MX2011004755A

MX2011004755A - Composicion inmunogenica multicomponente para la prevencion de enfermedad estreptococica beta-hemolitica (bhs).

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Publication number: MX2011004755A
Application number: MX2011004755A
Authority: MX
Inventors: Michael Hagen; Ingrid Lea Dodge; Eduardo Arturo Rojas; Annaliesa Sybil Anderson; Guyanand Singh
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2008-11-05
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2011-10-10
Also published as: US20100119534A1; CA2741691A1; WO2010053986A1; BRPI0921286A2; CN107050442A; PE20120116A1; TW201022442A; EP2356135B1; NZ614064A; CN107050442B; US9127050B2; EP2356135A1; AU2009313615B2; US8563001B2; JP2012508174A; AR074273A1; RU2011116286A; DK2356135T3; CA2741691C; BRPI0921286B8

Abstract

Se describen varios polinucleótidos y polipéptidos de estreptococos ß- hemolíticos, particularmente polipéptidos y polinucleótidos de Streptococcus pyogenes. Dos o más de los polipéptidos de la invención pueden formularse para su uso como composiciones inmunogénicas. También se desvelan procedimientos para inmunizar frente a y reducir la infección causada por estreptococos ß-hemolíticos.

Description

COMPOSICIÓN INMUNOGÉNICA MULTICOMPONENTE PARA LA PREVENCIÓN DE ENFERMEDAD ESTREPTOCÓCICA BETA HEMOLÍTICA (BHS) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a polipéptidos y polinucleótidos estreptocócicos ß-hemolíticos (BHS), particularmente polipéptidos y polinucleótidos de Streptococcus pyogenes y su uso en composiciones inmunogénicas multicomponentes para prevenir enfermedad BHS. De forma más específica, la invención se refiere a polipéptidos de Streptococcus pyogenes que se localizan en la superficie. La invención se refiere adicionalmente a composiciones inmunogénicas y procedimientos para inmunizar contra y reducir la infección estreptocócica ß-hemolítica que comprenden combinaciones de dos o más de los polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los criterios fenotípicos tradicionales para la clasificación de estreptococos incluyen tanto reacciones hemolíticas como agrupamientos serológicos de Lancefield. Sin embargo, con los avances taxonómicos, se sabe ahora que especies no relacionadas de estreptococos ß-hemolíticos (BHS) (definido como la lisis completa de eritrocitos de oveja en placas de agar) pueden producir antígenos de Lancefield idénticos y que cepas genéticamente relacionadas en el nivel de especie pueden tener antígenos de Lancefield heterogéneos. A pesar de estas excepciones a las reglas tradicionales de taxonomía estreptocócica, las reacciones hemolíticas y ensayos serológicos de Lancefield aún pueden usarse para dividir a los estreptococos en categorías amplias como una primera etapa en la identificación de aislados clínicos. Ruoff, K.L. , R.A. Whiley, y D. Beighton. 1999. Streptococcus. En P.R. Murray, E.J. Barón, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, y R.H. Yolken (eds.), Manual of Clinical Microbiology. American Society of Microbiology Press, Washington D.C.

Los aislados ß-hemolíticos con antígeno de Lancefield de grupo A, C o G pueden subdividirse en dos grupos: formadores de colonias grandes (>0,5 mm de diámetro) y colonias pequeñas (<0,5 mm de diámetro). Las cepas formadoras de colonias grandes de grupo A (Streptococcus pyogenes), C y G son estreptococos "piogénicos" repletos de una diversidad de mecanismos de virulencia eficaces.

Streptococcus agalactiae (grupo B) aún se identifica de forma fiable por su producción de antígeno de Lancefield de grupo B u otros rasgos fenotípicos.

Las similitudes entre especies BHS incluyen no solamente factores de virulencia, sino también manifestaciones de enfermedad. En la segunda se incluyen neumonía, artritis, abscesos, rinofaringitis, metritis, sepsis puerperal, septicemia neonatal, infecciones de heridas, meningitis, peritonitis, celulitis, pioderma, fascitis necrotizante, síndrome de choque tóxico, septicemia, endocarditis infecciosa, pericarditis, glomerulonefritis y osteomielitis.

Streptococcus pyogenes son diplococos Gram-positivos que colonizan la faringe y la piel de los seres humanos, sitios que sirven después como el depósito primario para este organismo. Un parásito obligado, esta bacteria se transmite por contacto directo de secreciones respiratorias o de la mano a la boca. La mayoría de las infecciones por Streptococcus pyogenes son enfermedades relativamente leves, tales como faringitis o impétigo. Actualmente, existen entre veinte millones y treinta y cinco millones de casos de faringitis solamente en los Estados Unidos, que cuestan aproximadamente 2000 millones de dólares en visitas al médico y otros gastos relacionados. Adicionalmente, secuelas no supurantes tales como fiebre reumática, escarlatina y glomerulonefritis resultan de infecciones por Streptococcus pyogenes. Globalmente, la fiebre reumática aguda (ARF) es la causa más común de enfermedad cardiaca pediátrica (1997. Case definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. CDC).

Desde las puertas de entrada iniciales, la faringe y la piel, Streptococcus pyogenes puede diseminarse a otras partes del cuerpo en las que normalmente no se encuentran bacterias, tales como la sangre, músculo profundo y tejido graso o los pulmones y pueden provocar infecciones invasivas. Dos de las formas más graves pero menos comunes de enfermedad por Streptococcus pyogenes invasiva son fascitis necrotizante y síndrome de choque tóxico estreptocócico (STSS). La fascitis necrotizante (descrita en los medios como "bacteria carnívora") es una infección destructiva de músculo y tejido graso. STSS es una infección de progresión rápida que provoca choque y lesión a órganos internos tales como los ríñones, hígado y pulmones. Gran parte de este daño se debe a una toxemia en lugar de daño localizado debido a crecimiento bacteriano.

En 1995, las infecciones por Streptococcus pyogenes y STSS se convirtieron en enfermedades de declaración obligatoria. A diferencia de los millones de individuos que adquieren faringitis e impétigo, los informes obligatorios de casos de los Centros de Estados Unidos para el Control y Prevención de la Enfermedad (CDC) indican que en 1997 hubo de 15.000 a 20.000 casos de enfermedad por Streptococcus pyogenes invasiva en los Estados Unidos, dando como resultado más de 2.000 muertes (1997. Case definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. CDC). Otros informes estiman que la enfermedad invasiva es de hasta 10-20 casos por cada 100.000 individuos por año (Stevens, D. L. 1995. Streptococcal toxic-shock syndrome: spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in treatment. Emerg Infect Dis. 1 :69-78). Más específicamente, de los 15.000 a 20.000 casos de enfermedad invasiva, de 1.100 a 1.500 son casos de fascitis necrotizante y de 1.000 a 1.400 son casos de STSS, con una tasa de mortalidad del 20 % y el 60 %, respectivamente. También se incluyen en enfermedad invasiva grave casos de miositis, que conlleva una tasa de letalidad del 80 % al 100 %. Un 10 a 15 % adicional de individuos mueren con otras formas de enfermedad estreptocócica invasiva de grupo A. Estos números han aumentado desde que se inició el informe de los casos en 1995 y reflejan una tendencia general que se ha producido a lo largo de las pasadas una o dos décadas. Adicionalmente, se admite habitualmente que la rigurosidad de las definiciones de los casos da como resultado números menores y, por lo tanto, engañosos, en tanto que muchos casos se resuelven de forma exitosa debido a un diagnóstico y tratamiento temprano antes de que se haya cumplido la definición.

Aunque Streptococcus pyogenes sigue siendo sensible a penicilina y sus derivados, el tratamiento no erradica necesariamente el organismo. Aproximadamente del 5 al 20 % de la población humana son portadores dependiendo de la temporada (Stevens, D. L. 1995. Streptococcal toxic-shock syndrome: spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in treatment. Emerg Infect Dis. 1 :69-78), a pesar de terapia con antibióticos. Las razones de esto no están completamente claras y pueden implicar una diversidad de mecanismos. En casos de infecciones masivas graves, el tratamiento con frecuencia requiere intervención quirúrgica agresiva. Para los casos que implican STSS o enfermedad relacionada, clindamicina (un inhibidor de síntesis proteica) es el antibiótico preferido puesto que penetra bien en los tejidos y evita la producción de exotoxina. Existen informes de cierta resistencia a tetraciclina, sulfas y, más recientemente, eritromicina. Claramente, sigue existiendo una necesidad de composiciones para prevenir y tratar infección ß-hemolítica.

Se han identificado numerosos factores de virulencia para Streptococcus pyogenes, algunos secretados y algunos localizados en superficie. Aunque está encapsulada, la cápsula se compone de ácido hialurónico y no es adecuada como un antígeno candidato para su inclusión en composiciones inmunogénicas, puesto que se expresa de manera habitual en células mamíferas y es no inmunogénico (Dale, J. B., R. G. Washburn, M. B. Marques, y M. R. Wessels. 1996. Hyaluronate capsule and surface M protein in resistance to opsonization of group A streptococci. Infect Immun. 64: 1495-501 ). El antígeno T y el Grupo Carbohidrato son otros candidatos, pero también pueden inducir anticuerpos de reacción cruzada para el tejido cardíaco. El ácido lipoteicoico está presente en la superficie de Streptococcus pyogenes, pero provoca preocupaciones de seguridad similares a LPS.

Las proteínas de superficie más abundantes entran en una familia de proteínas denominada proteínas M o "de tipo M" debido a su similitud estructural. Aunque miembros de esta clase tienen papeles biológicos similares en la inhibición de fagocitosis, cada uno tiene propiedades de unión a sustrato únicas. La proteína mejor caracterizada de esta familia es la proteína M helicoidal. Los anticuerpos dirigidos a cepas de M homologas han mostrado ser opsónicas y protectoras (Dale, J. B., R. W. Baird, H. S. Courtney, D. L. Hasty, y M. S. Bronze. 1994. Passive protection of mice against group A streptococcal pharyngeal infection by lipoteichoic acid. J Infecí Dis. 169:319-23, Dale, J. B., M. Simmons, E. C. Chiang, y E. Y. Chiang. 1996. Recombinant, Ellen, R. P., y R. J. Gibbons. 1972. M protein-associated adherence of Streptococcus pyogenes to epithelial surfaces: prerequisite for virulence. Infecí Immun. 5:826-830.). Complicando el uso de la proleína M como un anlígeno candidato esfá el hecho de que se han idenfificado aproximadamenfe 100 seroíipos diferentes de proteína M con varios más no tipificados. Normalmeníe, los serotipos de M de Clase I, ejemplificados por los serotipos M1 , M3, M6, M12 y M18, se asocian con faringitis, escarlatina y fiebre reumática y no expresan proteínas de unión a inmunoglobulina. Los serotipos M de clase II tales como M2 y M49, se asocian con las infecciones cutáneas localizadas más comunes y la glomerulonefritis secuela y expresan proteínas de unión a inmunoglobulinas (Podbielski, A., A. Flosdorff, y J. Weber-Heynemann. 1995. The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genes. Infecí Immun. 63:9-20). Es importante observar que existe poca, si la hay, reactividad cruzada heteróloga de anticuerpos con serotipos M. Igualmente importante es el papel que estos anticuerpos desempeñan en fiebre reumática. Regiones específicas de la proteína M inducen anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con el tejido cardíaco del huésped, provocando o al menos correlacionándose con daño celular (Cunningham, M. W., y A. Quinn. 1997. Immunological crossreactivity between the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Adv Exp Med Biol. 418:887-921 , Quinn, A., K. Ward, V. A. Fischetti, M. Hemric, y M. W. Cunningham. 1998. Immunological relationship between the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Infect Immun. 66:4418-24.).

Las proteínas M y de tipo M pertenecen a una familia grande de proteínas localizadas en superficie que se definen por el motivo LPXTG diana de la sortasa (Mazmanian, S. K., G. Liu, H. Ton-That, y O. Schneewind. 1999. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science. 285:760-3, Ton-That, H., G. Liu, S. K. Mazmanian, K. F. Faull y O. Schneewind. 1999. Purification and characterization of sortase, the transpeptidase that cleaves surface proteins of Staphylococcus aureus at the LPXTG motif. Proc Nati Acad Sci U S A. 96: 12424-12429). Este motivo, localizado cerca del extremo carboxi terminal de la proteína, se escinde primero por sortasa entre los restos de treonina y glicina del motivo LPXTG. Una vez escindida, la proteína se une covalentemente mediante el carboxilo de treonina a un grupo amida libre del enlace cruzado aminoacídico en el peptidoglicano, uniendo de este modo permanentemente la proteína a la superficie de la célula bacteriana. Se incluyen en esta familia de proteínas diana de la sortasa la peptidasa C5a (Chen, C. C, y P. P. Cleary. 1989. Cloning and expression of the streptococcal C5a peptidase gene in Escherichia coli: linkage to the type 12 M protein gene. Infect. Immun. 57: 1740-1745, Chmouryguina, I., A. Suvorov, P. Ferrieri, y P. P. Cleary. 1996. Conservaron of the C5a peptidase genes in group A and B streptococci. Infect. Immun. 64:2387-2390), adhesinas para fibronectina (Courtney, H. S., Y. Li, J. B. Dale y D. L. Hasty. 1994. Cloning, sequencing, and expression of a fibronectin/fibrinogen-binding protein from group A streptococci. Infecí Immun. 62:3937-46, Fogg, G. C, y M. G. Caparon. 1997. Constitutive expression of fibronectin binding in Streptococcus pyogenes as a result of anaerobio activation of rofA. J Bacteriol. 179:6172-80, Hanski, E. y M. Caparon. 1992. Protein F, a fibronectin-binding protein, is an adhesión of the group A streptococcus Streptococcus pyogenes. Proc Nati Acad Sci., USA. 89:6172-76, Hanski, E., P. A. Horwitz y M. G. Caparon. 1992. Expression of protein F, the fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes JRS4, in heterologous streptococcal and enterococcal strains promotes their adherence to respiratory epithelial cells. Infect Immun. 60:5119-5125), vitronectina, y colágeno de tipo IV y cualquier otra proteína de tipo M que se una a plasminógeno, IgA, IgG y albúmina (Kihlberg, B. M., M. Collin, A. Olsen, y L. Bjorck. 1999. Protein H, an antiphagocytic surface protein in Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 67: 1708-14).

Se han descrito numerosas proteínas secretadas, varias de las cuales se considera que son toxinas. La mayoría de los aislados de Streptococcus pyogenes de casos de enfermedad invasiva grave y síndrome de choque tóxico estreptocócico (STSS) producen exotoxinas piogénicas estreptocócicas (SPE) A y C (Cockerill, F. R., 3o, R. L. Thompson, J. M. Musser, P. M. Schlievert, J. Talbot, K. E. Holley, W. S. Harmsen, D. M. Ilstrup, P. C. Kohner, M. H. Kim, B. Frankfort, J. M. Manaban, J. M. Steckelberg, F. Roberson y W. R. Wilson. 1998. Molecular, serological, and clinical features of 16 consecutive cases of invasive streptococcal disease. Southeastern Minnesota Streptococcal Working Group. Clin Infect Dis. 26:1448-58). Otras exotoxinas piogénicas también se han identificado en la secuencia genómica de Streptococcus pyogenes completada en la Universidad de Oklahoma remitida a GenBank y con número de acceso asignado AE004092 y se han caracterizado (Proft, T., S. Louise Moffatt, C. J. Berka n y J. D. Fraser. 1999. Identification and Characterization of Novel Superantigens from Streptococcus pyogenes. J Exp Med. 189:89-102). Otras toxinas tales como toxina de Síndrome de Tipo Choque Tóxico, Superantigeno Estreptocócico (Reda, K. B., V. Kapur, D. Goela, J. G. Lamphear, J. M. Musser y R. R. Rich. 1996. Phyiogenetic distribution of streptococcal superantigen SSA allelic variants provides evidence for horizontal transfer of ssa within Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 64: 1 161 -5), y Factor Mitogénico (Yutsudo, T., K. Okumura, M. Iwasaki, A. Hará, S. Kamitani, W. Minamide, H. Igarashi y Y. Hinuma. 1994. The gene encoding a new mitogenic factor in a Streptococcus pyogenes strain is distributed only in group A streptococci. Infection and Immunity. 62:4000-4004) desempeñan papeles menos definidos en la enfermedad. La estreptolisina O también podría considerarse un posible antígeno candidato, debido a que provoca la liberación de IL-ß. Además, también se han identificado una diversidad de enzimas secretadas que incluyen la Cisteína proteasa (Lukomski, S., C. A. Montgomery, J. Rurangirwa, R. S. Geske, J. P. Barrish, G. J. Adams y J. M. Musser. 1999. Extracellular cysteine protease produced by Streptococcus pyogenes participates in the pathogenesis of invasive skin infection and dissemination in mice. Infect Immun. 67: 1779-88, Matsuka, Y. V., S. Pillai, S. Gubba, J. M. Musser y S. B. Olmsted. 1999. Fibrinogen cleavage by the Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease and generation of antibodies that inhibit enzyme proteolytic activity. Infect Immun. 67:4326-33), Estreptocinasa (Huang, T. T., H. Malke y J. J. Ferretti. 1989. The streptokinase gene of group A streptococci: cloning, expression in Escherichia coli, and sequence analysis. Mol Mícrobiol. 3:197- 205, Nordstrand, A. , W. M. McShan, J. J. Ferretti, S. E. Holm y M. Norgren. 2000. Alíele substitution of the streptokinase gene reduces the nephritogenic capacity of group A streptococcal strain NZ131 . Infect Immun. 68:1019-25), y Hialuronidasa (Hynes, W. L, A. R. Dixon, S. L. Walton y L. J. Aridgides. 2000. The extracellular hyaluronidase gene {hylA) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiol Lett. 184: 109-12, Hynes, W. L, L. Hancock y J. J. Ferretti. 1995. Analysis of a second bacteriophage hyaluronidase gene from Streptococcus pyogenes: evidence for a third hyaluronidase involved in extracellular enzymatic activity. Infect Immun. 63:3015-20).

Dada la variedad de factores de virulencia conocidos producidos por Streptococcus pyogenes, está claro que una característica importante para una composición inmunogénica estreptocócica ß-hemolítica exitosa sería su capacidad para estimular una respuesta que evite o limite la colonización temprana en el proceso de infección. Esta respuesta protectora bloquearía la adherencia y/o potenciaría la eliminación de células a través de opsonofagocitosis. Los anticuerpos para la proteína M han mostrado ser opsónicos y proporcionan un mecanismo para superar las propiedades antifagocíticas de la proteína (Jones, K. F. y V. A. Fischetti. 1988. The ¡mportance of the location of antibody binding on the M6 protein for opsonization and phagocytosis of group A M6 streptococci. J Exp Med. 167: 1 1 14-23) de una forma muy similar a como los anticuerpos capsulares antiserotipo B han demostrado protección de enfermedad causada por Haemophilus influenzae B (Madore, D. V. 1998. Characterization of immune response as an indicator of Haemophilus influenzae type b vaccine efficacy. Pediatr Infect Dis J. 17:S207-10). Además, se ha mostrado que anticuerpos específicos para proteína F bloquean la adherencia e internalización por células de cultivo tisular (Molinari, G., S. R. Talay, P. Valentin-Weigand, M. Rohde y G. S. Chhatwal. 1997. The fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes, Sfbl, is involved in the internalizaron of group A streptococci by epithelial cells. Infect Immun. 65:1357-63).

Sigue existiendo una necesidad de desarrollar composiciones inmunogénicas y procedimientos para prevenir o aliviar infecciones causadas por estreptococos ß-hemolíticos, incluyendo grupos A, B, C y G. También sigue existiendo una necesidad de proporcionar composiciones inmunogénicas que proporcionen inmunidad a una amplia serie de bacterias BHS.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Para cumplir estas y otras necesidades, y a la vista de sus fines, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas para la protección de mamíferos susceptibles frente a colonización o infección por estreptococos ß-hemoliticos incluyendo estreptococos de grupos A, B, C y/o D, incluyendo los de Streptococcus pyogenes. Estas composiciones inmunogénicas comprenden una mezcla de dos o más polipéptidos como se describe de forma más completa posteriormente. La invención también proporciona procedimientos para prevenir o aliviar dicha colonización, en un mamífero susceptible por administración de una cantidad eficaz de la composición inmunogénica para generar anticuerpos para los polipéptidos específicos contenidos dentro de la composición inmunogénica. La invención proporciona adicionalmente polipéptidos y polinucleótidos de Streptococcus pyogenes, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. Otro aspecto de la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos de Streptococcus pyogenes. Los polipéptidos y polinucleótidos también pueden usarse en la fabricación de un medicamento para prevenir o aliviar una infección causada por estreptococos ß-hemolíticos.

Los polipéptidos usados en las composiciones ¡nmunogénicas de la invención incluyen polipéptidos aislados que comprenden al menos una de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las Figuras 2, 4, 6, 8 o 10. La invención también incluye secuencias de aminoácidos que tienen al menos 90 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores y polipéptidos maduros de estas. La invención incluye adicionalmente fragmentos inmunogénicos y equivalentes biológicos de estos polipéptidos. También se proporcionan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a los polipéptidos de la invención.

Los polinucleótidos de la invención incluyen polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de la invención. Estos polinucleótidos incluyen polinucleótidos aislados que comprenden al menos una de las secuencias de nucleótidos de cualquiera de las figuras 1 , 3, 5, 7 o 9 y también incluyen otras secuencias de nucleótidos que, como resultado de la degeneración del código genético, también codifique un polipéptido de la invención. La invención también incluye polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención y polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores. Además, los polinucleótidos aislados de la invención incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención, secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias anteriores y secuencias de nucleótidos que son completamente complementarias con estos polinucleótidos. Además, la invención incluye vectores de expresión y células huésped que comprenden estos polinucleótidos.

La invención también proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunogénica de al menos dos o más componentes (seleccionados de SCP (Figura 2 (SEC ID N°: 2) y los péptidos codificados por ORF 554 (peptidilpropil isomerasa (Figura 4 (SEC ID N°: 4)), ORF 1218 (proteína hipotética (Figura 6 (SEC ID N°: 6)), ORF 1358 (proteína de adhesión potencial (Figura 8 (SEC ID N°: 8)) y ORF 2459 (lipoproteína de superficie (Figura 10 (SEC ID N°: 10)) cada una de las cuales comprende un polipéptido de la invención en una cantidad eficaz para prevenir o aliviar una colonización o infección estreptocócica ß-hemolítica en un animal sensible. Cada componente puede comprender el polipéptido en sí mismo o puede comprender el polipéptido y cualquier otra sustancia (por ejemplo, uno o más agentes químicos, proteínas, etc.) que pueden ayudar a la prevención y/o alivio de colonización o infección estreptocócica ß-hemolítica. Estas composiciones inmunogénicas pueden comprender adicionalmente al menos una parte del polipéptido, opcionalmente conjugado o ligado a un péptido, polipéptido o proteína o a un polisacárido.

La invención también incluye procedimientos para proteger a un animal sensible frente a colonización o infección estreptocócica ß-hemolítica. En una realización, el procedimiento comprende administrar a un mamífero una cantidad eficaz de una composición de dos o más inmunogénicos que comprende una cantidad inmunogénica de un polipéptido de la invención, siendo dicha cantidad eficaz para prevenir o aliviar colonización o infección estreptocócica ß-hemolítica en el mamífero susceptible. Tales combinaciones de componentes, se ha descubierto que son eficaces para proporcionar dicha protección a una serie amplia de grupos y generalmente proporcionan una mayor respuesta inmune que los componentes individuales administrados por separado. Las composiciones ínmunogénicas de la invención pueden administrarse por cualquier vía convencional por ejemplo, por inyección subcutánea o intramuscular, ingestión oral o por vía intranasal.

La invención proporciona adicionalmente composiciones ínmunogénicas. En una realización, la composición inmunogénica comprende al menos un polipéptido de la invención. En otra realización, la composición inmunogénica comprende al menos un polinucléotido de la invención.

Debe entenderse que la descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son a modo de ejemplo, pero no restrictivas, de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta la secuencia de ácido nucleico que codifica la peptidasa C5a ("SCP"; SEC ID N°: 1 ).

La Figura 2 presenta la secuencia de aminoácidos de SCP (SEC ID N°: 2).

La Figura 3 presenta la secuencia de ácido nucleico de ORF 554 que codifica la peptidilpropil isomerasa (SEC ID N°: 3).

La Figura 4 presenta la secuencia de aminoácidos de la peptidilpropil isomerasa (SEC ID N°: 4).

La Figura 5 presenta la secuencia de ácido nucleico de ORF 1218 que codifica una proteína hipotética (SEC ID N°: 5).

La Figura 6 presenta la secuencia de aminoácidos de una proteína hipotética (SEC ID N°: 6).

La Figura 7 presenta la secuencia de ácido nucleico de ORF 1358 que codifica una proteína de adhesión potencial (SEC ID N°: 7).

La Figura 8 presenta la secuencia de aminoácidos de una proteína de adhesión potencial (SEC ID N°: 8).

La Figura 9 presenta la secuencia de ácido nucleico de ORF 2459 que codifica una lipoproteína de superficie (SEC ID N°: 9).

La Figura 10 presenta la secuencia de aminoácidos de una lipoproteína de superficie (SEC ID N°: 10).

La Figura 1 1 presenta gráficamente el porcentaje de muertes en comparación con medios de las composiciones inmunogénicas de tres componentes ("Trivax"= SCP, peptidilpropil isomerasa (ORF 554) y proteína de adhesión potencial (ORF 1358)) y un componente ("554" = peptidilpropil isomerasa (ORF 554)) examinadas en el Ejemplo 2.

Las Figuras 12-16 demuestran gráficamente los resultados de transferencia de inmunidad pasiva del Ejemplo 3. UFC = unidades formadoras de colonias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas para prevenir o aliviar infecciones causadas por estreptococos ß-hemol ¡ticos, incluyendo grupos A, B, C y G. Dos o más de los polipéptidos enumerados en el presente documento se combinan para realizar una composición inmunogénica.

Específicamente, en una realización, una composición inmunogénica de la presente invención comprende una mezcla de dos o más polipéptidos, codificado cada polipéptido por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) peptidasa C5a ("SCP") (Figura 1 (SEC ID N°: 1)); (b) marco de lectura abierto ("ORF") 554 (Figura 3 (SEC ID N°: 3)); (c) ORF 1218 (Figura 5 (SEC ID N°: 5)); (d) ORF 1358 (Figura 7 (SEC ID N°: 7)); y (e) ORF 2459 (Figura 9 (SEC ID N°: 9)).

En otra realización, una composición inmunogénica de la presente invención comprende una mezcla de dos o más polipéptidos, teniendo cada polipéptido al menos un 90 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SCP (Figura 2 (SEC ID N°: 2)); (b) peptidilpropil isomerasa (Figura 4 (SEC ID N°: 4)); (c) proteína hipotética (Figura 6 (SEC ID N°: 6)); (d) proteína de adhesión potencial (Figura 8 (SEC ID N°: 8)); y (e) lipoproteína de superficie (Figura 10 (SEC ID N°: 10)).

En otra realización más, una composición inmunogénica de la presente invención comprende una mezcla de: (a) un polipéptido SCP codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1 (SEC ID N°: 1 ); (b) un polipéptido de peptidilpropil isomerasa codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la Figura 3 (SEC ID N°: 3); y (c) al menos otro polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (i) Figura 5 (SEC ID N°: 5); (ii) Figura 7 (SEC ID N°: 7) y (iii) Figura 9 (SEC ID N°: 9).

En otra realización más, una composición inmunogénica de la presente invención comprende una mezcla de: (a) un polipéptido de SCP que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEC ID N°: 2); (b) un polipéptido de peptidilpropil isomerasa que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEC ID N°: 4); y (c) al menos otro polipéptido que tiene al menos 90 % de identidad con una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en (i) Figura 6 (SEC ID N°: 6); (ii) Figura 8 (SEC ID N°: 8); y (iii) Figura 10 (SEC ID N°: 10).

Las expresiones "polinucleótido", "ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico" se usan de forma intercambiable en el presente documento. Estas expresiones abarcan nucleótidos conectados por enlaces fosfodiéster. Un "polinucleótido" puede ser un polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) que es mono o bicatenario, que contiene opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido en forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o mezclas de los mismos. Las bases nucleotídicas se indican en el presente documento por un código de una letra: adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C), inosina (I) y uracilo (U).

Los polinucleótidos estreptocócicos descritos en el presente documento pueden obtenerse usando técnicas de clonación y exploración convencionales. Estos polinucleótidos pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de ADN genómico, a partir de una biblioteca de ADNc derivada de ARNm, a partir de una biblioteca de ADN genómico o pueden sintetizarse usando técnicas disponibles en el mercado y bien conocidas, tales como, por ejemplo, por PCR de una biblioteca de ADNc o mediante RT-PCR (transcripción inversa -reacción en cadena de la polimerasa).

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos para los expertos en la materia para obtener ADNc de longitud completa o para prolongar ADNc cortos, tales como, por ejemplo, los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE). Véase Frohman y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988. Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificadas por la tecnología MARATHON™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado de forma significativa la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología MARATHON™, se han preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y una secuencia "adaptadora" ligada en cada extremo. Después se lleva a cabo amplificación de ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADNc usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de adaptador y específicos de gen. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridar dentro del producto amplificado (normalmente un cebador específico de adaptador que híbrida más 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que alinea más 5' en la secuencia del gen conocida). Los productos de esta reacción pueden después analizarse por secuenciación de ADN y puede construirse un ADNc de longitud completa uniendo el producto directamente al ADNc existente para proporcionar una secuencia completa o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

El término "recombinante" significa, por ejemplo, que un polinucleótido se prepara por una combinación artificial de dos o más segmentos polinucleotídícos de otro modo separados, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de polinucleótidos aislados usando técnicas de ingeniería genética. Una "construcción de ADN recombinante" comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención unidos operativamente con al menos un elemento regulador.

Las variantes ortólogas y alélicas de los polinucleótidos estreptocócicos pueden identificarse fácilmente usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Las variantes alélicas y ortólogos de los polinucleótidos pueden comprender una secuencia de nucleótidos que normalmente es aproximadamente del 90-95 % o más idéntica a una o más cualesquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas en las Figuras de números impares 1 -9 (SEC ID N° de números impares: 1-9) o fragmentos de las mismas. Las variantes alélicas y ortólogos de estos polinucleótidos pueden codificar un polípéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en una o más cualesquiera de las Figuras de números pares 2-10 (SEC ID N° de números pares: 2-10). Tales polinucleótidos pueden identificarse fácilmente como capaces de hibridar en condiciones rigurosas, con uno o más cualesquiera de los polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos expuesta en las Figuras 1-9 (números impares de SEC ID N°: 1 -9) o fragmentos de los mismos.

Se entiende bien por un experto en la materia que muchos niveles de identidad de secuencia son útiles en la identificación de secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas relacionadas. Los alineamientos de secuencia y los cálculos de identidad porcentual pueden realizarse usando el programa MEGALIGN™ del paquete de aplicaciones de bioinformática LASERGENE™ (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Pueden realizarse múltiples alineamientos de las secuencias usando el procedimiento de Clustal de alineamiento (Higgins y Sharp, Gene, 73(1 ):237-44, 1988) con los parámetros por defecto de, por ejemplo, PENALIZACIÓN DE HUECO=10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO=10. Los parámetros por defecto para alineamientos por pares usando el procedimiento Clustal pueden ser, por ejemplo, KTUPLE 1 , PENALIZACIÓN DE HUECO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5.

Una secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia indicada, es decir, el 100 % idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad es menor del 100 %. Tales alteraciones incluyen al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa o inserción de un aminoácido. Las alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia polipeptidica de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de aminoácidos de referencia.

Por lo tanto, la invención también proporciona polipéptidos aislados que tienen identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos contenidas en las secuencias indicadas. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia es preferentemente mayor del 90 % (por ejemplo, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más). Estas proteínas homologas incluyen mutantes y variantes alélicas.

"Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como se determina por comparación de la secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre hebras de dichas secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitación los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991 ; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Están codificados procedimientos para determinar identidad y similitud en programas informáticos públicamente disponibles. Los procedimientos de programa informático preferidos para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J„ y col. 1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F., y col., 1990). El programa BLASTX está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., y col., 1990). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también puede usarse para determinar la identidad.

Por ejemplo, el número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado puede determinarse multiplicando el número total de aminoácidos en una de las Figuras con números pares 2-10 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 y 10) por el porcentaje numérico de la identidad porcentual respectiva (dividida por 100) y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos en una de las Figuras de números pares 2-10 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 y 10) o: na<xa-(xa y), en la que na es el número de alteraciones de aminoácidos, xa es el número total de aminoácidos en una de las Figuras de números pares 2-10 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 y 10) e y es, por ejemplo, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 %, 0,97 para 97 % etc. y en la que cualquier producto no entero de xa e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de restarlo de xa.

La presente invención también contempla polipéptidos aislados que se conservan sustancialmente entre cepas de estreptococos ß-hemolíticos. Además, también se contemplan por la presente invención polipéptidos aislados que están sustancialmente conservados entre cepas de estreptococos ß-hemolíticos y que son eficaces en la prevención o alivio de una colonización o infección estreptocócica ß-hemolítica en un sujeto susceptible. Como se usa en el presente documento, el término "conservado" se refiere a, por ejemplo, el número de aminoácidos que no experimentan inserciones, sustituciones y/o deleciones como un porcentaje del número total de aminoácidos en una proteína. Por ejemplo, si una proteína está conservada al 90 % y tiene, por ejemplo, 263 aminoácidos, entonces hay 237 posiciones de aminoácidos en la proteína en las que los aminoácidos no experimentan sustitución. De forma similar, si una proteína está conservada al 95 % y tiene, por ejemplo, aproximadamente 280 aminoácidos, entonces hay 14 posiciones de aminoácidos en las que los aminoácidos pueden experimentar sustitución y 266 (es decir, 280 menos 14) posiciones de aminoácidos en las que los aminoácidos no experimentan sustitución. De acuerdo con una realización de la presente invención, el polipéptido aislado está preferentemente conservado al menos aproximadamente al 90 % entre las cepas de estreptococos ß-hemolíticos, más preferentemente conservado al menos aproximadamente al 95 % entre las cepas, incluso más preferentemente conservado al menos aproximadamente al 97 % entre las cepas y más preferentemente conservado al menos aproximadamente al 99 % entre las cepas, sin limitación.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos y aun obtener polipéptidos que tengan actividad y/o antigenicidad para estreptococos ß-hemolíticos y/o Streptococcus pyogenes. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad y/o antigenicidad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, ciertas sustituciones de secuencia de aminoácidos pueden realizarse en una secuencia polipeptidica (o, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente) y obtener no obstante un polipéptido con propiedades similares.

La invención incluye cualquier polipéptido aislado que sea un equivalente biológico que proporcione la reactividad deseada como se describe en el presente documento. La expresión "reactividad deseada" se refiere a la reactividad que se reconocería por un experto en la materia como un resultado útil para los fines de la invención. Se describen ejemplos de reactividad deseada en el presente documento, incluyendo sin limitación, niveles deseados de protección, titulaciones de anticuerpos deseadas, actividad opsonofagocítica deseada y/o reactividad cruzada deseada, tal como reconocería un experto en la materia como útiles para los fines de la presente invención. La actividad opsonofagocítica deseada se indica por un porcentaje de muertes de bacterias según se mide por reducción en unidades formadoras de colonias (UFC) en OPA frente a un control negativo. Sin quedar limitado a lo mismo, la actividad opsonofagocítica deseada es preferentemente de al menos aproximadamente el 15 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 20 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 40 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 50 % y más preferentemente al menos aproximadamente el 60 %.

La invención incluye polipéptidos que son variantes de los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de las Figuras con números pares 2-10 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 y 10). "Variante" como se usa el término en el presente documento, incluye un polipéptido que difiere de un polipéptido de referencia pero conserva propiedades esenciales. Generalmente, las diferencias se limitan de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas (es decir, biológicamente equivalentes). Un polipéptido de referencia y variante pueden diferir en secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones o deleciones en cualquier combinación. Un resto aminoacídico sustituido o insertado puede o no ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica o puede ser una variante que no se conozca que se produce de forma natural. Las variantes de origen no natural de polipéptidos pueden prepararse por síntesis directa o por técnicas de mutagénesis.

Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir la función biológica interactiva en un polipéptido generalmente se entiende en la técnica (Kyte & Doolittle, 1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos que tengan una puntuación o índice hidropático similar y aun dar como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga. Esos índices se enumeran entre paréntesis después de cada aminoácido como sigue: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1 ,9); alanina (+1 ,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1 ,3); prolina (-1 ,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

Se cree que el carácter hidropático relativo del resto aminoacidico determina la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, lo que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antigenos y similares. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y aun obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +1-2, se prefieren particularmente los que están dentro de +/-1 y se prefieren aún más particularmente los que está dentro de +/-0,5.

La sustitución de aminoácidos similares también puede realizarse basándose en la hidrofilia, particularmente cuando el polipéptido o péptido equivalente funcional biológico creado de este modo se pretende para su uso en realizaciones inmunológicas. La Patente de Estados Unidos N° 4.554.101 incorporada en el presente documento por referencia, indica que la mayor hidrofilia media local de un polipéptido, según se regula por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se relaciona con su inmunogenia y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica del polipéptido.

Como se detalla en la Patente de Estados Unidos N° 4.554.101 , incorporada en el presente documento por referencia, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a restos aminoacídicos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0+1 ); glutamato (+3,0±1 ); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5±1 ); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1 ,0); metionina (-1 ,3); valina (-1 ,5); leucina (-1 ,8); isoleucina (-1 ,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); y triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituir a otro que tenga un valor de hidrofilia similar y obtener aun un polipéptido biológicamente y en particular inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de +2, se prefieren particularmente los que están dentro de ±1 y se prefieren más particularmente los que están dentro de +0,5.

Como se ha descrito anteriormente, las sustituciones de aminoácidos están generalmente, por lo tanto, basadas en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones a modo de ejemplo que toman diversas de las anteriores características en consideración se conocen bien por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Como se muestra en la Tabla I a continuación, las sustituciones de aminoácidos adecuadas incluyen las siguientes: TABLA 1 : Resto Sustitución de original resto a modo de ejemplo Resto Sustitución de original resto a modo de ejemplo Por lo tanto, la invención incluye equivalentes funcionales o biológicos de los polipéptidos de las secuencias en las Figuras de número par 2-10 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 y 10) que contienen una o más sustituciones de aminoácidos.

Los equivalentes biológicos o funcionales de un polipéptido también pueden prepararse usando mutagénesis específica. La mutagénesis específica es una técnica útil en la preparación de polipéptidos de segunda generación o polipéptidos biológicamente, funcionalmente equivalentes, derivados de las secuencias de los mismos, a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. Como se ha observado anteriormente, tales cambios pueden ser deseables cuando sean deseables sustituciones de aminoácidos. La técnica proporciona adicionalmente una capacidad fácil para preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios de secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias oligonucleotídicas especificas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar una doble cadena estable en ambos lados del punto de unión de deleción que se atraviesa. Normalmente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, alterándose aproximadamente de 5 a 10 restos a ambos lados del punto de unión de la secuencia.

En general, la técnica de mutagénesis específica se conoce bien en la materia. Como se apreciará, la técnica usa normalmente un vector de fago que puede existir en forma monocatenaria y bicatenaria. Normalmente, la mutagénesis dirigida de acuerdo con el presente documento se realiza obteniendo primero un vector monocatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica toda o una parte de la secuencia polípeptídica de Streptococcus pyogenes seleccionada. Un cebador oligonucleotídico que porta la secuencia mutada deseada se prepara, por ejemplo, por técnicas bien conocidas (por ejemplo, de forma sintética). Este cebador se híbrida después con el vector monocatenario y se extiende mediante el uso de enzimas, tales como fragmento de Klenow de polimerasa I de £ co//, para completar la síntesis de la hebra que porta la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia original no mutada y la segunda hebra porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa después para transformar células apropiadas, tales como células de E. coli y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que portan la mutación. Kits disponibles en el mercado proporcionan los reactivos necesarios.

Se entiende que los polipéptidos y antígenos polipeptídicos de la invención incluyen cualquier polipéptido que comprenda similitud de secuencia, similitud estructural y/o similitud funcional sustancial con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las Figuras de números pares 2-10 (SEC ID N°: 2, 4, 6, 8 y 10). Además, un polipéptido o antígeno polipeptídico de la invención no está limitado a una fuente particular. Por lo tanto, la invención posibilita la detección general y aislamiento de los polipéptidos de una diversidad de fuentes.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína mayor tal como una proteína de fusión. Con frecuencia es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene, por ejemplo, secuencias secretoras o líder, prosecuencías, secuencias que ayudan a la purificación tales como restos múltiples de histidina o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción de recombinación.

La expresión "composición inmunogénica" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier tipo de agente biológico en una forma administrable capaz de estimular una respuesta inmune en un sujeto inoculado con la composición inmunogénica. Una respuesta inmune puede incluir inducción de anticuerpos y/o inducción de una respuesta de linfocitos T. El término "protección" cuando se usa en referencia a una composición inmunogénica, se refiere en el presente documento al alivio (parcial o completo) de cualquiera de los síntomas asociados con la enfermedad o afección en cuestión. Por lo tanto, la protección de los sujetos de infección por una especie de Estreptococo tal como S. dysgalactiae (incluyendo las subespecies Dysgalactiae y Equisimilis) por las composiciones inmunogénicas presentes generalmente da como resultado una reducción del crecimiento bacteriano y/o uno o más de los síntomas clínicos asociados con infección estreptocócica, incluyendo artritis, endocarditis,' meningitis, poliserositis, bronconeumonía, meningitis, pérdida de audición permanente y choque séptico.

Los procedimientos desvelados en el presente documento pueden incluir inducir una respuesta inmune contra uno o más patógenos que incluyen una especie de Estreptococos (por ejemplo, Streptococcus dysgalactiae, S. dysgalactiae sub. Equisimilis, S. dysgalactiae sub. Dysgalactiae, S. pyogenes, S. agalactiae, S. anginosus, S. constellatus, S. equisimilis y S. intermedius.). Por ejemplo, los procedimientos pueden incluir inducir producción de anticuerpos policlonales contra uno o más patógenos estreptocócicos tales como por ejemplo S. dysgalactiae sub. Equisimilis.

Como se ha analizado anteriormente, las composiciones inmunogénicas comprenden dos o más polipéptidos de la invención. Para hacerlo, uno o más polipéptidos se ajustan a una concentración apropiada y pueden formularse con cualquier adyuvante, diluyente, vehículo farmacéuticamente aceptable adecuados o cualquier combinación de los mismos. Como se usa en el presente documento se pretende que la frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, excipientes y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Pueden usarse vehículos fisiológicamente aceptables como excipientes y/o diluyentes. Se entiende que un vehículo farmacéuticamente aceptable designa un compuesto o una combinación de compuestos que entra en una composición farmacéutica o inmunogénica que no provoca efectos secundarios y que hace posible, por ejemplo, facilitar la administración del compuesto activo, aumentar su vida y/o su eficacia en el cuerpo, aumentar su solubilidad en solución o como alternativa mejorar su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien y se adaptarán por expertos en la materia de acuerdo con la naturaleza y el modo de administración del compuesto activo seleccionado. Estos incluyen, pero sin limitación, agua, solución de Ringer, un medio isotónico apropiado, glicerol, etanol y otros disolventes convencionales, solución salina tamponada con fosfato y similares.

Composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parisppany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida hasta el punto de que exista inyectabilidad fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y similares. En muchos casos, se incluyen agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y/o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando los polipéptidos en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos para los anteriormente enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado en vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones inmunogénicas como se han descrito en el presente documento también comprenden, en ciertas realizaciones, uno o más adyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmunógeno o un antígeno. Varias citocinas o linfocinas han mostrado tener actividad inmunomoduladora y por lo tanto son útiles como adyuvantes, incluyendo, pero sin limitación, las interleucinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8 y 10, 12 (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones a, ß y ?; factores estimuladores de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.078.996 y Número de Acceso de ATCC 39900); factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF); factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF); y los factores de necrosis tumoral a y ß. Otros adyuvantes más que son útiles con las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento incluyen quimiocinas, incluyendo pero sin limitación, MCP-1 , ???? a, ???-1 ß y RANTES; moléculas de adhesión, tales como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina, E-selectina; moléculas de tipo mucina, por ejemplo, CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1 ; un miembro de la familia de la integrina tal como LFA-1 , VLA-1 , Mac-1 y p150.95; un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas tales como PECAM, ICAMs, por ejemplo, ICAM-1 , ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras tales como CD40 y CD40L; factores de crecimiento incluyendo factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1 y factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas receptoras incluyendo Fas, receptor TNF, Flt, Apo-1 , p55, WSL-1 , DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6; y Caspasa (ICE).

Adyuvantes adecuados usados para mejorar una respuesta inmune incluyen adicionalmente, sin limitación, MPL™ (monofosforilo lípido A 3-0-desacilado, Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.912.094. También son adecuados para su uso como adyuvantes análogos de lípido A sintéticos o compuestos de aminoalquil glucosamina fosfato (AGP) o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la Patente de Estados Unidos N° 6.1 13.918. Un AGP tal es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (AF) o como una emulsión estable (SE).

Otros adyuvantes más incluyen péptidos de muramilo, tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1 '-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones de aceite en agua, tales como MF59 (Patente de Estados Unidos N° 6.299.884) (que contiene Escualeno 5 %, Tween 80 0,5 % y Span 85 0,5 % (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como un microfluidizador Modelo 1 10? (Microfluidics, Newton, MA)) y SAF (que contiene Escualeno 10 %, Tween 80 0,4 %, polímero bloqueado con pluronic 5 % L121 y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado en vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partículas); sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amphigen; Avridine; L121/escualeno; D-lactida-polilactida/glucósido; polioles de pluronic; Bordetella muerta; saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrito en la Patente de Estados Unidos N° 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descrito en la Patente de Estados Unidos N° 5.254.339, y complejos inmunoestimuladores (ISCOMS); Tuberculosis micobacteriana; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), descrito en las Patentes Europeas N° 1.296.713 y 1.326.634; una toxina pertussis (PT) o mutante de la misma, una toxina del cólera o mutante de la misma (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 7.285.281 , 7.332.174, 7.361.355 y 7.384.640); o una toxina inestable ante calor de E. coli (LT) o mutante de la misma, particularmente LT-K63, LT-R72 (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 6.149.919, 7.1 15.730 y 7.291.588).

El polipéptido también puede incluir al menos una parte del polipéptido, opcionalmente conjugado o ligado a un péptido, polipéptido o proteína o a un polisacárido. También se anticipa que las composiciones inmunogénicas. pueden contener otros componentes, tales como polisacáridos, solos o conjugados con proteínas que pueden inducir una respuesta inmune.

Se usan diversos ensayos para evaluar la inmunogenicidad in vitro de los polipéptidos que comprenden las composiciones inmunogénicas de la invención. Por ejemplo, se realiza un ensayo opsónico in vitro incubando juntas una mezcla de células de Streptococcus sp., suero inactivado por calor que contiene anticuerpos específicos para el polipéptido en cuestión y una fuente de complemento exógena. La opsonofagocitosis se realiza durante la incubación de células polimorfonucleares recién aisladas (PMN) y la mezcla de anticuerpo/complemento/células de Streptococcus sp. Las células bacterianas que se revisten con anticuerpo y complemento se matan tras la opsonofagocitosis. Las unidades formadoras de colonias (ufe) de bacterias supervivientes que escapan de la opsonofagocitosis se determinan sembrando en placas la mezcla de ensayo. Los títulos se indican como el recíproco de la dilución mayor que proporciona > 50 % de muerte de las bacterias, según se determina por comparación con los controles de ensayo. Las muestras de ensayo que demuestran menos del 50 % de muertes a la menor dilución de suero ensayada (1 :8), se indica que tienen un título de anticuerpo de opsonofagocitosis (OPA) de 4. El procedimiento descrito anteriormente es una modificación del procedimiento de Gray (Gray, Conjúgate Vaccines Supplement, p. 694-697, 1990).

Se incluye un control de suero de ensayo, que contiene suero de ensayo más células bacterianas y complemento inactivado por calor, para cada suero individual. Este control se usa para evaluar si la presencia de antibióticos u otros componentes de suero son capaces de matar la cepa bacteriana directamente (es decir en ausencia de complemento o PMN). Un suero humano con título opsónico conocido se usa como un control de suero humano positivo.

El título de anticuerpo opsónico para cada suero desconocido se calcula como el recíproco de la dilución inicial del suero que proporciona 50 % de reducción de ufe en comparación con el control sin suero.

También puede usarse un ensayo ELISA de células completas para evaluar la inmunogenicidad in vitro y exposición en superficie del antígeno polipeptídico, en el que una placa, tal como una placa de 96 pocilios, se reviste con la cepa bacteriana de interés y se hacen reaccionar los sueros de ensayo de un animal inmunizado con las células bacterianas. Si cualquier anticuerpo específico para el antígeno polipeptídico del ensayo es reactivo con un epítopo expuesto en superficie del antígeno polipeptídico, puede detectarse por procedimientos convencionales conocidos para los expertos en la materia. Un enfoque similar es controlar el antígeno en la superficie celular usando citometría de flujo y anticuerpos específicos de antígeno.

Cualquier polipéptido que demuestre la actividad in vitro deseada puede ensayarse después en un modelo de reto en animales in vivo. En algunas realizaciones, se usan composiciones inmunogénicas en la inmunización de un animal (por ejemplo, un ratón) por procedimientos y vías de inmunización conocidas para los expertos en la materia (por ejemplo, intranasal, parenteral, intramuscular, oral, rectal, vaginal, transdérmica, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, etc). Después de la inmunización del animal con una composición inmunogénica estreptocócica, se enfrenta al animal con una o más especies estreptocócicas y se ensaya con respectó a resistencia a infección por Streptococcus spp.

Se proporcionan composiciones inmunogénicas de combinación incluyendo dos o más de los polipéptidos de la invención, así como combinando uno o más de los polipéptidos de la invención con uno o más polipéptidos de Streptococcus pyogenes, incluyendo, pero sin limitación, las proteínas , adhesinas y similares.

Una vez formuladas, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse directamente al sujeto, suministrarse ex vivo a células derivadas del sujeto o in vitro para expresión de proteínas recombinantes. Para suministro directamente al sujeto, la administración puede ser de cualquier forma convencional, tal como por vía intranasal, vía parenteral, vía oral, vía intraperitoneal, vía intravenosa, vía subcutánea o vía tópica aplicado a cualquier superficie mucosa tal como superficie intranasal, oral, ocular, pulmonar, vaginal o rectal, tal como por un pulverizador en aerosol.

Es ventajoso formular composiciones orales y parenterales en formas farmacéuticas unitarias para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Las formas farmacéuticas unitarias como se usan en el presente documento se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula que produce el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención se dictan por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir y las limitaciones inherentes en la técnica de formar un compuesto activo tal para el tratamiento de individuos.

Se formulan preparaciones inyectables, por ejemplo suspensiones oleaginosas o acuosas inyectables estériles, de acuerdo con la técnica conocida usando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1 ,3-butanodiol.

Para administración parenteral, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse como dosificaciones inyectables en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéuticamente aceptable que puede ser un líquido estéril tal como aceites acuosos, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares pueden estar presentes en composiciones. Otros componentes pueden incluir los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables.

Normalmente, las composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como polilactida, piliglicolida o copolímero para efecto adyuvante mejorado, como sé ha analizado anteriormente (véase Langer, Science 249: 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden administrarse en forma de una inyección de liberación prolongada o de preparación de implante, que puede formularse de tal manera que permita una liberación prolongada o pulsátil del principio activo.

Los sujetos son generalmente seres humanos. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición ¡nmunogénica en un número de dosis apropiado se administra al sujeto para inducir una respuesta inmune. Cantidad inmunológicamente eficaz, como se usa en el presente documento, significa la administración a un huésped mamífero (preferentemente ser humano), en una dosis única o como parte de una serie de dosis, de la cantidad suficiente para causar al menos que el sistema inmune del individuo tratado genere una respuesta inmune que reduzca el impacto clínico de la infección bacteriana. La expresión "respuesta inmune" o "respuesta inmunológica" incluye el desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por linfocitos T específicos de antígeno o sus productos de secreción). Puede conferirse protección por una dosis única de la composición inmunogénica o puede requerirse la administración de varias dosis, además de dosis de refuerzo en momentos posteriores para mantener la protección. Esto puede variar de una reducción mínima en carga bacteriana a prevención de la infección. Idealmente, el individuo tratado no mostrará las manifestaciones clínicas más graves de la infección estreptocócica ß-hemolítica. La cantidad de dosificación puede variar dependiendo de condiciones específicas del individuo, tales como edad y peso. Esta cantidad puede determinarse en ensayos rutinarios por medios conocidos para los expertos en la materia.

En aplicaciones profilácticas, se administran composiciones inmunogénicas a un sujeto sensible a, o de otro modo en riesgo de, infección estreptocócica ß-hemolítica en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, reducir la gravedad o retardar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad asociados con la infección, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente sospechoso de padecer, o que ya padece, una enfermedad tal en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad.

Se ha observado que no existe secuencia peptídica sencilla que proporcione protección para todas las cepas de BHS, incluyendo los grupos A, B, C y G. Como se muestra en la Tabla II (presentada en el Ejemplo 1 posterior), posteriormente, cada antígeno proporciona una respuesta inmune contra un subconjunto de estos grupos.

Generalmente, se esperará que cualquier combinación de dos o más antígenos expresados en superficie de BHS proporcione la respuesta inmune mejorada descrita anteriormente. Tales podrían incluir los antígenos analizados anteriormente, antígenos capsulares de BHS, proteína M, transportador ABC o cualquier otro antígeno expuesto en superficie. Sin embargo, se ha descubierto que los siguientes antígenos muestran propiedades particularmente beneficiosas para producción de composiciones inmunogénicas: SCP (Peptidasa C5a) petidilpropil isomerasa (codificada por ORF 554) proteína de adhesión potencial (codificada por ORF 1358) lipoproteína de superficie (codificada por ORF 2459) proteína hipotética (codificada por ORF 1218) Las combinaciones de dos o más de estos antígenos en una composición ¡nmunogénica multicomponente sencilla proporcionan protección mejorada frente a uno o más grupos de BHS y producen una respuesta inmune mejorada ante ellos.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no se pretende que la presente invención esté limitada a los mismos.

EJEMPLO 1 -UNIÓN DE ANTICUERPOS La unión de anticuerpos a bacterias, un proceso conocido como opsonización, puede conducir a la captación y muerte de las bacterias por células fagocíticas. La exploración de tales anticuerpos se usa para determinar la eficacia de los anticuerpos inducidos contra serotipos particulares en la muerte de bacterias que expresan o no expresan ese serotipo en la superficie.

Para cada serotipo explorado, se indujeron anticuerpos en ratones contra los anticuerpos codificados por la ORF indicada. Los anticuerpos se exploraron después contra diversas cepas de BHS. La exploración de los anticuerpos se realizó por separación de células activada por fluorescencia (FACS). Brevemente, se incubaron estreptococos muertos por calor con un anticuerpo indicado en hielo durante 45 minutos, seguido de dos lavados. Los estreptococos se incubaron después con un anticuerpo de cabra anti-Alexa-488 de ratón (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 30 minutos en hielo, seguido de dos lavados. Las células tratadas de este modo se ensayaron en una máquina de FACS (por ejemplo véase DeMaster y col., Infect. Immun., 70(1 ): 350-359, 2002.). Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Durante la exploración de antisueros anti-beta hemolítico-estreptocócicos y anticuerpos monoclonales contra diversas cepas estreptocócicas beta hemolíticas (BHS), se observó que algunos antisueros y anticuerpos reaccionaban de manera cruzada contra muchas cepas BHS, incluyendo miembros de Streptococcus pyogenes (estreptococos de Grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococos de Grupo B) y estreptococos de Grupo C y Grupo G (que incluyen las especies estreptocócicas Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus ¡ntermedius, Streptococcus dysgalactiae sub. Equisimilis y Streptococcus dysgalactiae sub. Dysgalactiae). Esta reactividad cruzada también significa que los polipéptidos indicados o codificados por la ORF relevante pueden usarse en una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune eficaz para proteger contra la infección por estreptococos de Grupo A o Grupo B, así como por estreptococos de Grupo C o Grupo G.

En la Tabla 2, el símbolo "+" significa que los anticuerpos reaccionan con el antígeno al menos tres veces por encima del fondo; el símbolo "+/-? significa que los anticuerpos reaccionan con el antígeno entre dos veces y tres veces por encima del fondo y el símbolo "-? significa que la detección de la señal de -'? - · ~. '?¦¦¦*· i '!l EJEMPLO 2-USO DE UNA COMPOSICIÓN INMUNOGÉNICA DE TRES COMPONENTES PARA PRODUCIR SUEROS INMUNES Se preparó una composición inmunogénica trivalente consistente en SCP, el polipéptido codificado por ORF 554 y el polipéptido codificado por ORF 1358 usando como adyuvante fosfato de aluminio y se usó la composición inmunogénica para producir suero hiperinmune de conejo por tres inoculaciones subcutáneas separadas por 2-4 semanas, seguido de sangrado; se usó una composición inmunogénica monovalente consistente en polipéptidos con adyuvantes similares codificados por ORF 554 como control. Los sueros se exploraron con respecto a actividad opsonofagocítica (OPA) frente a S. pyogenes SF370 a diversas diluciones. Brevemente, las bacterias se incubaron con 10 µ? de suero durante una hora en presencia de complemento (complemento de cria de conejo) y después se diluyeron 1 : 10 y se sembraron en placas de agar sangre. Los resultados se presentan en la Figura 1 1.

Como se muestra, puede verse que Trivax induce una actividad opsonofagocítica mayor que la composición inmunogénica 554, lo que indica una mayor muerte de las bacterias.

EJEMPLO 3--TRANSFERENCIA DE INMUNI DAD PASIVA Se indujeron anticuerpos contra cada uno de los siguientes antígenos como se ha descrito anteriormente: SCP y polipéptidos codificados por las ORF 554, 1358, 2459 y 1218. Estos anticuerpos se inyectaron después en crías de rata sin sistemas inmunes completamente funcionales. Las ratas tratadas se enfrentaron posteriormente con S. pyogenes, y las bacterias recuperadas se contaron cuatro horas después de la presentación. El control negativo fue PBS y el control positivo humano fue suero 385.

Los resultados se muestran en la Figuras 12-16. Brevemente, los resultados demostraron que los anticuerpos inducidos por cada uno de los antígenos redujeron significativamente la bacteriemia en las crías de rata.

Aunque esté ilustrada y descrita anteriormente con referencia a realizaciones específicas, no se pretende que la invención no obstante esté limitada a los detalles mostrados. En su lugar, pueden realizarse diversas modificaciones en los detalles dentro del alcance e intervalo de equivalentes de las reivindicaciones y sin separarse del espíritu de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de dos o más polipéptidos, cada polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) peptidasa C5a ("SCP") (Figura 1 (SEC ID N°: 1 )); (b) marco de lectura abierto ("ORF") 554 (Figura 3 (SEC ID N°: 3)); (c) ORF 1218 (Figura 5 (SEC ID N°: 5)); (d) ORF 1358 (Figura 7 (SEC ID N°: 7)); y (e) ORF 2459 (Figura 9 (SEC ID N°: 9)).

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

4. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 en la que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido y en la que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en un mamífero susceptible.

5. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

6. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

7. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de Grupo G.

8. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son Streptococcus pyogenes.

9. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de dos o más polipéptidos, teniendo cada polipéptido al menos un 90 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SCP (Figura 2 (SEC ID N°: 2)); (b) peptidilpropil isomerasa (Figura 4 (SEC ID N°: 4)); (c) proteína hipotética (Figura 6 (SEC ID N°: 6)); (d) proteína de adhesión potencial (Figura 8 (SEC ID N°: 8)); y (e) lipoproteina de superficie (Figura 10 (SEC ID N°: 10)).

10. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

1 1. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

12. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, en la que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido y en la que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en un mamífero susceptible.

13. La composición inmunogénica de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

14. La composición inmunogénica de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

15. La composición inmunogénica de la reivindicación 12, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de Grupo G.

16. La composición inmunogénica de la reivindicación 15, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son Streptococcus pyogenes.

17. Un procedimiento para proteger a un mamífero susceptible frente a colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en el que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo específico para dicho polipéptido y en el que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en el mamífero susceptible.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la composición inmunogénica se administra por inyección subcutánea, por inyección intramuscular, por ingestión oral, por vía intranasal o combinaciones de las mismas.

19. El procedimiento de la reivindicación 17 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de Grupo G.

20. El procedimiento de la reivindicación 19 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son Streptococcus pyogenes.

21. El procedimiento de la reivindicación 17 en el que el mamífero es un ser humano.

22. Un procedimiento para proteger a un mamífero susceptible frente a colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de la reivindicación 9, en el que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo específico para dicho polipéptido y en el que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en el mamífero susceptible.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la composición inmunogénica se administra por inyección subcutánea, por inyección intramuscular, por ingestión oral, por vía intranasal o combinaciones de las mismas.

24. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de Grupo G.

25. El procedimiento de la reivindicación 24 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son Streptococcus pyogenes.

26. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que el mamífero es un ser humano.

27. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de: (a) un polipéptido SCP codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1 (SEC ID N°: 1 ); (b) un polipéptido de peptidilpropil isomerasa codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la Figura 3 (SEC ID N°: 3); y (c) al menos otro polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (i) Figura 5 (SEC ID N°: 5); (ii) Figura 7 (SEC ID N°: 7); y (iii) Figura 9 (SEC ID N°: 9).

28. La composición inmunogénica de la reivindicación 27, que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

29. La composición inmunogénica de la reivindicación 27, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

30. La composición inmunogénica de la reivindicación 27 en la que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido y en la que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en un mamífero susceptible.

31. La composición inmunogénica de la reivindicación 30, que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

32. La composición inmunogénica de la reivindicación 30, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

33. La composición inmunogénica de la reivindicación 30, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de Grupo G.

34. La composición inmunogénica de la reivindicación 33, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son Streptococcus pyogenes.

35. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de: (a) un polipéptido de SCP que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEC ID N°: 2); (b) un polipéptido de peptidilpropil isomerasa que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEC ID N°: 4), y (c) al menos otro polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) Figura 6 (SEC ID N°: 6); (ii) Figura 8 (SEC ID N°: 8); y (iii) Figura 10 (SEC ID N°: 10).

36. La composición inmunogénica de la reivindicación 35, que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

37. La composición inmunogénica de la reivindicación 36, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante.

38. La composición inmunogénica de la reivindicación 35 en la que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo que reconoce específicamente dicho polipéptido y en la que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en un mamífero susceptible.

39. La composición inmunogénica de la reivindicación 38, que comprende adicionalmente un vehículo fisiológicamente aceptable.

40. La composición inmunogénica de la reivindicación 38, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un adyuvante. .

41. La composición inmunogénica de la reivindicación 38, en la que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de Grupo G.

42. La composición inmunogénica de la reivindicación 41 , en la que los estreptococos ß-hemol ¡ticos son Streptococcus pyogenes.

43. Un procedimiento para proteger a un mamífero susceptible frente a colonización o infección por estreptococos ß-hemol ¡ticos que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de la reivindicación 27, en el que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo específico para dicho polipéptido y en el que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en el mamífero susceptible.

44. El procedimiento de la reivindicación 43, en el que la composición inmunogénica se administra por inyección subcutánea, por inyección intramuscular, por ingestión oral, por vía intranasal o combinaciones de las mismas.

45. El procedimiento de la reivindicación 43 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de G.

46. El procedimiento de la reivindicación 45 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son Streptococcus pyogenes.

47. El procedimiento de la reivindicación 43 en el que el mamífero es un ser humano.

48. Un procedimiento para proteger a un mamífero susceptible frente a colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de la reivindicación 35, en el que cada polipéptido es capaz de generar un anticuerpo específico para dicho polipéptido y en el que la cantidad de dicha composición inmunogénica es eficaz para prevenir o aliviar la colonización o infección por estreptococos ß-hemolíticos en el mamífero susceptible.

49. El procedimiento de la reivindicación 48, en el que la composición inmunogénica se administra por inyección subcutánea, por inyección intramuscular, por ingestión oral, por vía intranasal o combinaciones de las mismas.

50. El procedimiento de la reivindicación 48 en el que los estreptococos ß-hemolíticos son estreptococos de Grupo A, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo C o estreptococos de grupo G.

51. El procedimiento de la reivindicación 50 en el que los estreptococos ß-hemol ¡ticos son Streptococcus pyogenes.

52. El procedimiento de la reivindicación 48 en el que el mamífero es un ser humano.

53. Una composición inmunogénica que comprende una mezcla de: (a) un polipéptido de SCP que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEC ID N°: 2); (b) un polipéptido de peptidilpropil isomerasa que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEC ID N°: 4); y (c) un polipéptido de adhesión potencial que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 8 (SEC ID N°: 8).