KR20010034727A - 리포솜 조성물 및 퀴놀론의 투여 방법 - Google Patents

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Abstract

박테리아 감염 치료용 리포솜 조성물이 기재되어 있다. 조성물은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜 및 아미노산에 결합된 퀴놀론 화합물을 포함하는 포획 약물-결합체을 포함한다.

Description

리포솜 조성물 및 퀴놀론의 투여 방법 {LIPOSOME COMPOSITION AND METHOD FOR ADMINISTERING A QUINOLONE}
리포솜은 여러가지 치료제를 위한 담체로서 제안되어 왔다. 리포솜을 이용하는 약물 수송 시스템은 혈액 순환 시간의 증가, 세포 독성의 감소, 약물 방출지속, 및 선택된 조직에 대한 적합성을 포함하여, 향상된 수송성의 가능성을 부여한다.
약물 수송을 위한 리포솜을 이용하는데 있어서, 통상 리포솜을 높은 캡슐화 약물 농도로 로딩하는 것이 바람직하다. 리포솜 포획형에서 약물 수송의 이점을 유지하기 위해, 리포솜으로부터 약물의 유출 속도는 또한 느려야 한다.
여러가지 약물 로딩법이 포획된 약물을 가지고 리포솜을 제조하기 위해 이용가능하다. 많은 친유성 약물의 경우, 효과적인 약물 포획은 예컨대 건조 필름 내에서 소포 형성 지질 및 약물의 혼합물을 제조하고, 혼합물을 수화시켜, 소포의 지질 이중층 상 내에 주로 포획된 약물을 가지고 리포솜을 형성함으로써 달성될 수 있다. 약물의 분배 계속가 지질상을 선호한다고 가정하면, 고로딩 효능 및 안정한 약물 유지가 이루어질 수 있다.
동일한 형태의 수동 로딩은, 또한 캡슐화된 친수성 화합물을 가지고 리포솜을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 약물은 통상 소포 형성 지질의 지질 필름을 수화시키기 위해 사용되는 수성 매질 내에 용해된다. 수화 조건 및 약물의 성질에 따라, 통상 약 5 -20 % 의 캡슐화 효능이 얻어지고, 약물의 잔류물은 벌크 수성상 내에 존재한다. 비캡슐화 약물을 제거하기 위한 부가 처리 단계가 통상 요구된다.
유기 용매로부터의 역 증발을 수반하는, 캡슐화 친수성 약물을 위한 더 효과적인 방법이 또한 보고되어 있다 (Szoka 등, 1980). 상기 접근법에서, 친수성 약물 및 소포 형성 지질의 혼합물은 수중유 유화액 내에 유화된 후, 용매 제거되어, 불안정한 지질 단일층 겔을 형성한다. 통상 첨가된 수성상의 존재 하에, 겔이 교반되는 경우, 겔은 붕괴되어, 고캡슐화 (50 % 까지) 된 약물을 가진 올리고라멜라 리포솜을 형성한다.
이온화가능 친수성 또는 양쪽친화성 약물의 경우, 막횡단 이온 구배에 반하여, 약물을 리포솜에 로딩함으로써 훨씬 더 큰 약물 로딩 효능을 얻을 수 있다 (Nichols 등, 1976; Cramer 등, 1977). 통상 원격 로딩이라 명명되는 상기 로딩법은, 통상 내부가 낮고 외부가 높은 이온 구배, 종종 pH 구배를 갖도록 제조된 리포솜의 현탁액에 그것을 첨가함으로써 로딩되는, 이온화가능한 아민기를 갖는 약물을 포함한다.
그러나, 원격 로딩이 가진 문제들이 인식되는데, 한 가지는 모든 이온가능한 약물이 이온 구배에 반응하여 리포솜에 축적되지는 않는다는 것이다 (Chakrabarti 등, 1995; Madden 등, 1990). 다른 문제는 리포솜에 축적되는 일부의 제제가 축적 후 즉시 방출된다는 것이다. 또 다른 문제는, 시험관 내에서 리포솜 내에 성공적으로 로딩 및 유지되는 일부의 제제가, 생체 내에서 리포솜 포획형으로 제제를 투여하는 것의 이점이 사라지고, 리포솜으로부터의 빠른 유출 속도를 갖는 것이다.
[발명의 개요]
일면에서, 본 발명은 박테리아 감염의 치료용 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 소포 형성 지질 및 1 - 20 몰 % 의 친수성 중합체로 유도체화된 지질로 이루어진 리포솜, 및 리포솜으로 포획된, 아미노산에 공유 결합된 퀴놀론 화합물을 포함하는 항박테리아 활성을 갖는 약물-결합체를 포함하는 조성물이다. 상기 아미노산은 리포솜 내의 퀴놀론 화합물의 유지에 비해 리포솜 내의 약물-결합체의 유지를 증가시키는데 효과적이다.
한 구현예에서, 퀴놀론 화합물은 플루오로퀴놀론이고, 다른 구현예에서, 퀴놀론 화합물은 6-플루오로퀴놀론이다. 다른 구현예에서, 6-플루오로퀴놀론은, 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신, 로메플록사신, 플레록사신, 페플록사신 및 아미플록사신으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 글리신, 세린 및 트레오닌으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 퀴놀론은 시프로플록사신이고, 아미노산은 시프로플록사신의 피페라진 고리에 공유 결합되었다.
다른 구현예에서, 리포솜 조성물 내의 친수성 중합체는 1,000 - 5,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 리포솜 조성물의 제조 방법을 포함한다. 그 방법은 첫 번째 이온 농도를 갖는 내부 수성상을 갖도록 리포솜을 제조하고, 벌크상 매질 내에서 첫 번째 이온 농도보다 더 큰 두 번째 이온 농도를 갖는 리포솜을 배양하는 것을 포함하고, 상기 벌크상은 약물-결합체를 포함하는 방법이다.
한 구현예에서, 상기 첫 번째 낮은 이온 농도 및 상기 두 번째 높은 이온 농도가 각각, 첫 번째 및 두 번째 pH 값을 정하는 수소 이온 농도이고, 첫 번째 pH 가 약 4.5 - 7.5 로서, 외부 벌크상 매질의 두 번째 pH 보다 2 pH 이상 더 낮다.
다른 구현예에서, 리포솜은 주로 약 37 ℃ 초과의 상 전이 온도를 갖는 지질로 형성되고, 배양은 실질적으로 리포솜 형성 지질의 상 전이 온도 초과의 온도에서 수행된다.
다른 구현예에서, 상기 첫 번째 및 두 번째 pH 값은 내부가 높고 외부가 낮은 암모늄 이온 구배에 기인한 pH 구배를 나타낸다.
다른 구현예에서, 내부 수성상 내의 약물-결합체의 수용성을 감소시키는데 효과적인 짝이온을 갖는 암모늄염에 의해 구배가 형성된다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은, 본 발명의 하기 상세한 설명을 도면과 함께 병용하여 읽을 경우, 더욱 충분히 이해될 것이다.
본 발명은 박테리아 감염 치료용 퀴놀론의 투여를 위한 조성물, 더욱 특히 아미노산에 공유 결합된 퀴놀론의 약물-결합체의 투여를 위한 리포솜 조성물에 관한 것이다.
[참고자료]
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Zalipsky, S., STEALTH LIPOSOMES, D. Lasic 및 F. Martin 편집, CRC Press, 제 9 장 (1995).
도 1A 는 퀴놀론 항생제 화합물의 일반 구조를 나타내고;
도 1B 는 6-플루오로-퀴놀론 화합물의 일반 구조를 나타내고;
도 1C 는 6-플루오로-퀴놀론 시프로플록사신의 구조를 나타내고;
도 2A - 2D 는 본 발명에서 사용하는데 적절한 기타 6-플루오로-퀴놀론을 나타내고;
도 3 은 시프로플록사신의 아미노산 아미드의 제조를 위한 일반 반응식을 나타내고;
도 4A - 4D 는 시프로플록사신-글리신 (도 4A), 시프로플록사신-리신 (도 4B), 시프로플록사신-트레오닌 (도 4C) 및 시프로플록사신-류신 (도 4D) 을 포함하여, 본 발명을 위해 제조되는 전형적인 시프로플록사신-이미노산 결합체를 나타내고; 도 5A - 5B 는 α-아미노카프로일 시프로플록사신 (도 5A) 및 ε-아미노카프로일 시프로플록사신 (도 5B) 의 구조를 나타내고;
도 6 은 이온 구배에 반하여 리포솜 내로 시프로플록사신-아미노산 결합체를 로딩하는 경우의 이온화 발생을 설명하고;
도 7 은 리포솜으로 포획된 글리시닐-시프로플록사신 (■), 리포솜으로 포획된 시프로플록사신 (●) 및 유리 글리시닐-시프로플록사신 (◇) 및 유리 시프로플록사신 (▲) 을 랫트에 투여한 후, 혈장 내에 남아있는 약물의 백분율을 나타내는 도면이다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 그 안에 포획된 시프로플록사신-아미노산 결합체를 갖는 리포솜 조성물을 제공한다. 하기 단락 I 은 전형적인 결합체 및 그것의 제조를 기재하고, 단락 II 는 리포솜의 제조 및 리포솜 내 결합체의 로딩을 기재하고 있다. 단락 III 에서는, 2 개의 전형적인 결합체를 포함하는 리포솜이 시험관 내 및 생체 내에서 특징지워진다.
I. 퀴놀론-아미노산 결합체
퀴놀론은 도 1A 에 나와 있는 것처럼, 일반적인 4-피리돈-3-카르복실산 구조의 합성 항생제의 한 계열이다. 도면에 나와있는 일반 구조에서, X 는 N 또는 C 이고, R1, R2, R5, R6, R7및 R8은 임의의 기일 수 있다. 퀴놀론 계열의 약물의 일부 원, 예컨대 나리딕스산은 여러 해 동안 이용되어왔다. 최근의 구조 활성 관계는 항균 활성을 갖는 수많은 퀴놀론의 합성을 야기하였고 (Culbertson 등, 1990; Domagala 등, 1986; Hagen 등, 1990, 1991; Klopman 등, 1993; Sanchez 등, 1988), 그러한 화합물들의 합성은 당업자에 의해 즉시 수행될 수 있다.
상기 구조-활성 관계의 부분으로서, 플루오르화된 퀴놀론이 도입되었고, 플루오르화된 제제는 넓은 항미생물활성을 가지고, 매우 다양한 감염 질환의 치료에 대해 경구 투여 후 효과적이므로, 그 유도체는 계열 내의 이전의 원(member)에 비해 치료적 이점을 제공한다. 이 화합물은 또한 상대적으로 적은 부작용을 가지고, 그것의 작용에 대한 미생물의 내성이 빨리 발생하지 않는다. 6-플루오로퀴놀론의 일반 구조는 도 1B 에 나와 있다.
6-플루오로-퀴놀론은 널리 연구되었고, 많은 구조 변형체가 알려졌으며, 그 중 많은 것이 본 발명에서의 사용에 적절하다. 도 1B 를 다시 계속 참조하여, 6-플루오로-퀴놀론은, 통상 R1은 C1내지 C3알킬기, 예컨대 하나 이상의 위치가 F, Cl 또는 Br 로 치환된 메틸, 에틸, 프로필 또는 시클로프로필이고; R7은 바람직하게는 이온화가능한 아미노기를 포함하는, 직쇄, 측쇄 또는 고리화 질소 함유 알칸이고; 전형적인 R7치환체는 고리 구조, 예컨대 1-아제티딜, 1-피페라지닐, 4-메틸-1-피페라지닐, 4-에틸-1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 1-피롤리딜을 포함하고, 그것의 각각은 NH2, NHCH3, N(CH3)2, 2-아미노에틸, 에틸아미노메틸, 1-피롤리딜 또는 아미노에틸아미노메틸기로 치환될 수 있고, 기타 전형적인 포화 및 불포화된 질소 복소환은 모노시클릭 복소환, 예컨대 이미다졸, 이미다졸린, 디히드로피롤, 1,2,3,6-테트라히드로피리딘, 1,4,5,6-테트라히드로피리미딘, 피롤리딘, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 1,3,5-트리아진 및 비시클릭 복소환, 예컨대 퍼히드로인돌, 퍼히드로퀴놀린, 퍼히드로이소퀴놀린, 퍼히드로-7-아자인돌, 퍼히드로-4-아자벤즈이미다졸, 1,5-디아자비시클로[4.3.0]노넨 (DBN), 1,8-디아자비시클로[5.5.0]운데스-7-엔 (DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]노넨, 1,8-디아자비시클로[5.5.0]운데칸, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄 (트리에틸렌디아민), 3-아자비시시클로[3.2.2]노난, 3-아자비시클로[4.3.0]노난, 3-아자비시클로[3.3.0]옥탄, 2,8-디아자비시클로[4.3.0]노난, 5-디아자비시클로[4.3.0]노난, 1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데스-5-엔, 2,7-디아자스피로[4.4]노난을 포함하고; X 는 N 또는 C 이고, X 가 N 인 경우, R8은 존재하지 않으며, X 가 C 인 경우, R8은 H, F, Cl 또는 CF3, OCH3또는 OCH2CH3이거나, R1및 R8은 함께 퀴놀론 고리 중 1 및 8 고리 원자를 연결하는 2- 또는 3-원자 알킬 또는 알콕시 가교를 포함하여, 각각 5- 또는 6-원환을 형성한다. 시스- 및 트랜스-입체이성체가 가능한 경우, 양 이성체가 고려된다. 비대칭 키랄 중심이 존재하는 경우, 화합물은 단일 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물, 통상 라세믹 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용에 고려되는 일부의 전형적인 6-플루오로-퀴놀론은 도 5A - 5D 에 나와 있다.
일부의 더욱 잘 알려진 6-플루오로-퀴놀론으로는 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신, 로메플록사신, 플레록사신, 페플록사신 및 아미플록사신을 들 수 있다. 상기 중, 시프로플록사신 (1-시클로프로필-6-플루오로-1,4-디히드로-4-옥소-7-(1-피페라지닐)-3-퀴놀린 카르복실산) 은 가장 강력한 것 중 하나이고, 그것의 구조는 도 1C 에 나와 있다. 기타 퀴놀론과 마찬가지로, 시프로플록사신은 박테리아의 DNA 복제를 억제함으로써 작용한다. 약물은, 수퍼코일이 이완되고 재형성되게 하는 DNA 복제에 필수적인 효소인, DNA 선회효소의 β-단위체에 결합하고, 그것의 활성을 효과적으로 억제한다 (Salyers 등, 1994). 시프로플록사신은 R1에 시클로프로필 고리, R7에 피페라진 고리를 포함하고, 이것은 pKa 가 약 8.7 인 이온화가능한 아민을 포함한다. 그 약물은 대부분의 그람 음성 및 일부의 그람 양성 병원성 박테리아에 대해 효과적이다. 그러나, 항균제 및 많은 기타 퀴놀론 화합물의 치료 효능은 4 시간의 짧은 소실 반감기에 의해 제한되고, 이것은 혈 중 치료 농도를 유지하기 어렵게 만든다.
상기 기재된 바와 같이, 약물의 리포솜 내의 포획은 약물의 치료 효능을 향상시키기 위한 한 가지 접근법이고, 시프로플록사신의 포획이 기재되어 있다 (Ryan 등, 1991; Wong 등, 1995, Hope 등, 1996). 그러나, 리포솜으로 포획된 시프로플록사신은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 갖는 장기 순환(long-circulating) 리포솜의 생체내 분포의 확장을 얻기 위해 충분한 시간 동안 리포솜 내에서 유지되지 않는다. 이것은, 원격 로딩에 의한 리포솜 내 시프로플록사신의 포획 및 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜의 제조를 기재하고 있는, 비교예 1 에서 입증된다. 혈장 내 리포솜으로부터 방출되는 시프로플록사신의 양을 측정하기 위해, 시프로플록사신 함유 리포솜을 시험관 내에서 시험하였다 (비교예 1B). 37 ℃ 에서 24 시간 동안 혈장 내 배양한 후, 1 시간 이내에 방출된 약물 40 % 와 함께, 약물의 85 % 가 리포솜으로부터 유출된 것이 발견되었다.
장기 순환 리포솜은 혈류 중 24 시간 동안까지 남아 있다. 여기에 사용되는 "장기 순환" 리포솜은, USP 번호 제 5,013,556 호에 기재된, 폴리에틸렌 글리콜 코팅된 리포솜과 같은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜을 명명한다. 수 시간 내에 혈류로부터 소실되는, 통상의 리포솜, 예컨대 중합체 사슬의 코팅이 결여된 리포솜에 반하여, 장기 순환 리포솜의 주입 용량의 10 % 까지는 주입 24 시간 후, 혈류 내에 남아 있다. 따라서, 장기 순환 리포솜은, 통상의 리포솜이 투여 후 빨리 축적되는, 단핵 식세포계 또는 망상내피계 이외의 기관 및 조직을 포함하는 생체 내의 분포를 달성한다 (Paphadjopoulos 등, 1991). 명백하게, 리포솜 이중층을 가로지르는 약물의 유출로 인해 수 시간 내에 시프로플록사신의 로딩의 반 이상을 방출하는 시프로플록사신-리포솜 조성물은, 장기 순환 기간 및 장기 순환 리포솜의 우수한 생체분포의 이점을 갖지 않는다.
본 출원인은 아미노산에 결합된 시프로플록사신은 리포솜 내에 로딩되어, 시프로플록사신보다 훨씬 더 오랫동안 리포솜 내에서 유지될 수 있다는 것을 발견하였다. 이에, 본 발명은 포획 화합물의 우수한 생체분포 및 지속 방출을 달성하기 위해, 장기 혈액 순환 기간의 이점을 가질 수 있는, 시프로플록사신 결합체를 포함하는 리포솜 조성물을 제공한다.
시프로플록사신-아미노산 결합체에 의해 예시된 바와 같이, 퀴놀론-아미노산 결합체의 제조를 위한 합성 반응 도식이 도 3 에 나와 있고, 실시예 2 에 기재되어 있다. 통상, 퀴놀론의 3-카르복시기는 당분야에 공지된 임의의 수의 카르복시 보호기에 의해 보호되고 (Greene 등, 1991), t-부틸 에스테르는 도 3 에 나와 있다. 그 후, 보호된 퀴놀론은 농축제의 존재 하에서 N-보호된 염기성 아미노산과 반응하여, 퀴놀론 내의 임의의 일차 또는 이차 아미노기, 예컨대 시프로플록사신의 피페라진 고리의 이차 아미노기가, 아미드 결합에 의해 염기성 아미노산의 알파 카르복실기에 결합된다. 그 후, 생성되는 보호 아미드 결합체는 리포솜 내로의 로딩에 선행하여 탈보호된다. 아미드 결합은 화학적으로 안정하나, 리소자임에 의해 생체 내에서 절단된 후, 대식세포에 의해 리포솜이 섭취된다.
본 발명을 지지하는 연구에서, 시프로플록사신은 도 3 의 도식에 따라, 다음 아미노산, 글리신, 리신, 트레오닌 및 류신에 결합된다. 상기 시프로플록사신-아미노산 결합체의 구조는 도 4A - 4D 에 나와 있고, 여기서 도 4A 는 시프로플록사신-글리신을 나타내고, 도 4B 는 시프로플록사신-리신을 나타내고, 도 4C 는 시프로플록사신-트레오닌을 나타내고, 도 4D 는 시프로플록사신-류신을 나타낸다. 하기 기재되는 것처럼, 글리시닐-시프로플록사신 및 리시날-시프로플록사신은 리포솜 내에 포획되고, 시험관 내에서 혈장 유출 및 생체 내에서 혈액 순환 기간이 테스트되었다.
상기 언급된 것과 같이, 본 발명은 결합체가 리포솜 포획형으로 투여되는 경우, 결합체가 치료 효능에 적절한 항균 활성을 유지하는 한, 임의의 아미노산을 임의의 퀴놀론 화합물과 배합하여 사용하는 것을 고려한다. 한 구현예에서, 바람직한 아미노산은 직쇄 또는 측쇄 지방족 R 기를 갖는 것, 예컨대 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신 및 아르기닌이다. 다른 구현예에서, pKa 가 9.0 을 초과하는 아미노산이 바람직하다. 예컨대, 글리신, 알라닌 및 류신 내의 NH3와 연관된 pKa 값은 각각, 9.6, 9.7 및 9.6 이다. 리신 및 아르기닌은 R 기 내에 이차 아미노기를 갖는 삼양자성 (triprotic) 이다. 리신 내의 아미노기에 대한 pKa 값은 8.95 및 10.53 이고, 아르기닌에 대한 pKa 값은 9.04 및 12.48 이다 (Lehninger).
리포솜 내에 안정적으로 포획되고, 리포솜의 생체분포에 따라 생체분포에 충분한 시간을 유지하는 퀴놀론을 제공하기 위한 본 발명의 일반적 개념은, 시프로플록사신과 함께 상기 연구들에서 예시된 바와 같이, 임의의 퀴놀론 화합물에 적용가능한 것으로 여겨진다. 통상, 약 9.0 초과의 pKA 값을 갖는 임의의 퀴놀론 또는 6-플루오로퀴놀론이, 사용에 적절하고, 퀴놀론은 9.0 초과의 pKa 를 갖는 부분을 포함하거나, 상기 기재된 바와 같이, 실재하는 화합물이 9.0 초과의 pKa 를 갖는 부분을 포함하도록, 아미노산 또는 기타 화합물을 사용하여 변형될 수 있는 것으로 여겨진다.
또한, 원하는 증가된 리포솜 유지를 위해, 퀴놀론 화합물은 아미노산 이외의 리간드를 사용하여 변형될 수 있다고 여겨진다. 예컨대, 시프로플록사신은 α-아미노카프르산 (pKa 9.6) 및 ε-아미노카프르산 (pKa 10.5) 를 사용하여 변형되어, α-아미노카프로일-시프로플록사신 (도 5A) 및 ε-아미노카프로일-시프로플록사신 (도 5B) 을 형성한다.
II. 리포솜 조성물
상기 기재된 시프로플록사신-아미노산 결합체는 리포솜 내에 포획되며, 여기서 "포획된" 은 리포솜의 중심 수성 구획 내, 리포솜 지질 이중층 사이 수성 공간 내 또는 이중층 그 자체 내에, 가두어진 화합물을 말한다. 이 단락은 원격 로딩에 의해 본 발명의 약물 결합체를 포획하는 데 사용되는 리포솜의 제조를 기재하고 있다.
A. 리포솜 성분
본 발명의 리포솜은 통상, 소수성 꼬리기 및 극성 머리기를 갖는 양쪽친화성 지질을 포함하는, 소포 형성 지질로 이루어진다. 소포 형성 지질의 특징은, (a) 인지질에 의해 예시되는 것과 같이, 자발적으로 물 속에서 이중층 소포로 형성되거나, (b) 내부의 이중막의 소수성 영역과 접촉하는 소수성 부분, 및 외부의 막의 극성 표면을 향하는 극성 머리기를 가짐으로써, 지질 이중층으로 안정적으로 혼입되는 능력이다. 본 발명에서의 사용을 위한 소포 형성 지질은 상기 기재된 특성 중 한 가지를 갖는 임의의 통상의 지질이다.
상기 형태의 소포 형성 지질은, 바람직하게는 2 개의 탄화수소 꼬리 또는 사슬, 통상 아실기, 및 극성 머리기를 갖는 것이다. 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티드산 (PA), 포스파티딜글리세롤 (PG) 및 포스파티딜이노시톨 (PI) 이 이 계열에 포함되고, 여기서 2 개의 탄화수소 사슬은 통상 약 14 - 22 탄소 원자를 길이로 하고, 다양한 불포화도를 갖는다. 바람직한 인지질로는 PE 및 PC 를 들 수 있다. 전형적인 PC 는 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC) 이다. 단일 사슬 지질, 예컨대 스핑고미엘린 (SM) 이 또한 사용될 수 있다.
아실 사슬이 다양한 포화도를 갖는 상기 기재된 지질 및 인지질은, 시장에서 구입하거나, 공개된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있는 기타 지질은 당지질이다. 여기서 사용되는 "당지질" 이라는 용어는, 그 중 하나가 스핑고신의 탄화수소 사슬인, 2 개의 탄화수소 사슬, 및 하나 이상의 슈거 잔기을 갖는 지질을 나타낸다.
본 발명에서의 사용을 위한 지질은, 지질상이 상대적으로 낮은 지질 용융 온도, 예컨대 실온 이하의 온도를 갖는 것을 의미하는, 상대적으로 "유동성인" 지질이거나, 선택적으로는 지질이 상대적으로 높은 용융점, 예컨대 50 ℃ 까지의 온도를 갖는 것을 의미하는 상대적으로 "굳은" 지질일 수 있다. 일반적으로, 더욱 굳은, 즉 포화된 지질은, 지질 이중층 구조에 더욱 큰 막강도를 부여하고, 이에 활성 약물 로딩 후 더욱 안정적인 약물 유지에 기여한다. 이러한 형태의 바람직한 지질은 약 37 ℃ 초과의 상 전이 온도를 갖는 것이다.
리포솜은 주로 인지질로 이루어진 리포솜 또는 소포를 안정화할 수 있는 지질을 부가 포함할 수 있다. 이러한 군으로부터 가장 빈번하게 사용되는 지질은 25 내지 45 몰 % 수준의 콜레스테롤이다.
본 발명에 사용되는 리포솜은, 몰 % 기준으로 표현하여, 바람직하게는 30 - 75 % 의 인지질, 바람직하게는 포스파티딜콜린 (PC), 25 - 45 % 의 콜레스테롤, 및 1 - 20 % 의 중합체 유도체화된 지질을 포함한다. 한가지 전형적인 리포솜 제형물은, 50 몰 % 의 포스파티딜콜린 및 45 몰 % 의 콜레스테롤 및 5 몰 % 의 중합체 유도체화된 지질, 하기 기재될, mPEG-DSPE 를 포함한다.
본 발명의 리포솜은 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 포함한다. "표면 코팅" 은 리포솜의 표면 상에 임의의 친수성 중합체의 코팅을 말한다. 친수성 중합체는, 리포솜 조성물 내에 친수성 중합체 사슬로 유도체화된 하나 이상의 소포 형성 지질을 포함함으로써, 리포솜 내에 포함된다. 사용가능한 소포 형성 지질은 첫 번째 소포 형성 지질 성분에 대해 상기 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있으나, 디아실 사슬을 갖는 소포 형성 지질, 예컨대 인지질이 바람직하다. 한 가지 바람직한 인지질은, 활성화된 중합체에 커플링하기에 편리한 반응성 아미노기를 포함하는 포스파티딜에탄올아민 (PE) 이다. 한가지 전형적인 PE 는 디스테아릴 PE (DSPE) 이다.
소포 형성 지질에 커플링하여 사용하기에 바람직한 친수성 중합체는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 사슬이 바람직하게는 1,000 - 10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 1,000 - 5,000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 이다.
적절한 기타 친수성 중합체로는, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필메트아크릴아미드, 폴리메트아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 및 유도체화된 셀룰로오스, 예컨대 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시에틸셀룰로오스를 들 수 있다.
적절한 지질, 예컨대 PE 에 결합된 상기 중합체를 포함하는 지질-중합체 결합체의 제조는, 예컨대 명백히 참조로 여기에 포함된, USP 번호 제 5,395619 호 및 Zalipsky 의 [STEALTH LIPOSOMES (1995)] 에 기재되어 있다. 통상, 약 1 - 20 몰 % 의 중합체 유도체화된 지질이 리포솜 형성시 리포솜 형성 성분 내에 포함된다.
친수성 중합체 사슬은 코팅의 부재시에 리포솜의 혈액 순환 시간을 연장시키기에 충분한 친수성 사슬의 표면 코팅을 제공한다. 혈액 순환 시간의 증가 정도는, 명백히 참조로 여기에 포함된 USP 번호 제 5,013,556 호에 기재된 것과 같이, 중합체 코팅의 부재시에 얻어지는 것에 비해 여러배이다.
또한, 리포솜은 표면기, 예컨대 항제 또는 항체 단편, 세포 표면 수용체와 상호작용하기 위한 작은 작동체 분자, 항원, 및 특정 세포 집단에 원하는 표적 결합성을 얻기 위한 기타 화합물을 포함하도록 제조될 수 있다. 리포솜 내 포함된 지질 성분은 표적 분자를 사용하여 유도체화된 지질, 또는 공지의 방법에 따라, 미리 형성된 리포솜 내의 표적 분자를 사용하여 유도체화될 수 있는 극성 머리 화학기를 갖는 지질을 포함할 것이다.
B. 이온 구배 리포솜의 제조
상기 논의된 바와 같이, 약물의 높은 내부 농도를 갖는 리포솜은 원격 로딩에 의해 제조될 수 있다. 이 기술에서, 약물은 이온 구배, 통상 리포솜 이중층을 가로지르는 pH 구배에 반응하여 리포솜의 중심 구획 내에 축적된다. pH 구배를 갖는 리포솜의 제조 및 약물의 로딩이 본 단락에 기재된다.
원하는 이온 구배를 갖는 리포솜은 여러가지 기술에 의해 제조될 수 있다. 통상의 절차에서, 리포솜 형성 지질의 혼합물은 적절한 유기 용매 내에 용해되고, 용기 내에서 증발되어, 얇은 필름을 형성한다. 그 후, 그 필름은 하기 논의되는 바와 같이, 최종 리포솜 제조시에, 리포솜 내부 공간에 수성상을 형성할, 용질 종을 포함하는 수성 매질로 덮여진다. 지질 필름은 수화되어, 통상 약 0.1 내지 10 미크론의 불균일한 크기를 갖는 다중라멜라 소포 (MLVs) 를 형성한다.
리포솜 형성 후, 소포는 정립되어, 공지된 방법에 따라 선택된 범위 내에서 리포솜의 크기 분포를 얻을 수 있다. 리포솜은 바람직하게는 0.04 내지 0.25 ㎛ 의 선택된 크기 범위로 균일하게 정립된다. 통상 0.04 내지 0.08 ㎛ 범위의 작은 단일라멜라 소포 (SUVs) 는, 리포솜의 집중적인 초음파처리 또는 동종화 (Martin 등, 1990) 에 의해 제조될 수 있다.
약 0.08 내지 0.4 미크론의 선택된 범위의 크기를 갖는 균일하게 정립된 리포솜은, 0.03 내지 0.5 미크론, 통상 0.05, 0.08, 0.1 또는 0.2 미크론의 선택된 균일한 세공 크기를 갖는 폴리카르보네이트 막 또는 기타 정의된 세공 크기 막을 통한 압출에 의해 제조될 수 있다. 막의 세공 크기는, 특히 제제가 동일한 막을 통해 2 회 이상이 압출되는 경우, 막을 통한 압출에 의해 제조되는 가장 큰 크기의 리포솜과 대체로 일치한다.
정립은 바람직하게는 본래의 지질 수화 완충액에서 수행되어, 리포솜 내부 공간이 초기 리포솜 처리 단계를 통해 매질을 유지하도록 한다.
정립 후, 리포솜의 외부 매질은, 통상 내부가 낮고 외부가 높은 농도 구배인, 리포솜 막을 가로지르는 이온 구배를 형성하도록 처리된다. 이것은 여러가지 방법, 예컨대 (i) 외부 매질을 희석시킴, (ii) 원하는 최종 매질에 대한 투석, (iii) 예컨대 세파덱스 (Sephdex) G-50 을 사용하여, 원하는 매질에 대한 분자체 크로마토그래피, 또는 (iv) 원하는 최종 매질 내의 펠렛화된 리포솜의 고속 원심분리 및 재현탁에 의해 수행될 수 있다.
선택되는 외부 매질은, 하기 고려될, 원하는 외부 pH 및 구배 형성의 메커니즘에 의존할 것이다.
pH 구배를 생성하기 위한 가장 단순한 접근법에서, 수화 정립된 리포솜은 선택된 내부 매질 pH 를 갖는다. 리포솜의 현탁액은 원하는 최종 pH 에 도달할 때가지 적정되거나, 상기와 같이 처리되어, 원하는 외부 pH 를 갖는 것과 외부상 완충액을 교환한다. 예컨대, 본래의 매질은 선택된 완충액, 예컨대 글루탐산염 또는 인산염 완충액에서 5.5 의 pH 를 가질 수 있고, 최종 외부 매질은 동일하거나 상이한 완충액 내에서 8.5 의 pH 를 가질 수 있다. 내부 및 외부 매질은 바람직하게는 완충액, 염, 또는 저분자량 용질, 예컨대 수크로오스의 농도를 적절히 조절함으로써, 대략 동일한 삼투압을 갖도록 선택된다.
다른 일반적인 접근법에서, 구배는 선택된 이온투과담체를 리포솜 내에 포함함으로써 제조된다. 설명을 위해, 리포솜 이중층 내에 발리노마이신을 포함하도록 제조된 리포솜이 칼륨 완충액 내에서 제조되고, 정립된 후, 나트륨 완충액과 교환되어, 내부가 칼륨이고 외부가 나트륨인 구배를 형성하였다. 교대로 내부에서 외부로의 칼륨 이온의 이동은, 아마도 리포솜 막을 가로지르는 순 음전하에 반응하여 리포솜 내로의 양성자의 이동으로 인해, 내부가 낮고 외부가 높은 pH 구배를 형성한다 (Deamer 등, 1972).
다른 더욱 바람직한 접근법에서, 약물 로딩에 사용되는 양성자 구배는 예컨대, USP 번호 제 5,192,549 호에 기재된 바와 같이, 리포솜 막을 가로지르는 암모늄 이온 구배를 형성함으로써 만들어진다. 여기서, 리포솜은 적절한 pH, 예컨대 5.5 내지 7.5 에서, 암모늄염, 통상 0.1 내지 0.3 M 암모늄염, 예컨대 황산암모늄을 함유하는 수성 완충액 내에서 제조된다. 리포솜 형성 및 정립 후, 외부 매질은 암모늄 이온이 없는 것, 예컨대, 동일한 완충액이지만, 황산암모늄이 리포솜의 내부 및 외부에 동일한 삼투압을 제공하는 NaCl 또는 슈거로 대체되는 것과 교환된다.
리포솜 형성 후, 리포솜 내부의 암모늄 이온은 암모니아 및 양성자와 평형을 이룬다. 암모니아는 리포솜 이중층을 통과하고, 리포솜 내부로부터 빠져나갈 수 있다. 암모니아가 빠져나가는 것은 리포솜 내의 평형을 양성자를 생성하는, 우측으로 이동시킨다.
암모늄 이온 구배는 상기에 주어진 또 다른 2 개의 접근법에 비해 활성 약물 로딩에 많은 이점을 제공한다. 그것들 중 하기를 들 수 있다:
i. 이 시스템은 약물 로딩에 대해 양성자를 생성하여, 약물을 로딩하는 능력이 양성자의 초기 농도 또는 초기 pH 구배에 의해 제한되지 않도록 할 수 있다. 즉, 비양성자형인 약물 분자가 리포솜 내로 포획되고 양성자화되는 경우, 리포솜 내의 양성자의 손실은, 로딩된 약물의 양과 무관하게 상대적으로 일정한 수준에서 양성자의 농도를 유지시키면서, 암모늄/암모니아 평형을 암모니아 및 양성자 생성으로 옮긴다. 단지, 리포솜 내의 초기 암모늄 이온 농도는 최종 로딩된 약물 농도의 실질적인 몰 과다량인 것이 요구된다.
ii. 이 시스템은 암모늄/암모니아 평형이 암모니아 생성으로 이동되는 경우, 신규 생성된 양성자와 함께 막 바깥으로 확산됨으로써 손실될 수 있는 양성자와 대체되면서, 리포솜 저장시 배터리처럼 작용할 수 있다.
iii. 암모늄염의 짝이온, 예컨대 황산염 짝이온은 약물이 로딩되면서, 침전을 일으키거나 불용성 착체를 형성하는 능력에 의해, 약물 로딩을 더 증가시킬 수 있다.
C. 리포솜 로딩
상기와 같이 형성된 리포솜은 본 발명의 시프로플록사신-아미노산 화합물을 로딩하는데 사용된다. 이 방법에서, 화합물은 pH 구배 리포솜의 현탁액에 첨가되고, 현탁액은 화합물을 외부 매질로부터 리포솜 내부로 통과시키기에 효과적인 조건하에서 처리된다. 약물 로딩을 위해 적절한 배양 조건은, (i) 유도체화된 화합물을 비하전형인 것과 함께 리포솜 내로 확산시키고, (ii) 바람직하게는 높은 약물 로딩 농도, 예컨대 50 - 200 mM 의 캡슐화된 약물로 만드는 것이다.
로딩은 바람직하게는 리포솜 지질의 상 전이 온도 초과의 온도에서 수행된다. 따라서, 주로 포화 인지질로 형성되는 리포솜에 있어서, 로딩 온도는 60 ℃ 이상일 수 있다. 로딩 기간은, 리포솜 이중층 막에 대한 유도체화된 약물의 투과도, 온도, 및 리포솜 지질 및 약물의 상대 농도에 의존하며, 통상 15 - 120 분이다.
도 6 은 이온 구배를 갖는 리포솜 내로의 약물의 로딩의 메커니즘을 설명한다. 도면은 내부가 높고 외부가 낮은 암모늄 이온 농도로 인한 내부가 낮고 외부가 높은 pH 구배 및 이중층 막 12 를 갖는 리포솜 10 을 나타낸다.
외부 리포솜 환경, 예컨대 리포솜 현탁액 매질 또는 벌크상 매질에서, 약물-결합체 (Q-NH2로 표시됨) 는 그것의 양성자화된 아미노형과 평형을 이루고 있으며, 평형 균형은 선택된 외부 pH 와 일치한다. 통상, 내부 pH 는 4.5 - 7.5 이고, 통상 6.5 - 9.5 인, 외부 pH 보다 약 2 pH 단위 더 낮다.
약물의 중성 형태는 리포솜 로딩시에 배양 조건 하에서 리포솜 이중층을 투과할 수 있고, 리포솜 외부의 비하전된 약물은 리포솜 내부의 비하전된 약물과 평형을 이루고 있다. 중성 약물이 리포솜 이중층을 투과하는 경우, 그것은 리포솜 내부에 축적된 양성자의 과다량에 의하여 양성자화된다. 약물의 양성자화된, 하전형은 용이하게 리포솜 이중층을 투과하지 못하고, 이에 약물이 리포솜 내에 축적된다.
리포솜 내부의 약물의 양성자형은 예컨대 암모늄염 내의 황산염 짝이온과 같은 짝이온과 착체 또는 침전물을 형성할 수 있다. 이러한 경우, 화합물은, 포획될 수 있는 화합물의 농도 및 약물 포획의 안정도가 증가하면서, 더욱 포획된 상태로 움직인다. 여러가지 암모늄염 짝이온 중 유도체화된 화합물의 용해도는, 착체 형성을 유발할 짝이온을 선택하기 위해, 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
리포솜 농도, 첨가되는 화합물의 외부 농도 및 pH 구배를 적절히 선택하면서, 본질적으로 모든 화합물이 리포솜 내에 로딩될 수 있다. 예컨대, 3 단위의 pH 구배 (또는 암모늄 이온 구배를 이용하는 구배력) 를 사용하여, 약물의 최종 내부 : 외부 농도는 약 1000 : 1 일 것이다. 계산된 내부 리포솜 부피 및 로딩된 약물의 최대 농도를 인지한 후, 리포솜 내에 실질적으로 완전한 로딩을 유발하는 외부 매질 내의 많은 약물을 선택할 수 있다.
선택적으로, 약물 로딩이 실질적으로 유리 약물의 외부 매질을 고갈시키는데 효과적이지 않으면, 리포솜 현탁액이 처리된 후, 약물 로딩되어, 비캡슐화 약물을 제거시킨다. 유리 약물은 예컨대 분자체 크로마토그래피, 투석 또는 원심 분리에 의해 제거될 수 있다.
III. 리포솜 조성물의 특성
상기 기재된 바와 같이, 글리시닐-시프로플록사신은 실시예 2A - 2B 에 나와 있는 것과 같이 제조되고, 실시예 2C 에 기재된 바와 같이, 시험관 내에서 항미생물 활성이 테스트되었다. 박테리아 균주 S. 피로게네스 (S. pyrogenes), E. 파에칼리스 (E. faecalis), S. 아우레우스 (S. aureus), E. 콜리 (E. coli) 및 P. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 에 대한 약물의 최소 억제 농도가 측정되었다. 그 결과는 표 1 에 나와 있고, 시프로플록사신과 비교하였다.
시프로플록사신 및 글리시닐-시프로플록사신의 활성
약물 최소 억제 농도(㎍/ml)
S. 피로게네스 E. 파에칼리스 S. 아우레우스 E. 콜리 P. 아에루기노사
시프로 ＜ 0.5 1.0 1.0 ＜ 0.5 ＜ 0.5
G-시프로 4 32 32 8 ＞ 512
글리시닐-시프로플록사신의 더 큰 MICs 에 의해 입증되는 것과 같이, 글리신을 사용한 시프로플록사신의 유도체화는 약물의 강도의 약간의 손실을 가져온다. 그러나, 강도의 손실은 장기 순환 리포솜에 의해 제공되는 더 나은 생체분포에 의해 상쇄되고, 이로써, 동효능을 제공하기 위해 더 적은 약용량을 필요로 한다.
실시예 2D 에 기재된 바와 같이, 리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신 및 리시닐-시프로플록사신의 시험관 내 혈장 유출이 측정되었다. 간단히, 글리시닐-시프로플록사신 또는 리시닐-시프로플록사신을 포함하는 리포솜은 37 ℃ 에서 24 시간 동안 랫트 혈장 내에서 배양되었다. 24 시간 배양 기간의 종결시, 유리 약물의 존재에 대해 혈장을 분석하였다. 리포솜-포획 리시닐-시프로플록사신 또는 리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신 중 어느 것에 대해서도, 혈장 내에서 유리 약물이 검출되지 않았다. 리포솜 분획으로부터 약물의 회수 백분율은 리포솜-포획 리시닐-시프로플록사신에 대해 93 %, 리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신에 대해 100 % 였다.
이와 대조적으로, 비교예 1 에 대해 상기 논의된 바와 같이, 약물의 85 % 가 리포솜으로부터 유출된, 순 시프로플록사신은 24 시간 배양 기간 후에 혈장 내에 회수되었다. 명백하게, 시프로플록사신에 대한 아미노산 변형은 리포솜 내 약물의 유지를 증가시키는데 효과적이다.
리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신의 생체 내 혈액 순환 기간은 랫트에서 측정되고, 리포솜-포획 시프로플록사신 및 유리 글리시닐-시프로플록사신 및 유리 시프로플록사신과 비교되었다. 실시예 2E 에 기재된 바와 같이, 16 마리의 랫트를 4 개의 시험군으로 나누고, 각 군의 4 마리의 동물에 상기 제형물 중의 하나인 약물을 30μM/kg 으로 포함하면서, 정맥내 보러스(bolus) 주입하였다. 혈장 중 약물 농도는 시간의 함수로 측정하였고, 그 결과는 도 7 에 나와 있다.
도면에서 보이는 바와 같이, 리포솜으로 포획된 글리시닐-시프로플록사신 투여 후 혈장 내에 남아있는 약물의 백분율 (■) 은, 리포솜으로 포획된 시프로플록사신 투여 후 혈장 내에 남아있는 약물의 백분율 (●) 보다 훨씬 크다. 24 시간 후, 리포솜으로 포획된 글리시닐-시프로플록사신으로서 투여되는 경우, 약물의 용량의 30 % 초과량이 혈중에 남아있다. 이와는 대조적으로, 리포솜-포획 시프로플록사신에 있어서는, 4 시간 후, 거의 모든 약물이 혈액으로부터 소실되었다. 유리 글리시닐-시프로플록사신 (◇) 및 유리 시프로플록사신 (▲) 은 1 시간 미만에 혈액으로부터 소실되었다.
PEG 표면 코팅을 갖는 리포솜 내에 포획된 글리시닐-시프로플록사신의 혈장 반감기는 약 24 시간인 것으로 측정되었다. 이것은 리포솜 그 자체와 대략 동일하며, 생체 내에서 약물이 리포솜 내에서 유지된다는 것의 지표이다. 이것은 또한, 유리 글리시닐-시프로플록사신이 약 30 분 후 혈액으로부터 소실된다는 사실에 의해 뒷받침된다. 이와는 대조적으로, PEG 의 표면 코팅을 갖는 리포솜 내에 포획된 시프로플록사신은 약 1 시간의 혈액 순환 반감기를 갖는다. 유리 시프로플록사신은 약 30 분 후 소실된다. 이러한 경우, 리포솜은 24 시간 동안 순환 중에서 유지될 수 있는 반면, 시프로플록사신은 더욱 빨리 소실되며, 이것은 약물이 생체 내에서 리포솜으로부터 유출되는 것을 나타낸다.
이러한 관찰은 퀴놀론을 적절히 변형시킴으로써, 예컨대 아미노산을 사용한 유도체화 또는 필요한 pKa 값을 갖는 실재하는 퀴놀론의 신중한 선택을 통해 퀴놀론의 아민 강도를 증가시킴으로써, 또는 신규 퀴놀론 약물 또는 유사체를 합성함으로써, 리포솜 내의 약물의 유지를 향상시키는 것이 가능하다는 것을 입증한다.
리포솜 내의 유지를 증가시키기 위해, 퀴놀론의 pKa 값은 선택된 퀴놀론의 다른 특성들, 예컨대 화합물의 용해도 및 확산 계수와 결합하여 작용할 수 있는 것으로 또한 여겨진다.
본 발명의 리포솜 조성물은, 미코박테리움(Mycobacterium) 감염, 특히 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), M. 칸사실 (M. kansasil), M. 제노피 (M. xenopi), M. 포르투이툼 (M. fortuitum) 및 M. 아비움-M. 인트라셀룰라 (M. avium-M. intracellular) 착체의 치료를 포함하는 여러가지 박테리아 감염의 치료에 사용될 수 있다.
리포솜-포획 퀴놀론 화합물로 치료가능한 다른 상태로는 만성 피부 감염, 예컨대 와창 (decubitus ulcer) 또는 욕창을 들 수 있다. 리포솜 포획형의 투여는 리포솜의 장기 순환 시간이 약물 수송 리포솜을 감염 및 염증 부위에 축적시키는 장점을 제공한다.
다약제 내성 결핵은 리포솜 포획형의 투여로부터 이점을 얻는, 퀴놀론 제제로 치료되는 또 다른 상태이다. 이것은, 종종 대식 세포에 존재하는 결핵균이 활동적으로 PEG-코팅된 리포솜을 섭취하여, 감염 부위에 약물의 농축을 가져오기 때문이다.
다른 상태로는, 그람 음성 슈도모나스 (Pseudomonas) 에 의해 유발되는 폐 감염, 만성 골 감염 및 대식 세포 거주 미코박테리움에 관련된 상태를 들 수 있다.
IV. 실시예
하기 비교예 및 실시예는 리포솜의 제조, 시프로플록사신-아미노산 결합체의 제조 및 리포솜 내의 결합체의 로딩을 설명한다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
비교예 1
시프로플록사신 함유 리포솜의 제조 및 특성
A. 리포솜 제조 및 로딩
661.1 mg 의 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), 220.5 mg 의 콜레스테롤 및 디스테로일 포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE) 으로부터 유도체화된 220.5 mg 의 폴리에틸렌 글리콜을 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내의 10ml 에 클로로포름에 용해시킴으로써, 폴리에틸렌 글리콜의 표면 코팅을 갖는 리포솜을 제조하였다. 건조될 때까지 감압 하에서 순간증발기를 사용하여, 클로로포름을 제거하였다. 플라스크 표면 상의 얇은 지질 필름에 pH 5.5 의 250 mM 황산암모늄 용액 15 ml 를 첨가하고, 60 ℃ 에서 약 30 분간 진탕함으로써 용액 내에 지질을 분산시켰다. 수득된 다중라멜라 소포를 200 - 400 psig 의 압력 하에서 스테인리스강 압출 셀을 사용하여 0.4 ㎛ 세공 크기의 누클레오포어 (Nucleopore) 폴리카르보네이트 필터를 통해 6 회, 0.1 ㎛ 폴리카르보네이트 필터를 통해 6 회, 및 0.05 ㎛ 폴리카르보네이트 필터를 통해 3 회 압출하였다. 압출 공정은 60 ℃ 에서 수행되었다. 압출 공정 후의 리포솜은 100 ±30 nm 의 평균 직경을 가졌다. 그 후, 10 % 수크로오스 4 리터에 대해 리포솜을 밤새 투석하여, 4 ℃ 에서 외부 황산암모늄을 제거하였다.
10 % 수크로오스 수용액에 시프로플록사신 HCl 분말을 용해시킴으로써 40 mg/ml 의 시프로플록사신 원액을 제조하였다. 40, 20, 10 또는 5 mg/ml 의 시프로플록사신 용액과, 총 지질 농도 80 mg/ml 에서 상기 기재된 바와 같이 제조된, 동일한 부피의 리포솜을 혼합함으로써 활성 약물 로딩을 수행하였다. 혼합물을 60 ℃ 에서 30 분간 배양하였다. 배양 후, 혼합물을 냉각조에서 즉시 냉각시켰다. 나누어진 샘플을 취하고, 세파덱스 G-50 컬럼 (1.0 × 19 cm) 을 사용함으로써 약물 로딩의 백분율을 구하였다. 지질/약물비가 2, 4, 8 및 16 인 리포솜 제형물에 대한 약물 로딩의 백분율은 각각 49 %, 75 %, 90 % 및 91 % 였다.
B. 시험관 내 시프로플록사신의 혈장 내로의 방출
지질/약물비가 8 이고 시프로플록사신 로딩이 75 % (리포솜 내 약 75 mg/ml) 인 리포솜 제형물을 랫트 혈장으로 1/50 으로 희석하고, 37 ℃ 에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양의 종결 시에, 혈장 0.5 ml 를 세파로스 (Sepharose) CL-4B 컬럼에 로딩하였다. 약 45 개의 1 ml 분획을 수집하고, 리포솜성 및 유리 약물 분획을 모았다. 모은 분획을 메탄올 및 1 N HCl 용매 (9:1 v/v) 을 1:4 희석액으로 사용하여 추출하였다. 이것을 연속적으로 원심분리하여, 침전된 혈장 단백질을 스핀 다운하고, 상층액을 C-19 컬럼을 사용하여, 역상 HPLC 로 분석하였다. HPLC 이동상은 pH 2.3 인 85 % 25 mM 인산나트륨 완충액 및 15 % 아세토니트릴이었다.
24 시간 후 리포솜으로부터 유출된 시프로플록사신의 백분율은 85 % 였다.
실시예 2
글리시닐-시프로플록사신 및 리시닐-시프로플록사신의 제조
A. 글리시닐-시프로플록사신 및 리시닐-시프로플록사신의 합성
N-TBOC 보호 아미노산을 시장에서 구입하였다. 화합물을 염화메틸렌 중 10 % 과량의 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 및 동몰량의 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜, N-히드록시숙신이미드 에스테르를 수득하였다.
에스테르를 건조 용매 중 1 몰의 건조 카르복실-보호 시프로플록사신 HCl 및 2 몰의 트리에틸아민으로 처리하여, 아미노산의 TBOC 보호 시프로플록사신 아미드를 수득하였다.
시프로플록사신-아미드는 트리플루오로아세트산으로 탈보호시킨 후, 생성물의 물리 및 화학적 성질에 대해 적절한 방법에 의해 분리하였다. 예컨대, L-트레오닌-시프로플록사신을 pH 7 로 수용액의 pH 를 조정함으로써 회수하여, 결정질 결합체를 분리시켰다. L-류신-시프로플록사신의 결합체를 pH 7-8 수용액으로부터 1-부탄올로 추출한 후, 메탄올로부터 재결정화하여 회수하였다. L-리신-시프로플록사신의 유도체를 포스포텅스텐산 및 수산화바륨으로 처리하여 포스포텅스테이트로 전환시킨 후, 묽은 황산으로 처리하여 그것의 황산염으로 전환시켰다.
양성자 NMR 분광기를 사용하여, 회수된 생성물을 확인하였다.
B. 리포솜 제조 및 로딩
비교예 1 에서 상기 기재된 바와 같이, 585 mg 의 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), 261 mg 의 콜레스테롤 및 210 mg 의 PEG-DSPE (예컨대 Zalipsky (1995) 에 기재된 바와 같이 제조됨) 를 용해시킴으로써, 하기 조성을 갖는 리포솜을 제조하였다 : 50 % HSPC, 45 % 콜레스테롤 및 5 % mPEG-DSPE.
시프로플록사신-글리신 및 시프로플록사신-리신 약물 결합체를, 하기 농도로, 상기 기재된 바와 같이, 원격 로딩을 통해 리포솜 내에 로딩하였다.
약물 결합체 약물:지질비(mg/ml/mM) 지질 농도 36 mg/ml 에서 약물 농도 로딩 % 내부 리포솜 약물 농도 (mg/ml)
리신-시프로 2.5:50 1.825 73 13.1
글리신-시프로 5:50 5 75 37.5
C. 항미생물 활성
시프로플록사신, 글리시닐-시프로플록사신 및 리시날-시프로플록사신의 항미생물 활성을 S. 피로게네스, E. 파에칼리스, S. 아우레우스, E. 콜리 및 P. 아에루기노사에 대해 측정하였다. 5 × 105CFU/ml 의 출발 접종물을 사용하여, 임상 실험 기준 지침 국제 위원회 (NCCLS 문헌 M7-A, 실험 기준 국제 위원회, 빌라노바, PA, 1994 "호기성 박테리아에 대한 희석 항미생물 감수성 시험법" 에 대한 입증된 기준) 에 따른 액체배지 미소희석 기법에 의해 최소 억제 농도를 구하였다. 시프로플록사신 및 글리시닐-시프로플록사신에 대한 결과가 표 1 에 나와 있다.
D. 시험관 내 혈장 유출 속도
리시닐-시프로플록사신 및 글리시닐-시프로플록사신을 포함하는 리포솜을 랫트 혈장을 사용하여 1/10 및 1/100 으로 각각 희석하고, 37 ℃ 에서 24 시간 동안 배양하였다. 약물-결합체의 유출을 상기 비교예 1B 에 나와 있는 방법에 의해 측정하였다. 24 시간 배양의 종결시, 리포솜-포획 리시닐-시프로플록사신 또는 리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신 중 어느 것에 대해서도 유리 약물이 검출되지 않았다. 리포솜 분획으로부터 약물의 회수 백분율은 리포솜 포획된 리시닐-시프로플록사신에 대해 93 % 이고, 리포솜 포획된 글리시닐-시프로플록사신에 대해서 100 % 였다.
E. 생체 내 혈액 순환 기간
리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신 및 리포솜-포획 시프로플록사신의 혈장 체류 시간을 랫트에서 구하였다. 16 마리의 랫트를 4 개의 시험군으로 나누고, 각 군 당 4 마리의 동물에 리포솜-포획 글리시닐-시프로플록사신 또는 리포솜-포획 시프로플록사신 또는 유리 글리시닐-시프로플록사신 또는 유리 시프로플록사신의 일회 정맥내 보러스 주입으로 약물을 30 ㎍/kg 투여하였다.
꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 취하고, 혈장 내 약물 농도를 메탄올 추출한 후, HPLC 분석에 의해 구하였다. 그 결과가 도 7 에 나와 있다.
비록 본 발명은 특정 구현예에 대해 기재되었지만, 본 발명으로부터 분리되지 않고, 여러가지 변화 및 변형이 만들어질 수 있다는 것이 당업자들에게 명확할 것이다.

Claims (13)

  1. 소포 형성 지질 및 1 - 20 몰 % 의 친수성 중합체로 유도체화된 지질로 이루어진 리포솜, 및
    리포솜으로 포획된, 아미노산에 공유 결합된 퀴놀론 화합물을 포함하는 약물-결합체
    를 포함하는 박테리아 감염의 치료용 조성물로서, 상기 아미노산이 리포솜 내의 퀴놀론 화합물의 유지에 비해 리포솜 내의 약물-결합체의 유지를 증가시키는데 효과적인 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 퀴놀론 화합물이 플루오로퀴놀론인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 퀴놀론 화합물이 6-플루오로퀴놀론인 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 6-플루오로퀴놀론이 시프로플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 스파르플록사신, 로메플록사신, 플레록사신, 페플록사신 및 아미플록사신으로부터 선택되는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 글리신, 세린 및 트레오닌으로부터 선택되는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 퀴놀론 화합물이 시프로플록사신인 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 아미노산이 시프로플록사신의 피페라진 고리에 공유 결합된 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 친수성 중합체가 1,000 - 5,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 첫 번째 이온 농도를 갖는 내부 수성상을 갖도록 리포솜을 제조하고; 벌크상 매질 내에서 첫 번째 이온 농도보다 더 높은 두 번째 이온 농도를 갖는 리포솜을 배양하는 것을 포함하는 리포솜 조성물의 제조 방법으로서, 상기 벌크상 매질이 상기 약물-결합체를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 첫 번째 낮은 이온 농도 및 상기 두 번째 높은 이온 농도가 각각, 첫 번째 및 두 번째 pH 값을 정하는 수소 이온 농도이고, 첫 번째 pH 가 약 4.5 - 7.5 로서, 외부 벌크상 매질의 두 번째 pH 보다 2 pH 이상 더 낮은 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 리포솜이 주로 약 37 ℃ 초과의 상 전이 온도를 갖는 소포 형성 지질로 형성되고, 배양이 실질적으로 리포솜 형성 지질의 상 전이 온도 초과의 온도에서 수행되는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 pH 값이, 내부가 높고 외부가 낮은 암모늄 이온 구배로 인한 pH 구배를 나타내는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 구배가 내부 수성상 내의 약물-결합체의 용해도를 감소시키는데 효과적인 짝이온을 갖는 암모늄염에 의해 형성되는 방법.
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