v*l Asp Gla 420 425 430 ««« Pro AU Ala PAe tis Ser ftrg Lys A»p Gly L*U Leu Leu Lys Glu 435 440 445
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Leu Ser Ser V*1 Ala Asa to Ly» Tyr Ala Lye Leu Bex Gly Thr Ser $08 50$ 510
Met ser Ala Pro Le» v«l ide 0iy 11« »ee Qly .Leu Leu Gin Lys dia 515 520 525 yyr Glu TLr Gl» fyr Pro Asp Mot Thr Pr* Ser Glu Arg Lee a&jj Leu SOO 535 540
Ala Ly» Lyô Vâl Leu Néfc Ser S«r Ala Tfar Ala Leu Tyr Asp Glu Asp 545 SS0 55$ 560
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Mp Gla Ais Pro Asp Lya Lys Paso βίο Thr Lye Pro Gla Gla Asp Oly 104S 1050 1055
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Asn &rg Leu His Leu Leu Lys Leu Vai Hefc Thr Thr Pàe Phe Leu Gly 115$ liso 3.2SS
Leu Vai Ala His ile £h« Lys Thr Lys Axg Thr Lys Lys mo ms uso
Lisboa, 9 de Outubro de 2007 92

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Vacina compreendendo uma quantidade imunogénica de um péptido isolado e purificado compreendendo uma Peptidase C5a Estreptocócica enzimaticamente inactiva (SCP), cuja quantidade é eficaz para imunizar um mamífero susceptível contra Streptococcus β-hemolítico, em combinação com um veículo não tóxico fisiologicamente aceitável, em que a SCP é uma variante da SCP do tipo selvagem em que a SCP variante possui uma substituição nos resíduos de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 130 e 512 de SEQ ID N°: 1.
  2. 2. Vacina da reivindicação 1, em que a SCP é expressa a partir de uma sequência de ADN isolada codificando SCP.
  3. 3. Vacina de qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que a SCP possui uma fenda de especificidade dos resíduos de aminoácidos contíguos correspondentes aos resíduos desde cerca do resíduo 260 até ao resíduo 417 de SEQ ID N°:l, ou um domínio catalítico de resíduos de aminoácidos contíguos correspondente aos resíduos desde cerca do resíduo 130 ao resíduo 512 de SEQ ID N°: 1.
  4. 4. Vacina de qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a substituição é uma substituição conservadora.
  5. 5. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a SCP variante adicionalmente varia da SCP de tipo selvagem, em que não contém uma sequência sinal e/ou uma inserção na parede celular. 1
  6. 6. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a SCP é uma variante de SCP de Streptococcus do grupo A, Streptococcus do grupo B, Streptococcus do grupo C ou Streptococcus do grupo G.
  7. 7. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que adicionalmente compreende uma quantidade eficaz de um adjuvante imunológico.
  8. 8. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o mamífero é humano, cão, bovino, porcino ou cavalo.
  9. 9. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o Streptococcus β-hemolítico é um Streptococcus do grupo A, Streptococcus do grupo B, Streptococcus do grupo C ou Streptococcus do grupo G.
  10. 10. Vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a SCP está conjugada ou ligada a um péptido ou a um polissacárido.
  11. 11. Vacina da reivindicação 10, em que o péptido ou polissacárido conjugado ou ligado a SCP é de outro patogénico.
  12. 12. Vacina da reivindicação 11, em que o polissacárido de outro patogénico é um polissacárido Estreptocócico do grupo A, um polissacárido C de Streptococcí do grupo B ou um polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae ou Streptococcí do grupo B. 2
  13. 13. Utilização da vacina de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 na preparação de um medicamento para protecção contra a colonização ou infecção por Streptococcus β-hemolíticos. Lisboa, 9 de Outubro de 2007 3
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6355255B1 (en) * 1998-12-07 2002-03-12 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
US6824997B1 (en) 1998-09-18 2004-11-30 Binax, Inc. Process and materials for the rapid detection of streptococcus pneumoniae employing purified antigen-specific antibodies
US9134303B1 (en) 1998-08-25 2015-09-15 Alere Scarborough, Inc. ICT immunoassay for Legionella pneumophila serogroup 1 antigen employing affinity purified antibodies thereto
US7256265B2 (en) * 1999-12-03 2007-08-14 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
MX357775B (es) 2000-10-27 2018-07-20 J Craig Venter Inst Inc Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos.
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7301554B2 (en) * 2002-09-20 2007-11-27 Ricoh Company, Ltd. Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method
WO2004094468A2 (en) * 2003-04-23 2004-11-04 Hansa Medical Ab Method for identifying an anti-streptococcal agent and its use for treating streptococcal infections
AU2005302269B2 (en) 2004-11-01 2011-05-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modified streptococcal polysaccharides and uses thereof
GB2428006A (en) * 2005-07-07 2007-01-17 Jevgenis Morov AMI-3 vaccine comprising group A Streptococcus pyogenes bacteria
US7596254B2 (en) * 2006-03-17 2009-09-29 William Marsh Rice University Intra-operative 3-D reconstruction of bone cement boli using X-rays
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
CA2654269C (en) * 2006-06-23 2015-09-22 Danisco Us Inc. Systematic evaluation of sequence and activity relationships using site evaluation libraries for engineering multiple properties
US20080311129A1 (en) * 2006-11-02 2008-12-18 Camas Incorporated Adherence inhibitor directed to and method of making and using
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
ES2586418T3 (es) * 2007-04-16 2016-10-14 Minervax Aps Vacuna de proteína de fusión
AU2008299376B2 (en) 2007-09-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. GAS57 mutant antigens and GAS57 antibodies
DK2356135T3 (en) 2008-11-05 2017-12-04 Wyeth Llc IMMUNOGEN MULTICOMPONENT COMPOSITION FOR THE PREVENTION OF BETA-HAEMOLYTIC STRUCTURAL TOC (BHS) DISEASE
AU2011262346B2 (en) 2010-06-04 2014-12-11 Wyeth Llc Streptococcus pneumoniae vaccine formulations
MX350142B (es) 2010-08-23 2017-08-28 Wyeth Llc * Formulaciones estables de antigenos rlp2086 de neisseria meningitidis.
EP3549601B1 (en) 2010-09-10 2021-02-24 Wyeth LLC Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens
ITMI20111182A1 (it) 2011-06-28 2012-12-29 Canio Buonavoglia Vaccino per coronavirus canino
MX359256B (es) 2012-03-09 2018-09-19 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas.
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
CN102746388B (zh) * 2012-07-02 2014-06-25 中山大学 一种链球菌保护性抗原C5a及其制备方法
EP2964665B1 (en) 2013-03-08 2018-08-01 Pfizer Inc Immunogenic fusion polypeptides
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
CN107249626A (zh) 2015-02-19 2017-10-13 辉瑞大药厂 脑膜炎奈瑟球菌组合物及其方法
KR101775093B1 (ko) 2016-05-31 2017-09-19 그린코스 주식회사 베타인살리실레이트와 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 각질 용해 화장품 조성물, 그 제조 방법, 및 이를 포함하는 화장품
SG11201906519RA (en) 2017-01-31 2019-08-27 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN106822885B (zh) * 2017-02-16 2020-06-30 清华大学 肺炎链球菌疫苗
WO2018175783A1 (en) * 2017-03-22 2018-09-27 Modernatx, Inc. Rna bacterial vaccines
CN109045292A (zh) * 2018-11-08 2018-12-21 山东大学 一种a群链球菌寡糖蛋白缀合物及其制备方法与应用
KR102165688B1 (ko) 2020-04-03 2020-10-14 주식회사 퀀타매트릭스 그람 양성균 배양용 배양액
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024110839A2 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4152411A (en) * 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
NZ191327A (en) * 1978-08-24 1981-07-13 W B Martin Pasteurellosis vaccine comprising antigenic material derived from the a1 and a2 serotypes of pasteurella haemolytica
US5077044A (en) * 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4454121A (en) 1982-07-27 1984-06-12 The University Of Tennessee Research Corporation Synthetic peptides corresponding to antigenic determinants of the M protein of Streptococcus pyogenes
US4695562A (en) 1984-04-06 1987-09-22 Univ. Of Tennessee Research Corp. Synthetic peptide compounds
US4772584A (en) 1986-05-23 1988-09-20 Cleary Paul P Inhibitor of C5a-mediated chemotaxis
EP0272929B1 (en) 1986-12-24 1996-03-20 Genentech, Inc. Enkephalinase for therapeutic use
US5162226A (en) 1987-08-24 1992-11-10 University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products
US5124153A (en) 1987-08-24 1992-06-23 University Of Tennessee Research Corp. Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products
US4863159A (en) 1988-03-25 1989-09-05 Morrison Molded Fiber Glass Company Apparatus for use in the exercise of the human body
EP0365646B1 (en) 1988-03-25 1996-05-08 The Rockefeller University Synthetic peptides from streptococcal m protein and vaccines prepared therefrom
DK0542869T3 (da) 1990-07-31 1996-02-05 Genentech Inc Vævsplasminogenaktivatorvarianter med nedsat udskillelse
US6100380A (en) * 1991-10-28 2000-08-08 Cytran, Inc. Immunomodulating peptides and methods of use
WO1993014198A1 (en) 1992-01-08 1993-07-22 The Rockefeller University Multifunctional surface protein of streptococci
ATE228565T1 (de) 1992-03-09 2002-12-15 Univ California Nukleinsäure, expressionsvektor und zusammensetzungen zur identifizierung und herstellung von rekombinanten sialyltransferasen
WO1993021220A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Synthetic peptides useful in a vaccine against and in the diagnosis of streptococcal infection
IL106922A (en) 1992-09-14 1998-08-16 Novartis Ag Complex materials with one or more wettable surfaces and a process for their preparation
IL107026A0 (en) 1992-09-16 1993-12-28 Univ Tennessee Res Corp Antigen of hybrid m protein and carrier for group a streptococcal vaccine
IL107025A0 (en) 1992-09-16 1993-12-28 Univ Tennessee Res Corp Recombinant multivalent m protein vaccine
US5866135A (en) 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
US5679654A (en) * 1994-09-02 1997-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
US5618129A (en) 1995-03-13 1997-04-08 Paragon Electric Company, Inc. Snap-engaging mounting plate
US6355255B1 (en) 1998-12-07 2002-03-12 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
US5846547A (en) 1996-01-22 1998-12-08 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
US7256265B2 (en) * 1999-12-03 2007-08-14 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
US6605302B2 (en) * 2001-07-17 2003-08-12 Osmotica Corp. Drug delivery device containing oseltamivir and an H1 antagonist

Also Published As

Publication number Publication date
US8440205B2 (en) 2013-05-14
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ES2363446T3 (es) 2011-08-04
PT1892298E (pt) 2011-06-01
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US7635483B2 (en) 2009-12-22
EP1137785A1 (en) 2001-10-04
WO2000034487A1 (en) 2000-06-15
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DK1137785T3 (da) 2007-12-10
CA2354508C (en) 2011-02-01
EP1892298A1 (en) 2008-02-27
ATE503017T1 (de) 2011-04-15
US6951653B2 (en) 2005-10-04
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US20040062777A1 (en) 2004-04-01
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KR100777502B1 (ko) 2007-11-16

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