KR20010040407A - 돌연변이 피53에 의해 유발되는 디앤에이 변성의 억제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돌연변이 ｐ53이 유발하는 DNA 변성의 억제방법에 관한 것으로, 좀 더 자세하게는 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA에 결합하는 것을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 억제에 적합한 물질의 식별을 위한 시스템에 관한 것이다.

Description

돌연변이 피53에 의해 유발되는 디앤에이 변성의 억제방법{INHIBITION OF DNA MODULATION CAUSED BY MUTATED p53}

본 발명은 돌연변이 p53에 의해 유발되는 DNA 변성(modulation)을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 억제의 기능을 하는 물질(substance)을 식별하는데 사용가능한 시스템에 관한 것이다.

세포 내에는 p53 단백질이 존재하는데, 상기 단백질은 DNA가 손상된 경우에 활성화되어 활동하는 암 억제인자(tumor suppressor)이다. 암이 유발되었을 때 p53은 목표 유전자의 프로모터(promoters)에 결합하여 유전자의 전사(transcription)를 막는다. 결과적으로 세포의 성장이 정지되어 DNA 손상이 계속하여 복구되거나 또는 세포가 소멸되게 된다.

알려진 대로 많은 암에서는 p53이 돌연변이화 된 상태로 발견된다. 상기 돌연변이 p53은 그 자체로 암유발인자(oncogenic)의 특성을 띠고 존재하는데, 이러한 암유발인자(oncogenic)의 특성을 억제하기 위하여 현재까지 다양한 실험들이 행해지고 있으나 아직 만족스러운 결과는 얻지 못하고 있다.

도 1은 MARI DNA상에서 돌연변이 p53에 의해 발생된 DNA 가닥의 분리 현상을 나타낸다.

도 2는 MARII DNA상에서 돌연변이 p53에 의해 발생된 DNA 가닥의 분리 현상을 나타낸다.

도 3은 MAR5 DNA상에서 돌연변이 p53에 의해 발생된 복합체 형성을 나타낸다.

도 4는 MAR7, MAR8 DNA상에서 돌연변이 p53에 의해 발생된 복합체 형성을 나타낸다.

도 5는 MARI DNA상에서 돌연변이 p53에 의해 발생된 DNA 가닥의 분리의 억제를 나타낸다.

그러므로, 본 발명의 목적은 돌연변이 p53을 감지할 수 있으며, p53의 암 유발을 선택적으로 억제할 수 있는 결과물(product)을 제공하는 것이다.

본 발명의 청구항에서 정의된 물질에 의하여 상기 목적이 달성될 수 있다.

따라서, 본 발명의 물질(subject matter)은 분리될 가닥을 가진 DNA(DNA with strand separating potential)에 p53이 결합하는 것을 억제하는 것으로 구성되는 돌연변이 ｐ53이 유발하는 DNA 변성의 억제방법과 관련되어 있다.

본 발명은 정상형 p53이 아닌 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA의 변성을 유발할 수 있다는 본 발명자의 발견에 의한 것이다. 본 발명자들은 상기 분리될 가닥을 가진 DNA가 광범위하게 존재하며 특히, MAR(matrix attachment region) DNA에 높은 빈도로 존재함을 발견하였다. 상기 MAR DNA는 염색체에 높은 빈도로 나타나는 조절 인자(regulatory elements)로서, 이것에 의해 염색체가 위상학적으로 독립적인 루프들(loops)로 나뉘어지고, 시공간적으로 독립적인 조절에 의해 유전자의 발현 및 DNA의 복제가 이루어지는 것을 가능하게 한다. 본 발명자들은 또한 분리될 가닥을 가진 DNA가 AATATATTT의 염기서열 또는 그의 변이서열을 함유하고 있음을 발견하였으며, 부가적으로 AT 염기가 많이 존재하는 부분을 높은 빈도로 함유하고 있음을 발견하였다. DNA의 변성은 돌연변이 p53과 DNA의 강한 결합에 의한 복합체 및 분리된 가닥 자체로 나타날 수 있는데, 상기 기술된 AATATATTT 염기서열이 존재하고 그 주변의 서열이 AT 염기를 다수 함유할 경우에는 가닥이 분리되는 DNA 변성이 높은 빈도로 발생되는 반면 AT 염기가 존재하지 않거나 매우 낮은 빈도로 존재할 경우에는 돌연변이 p53과 DNA가 강한 복합체를 이루는 변성이 발생함을 확인하였다. 더욱이, 분리될 가닥을 가진 DNA에 p53이 결합하는 것을 억제하면 돌연변이 p53에 의한 DNA의 변성이 억제될 수 있음을 발견하였다.

이런 견지에서 본 발명은 돌연변이 ｐ53이 유발하는 DNA 변성의 억제방법을 개발하였으며, 상기 방법은 분리될 가닥을 가진 DNA에 돌연변이 p53이 결합하는 것을 억제하는 것으로 이루어진다.

본 발명에서 "돌연변이 p53"은 분리될 가닥을 가진 DNA에 결합가능한 p53 자체 또는 일부분을 의미한다. 특히, p53은 돌연변이화된 코어 도메인 및/또는 돌연변이화된 C-말단을 가질 수 있으며 상기 돌연변이 p53의 예로는 Pro273 p53 및 MethA p53이 있다. 돌연변이 p53은 또한 융합 단백질의 형태로 다른 단백질과 함께 존재할 수도 있다.

본 발명에서 "분리될 가닥을 가진 DNA"는 돌연변이 p53에 의해 변성될 수 있는 모든 DNA를 의미한다. 상기 변성은 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA와 강하게 결합한 복합체 또는 분리된 가닥 그 자체로 다르게 나타날 수 있다. 특히, 분리될 가닥을 가진 DNA 변성의 경우 염기서열에 AATATATTT 또는 이의 다양한 변이서열의 카피가 하나 또는 그 이상 존재하며, 부가적으로 AT 염기가 풍부한 부분을 가질 수도 있다. 상기 "분리될 가닥을 가진 DNA"는 MAR DNA에서 높은 빈도로 발견된다.

본 발명에서 "결합(bonding)"은 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA에 결합할 수 있는 모든 방식(kinds) 및 방법(way)을 의미한다. 상기 "결합"은 돌연변이 p53이 DNA에 직접적으로 결합하는 것을 의미할 수도 있으며, 또한, 상기 돌연변이 p53이 단백질 등의 여러가지 다른 요인들에 의해 간접적으로 DNA에 결합하는 것을 의미할 수도 있다.

본 발명에서 "억제(inhibition)"는 상기 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA에 결합되는 것이 억제될 수 있는 모든 방식 및 방법을 의미한다. 억제 방식은 돌연변이 p53이 DNA에 직접적으로 결합하는지 간접적으로 결합하는지의 여부에 따라 달라질 수 있는데, 단백질과 같은 다른 요인들에 의한 간접적인 결합의 경우, 상기 다른 요인들을 억제하는 물질들을 통해 억제가 일어날 수 있으며, 직접적으로 결합하는 경우에는 돌연변이 p53을 억제하는 물질을 사용하는 것이 보다 효과적일 것으로 예측된다. 상기에 언급된 물질들은 p53의 돌연변이화된 코어 도메인 및/또는 C-말단을 억제하는 물질이며, 예로는 항체 PAb 240 및 항체 PAb 421가 있다.

또한, 본 발명은 돌연변이 p53에 의한 DNA 변성을 억제하는데 매우 효과적인 상기 물질들을 식별하는 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 돌연변이 p53과 분리될 가닥을 가진 DNA의 결합 억제 효과의 시험을 통해 선택된 물질 뿐 아니라 돌연변이 p53 및 분리될 가닥을 가진 DNA도 포함한다. 상기 설명에 의한 시스템의 각 요소들은 상호 의존적며, 더욱이 참고문헌을 통해 DNA의 변성 및 그의 억제가 각각 공지의 방법에 의해 결정될 수 있음을 알 수 있었다.

예를 들면 DNA 가닥 분리, 돌연변이 p53과의 복합체 형성 및 그의 억제의 정도는 공지의 EMSA 테스트(Electrophoretic Mobility Shift Assay)에 의해 결정될 수 있다. 상기 목적을 위해서는, 돌연변이 p53을 분리될 가닥을 가진 표지된 이중 가닥 DNA와 함께 배양한 후, 단일 가닥 DNA의 형성, 그것의 복합체, 및 그것의 억제 정도를 시각화하기 위하여 상기 혼합물을 전기영동(electrophoresis)하여 분리한다.

본 발명의 수단에 의하면, 돌연변이 p53에 의한 DNA의 변성을 억제할 수 있다. 상기 억제는 돌연변이 p53와 분리될 가닥을 가진 DNA와의 견고한 결합 및 분리된 가닥 자체일 수 있다. DNA의 변성은 세포내 많은 과정에서 중요한 역할을 한다. 예를 들면 DNA 가닥의 분리는 유전자의 발현 및 DNA의 복제를 위해 반드시 필요한 과정이기 때문에 강력한 조절에 의하여 이루어진다. 그러나, 돌연변이 p53은 DNA 가닥의 분리의 조절을 무력화 시킴으로써 세포에 변성을 유도하여 암 등을 유발시킨다.

본 발명은 돌연변이 p53이 유발한 DNA 변성에 의한 질병의 경우에 치료 방법으로 사용하는 것이 가능하고, 특히 암 치료에 바람직하다. 더욱이, 본 발명은 돌연변이 p53에 의해 유발된 DNA 변성, 특히 암의 억제에 적합한 물질들을 식별하는 능력에 있어서 다른 것들과 뚜렷이 구별되며, 상기 물질들은 또한 본 발명의 주된 물질들이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 기술된다.

실시예: 돌연변이 p53에 의한 DNA의 변성 및 그의 억제

DNA의 변성은 각각 DNA 가닥의 분리 및 복합체 형성의 형태로 나타난다.

(a) 돌연변이 p53에 의한 DNA 가닥 분리 및 복합체 형성의 증폭

면역글로블린(immunoglobulin)의 헤비 체인에 해당하는 유전자의 인핸서 부분에 존재하는 997 bp의 Xba I IgE MAR 절편의 염기서열을 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 두 개의 MAR 부분을 만들었다. 상기 MAR 부분은 각각 인핸서의 3'-말단 근접 부분인 MAR I과 인핸서의 5'-말단 근접 부분인 MAR II로 지칭하였다. 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다.

MAR I IgH 인핸서 3'-말단 근접 부분

5'-AGTGTCTTTAATTTCTAATATATTTAGAAAACTGCG-3'

MAR II IgH 인핸서 5'-말단 근접 부분

5'-TTTTAACAATAATAAATTAAGTTTAAAATATTTGCG-3'

MARI은 전술된 AATATAATTT의 염기서열을 갖는다. MARII는 상기 염기서열이 변형된 서열을 나타내나 전반적으로 AT 염기가 많이 존재하는 것에는 변함이 없다.

또 다른 올리고뉴클레오타이드는 전반적으로 AT 염기가 감소된 MAR I의 변형서열로 합성되었으며, 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다.

MAR6 : ACTATGCTT

MAR7 : GCTCTCTTT

더욱이, 상기 올리고뉴클레오타이드에는 MARI의 염기서열과 함께 이웃하는 "GC 클램프"가 삽입되었으며 상기 "GC 클램프"에 의해 AT의 성격이 감소된다.

상기와 같이 합성된 올리고뉴클레오타이드는³²P로 말단이 표지되었고, 이중 가닥의 형태를 얻기 위해 접합(annealing) 단계를 수행하였다. 그 후 상기 DNA들은 각각 정상형 p53 및 돌연변이 p53인 MethA p53 및 Pro 273 p53와 함께 배양되었으며 배양이 끝난 후 EMSA 테스트를 수행하였다. 상기 목적을 위해 수행한 과정은 다음과 같다:

정상형 p53 및 돌연변이 p53인 MethA p53 및 Pro 273 p53을 함유하고 있는 혼합물을 10 mM 헵스(hepes; pH 7.8)에 녹아있는 2 ㎍ 폴리 dl:dc(비특이적 경쟁자); 50 mM KCl;1 mM EDTA; 5mM 염화마그네슘(MgCl₂); 10% 글리세린이 함유된 완충용액에서 20분간 배양하였다.

상기 전-배양 과정 후에 표지된 올리고뉴클레오타이드를 첨가하였고, 상기 혼합물은 상온에서 30분간 다시 배양하였다. 배양이 끝난 후 상기 혼합물들은 4% 폴리아크릴아마이드 겔에 3시간 동안 전기영동하였고 전기영동이 끝난 겔은 건조시켜 X선 필름에 노출시켜 그 결과를 확인하였다(도 1 내지 도 4 참조)

그 결과, MethA p53 및 Pro 273 p53 등의 돌연변이 p53은 분리될 가닥을 가진 DNA 상에서 가닥 분리 및 복합체 형성 등의 변성을 유발할 수 있음을 확인하였다.

(b) 돌연변이 p53에 의해 유발되는 DNA 가닥 분리의 저해

MethA p53 혼합물에 각각 항체 PAb 421 및 항체 PAb 240을 추가로 첨가한 것을 제외하고는 상기 (a)와 같은 방법으로 수행하였다. 올리고뉴클레오타이드는 MARI DNA가 포함된 것을 사용하였다(도 5 참조).

결과적으로, 항체 PAb 421 및 항체 PAb 240은 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA에 결합하는 것을 억제함으로써, 돌연변이 p53에 의한 DNA 가닥의 분리가 억제됨을 확인하였다.

Claims (23)

1. 돌연변이 p53과 분리될 가닥을 가진 DNA의 결합을 억제하는 것을 포함하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 변성은 돌연변이 p53 및 분리될 가닥을 가진 DNA의 강한 복합체인 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 변성은 분리될 가닥을 가진 DNA의 가닥이 분리되는 것임을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 p53은 돌연변이화된 코어 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 p53은 돌연변이화된 C-말단을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 가닥을 가진 DNA는 AATATATTT 염기서열 또는 그의 변이서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 변이서열은 AAAATATTT 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 가닥을 가진 DNA는 MAR DNA에 존재하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
9. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제는 p53의 돌연변이화된 코어 도메인을 억제하는 물질에 의해 일어나는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 물질은 항체 PAb240인 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
11. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제는 p53의 돌연변이화된 C-말단을 억제하는 물질에 의해 일어나는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 물질은 항체 PAb421인 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제는 p53의 돌연변이화된 코어 도메인 및 돌연변이화된 C-말단을 억제하는 물질에 의해 일어나는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 물질은 항체 PAb240 및 PAb421인 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 p53이 유발하는 DNA 변성은 질병의 치료시 억제되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 질병은 암 관련 질병인 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성의 억제방법.
17. 돌연변이 p53 및 분리될 가닥을 가진 DNA로 이루어지는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.
18. 제17항에 있어서, 상기 시스템은 또한, 돌연변이 p53이 분리될 가닥을 가진 DNA에 결합하는 것을 억제하는 효과가 시험된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 돌연변이 p53은 돌연변이화된 코어 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.
20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 돌연변이 p53은 돌연변이화된 C-말단을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.
21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 분리될 가닥을 가진 DNA는 MAR DNA에 존재하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.
22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리될 가닥을 가진 DNA는 AATATATTT 염기서열 또는 그의 변이서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.
23. 제22항에 있어서, 상기 변이서열은 AAAATATTT 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 ｐ53에 의해 유발되는 DNA 변성을 억제하는데 적합한 물질을 식별하는 시스템.