CN1289373A - 对由突变的p53导致的DNA调制的抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制由mutp53导致的DNA调制的方法,包括抑制mutp53与具有链分离势的DNA的结合。本发明还涉及用于鉴别适用于所述的抑制的物质的系统。

Description

对由突变的p53导致的DNA调制的抑制
本发明涉及对由突变的p53导致的DNA调制的抑制方法，本发明还涉及用于鉴别适用于这种抑制的物质的系统。
细胞中存在称为p53的蛋白质，这一蛋白是肿瘤抑制蛋白，其在DNA损伤时活化，然后其与靶基因的启动子结合并激活该基因的转录。结果是，细胞的生长停顿和随后DNA损伤的修复以及细胞死亡得以实现。
如以前所证实的，p53在许多肿瘤中发生突变。突变形式的p53通常没有肿瘤抑制蛋白活性，甚至其以具有致癌性质的蛋白质存在。已进行了各种实验抑制突变的p53(以下称为mut p53)的致癌性质。但是这些实验没有得到满意的结果。
因此，本发明的目的在于提供一种产物，通过其可以研究mutp53，并任选地抑制其致癌性质。
根据本发明，这一目的由权利要求书中限定的主题实现。
因此，本发明的主题涉及抑制由mut p53导致的DNA调制的方法，包括抑制mut p53与具有链分离势的DNA的结合。
本发明基于本申请人的发现，即mut p53而非野生型p53可以导致具有链分离势的DNA的调制。申请人发现，这种DNA是广泛分布的并通常存在于MAR DNA。MAR(“基质附着区”)DNA是指染色质的高级调节元件，通过其将染色质分成拓扑学独立的“环”，从而能对基因表达和DNA复制进行独立的空间和时序调节。申请人还发现具有链分离势的DNA经常包括序列AATATATTT或其变体。除了所述序列外，该DNA还经常包括富含AT的其它区域。另外，本申请人认识到DNA的调制可以是不同的，例如，mut p53与该DNA的牢固的复合物，或者其链分离。申请人发现当所指示的序列和任选地相邻序列全部由AT组成时，所述的调制通常是链分离。另一方面，如果在序列中不存在或仅存在较弱的全AT性质，则调制通常是牢固的复合物。另外，申请人发现，当mut p53与具有链分离势的DNA的结合被抑制时，由mut p53导致的DNA调制可被抑制。
根据本发明，这些观察被用于抑制由mut p53导致的DNA调制的方法中。这种方法包括抑制mut p53与具有链分离势的DNA的结合。
术语“mut p53”包括能与具有链分离势的DNA结合的任何p53或其一部分。具体地，p53可以是具有突变的核心区和/或突变的C-末端的p53。这种p53突变体的例子是Pro273 p53和MethA p53。mutp53也可以与另一种蛋白质共同存在于一种融合蛋白中。
术语“具有链分离势的DNA’包括可由mut p53调制的任何DNA。调制可以是不同的，例如mut p53和具有链分离势的DNA的牢固的复合物，或其链分离。特别是，具有链分离势的DNA可以是包括一或几个拷贝的序列AATATATTT或其变异序列的DNA。另外，该DNA也可进一步包括富含AT的区域。具有链分离势的DNA优选在MAR DNA中发现。
术语“结合”包括mut p53与具有链分离势的DNA结合的任何类型和方式。特别是结合可以是mut p53直接与DNA结合的方式。结合也可以是mut p53间接即通过其它因子如蛋白质与DNA结合。
术语“抑制”包括可以抑制mut p53与具有链分离势的DNA结合的任何类型和方式。抑制类型取决于mut p53是直接还是间接与DNA结合。在间接结合的情况下，即通过其它因子如蛋白质而结合，可通过抑制所述的其它因子的物质发生抑制。还可以加入抑制mut p53的物质。在mut p53直接结合DNA的情况下，采用抑制mut p53的物质似乎是实用的。这种物质可以是例如抑制p53的突变核心结构域和/或p53的突变的C-末端的物质。这种物质的例子是抗体PAb 240和PAb 421。
根据本发明，还提供了鉴别适用于抑制由mut p53导致的DNA调制的物质的系统。这种系统包括mut p53，具有链分离势的DNA以及任选地一种物质，该物质对mut p53与具有链分离势的DNA的结合的抑制效应被测试。对于该系统的各个单独组分，上述解释也相应地适用。另外，对DNA的调制及其抑制可用常规方法确定。例如，可以通过EMSA(“电泳迁移率变动分析”)测试确定DNA链分离和复合物形成以及其抑制。为此，常规地，将mut p53与具有链分离势的标记的双链DNA保温，并电泳分离该混合物，从而分别可见单链DNA的形成和其复合物的形成，以及其抑制。
通过本发明，可以抑制由mut p53导致的DNA调制。这种调制可以是mut p53与具有链分离势的DNA的牢固的复合物，或其链分离。DNA的调制在许多细胞过程中起重要作用。例如，DNA链分离是基因表达和DNA复制中的关键步骤。DNA链分离设置强对照，该对照由mut p53删除。因此，细胞退化的方式，即肿瘤形成的方式被了解。
通过本发明，可以对由mut p53导致DNA调制的疾病采取治疗步骤。这种疾病特别是肿瘤疾病。另外，本发明的特征在于提供了鉴别适用于抑制特别是在肿瘤中由mut p53导致的DNA调制的物质的可能性。这种物质也是本发明的一个主题。
附图的简要描述
图1示出在MARI DNA中由mut p53导致的DNA链分离。
图2示出在MARII DNA中由mut p53导致的DNA链分离。
图3示出在MAR5 DNA中由mut p53导致的复合物形成。
图4示出在MAR7和MAR8 DNA中由mut p53导致的复合物形成。
图5示出在MARI DNA中对由mut p53导致的DNA链分离的抑制。
本发明通过下述实施例详细描述。
实施例：由mut p53对DNA的调制及其抑制
DNA调制分别由DNA链分离和复合物形成的形式示出。
(a)由mut p53分别诱导DNA链分离和复合物形成
从位于免疫球蛋白重链基因的增强子区的997bp XbaI IgE MAR片段设计寡核苷酸形式的两个MAR区。它们是MARI，即增强子的3’-侧翼区，和MARII，即增强子的5’-侧翼区。这些寡核苷酸具有如下序列：
MARIIgH增强子3′-侧翼区
5′-AGTGTCTTTAATTTCTAATATATTTAGAAAACTGCG-3′
MARII IgH增强子5′-侧翼区
5′-TTTTAACAATAATAAATTAAGTTTAAAATATTTGCG-3′
MARI具有上述所示的序列AATATAATTT。MARII示出这一序列的变异，但全AT性质未变化。
另外，设计了具有MARI变异体的寡核苷酸，从而全AT性质降低。这些寡核苷酸具有如下序列：
MAR6：ACTATGCTT
MAR7：GCTCTCTTT
另外，设计了具有相邻“GC夹”的MARI序列的寡核苷酸，全AT性质由“GC夹”降低。
合成这些寡核苷酸，用32P末端标记，并进行退火反应，从而获得双链形式。然后将其分别与野生型p53和mut p53例如MethA p53hPro 273 p53保温，进行EMSA测试。为此，进行下述步骤：
分别含有野生型p53，MethA p53和Pro 273 p53的混合物与2微克Poly dl：dC(非特异性竞争剂)在10mM Hepes，pH7.8；50mM KCl；1mM EDTA；5mM MgCl2；10％甘油中预保温20分钟。
预保温后，加入标记的寡核苷酸，混合物在室温保温30分钟。之后，混合物在4％天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳3个小时，然后干燥凝胶并放射自显影(见图1-4)。
如图所示，对于具有链分离势的DNA,mut p53，例如MethA p53或Pro 273 p53可导致DNA调制，例如链分离或复合物形成。
(b)对由mut p53导致的DNA链分离的抑制
进行上述(a)中所述的步骤，只是MethA p53的混合物还含有抗体PAb 421或PAb 240。所用寡核苷酸是含有MARI DNA的寡核苷酸(见图5)。
如图所示，通过能抑制mut p53与具有链分离势的DNA的结合的产物，如抗体PAb 421或PAb 240，可以抑制mut p53诱导的链分离。

Claims (23)

1、抑制由mut p53导致的DNA调制的方法，包括抑制mut p53与具有链分离势的DNA的结合。
2、权利要求1的方法，其中所述的调制是mut p53与具有链分离势的DNA的牢固的复合物。
3、权利要求1的方法，其中所述的调制是具有链分离势的DNA的链分离。
4、权利要求1-3任一项的方法，其中mut p53具有突变的核心结构域。
5、权利要求1-3任一项的方法，其中mut p53具有突变的C-末端。
6、权利要求1-5任一项的方法，其中具有链分离势的DNA包括序列AATATATTT或其变异序列。
7、权利要求6的方法，其中所述的变异序列包括序列AAAATATTT。
8、权利要求1-7任一项的方法，其中具有链分离势的DNA存在于MAR DNA中。
9、权利要求1-4和6-8任一项的方法，其中抑制通过能抑制p53的突变的核心结构域的物质进行。
10、权利要求9的方法，其中所述的物质是抗体PAb240。
11、权利要求1-3和5-8任一项所述的方法，其中抑制通过能抑制p53的突变的C-末端的物质进行。
12、权利要求11的方法，其中所述的物质是抗体PAb421。
13、权利要求1-8任一项的方法，其中抑制通过能抑制p53的突变的核心结构域和突变的C-末端的物质进行。
14、权利要求13的方法，其中所述的物质是抗体PAb240和PAb421。
15、权利要求1-14任一项的方法，其中在疾病的治疗中由mutp53导致的DNA调制被抑制。
16、权利要求15的方法，其中所述的疾病是肿瘤疾病。
17、一种鉴别适用于抑制由mut p53导致的DNA调制的物质的系统，包括mut p53和具有链分离势的DNA。
18、权利要求17的系统，其中该系统还包括一种物质，其对mutp53与具有链分离势的DNA的结合的抑制效应被测试。
19、权利要求17或18的系统，其中mut p53具有突变的核心结构域。
20、权利要求17或18的系统，其中mut p53具有突变的C-末端。
21、权利要求17-20任一项的系统，其中具有链分离势的DNA存在于MAR DNA中。
22、权利要求17-21任一项的系统，其中具有链分离势的DNA包括序列AATATATTT或其变异序列。
23、权利要求22的方法，其中所述的变异序列包括序列AAAATATTT。
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