KR20010075621A - 에스트로겐의 에난티오머를 사용한 허혈성 손상으로부터의세포 보호 방법 - Google Patents

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Abstract

각종 양태에 있어서의 본 발명은 세포가 추가로 손상되는 것을 막기 위해 세포변성 질환이 있는 피검자 중의 세포 집단에 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 제공하는 것을 포함하여, 세포를 보호하고 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 세포변성 질환의 예로는 발작 및 신경변성 질환이 있다.

Description

에스트로겐의 에난티오머를 사용한 허혈성 손상으로부터의 세포 보호 방법{Methods of Cytoprotection Using an Enantiomer of Estrogen of Ischemic Damage}
허혈증은 혈액을 공급하는 혈관의 수축 또는 봉쇄로 인해 야기된, 산소포화된 혈액이 신체 일부 내로 부적절하게 유동하는 것과 연관된 급성 질환이다. 허혈증은 특정 조직으로의 혈류량이 임계 수준 미만으로 감소될 때 언제든지 일어난다. 이러한 혈류량 감소는 (i) 색전 (응혈)에 의한 혈관의 봉쇄; (ii) 아테롬성동맥경화증으로 인한 혈관의 봉쇄; (iii) 혈관의 파괴 (출혈성 발작); (iv) 혈관경련 동안 및 가능하게는, 일시적인 허혈성 발작 (TIA)과 이에 수반되는 지망막하 출혈 동안에 발생되는 것과 같은 혈관수축으로 인한 혈관의 봉쇄에 기인할 수 있다. 추가로, 허혈이 일어나는 상황으로는 (i) 심근 경색; (ii) 외상; 및 (iii) 심장 및 흉곽 수술 및 신경수술 동안 (수술이 성공적으로 이루어지기 위해서는 혈류량이 감소되거나 중단되어야 한다)이 있다. 심근 경색 동안에는, 기관으로의 혈류량을 감소시키는 심박 정지나 손상이 일어나, 허혈이 된다. 심장 조직 자체도 허혈성 손상을 입게 된다. 각종 수술 동안, 혈류량 감소, 응혈 또는 기포 발생으로 인해, 심각한 허혈성 손상이 야기될 수 있다.
허혈성 사건이 일어나면, 허혈 부위로부터 발생되는 손상이 단계적으로 변하게 된다. 혈액 흐름이 제한된 부위의 세포는 괴사를 일으키게 되고 이는 병변의 중심을 형성한다. 명암선 (penumbra)이 상기 병변 중심 주변에 형성되고, 여기서는 상해가 즉시 치사적이진 않지만 서서히 세포 사멸쪽으로 진행된다. 이러한 세포 사멸로의 진행은 허혈성 사건 후 단시간 내에 혈류량을 회복시키면 반전될 수 있다.
병소 허혈증은 뇌혈관성 질환 (발작), 지망막하 출혈 (SAH) 및 외상을 포괄한다. 발작은 일년에 500,000건 이상이 발생하여 매년 150,000명이 사망하는, 미국에서 3번째로 높은 질병률을 나타낸다. 발작 후의 휴유증이, 예방이나 치료가 현재 개발되지 않은 신경단위 손상으로부터 비롯되어 사망하게 만들고 쇠약하게 만드는 만성 신경병적 합병증이다.
발작이 일어난 후, 상기 병변 중심 영역은 세포 사멸의 신호를 나타내지만, 명암선 내의 세포는 기능 이상을 나타내긴 하지만 일정 기간 동안 살아 있으며, 수 일 이내에 괴사 중심과 유사해질 것이다. 명암선 내의 신경단위는 국부적 혈류량을 기준으로 하여 등급을 매기는 방식으로 기능 이상을 나타내는 것으로 보인다. 혈류량이 고갈됨에 따라, 신경단위는 전기적으로 활동을 하지 않게 되고, 이들의 이온 구배가 소멸되며, 세포가 소극되어 사멸하게 된다. 뇌 모세혈관의 내피 세포는 팽윤되기 시작하여, 이러한 모세혈관의 관강 (luminal) 직경이 작아진다. 이들사건과 관련하여, 혈액 뇌 장벽이 파열되고, 혈류와 산소로의 세포 접근을 추가로 방해하는 염증 반응이 수반된다.
신경단위에 대한 발작의 효과는 전기적 시그날링과 신경전달자 방출에 관계하는 상당히 중요한 이온 펌프의 파열을 가져다 주는 산소 결핍과 연관된 에너지 공급원의 고갈로부터 비롯된다. ATP-의존성 이온 특이적 펌프가, 세포로부터의 나트륨, 염소, 수소 및 칼슘 이온의 능동 수송과 세포 내로의 칼륨 이온의 능동 수송을 통한 이온 구배를 유지시키지 못하면, 일련의 해로운 생화학 사건이 일어난다. 예를 들면, 세포내 칼슘 이온 수준이 증가하게 되면, (i) 지질과 단백질을 광범위하게 손상시키는 자유 라디칼이 생성되고; (ii) N-메틸 D-아스파르테이트 (NMDA) 및 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이족사졸프로피온산 (AMPA) 시냅스성 글루타메이트 수용체와 같은 칼슘 민감성 수용체가 파열되며; (iii) 이온의 비정상적인 축적의 결과로써 세포가 물로 팽윤되고; (iv) 세포내 pH가 감소된다. 세포 내에서의 대사 변화로 인해, 에너지 공급원이 고갈됨에 따라 세포 내에 이온이 축적된다. 예를 들면, 젖산을 형성하는 혐기성 당분해가 미토콘드리아에서 정상적인 호기성 당분해 경로를 대체한다. 이로써, 칼슘 이온을 세포에 추가로 축적시키게 되는 산성증이 생긴다.
허혈증 (발작 포함)이 빈번히 발생함에도 불구하고 또한 환자에 대한 심각한 결과를 초래함에도 불구하고, 이들 질환에 대한 치료법은 알 수 없는 것이었다. 명암선 내의 변성 세포를 보호하기 위해 취해진 두가지 기본적 접근법이 있다. 현재까지 가장 효과적인 첫번째 접근법은 세포로의 혈액 흐름을 제한하는 혈관성 봉쇄를 신속히 제거시키는 응혈 용해인자를 확인하는 것이다. 재조합 조직 플라스미노겐 활성화인자 (TPA)가 혈전성 발작에서 허혈을 유발시키는 응혈을 용해시키는데 사용하도록 연방 의약품국에 의해 승인되었다. 그럼에도 불구하고, TPA의 사용에는 부작용이 따른다. 예를 들면, TPA 처리하여 응혈을 붕괴시킨 결과, 허혈로 인해 야기된 혈관 손상으로부터 비롯된 뇌출혈이 일어난다. 산소가 고갈된 변성 세포를 치료하기 위한 두번째 기본적 접근법은 연관된 에너지 부족으로부터 누적되는 손상으로부터 세포를 보호하는 것이다. 이를 위하여, 글루타메이트 길항제와 칼슘 채널 길항제가 가장 철저하게 연구되었다. 이들 중 어떠한 것도 실질적인 효능이 있는 것으로 입증된 바 없지만, 이들은 여전히 초기 임상 개발 단계에 있다. 병소 뇌 허혈증의 병리생리학 및 치료법이 다음 문헌에 고찰되어 있다 [참조: B.K. Seisjo, J.Neurosurgery, 1992, vol.77, p.169-184 and 337-354].
상기 문헌 (Seisjo, 1992)에 기재된 약물 개발의 표적에 덧붙여, 역학적 연구는 에스트로겐 및 프로게스테론으로 호르몬 대체 요법을 받은 여성이 심장 질환의 발병률과 중증도 면에서 감소를 나타냄을 밝혀냈다. 이러한 상관관계는 혼합된 결과를 나타내는 발작에 대해 추가로 조사되었다. 문헌 [참조: Stampfer et al., New England Journal of Medicine, 1991, vol 325, p.756]에 보고된 48,000명 여성을 대상으로 한 10년 간의 역학적 연구 결과, 에스트로겐 사용과 관상 심장 질환의 발병률 감소 간에는 상관관계가 있는 것으로 결론지었지만, 발작 발병률 감소는 전혀 관찰되지 않았다. 이와는 반대로, 에스트로겐이 아테롬성동맥경화증과 심근 경색의 위험을 감소시키는지에 관한 의문에 주의를 집중한 100편의 문헌을 고찰한 렌(Wren)에 의한 보고서 [The Medical Journal of Australia, 1992, vol. 157, p.204]는, 호르몬 대체 요법시의 에스트로겐이 심근 경색과 발작의 발병률을 상당히 저하시키고 이를 혈관벽 부위에서 수행할 수 있다고 결론지었다. 이러한 결론은 문헌 [참조: Falkeborn et al., Arch Intern. Med., 1993, vol. 153, p.1201]에 의해 추가로 뒷받침되었다. 에스트로겐 대체 요법과 발작 발병률 감소 간의 상기 상관관계는 단지 역학적 데이타에만 의존하고 있다. 이러한 결론들을 해석하거나 지지해주는 어떠한 생화학적 데이타도 분석되지 않았을 뿐만 아니라, 호르몬 사용으로 인한 허혈성 병변 또는 질병률 저하에 관한 어떠한 정보도 없다. 더욱이, 이들 연구는 장기간 호르몬 대체 치료를 받은 환자로만 국한되었다. 처음으로 발작이 일어나기 전, 일어나는 동안 또는 일어난 후에 치료학적으로 에스트로겐을 투여한 환자에 대해서는 어떠한 연구도 수행되지 않았다. 더욱이, 이러한 연구는 에스트로겐 대체 요법에 이용된 에스트로겐으로만 제한되었다. 남성이나 여성을 치료하는데 사용될 수도 있는, 성별과 무관한 에스트로겐에 대한 연구는 전혀 수행되지 않았다.
스테로이드의 신경보호 효과에 관한 연구가 수행되었는데, 여기서는 예를 들어, 글루코코르티코스테로이드가 척수 손상을 감소시키는데 긍정적인 효과를 나타내지만 해마 신경변성에 대해서는 부정적인 효과를 나타내는 것으로 결론지어졌다. 예를 들어, 문헌 [참조: Hall, J. Neurosurg vol. 76, 13-22 (1992)]에는, 산소 자유 라디칼-유도된 지질 과산화의 억제와 연관있는 것으로 여겨지는 글루코코르티코이드 스테로이드인 메틸프레드니솔론을, 척수 손상을 입은지 8시간 이내 부터 시작하여 24시간 집중적인 정맥내 섭생으로 투여한 경우에 이러한 척수 손상을 입은 환자의 6개월간의 회복율을 증진시킬 수 있다고 언급되어 있다. 그러나, 상기 스테로이드를 대상으로 하여, 해마 신경단위의 신경단위 괴사의 선택적인 보호에 대해 연구한 결과, 해마 신경단위 손상이 글루코코르티코이드 스테로이드 투여로 인해 상당히 악화된 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 호르몬이 급성 뇌 허혈을 치료하는데 부적합하다는 것을 제시해준다. 홀 (Hall)은 21'-히드록실 작용기 대신 비-글루코코르티코이드 스테로이드 상의 복합 아민으로 치환하면, 지질 항산화 활성이 증진된다고 보고하였다. 허혈성 사건을 치료하거나 뇌의 신경단위를 신경보호하는데 있어서의 상기 분자의 행위에 관한 어떠한 데이타도 제공되지 않았다. 부가적으로, 치환된 21'-히드록실 작용기를 갖는 또 다른 비-글루코코르티코이드 스테로이드인 라자로이드 (lazaroid)에 대한 자유 라디칼 소거 활성이 보고되었지만, 이러한 화합물이 발작이나 다른 형태의 허혈증을 치료하는데 상당히 효능이 있다는 것을 입증해주는 자료는 없다.
요약
본 발명은 상기 필요성을 충족시켜 준다. 에스트로겐 화합물을 사용하여 허혈성 손상을 예방 및 치료하는 신규한 방법이 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태는, 에스트로겐 화합물을 용매, 안정화제 또는 방부제와 같은 부가의 부형제의 존재하 또는 부재하에 오일에 용해시킨 약물 전달 시스템 중의 에스트로겐 화합물을, 세포 집단에 보호를 부여하도록 피하 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 사건이 일어난 피검자에서의 허혈성 병소와 연관된 세포 집단에 보호를 부여하는 방법을 제공한다. 추가의 양태는 허혈성 사건 이전에 유효량의 에스트로겐 화합물을 투여하기에 가장 가까운 시간을 선택하는 것을 포함한다. 또 다른 한편, 에스트로겐 화합물을 허혈성 사건 후 효과적으로 가장 가까운 시간 내에 투여할 수 있다. 본 발명의 방법은 뇌혈관성 질환, 지망막하 출혈, 심근 경색, 수술 및 외상 중의 어떠한 질환에도 적용할 수 있다. 특히, 허혈성 사건이 발작인 경우, 보호된 세포는 신경단위와 내피 세포 중의 하나 이상을 포함한다.
당해 방법은 에스트로겐 화합물의 알파 이성체 또는 베타 이성체를 포함할 수 있는 에스트로겐 화합물을 이용한다. 상이한 이성체의 예가 제공되는데, 여기서 에스트로겐 화합물은 17α-에스트라디올 및 17β-에스트라디올로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 허혈성 사건 동안 또는 후 피검자의 세포가 변성되지 못하도록 보호해주는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 감수성 피검자를 확인하는 단계, 허혈성 사건 이전 또는 후에 유효량의 에스트로겐 화합물을 제공하는 단계, 및 에스트로겐 화합물의 부재하에서는 발생될 수도 있는 변성으로부터 세포를 보호하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서는, 유효량의 에스트로겐 화합물을 약제학적 제형 내에 제공하는 단계, 및 발작의 불리한 효과를 감소시키도록 상기 제형을 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피검자에게서 발작을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에 있어서의 본 발명은 (a) 오일 비히클 중에 제형화된 에스트로겐 화합물을 제공하는 단계; 및 (b) 세포 집단에 보호를 부여하도록, 허혈성 사건에 효과적으로 가장 가까운 시간 내에 1회분 이상의 용량을 포함하는 코스에 걸쳐 상기 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 사건이 일어난 피검자에서의 허혈증과 연관된 세포 집단에 대한 보호를 부여하는 방법을 제공한다. 추가로, 상기 양태 (b)에서는, 에스트로겐 화합물을 피하 주사하여 투여한다.
또 다른 양태에서는, 본 발명이 [3R-(3α,3aα,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-1,2,3,3a,4,5,8,9,9a,9b-데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온의 이중 결합을 환원시켜 트리시클릭 화합물 [3R-(3α,3aα,5aβ,6β,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-도데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온을 수득하는 단계; 이러한 트리시클릭 화합물 [3R-(3α,3aα,5aβ,6β,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-도데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온을 폐환시켜ent-19-노르테스토스테론을 수득하는 단계;ent-19-노르테스토스테론의 히드록시 기를 에스테르화시켜ent-19-노르테스토스테론, 17-아세테이트를 수득하는 단계;ent-19-노르테스토스테론, 17-아세테이트의 스테로이드 A 환을 방향족화하여ent-17β-에스트라디올, 17-아세테이트를 수득하는 단계; 및ent-17β-에스트라디올, 17-아세테이트를 비누화하여 17-아세테이트 기를 제거하여ent-17β-에스트라디올을 수득하는 단계를 포함하는, [3R-(3α,3aα,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-1,2,3,3a,4,5,8,9,9a,9b-데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온으로부터ent-17β-에스트라디올을 합성하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 따르면, [3R-(3α,3aα,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-1,2,3,3a,4,5,8,9,9a,9b-데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온의 이중 결합을 환원시키는 것은 액체 암모니아 중의 리튬을 사용하는 단계 및 촉매적 수소화 반응을 이용하는 단계로 이루어진 군에서 선택된 단계에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 양태는 화합물 [3R-(3α,3aα,5aβ,6β,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-도데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태는 화합물ent-17β-에스트라디올, 17-아세테이트를 제공한다. 또한, 본 발명의 추가의 양태는 화합물ent-19-노르테스토스테론, 17-아세테이트이다.
본 발명은 발작 (stroke)이나 허혈성 사건으로 인해 사멸하게 되는 세포를 보호하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 양태, 국면 및 이점들은 다음의 기재 내용, 첨부된 청구의 범위 및 도면을 참조로 하여 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 중뇌 동맥 교합 (MCAO)에 의해 유도된 허혈이 나타나기 24시간 전에 개시한, 난소척제된 쥐를 17β-에스트라디올로 예비처리한 효과를 도시한 막대 그래프인데, 여기서 17β-에스트라디올을 피하 5 ㎜ 실라스틱 (Silastic) (등록상표) 이식체 (E2)로서 투여하거나 상기 에스트라디올-화학적 전달 시스템 (E2-CDS)을 통하여 투여하고 (1 ㎎/체중 ㎏) 대조군이 제공된다 (모의 펠릿). 값은 3개의 뇌 박편에서의 허혈 면적 (%)에 대한 평균치±평균치의 표준 오차 (±SEM)로서 제공된다. 별표는 관찰된 p 값이 모의 그룹에 대해 0.05 미만 (*=p<0.05), 즉 실험 그룹에 대한 데이타와 모의 그룹에 대한 데이타 간의 차가 통계적으로 유의적이라는 것을 지시해준다. 샘플 수는 모의=6, 17β-에스트라디올=8 및 ES-CDS 그룹=10이다.
도 2는 MCAO에 의해 유도된 허혈이 나타나기 2시간 전에, 난소척제된 (OVX) 쥐를 17β-에스트라디올로 처리한 효과를 도시한 막대 그래프인데, 여기서 17β-에스트라디올 (10 ㎍/㎏)을 오일 비히클 중에서 피하 주사한다. MCAO한지 24시간 후에 쥐를 참수한다. MCAO한지 24시간 후에 쥐 뇌를 부위 A-E로서 관상 절개한다. 값은 평균치±SEM으로서 제공되고, OVX + E2 그룹에 대한 n은 8이고 OVX 그룹 (대조군)에 대한 n은 6이다. *=상응하는 비히클 대조군 그룹에 대한 p<0.05.
도 3은 MCAO에 의해 유도된 허혈이 나타나기 24시간 전에 개시한, 난소척제된 쥐를 17α-에스트라디올로 예비처리한 효과를 도시한 막대 그래프인데, 여기서 17α-에스트라디올을 5 ㎜ 실라스틱 (등록상표) 튜브로 투여하고, 음성 대조군은 에스트로겐을 함유하지 않는 5 ㎜ 실라스틱 (등록상표) 튜브 (모의)이다. MCAO한지 24시간 후에 쥐를 참수한다. 값은 5개의 뇌 박편에서의 허혈 면적 (%)에 대한 평균치±SEM으로서 제공된다. A 내지 E는 후신경구의 미부까지의 거리를 지칭하는데, A=5 ㎜, B=7 ㎜, C=9 ㎜, D=11 ㎜, 및 E=13 ㎜이다. *=등가의 뇌 박편에 대한 모의 그룹에 대한 p<0.05; 모의 그룹에 대해서는 n이 10이고, 17α-에스트라디올 그룹에 대해서는 n이 13이다.
도 4는 MCAO를 개시한지 40분 후 (a) 및 90분 후 (b) 17β-에스트라디올 또는 히드록시프로필 시클로덱스트린 (HPCD) 대조군으로 난소척제된 쥐를 후처리한효과를 도시한 막대 그래프이다. 상기 17β-에스트라디올을 에스트라디올 화학적 전달 시스템 (E2-CDS)에 1 ㎎/체중 ㎏의 농도로 제형화하여 이를 정맥내 주사한다. MCAO한지 24시간 후에 쥐를 참수한다. 값은 5개의 뇌 박편에서의 허혈 면적 (%)에 대한 평균치±SEM으로서 제공된다. A 내지 E는 후신경구의 미부까지의 거리를 지칭하는데, A=5 ㎜, B=7 ㎜, C=9 ㎜, D=11 ㎜ 및 E=13 ㎜이다. *=동일한 뇌 박편에 대한 HPCD 그룹에 대한 p<0.05; 비히클에 대해서는 N이 9이고, E2-CDS 그룹에 대해서는 N이 13이다.
도 5는 24시간 저혈당증에 이은 뇌 모세혈관 내피 세포 (BCEC) 사망률에 대한 17β-에스트라디올 (2 nM)의 효과를 도시한 막대 그래프이다. 대조군은 에탄올 비히클 만으로 이루어진다. 적절한 양의 D-(+)-글루코오스를 글루코오스-무함유 배지에 가함으로써 세포 배지 중의 글루코오스 농도를 20 ㎎%에서 200 ㎎%로 조정한다. BCEC를 24시간 동안 (a) 및 48시간 동안 (b) 인큐베이션시킨다. 트립판 블루 염색을 사용하여 살아있는 세포를 사멸된 세포와 구별한다. 두가지 상이한 혈구계산반 정방형에서 두가지 세포 계수치를 평균낸다. 평균치±SEM를 도시한다 (n=8-12). *=상응하는 비히클 대조군에 대한 p<0.05.
도 6은 산소결핍증에 이은 BCEC 사망률에 대한 17β-에스트라디올 (2 nM)의 효과를 도시한 막대 그래프이다. 대조군은 에스트로겐을 함유하지 않은 에탄올 비히클로 이루어진다. 세포 배지는 200 ㎎% 글루코오스를 함유한다. BCEC를 함유하는 배양 디쉬를 질소 충전된 챔버 내에 4시간 동안 놓아둔다. 트립판 블루 염색을 사용하여 살아있는 세포와 사멸된 세포를 구별한다. 두가지 상이한 혈구계산반 정방형에서 두가지 세포 계수치를 평균낸다. 평균치±SEM를 도시한다 (n=8-12). *=상응하는 비히클 대조군에 대한 p<0.05.
도 7은 산소결핍증과 저혈당증을 조합하여 치료한 후 대조군 (에탄올 비히클)과 비교한 BCEC 사망률에 대한 17β-에스트라디올 (2 nM)의 효과를 도시한 막대 그래프이다. 세포 배지는 200 ㎎% 또는 100 ㎎% 글루코오스를 함유한다. BCEC를 함유하는 배양 디쉬를 인큐베이터 또는 질소 충전된 챔버 내에 2시간 동안 놓아둔다. 트립판 블루 염색을 사용하여 살아있는 세포와 사멸된 세포를 구별한다. 두가지 상이한 혈구계산반 정방형에서 두가지 세포 계수치를 평균낸다. 평균치±SEM를 도시한다 (n=8-12). *=상응하는 비히클 대조군에 대한 p<0.05.
도 8은 MCAO에 의해 유도된 허혈이 나타난지 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간 또는 4시간 후 17β-에스트라디올로 난소척제된 (OVX) 쥐를 후-처리한 효과를 도시한 막대 그래프이다. 에스트로겐 화합물은 지시된 후-교합 시간에 HPCD-복합 17β-에스트라디올과 실라스틱 (등록상표) 펠릿의 정맥내 제제 (100 ㎍/㎎) 조합물로서 투여한다. 난소척제되었지만 처리되지 않은 동물 (OVX)과 난소척제되지 않고 처리되지도 않은 동물 (INT)을 대조군으로서 사용한다 (각각 n=12 및 n=6). MCAO한지 48시간 후, 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 (TTC) 염색을 사용하여 허혈성 병변 용적을 결정한다.
도 9는 세포좌표 상에 오일 중의 단일 피하 거환 주사제로 에스트로겐 화합물을 투여하는 약물 역학에 대한 효과를 가로좌표 상의 시간의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 10은 천연의 17β-에스트라디올 (βE2)과 천연이 아닌ent-17β-에스트라디올 (ent-E2)의 구조이다.
도 11은 HT-22 세포에서 글루타메이트 독성에 대한 17β-에스트라디올 (βE2)과ent-E2의 효과를 도시한 것이다. 지시된 스테로이드 농도는 글루타메이트 (5 mM)를 가하기 2시간 전에 가하고, 칼세인 AM 형광성을 이용하여 24시간 후에 생존율을 평가한다. 각각의 독소-무함유 그룹에 대한 상대적인 형광 단위를 100% 생존율로서 표준을 맞추고, 각 실험당 4 내지 8웰을 이용한 2가지 실험의 평균에 대한 평균치±SEM을 나타낸다. *=독소 단독 그룹에 대한 p<0.05 및 **=독소 단독 그룹에 대한 p<0.01. 칼세인 AM 및 프로피듐 요오다이드로 염색된 대표적 필드가 도시되어 있다.
도 12는 HT-22 세포에서 H2O2독성에 대한 17β-에스트라디올 (βE2)과ent-E2의 효과를 도시한 것이다. 지시된 농도의 H2O2를 가하기 2시간 전에 스테로이드 10 nM을 HT-22 세포에 가한다. 칼세인 AM 형광성을 이용하여 24시간 후에 생존율을 평가한다. 각각의 독소-무함유 그룹에 대한 상대적인 형광 단위를 0% 생존율 저하로서 표준을 맞추고, 각 실험당 4개 웰을 이용한 2가지 실험의 평균에 대한 평균치±SEM을 나타낸다. *=독소 단독 그룹에 대한 p<0.05.
도 13은 SK-N-SH 세포에서 H2O2독성에 대한ent-E2의 효과를 도시한 것이다. 3μM H2O2를 가하기 24시간 전에 지시된 농도의ent-E2를 가한다. 칼세인 AM 형광성을 이용하여 24시간 후에 생존율을 평가한다. 각각의 독소-무함유 그룹에대한 상대적인 형광 단위를 100% 생존율로서 표준을 맞추고, 각 실험당 3 내지 4개 웰을 이용한 2가지 실험의 평균에 대한 평균치±SEM을 나타낸다. *=독소 단독 그룹에 대한 p<0.05 및 **=독소 단독 그룹에 대한 p<0.001.
도 14는 난소척제된 암컷 쥐에서 MCA 교합-유도된 병변 용적에 대한 17β-에스트라디올 (βE2)과ent-E2의 효과를 도시한 것이다. 교합되기 2주 전에 쥐를 난소척제시키고, 병소 허혈이 시작되기 2시간 전에 스테로이드를 피하 주사로 투여한다. 1시간 MCA 교합 및 23시간 재관류 후, 뇌를 꺼내고 후신경구의 3, 5, 7, 9 및 11 후부에서 2 ㎜ 박편을 만든다. 병변 용적을 TCC 염색으로 결정한다. 그룹당 6마리 쥐에 대한 평균치±SEM가 그래프로 제시되어 있다. *=비히클 처리된 쥐에 대한 p<0.05. 각 처리 그룹에 대한 대표적인 박편이 도시되어 있다.
도 15는 17β-에스트라디올 (βE2)과ent-E2 투여 후의 혈장 17β-에스트라디올 (βE2) 수준을 도시한 것이다. 난소척제된 암컷 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 쥐에게 100 ㎍/㎏ 17β-에스트라디올 (βE2) 또는ent-E2로 피하 주사한다. 주사하기 5분 전, 주사한지 2시간 후, 주사한지 4시간 후 또는 주사한지 24시간 후에 심장 천자로 혈액을 빨아들인다. 혈장을 수집하고 17β-에스트라디올 (βE2) 농도를 RIA로 결정한다. 그룹당 3마리 쥐에 대한 평균치±SEM이 도시되어 있다.
도 16은 미숙한 쥐에서 자궁 중량에 대한 17β-에스트라디올 (βE2)과ent-E2의 효과를 도시한 것이다. 25일생 암컷 쥐에게 지시된 용량의 17β-에스트라디올 (βE2) 또는ent-E2를 피하 주사하거나, 또는 지시된 용량의ent-E2를 3일 동안매일 1 ㎍/㎏ 17β-에스트라디올 (βE2)과 함께 투여한다. 4일째, 상기 자궁을 절제하고 칭량한다. 그룹당 3 내지 9마리 쥐에 대한 평균치±sem이 제시되어 있다. *=오일 주사에 대한 p<0.05.
도 17은 17β-에스트라디올 (βE2)과ent-E2가 쥐 뇌 균등질에서 FeSO4-유도된 지질 산화를 억제시키는 것을 도시하고 있다. 균등질은 난소척제된 암컷 스프라그-돌리 쥐의 신피질 조직으로부터 준비한다. 균등질을 지시된 농도의 스테로이드와 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 다음, 37℃에서 200μM FeSO4와 함께 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 산화시킨다. TBAR 형성에 의해 지질 산화 정도를 결정한다. FeSO4단독 그룹에 대한 데이타를 100% 산화율로서 표준을 맞추었다. 그룹당 3개 샘플에 대한 평균치±sem이 제시되어 있다. *=FeSO4단독 그룹에 대한 p<0.05.
안전하고, 발작 및 기타 형태의 허혈증에 걸리기 쉬운 남성과 여성에게 예방 적으로 투여할 수 있으며 허혈증이 일어난 후에도 이러한 허혈성 사건에 의해 개시되는 진행성 변성으로부터 세포를 보호하도록 추가로 사용될 수 있는, 발작 및 기타 형태의 허혈증에 대한 효과적인 치료법이 요망된다. 활성 약물이 혈류 내로 매우 신속하게 유입되어 수 분 이내에 피크 수준에 도달한 후, 상당 시간 동안 (예를 들어, 수 시간) 보다 낮은 치료학적 약물 투여량 수준을 유지시키는, 발작 또는 기타 형태의 허혈성 사건 (예: 심근 경색)의 희생자를 치료하기 위한 치료학적 전략이 추가로 요망된다.
본 발명은 허혈성 사건에 의해 개시되는 진행성 변성으로부터 세포를 보호하도록 남성과 여성에게 안전하게 투여될 수 있는, 발작 및 기타 형태의 허혈증에 대한 효과적인 치료법을 제공한다.
에스트로겐 화합물은 본 명세서 및 청구의 범위에서, 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌 [the 11th edition of "Steroids" from Steraloid Inc., Wilton, N.H.]에 기재된 어떠한 구조로서도 정의된다. 이러한 정의에는 상기 참조문헌에 기재된 비-스테로이드계 에스트로겐이 포함된다. 이러한 정의에 포함되는 기타 에스트로겐은 에스트로겐 유도체, 에스트로겐 대사물, 에스트로겐 전구체 및 이들의 변형물 뿐만 아니라 세포 연관된 에스트로겐 수용체를 결합시킬 수 있는 분자, 및 결합의 결과로 인해 특징적인 에스트로겐 효과가 촉발되는 기타 분자이다. 본원에 기재된 화합물의 모든 부분입체이성체 또는 에난티오머는 본원에서 상기 정의에 포함된다. 또한, 하나 이상의 에스트로겐의 혼합물도 포함된다. 용어 "에스트라디올" 또는 "에스트로겐"은 에스트로겐 화합물의 의미에 포함된다.
β-에스트로겐과 α-에스트로겐은 에스트로겐의 이성체이다.
용어 "E2"는 β-에스트라디올, 17β-에스트라디올, E2, 및 β-E2와 동의어이다.
본 명세서 및 청구의 범위에 정의된 "동물 피검자"는 사람을 포함한 고등 유기체이다.
용어 "비-성별 호르몬"은 본 명세서 및 청구의 범위에서, 피검자에 대한 성별-관련 효과가 감소되거나, 최소이거나 또는 전혀 없는 에스트로겐 화합물로서 정의된다.
에스트로겐 화합물은 허혈성 병변의 명암선에서 세포가 변성되는 것으로부터 보호해주는 것으로 나타났다 (실시예 1 및 2). 에스트로겐 화합물은 신경단위 세포 및 내피 세포를 포함한 다수의 세포 유형을 보호해주는 것으로 추가로 밝혀졌다 (실시예 1 내지 3). 본 발명에 따르면, 에스트로겐 화합물을 사용하여 산소 결핍 및 글루코오스 결핍 효과로부터 세포를 보호하여 결과적으로 허혈증과 연관된 에너지 결핍으로부터 세포를 보호할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서는, 남성 및 여성 피검자에게 적합한 치료 방법이 제공되고, 이는 발작이 발생하기 전 또는 후에 유효량의 에스트로겐을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 따르는 특정 상황에서는, 예정된 허혈성 사건 이전에 에스트로겐을 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 상황은, 예를 들어, 피검자가 발작을 일으킨 적이 있는 경우에 발생된다. 이러한 경우, 상기 피검자는 두번째 발작을 일으킬 가능성이 증가할 것이다. 일시적인 허혈성 발작을 일으키기 쉬운 피검자 또한 발작 위험성이 증가한다. 지망막하 출혈로 고생하는 피검자는 혈관을 수축시키는 혈관경련에 의해 유도된 추가의 허혈성 사건을 경험할 수 있다. 뇌와 같은 기관에 손상을 입은 피검자는 또한 허혈성 사건에 걸리기 쉽다. 상기 상황들은 피검자를 에스트로겐 화합물로 예비처리한 경우에 유익할 수 있는 상황을 예시한 것이다. 이러한 예비처리는 사건이 일어나기 24시간 전 (실시예 1)과 같은 단기간으로 투여하거나, 또는 장기간으로 투여하는 경우 (여기서, 투여는 발작과 같은 사건 직후에 시작하여 장시간 동안 예방적 차원에서 지속된다)에 추가의 허혈성 사건의 불리한 효과를 저하시키는데 유익할 수 있다. 예방적 차원에서의 투여 시간의 예는 개개인의 특정한 감수성 프로필에 따라서 수 일에서부터 수 개월로 연장될 수 있다. 이들 상황하에서는, 에스트로겐 1회분 이상의 용량의 코스가, 유효 용량이 피검자에게서 유지되도록 하는 시간에 걸쳐 투여될 수 있다. 단기간 치료의 경우에는, 다음에 명시된 투여 경로 중의 어느 한 경로에 의해 1회 용량을 전달하기 위한 대안으로서 비경구 투여를 이용할 수 있다. 예방적 차원에서 에스트로겐 화합물의 최적의 용량은 에스트로겐 화합물 10 내지 500 pg/㎖의 혈장 농도를 제공해야 하지만, 이 보다 많은 용량도 또한 허용된다. 이들 상황하에서는, α-에스트로겐 이성체와 같은 비-성별 에스트로겐 화합물을 사용하는 것이 남성과 여성에게서 특히 유용한데, 이는 상기 호르몬의 성별-관련 기능이 회피되기 때문이다.
본 발명의 양태에 따르면, 에스트로겐 화합물은 뇌혈관성 질환, 지망막하 출혈 또는 외상과 같은 허혈성 사건의 불리한 효과를 저하시키는데 효과적이다. 따라서, 상기 화합물은 허혈성 사건이 일어난 후 가능한 한 신속히, 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 5시간 이내에 투여된다. 허혈성 사건이 일어난 후 적어도 수 시간 내지 수 일 동안 에스트로겐 화합물의 증가된 농도가 혈장 내에 유지되는 것이 바람직하다. 혈장 내의 에스트로겐 화합물의 증가된 농도는 에스트로겐 화합물 10 내지 12,000 pg/㎖의 범위이어야 한다.
본 발명은 에스트로겐으로 예비처리하거나 에스트로겐 화합물로 초기에 후처리하는 것이 허혈성 사건 후의 괴사 면적 크기를 상당히 감소시킬 수 있다는 사실을 처음으로 입증하고 있다. 이러한 에스트로겐 화합물로의 예비처리 효과는 에스트로겐 화합물의 이성체 형태와 이의 투여 경로와는 무관하다. 에스트로겐의 α-이성체가 허혈증 효과로부터 세포를 보호하는데 있어서 에스트로겐의 β-이성체 만큼 유효한 것으로 밝혀졌다. 실시예 1, 및 도 1, 2 및 3에 예시된 바와 같은 방법은 에스트로겐 화합물의 보호 활성이 이러한 호르몬의 성별-관련 활성에 의존적이지 않다는 것을 확인시켜 준다 (에스트로겐성). 에스트로겐 화합물의 α-이성체는 비-성별 호르몬이지만, 이들 화합물은 뇌를 허혈성 손상으로부터 보호하는데 있어서 β-이성체 만큼 유효하다. 실시예 1은 17β-에스트라디올로 처리된 경우 관찰된 난소척제된 쥐의 사망률 감소는 투여 경로에 의존적이지 않다는 것을 추가로 입증해주는데, 이는 동일한 에스트로겐 화합물이 피하 이식체로서 또는 정맥내 주사액으로서 투여되는 경우에는 보호 효과가 유사하기 때문이다. 투여 경로 또는 제형에 상관없이, 에스트로겐 화합물은 허혈성 사건에 살아남는 동물의 능력에 대한 현저한 효과를 지니고 있다.
에스트로겐이 허혈성 영역에서 세포를 보호하는데 효능이 있다는 증거는 중뇌 동맥 (MCA)을 실험적으로 교합시킨 쥐 모델, 즉 중뇌 동맥 교합 (MCAO) 모델을 사용하여 다음 실시예에서 입증되었다. 이러한 동물 모델은 사람 피검자에게서 발생할 수 있는 것과 같은 생체내 허혈성 사건을 모사하는 것으로 당해 분야에 널리 공지되어 있다. MCA의 실험적 교합으로 인해, 기초 신경절 및 전두, 벽 및 측두 피질 영역을 전형적으로 포함하는 커다란 일측성 허혈 영역이 생겨난다 [참조:Menzies et al., Neurosurgery 31, 100-106 (1992)]. MCA에 의해 관류된 부위에서 보다 작은 중심으로부터 허혈성 병변이 시작되어 시간이 지남에 따라 성장한다. 이러한 중심 경색 주변의 명암선 영역은 상기 중심으로부터의 병변이, 교합 동안 부수적인 순환에 의해 관류된 채로 있는 조직을 향해 밖으로 전파된 것으로부터 비롯되는 것으로 여겨진다. 허혈성 사건 중심을 둘러싸고 있는 명암선에 대한 치료제의 효과는 상기 동물로부터 뇌 박편을 수득한 경우에 검사할 수 있다. MCA는 혈액을 전두, 벽 및 측두엽의 피질 표면 뿐만 아니라 기초 신경절 및 내부 캡슐에 공급한다. 가장 큰 허혈성 사건이 일어난 영역 주변의 뇌 박편을 취한다. 이들 영역은 실시예 2 및 3에서 영역 B, C 및 D로 동정되었다. 이들 영역은 영역 A 및 E와 같이 대체 혈류 공급원에 의해 용이하게 보상되지 못한다. 이는 MCA가 MCA-분포된 면을 공급해주는 부수적인 동맥 레이스가 의존하는 말단 동맥이어서, MCA-교합 유도된 허혈증이 보상될 수 없도록 만들기 때문이다. 한편, MCA와 영역 A에서의 전방 경동맥 (ACA) 간의 문합, 및 MCA와 영역 E에서의 후방 경동맥 (PCA) 간의 문합 (실시예 1 및 2)이 본 연구에서 관찰된 바와 같이 MCA 교합 유도된 허혈증을 보상해줄 수 있다.
허혈성 사건이 일어난 후 병변의 증식에 대한 에스트로겐의 효과를 연구하기 위하여, 쥐를 난소척제시키고, 2주 후에, MCAO 이전 또는 이후에 각종 에스트로겐 제제에 노출시킨다 (실시예 1 및 2). 처리되지 않은 난소척제된 쥐의 사망률은 65%이다. E2-CDS 또는 17β-에스트라디올 자체로의 예비처리는 사망률을 각각 16% 및 22%로 감소시켰다. 이러한 현저한 사망률 감소는 뇌의 허혈성 영역이, 처리되지 않은 난소척제된 쥐에서의 25.6±5.7%에서 E2-CDS 또는 17β-에스트라디올 처리된 쥐에서의 9.1±4.2% 및 9.8±4.0%로 각각 감소됨으로써 비롯된 것이다. 유사하게, 17α-에스트라디올로 예시되는 비-성별 호르몬으로의 예비처리로 인해, 허혈성 면이 55 내지 81% 감소되었다 (실시예 1). MCAO한지 40 또는 90분 후에 투여한 경우, 17β-에스트라디올은 허혈성 영역을 각각 45 내지 90% 또는 31% 감소시켰다 (실시예 2). 비-성별 호르몬은 또한, 허혈증의 유도 후에 투여된 경우에도 높은 보호 활성을 나타낸다. 이들 결과는 허혈성 사건이 일어난 후 뇌에서의 에스트로겐 화합물의 신경보호 효과를 입증해준다.
에너지 대사에 이용될 수 있는 산소와 글루코오스의 감소가 허혈성 사건의 한 특징이다. 이는 일단 교합이 반전되는 영양분을 공급하도록 요구할 수 있는 혈관에 대해 부정적인 영향을 미친다. 이러한 허혈증 후의 혈관에 대한 부정적인 효과는 상기 허혈성 사건과 연관된 장기간 동안의 손상을 추가로 증가시킨다. 이러한 효과는 실시예 3에 기재된 바와 같이 시험관내에서 재생시킬 수 있다. 이들 상황하에서, 에스트로겐 화합물이 허혈성 사건 동안의 저혈당증 및 산소결핍증시 일어날 수도 있는 세포 사멸로부터 뇌 모세혈관 내피 세포를 보호할 수 있다는 것이 본 발명에서 밝혀졌다 (도 5 내지 7). 이러한 보호 결과, 혈관 공급체 원형과 혈액 뇌 장벽이 에스트로겐 화합물에 의해 보존되어, 허혈성 사건 후 뇌의 재관류에 이어, 혈액 흐름과 수송 기능이 다시 한번 일어날 수 있다.
에스트로겐 화합물은 오일 비히클 중에서 효과적으로 피하 전달되는 것으로 본 발명에서 밝혀졌다 (실시예 5 및 도 9). 이러한 전달 방식은 30분 이내에 에스트로겐 화합물의 혈액 수준을 4,610 pg/㎖로 달성하는데 성공적이다. 2,004 pg/㎖의 동물 혈액 수준이 4시간 시점에서 이루어졌기 때문에, 지속적인 전달도 또한 달성되었다 (도 9).
ent-17β-에스트라디올의 합성이 실시예 6의 방법 및 표 3에 제시된다. 도 10 및 실시예 7은ent-17β-에스트라디올이ent-17β-에스트라디올 만큼 효과적인 치료제라는 것을 보여준다.
실시예 1.허혈성 사건 이전에 투여된 에스트로겐 화합물의 효과 측정
허혈성 손상으로부터 보호하는데 있어서의 에스트로겐 화합물의 효과를 시험하기 위한 실험상 모델로서 쥐를 사용한다. 에스트로겐의 천연 공급원을 제거하기 위하여, 허혈증 유도 이전에 난소척제술을 수행한다.
난소척제술에 이어서, 다음과 같이 MCA 교합하기 24시간 전에 실라스틱 (등록상표) 튜브로 피하 전달시키거나 정맥내 전달함으로써 쥐를 에스트로겐 화합물로 처리한다:
피하 지속 전달: 17β- 또는 17α-에스트라디올을 문헌 [참조: Mohammed et al., 1985 Ann. Neurol 18, 705-711]의 방법에 따라서 5 ㎜ 길이의 실라스틱 (등록상표) 튜브 (Dow-Corning, Midland, MI) 내에 채운다. 모의 (비어 있음) 튜브를 에스트로겐 음성 대조군으로서 유사하게 준비한다. MCAO하기 24시간 전에 난소척제된 쥐에게 상기 펠릿을 피하 (sc) 이식한다. 에스트로겐을 함유하는 5 ㎜의 실라스틱 튜빙은 약 100 내지 200 pg/㎖의 혈장 수준을 생성시킨다.
정맥내 (iv) 전달: 문헌 [참조: Brewster et al., Reviews in The Neurosciences 2, 241-285 (1990) and Estes et al., Life Sciences 40:1327-1334 (1987)]에 기재된 바와 같이 에스트로겐-화학적 전달 시스템 (E2-CDS)을 사용하여 정맥내 전달하기 위한 17β-에스트라디올을 준비한다. E2-CDS를 히드록시프로필- -시클로덱스트린 (HPCD) [참조: Brewster et al., J. Parenteral Science and Technology 43:231-240, (1989)]과 복합체 형성시킨다. 이와 같이 달성된 복합체 형성은 HPCD 1g당 E2-CDS 32 ㎎이다. 첫번째 연구에서는, MCAO하기 24시간 전에 E2-CDS의 단일 정맥내 주사액 (1 ㎎/체중 ㎏)을 투여한다. 대조군에게는 HPCD 만을 투여한다. 에스트로겐이 담체로부터 서서히 방출되도록 상기 화학적 전달 시스템을 제형화한다. 이러한 전달 시스템은 에스트로겐을 지속적인 방식으로 뇌에 효과적으로 전달하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 실시예 1 및 2에서 사용된 E2-CDS의 용량 (1 ㎎/㎏)은 투여한지 24시간 후 뇌 조직 1 g당 1000 pg을 제공하기에 충부하다.
난소척제술을 수행한지 7 내지 8일 후, 문헌 [참조: Longa et al., (1989) Stroke, vol.20, 84-91; and Nagasawa et al., (1989); Stroke, vol.20, 1037-1043]에 따른 방법의 변형 (본원에 기재된 바와 같은 특정 변형을 지님)을 이용하여, 중앙 경동맥을 교합시키는 방법을 상기 쥐에 적용한다.
케타민 (60 ㎎/㎏)과 크실라진 (10 ㎎/㎏)을 복강내 주사함으로써 동물을 마취시킨다. 직장 온도를 기록하고 전체 과정에 걸쳐 가열 램프를 사용하여 온도를 36.5와 37.0℃ 사이로 유지시킨다. 중선 경부 절개를 통하여 좌측 경동맥을 노출시킨다. 좌측 흉골설골, 흉유돌, 이복 (후복) 및 견갑설골 근육을 나누고 수축시킨다. 설골의 보다 큰 각 일부를 절단하여 원심성 외부 경동맥 (ECA)의 노출을 촉진시킨다. 모든 경동맥 (CCA), ECA 및 내부 경동맥 (ICA)를 인접 신경으로부터 멀리 절개한다. 원심성 ECA 및 이의 분지물인 CCA, 및 익돌구개 동맥을 완전하게 응고시킨다. 미소혈관성 클립을 두골대 근처 ICA 상에 놓아둔다. 3-0 모노필라멘트 나일론 봉합의 2.5 cm 길이를 가열하여 혈관강의 용이한 이동과 차단을 위한 구를 생성시킨다. 이를 천자를 통하여 ECA 관강 내로 도입한다. 봉합물이 클립 고정된 위치에 도달할 때까지 이를 원위 ICA쪽으로 조심스럽게 나아가게 한다. 이이서, 미소혈관성 클립을 꺼내고 내성이 느껴질 때까지 봉합물을 삽입한다. CCA 분기와 내성 지점 간의 거리는 약 1.8 cm이다. 이러한 수술 과정은 출혈없이 10분 이내에 완료된다. 처방된 교합 시간 (40분) 후, 봉합물을 ICA로부터 꺼내고 원위 ICA를 즉시 소작시킨다.
예정된 희생 시간까지 살아남은 동물은 참수시켜 희생시킨다. 예정된 허혈 후 희생은 MCAO한지 6시간, 24시간 및 1주 후에 일어났다 (표 1). 6시간 샘플의 경우, 동물을 지속적으로 모니터한다. 24시간 샘플의 경우에는, 동물을 약 4시간 동안 관찰한 다음 우리에 돌려 보낸다. 유사하게, 허혈 1주 후에 희생되는 것으로 예정된 동물은 수술 후 처음 4시간 동안 모니터한 다음, 그 후 매일 기록한다.
참수된 머리로부터 뇌를 분리하고, 다음에 기재된 바와 같이 3 또는 5개 관상 조직 박편으로 나눈 다음, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 허혈성 면 정도를 결정한다. 염색된 박편의 사진을 찍은 다음, 연속적으로 허혈성 병변의 단면적을평가하기 위한 영상 1.47 소프트웨어 프로그램이 장착된 매킨토시 카드레 800 컴퓨터를 사용하여 영상화한다. 나중의 검색과 데이타 정리를 위하여, 이들 영상과 계산된 허혈성 손상 면적을 프로그램에 저장한다. 상이한 처리 그룹 간의 사망률 유의차는 치-스퀘어 (Chi-Square) 분석을 이용하여 결정한다.
상이한 투여 경로와 에스트로겐 화합물의 상이한 이성체 형태를 사용하여 수득된 결과가 다음에 제공된다.
허혈성 사건이 일어나기 24시간 전에, 에스트로겐 화합물을 실라스틱 (등록상표) 튜브를 사용하여 피하 투여하거나 조절식 정맥내 전달 투여하면, 뇌 병변 크기와 사망률이 감소되었다.
후신경구의 1, 5 및 7 ㎜ 후부에서 3가지 관상 박편을 만들었다. 예정된 허혈 후 희생 시간까지 대조군 (모의) 동물의 35%만이 생존하였다 (표 1). 이와는 반대로, MCAO하기 24시간 전에, 실라스틱 (등록상표) 튜브 중의 17β-에스트라디올로 처리되거나 E2-CDS 1 ㎎/㎏이 정맥내 주사 투여된 동물의 78% 및 84%가, 6시간, 1일 및 1주의 예정된 허혈 후 희생 시간까지 생존하였다. 희생시 모든 샘플에서 증가된 수준의 17β-에스트라디올이 검출되었다. 에스트로겐 화합물 예비처리 그룹에서의 사망률 감소는 MCAO한지 1일 및 1주 후에 가장 현저하게 나타났다 (표 1). 더욱이, 에스트로겐 화합물 처리된 쥐에서의 사망률 감소는 예정된 1일 또는 1주의 허혈-후 희생 시간까지 생존한 동물에서의 허혈성 면적 감소와 상관이 있다 (도 1). 대조군 (모의) 쥐는 평가된 뇌 절편 단면적의 25.6±5.7%를 차지하는 허혈성 병변을 지니고 있다 (도 1). 이와 대조적으로, 실라스틱 (등록상표) 튜브 중의 17β-에스트라디올, 또는 E2-CDS로 처리된 쥐는 평가된 뇌 면적의 9.8±4.0 및 9.1±4.2%만을 각각 점유하는 허혈성 병변을 지니고 있다. 그룹 간의 유의차는 분산 분석 (ANOVA)으로 결정하고 후hoc 비교를 위해 피셔 시험을 사용한다. 3개의 뇌 박편 만을 취했기 때문에, 곡선 아래의 면적 결정은 본 실시예에서 수행하지 않았다.
도 2에 도시된 결과는 허혈성 사건이 일어나기 2시간 전에 17β-에스트라디올 (10 ㎍/㎖)을 피하 주사 처리한 동물 중의 조직 박편 A 내지 D에서 에스트로겐 화합물의 상당한 보호 효과를 예시해준다.
쥐를 난소척제시키고, 난소척제시킨지 14일 후 및 상기 언급된 바와 같이 허혈성 사건이 일어나기 2시간 전에 피하 주사함으로써 투여된 단일 용량의 17β-에스트라디올 (10 ㎍/㎏)로 처리한다. 이러한 주사액이 교합시 250 pg/㎖의 혈장 농도를 달성하기에 충분한다. 24시간째에 상기 동물을 희생시키고 뇌를 추출한다. 에스트로겐 화합물 대체 요법을 받은 난소척제된 쥐는 영역 C 및 D에서 전체 관상 절편의 허혈성 병변 크기가 각각 46.3% 및 44.1% (p<0.05) 감소되었다 (도 2). 이들 영역은 후신경구의 9 및 11 ㎜ 미부에서 취한 절편에 상응한다.
도 3에 도시된 결과는 허혈성 사건이 일어나기 24시간 전에 개시된, 17α-에스트라디올의 지속적인 피하 전달을 이용하여 처리된 동물 중의 조직 박편 A 내지 E에서 17α-에스트라디올의 상당한 보호 효과를 예시하고 있다.
난소척제된 쥐를, MCAO하기 24시간 전에 17α-에스트라디올을 함유하는 5 ㎜ 실라스틱 (등록상표) 튜브로 처리한다. MCAO한지 24시간 후에, 상기 동물을 희생시키고, 뇌를 추출한다. 후신경구의 5, 7, 9, 11 및 13 ㎜ 후부에 5개의 2 ㎜ 두께 관상 절편을 만든다. 이어서, 상기 박편들을 37℃하 생리 식염수 중의 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 (TTC; Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO)의 2% 용액에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 모의 처리된 쥐는 예상된 허혈성 병변을 나타냈는데, 최대 허혈성 면적 (24.1±2.4%)이 박편 C (후신경구의 9 ㎜ 후부)에서 일어났고 더 작은 병변 면적은 보다 부리쪽의 미부 박편에서 일어났다 (도 3). 따라서, 모의 처리된 그룹과 스테로이드 처리된 그룹 간의 유의차를 결정하고, 각 실험에 대한 두 그룹으로부터의 데이타를 비교한다. 소정의 처리 동안 병변 곡선 아래의 면적을 결정하기 위하여, 사다리형 방법을 사용한다. 각 동물에 대해 계산된 면적을 그룹 별로 나누고 그룹들 간의 차이를 스튜던트 t 시험으로 결정한다.
17α-에스트라디올로 예비처리된 동물은 평가된 모든 박편에서 모의 처리된 동물과 비교해서 보다 작은 허혈성 면적을 나타내었다 (도 3, A-E). 구체적으로 언급하면, 박편 C, D 및 E (후신경구의 7, 9 및 11 ㎜ 후부에서 취한 절편) 허혈성 면적은 각각 55%, 66% 및 81% 감소되었다 (도 3). 모의 처리된 그룹 및 17α-에스트라디올 그룹에 대한 허혈성 병변 곡선 아래의 면적은 각각 8.1±0.8 및 3.7±1.3이다 (표 2).
실시예 2.허혈성 사건이 일어난 후에 투여된 에스트로겐 화합물의 효과 측정
교합이 일어난 후의 에스트로겐 처리가 유효한 정도를 시험하기 위하여, 난소척제된 쥐를, E2-CDS를 지속적으로 방출시키면서 정맥내 처리하거나 대조군 (HPCD 비히클)으로 처리하면, 양성 샘플은 투여한지 24시간 후에 에스트로겐 1000pg/뇌 조직 gm의 뇌 조직 에스트로겐 농도를 유발시킨다. MCAO한지 40분 후 및 90분 후에 에스트로겐 화합물을 투여하고 (도 4a 및 b, 표 2) MCAO한지 24시간 후에 상기 동물을 희생시킨다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 후신경구의 5, 7, 9, 11 및 13 ㎜ 후부에 5개의 2 ㎜ 두께 관상 절편을 만든다.
40분에서의 후-처리:도 4a에 도시된 바와 같이, 대조군 쥐 (HPCD 처리됨)는 샘플 처리된 모든 박편에서 커다란 허혈성 면적을 지니고 있는데, 25.6±2.7%의 최대 허혈성 면적이 박편 C에서 관찰되었다. E2-CDS 처리로 인해, 샘플 처리된 모든 박편에서 허혈성 면적이 감소되었다 (도 4). 허혈성 면적 감소 정도는 박편 A (후신경구의 5 ㎜ 후부)에서의 90% 감소로부터 박편 C (후신경구의 9 ㎜ 후부)에서의 45% 감소까지로 다양하다 (도 4a). 허혈성 병변 곡선 아래의 통합 면적은, 비히클 처리된 쥐에 대해서는 10.1±1.6이고 E2-CDS 동물에 대해서는 4.5±0.9이다 (표 2).
90분에서의 후-처리:교합을 시작한지 90분 후에 E2-CDS 또는 HPCD 비히클로 쥐를 처리한다 (도 4b 및 표 2). 다시 언급하면, HPCD 처리된 동물은 샘플 처리된 모든 박편에서 커다란 병변을 나타냈는데, 최대 허혈성 면적이 박편 C에서 관찰되었다 (박편 면적의 20.5±3.1%). E2-CDS로 처리하면, 검사된 모든 박편에서의 평균 허혈성 면적이 감소하였지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않다. 두 그룹에 대한 허혈성 곡선 아래의 면적을 평가한 결과, E2-CDS로의 처리가 허혈성 면적을 8.2±1.7 (HPCD 처리된 동물)에서 5.2±1.7 (E2-CDS 처리된 동물)로 37.1% 감소시킨 것으로 나타났다.
실시예 3.에스트로겐 화합물은 병소 허혈과 연관된 질환 상태의 뇌 모세혈관 내피 세포를 보호해준다.
본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[Goldstein, J. Neurochemistry vol. 25, 715-717, 1975]의 방법에 따라서, 1차 쥐 뇌 모세혈관 내피 세포 (BCEC) 배양물을 제조한다.
저혈당증 실험을 수행하였다. 17β-에스트라디올 (2 nm) 또는 대조군 (에탄올 비히클)을 BCEC 배양물에 가한다. 이어서, 적당한 양의 D-(+)-글루코오스를 글루코오스-무함유 배지에 가함으로써 상기 배지의 글루코오스 농도를 20 ㎎%에서 200 ㎎%로 조정하고, 글루코오스 및 L-락테이트 분석기 (YSI 모델 2300 STAT plus, YSI, Inc., Yellow Springs, OH)로 모니터한다. 트립판 블루로 염색하기 전에 24시간 및 48시간 동안 상기 저혈당증 배양물을 유지시킨다.
2nm 17β-에스트라디올의 존재하 또는 부재하에 BCEC를 함유하는 배양 디쉬를 분자 인큐베이터 챔버 (Billups-Rothenberg, Inc., Delmar, CA)에 놓아둠으로써 산소결핍증 환경을 만든다. 질소 가스를 유입하여 상기 챔버 내의 산소를 대체시킨다. 상기 챔버를 밀폐시키고, 비-저혈당성 배양을 위해 4시간 동안 항온기에 놓아두고 저혈당성 배양을 위해서는 2시간 동안 항온기에 놓아둔다.
트립판 블루 염색법을 사용하여 세포 사망률을 계수한다. 세포 사망률 (%)은 사멸된 세포/살아있는 세포 ×100%로 산정한다.
사용된 통계 방법은 실험 그룹들 간의 유의차를 결정하기 위해 적용된, 투-웨이 분산 분석을 포함한다. 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 비-파라미터식 분석이 %로서 제시된 데이타에 사용된다. 크루스칼-왈리스가 그룹들 간의 유의성을 나타낸 경우에는 만-위트니 (Mann-Whitney) U 시험이 사용된다. P<0.05는 유의적인 것으로 간주된다.
글루코오스가 결핍된 세포에 대한 결과가 도 5a 및 5b에 도시되어 있다. 배지 중의 정상적인 글루코오스 농도는 100 ㎖ 당 200 ㎎이다 (200 ㎎%). 이러한 글루코오스 농도에서는 에스트로겐 보충물을 함유하는 배양물과 함유하지 않은 배양물 간의 세포 사망률 (%) 차이가 거의 관찰되지 않았다. 그러나, 배지 글루코오스 함량이 100 ㎎%, 40 ㎎%, 및 20 ㎎%로 감소하게 되면, 세포 사멸이 일어났고, 17β-에스트라디올이 에스트로겐 화합물에 노출되지 않은 상응하는 대조군 그룹과 비교해서 세포 손실을 각각 35.9%, 28.4% 및 23% (p<0.05) 정도 덜게 해주었다. 상기 에스트라디올 처리된 그룹 보다는 대조군 그룹에서 유주하는 세포 (즉, 사멸된 세포가 보다 많음을 의미한다)가 있는 것으로 추가로 인지되었다. 이들 세포는 세포 사망률 계수시 제외되었기 때문에, 에스트라디올의 보호 효과가 과소평가될 수 있다. 유사한 유익한 효과가 24시간 및 48시간 저혈당 치료시 관찰되었다 (각각 도 5a 및 b).
산소결핍증은, 200 ㎎% 글루코오스를 함유하는 배지 중의 세포에 대해 도 6에서 도시된 바와 같이 세포 생존율에서 보다 현저한 효과를 나타낸다. 산소결핍증은 대조군에서 48.8% 및 39.8% 정도로 많이 세포 사멸을 유도하였으며, E2는 1시간 산소결핍증 상해에서는 세포 사멸을 28.4% (p<0.05) 감소시켰고 4시간 산소결핍증 상해에서는 세포 사멸을 18.4% 감소시켰다.
세포를 저혈당증 (100 ㎎% 저혈당증) 및 산소결핍증 상태 (2시간)에 노출시킨 경우, 17β-에스트라디올이 양 질환의 누적 효과로부터 배양된 BCEC를 보호하는데 효과적이다 (도 7).
상기 시험관내 검정이, 혈액 뇌 장벽 내피 세포에 대한 산소와 글루코오스 공급량이 감소되는 MCAO에 의해 유도된 것과 같은 허혈증이 일어난 사건을 대표한다.
실시예 4.0.5, 1, 2, 3 및 4시간 시점에서의 후-처리 비교
난소척제된 쥐를, 교합 개시 후 지시된 시간에 HPCD 복합된 17β-에스트라디올의 정맥내 주사액 (100 ㎍/㎏)과 17β-에스트라디올 함유 실라스틱 (등록상표) 펠릿 모두로 처리한다 (도 8). HPCD 및 HPCD-캡슐화 17β-에스트라디올은 시그마 (Sigma; St. Louis, MO)로부터 구입한다. 난소척제되었지만 처리되지 않은 동물 (OVX)과, 난소척제되지 않고 처리되지도 않은 동물 (INT)을 대조군으로서 사용한다 (각각 n=12 및 n=6). MCAO 후 48시간째에, 동물을 희생시키고 앞서 기재된 바와 같이 뇌 절편을 수득하고 이를 TTC로 염색함으로써 허혈성 병변 용적을 결정한다. 도 8은 교합시킨지 0.5, 1, 2 또는 3시간 후에 약물을 투여한 경우, 상당한 보호가 관찰되었다는 것을 도시하고 있다.
실시예 5.오일 비히클을 사용한 에스트로겐 화합물의 전달
오일 비히클 중에서의 에스트로겐 화합물의 흡수 역학을 시험하기 위하여, 숫컷 스프라그-돌리 쥐 (Taconic)에게 17β-에스트라디올을 피하 주사하고, 혈중 약물 수준을 25시간에 걸쳐 결정한다. 이 약물은 옥수수 오일에 100 ㎍/㎖로 용해되었고 전달된 최종 용량은 100 ㎍/㎏이다. 약물 투여하기 30분 전, 약물 투여한지 30분 후, 약물 투여한지 4시간 후 및 약물 투여한지 24시간 후에 혈액 샘플을 뽑아낸다. 정맥혈을 헤파린 가해진 튜브 내로 수집하고, 원심분리시킨 다음, 혈장을 수집하여 동결시킨다. 시판용 방사선면역검정용 키트를 사용하여 17β-에스트라디올의 수준을 결정한다.
도 9에 도시된 바와 같이, 17β-에스트라디올이 혈류 내로 매우 신속하게 상당량 흡수되었으며, 이 실험에서는 30분 시점에서 피크에 도달하였다 (4,610 pg/㎖). 4시간째, 순환 17β-에스트라디올의 수준은 2,004 pg/㎖이다. 25시간째, 혈중 17β-에스트라디올 수준은 거의 제로로 떨어졌다.
이들 전달 역학은, 에스트로겐 화합물을 오일에 용해시키고 동물에게 단일 피하 주사액으로써 전달시키는 본원에 기재된 전달 비히클이 상기 화합물의 혈액 내로의 신속한 흡수를 개시시킬 뿐만 아니라 그 후 수 시간 동안 상기 화합물을 지속적으로 전달시키게 해주는 이중 목적을 제공해준다는 것을 지시해준다.
실시예 6. ent- 17β-에스트라디올의 합성
ent-17β-에스트라디올의 합성 방법이 표 3에 요약되어 있다. 공지된 출발 물질 [3R-(3α,3aα,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-1,2,3,3a,4,5,8,9,9a,9b-데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온 (Chemical Abstracts Registry Number, 139973-49-2)은 다음 문헌에 기재된 바와 같은 다단계 합성 경로에 의해 제조한다 [참조: Rychnovsky, S.D. et al. J.Org. Chem. 1992 vol.57, 2743-2736]. 이어서, 상기 화합물을 두 방법 중의 어느 한 방법 (방법 A 또는 방법 B)으로ent-19-노르테스토스테론 (Chemical Abstracts Registry Number, 4091-86-5)으로 전환시킨다.
방법 A의 첫번째 단계에서는, 액체 암모니아 중의 리튬을 사용하여 이중 결합을 환원시키고, 이로써 생성된 트리시클릭 화합물을 두번째 단계에서 폐환시켜ent-19-노르테스토스테론을 수득한다. 방법 B의 첫번째 단계에서는, 상기 이중 결합을 촉매적 수소화시켜 환원시키고, 이로써 생성된 트리시클릭 화합물을 두번째 단계에서 다시 폐환시켜ent-19-노르테스토스테론을 수득한다. 방법 B를 미리 사용하여 19-노르테스토스테론을 제조하였다 [참조: Micheli, R.A. et al., 1975 J. Org. Chem. Vol.40, 675-681]. 이어서,ent-19-노르테스토스테론의 히드록시 기를 에스테르화시키고, 이러한 스테로이드의 A-환을 아세토니트릴 중의 CuBr2를 사용하여 방향족으로 만든다. 이 반응은 19-노르테스토스테론, 17-아세테이트를 17β-에스트라디올, 17-아세테이트로 전환시키는 것으로 앞서 보고된 바 있다 [참조: Rao, P.N. et al. 1994, Steroids vol.59, 621-627]. 최종적으로, 상기 17-아세테이트 기를 비누화하여 제거하여,Ent-17β-에스트라디올 (Chemistry Abstracts Registry Number, 3736-22-9)을 수득한다. 이러한Ent-17β-에스트라디올의 구조는 실험 데이타에 의해 입증되었는데, 이는 상기 화합물이 17β-에스트라디올과 동일한 융점, IR,1H NMR 및13C NMR 스펙트럼을 지니고 있지만, 광회절도는 반대를 나타낸다고 제시하였다.
A. (8α,9β,10α,13α,14β,17α)-17-히드록시에스트르-4-엔-3-온 (ent-19-노르테스토스테론)의 제조
방법 A
암모니아 가스를, 200 ㎖의 액체 암모니아가 수집될 때까지 질소 하에 -78℃로 냉각된 (냉각조: 드라이 아이스, 2-프로판올) 500 ㎖ 들이 3-구 환저 플라스크에서 응축시킨다. 신선하게 절단된 리튬 (1.4 g, 200 mmol)을 가하고, 이 반응 용액을 15분 동안 교반시킨다 (오버헤드 기계적 교반기). 이와 같이 블루 착색된 반응 용액에, 무수 테트라히드로푸란 (THF; 100 ㎖) 중의 [3R-(3α,3aα,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-1,2,3,3a,4,5,8,9,9a,9b-데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온 (4 g, 10 mmol)을 가하고, 반응 용액을 1시간 동안 교반시킨다. 이 시간 동안 블루색이 유지된다. 1시간 후, 온도를 -78℃로 유지시키면서 고체 염화 암모늄 (5 g)을 서서히 조심스럽게 가한다. 이러한 블루 착색된 용액은 염화암모늄을 가하면 유백색 용액으로 변하게 된다. 냉각조를 꺼낸 다음, 반응 혼합물을 밤새 정치시켜 두면, 이 동안에 액체 암모니아가 가스상 암모니아로 되어 증발된다. 물 (200 ㎖)을 가하고, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 100 ㎖)로 추출한다. 합한 에틸 아세테이트 추출물을 염수 (100 ㎖)로 세척한다. 용매를 제거하고 수득된 잔사를 헥산 중의 20% 에틸 아세테이트로 용출된 실리카 겔 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 순수한 [3R-(3α,3aα,5aβ,6β,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-도데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온 (3g, 75%)을 수득한다. 이어서, 상기 물질의 일정 부분을 다음에 기재된 바와 같이ent-19-노르테스토스테론으로 전환시킨다. 메탄올 (100 ㎖) 중의 상기 [3R-(3α,3aα,5aβ,6β,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-도데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온 (2g, 5.12 mmol)에 3N 염산 (30 ㎖)을 가하고 반응 용액을 24시간 동안 환류시킨다. 이어서, 반응 용액을 물에 붓고 수성 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 100 ㎖)로 추출한다. 합한 추출물을 염수로 세척한다. 조악한 생성물을 헥산 중의 20% 에틸 아세테이트 혼합물로 용출된 실리카 겔 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 순수한ent-19-노르테스토스테론 (0.5g, 57%)을 백색 결정성 고체로서 수득하는데, 이는 상기 화합물을 방법 B를 사용하여 제조한 경우에 다음에 보고된 것과 동일한 물리적 성질을 지니고 있다.
방법 B
[3R-(3α,3aα,9aα,9bβ)]-3-(1,1-디메틸에톡시)-1,2,3,3a,4,5,8,9,9a,9b-데카히드로-3a-메틸-6-[2-(2-메틸-1,3-디옥솔란-2-일)에틸-7H-벤즈[e]인덴-7-온 (18.35g, 47 mmol)을 파르 수소화 장치와 함께 사용된 파르 수소화 병에서 에탄올 (EtOH; 180 ㎖)에 용해시킨다. Pd/C 촉매 (1.00 g, 9.4 mmol)를 가하고, 공기를 제거하며, 수소 가스로 반응 용기를 60 psi로 가압시킨 다음, 로커 모터를 개시한다. 이 수소화 반응을 4시간 동안 수행한다. 이를 완료한 후, 반응 혼합물을 셀라이트 상을 통해 여과시킨다. 용매를 제거하여 오일을 수득하고, 이를 다음 단계에 즉시 사용한다.
상기 오일을 EtOH (50 ㎖)에 용해시키고 6N HCl을 가한다 (50 ㎖). 이어서,상기 반응 용액을 환류시킨다. 48시간 후, pH가 8 내지 9가 될 때까지 고형 NaHCO3를 가함으로써 반응 혼합물을 중화시킨다. 휘발성 용매를 제거하고, 수성 잔사를 메틸렌 클로라이드 (각각 200 ㎖ 3분획)로 추출한다. 유기 추출물을 합하고, MgSO4로 건조시키며, 여과시킨 다음, 용매를 제거하여 오일을 수득한다 (12.5 g).1H NMR 분석은 생성물의 복합 혼합물을 나타낸다. 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중의 19 내지 37% 에틸 아세테이트로 용출시킨 실리카 겔)하여 정제한 다음, 재결정화하여ent-19-노르테스토스테론 (2.04g, 7.45 mmol, 16% 수율)을 수득한다: [α]=-57.3° (c=0.99, CHCl3); 융점 124-125℃; IR 3425, 2926, 2866, 1661, 1619, 1450, 1334, 1261, 1208, 1135, 1056cm-1;1H NMR (300MHz, CDCl3) δ5.81 (1H,s), 3.65 (1H,t,J=8.4Hz), 2.5-2.0 (7H,m), 1.90-1.75 (3H,m), 1.70-0.80 (11H,m), 0.79 (3H,s);13C NMR (75MHz, CDCl3) δ200.05, 166.72, 124.64, 81.66, 49.70, 49.53, 42.93, 42.52, 40.43, 36.39, 36.33, 35.37. 30.59, 30.32, 26.48, 26.02, 23.07, 10.89; C18H26O2에 대한 계산치: C, 78.79; H, 9.55; 실측치: C, 79.04, H, 9.41.
B. (8α,9β,13α,14β,17α)-에스트라-1,3,5(10)-트리엔-3,17-디올, 17-아세테이트 (ent-17β-에스트라디올, 17-아세테이트)의 제조
아세트산 무수물 (1.85 ㎖)을 피리딘 (5 ㎖)과 혼합하고 질소하에 45분 동안 교반한 다음,ent-17β-노르테스토스테론 (304 ㎎, 1.11 mmol)을 가한다. 반응 용기에 질소를 퍼징하고 반응 용액을 밤새 교반시킨다. 그 다음날 아침, 0.5M HCl (15 ㎖)을 가한다. 1시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드 (30 ㎖ 3분획)으로 추출한다. 합한 유기 추출물을 1N HCl (30 ㎖ 2분획), 포화 NaHCO3(30 ㎖ 1분획) 및 염수 (30 ㎖ 1분획)으로 추출한다. 이어서, 합한 추출물을 MgSO4로 건조시키고, 여과시킨 다음, 용매를 제거하여 황색 오일 (0.37 g)을 수득한다. 크로마토그래피 (실리카 겔, 헥산 중의 20% 에틸 아세테이트로 용출시킴)하여 정제하여,ent-19-노르테스토스테론, 17-아세테이트를 무색 오일 (0.32 g, 1.01 mmol, 91% 수율)로서 수득하고, 이를 다음 반응에 사용한다.Ent-19-노르테스토스테론, 17-아세테이트 (0.32g, 1.01 mmol)을 아세토니트릴 (10 ㎖)에 용해시킨다. CuBr2(0.28g, 1.25 mmol, 1.24 당량)을 가한다. 반응 용기에 질소를 퍼징하고, 반응물을 밤새 교반시킨다. 그 다음날 아침, 추가의 CuBr2(0.14g, 0.63 mmol, 0.62당량)을 가한다. 2시간이 더 지난 후, 물 (15 ㎖)을 가함으로써 상기 반응물을 급냉시킨다. 아세토니트릴을 감압하에 제거한다. 물 (10 ㎖)과 염수 (10 ㎖)를 더 가한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 40 ㎖)로 추출한다. 합한 유기 추출물을 염수 (2 x 40 ㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키며, 여과시킨다음, 용매를 제거하여 황색 고상물 (0.35g)을 수득한다. 크로마토그래피 (실리카 겔, 헥산 중의 20% 에틸 아세테이트로 용출시킴)하여 정제하여,ent-17β-에스트라디올, 17-아세테이트를 백색 고상물 (0.24 g, 0.76 mmol, 76% 수율)로서 수득한다: 융점 219-21℃; IR 3419, 2927, 2871, 1708, 1611, 1585, 1546, 1500, 1447, 1375, 1358, 1274, 1181, 1153, 1132, 1039, 962cm-1;1H NMR (300MHz, CDCl3) δ7.14 (1H,d,J=8.4Hz), 6.64-6.56 (2H,m), 5.00 (1H,s), 4.69 (1H,dd,J=7.8Hz,9.3Hz), 2.82 (2H,m), 2.06 (3H,s), 0.82 (3H,s);13C NMR (75MHz, CDCl3) δ171.59, 153.58, 138.27, 132.61, 126.60, 115.32, 112.77, 82.84, 49.73, 43.72, 42.85, 38.50, 36.83, 29.48, 27.47, 27.07, 26.12, 23.14, 21.08, 11.93.
C. (8α,9β,13α,14β,17α)-에스트라-1,3,5(10)-트리엔-3,17-디올 (Ent-17β-에스트라디올)의 제조
상기 B의 화합물 (0.21g, 0.668 mmol)을 교반된 EtOH (25 ㎖)에 용해시키고 10% 수성 NaOH (2.5 ㎖)를 가한다. 반응 용기에 질소를 퍼징하고 반응을 밤새 진행시킨다. 그 다음날 아침, 1N HCl (2 ㎖)와 염수 (5 ㎖)를 가함으로써 상기 반응 용액을 급냉시킨다. 이 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (60 ㎖ 3분획)로 추출한다. 합한 유기 추출물을 염수 (50 ㎖ 2분획)로 세척하고, 여과시킨 다음, 용매를제거하여 황색 고상물 (0.20 g)을 수득한다. 크로마토그래피하여 정제하여,ent-17β-에스트라디올을 백색 고상물 (174 ㎎, 0.64 mmol, 96%)로서 수득한다: 융점 176-177℃; [α]=-71.2 (c=0.99, CH3OH); IR 3449, 3246, 2936, 2864, 1611, 1587, 1500, 1450, 1283, 1250, 1057, 1012, 930, 874cm-1;1H NMR (300MHz, CD3OD) δ7.06 (1H,d,J=8.7Hz), 6.54-6.46 (2H,m), 3.64 (1H,t,J=8.4Hz), 0.75 (3H);13C NMR (75Hz, CD3OD) δ156.07, 138.98, 132.80, 127.32, 116.18, 113.85, 82.57, 51.32, 45.34, 44.36, 40.50, 38.01, 30.67 (2C), 28.48, 27.56, 23.99, 11.62.
실시예 7. Ent -17β-에스트라디올에 의한 발작 치료
스프라그-돌리 암컷 쥐 (체중 20 내지 225 g)를 다음 공급처 (Charles River Laboratories, Inc.; Wilmington, MA)로부터 구입한다. 이들 동물을, 수술하기 최소한 3일 전부터 매일 조명을 비추면서 (매일 07:00부터 19:00시까지 조명을 비춤) 온도 조절실 (25℃)에 걸려있는 스텐레스 강 우리에 한 쌍씩 사육한다. 모든 쥐는 퓨리나 쥐 초우 (Purina Rat Chow)와 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있다. 동물에 대해 수행된 모든 과정은 본 연구를 시작하기 전에 플로리다 대학의 동물 보호 및 이용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Florida)의 검토를 거쳐 승인된 것이다. 중뇌 동맥 (MCA) 교합하기 1주 전에 동물을 난소척제시킨다. MCA 교합하기 2시간 전에, 동물에게 다음들 중의 어느 하나를 피하 주사한다: 옥수수 오일 비히클 (1 ㎎/체중 ㎏), 17β-에스트라디올 (100㎍/체중 ㎏) 또는ent-17β-에스트라디올 (100 ㎍/체중 ㎏). 본 발명자들에 의해 앞서 기재된 방법에 따라서 MCAO를 달성한다. 간략하게 언급하면, 케타민 (60 ㎎/㎏, 복강내) 및 크실라진 (10 ㎎/㎏, 복강내) 마취제를 투여한 후, 좌측 상의 모든 경동맥 (ICA)를 중선 경부 절개를 통하여 노출시킨 다음, 인접 신경으로부터 멀리 떨어지게 절개한다. 3-0 모노필라멘트 나일론 봉합을 좌측 MCA 관강 내로 도입하고, 내성이 느껴질 때까지 이를 원위 ICA 쪽으로 조심스럽게 나아가게 하는데, 여기서 상기 봉합물은 MCA와 전부 뇌동맥 (ACA)의 분기를 통과한다. 실을 60분 동안 그 자리에 놓아둔 후, 재관류를 개시한다. 전체 발작 과정 동안에 직장 온도를 기록하고 36.5℃와 37.0℃ 사이로 유지시킨다. 재관류시킨지 24시간 후에 각 그룹의 동물을 참수시킨다. 뇌를 꺼내고, 희생 직후 조직 박편을 만들기 위해 금속성 뇌 매트릭스에 놓아둔다. 후신경구의 3, 4, 7, 9 및 11 ㎜ 후부에 5개의 박편을 만든다. 이 박편을 37℃ 하 생리 식염수 중의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC)의 2% 용액에서 30분 동안 인큐베이션시킨 다음 10% 포르말린에 고정시킨다. 염색된 박편의 사진을 찍고, 연속적으로 상기 박편의 표면적과 허혈성 병변 면적에 대해 측정한다. 허혈성 병변 용적은, 이들 5개 뇌 박편의 총 단면적을 5개 박편에 걸친 허혈성 병변 면적의 합으로 나눔으로써 산정한다.
비히클 대조군에 대한 평균 면적에 기준한 17β-에스트라디올 또는ent-17β-에스트라디올로의 예비처리 결과는 13.3±2.0 (평균치±SEM)이다. 17β-에스트라디올로 처리하면, 경색 면적이 5.3±1.6으로 60% 감소하였다.ent-17β-에스트라디올로 처리하면, 경색 면적이 유사하게 5.3±1.7로 감소하였다. 던 (Dunn)의 복수 비교 시험 결과, 17β-에스트라디올과ent-17β-에스트라디올 모두는 비히클 대조군 (p<0.05)과 상당히 상이하지만, 서로는 상이하지 않은 것으로 나타났다.
ent-E2 투여 후 혈장 17β-에스트라디올 수준은 0.05±0.01 nM의 예비-주사 기선으로부터 변하지 않았다 (도 6). 이와는 달리, 17β-에스트라디올을 피하 주사하면, 1시간 이내에 혈장 17β-에스트라디올 수준이 5.16±0.94 nM으로 신속하게 상승하였고, 24시간째에 기선 근처 (0.24±0.08)로 회복되었다.
실시예 8
시험관내 및 생체내 모두에서 17β-에스트라디올의 에난티오머 (ent-E2)의 신경보호 효과는 말초 에스트로겐 활성과 연관이 없을 수 있다. Ent-E2는 β-에스트라디올의 성별 관련 활성 없이도 신경보호를 제공하므로, β-에스트라디올에 불리하게 반응하는 것으로 예상되는 남성이나 여성을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 실시예는 ent-E2가 암컷의 생식과 연관된 효과를 자극하지 않고서도 신경보호 효과를 발휘할 수 있다는 것을 보여준다. 실시예 6에 따라서 ent-E2를 만든다. 17β-에스트라디올은 다음 공급처 (Steraloids, Inc.; Wilton, NH)로부터 구입한다.
스테로이드를 초기에 10 mM 농도로 에탄올에 용해시킨 다음, 세포 배양 또는 생체외 검정을 위해 각각 배지 또는 검정용 완충액에서 적당한 농도로 희석시킨다.스테로이드를 옥수수 오일에 필요한 농도로 용해시켜 설치류 연구를 위해 1 ㎖/㎏ 주사액 중의 지시된 용량을 획득한다. 쥐를 실시예 7에 기재된 바와 같이 사육한다.
세포 배양물
SK-N-SH 사람 신경아세포종 세포를 ATCC (Rockville, MD)로부터 수득하고 HT-22 세포 (쥐 기원의 불멸화된 해마 신경단위)를 다음 공급처 (Salk Institute, San Diego, CA)로부터 수득한다. 세포를, 표준 배양 조건에 따라서 10% 목탄/덱스트란-스트립핑된 태아 송아지 혈청 (Hyclone, Logan, UT) 및 200 ㎍/㎖ 젠타마이신이 보충된 RMPI-1640 및 DMEM 배지 (GIBCO, Gaithersburg, MD)에 각각 유지시킨다.
실험을 시작하기 24시간 전에 세포를 Nunc (등록상표) 96-웰 플레이트 (Fisher Scientific, Orlando, FL)에 2 x 104세포/웰 (SK-N-SH 세포) 또는 5 x 103세포/웰 (HT-22 세포)의 밀도로 플레이팅한다. 스테로이드를 글루타메이트 (5 mM) 또는 H2O2(3 내지 60 μM)에 노출시키기 2시간 전 또는 24시간 전에 0.1 nM 내지 10μM 범위의 농도로 가한다. 에탄올을 0.001 내지 0.1%v/v의 농도로 비히클 대조군으로서 사용한다. 이들 농도의 에탄올은 세포 생존율에 우려할 만한 효과를 나타내지 않는다. 24시간의 독소 노출 후, 세포를 PBS, pH 7.4로 세정하고, 15분 동안 PBS 중의 1 μM 칼세인 AM (Molecular Probes, Eugene, OR)과 1 ㎍/㎖ 프로피듐 요오다이드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 가함으로써 생존율을 평가한다. 칼세인 AM 형광성을 485 nm의 여기 및 538 nm의 방사 파장에서 결정한다. 1%SDS를 가함으로써 용해시킨 세포를 블랭크 판독에 사용한다. 형광성 니콘 현미경을 사용하여 염색을 가시화하고, 정성적 입증을 위해 세포의 사진을 찍는다.
난소척제술
3 내지 5일 동안 암컷 스프라그-돌리 쥐 (체중 220 내지 225 g)가 환경에 적응하도록 한 다음, 복부쪽으로 접근하여 이측으로 난소척제한다. 메톡시플루란 (Pitman Moore, Inc., Crossing, NJ) 흡입제 마취를 이용하여 동물을 마취시킨다. 피부, 안면 및 근육을 통하여 작은 (1cm) 절단물을 만든다. 난소를 밖으로 향하게 하고, 클립으로 고정시켜 꺼낸 다음, 근육, 안면 및 피부를 봉합 밀봉시킨다. 실험하기 2주 전에 난소척제술을 수행한다.
17β-에스트라디올의 혈장 수준
난소척제된 암컷 스프라그-돌리 쥐에게 오일 비히클 또는 100 ㎍/㎖의 17β-에스트라디올 또는ent-E2를 피하 주사한다. 주사하기 5분 전 또는 주사한지 1시간, 4시간 또는 24시간 후에 심장 천자로 혈액 샘플을 수득한다. 혈장을, 제조업자의 지시에 따라서 공급처 (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.; Los Angeles, CA)로부터의 초민감성 17β-에스트라디올 RIA 키트를 사용하여 검정될 때까지 -20℃에서 저장한다.Ent-E2는 10 μM 이하의 농도에서 RIA와 어떠한 교차 반응성도 나타내지 않았다.
자궁영양성 검정
미숙한 (25일생) 암컷 스프라그-돌리 쥐에게 오일, 17β-에스트라디올 (0.01 내지 1 ㎍/쥐) 또는ent-E2 (1 내지 100 ㎍/쥐)를 3일 동안 매일 (08:30) 피하 주사한다. 4일째 되는 날, 상기 쥐를 메톡시플루란으로 안락사시키고, 자궁을 절개한다. 습윤 중량을 결정하기 전에 관계없는 조직을 자궁으로부터 서서히 제거한다. 자궁 제거에 앞서 질 개구를 평가한다.
에스트로겐 수용체 결합의 리간드 경쟁
ER 결합 완충액 (20 mM 트리스, 1 mM EDTA, 400 mM KCl, 1 mM DTT, 10% 글리세롤, 0.1% BSA, pH 7.8) 중의 5 nM[2,4,6,7-3H]-17β-에스트라디올 (비활성 84.1 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 및 400 pM 재조합 사람 에스트로겐 수용체 (ER) α 또는 β (Affinity Bioreagents, Inc., Golden, CO)를 스테로이드 (총 결합), 1.2 μM 디에틸스틸베스테롤 (비-특이적 결합) 또는 0.1 nM 내지 10 μM 17β-에스트라디올 또는ent-E2를 전혀 첨가하지 않으면서 25 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 1 ㎖ 용출 용적을 지닌 세파덱스 G-25 (Amersham Pharmacia Biotech) 컬럼 (1.5 ㎖ 상 용적)을 사용하여, 결합된 방사선 리간드와 결합되지 않은 방사선 리간드를 분리시킨다. 10 ㎖ 신틸레이션 액체를 가하고 총수를 결정한다. 이러한 방법으로, 90% 초과의 수용체 회수율과 15% 미만의 비-특이적 결합이 생겨났다.
뇌막 산화
난소척제된 암컷 스프라그-돌리 쥐로부터 뇌를 꺼내고, 테플론/유리 조직 균질화기를 사용하여 1% 트리톤 X-100을 갖는 빙냉 트리스 완충액 (100 mM, pH 7.4)에서 신피질을 균질화시킨다. 이 균등질을 10분 동안 2000 rpm으로 원심분리시킨다. 이로써 생성된 상등액을 37 ℃에서 30분 동안 0.1 내지 100 μM 범위의 농도로 17β-에스트라디올 또는ent-E2와 함께 인큐베이션시킨다. 이어서, FeSO4를 200 μM의 최종 농도로 가하고, 37℃에서 30분 더 인큐베이션시킨다. 이어서, BHT (100 μM) 및 DPTA (100 μM)을 가한다. 0.5% 2-티오바르비투르산, 3.125% 트리클로로아세트산 및 0.2N HCl을 가한 다음 95 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 2-티오바르비투르산 반응성 생성물 (TBARs)을 즉시 결정한다. 샘플을 10분 동안 10,000 rpm으로 원심분리시키고, 532 nm에서의 상등액의 흡광도를 결정한다.
통계학적 분석
모든 데이타를 평균치±sem으로서 나타낸다. 그룹들 간의 계획된 비교를 위한 크루스칼-왈리스 시험을 이용한 원-웨이 ANOVA를 사용하여, 허혈성 병변 용적 비교를 수행한다. 기타 모든 실험에 대해서는, 유의차가 탐지되는 경우에 그룹들 간의 계획된 비교를 위한 터키의 복수 비교 시험 (Tukey's Multiple Comparisons Test)을 이용한 원-웨이 ANOVA에 의해 그룹들 간의 유의차를 결정한다. 모든 시험의 경우, p<0.05가 유의적인 것으로 고려된다.
결과
Ent -E2는 신경단위 배양물에서 산화적 스트레스-유도된 사멸을 약화시킨다.
HT-22 세포, 형질전환된 해마 신경단위는 글루타치온 고갈과 이로써 생성된 산화적 스트레스와 연관된 기전을 통하여 글루타메이트 독성에 대해 민감하다 (31). HT-22 세포를 10 mM 글루타메이트에 노출시키면, 24시간 노출시 신경단위생존율을 70 내지 75% 감소시킨다 (도 2). 17β-에스트라디올에 노출시키면, 상기 모델에서 상당한 보호를 제공해주는데, 10 μM 농도에서는 상기 세포의 35±4%를 보호해준다.Ent-E2는 상기 모델에서 유사한 신경보호를 제공해주는데,ent-E2 0.1 μM 및 10μM은 각각 HT-22 세포의 16±2% 및 56±4%를 보호해준다.
또 다른 산화적 스트레스 모델에서는, 17β-에스트라디올과ent-E2 모두가 HT-22 세포에서 H2O2-유도된 독성을 상당히 약화시킨다 (도 3). H2O2노출로 인해, HT-22 세포에서 농도-의존적 독성이 생겨나는데, 30 μM 농도에서는 생존율이 21±5% 감소하였고 60 μM 농도에서는 97±8% 감소되었다. 10 nM의 17β-에스트라디올 또는ent-E2는 30 μM H2O2의 독성을 완전히 약화시켰으며, 40 μM H2O2독성으로부터 세포의 48±14% 및 63±8%를 각각 보호하였다 (도 3). 40 μM 초과의 H2O2농도에서는 어느 한 스테로이드 10 nM 농도를 사용해서 어떠한 보호도 관찰되지 않았다 (데이타는 도시되지 않음). SK-N-SH 세포는 H2O2노출의 독성 효과에 대해 HT-22 세포 보다 더 민감한데, 3μM H2O2는 SK-N-SH 세포 생존율을 32±2% 감소시킨다. 세포 사멸은 10 nMent-E2에 의해 거의 완전히 약화되었는데, 1 nM 농도는 30±9% 보호를 제공해준다 (도 4). 이는 본 발명자들이 SK-N-SH 세포에서 H2O2-유도된 독성의 40±5%를 억제하는 것으로 밝혀낸 1 nM 17β-에스트라디올을 사용하여 관찰된 신경보호에 필적한다.
Ent -E2는 약한 ER 효능제/길항제이다.
17β-에스트라디올을 3일 동안 매일 투여하면, 자궁 습윤 중량이 용량 의존적으로 증가하는데, 1 ㎍/쥐 용량 (평균 13.8 ㎍/㎏ 용량)에서는 자궁 습윤 중량이 2배 정도 증가하였다 (도 7). 이와는 달리, 1 내지 10 ㎍/쥐 용량의ent-E2는 자궁 습윤 중량에 대해 어떠한 효과도 미치지 않았다. 100 ㎍/쥐 용량 (평균 1400 ㎍/㎏의 용량)에서는Ent-E2가 약간의 항-자궁영양성 효과를 나타내었는데, 자궁 습윤 중량을 23±3% 감소시킨다.ent-E2는 또한, 1 ㎍/쥐 17β-에스트라디올의 자궁영양성 효과를 약간 길항시키는데, 100 ㎍/쥐 용량이 17β-에스트라디올의 자궁영양성 효과를 27±8% 감소시킨다. 이들 결과는,ent-E2 (약 1200 ㎍/㎏ 용량)가 항-자궁영양성 효과를 발휘하고 (20)ent-E2가 100배 과량으로 존재하는 경우에ent-E2가 17β-에스트라디올의 자궁영양성 효과를 길항시키는 (23) 미숙한 마우스에서의 선행 보고서에 필적한다.
17β-에스트라디올 (1 ㎍/쥐)를 매일 주사하면, 검사된 동물의 100%에서 질 개방이 유도되었다 (표 1).ent-E2는 질 개방에 대한 혼합된 효능제/길항제 효과를 나타내는데, 100 ㎍/쥐 용량은 미숙한 쥐의 50%에서 질 개방을 유발하였다. 이러한 용량의ent-E2는 상기 쥐의 40%에서 17β-에스트라디올-유도된 질 개방을 억제하였다. 17β-에스트라디올,ent-E2 또는 이들의 조합물을 투여한 경우에 어떠한 체중 변화도 관찰되지 않았다. 미숙한 쥐의 체중은 평균 72±1 g이다.
경쟁 결합 실험에서,ent-E2는 공지된 에스트로겐 수용체 둘 다에 대해 약한 결합을 나타내었는데, ERα및 ERβ에 대한 17β-에스트라디올의 상대적인 결합 친화도는 각각 4.2% 및 6.3%이다.
Ent -E2는 생체외에서 뇌 지질 산화를 약화시킬 수 있다.
본 발명자들은 뇌막 산화의 생체외 검정에서 17β-에스트라디올과ent-E2 모두의 효능을 검사하였다. 신피질 균등물을 30분간 인큐베이션하면, TBAR 형성이 16배 증가하였다. 17β-에스트라디올과ent-E2는 TBAR 형성으로 결정된 바와 같이 FeSO4-유도된 지질 산화를 약화시키는데 있어서 동일한 효능을 지니고 있는데 (도 8), 어느 한 스테로이드 50 μM 농도는 FeSO4-유도된 TBAR 형성을 상당히 약화시켰다.
요약하면,ent-E2는 신경보호 배양 모델에서 17β-에스트라디올과 동일한 정도로 강력하고 효능이 있으며, 추가로ent-E2는 MCA 교합 후의 허혈성 병변 용적을 17β-에스트라디올과 동일한 정도로 감소시킨다. 이와는 달리,ent-E2는 어느 하나의 공지된 에스트로겐 수용체에 대해 단지 최소한의 결합 친화도를 나타내고, 자궁 성장이나 질 개방에 대한 효과를 발휘하는데 있어서도 17β-에스트라디올 보다 100배 이상 덜한 효능을 나타내며, 약한 항-자궁영양성 효과를 지니고 있다. 이들 데이타는 에스트로겐의 신경보호 효과가 말초 에스트로겐-반응성 조직의 자극없이도 일어날 수 있다는 것을 지시해준다.
ent-E2의 신경보호 효과는 보다 강력한 17β-에스트라디올로의 전환에 기인된 것으로 보이지 않는데, 이는 이러한 전환을 위해서는, 5개의 개개의 키랄 탄소의 이성체화가 요구되기 때문이다. 17-히드록시 기의 이성체화는 17β-히드록시 스테로이드 데히드로게나제에 의해 촉진될 수 있지만,ent-E2는 이러한 효소에 대한 기질이 아니다 [참조: Segal GM, Cherkasov AN, Torgov IV 1967 (제목: dl-에스트라디올의 d-에스트론과 l-에스트라디올로의 효소적 변환), Khim Prir Soedin 3:304-307]. 추가로, 암컷 쥐에서ent-E2를 피하 주사한 후 24시간 동안, 탐지 가능할 정도의 혈장 17β-에스트라디올 수준 증가가 없었으며, 이는ent-E2 자체가 신경보호성임을 나타낸다.
중뇌 동맥 교합 후의 사망률에 대한 17β-에스트라디올 또는 에스트라디올 화학적 전달 시스템 (E2-CDS)으로의 예비처리 효과
처리 계획된희생 시간 시험된동물의 수 살아있는동물의 수 사멸된동물의 수 생존율 (%)
모의 6시간 12 5 7 42
1일 18 6 12 33
1주 5 1 4 20
총 35 12 23 35
E2 이식체 6시간 6 3 3 50
1일 8 8 0 100*
1주 4 3 1 75*
총 18 14 4 78*
E2-CDS 6시간 7 5 2 71
1일 8 7 1 88*
1주 4 4 0 100
총 19 16 3 84*
* 치 스퀘어 (Chi Squares) 분석으로 결정된 바와 같이, 각 시점에서의 모의 대조군 그룹에 대한 p<0.05
난소척제된 쥐에서 허혈성 병변 곡선 아래의 면적에 대한 에스트로겐의 효과
스테로이드 처리 곡선 아래의 면적
모의 24시간 예비처리 8.1±0.8
17α-에스트라디올 24시간 예비처리 3.7±1.3*
HPCD 비히클 40분 후-처리 10.1±1.6
E2-CDS 40분 후-처리 4.5±0.9*
HPCD 비히클 90분 후-처리 8.2±1.7
E2-CDS 90분 후-처리 5.21±1.7
* 스튜던츠 t 시험에 의한 모의 대조군에 대한 p<0.02
미숙한 암컷 쥐에서 질 개방에 대한 17α-에스트라디올과Ent-E2의 효과
Ent-E2 용량 (㎍/쥐) 질 개방 수
17α-에스트라디올을사용하지 않음 1㎍/쥐의 17α-에스트라디올을사용함
0 4개 중의 0개 5개 중의 5개
10 4개 중의 1개 4개 중의 3개
100 4개 중의 2개 5개 중의 3개
25일생 암컷 스프라그-돌리 쥐에게, 3일 동안 매일 1 ㎍/㎏의 17α-에스트라디올을 동시에 투여하거나 투여하지 않으면서 지시된 용량의Ent-E2를 피하 주사한다. 4일째에, 질 개방을 평가한다.

Claims (26)

  1. a) 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 제공하는 단계; 및
    b) 세포 집단에 대한 보호를 부여하도록, 허혈성 사건에 효과적으로 가장 가까운 시간 내에 1회분 이상의 용량을 포함하는 코스에 걸쳐 상기 화합물의 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 피검자에서의 허혈증과 연관된 세포 집단에 대한 보호를 부여하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 가장 가까운 시간이 허혈성 사건이 일어나기 전인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 가장 가까운 시간이 허혈성 사건 후인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 가장 가까운 시간이 허혈성 사건이 일어난 후 12시간 이내인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 허혈성 사건이 뇌혈관성 질환, 발작, 지망막하 출혈, 심근 경색, 수술 및 외상으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 허혈성 사건이 발작인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 허혈성 사건이 심근 경색인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 세포가 신경단위인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포가 내피 세포인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 세포가 심근 세포인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 에스트로겐 화합물의 에난티오머가, 피검자 중에서의 혈장 농도가 10 내지 500 pg/㎖의 범위가 되도록 해주는 유효량으로 투여되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 에스트로겐 화합물이Ent-17β-에스트라디올인 방법.
  13. a) 오일 비히클 중에 제형화된 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 제공하는 단계; 및
    b) 세포 집단에 대한 보호를 부여하도록, 허혈성 사건에 효과적으로 가장 가까운 시간 내에 1회분 이상의 용량을 포함하는 코스에 걸쳐 상기 화합물의 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 허혈성 사건이 일어난 피검자에서의 허혈증과 연관된 세포 집단에 대한 보호를 부여하는 방법.
  14. 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 약제학적 제형 내에 제공하는 단계; 및
    이러한 제형을 피검자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 피검자에게서 신경 변성 장애를 치료하는 방법.
  15. 제13항 또는 14항에 있어서, 상기 제형이 피하, 경피 및 정맥내로 이루어진 군에서 선택된 경로로 투여되는 방법.
  16. 제13항 또는 14항에 있어서, 단계 (b)가, 에스트로겐 화합물을 피하 주사하여 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제13항 또는 14항에 있어서, 단계 (b)가, 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 정맥내 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제13항 내지 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 에난티오머가Ent-17β-에스트라디올인 방법.
  19. Ent-17β-에스트라디올, 17-아세테이트를 포함하는 조성물.
  20. (A) 비실질적인 성별 관련된 활성을 가진 에스트로겐 화합물 또는 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 약제학적 제형 내에 제공하는 단계; 및
    (B) 이러한 제형을, 세포 집단에 세포 보호를 부여하기에 유효한 양으로 투여하는 단계
    를 포함하는, 남성 또는 여성 피검자에게서 세포 집단에 대한 세포 보호 효과를 부여하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 (a)가 유효량의 에스트로겐 화합물 또는 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 약제학적 제형 내에 제공하는 것을 추가로 포함하고; 단계 (b)가 변성 질환의 불리한 효과가 지연되도록 상기 제형을 피검자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 변성 질환이 급성 변성 질환 및 만성 변성 질환 중에서 선택되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 급성 변성 질환이 허혈증을 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 만성 변성 질환이 알츠하이머병으로 예시되는 신경 변성 질환 또는 골다공증으로 예시되는 골변성 질환을 포함하는 방법.
  25. 오일 함유 제형 중의 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 포함하는 약제학적 제형.
  26. 에스트로겐 화합물 또는 이의 에난티오머의 유효량을 선택하는 단계; 및
    이러한 유효량을 피하 투여하는 단계
    를 포함하는, 에스트로겐 화합물 또는 에스트로겐 화합물의 에난티오머를 투여하는 방법.
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