ES2218656T3 - Vacuna de peptidasa c5a estreptococica. - Google Patents
Vacuna de peptidasa c5a estreptococica.Info
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Abstract
SE DESCUBREN NUEVAS VACUNAS PARA SU USO CONTRA LA COLONIZACION O INFECCION POR STREPTOCOCCUS BE - HEMOLITICO. LAS VAC UNAS CONTIENEN UNA CANTIDAD INMUNOGENICA DE PEPTIDASA C5A ESTREPTOCOCCICA, O UN FRAGMENTO O MUTANTE DE LA MISMA. SE DESCUBRE ASIMISMO UN METODO PARA PROTEGER UN MAMIFERO SUSCEPTIBLE CONTRA LA COLONIZACION O INFECCION POR STREPTOCOCCUS BE HEMOLITICO ADMINISTRANDO UNA VACUNA DE ESTE TIPO.
Description
Vacuna de peptidasa C5A estreptocócica.
Existen varias especies de estreptococos
\beta-hemolíticos que han sido identificadas.
Streptococcus pyogenes, denominados también estreptococos del
grupo A, es una bacteria patógena común de los humanos.
Fundamentalmente una enfermedad de los niños, causa una diversidad
de infecciones que incluyen faringitis, impétigo y sepsis en los
humanos. Subsiguientemente a la infección, pueden presentarse en los
humanos complicaciones autoinmunes tales como fiebre reumática y
glomerulonefritis aguda. Este patógeno causa también enfermedades
agudas graves tales como escarlatina, fasciítis necrotizante y
choque tóxico.
El mal de garganta causado por los estreptococos
del grupo A, denominado comúnmente "garganta estreptocócica",
asciende al menos al 16% de todas llamadas a las consultas en una
clínica de medicina general, dependiendo de la estación.
Hope-Simpson, E. "Streptococcus pyogenes in the
throat: A study in a small population,
1972-1975", J. Hyg. Camb.,
87:109-129 (1981). Esta especie es también la causa
del reciente resurgimiento en América del Norte y otros cuatro
continentes del choque tóxico asociado con la fasciítis
necrotizante. Stevens, D.L., "Invasive group A streptococcus
infections", Clin. Infect. Dis., 14:2-13
(1992). También están implicados en la causa de la garganta
estreptocócica y ocasionalmente en la causa del choque tóxico son
los estreptococos de los grupos C y G.
Hope-Simpson, E., "Streptococcus pyogenes in the
throat: A study in a small population,
1962-1975", J. Hyg. Camb., 87:
109-129 (1981).
Los estreptococos del grupo B, conocidos también
como Streptococcus agalactiae, son responsables de la sepsis
y la meningitis neonatal. T.R. Martin et al., "The effect
of type-specific polysaccharide capsule on the
clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult
rats", J. Infect. Dis., 165: 306-314
(1992). Aunque es frecuentemente un miembro de la flora de la
mucosa vaginal de las hembras adultas, de 0,1 a 0,5/1000 recién
nacidos desarrollan una enfermedad grave a consecuencia de infección
durante el parto. A pesar de la alta mortalidad de las infecciones
por los estreptococos del grupo B, los mecanismos de la patogenia
son poco conocidos. Martin, T.R. et al., "The effect of
type-specific polysaccharide capsule on the
clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult
rats", J. Infect. Dis., 165: 306-314
(1992).
Las infecciones por estreptococos se tratan
actualmente mediante terapia con antibióticos. Sin embargo, el
25-30% de los individuos tratados presentan
enfermedad recurrente y/o arrojan el organismo en las secreciones
mucosas. En el momento actual no existe ningún medio para prevenir
las infecciones estreptocócicas. Históricamente, el desarrollo de
vacunas estreptocócicas se ha enfocado en la proteína M de la
superficie de la célula bacteriana. Bessen, D. et al.,
"Influence of intranasal immunization with synthetic peptides
corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal
colonization by group A streptococci", Infect. Immun.,
56:2666-2672 (1988); Bronze, M.S. et al.,
"Protecive immunity evoked by locally administered group A
streptococcal vaccines in mice", Journal Immunology, 141:
2767-2770 (1988).
Dos problemas principales limitarán el uso, la
comercialización, y la posible aprobación por la FDA, de una vacuna
contra la proteína M. En primer lugar, existen más de 80 serotipos
M diferentes de S. pyogenes y aparecen continuamente nuevos
serotipos. Fischetti V.A., "Streptococcal M protein: molecular
design and biological behavior", Clin. Microbiol. Rev.,
2:285-314 (1989). Así, la inoculación con un solo
serotipo específico de la proteína M no será eficaz probablemente
para proteger contra otros serotipos M. El segundo problema está
relacionado con la seguridad de una vacuna contra la proteína M.
Varias regiones de la proteína M contienen epítopes antigénicos que
reaccionan inmunológicamente de manera cruzada con los tejidos
humanos, en particular con el tejido cardiaco. Los términos N de
las proteínas M son altamente variables en secuencia y
especificidad antigénica. Sería precisa la inclusión de más de 80
péptidos diferentes, que representan esta secuencia variable, en una
vacuna para conseguir una protección generalizada contra la
infección por los estreptococos del grupo A. Nuevas proteínas M
variantes continuarían apareciendo todavía, lo que requeriría una
vigilancia continua de la enfermedad estreptocócica y cambios en la
composición de la vacuna. En contraste, los términos carboxilo de
las proteínas M están conservados en secuencia. Esta región de la
proteína M, sin embargo, contiene una secuencia de aminoácidos que
reacciona inmunológicamente de manera cruzada con el tejido
cardiaco humano. Se cree que esta propiedad de la proteína M
explica el deterioro de las válvulas cardiacas asociado con la
fiebre reumática. P. Fenderson et al., ``Tropomyosinsharies
immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins,
J.Immunol. 142: 2475-2481 (1989). En una
prueba inicial, los niños que se vacunaron con proteína M en 1979
tuvieron una incidencia diez veces mayor de fiebre reumática y daño
asociado de las válvulas cardiacas. Massell, B.F. et al.,
"Rheumatic fever following streptococcal vaccination",
JAMA, 207:1115-1119 (1969).
Otras proteínas en consideración para desarrollo
de vacunas son las toxinas eritrogénicas, la exotoxina pirogénica
estreptocócica A y la exotoxina pirogénica estreptocócica B. Lee,
P.K. et al., "Quantification and toxicity of group A
streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock
syndrome-like illness", J. Clin. Microb.,
27:1890-1892 (1989). La inmunidad a estas proteínas
podría prevenir los síntomas mortales del choque tóxico, pero no
prevendrá la colonización por estreptococos, ni reducirá
probablemente la incidencia de la garganta estreptocócica.
Estimaciones realizadas sugieren que la incidencia de las
infecciones por el choque tóxico es de 10 a 20 casos por cada
población de 100.000 individuos; por consiguiente, el uso de estas
proteínas para inmunizar la población general contra choque tóxico
no es práctico ni económicamente factible.
Así pues, persiste una necesidad continuada de un
medio eficaz para prevenir o mejorar las infecciones por
estreptococos. De un modo más específico, existe necesidad de
desarrollar composiciones útiles en vacunas para prevenir o mejorar
la colonización de los tejidos del hospedador por estreptococos,
reduciendo con ello la incidencia de la garganta estreptocócica y el
impétigo. La eliminación de secuelas tales como fiebre reumática,
glomerulonefritis aguda, sepsis, choque tóxico y fasciítis
necrotizante sería una consecuencia directa de la reducción de la
incidencia de la infección aguda y el transporte del organismo.
Existe también necesidad de desarrollar composiciones útiles en
vacunas para prevenir o mejorar las infecciones causadas por todas
las especies estreptocócicas \beta-hemolíticas, a
saber los grupos A, B, C y G.
La presente invención proporciona una vacuna, y
métodos de vacunación,eficaces para prevenir o reducir la incidencia
de Streptococcus \beta-hemolíticos en
mamíferos propensos, con inclusión de humanos, y animales domésticos
tales como perros, vacas, cerdos y caballos. La vacuna comprende una
cantidad inmunógena de una peptidasa C5a estreptocócica (SCP)
enzimáticamente inactiva, o uno o más fragmentos inmunógenos o
mutantes de la misma en combinación con un vehículo no tóxico
fisiológicamente aceptable. La misma puede contener también un
adyuvante inmunológico. La vacuna puede utilizarse para prevenir la
colonización de Streptococcus del grupo A,
Streptococcus delgrupo B, Streptococcus del grupo C o
Streptococcus del grupo G. La vacuna puede comprender una
peptidasa C5a estreptocócica inmunógena recombinante enzimáticamente
inactiva, conjugada o enlazada a un péptido inmunógeno o a un
polisacárido inmunógeno.
La vacuna de peptidasa C5a estreptocócica puede
administrarse por inyección subcutánea o intramuscular.
Alternativamente, la vacuna se puede administrar por ingestión oral
o inoculación intranasal.
Como se describe en los ejemplos prácticos que
siguen, un gen SCP (scpA49) se clonó en un vector de
expresión de E. coli
(pGEX-4T-1). La fusión
transferasa-SCP del clon de E. coli se
expresó y purificó. El SCP recombinante purificado se utilizó luego
para inmunizar ratones. Los ratones vacunados y un grupo de ratones
de control se enfrentaron luego con Streptococci de tipo
salvaje. Los ratones que recibieron la vacuna SCP recombinante
estaban exentos de estreptococos poco tiempo después de la
infección, mientras que el 30-50% del grupo de
control eran positivos en cultivo durante muchos días. Por
consiguiente, la SCP recombinante era eficaz como vacuna contra
Streptococci \beta-hemolíticos.
Asimismo, un fragmento de 2908 pb del gen
scpA49, \DeltaSCPA49, se ligó al vector de expresión
pGEX-4T-1 y se expresó en E.
coli. La proteína purificada inducía títulos altos de
anticuerpos de conejo que eran capaces de neutralizar la actividad
de peptidasa in vitro asociada con el serotipo
estreptocócico M49 homólogo, así como los serotipos heterólogos M1,
M6 y M12. La inmunización intranasal de ratones con el inmunógeno
\DeltaSCPA49 estimulaba niveles significativos de IgA salivar
específica y anticuerpos IgG en el suero y reducía el potencial de
los estreptococos de tipo salvaje M1, M2, M6, M11 y M49 para
colonizar.
Así pues, la proteína SCP era eficaz como vacuna
contra varios serotipos de estreptococos.
Figura 1. Arquitectura de la peptidasa C5a de
estreptococos \beta-hemolíticos. D indica un
residuo de ácido aspártico; H indica histidina; S indica serina; L
indica leucina; P indica prolina; T indica treonina; y N indica
asparagina. R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} indican secuencias
repetidas. Los números indican la posición de los residuos de
aminoácidos en la peptidasa.
Figura 2. Alineación de la secuencia de
aminoácidos de SCP de la cepa A49 de estreptococos del grupo A, la
cepa 12 de estreptococos del grupo A y los estreptococos del grupo
B (SEQ.ID. Núms. 1, 2 y 3, respectivamente). Las secuencias son
idénticas excepto en las posiciones de aminoácidos que se indican.
El triángulo (\triangledown) indica el punto de escisión predicho
de la peptidasa de señal. Los aminoácidos cuya presencia se predice
en el sitio activo de la enzima están marcados por asteriscos. Las
deleciones en la secuencia de aminoácidos están indicadas por
puntos y están encuadradas.
Figura 3. Construcción de la inserción de SCP y
mutantes de deleción. La caja negra indica la región
delecionada.
Figura 4. Análisis FACS monocolor. Los datos de
fluorescencia se analizaron por selección en PMNs. Se ajustó una
segunda puerta para contar las células de alta tinción definidas
por la primera puerta. Se inocularon sacos de aire con 1 x 10^{6}
CFU (unidades formadoras de colonias).
Figura 5. Persistencia del tipo salvaje y
SCPA^{-} después de infección intranasal.
Figura 6. La inmunización intranasal de ratones
CD-1 con la proteína SCPA interfiere con la
colonización oral por estreptococos M de tipo 49.
Figura 7. Comparación de la capacidad de
SCPA^{-} y los mutantes M^{-} de los estreptococos del grupo A
para colonizar ratones después de infección intranasal. Compara
ratones BALB/c (diez en cada grupo experimental) inoculados con 2 x
10^{7} CFU de estreptococos M6. Se cultivaron frotis de garganta
cada día en placas de agar sangre que contenían estreptomicina. Los
ratones se consideraron positivos si las placas contenían una sola
colonia \beta-hemolítica. Los datos se analizaron
estadísticamente por el ensayo X^{2}.
Figura 8. Construcción de la vacuna
\DeltaSCPA49 y protocolo de inmunización.
Figura 9. Respuestas de IgG en suero e IgA
secretora después de inmunización intranasal de ratones con la
proteína \DeltaSCPA49 purificada. Se determinaron los niveles en
suero y saliva de IgG específica de SCPA49 por ELISA indirecto. Los
sueros procedentes de cada ratón se diluyeron a 1:2.560 en PBS; la
saliva se diluyó 1:2 en PBS.
Figura 10. Comparación de la capacidad de los
estreptococos de serotipo M49 para colonizar ratones hembra CD1
inmunizados y no inmunizados. Cada grupo experimental contenía 13
ratones que se infectaron por vía intranasal (i.n.) con 2,0 x
10^{8} CFU. Los datos se analizaron estadísticamente por el ensayo
\chi^{2}. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.
Una primera línea de defensa importante contra la
infección por muchos patógenos bacterianos es la acumulación de
leucocitos fagocíticos polimorfonucleares (PMNs) y células
mononucleares en el sitio de infección. La alteración de estas
células está medida por estímulos quimiotácticos, tales como
factores del hospedador o factores secretados por el organismo
invasor. El quimioatrayente C5a es fundamental para la estimulación
de esta respuesta inflamatoria en mamíferos. C5a es un glicopéptido
de 74 residuos escindido del quinto componente (C5) del
complemento. Las células fagocíticas responden de una manera
directa a un gradiente de C5a y se acumulan en el sitio de
infección. C5a puede ser el atrayente más inmediato de los
fagocitos durante la inflamación. A medida que se infiltran los
PMNs en una lesión inflamatoria, secretan otras quimioquinas, tales
como IL8, que intensifican ulteriormente la respuesta
inflamatoria.
La peptidasa C5a estreptocócica (SCP) es una
enzima proteolítica localizada en la superficie de los
estreptococos patógenos donde aquélla destruye C5a, a medida que se
produce localmente C5a. SCP escinde específicamente la quimiotaxina
C5a en el sitio de fijación de PMN (entre los residuos
His^{67}-Lys^{68} de C5a) y elimina los siete
residuos más próximos al terminal C de C5a. Esta escisión del sitio
de fijación de PMN elimina la señal quimiotáctica. Cleary, P., et
al. "Streptococcal C5a peptidase is a highly specific
endopeptidase", Infect. Immun.,
60:5219-5223 (1992); Wexler, D.E., et al.,
"Mechanism of action of the group A streptococcal C5a
inactivator", Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82:8144-8148 (1985).
La SCP de los estreptococos del grupo A es una
serina-proteasa semejante a la subtilisina con un
M_{r} de 124.814 daltons y con un motivo de anclaje a la
pared celular que es común a muchas proteínas de la superficie
bacteriana gram^{+}. La arquitectura de la peptidasa C5a se da en
la Figura 1. La secuencia completa de nucleótidos del gen de la
peptidasa C5a estreptocócica de Streptococcus pyogenes, ha
sido publicada. Chen, C., y Crearli, P., "Complete nucleotide
sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus
pyogenes", J. Biol. Chem., 265:3161-3167
(1990). En contraste con las subtilisinas, SCP tiene una
especificidad de sustrato muy estrecha. Esta especificidad estrecha
es sorprendente a la vista de las acusadas semejanzas entre sus
dominios catalíticos. Cleary P. et al., "Streptococcal C5a
peptidase is a highly specific endopeptidase", Infect.
Immun., 60:5219-5223 (1992). Los residuos
implicados en la transferencia de carga están conservados, como lo
están los residuos en ambos lados de la bolsa de fijación; sin
embargo, la secuencia de aminoácidos restante de SCP no es afín a
la de las subtilisinas. Se encontraron más de 40 serotipos de
estreptococos del grupo A que producen la proteína SCP o que
albergan el gen. Cleary, P. et al., "A streptococcal
inactivator of chemomotaxis: a new virulence factor specific to
group A streptococci", en Recent Advances in Streptococci and
Streptococcal Disease p. 179-180 (S. Kodami e
Y. Shiokawa compiladores; Reedbooks Ltd. Berkshire, Inglaterra;
1984); Podbielski A., et al., "The group A streptococcal
virR49 gen controls expression of four structural vir regulon
genes", Infect. Immun., 63:9-20
(1995).
Una enzima peptidasa C5a asociada con
estreptococos del grupo B ha sido también identificada. Hill, H.R.,
et al., "Group B streptococci inhibit the chemotactic
activity of the fifth component of complement", J.
Immunol., 141:3551-3556 (1988). El mapeado de
restricción y la culminación de la secuencia de nucleótidos de
scpB demostraron que scpB es similar en un
97-98% a scpA. Véase la Figura 2 para
comparación de la secuencia de aminoácidos de SCP de la cepa A49 de
estreptococos del grupo A, la cepa 12 de estreptococos del grupo A
y los estreptococos del grupo B (SEQ.ID. Núms. 1, 2 y 3,
respectivamente). Más de 30 cepas, representativas de todos los
serotipos de estreptococos del grupo B llevan el gen scpB.
Cleary P.P., et al., "similarity between the Group B and A
streptococcal C5a Peptidase genes", Infect. Immun.
60:4239-4244 (1992); Suvorov A.N., et al.,
"C5a peptidase gene from group B streptococci", en Genetics
and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci, and
Enterococci p. 230-232 (G. Dunny, P. Cleary y L.
McKay (compiladores); American Society for Microbiology,
Washington, D.C.; 1991).
Aislados humanos de estreptococos de los grupos G
y C albergan también genes semejantes a scpA. Se demostró
que algunas cepas del grupo G expresan actividad de proteasa
específica C5a en su superficie. Cleary, P.P., et al.,
"Virulent human strains of group G streptococci express a C5a
peptidase enzyme similar to that produced by group A
streptococci", Infect. Immun.,
59:2305-2310 (1991). Por esta razón, todos los
serotipos (> 80) de estreptococos del grupo A, estreptococos del
grupo B, estreptococos del grupo C y estreptococos del grupo G
producen la enzima SCP.
SCP ayuda a los estreptococos a colonizar un
sitio potencial de infección, tal como la mucosa nasofaríngea, por
inhibir la afluencia de los glóbulos blancos fagocíticos al sitio
de infección. Esto impide el aclaramiento inicial de los
estreptococos por el hospedador. Se examinó el impacto de SCP sobre
la inflamación, la quimiotaxis de los leucocitos C5a y la
virulencia estreptocócica utilizando cepas de estreptococos con
mutaciones bien definidas en el gen estructural de proteasa. Se
construyeron mutantes de SCP por inserción direccionada de
plásmidos y por reemplazamiento del gen de tipo salvaje con
scpA que contenía una deleción interna específica. Los
mutantes carecían de actividad de proteasa C5a y no inhibían la
respuesta quimiotáctica de los PMNs humanos o de ratón a C5a in
vitro.
Se utilizó un modelo de saco de aire de tejido
conectivo de ratón para confirmar que SCP retarda la afluencia de
las células fagocíticas y el aclaramiento de los estreptococos del
sitio de infección. Se genera un saco de aire de tejido conectivo
por inyección de una pequeña cantidad de aire y PBS (con o sin
estreptococos en él) con una aguja de calibre 25 bajo la piel del
lomo de un ratón. Boyle, M.D.P. et al., "Measurement of
leukocyte chemotaxis in vivo", Meth. Enzymol.,
162:101-115 (1988). Al final del experimento, los
ratones se sacrificaron por dislocación cervical, se extirparon los
sacos de aire de los animales, y se homogeneizaron los sacos de
aire en tampón. Una ventaja del modelo de sacos de aire es que el
saco de aire se mantiene inflado durante varios días y exento de
inflamación, a no ser que se inyecte un irritante. Así, las
bacterias inyectadas y la respuesta inflamatoria resultante se
mantienen localizadas durante periodos de infección cortos.
El modelo de saco de aire se modificó para
comparar el aclaramiento de los estreptococos SCP^{+} y SCP^{-}
de tipo salvaje, (es decir, estreptococos del grupo A que llevaban
una forma mutante no funcional de SCP) y para analizar el
infiltrado celular en una etapa precoz de la infección. Se ensayaron
suspensiones de tejidos en cuanto a estreptococos viables en placas
de agar sangre, y se analizó el infiltrado celular por
clasificación de células fluorescentes (FACS). En el análisis FACS,
las células individuales en suspensión se marcan con
monoanticuerpos fluorescentes específicos. Se inyectan partes
alícuotas de las células marcadas en un citómetro de flujo
FAC-Scan, o clasificador de células fluorescentes,
que cuenta las células basándose en su fluorescencia singular. Los
experimentos que utilizaron el modelo de sacos de aire indicaban
que los estreptococos que eran SCP^{+} eran más virulentos que
los estreptococos que
\hbox{eran SCP ^{-} .}
Se realizó un estudio para medir la producción de
anticuerpo humano, tanto IgG como IgA, contra SCP en suero y saliva
humanos. O'Connor, SP, et al., "The Human Antibody
Response to Streptococcal C5a Peptidase", J. Infect. Dis.
163:109-116 (1991). Generalmente, el suero y la
saliva de los muchachos jóvenes no infectados carecían de
anticuerpo para SCP. En contraste, la mayor parte de las muestras
de suero y saliva de adultos sanos tenían niveles apreciables de
IgG anti-SCP e IgA secretora específica de SCP (IgA
anti-SCP). Los sueros agudos y convalecientes
apareados de pacientes con faringitis estreptocócica poseían
niveles significativamente mayores de IgG anti-SCP
que los sueros procedentes de individuos sanos. Los sueros que
contenían altas concentraciones de inmunoglobulina
anti-SCP eran capaces de neutralizar la actividad
de SCP. La detección de este anticuerpo en > 90% de las muestras
de saliva obtenidas de niños que habían sufrido recientemente
faringitis estreptocócica demostró que los niños pueden producir
una respuesta de anticuerpos.
Aun cuando los individuos humanos producían IgG e
IgA contra SCP en respuesta a una infección estreptocócica natural,
no se sabía si la inmunoglobulina anti-SCP
proporciona alguna protección contra la infección. La base para la
inmunidad a la infección estreptocócica subsiguiente a la infección
natural es deficientemente comprendida. Adicionalmente, no se sabía
si la proteína SCP podría actuar como vacuna contra la colonización
o infección estreptocócica \beta-hemolítica. Se
realizó primeramente un estudio para examinar el papel de SCP en la
colonización de la nasofaringe. Después de infección intranasal con
estreptococos vivos del grupo A, se tomaron diariamente cultivos de
garganta durante hasta diez días. Se compararon los estreptococos
mutantes de tipo salvaje y mutantes isogénicos deficientes en SCP en
cuanto a la capacidad de persistir en la garganta durante este
periodo de diez días. Como se había predicho, los estreptococos
mutantes deficientes en SCP se aclararon de la nasofaringe más
rápidamente.
Se utilizó el mismo modelo intranasal de ratón
para ensayar la capacidad de SCP para inducir inmunidad que pueda
prevenir la colonización. Una forma mutante del gen recombinante
scpA49 (que carecía de los nucleótidos
848-1033 desde el extremo 5' y los nucleótidos
3941-4346 desde el extremo 3' del gen) se clonó en
y se expresó a partir del vector de alta expresión
pGEX-4T-1. La proteína SCP
enzimáticamente defectiva se purificó a partir de un recombinante
de E. coli por cromatografía de afinidad. Los sueros de
conejos vacunados intradérmicamente con esta preparación de
proteína neutralizaban la actividad de SCP in vitro. La
proteína purificada (40 \mug) se administró intranasalmente a
ratones a lo largo de un periodo de cinco semanas. Los ratones
inmunizados aclaraban los estreptococos en 1-2 días;
en tanto que los cultivos de garganta de ratones no inmunizados se
mantenían positivos durante hasta 10 días. El experimento se repitió
en tres series de ratones, vacunados con tres reparaciones
separadas de una proteína SCP.
Se realizaron experimentos adicionales para
determinar si la inmunización de un animal con una peptidasa C5a
estreptocócica de un serotipo del grupo A podría prevenir la
colonización por serotipos heterólogos. Un fragmento de 2908 pb del
gen scpA49 se clonó en un vector de expresión y se expresó en
E. coli. La proteína \DeltaSCPA49 purificada por afinidad
demostró ser altamente inmunógena en ratones y conejos. Aunque el
inmunógeno \DeltaSCPA49 purificado carecía de actividad
enzimática, inducía títulos altos de anticuerpos de conejo que eran
capaces de neutralizar la actividad de peptidasa in vitro
asociada con los estreptococos M1, M6, M12 y M49. Esto confirmó que
los anticuerpos anti-peptidasa poseen actividad de
anticuerpos neutralizante cruzadamente. Se inmunizaron luego por
vía intranasal cuatro series de ratones con \DeltaSCPA49 y se
enfrentó cada uno con un serotipo diferente de estreptococos del
grupo A. La inmunización de ratones con la forma delecionada de la
proteína SCPA49 estimulaba niveles importantes de anticuerpos
específicos IgA salivares e IgG en suero y reducía el potencial de
los estreptococos de tipo salvaje M1, M2, M6, M11 y M49 para
colonizar. Estos experimentos confirman que la inmunización con la
vacuna de peptidasa estreptocócica C5a es eficaz para prevenir la
colonización de la nasofaringe.
La presente invención proporciona por tanto una
vacuna para uso a fin de proteger los mamíferos contra la
colonización o infección por Streptococcus
\beta-hemolíticos. En una realización de esta
invención, como es habitual para las vacunas, la peptidasa C5a
estreptocócica enzimáticamente inactiva, una variante o fragmento
de la misma, puede suministrarse a un mamífero en un vehículo
farmacológicamente aceptable. Como apreciarán los expertos en la
técnica, no es necesario utilizar la proteína entera. Puede
utilizarse una porción seleccionada del polipéptido (por ejemplo,
un polipéptido inmunógeno sintético correspondiente a una porción
de la peptidasa C5a estreptocócica).
Como apreciarán también los expertos en la
técnica, no es necesario utilizar un polipéptido que sea idéntico a
la secuencia de aminoácidos de SCP nativa. La secuencia de
aminoácidos del polipéptido inmunógeno puede corresponder
esencialmente a la secuencia de aminoácidos de SCP nativa. Tal como
se utiliza en esta memoria "corresponder esencialmente a" hace
referencia a una secuencia de polipéptido que suscitará una
respuesta inmunológica protectora al menos sustancialmente
equivalente a la respuesta generada por la SCP nativa. Una
respuesta inmunológica a una composición o vacuna es el desarrollo
en el hospedador de una respuesta inmune celular y/o mediada por
anticuerpos al polipéptido o vacuna de interés. Usualmente, una
respuesta de este tipo consiste en la producción por el individuo
de anticuerpos, células B, células T adyuvantes, células T
supresoras, y/o células T citotóxicas dirigidas específicamente
contra un antígeno o antígenos incluido(s) en la composición
o vacuna de interés. Las vacunas de la presente invención pueden
incluir también cantidades eficaces de adyuvantes inmunológicos,
conocidos por aumentar una respuesta inmune.
Alternativamente, la SCP de la invención puede
conjugarse o enlazarse a otro péptido o a un polisacárido. Por
ejemplo, pueden emplearse proteínas inmunógenas bien conocidas en
la técnica, conocidas también como "portadores". Proteínas
inmunógenas útiles incluyen hemocianina de lapa bocallave (KLH),
seroalbúmina bovina (BSA), ovoalbúmina, seroalbúmina humana,
gamma-globulina humana, inmunoglobulina G de pollo
y gamma-globulina bovina. Polisacáridos inmunógenos
útiles incluyen el polisacárido de Streptococci del grupo A,
polisacárido C de Streptococci del grupo B, o el polisacárido
capsular de Streptococci pneumoniae. Alternativamente,
polisacáridos de otros patógenos que se utilizan como vacunas
pueden conjugarse o enlazarse a SCP.
Para inmunizar un individuo, la SCP de la
invención o un fragmento o mutante inmunológicamente activo de la
misma, se administra por vía parenteral, usualmente por inyección
intramuscular o subcutánea en un vehículo apropiado. Sin embargo,
son también aceptables otros modos de administración, tales como
suministro oral o suministro intranasal. Las formulaciones de vacuna
contendrán una cantidad eficaz del ingrediente activo en un
vehículo, siendo la cantidad eficaz determinada fácilmente por un
experto en la técnica. El ingrediente activo puede constituir por
regla general desde aproximadamente 1% a aproximadamente 95% (p/p)
de la composición, o incluso una proporción mayor o menor en caso
apropiado. La cantidad a administrar depende de factores tales como
la edad, el peso y la condición física del individuo o animal o
humano considerado para vacunación. La cantidad depende también de
la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar
anticuerpos, y del grado de protección deseado. Las dosificaciones
eficaces pueden ser establecidas fácilmente por una persona con
experiencia ordinaria en la técnica mediante pruebas de rutina que
establecen curvas de respuesta a la dosis. El individuo se inmuniza
por administración de la SCP de la invención o fragmento de la
misma en una o más dosis. Pueden administrarse dosis múltiples en
caso requerido para mantener un estado de inmunidad a los
estreptococos.
Las formulaciones intranasales pueden incluir
vehículos que no causan irritación a la mucosa nasal ni perturban
significativamente la función ciliar. Diluyentes tales como agua,
solución salina acuosa u otras sustancias conocidas pueden
emplearse con la presente invención. Las formulaciones nasales
pueden contener también, pero sin carácter limitante, conservantes
tales como clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar
presente un agente tensioactivo para mejorar la absorción de las
presentes proteínas por la mucosa nasal.
Las preparaciones orales líquidas pueden
encontrarse en forma de, por ejemplo, suspensión acuosa o aceitosa,
soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse
secas en forma de tableta o un producto para reconstitución con
agua u otro vehículo adecuado antes de su utilización. Tales
preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales
como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no
acuoso (que pueden incluir aceites comestibles) o conservante.
Para preparar una vacuna, la SCP, subunidad o
mutante de la misma purificada de la invención, puede aislarse,
liofilizarse y estabilizarse. El péptido SCP puede ajustarse luego a
una concentración apropiada, combinarse opcionalmente con un
adyuvante adecuado para vacunas, y empaquetarse para su utilización.
Adyuvantes adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, agentes
tensioactivos, v.g., hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina,
bromuro de dimetildioctadecilamonio,
N,N-dioctadecil-N'-N-bis(2-hidroxietil-propano-diamina),metoxihexadecil-glicerol,
y polioles de tipo Pluronic; polianiones, v.g., pirano, sulfato de
dextrano, poli-IC, poli(ácido acrílico), carbopol;
péptidos, v.g., muramil-dipéptido, dimetilglicina,
tuftsina, emulsiones de aceite, alumbre, y sus mezclas. Otros
adyuvantes potenciales incluyen las subunidades del péptido B de la
toxina termolábil de E. coli o de la toxina del cólera.
McGhee, J.R., et al., "On vaccine development", Sem.
Hematol., 30:3-15 (1993). Finalmente, el
producto inmunógeno puede incorporarse en liposomas para uso en una
formulación de vacuna, o puede conjugarse a proteínas tales como
hemocianina de lapa bocallave (KLH) o seroalbúmina humana (HSA) u
otros polímeros.
La aplicación de SCP, subunidad o mutante de la
misma de la invención, para vacunación de un mamífero contra la
colonización presenta ventajas sobre otras vacunas candidato. La
prevención de la colonización o infección por inoculación con una
sola proteína no sólo reducirá la incidencia de los problemas muy
frecuentes de garganta estreptocócica e impétigo, sino que
eliminará también secuelas tales como fiebre reumática,
glomerulonefritis aguda, sepsis, choque tóxico y fasciítis
necrotizante.
Los ejemplos siguientes tienen por objeto
ilustrar la invención, pero no limitarla.
a) Cepas bacterianas y condiciones de
cultivo. La cepa CS101 de S. pyogenes es una cepa de
serotipo M49, y OF^{+}. CS159 es un aislado clínico con una
deleción que se extiende a lo largo de la agrupación de genes M y
scpA. Un derivado espontáneo, resistente a estreptomicina de
la cepa CS101, designado CS101Sm, se seleccionó por extensión en
placa de estreptococos procedentes de un cultivo en fase
estacionaria sobre agar triptosa-sangre que
contenía estreptomicina (200 \mug/ml). CS101::pG^{+}host5 es la
cepa CS101 con pG^{+}host5 integrado en el cromosoma en una
localización desconocida, pero fuera de scpA y de la
agrupación de genes emm. La cepa ER1821 de Escherichia
coli (de New England Biolabs, Inc. Beverly, MA) se utilizó como
el receptor para el vector suicida, plásmido pG^{+}host5. El
plásmido pG^{+}host5 se obtuvo de Appligene, Inc. Pleasanton, CA.
Los estreptococos se cultivaron en caldo de
Todd-Hewitt complementado con 2% de neopeptona o 1%
de extracto de levadura, o en placas de agar triptosa con 5% de
sangre de oveja. La cepa ER1821 de E. coli que contenía el
plásmido pG^{+}host5 se cultivó en caldo LB con eritromicina (300
\mug/ml). Los estreptococos con el plásmido pG^{+}host5 se
cultivaron en caldo Todd-Hewitt con 1% de extracto
de levadura (THY) que contenía 1 \mug/ml de eritromicina
(Erm).
SCP se refiere generalmente a la peptidasa
estreptocócica C5a de Streptococcus
\beta-hemolítico. SCPA12, SCPA49, SCPA6 son las
peptidasas específicas de las cepas 12, 49 y 6 de tipo M de
Streptococcus del grupo A, respectivamente. El término
scpA hace referencia al gen codificante de SCP de los
estreptococos del grupo A. ScpA12, scpA6 y scpA49 son
los genes codificantes de las peptidasas SCPA12, SCPA49 y SCPA6.
SCPB y scpB hacen referencia a la peptidasa y el gen de los
estreptococos del grupo B. Las secuencias de aminoácidos para
SCPA49 (SEQ.ID.No.1), SCPA12 (SEQ.ID.No.2) y SCPB (SEQ.ID.No.3) se
dan en la Figura 2.
b) Construcción del mutante de
inserción scpA . Se construyeron mutantes de inserción
bien definidos de scpA utilizando inserción de plásmidos y
métodos de reemplazamiento de genes. Un fragmento interno scpA49
BglII-BamHI, la diana de inserción, se ligó al
vector lanzadera termosensible pG^{+}host5 para formar el plásmido
pG::SCPA1.2 y se transformó en E. coli ER1821 (Fig. 3). El
vector pG^{+}host5 contiene un origen de replicación de E.
coli que es activo a 39ºC, un origen de replicación Gram^{+}
sensible a la temperatura (activo a 30ºC e inactivo a 39ºC en
estreptococos), y un gen de resistencia a la eritromicina para
selección. La temperatura alta fuerza al plásmido a integrarse en
el DNA cromosómico de los estreptococos del grupo A por recombinante
homólogo a frecuencias que van desde 10^{-2} a 10^{-3}.
El DNA del plásmido recombinante pG::SCPA1.2 se
sometió a electroporación en células receptoras CS101. Se
seleccionaron transformantes sobre placas de agar THY que contenían
1 \mug/ml de eritromicina a 30ºC. Los integrantes cromosómicos
que resultaron de la recombinación entre la inserción del plásmido
y el scpA cromosómico se seleccionaron por resistencia a la
eritromicina a 39ºC. Se analizaron dos mutantes de inserción, M14 y
M16. Se obtuvieron reversores EmrS de las cepas M14 y M16 por paso
en THY sin antibiótico a 30ºC y se extendieron finalmente en placas
a 37ºC sin selección de Erm. Las colonias que habían perdido el
plásmido se aislaron para confirmar que el fenotipo mutante era
resultado de la inserción del plásmido en scpA49, más bien
que de una mutación simultánea no afín.
c) Introducción de una deleción
definida en scpA . Se construyó una cepa mutante con una
deleción definida interna a scpA para eliminar la
posibilidad de que las inserciones en scpA pudieran ser
polares y redujeran la expresión de los genes situados aguas abajo,
genes desconocidos que podrían contribuir también a la virulencia
del organismo. En primer lugar, se produjo una deleción definida en
el fragmento BglII-HindIII de scpA por PCR de
dentro afuera con el iniciador 1
(5'-GGGGGGGAATTC GTAGCGGGTATCATGGGAC-3'),
SEQ.ID.No.4, y el iniciador 2
(5'-GGGGGGGAATTC GGGTGCTGCAATATC-
TGGC-3'), SEQ.ID.No.5. Los nucleótidos
subrayados corresponden a secuencias de scpA con coordenadas
2398 y 2322, respectivamente, y los nucleótidos en tipo negrita
corresponden a un sitio de reconocimiento por EcoRI. Los
iniciadores se seleccionaron para producir una deleción en marco en
el gen scpA. Estos iniciadores copian el DNA del plásmido en
direcciones opuestas y definen los límites de la deleción. Innis,
M.A. et al., compiladores, PCR Protocols A Guide to
Methods and Applications (Academic Press, 1990). Como molde se
utilizó DNA del plásmido pG::scpA1.2.
El producto multiplicado se digirió con
EcoRI y se ligó al plásmido pG^{+}host5. El plásmido
pG::\DeltaAuml;scpA1.1 resultante contenía una deleción de 76 pb
interna a scpA. Esta deleción en marco eliminaba 25
aminoácidos, con inclusión de la serina que forma parte del centro
catalítico predicho de las serina-proteasas. Chen,
C., y Cleary, P., "Complete nucleotide sequence of the
streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes",
J. Biol. Chem., 265:3161-3167 (1990). Se creó
un sitio EcoRV en el punto de deleción. El DNA que solapa la
deleción se secuenció para confirmar los límites de la
deleción.
El plásmido pG::scpA1.1, que contiene la
deleción, se transformó en E. coli ER1821. Se seleccionaron
colonias para ErmR y se escrutaron luego respecto a la deleción
scpA apropiada utilizando DNA de plásmido miniprep
restringido por EcoRI. Los límites precisos de la deleción se
confirmaron por secuenciación del DNA. El plásmido pG::
\DeltascpA1.1 se sometió a electroporación en la cepa CS101Sm
como se ha descrito arriba, después de lo cual se seleccionaron los
integrantes por cultivo en Erm a 39ºC e integración del plásmido en
el cromosoma de la cepa M49 SC101sm utilizando selección a alta
temperatura. La localización de la inserción se confirmó por PCR. El
cultivo de CS101Sm (pG::scpA1.1) a baja temperatura sin
selección por eritromicina dio como resultado una segregación de
alta frecuencia de reversores de ErmS que han perdido el plásmido
por un suceso de deleción aleatoria o por escisión debida a
recombinación entre las secuencias scpA duplicadas creadas
por la inserción. Se identificaron dos mutantes de deleción,
MJ2-5 y MJ3-15, y se estudiaron
ulteriormente. La deleción cromosómica dejada atrás por escisión
recombinatoria del plásmido pG::scpA1.1 se definió por PCR e
hibridación Southern a DNA digerido con EcoRV.
d) Efectos in vitro sobre
SCP. El impacto de las inserciones y deleciones sobre la
expresión del antígeno SCP y la actividad de peptidasa se evaluó
por transferencia Western y ensayos de adherencia a PMNs. Se
incubaron estreptococos en 100 ml de THY a 37ºC durante una noche.
El pelet de cultivo se lavó dos veces en 5 ml de acetato de sodio
0,2 M frío (pH 5,2), y se suspendió luego en 1 ml de tampón
TE-sacarosa (20% sacarosa, Tris 10 mM, EDTA 1 mM,
pH 7,0) y 40 \mul de Mutanolisina. La mezcla se dejó en rotación
a 37ºC durante 2 horas, y se centrifugó luego 5 min a 4500 rpm. Los
sobrenadantes contenían inhibidor de proteasa, fluoruro de
fenilmetil-sulfonilo 100 mM (PMSF). La
electroforesis y los métodos de transferencia Western se realizaron
como se describe en Laemmli, U.K., "Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4",
Nature 227:680-685 (1970). Para las
transferencias de colonias, se cultivaron las colonias sobre placas
de agar THY, se estamparon sobre membranas de nitrocelulosa
(BioBlot-Nc, Costor, Cambridge, MA), se fijaron bajo
una lámpara infrarroja durante 10 min y se expusieron al
anticuerpo. O'Connor, S.P. y Cleary, P.P., "In vivo
Streptococcus pyogenes C5a peptidase activity", J. Infect.
Dis. 156:495-506 (1987). El antisuero primario
utilizado para detectar la proteína SCP en las transferencias
Western y de colonias se preparó por inmunización de un conejo con
proteína SCP recombinante purificada. La fijación se detectó por el
conjugado de fosfatasa alcalina con anticuerpos
anti-ratón.
Se midió la actividad de peptidasa C5a utilizando
un ensayo de adherencia de PMN. Booth, S.A. et al.,
"Dapsone suppresses integrin-mediated neutrophil
adherence function", J. Invest. Dermatol.
98:135-140 (1992). Después de incubación de C5a
(Sigma, St. Louis, MO) con extractos estreptocócicos o proteasa
purificada, la C5a residual puede activar los PMNs para hacerlos
adherentes a los pocillos recubiertos con BSA. En primer lugar, los
pocillos de microtitulación se recubrieron con 0,5% BSA en PBS y se
incubaron durante una hora a 37ºC. Los PMNs humanos se aislaron por
centrifugación en Ficoll Hypaque (Sigma, St. Louis, MO). 40 \mul
de estreptococos intactos o extractos de proteína se incubaron con
20 \mul de C5a 5 \muM en 340 \mul de PBS con 1% de glucosa y
0,1% de CaCl_{2} a 37ºC durante 45 min. Los pocillos recubiertos
con BSA se lavaron con PBS, y se añadieron a los pocillos PMNs
resuspendidos y C5a residual. La mezcla se incubó durante 45 min a
37ºC en 7% de CO_{2}. Finalmente, los pocillos se lavaron para
eliminar los PMNs no adherentes. Los PMNs adherentes se tiñeron con
violeta cristal y se leyó la DO_{570nm} en un lector ELISA. La
densidad óptica es proporcional a la cantidad de C5a residual o
inversamente proporcional a la cantidad de actividad de SCP.
Los mutantes de inserción carecían por completo
del antígeno SCPA49; en tanto que los mutantes de deleción
MJ2-5 y MJ3-15, como era de esperar,
producían antígeno SCP. Tanto las células enteras como los
extractos de la proteína mutanolisina de M14, M16,
MJ2-5 y MJ3-15 carecían de la
capacidad para destruir la adherencia activada por rC5a de los PMNs
a las placas de microtitulación. Una pequeña cantidad de actividad
inhibidora residual (10-15%) asociada con los
extractos mutantes puede ser debida a efectos tóxicos del extracto
sobre los neutrófilos.
Con objeto de comprobar que SCP era responsable
de la desactivación de C5a, se construyeron los mutantes de
inserción y deleción de scpA como se describe en el Ejemplo
1 anterior, y se ensayaron en cuanto a actividad. Cuando se
introdujeron inserciones o deleciones en scpA, la SCP mutante
no era capaz de destruir la adherencia activada por C5a de los PMNs
a las placas de microtitulación.
El impacto de las mutaciones en scpA sobre
la virulencia se ensayó utilizando un modelo animal en el cual los
estreptococos se mantenían localizados, y en el cual podía
analizarse la afluencia de células inflamatorias. Para ensayar la
hipótesis de que SCP funciona muy precozmente para retardar el
aclaramiento inicial del organismo, se comparó el destino de los
estreptococos SCP^{+} y SCP^{-} exactamente 4 horas después de
la inoculación de sacos de aire de tejido conectivo. Además, se
evaluó también la diseminación de estreptococos a los nódulos
linfáticos y los bazos después de este breve período de infección.
Se utilizaron para todos los experimentos ratones macho CD1
reproducidos por exogamia (25 g) obtenidos de Charles River
Breeding Laboratory, Wilmington, MA. Se generó un saco de aire de
tejido conectivo por inyección de 0,9 ml de aire y 0,1 ml de
estreptococos del grupo A diluidos en PBS con una aguja de calibre
25 bajo la piel del lomo del ratón. En algunos experimentos, se
utilizó el CS101::pG^{+}host5 de SCP^{+} como control positivo.
En otros experimentos se utilizó la cepa GS101Sm como el control
positivo. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical 4
horas después de la infección. Donde se indica, la totalidad de los
cuatro ganglios linfáticos inguinales, el bazo y el saco de aire se
extirparon de los animales y se homogeneizaron en PBS. Se ensayaron
suspensiones de tejidos en cuanto a unidades formadoras de colonias
viables (CFU) sobre placas de agar sangre que contenían 1 \mug/ml
de eritromicina o 200 \mug/ml de estreptomicina.
En un experimento preliminar, los sacos de aire
se fijaron sobre portaobjetos, se tiñeron con tinte Wright y se
examinaron al microscopio. Aunque los recuentos de granulocitos por
este método no eran fiables, parecía haber significativamente menos
SCP^{-} residual que estreptococos de tipo salvaje en el tejido
fijado. Se realizaron experimentos adicionales en un intento de
medir esta diferencia. Se prepararon poblaciones de sacos de aire
de células dispersadas por trituración del saco de aire en PBS y
paso de los mismos a través de malla de monofilamentos de nailon
(TETKO Co., Nueva York).
Las células se redujeron a un sedimento por
centrifugación durante 5 min a 300 x g y se resuspendieron a 5 x
10^{6} ml en tampón FACS (solución salina equilibrada de Hank sin
rojo de fenol, 0,1% de NaN_{3}, 1% de fracción V de BSA). Las
células (1,0 x 10^{6}) se tiñeron directamente con 1 \mug de
Mac-1 FITC anti-ratón o
indirectamente con 1 \mug de Gr-1
anti-ratón conjugado con biotina seguido por 1
\mug de estreptavidina marcada con fluoresceno o FITC. Los
anticuerpos monoclonales, Mac-1 y
Gr-1, se obtuvieron de Pharmingen, Inc. CA. Las
células marcadas se fijaron en paraformaldehído al 1,0%. Se
generaron perfiles de fluorescencia utilizando un citómetro de
flujo FAC-Scan y soporte lógico Consort 32 (Becton
Dickinson). Los PMNs de ratón se purificaron de sangre entera por
centrifugación en gradiente de densidad Ficoll Hypaque y se
utilizaron como estándar para PMNs definidos en poblaciones mixtas.
Para la medida de células marcadas específicamente, se determinó la
fluorescencia media para cada marcador de anticuerpo y se
establecieron puertas para reflejar las células marcadas
intensamente. Los controles incluyeron células sin teñir, y células
expuestas únicamente a estreptavidina-FITC.
Se realizaron dos experimentos. El primero
comparó el mutante de inserción M16 de scpA49 con su cultivo
originario SCP^{+}, cepa CS101. El segundo comparó el mutante de
deleción MJ3-15 de scpA49, con su cepa
originaria CS101Sm. (Tabla 1). En ambos experimentos, los sacos de
aire homogeneizados procedentes de ratones inoculados con
estreptococos SCP^{-} contenían números inferiores de
estreptococos después de 4 horas que los sacos de aire inoculados
con estreptococos de tipo salvaje. El primer experimento demostró
una reducción de dos veces y el segundo demostró una reducción de
cuatro veces. Estas diferencias eran estadísticamente
significativas a P < 0,05 y P < 0,001, respectivamente,
utilizando un ensayo t desapareado. Se observó también que los
estreptococos SCP^{+} de tipo salvaje se encontraban en los
homogeneizados de bazo de 7 de cada 8 ratones y 6 de cada 8
ratones; mientras que los mutantes SCP^{-} se encontraban rara
vez en el bazo. Lo contrario sucedía en el caso de los
homogeneizados de ganglios linfáticos. Los ganglios de 10 de cada 16
ratones infectados con estreptococos SCP^{-} albergaban
estreptococos viables; mientras que solamente 4 de 16 ganglios de
los ratones infectados con estreptococos de tipo salvaje contenían
bacterias viables. Esta diferencia resultó ser estadísticamente
significativa para P < 0,05 utilizando el ensayo exacto de
Fisher.
El aclaramiento más rápido de los estreptococos
de los sacos de aire era resultado de un reclutamiento más intenso
de PMNs. La población total de células, el porcentaje de
granulocitos positivos a Mac-1 (Springer, G. et
al., "Mac-1: macrophage differentiation
antigen identified by monoclonal antibody", Eur. J.
Immunol. 9:301-306 (1979)), y el porcentaje de
PMN positivos a Gr-1 (Brummer E. et al.,
"Immunological activation of polymorphonuclear neutrophils for
fungal killing: studies with murine cells and blastomyces
dermatitidis in vitro", J. Leuko. Bio.
36:505-520 (1984)) en los sacos de aire se
compararon por análisis FACS monocolor. Clark J.M., "A new method
for quantitation of cell-mediated immunity in the
mouse", J. Reticuloendothel. Soc.
25:255-267 (1979). Resumidamente, en un análisis
FACS, las células individuales en suspensión se marcaron con
monoanticuerpos fluorescentes específicos. Partes alícuotas de
células marcadas se inyectan en un citómetro de flujo
FAC-Scan o clasificador de células fluorescentes que
cuenta las células basándose en su fluorescencia singular.
Los sacos de aire infectados con el mutante de
deleción SCP^{-} contenían un número de células inflamatorias
doble que los inoculados con estreptococos SCP^{+} (Fig. 4). Un
aumento de 100 veces en el tamaño del inoculante no alteraba esta
diferencia. Los sacos de aire infectados con 1 x 10^{6} células
SCP^{-}, cepa MJ3-15, contenían tres veces más
células positivas a Gr-1 que los inoculados con el
cultivo SCP^{+}. En los sacos de aire inoculados con
estreptococos SCP^{+}, aproximadamente el 6% de las células eran
PMNs y el 21% eran otras clases de granulocitos
Mac-1^{+}, con inclusión de PMNs. En contraste,
los sacos de aire inoculados con estreptococos SCP^{-} contenían
predominantemente PMNs. El número de células positivas a
Gr-1 era igual a o mayor que el número de células
positivas a Mac-1. Se dispusieron puertas para el
citómetro de flujo a fin de medir únicamente los granulocitos
teñidos fuertemente. El 70-80% de células restantes
que no se teñían con ningún anticuerpo eran probablemente o bien
granulocitos de baja tinción, glóbulos rojos de la sangre o
linfocitos. Se observaron microscópicamente grandes números de
linfocitos en las preparaciones de sacos aéreos teñidas con
Wrights.
Las colonias SCP^{+} de estreptococos que
emergían de los homogeneizados de bazo estaban muy encapsuladas,
asemejándose a gotas de agua. En contraste con las pocas colonias
SCP^{-} procedentes de ganglios linfáticos, se asemejaban más al
inoculante. Dichas colonias eran mezclas de colonias no mucoides y
moderadamente mucoides. Estos datos sugieren que los estreptococos
M^{+}SCP^{+} encapsulados pueden adaptarse, multiplicarse e
invadir el torrente sanguíneo en el transcurso de 4 horas después
de la infección. La base para el tráfico diferencial de
estreptococos mutantes y de tipo salvaje puede ser debida a la
afluencia más enérgica de las células fagocíticas en respuesta a
las bacterias SCP^{-}. Los macrófagos y/o células dendríticas de
la piel pueden engolfar más rápidamente estreptococos SCP y
suministrarlos a los ganglios linfáticos. La reducción de
estreptococos mutantes con relación al tipo salvaje es un
descubrimiento inesperado, dado que los estreptococos SCP^{-}son
M^{+}y resistentes a la fagocitosis por los neutrófilos humanos
in vitro.
Se inocularon ratones por vía intranasal para
evaluar la capacidad relativa de los estreptococos de tipo salvaje
(SCP^{+}) y SCP^{-} para colonizar la nasofaringe. En estos
experimentos se utilizaron la cepa M49 CS101 resistente a la
estreptomicina y el mutante de deleción MJ3-15. Los
cultivos no se pasaron en ratones a fin de evitar la selección de
variantes que podrían ser únicamente virulentas en el ratón, pero
no depender ya de la proteína M y/o SCP para persistencia en el
animal.
Ratones CD1 reproducidos por exogamia se
inocularon por vía intranasal con 2 x 10^{8} CFU en fase
estacionaria. Se obtuvieron diariamente frotis de las nasofaringes
de los ratones anestesiados durante 8-10 días y se
aplicaron en bandas en agar sangre que contenía estreptomicina. Las
diferencias entre SCP^{+} y SCP^{-} eran evidentes el día 1;
sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente
significativas hasta los días 3 y 4 (Fig. 5). Llegado el día
cuatro, 9/18 ratones infectados con estreptococos M^{+}SCP^{+}
producían cultivos de garganta positivos, mientras que sólo 2/18
ratones infectados con la cepa M^{+}SCP^{-} retenían
estreptococos en sus gargantas. Cuatro de 18 ratones murieron por
infección con estreptococos SCP^{+}. Ninguno de los ratones
procedentes de la infección con bacterias SCP^{-} sucumbió a la
infección. Los números de colonias en las placas de agar sangre
eran también consistentes con el aclaramiento más rápido de los
estreptococos SCP^{-}. Por ejemplo, el tercer día, los cultivos de
7 ratones contenían >100 CFU SCP^{+}, mientras que únicamente
1 ratón inoculado con estreptococos SCP^{-} contenía >100
CFU.
Dado que los estreptococos M49 están asociados
más frecuentemente con infecciones de la piel, se repitieron los
experimentos anteriores con una cepa M16, un serotipo asociado más
frecuentemente con las infecciones de garganta. Se construyó un
mutante de inserción, la cepa AK1.4, utilizando la cepa UAB200 M6 y
la estrategia descrita previamente en el Ejemplo 1. La cepa AK1.4 se
aclaraba también más rápidamente que el cultivo de M6 de tipo
salvaje de la nasofaringe. Los experimentos anteriores confirman
que los estreptococos del grupo A dependen de SCP para su
persistencia en la nasofaringe del ratón. Todos los mutantes
SCP^{-} utilizados en los experimentos anteriores eran M^{+}, es
decir resistían a la fagocitosis por la sangre humana reciente. Sin
embargo, se aclaraban de la mucosa nasofarín-
gea.
gea.
Un fragmento PCR que corresponde a una forma
delecionada del gen scpA49 se clonó a partir de
estreptococos CS101 M49, grupo A. Este fragmento se multiplicó por
PCR utilizando un iniciador directo que comenzaba en el nucleótido
1033 y un iniciador inverso que comenzaba en el nucleótido 3941 (la
numeración corresponde a la de Chen. C., y Cleary, P., "Complete
nucleotide sequence of the streptococal C5a peptidase gene of
Streptococcus pyogenes", J. Biol. Chem., 265:
3161-3167 (1990)). El fragmento se ligó al sitio de
fijación de trombina del gen de
glutatión-transferasa en el vector de alta expresión
pGEX-4T-1, de Pharmacia Inc. El
plásmido que contiene scpA designado pJC6 ha sido depositado
en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, 20852, EE.UU. en virtud de las disposiciones del
Tratado de Budapest el 15 de octubre de 1966, y le ha sido asignado
el número de acceso ATCC 98225.
La proteína de fusión
transferasa-SCP de un clon de E. coli se
expresó y purificó por cromatografía de afinidad en una columna de
glutatión-Sepharose 4b. Todos los métodos se
describen por el fabricante (Pharmacia). El dSCP se escindió de la
proteína híbrida por digestión con trombina. La trombina se separó
de la SCP eluida por cromatografía en una columna de benzamidina
Sepharose 6B (Pharmacia). Se confirmó la pureza de la proteína
purificada por afinidad como SCPA49 pura por
SDS-PAGE y por transferencia Western. Se preparó en
conejos un antisuero hiperinmune, dirigido contra la SCPA49
purificada. La SCP recombinante no era funcional como
peptidasa.
Se inmunizaron dos grupos de ratones por
administración de 10 \mul en cada orificio nasal, un total de 40
\mug de proteína, cuatro veces durante un periodo de cinco
semanas. Los ratones de control recibieron solamente PBS. Antes de
la infección, se determinó por ELISA que los sueros agrupados de
conjuntos de 5 ratones tenían títulos altos de anticuerpo
anti-SCPA49. Véase la Tabla 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los ratones se enfrentaron a 3 x 10^{8} CFU del
tipo salvaje, cepa CS101sm, 7 días después del último refuerzo de
vacuna. En dos experimentos separados, los ratones inmunizados
estaban libres de estreptococos 48 horas después de la infección
(Fig. 6; Tablas 3 y 4). En contraste, 30-50% de los
controles no vacunados seguían siendo positivos en cultivo durante
seis días, y algunos de ellos eran todavía positivos 10 días
después de la infección. Se determinó que las diferencias eran
estadísticamente significativas por el ensayo exacto de Fisher. La
infección de un tercer grupo de ratones inmunizados y de control
produjo resultados similares.
El suero de conejo con título alto dirigido
contra esta proteína mutante SCPA49 era capaz de neutralizar la
actividad de peptidasa asociada con los estreptococos intactos M1,
M12 y M6 in vitro, confirmando que la peptidasa carece de
especificidad de serotipo. Por esta razón, incluso SCP que no es
funcional como peptidasa es eficaz como vacuna. Debe indicarse que
la pre-incubación de estreptococos M49 con
anti-SCP de conejo antes de la inoculación i.n. de
los ratones no reducía la colonización.
(CFU después de la vacunación)
(CFU después de la vacunación)
El gen de la peptidasa C5a de estreptococos del
grupo B (SCPB) se clonó, secuenció y comparó con el de los
estreptococos M12 y M49 del serotipo grupo A. El gen entero
scpB se multiplicó por PCR utilizando iniciadores que
corresponden a porciones de la secuencia scpA 12 utilizando
el método descrito anteriormente en el Ejemplo 4. El gen SCPB
codifica un marco de lectura abierto (ORF) de 3450 pb que
especifica una proteína de 1150 aminoácidos con Mr de 126.237 da.
La secuencia de aminoácidos de SCPB se muestra en la Figura 2. La
comparación de la secuencia del nucleótido scpB y la de
aminoácidos deducida con las de los estreptococos del grupo A M12 y
M49 mostraba semejanzas altas, 98% y 97%, respectivamente.
scpB contenía una deleción de 50 pb que se superponía a dos
de las repeticiones del terminal C, y tenía varias otras diferencias
menores con relación a los genes scpA. El alineamiento de las
secuencias demostró que scpA12 es en realidad
filogenéticamente más próximo a scpB que lo es a
scpA49. Treinta cepas, que representaban los serotipos III,
III/R, II, Ia/c, NT/c, NT/c/R1 llevan una copia de scpB.
Se expresó SCP recombinante en E. coli
utilizando el plásmido vector de expresión
pGEX-4-1 (número de acceso ATCC
98225) y se mostró que era idéntico a la enzima extraía de la cepa
de estreptococos paterna del grupo B 78-471 (tipo
II a+b). El análisis por transferencia Western sugirió que la SCP
recombinante es idéntica a la enzima C5asa y purificada previamente
a partir de estreptococos del grupo B.
a) Cepas bacterianas. Las cepas de
estreptococos CS101, CS210, y CS463 son derivados espontáneos
resistentes a la estreptomicina de las cepas positivas con opacidad
de suero (OF^{+}), clase II, serotipo M49, M2, y M11,
respectivamente. MJ 3-15, descrito en el Ejemplo 1
anterior, es la cepa CS101 con una deleción interna en marco en el
gen SCPA49. Las cepas estreptocócicas 90-131 y
UAB200 son derivados espontáneos resistentes a la estreptomicina de
OF^{-}, clase I, serotipo M1 y aislados humanos M6 de
estreptococos del grupo A, respectivamente. Los estreptococos se
cultivaron en caldo Todd-Hewitt complementado con 2%
de neopeptona o 1% de extracto de levadura (THY) o en agar sangre
de oveja. En algunos experimentos, los estreptococos de dejaron
crecer en el medio de cultivo que contenía estreptomicina (200
\mug/ml) o eritromicina (1 \mug/ml). Se utilizó Escherichia
coli ER1821 (New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.) como el
receptor para el vector suicida termosensible, plásmido
pG^{+}host5. pG^{+}host5 se obtuvo de Appligene, Inc.,
Pleasanton, Calif. E. coli ER1821 que contenía el plásmido
PG^{+}host5 se cultivó en caldo Luria-Bertani que
contenía eritromicina (Erm, 300 \mug/ml) a 39ºC.
b) Construcción de los mutantes de
inserción scpA . El mutante de inserción scpA6,
AK1.4 se construyó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
El DNA de plásmido recombinante, pG::scpA1.2, contiene un fragmento
interno BglII-HindIII del gen scpA. Este
plásmido se sometió a electroporación en células receptoras UAB200 y
los transformantes se seleccionaron en placas de agar THY que
contenían eritromicina a 30ºC. Un integrante cromosómico de
pG::scpA1.2, cepa AK1.4, que resultó de la recombinación entre la
inserción del plásmido y el scpA6 cromosómico se seleccionó
por crecimiento en medio de agar que contenía eritromicina a 39ºC.
La inserción en scpA6 se confirmó por transferencia Southern
utilizando scpA como la sonda, y PCR utilizando un iniciador
universal M13
(5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (SEQ. ID.
No. 6), específico para el plásmido, y un iniciador scpA
For835 (5'-AAGGACGACACATTGCGTA-3')
(SEQ. ID. No. 7), específico para el scpA cromosómico de
GAS.
c) Construcción, expresión, y
purificación de \DeltaSCPA. Un fragmento de 2,9 kb de
scpA49 (desde pb 1033 a pb 3941) se multiplicó por PCR
utilizando un iniciador directo scpA que contenía una
secuencia de reconocimiento BamHI
(5'-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3')
(SEQ. ID. No. 8) y un iniciador inverso scpA
(5'-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3') (SEQ. ID.
No. 9). Las secuencias que codifican el péptido de señal y las
regiones de anclaje a la membrana de la proteína SCPA se
delecionaron del producto PCR resultante. Los productos PCR se
digirieron con BamHI y se ligaron al sitio de reconocimiento
de trombina del gen de
glutatión-S-transferasa en el vector
de expresión alta pGEX-4T-1 de
Pharmacia Inc. (Piscataway, NJ). El plásmido recombinante se
transformó en E. coli DH5\alpha. La proteína de fusión
\DeltaSCPA procedente de un transformante, E. coli (pJC6),
se purificó por cromatografía de afinidad en una columna de
glutatión-Sepharose 4B. Después de digestión con
trombina, se separó la trombina por cromatografía en una columna
benzamidina-Sepharose 6B. Los métodos de expresión y
purificación se describen por el fabricante. Esta proteína
\DeltaSCPA truncada y purificada por afinidad carecía de actividad
de peptidasa cuando se ensayó por el ensayo de adherencia PMN
(descrito en el Ejemplo 1 anterior).
d) Técnicas de transferencia
Western. Se prepararon extractos de estreptococos en
mutanolisina como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
Resumidamente, 100 ml de un cultivo nocturno de estreptococos se
redujeron a un sedimento y se lavaron dos veces en acetato de sodio
0,2M enfriado en hielo (pH 5,2). El sedimento se suspendió en 1 ml
de tampón TE-sacarosa (Tris 1 mM, EDTA 1 mM, y 20%
de sacarosa) con 40 \mul de mutanolisina. Después de rotación a
37ºC durante 2 h, la mezcla se centrifugó durante 5 min al 1500 x
g. Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo (100 mM) al
sobrenadante resultante. Las transferencias Western se realizaron
como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 anterior. Se
preparó un anticuerpo anti-SCPA por inmunización de
conejos con proteína \DeltaSCPA recombinante purificada por
afinidad.
e) Ensayos de adherencia de PMN y
neutralización. Se midió la actividad de SCPA utilizando un
ensayo de adherencia de PMN. C5a humana recombinante (rhC5a; C5788;
Sigma, St. Louis, Mo) se incubó a 37ºC durante 45 min con células
bacterianas enteras. La rhC5a residual se midió por su capacidad
para activar PMNs, que eran adherentes a los pocillos recubiertos
de seroalbúmina bovina (BSA) una placa de microtitulación. S.A.
Booth et al., "Dapsone Suppresses
Integrin-Mediated Neutrophyl Adherence Function",
J. Invest. Dermatol., 98, pp. 135-140
(1992). Se aislaron PMNs de sangre humana reciente por
centrifugación con gradiente de densidad en Ficoll Hypaque como se
describe en el Ejemplo 1 anterior. La neutralización de la actividad
SCPA por el suero anti-SCPA de conejo se ensayó
utilizando el ensayo de adherencia de PMN. Aproximadamente 1 x
10^{7} bacterias destruidas por calor en 0,5%
BSA-PBS se pusieron en rotación con 1,4 ml de suero
anti-\DeltaSCPA49 de conejo o suero normal de
conejo durante 1 h a 37ºC. Las bacterias se resuspendieron luego en
40 \mul de tampón BSA-PBS al 0,5% y se incubaron
con rhC5a durante 45 min antes de medir la quimiotaxina residual
por el ensayo de adherencia de PMN.
f) Ensayo de fagocitosis. Se
realizaron ensayos de fagocitosis de sangre humana in vitro
como se describe en R.C. Lancefield, "Differentiation of Group A
Streptococci with a Common R Antigen into Three Serological Types,
with Special Reference to Bactericidal Test", J. Exp.
Med., 106, pp. 525-685 (1957).
Resumidamente, cultivos en fase logarítmica de los estreptococos del
grupo A se diluyeron en THY a 10^{3} hasta 10^{4} CFU/ml. Se
mezclaron una décima de mililitro de cultivos diluidos y 0,9 ml de
sangre humana y se pusieron en rotación a 37ºC durante 3 h. Los
recuentos viables iniciales y los recuentos después de 3 h de
rotación se determinaron por extensión en placas de las muestras
diluidas en agar sangre.
g) Modelo de infección intranasal en el
ratón. Cultivos de 16 horas de cepas de estreptococos
enfrentadas (1 x 10^{8} - 9 x 10^{8} CFU), cultivadas en caldo
Todd-Hewitt que contenían 20% de suero normal de
conejo y resuspendidas en 10 \mul de PBS, se administraron por vía
intranasal a ratones hembra CD1 (Charles River Breeding
Laboratories, Inc., Wilmington, MA) o BALB/c (Sasco, Omaha, NE) de
25 g. Se determinaron los recuentos viables por extensión en placas
de diluciones de los cultivos en placas de agar sangre. Se
recogieron diariamente frotis de garganta de los ratones
anestesiados durante 6 a 10 días después de la inoculación y se
aplicaron en bandas sobre placas de agar sangre que contenían 200
\mug/ml de estreptomicina. Después de incubación durante una
noche a 37ºC, se contó el número de colonias
\beta-hemolíticas en las placas. Todas las cepas
del enfrentamiento se marcaron por resistencia a la estreptomicina
para distinguirlas de las bacterias
\beta-hemolíticas que pueden persistir en la
flora normal. Los frotis de garganta se cultivaron en agar sangre
que contenía estreptomicina. La presencia de una colonia
\beta-hemolítica se consideró como cultivo
positivo.
h) Inmunización y protocolo de
enfrentamiento. Ratones hembra CD1 reproducidos por exogamia,
de 4 semanas de edad, se inmunizaron por administración de 20
\mug de \DeltaSCPA49 purificada por afinidad en 10 \mul de
PBS en cada ventana nasal. Los ratones se inmunizaron tres veces en
días alternos y se reforzaron de nuevo tres semanas después de la
tercera inmunización. Después de dos semanas de reposo, los ratones
se reforzaron nuevamente. D. Bessen et al., "Influence of
Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to
Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A
Streptococci", Infect. Immun., 56, pp.
2666-2672 (1988). Los ratones de control recibieron
solamente PBS. Antes de la infección, se determinó por ELISA que
todos los ratones que se inmunizaron con la proteína
\Delta-SCPA tenían títulos elevados de anticuerpos
contra el antígeno \DeltaSCPA en su suero y su saliva. Se
utilizaron estreptococos del grupo A, cepa CS101 (2,0 x 10^{8}
CFU), CS210 (3,6 x 10^{8} CFU), CS463 (7,8 x 10^{8} CFU),
90-131 (3,4 x 10^{8} CFU), y UAB200 (9,6 x
10^{8}CFU) para enfrentarse intranasalmente a los ratones 7 días
después del último refuerzo de la vacuna. Los estudios con animales
se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos
Nacionales de la Salud.
i) Recogida de muestras y ELISA.
Las muestras de sangre y saliva se recogieron a partir de ratones
anestesiados después de la inmunización. Todos los sueros se
ensayaron en cuanto a la presencia de anticuerpos SCPA49 por ELISA,
como se ha descrito previamente. S.P. O'Connor et al.,
"The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase",
J. Infect. Dis., 163, pp. 109-116
(1990). La proteína SCPA49 purificada se fijó a los pocillos de
microtitulación por adición de 500 ng de proteína purificada en
tampón de bicarbonato 0,05M (pH 9,6). Después de incubación
nocturna a 4ºC se lavaron los pocillos, y se bloquearon luego con
0,5% de BSA en PBS durante 1 hora. Se estimuló la salivación en los
ratones por inyección de 100 \mul de una solución al 0,1% de
pilocarpina (Sigma) por vía subcutánea. Se recogieron las muestras
de saliva y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 min en una
microcentrífuga Eppendorf. Los sobrenadantes se ensayaron en cuanto
a la presencia de IgA secretora contra la proteína \DeltaSCPA49
por ELISA. Los títulos ELISA representan la dilución máxima del
suero y la saliva individuales que tenía una DO_{405} \geq
0,1.
j) Análisis estadísticos. Se
utilizó el ensayo \chi^{2} para analizar los datos de los
experimentos con animales. Un valor P de < 0,05 se
consideró significativo.
En primer lugar, se estudió la capacidad de los
estreptococos de tipo salvaje y mutantes SCPA^{-} isogénicos para
colonizar la nasofaringe de los ratones. Se analizaron extractos en
mutanolisina de las proteínas de la superficie celular de cultivos
originarios y mutantes por transferencia Western utilizando suero
específico de SCPA. Se confirmó que los mutantes carecían de SCPA.
Los extractos de mutantes SCPA^{-} AK1.4 y MJ3-15
no reaccionaban con suero anti-SCPA. Se observaron
proteínas SCPA del tamaño esperado en los extractos de las cepas de
tipo salvaje CS101 y UAB200. El fallo de las cepas mutantes AK1.4 y
MJ3-15 en cuanto a la producción de actividad de
peptidasa C5a se comprobó por comparación de su capacidad para
destruir rhC5a. La exposición de PMNs aislados a rhC5a los indujo a
volverse adherentes a los pocillos de microtitulación recubiertos
con BSA. La incubación con estreptococos o SCPA purificada escindía
específicamente rhC5a y alteraba su potencial para activar los
PMNs. Se tiñeron los PMNs que respondían a rhC5a residual y se
fijaban a los pocillos recubiertos con BSA, y se midieron luego
espectrofotométricamente. La incubación de rhC5a con cultivos
originarios, UAB200 y CS101, destruía rhC5a, lo cual inhibía la
adherencia de PMN en un 58,8% y un 54,5%, respectivamente. En
contraste, los mutantes SCPA^{-}, AK1.4 y MJ3-15,
no alteraban rhC5a o la adherencia de los PMNs a los pocillos
recubiertos con BSA (Tabla 5). Este experimento confirmó las
transferencias Western anteriores y demostró que los cultivos
SCPA^{-} carecen de otras proteasas que pudieran degradar
rhC5a.
Aunque la expresión de la proteína M no era de
esperar que estuviera influenciada por mutaciones en scpA, se
realizaron ensayos para evaluar si los estreptococos mutantes
SCPA^{-} expresaban todavía proteína M y tenían la capacidad de
resistir la fagocitosis. El crecimiento de los estreptococos en
sangre humana reciente durante 3 horas de incubación es indicativo
de la proteína M antifagocítica en su superficie. R.C. Lancefield,
"Differentiation of Group A Strepcocci with a Common R Antigen
into Three Serological Types, with Special Reference to Bactericidal
Test", J. Exp. Med., 106, pp.
525-685 (1957). Como era de esperar, los
estreptococos originarios, UAB200 y CS101, aumentaban 40 y 49 veces,
respectivamente (Tabla 5). Los cultivos M^{+} SCPA^{-}, cepas
AK1.4 y MJ3-15, aumentaban 37,5 y 14 veces,
respectivamente, confirmado que las mutaciones de scpA tenían
poco efecto sobre la expresión de la proteína M o la resistencia a
la fagocitosis en sangre humana entera. El crecimiento algo más
pobre de ambas cepas mutantes en sangre mantenida en rotación era
reproducible e inesperado. Las tasas de crecimiento de los cultivos
mutantes y originarios en plasma humano eran indistinguibles. Es
posible que la desactivación de SCPA permitiera que C5a se acumulara
en la sangre mantenida en rotación que, a su vez, activaba los PMNs.
Los PMNs activados son más fagocíticos y más capaces de destruir los
estreptococos M^{+}. Los extractos de proteína de la superficie
contienen antígeno M6 y M49 cuando se analizan por transferencia
Western utilizando antisueros anti-M49 y
anti-M6, confirmando que las mutaciones en SCPA no
alteraban la expresión de la proteína M.
A continuación, se determinó si la peptidasa C5a
se requiere para la colonización nasofaríngea. Ratones
CD-1 reproducidos por exogamia se inocularon
intranasalmente para evaluar la capacidad relativa de los
estreptococos de tipo salvaje y SCPA^{-} para colonizar la
nasofaringe. Se tomaron diariamente frotis de garganta durante 1 a
10 días de ratones anestesiados y se aplicaron en bandas sobre
placas de agar sangre que contenían antibióticos selectivos para la
cepa en cuestión. Se utilizaron ratones BALB/c para las infecciones
con la cepa UAB200 de M6 a fin de adaptarse a estudios previos que
utilizaron esta cepa. D. Bessen et al., "Influence of
Intranasal Immunization with Synthetic Peptides Corresponding to
Conserved Epitopes of M Protein on Mucosal Colonization by Group A
Streptococci", Infect. Immun., 56, pp.
2666-2672 (1988). Se determinó primeramente el
tamaño del inoculante que dio como resultado la colonización de
aproximadamente el 50% de los ratones durante hasta 5 días. Se
observaron diferencias significativas entre los estreptococos
M^{+} SCPA^{+} y M^{+} SCPA^{-} de tipo 49 los días 3 a 9
después de la inoculación. El día 4, el 50% (9 de 18) de los ratones
infectados con la cepa CS101 producían todavía cultivos de garganta
positivos; mientras que únicamente el 11% (2 de 18) de los ratones
infectados con MJ3-15 retenían estreptococos en sus
gargantas. Las diferencias en el número de colonias en las placas de
agar sangre eran también consistentes con un aclaramiento más rápido
de los estreptococos M^{+} SCPA^{-}. El 59% (31 de 54) de los
cultivos positivos de los ratones infectados con los estreptococos
de tipo salvaje contenían más de 100 CFU; en tanto que solamente 14%
(2 de 14) de los cultivos positivos procedentes de los animales
infectados con estreptococos SCPA^{-} contenían más de 100 CFU
(estadísticamente significativo para P<0,001). Además, el 22% (4
de 18) de los ratones murieron por infección con estreptococos
M^{+} SCPA^{+}. Ninguno de los ratones murió por infección con
estreptococos M^{+} SCPA^{-}. Esta diferencia es también
estadísticamente significativa (P<0,05). La comparación de las
variantes SCPA49^{+} y SCPA49^{-} de la cepa CS101 se repitió
dos veces más con resultados similares.
Dado que el espectro de la enfermedad causada por
las cepas OF^{+} y OF^{-} difiere significativamente, se
investigó también el impacto de SCPA sobre la colonización por un
serotipo OF^{-}, tipo M6 (Fig. 7). Nuevamente, la cepa SCPA6^{-}
AK1.4 se aclaraba más rápidamente que la cepa originaria UAB200.
Cuatro días después de la infección, todos los ratones habían
aclarado completamente los estreptococos SCPA^{-} de sus
gargantas; en tanto que el 30% de los ratones infectados con los
estreptococos de tipo salvaje seguían siendo positivos en cultivo.
Más del 98% de todos los cultivos positivos tenían más de una
colonia en la placa de agar sangre. En este experimento, todos los
ratones estaban exentos de estreptococos el quinto día después de la
inoculación.
El paso inmediatamente siguiente fue determinar
si podría utilizarse SCP para inmunizar un animal. En primer lugar,
se construyó una forma enzimáticamente inactiva de la proteína
SCPA49 para uso en los estudios de inmunización. Un fragmento de
2908 pb de scpA49 con secuencias de reconocimiento por
BamHI adicionales se obtuvo por PCR y se ligó al plásmido
pGEX-4T-1, que se había digerido con
BamHI y SmaI. En esta construcción, plásmido pJC6, la
secuencia scpA49 estaba fusionada en marco con el gen de
glutatión-transferasa. La inserción de estreptococos
no incluía la señal scpA o secuencias de anclaje a la pared
celular (Fig. 8). Las preparaciones de vacuna de la proteína
\DeltaSCPA49 purificada se evaluaron por SDS-PAGE
y transferencia Western para confirmar la pureza. Varias bandas de
proteína en la preparación \DeltaSCPA49 purificada reaccionaban
con antisuero policlonal de conejo dirigido contra la proteína
recombinante \DeltaSCPA49. El tamaño de la banda mayor era
aproximadamente 100 KD, el tamaño estimado de la forma de deleción
de SCPA49. Se supuso que las bandas más pequeñas eran productos de
degradación de SCPA, una característica común de las proteínas
sobre-expresadas en E. coli. El antisuero no
reaccionaba con ninguna proteína aislada de E. coli
DH5\alpha (pGEX-4T-1) sin una
inserción estreptocócica. El procedimiento arriba descrito produjo
rutinariamente 2-3 mg de proteína \DeltaSCPA49 de
alta pureza a partir de un litro de cultivo. Se encontró que la
proteína \DeltaSCPA49 purificada carecía de actividad de peptidasa
C5a cuando se sometió al ensayo de adherencia de PMN.
En segundo lugar, se evaluó la inmunogenicidad de
la vacuna de la subunidad \DeltaSCPA49. Se inmunizaron conejos con
\DeltaSCPA49 purificada. Los conejos desarrollaron niveles altos
de anticuerpos contra la proteína \DeltaSCPA49 como se determinó
por ELISA. Aunque el inmunógeno \DeltaSCPA49 purificado carecía de
actividad funcional, el antisuero de conejo hiperinmune podría
neutralizar la actividad de peptidasa de la enzima SCPA49 de tipo
salvaje purificada in vitro. Además, el antisuero de conejo
sin diluir contra la proteína \Delta SCPA49 era capaz de
neutralizar la actividad de peptidasa C5a asociada con serotipos
heterólogos. La actividad de peptidasa C5a asociada con los
estreptococos M1, M6 y M12 intactos era inhibida por este
antisuero,confirmando que el anticuerpo contra la proteína SCPA49
tiene una amplia reactividad cruzada contra varios serotipos
diferentes.
Asimismo, se obtuvieron muestras de suero y
saliva de diez ratones inmunizados y diez ratones de control para
evaluar la inmunogenicidad de la proteína \DeltaSCPA49 cuando se
administra por la ruta intranasal sin adyuvantes. Los ratones que se
inmunizaron con la proteína \DeltaSCPA49 purificada desarrollaron
títulos elevados de IgG específica de SCPA en sus sueros, en
comparación con los ratones de control inmunizados con PBS. Los
títulos de IgG en suero dirigida contra \DeltaSCPA49 variaban
desde 1:10.240 a 1:20.480. En contraste, el título de IgG específica
de SCPA49 de los ratones de control no era detectable en los sueros.
Los ratones inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 purificada
exhibían también un aumento significativo en la IgA salivar
específica de SCPA49 con relación a los ratones de control. Los
títulos específicos de IgA en la saliva de los ratones inmunizados
eran mayores que 1:16. En contraste, la IgA dirigida contra SCPA49
en la saliva de los ratones de control no era detectable. La
concentración relativa de IgG e IgA en suero diluido en relación
1/2.560 y saliva diluida en relación 1/2, respectivamente, se
muestran en la Figura 9. Estos resultados demuestran que la proteína
\DeltaSCPA49 purificada es un inmunógeno eficaz para la inducción
de respuestas específicas de anticuerpos sistémicas y secretoras en
los ratones cuando se administran por vía intranasal.
En tercer lugar, se realizaron experimentos para
determinar si la inmunización con la peptidasa C5a podría mejorar el
aclaramiento de los estreptococos de la nasofaringe. Tanto los
sueros hiperinmunes de conejo y humano que contienen niveles altos
de anticuerpo anti-SCPA pueden neutralizar la
actividad de SCPA in vitro. S.P. O'Connor et al.,
"The Human Antibody Response to Streptococcal C5a Peptidase",
J. Infect. Dis., 163, pp. 109-116
(1990). El hecho de que SCPA facilita significativamente la
colonización de la mucosa oral sugiere que la inmunización de
ratones con \DeltaSCPA49 purificada podría reducir la capacidad de
los estreptococos para colonizar la nasofaringe. Se inmunizaron
ratones intranasalmente con SCPA purificada por afinidad y
desactivada genéticamente para ensayar esta posibilidad. La proteína
truncada, \DeltaSCPA49, se administró intranasalmente sin
adyuvantes o vehículos. La colonización faríngea de los ratones
vacunados por los estreptococos de tipo salvaje M^{+} SCPA^{+}
difería significativamente de los inmunizados con PBS en tres
experimentos independientes utilizando ratones vacunados con dos
preparaciones diferentes de proteína \DeltaSCPA49 purificada
(datos representativos se muestran en la Figura 10). Únicamente uno
de trece ratones inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 era
positivo en cultivo para estreptococos diez días después de la
inoculación (Fig. 10). En contraste, 30-58% de los
controles no vacunados se mantenían positivos en cultivo durante
seis días, y algunos de ellos eran positivos todavía diez días
después de la infección. Los números de colonias
\beta-hemolíticas resistentes a la estreptomicina
en placas de agar sangre mostraban también una diferencia
significativa entre los ratones vacunados con \DeltaSCPA49 y los
ratones de control. Diferentes series de ratones inmunizados
aclaraban los estreptococos de serotipo M 49 de un modo
significativamente más rápido de sus nasofaringes que los controles
no inmunizados.
Por último, se examinó si la SCP de un serotipo
podría vacunar animales contra la infección de otros serotipos.
Existen más de 80 serotipos diferentes de estreptococos del grupo A.
Una vacuna eficaz debería prevenir la infección por más de un
serotipo estreptocócico. Se observó protección cruzada contra los
serotipos M2, M11, M1, y colonización estreptocócica por el grupo A
M6. El hecho de que el suero de conejo dirigido contra la proteína
\DeltaSCPA49 de los estreptococos de serotipo M49 neutralizara la
actividad de peptidasa asociada con varios serotipos diferentes
sugería que la inmunización intranasal con una vacuna de una sola
subunidad podría reducir o eliminar la colonización faríngea por
dichos serotipos. Para explorar esta posibilidad, se inmunizaron
cuatro grupos de 20 ratones por inoculación intranasal con proteína
\DeltaSCPA49 purificada por afinidad como se ha descrito arriba.
Los ratones de control recibieron PBS. Antes del enfrentamiento a
los estreptococos, se ensayaron muestras de suero y saliva de
ratones elegidos aleatoriamente, inmunizados y de control respecto a
anticuerpo anti-SCPA. Todos los ratones inmunizados
ensayados habían desarrollado una respuesta de anticuerpos fuerte en
suero y apreciable en saliva. La colonización faríngea de los
ratones inmunizados con proteína \DeltaSCPA49 por las cepas de la
totalidad de los cuatro serotipos se redujo con relación a los
controles no inmunizados. Las diferencias alcanzaban la máxima
significación los días 3 y 5 después de la inoculación (Tabla
6).
Se observaron diferencias estadísticamente
significativas entre los ratones inmunizados y los de control
inoculados con las cepas de los serotipos M2, M11 y M1. Sin embargo,
los serotipos OF^{+} M2 y M11 eran eliminados más eficientemente
por los ratones inmunizados que lo eran las cepas OF^{-}, M1 y M6.
La colonización por estreptococos M1 de los ratones inmunizados se
había reducido significativamente con relación a los ratones de
control. Únicamente el 10,5% de los ratones inmunizados eran
positivos en cultivo el día 5 después de la infección. En contraste,
el 37% de los ratones de control eran positivos en cultivo con esta
cepa. Aunque los ratones inmunizados parecían aclarar más
rápidamente los estreptococos M6, las diferencias no eran
estadísticamente significativas. Como en los experimentos previos,
el número de colonias estreptocócicas
\beta-hemolíticas en placas de agar sangre era
significativamente menor en las muestras tomadas de ratones
vacunados que en las tomadas de los animales de control. Así pues,
la proteína \DeltaSCPA49 era una vacuna eficaz que proporcionaba
protección cruzada contra otros serotipos estreptocócicos.
La invención se ha descrito con referencia a
diversas realizaciones y técnicas específicas y preferidas. Sin
embargo, debería entenderse que pueden hacerse muchas variaciones y
modificaciones manteniéndose dentro del alcance de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Rectores de la Universidad de Minnesota
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: VACUNA DE PEPTIDASA ESTREPTOCÓCICA C5a
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SCHWEGMAN, LUNDBERG, WOESSNER & KLUTH, P.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 2938
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MINNEAPOLIS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MINNESOTA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 55402
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD: NÚMERO DE SOLICITUD: DESCONOCIDO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/589.756
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 22 de enero de 1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Ann S. Viksnins
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 37.748
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 600.349WO1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: 612-359-3960
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 612-359-3263
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1164 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1167 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCGTAGCGGG TATCATGGGA C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGAAT TCGGGTGCTG CAATATCTGG C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACTACG GCAGT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGGACGACAC ATTGCGTA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCGGAT CCACCAAAAC CCCACAAACT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTGGCCCT CCAATAGC
\hfill18
Claims (14)
1. Una vacuna que comprende una cantidad
inmunógena de una peptidasa estreptocócica C5a enzimáticamente
inactiva,
o un fragmento, variante o mutante de la misma,
cantidad que es eficaz para inmunizar un mamífero propenso contra
Streptococcus \beta-hemolítico en
combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable y no
tóxico.
2. La vacuna de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante
inmunológico.
3. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la cual dicho mamífero se selecciona del
grupo constituido por humanos, perros, bovinos, porcinos y
caballos.
4. La vacuna de la reivindicación 3, en la cual
dicho mamífero es humano.
5. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual dicho Streptococcus
\beta-hemolítico se selecciona del grupo
constituido por Streptococcus del grupo A, Streptococcus
del grupo B, Streptococcus del grupo C y
Streptococcus del grupo G.
6. La vacuna de la reivindicación 5, en la cual
dicho Streptococcus \beta-hemolítico es
Streptococcus del grupo A.
7. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende una peptidasa C5a
estreptocócica recombinante, o un fragmento, variante o mutante de
la misma, conjugado o enlazado a un péptido.
8. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende dicha peptidasa
estreptocócica C5a, o fragmento, variante o mutante de la misma,
conjugado(a) o enlazado(a) a un polisacárido.
9. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que es adecuada para administración por
inyección subcutánea o intramuscular.
10. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que es adecuada para administración por
ingestión oral.
11. La vacuna de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que es adecuada para administración
intranasal.
12. Uso de una peptidasa estreptocócica C5a
enzimáticamente inactiva, o un fragmento, variante o mutante de la
misma, en combinación con un vehículo no tóxico y fisiológicamente
aceptable, para la preparación de una vacuna para proteger un
mamífero propenso contra la colonización o infección por
Streptococcus.
13. El uso de la reivindicación 12, en el cual
dicha vacuna es como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
14. Una peptidasa estreptocócica C5a
enzimáticamente inactiva, o un fragmento, variante o mutante de la
misma inmunógenamente activo(a), para uso en terapia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US589756 | 1996-01-22 | ||
| US08/589,756 US5846547A (en) | 1996-01-22 | 1996-01-22 | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2218656T3 true ES2218656T3 (es) | 2004-11-16 |
Family
ID=24359391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97902076T Expired - Lifetime ES2218656T3 (es) | 1996-01-22 | 1997-01-21 | Vacuna de peptidasa c5a estreptococica. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
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