KR20010033249A - 신경보호제 - Google Patents

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KR20010033249A
KR20010033249A KR1020007006679A KR20007006679A KR20010033249A KR 20010033249 A KR20010033249 A KR 20010033249A KR 1020007006679 A KR1020007006679 A KR 1020007006679A KR 20007006679 A KR20007006679 A KR 20007006679A KR 20010033249 A KR20010033249 A KR 20010033249A
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애슬리 프린글
마크 브래들리
라스 에릭 선드스트롬
파우스토 이아노티
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유니버시티 오브 사우스앰톤
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Abstract

화학식(I)로 표시되는 실질적으로 순수한 화합물:
상기 화학식(I)에서,
Q는 아미디노(amidino) 그룹, 시아노(cyano) 그룹 또는 화학식 XYN- 그룹을 나타내며(X, Y는 수소 원자 또는 다양한 그룹을 포함);
Ra는 알킬렌(alkylene)을 나타내고; Rb및 Rc는 각각 알킬렌을 나타내고, 알케닐렌(alkenylene) 그룹을 나타내며, 상기 Rb및 Rc직쇄에서의 총 탄소 원자의 수는 7이고;
R2및 R3는 각각은 수소 원자 또는 화학식 R, RCO-, ROCO-, 또는 RNHCO- 그룹을 나타내며,
여기서 R은 저급의 알킬 그룹 또는 아릴(aryl) 그룹이고;
별표(asterisk)로 표시된 키랄(chiral) 탄소 원자는 L 구조이고;
Z는 방향족 아미노산 잔사이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 수소 원자, 저급 알킬 그룹 또는 아릴 그룹이고;
W는 수소 원자, 알킬 또는 아릴 그룹을 나타내고;
약학적으로 수용되는 그의 염은 국소빈혈로 유발될 수 있는 신경손상을 보호할 수 있다.

Description

신경보호제{NEUROPROTECTIVE AGENTS}
본 발명은 신경보호제에 관한 것이다. 장기간의 저산소증이나 허혈의 경우에 저혈당증의 관련유무를 떠나 다양한 신경손상의 위험이 있다.
허혈은 심장마비동안에 통상 발생하는데, 이때 발생하는 손상은 실질적으로 심장 조직에 제한되어 특정 치료법이 발달되어왔다. 본 발명은 발작 환자나 뇌 손상의 결과 발생하는 장기간의 뇌 허혈 결과에 관한 것이다. 허혈의 심각성은 발작이나 손상에 달려있으나, 항상 뇌 손상이 존재하며, 이것이 바로 본 발명이 다루고자 하는 것이다.
뇌 손상 문제를 경감하기 위한 다양한 신경보호제가 당업계에 알려져 있지만, 현재 알려진 모든 약물들은 부작용과도 관련이 있다. 예를 들어, MK801(dizocilpine maleate)는 상당히 단순한 분자로 허혈 환자의 신경을 보호하는 것으로 알려져 있다. 그러나, MK801은 운동신경의 부작용뿐만 아니라 '항정신성 부작용'("alarming psychotropic effects") (Martindale)과 관계가 있다. 신경보호 효능은 레퍼런스로 언급된 뇌 연구 (Brain Research) 755(1997) 36-46(Pringle, A,K., et al)에 상세히 나와 있다. 저자들은 초기 논문에서 코노톡신(conotoxin)의 신경보호 효능에 대해 설명했으나, 이 화합물의 신경보호 효능에도 불구하고, 생체내 부작용이 발견되었다.
최근 연구들은 스페르미딘(spermidine)에 관련된 일련의 폴리아민(polyamine) 화합물에 관한 것으로, 양이온 채널 조절 물질제로서의 상세한 용도에 대한 언급이 WO93/12777에 기재되어 있다. 이 화합물들은 양이온 채널을 가진 세포막을 가로지르는 양이온 이동을 조절하는데 관한 것으로, 이 화합물들은 직쇄 폴리아민에 연결된 리진(lysine) 계 또는 아르기닌계 성분(arginine-based moiety) (또는 구아니딘계 성분)을 가진 폴리아민 화합물이다. NMDA 수용체(receptor)에 대한 효과도 언급되었다. 다른 화합물들이 칼륨이나 나트륨 채널에서 효능을 갖는 반면, 다양한 화합물이 P-타입 칼슘채널에 영향을 미칠 수 있을지라도 양이온 채널에서의 상기 화합물들의 효능은 예측할 수 없다. 상기 화합물들이 칼슘 채널에서의 효능에 대한 연구에 계속적으로 사용되어 왔지만, 퓨널-웹 스파이더 톡신(funnel-web spider toxin)으로부터의 FTX라고 알려진 물질이 극히 소량으로도 쥐에게 독성이 있는 것으로 발표한 Proc. Natl. Acad. Sci. USA[86, 1689-1693(1989), Llinas, R, et al]의 논문이 마지막이었다.
본 발명가들은 리나스(Llinas)와 그의 동료들에 의한 연구를 몰랐지만, 칼슘 채널 차단 활성을 가진 것으로 알려진 유사 화합물을 찾고 있었다. 사실 발견된 것은 칼슘 채널 차단 활성이 심각하지 않다는 것뿐만 아니라, NMDA 수용체에 거의 영향을 미치지 않는다는 것이었다. 더욱이, 초기 연구에도 불구하고 이 화합물들은 비독성이며 실질적인 신경보호 효능을 가지고 있는 것이 입증되었다.
초기 결과와 현재 결과의 불일치는 바로 화합물 제조에 있는 것으로 여겨진다. 특히 퓨널-웹 스파이더 톡신으로부터의 FTX 화합물은 별도로 제조되기보다는 선행기술에서 상기 톡신으로부터 특정하게 분리되었다. 이 화합물들은 현재 하기 화학식 (1)을 갖는 것으로 생각된다.
관련 화합물들은 최종 제품에 불순물이 거의 검출되지 않는 여기서 설명된 방법으로 합성 제조되었다. 다양한 분석에서 화합물들이 칼슘 채널에 영향을 거의 미치지 않을뿐더러 비독성이라는 점에서 결과는 매우 놀라운 것이었다. 사실 P-타입 칼슘 채널에 실질적으로 영향을 미치거나/또는 화합물들이 독성이 있다면, 진료 분야에서 소용이 없을 것이다. 또한 정제된 화합물들이 신경보호제로 사용된다는 것을 알 수 있었다.
첫번째 관점에서, 본 발명은 일반적인 화학식 (I)을 가진 실질적으로 순수한 화합물 및 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
여기에서 Q는 아미디노(amidino) 그룹, 시아노(cyano) 그룹 또는 화학식 XYN- 그룹을 나타내는데, X와 Y는 동일하거나 상이하며, 각각은 수소 원자, 저급 알킬 그룹 또는 간단한 헤테로-원자를 포함하는 그룹을 나타내거나 질소 원자와 함께 질소를 포함하는 헤테로사이클릭 그룹을 형성한다.
Ra는 C1∼C6의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌(alkylene) 또는 알케닐렌(alkenylene) 그룹을 나타내며, 각각은 C1∼C3의 1 내지 4개의 알킬 그룹들에 의해 선택적으로 치환된다.
Rb와 Rc는 직쇄 C3∼C4의 알킬렌 또는 알케닐렌 그룹이고, 각각은 C1∼C3의 1 내지 2개의 알킬 그룹에 의해 선택적으로 치환되고, 상기 Rb및 Rc직쇄에서의 총 탄소 원자의 수는 7이다.
R2와 R3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각은 수소 원자 또는 화학식 R, RCO-, ROCO- 또는 RNHCO- 그룹을 나타내며,
여기서 R은 저급 알킬 그룹이나 아릴 그룹이고, 상기 알킬이나 아릴 그룹은 하기 정의된 하나 또는 그 이상의 치환체 α에 의해 선택적으로 치환된다.
별표(asterisk)로 표시된 키랄(chiral) 탄소 원자는 L 구조이다.
Z는 방향제 아니노산 잔여분이다.
n은 0 또는 1이다.
R1은 수소 원자, 저급 알킬 그룹 또는 아릴 그룹이며, 상기 알킬 또는 아릴 그룹은 하기 정의된 하나 또는 그 이상의 치환체 α에 의해 선택적으로 치환된다.
W는 수소 원자, 알킬 또는 아릴 그룹을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 화합물 클래스는 화학식 (Ia)의 화합물들 및 약학적으로 허용가능한 그들의 염이다.
(여기서, Q, Ra, Rb, Rc, R2, R3, Z, n 및 R1은 상기 정의된 바와 같다)
본 발명의 더 바람직한 화합물 클래스는 화학식(Ib)의 화합물들 및 약학적으로 허용가능한 그들의 염이다.
여기서, X, Y, Z, n 및 R1은 상기 정의된 것이고,
x는 1에서 5까지의 정수이며,
y는 3 또는 4이고,
R4, R5, R6및 R7은 동일하거나 상이하며, 각각은 수소 원자 또는 저급 알킬 그룹을 나타내며,
별표에 의해 표시된 키랄 탄소 원자는 L 구조이다.
치환체 α는 할로겐 원자, 아미노 그룹, 아킬아미노 그룹, 디알킬아미노 그룹, 시아노 그룹, 히드록시 그룹, 알킬 그룹(치환된 그룹이 알킬인 경우를 제외하고), 아릴 그룹, 카르바모일 그룹, 알킬카르바모일 그룹, 디알킬카르바모일 그룹 및 카르복시 그룹과 그의 에스테르에서 선택된다.
본 발명은 상기 화학식 (I), (Ia) 또는 (Ib)의 비독성 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 허혈전후 또는 진행시에 신경손상의 지연용 약물 제조 과정에의 용도뿐만 아니라, 상기 화합물로 구성된 신경보호용 조성물을 제공한다. 본 발명은 허혈전후 또는 진행시에 화학식 (I), (Ia) 또는 (Ib)의 비독성 화합물의 유효량(effective amount)을 상기 포유류에 투여함으로써 허혈에 의한 신경손상으로부터 상기 포유류를 보호하는, 인간을 포함한 포유류의 치료 방법을 제공한다.
실질적으로 순수하다는 것은 HPLC(high performance liquid chromatography)에서 검출가능한 불순물의 양이 없다는 것이다. 미량의 불순물은 특정 조건에서는 허용되고, 그러한 조건은 숙련자들에 의해 판단된다. 일반적으로, 불순물 수준은 1%보다 낮아야 하며, 바람직하게는 실질적으로 1%보다 낮은, 예를 들어 0.1%보다 낮아야 하며, 가능하면 0.001%보다 낮은 것이 바람직하다.
선택적으로, 화합물들이 비독성인 것이 바람직하며 비독성이라는 의미는 적용되는 투여량에서 허용되지 않는 독성 수준을 나타내지 않는다는 것이다. 바람직하게는, 어떠한 독성을 보이지 않아야 한다.
앞서 말한 것에도 불구하고, 상기 화합물의 클래스는 저산소증이나 허혈하에서의 신경보호에 유용하며, 이것은 하기한 바와 같이 해마에 대한 실험으로 증명되었다. 이 화합물들이 활성을 보이는 수준은 선행 화합물이 활성을 보이는 수준보다 실질적으로 더 낮다.
본 발명의 화합물은 허혈의 위험이 있는, 특히 발작이나 뇌 손상이 의심되는 환자에게 적용될 수 있다. 허혈후에 적용될지라도 본 발명의 화합물이 매우 유용하다는 것이 증명되었지만, 많은 신경 퇴화를 가능한 피하기 위해 빠른 시간내에 이 화합물을 투여하는 것이 더욱 바람직하다. 특히 환자에게 허혈의 위험이 있는 경우에 반복적으로 투여하는 것이 바람직하다.
빠른 시간내에 바람직한 결과를 얻기 위한 투여의 바람직한 방법은 일반적으로 주입에 의한 것이다. 그래서 정맥내 주입이 특히 바람직하나 어떤 경우에는 뇌척수액으로 직접 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 화합물의 투여량은 투약의 모드, 빈도와 경로뿐만 아니라 나이, 무게와 환자의 일반 조건등의 여러 요인에 따라 다양하다. 그러나 0.01에서 50 mg/kg이 일반적으로 추천되며, 0.05에서 20mg/kg이 더욱 바람직하다. 일회 복용이나 횟수를 나누어 투여된다.
본 발명의 화합물에서, 화합물의 총 길이는 다음에 나타나는 화합물 A의 길이 영역이 바람직하다. 화합물 A는 18 유닛(unit)으로 간주될 수 있고, 본 발명의 화합물은 25 유닛보다 길지 않고, 14 유닛보다 짧지 않은 것이 바람직하다. 이것은 일반적인 것이나. 바람직하지 않은 하나의 유닛일지라도, 의미있는 길이의 변화에 의해 급격히 활성이 떨어지는 경우가 있다는 것을 주목하여야 한다. 따라서, 화합물이 17에서 22 유닛이 더욱 바람직하다. 유닛이라고 하는 것은 가장 긴 사슬에서의 원자를 의미하고, 여기에는 비-사슬인 원자들이 부착된다. 예를 들어 화학식(Ia)에서 NH2그룹은 유닛으로 간주되며, 그룹 CR2R4, CO, CR4R6등도 그렇게 간주된다.
Q는 시아노 그룹, 아미디노 그룹 또는 화학식 XYN-그룹을 나타낸다. 여기서, X 또는 Y는 저급 알킬 그룹을 나타내고, 바람직하게는 C1∼C6이고, 직쇄 또는 측쇄의 C1∼C6바람직하게는 C1∼C4그룹이다. 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필. 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 2-메틸부틸, 1-에틸프로필, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 3,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 헥실 및 이소헥실 그룹이다. 이중에서 C1∼C4알킬 그룹이 바람직하며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 및 이소부틸 그룹이 바람직하며, 가장 바람직하게는 메틸 그룹이다.
X 또는 Y가 간단한 헤테로-원자를 포함하는 그룹을 나타내는 경우, 이는 비환식 또는 환식 그룹일 수 있다. 비환식 그룹은 아미디노 그룹(X 및 Y가 부착된 질소 원자를 가지고 구아니디노 그룹을 형성한다), 알콕시카르보닐 그룹(알콕시카르보닐아미노 그룹을 형성한다), 카르바모일 그룹 또는 티오카르바모일 그룹(우레이도 그룹 또는 티오우레이도 그룹을 형성한다)이다. 헤테로사이클릭 그룹의 예는 1 내지 4원자는 질소 및/또는 산소 및/또는 황 헤테로-원자이며 나머지는 탄소 원자인 5 내지 10개의 환 원자(하나 또는 두 개의 환에서)를 가진 그룹을 포함한다. 4개의 헤테로 원자인 경우, 4개모두가 질소 원자인 것이 바람직하다. 3개의 헤테로 원자에서, 3,2 또는 1개가 질소 원자인 것이 바람직하다. 2개의 헤테로 원자에서는, 2 또는 1개가 질소 원자인 것이 바람직하다. 이와 같은 그룹의 예는 피롤릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 티아졸릴, 푸릴, 피라닐, 크로메릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 이소인돌릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 카르바졸릴, 크로마닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 이미다졸리디닐, 피페리딜, 피페라지닐, 인돌리닐 및 몰포리닐 그룹이다.
선택적으로, 질소 원자와 함께 X, Y는 질소를 포함하는 헤테로사이클환 그룹을 형성한다. 이러한 헤테로사이클환 그룹은 1내지 4개의 질소 및/또는 산소 및/또는 황 헤테로-원자이며 나머지는 탄소 원자인 5 내지 10개의 환원자(하나 또는 두 개의 환에서)를 가진 그룹을 포함한다. 4개의 헤테로-원자의 경우, 4개 모두 질소 원자인 것이 바람직하다. 3개의 헤테로-원자의 경우, 3,2 또는 1개가 질소 원자인 것이 바람직하다. 2개의 헤테로 분자는, 2 또는 1개가 질소 원자인 것이 바람직하다. 이러한 그룹으로는, 1-피롤릴. 1- 또는 2- 테트라졸릴, 1-인돌릴, 3-티아졸릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴, 2-이소티아졸릴, 3-옥사졸릴, 2-이소옥사졸릴, 1-피리딜, 1-피라지닐, 1-이소인돌릴, 1-퀴놀릴, 2-이소퀴놀릴, 9-카르바롤릴, 1-피롤리디닐, 1-피롤리닐, 1-이미다졸리디닐, 피페리디노, 1-피페라지닐, 1-인도리닐 및 몰폴리노 그룹이다.
Q가 알콕시카르보닐아미노 그룹인 경우, 알콕시 부분은 바람직하게는 직쇄 또는 측쇄의 C1∼C6그룹이다. 이러한 그룹으로는 메톡시카르보닐아미노, 에톡시카르보닐아미노, 프로폭시카르보닐아미노, 이소프로폭시카르보닐아미노, 부톡시카르보닐아미노, 펜틸옥시카르보닐아미노 및 헥실옥시카르보닐아미노 그룹이며 C1∼C4그룹이 바람직하며, 가장 바람직한 것은 에톡시카르보닐아미노 그룹이다.
X와 Y가 최소한 하나는 수소 원자를 나타내는 것이 바람직하다. X와 Y 중 하나 또는 둘다 수소 원자를 나타내는 것이 특별히 바람직하다. X와 Y가 수소 원자를 나타내거나, X나 Y 중 하나가 수소 원자를 나타내며 다른 하나는 아미디노 그룹 또는 카르바모일 그룹을 나타내는 화학식 (I)의 화합물이 바람직하다. X와 Y 모두 수소 원자를 나타내거나, X나 Y 중 하나가 수소 원자를 나타내고 다른 하나는 아미디노 그룹을 나타내는 화학식 (I), (Ia) 그리고 (Ib)의 화합물이 가장 바람직하다.
Ra및 Rb그룹의 길이, 즉 화학식 (Ia)에서 y와 결합한 x의 크기는 화합물의 전체 길이를 고려하는 경우를 제외하고 중요하지 않다. Ra인 특정 알킬렌이나 알케닐렌 그룹이 6 탄소 원자의 길이를 갖는 반면에, 각각의 알킬렌 사슬은 5이상을 갖지 않으며, 3 또는 4 탄소 원자로 제한되는 것이 바람직하며, 트리메틸린 및 테트라메틸린 그룹의 전체 결합이 일반적으로 바람직하다. 이러한 일킬렌이나 알케닐렌 그룹은 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌. 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 비닐렌, 프로페닐렌. 부트(but)-1-에닐렌, 부트(but)-2-에닐렌, 펜트(pent)-1-에닐렌, 펜트-2-에닐렌, 펜트-3-에닐렌, 헥스(hex)-1-에닐렌, 헥스-2-에닐렌, 헥스 3-에닐렌 및 헥스 4-에닐렌 그룹이다. 따라서, x는 3 또는 4가 바람직하며, y는 3 또는 4가 바람직하다. 유사하게 Rc인 알킬렌이나 알케닐렌 그룹은 트리메틸렌이나 테트라메틸렌 그룹이다. Rb가 트리메틸렌 그룹인 경우, Rc는 테트라메틸렌 그룹이며, 반대도 된다. 가장 바람직한 것은 Rb가 트리메틸렌 그룹이며 Rc는 테트라메틸렌 그룹인 것이다.
다양한 R1, R4, R5, R6및 R7그룹은 상기 정의된 최소한 하나의 치환체 α에 의해 치환되거나 치환되지 않은 저급 알킬이나 아릴 그룹이다. 저급 알킬 그룹은 바람직하게 C1∼C6이며, 그 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실 및 이소헥실 그룹으로, 메틸과 에틸 그룹이 바람직하며 메틸 그룹이 가장 바람직하다. 아릴 그룹은 C6∼C10의 탄소환 방향족 그룹이 바람직하며 6에서 10 환 탄소 원자, 예를 들어 페닐, 1-나프틸 및 2-나프틸 그룹이 바람직하며, 페닐 그룹이 더 바람직하다. 선택적으로 이 그룹들은 하나 또는 그이상의 치환체 α에 의해 치환될 수 있다.
치환분 α의 예는 다음과 같다.
염소, 불소 또는 브롬 원자와 같은 할로겐 원자;
아미노 그룹;
C1∼C6의 알킬 부분, 예를 들어 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노, 부틸아미노, t-부틸아미노, 펜틸아미노 및 헥실아미노 그룹을 가진 알킬아미노 그룹;
C1∼C6의 알킬 부분, 예를 들어 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸에틸아미노, 디프록시아미노, 디부틸아미노, 디펜틸아미노 및 디헥실아미노 그룹을 가진 디알킬아미노 그룹;
시아노 그룹;
하이드록시 그룹;
예를 들여 R1등과 관련하여 예를 든 것과 같은 알킬 그룹(알킬이 치환될 때를 제외);
R1등과 관련하여 예를 든 것과 같은 아릴 그룹;
카르바모일 그룹;
C1∼C6알킬 부분, 예를 들면 메틸카르바모일, 에틸카르바모일, 프로필카르바모일, 부틸카르바모일, t-부틸카르바모일, 펜틸카르바모일 및 헥실카르바모일 그룹을 가진 알킬카르바모일 그룹; 및
C1∼C6의 알킬 부분 예를 들면, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 메틸에틸카르바모일, 디프로필카르바모일, 디부틸카르바모일, 디펜틸카르바모일 및 디헥실카르바모일 그룹을 가진 디알킬카르바모일 그룹.
치환 그룹은 트리클로로메틸 및 트리플루오로메틸 그룹과 같은 바람직하게는 세 개의 할로겐 원자를 가진 할로겐-치환 메틸 그룹;
o-, m- 및 p- 클로로페닐, o-, m- 및 p-플루오로페닐, o-, m- 및 p-브로모페닐, 2,3-디클로로페닐, 2,3-디플루오로페닐, 3,4-디클로로페닐, 3,4-디플루오로페닐, 2,4,6-트리클로로페닐, 및 2,4,6-트리플루오로페닐 그룹과 같은 할로겐 치환 페닐 그룹;
아미노메틸, 2-아미노에틸, 3-아미노프로필 및 4-아미노부틸 그룹과 아미노치환 알킬그룹;
메틸아미노메틸, 2-메틸아미노에틸, 3-메틸아미노프로필, 4-메틸아미노부틸, 에틸아미노메틸, 2-에틸아미노에틸, 3-에틸아미노프로필, 4-에틸아미노부틸, 프로필아미노메틸, 2-프로필아미노에틸, 3-프로필아미노프로필, 4-프로필아미노부틸, 부틸아미노메틸, 2-부틸아미노에틸, 3-부틸아미노프로필 및 4-부틸아미노부틸 그룹과 같은 (알킬아미노의 알킬부분이 C1∼C4인) 알킬아미노 치환 알킬 그룹;
N, N- 디메틸아미노메틸, 2-N,N- 디메틸아미노에틸, 3-N,N- 디메틸아미노프로필, 4-N,N-디메틸아미노부틸, N,N-디메틸아미노메틸, 2-N,N-디에틸아미노에틸, 3-N,N-디에틸아미노프로필, 4-N,N-에틸아미노부틸, N,N-프로필아미노메틸, 2-N,N-프로필아미노에틸, 3-N,N-프로필아미노프로필, 4-N,N-프로필아미노부틸, N,N-부틸아미노메틸, 2-N,N-부틸아미노에틸, 3-N,N-부틸아미노프로필 및 4-N,N-부틸아미노부틸 그룹과 같은 (디알킬아미노의 알킬부분이 C1∼C4인) 디알킬아미노-치환 알킬 그룹;
벤질, 페네틸, 3-페닐프로필 또는 4-페닐부틸그룹과 같은 아릴-(특히, 페닐 또는 나프틸) 치환 알킬 그룹; 카바모일메틸, 2-카바모일에틸, 3-카바모일프로필 및 4-카바모일부틸 그룹과 같은 카바모일 치환 알킬 그룹; 메틸카바모일메틸, 2-메틸카바모일에틸, 3-메틸카바모일프로필, 4-메틸카바모일부틸, 에틸카바모일메틸, 2-에틸카바모일에틸, 3-에틸카바모일프로필, 4-에틸카바모일부틸, 프로필카바모일메틸, 2-프로필카바모일에틸, 3-프로필카바모일프로필, 4-프로필카바모일부틸, 부틸카바모일메틸, 2-부틸카바모일에틸, 3-부틸카바모일프로필 및 4-부틸카바모일부틸 그룹과 같은 (알킬카바모일 그룹의 알킬 부분이 바람직하게는 C1∼C4인) 알킬카바모일-치환 알킬 그룹;
N,N-디메틸카바모일메틸, 2-N,N-디메틸카바모일에틸, 3-N,N-디메틸카바모일프로필, 4-N,N-디메틸카바모일부틸, N,N-디에틸카바모일메틸, 2-N,N-디에틸카바모일에틸, 3-N,N-디에틸카바모일프로필, 4-N,N-에틸카바모일부틸, N,N-프로필카바모일메틸, 2-N,N-프로필카바모일에틸, 3-N,N-프로필카바모일프로필, 4-N,N-프로필카바모일부틸, N,N-부틸카바모일메틸, 2-N,N-부틸카바모일에틸, 3-N,N-부틸카바모일프로필, 및 4-N,N- 부틸카바모일부틸 그룹과 같은(디알킬카바모일 그룹의 알킬 부분은 C1∼C4인) 디알킬카바모일 치환 알킬그룹;
카르복시메틸, 2- 카르복시에틸, 3- 카르복시프로필 및 4-카르복실부틸 그룹 및 그의 에스테르와 같은 카르복시 치환 알킬그룹; 및
o-, m- 및 p-아미노페닐, 메틸아미노페닐, 에틸아미노페닐, 프로필아미노페닐, 부틸아미노페닐, N,N-디메틸아미노페닐, N, N-디에틸아미노페닐, N,N-디프로필아미노페닐, N,N-디부틸아미노페닐, 바이페닐릴, 카바모일페닐, 메틸카바모일페닐, 에틸카바모일페닐, 프로필카바모일페닐, 부틸카바모일페닐, N,N-디메틸카바모일페닐, N,N-디에틸카바모일페닐, N,N-디프로필카바모일페닐, N,N-디부틸카바모일페닐 및 카르복시페닐 그룹 및 카르복시페닐 그룹의 에스테르이다.
에스테르 그룹은 다음을 포함하는데,
C1∼C20, 바람직하게는 C1∼C6의 알킬 그룹, 예를 들면, 상기 예 및 당업계에 알려져 있는 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 도데실, 트리데실, 펜타데실, 옥타데실. 노나데실 및 이코실 그룹과 같은 고급 알킬 그룹이며, 가장 바람직한 것은 메틸, 에틸 및 t-부틸 그룹이며;
C3∼C7의 사이클로알킬 그룹, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸 그룹이고;
알킬 부분은 C1∼C3이고 아릴 부분은 C6∼C14인 카르보사이클릭 아로마틱 그룹인 치환 또는 비치환되지 않은 아랄킬 그룹, 비록 비치환 그룹들이 바람직하지만 치환된다면, 최소한 상기 정의된 하나의 치환체 α를 가지며, 아랄킬 그룹의 예는 벤질, 페네틸, 1-페닐에틸, 3-페닐프로필, 2-페닐프로필, 1-나프틸메틸, 2-나프틸메틸, 2-(1-나프틸)에틸, 2-2(나프틸)에틸, 벤즈히드릴(즉, 디페닐메틸), 트리페닐메틸, 비스-(0-니트로페닐)-메틸, 9-안트릴메틸, 2,4,6-트리메틸벤질, 4-브로모벤질, 2-니트로벤질, 4-니트로벤질, 3-니트로벤질, 4-메톡시벤질 및 피페로닐 그룹;
비닐, 알릴, 2-메틸알릴, 1-프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐 및 5-헥세닐 그룹과 같은 C2∼C5의 알케닐 그룹, 그 중에서 비닐, 알릴, 2-메틸알릴, 1-프로페닐, 이소프로페닐 및 부테닐 그룹이 바람직하며, 알릴 및 2-메틸알릴이 가장 바람직하고;
알킬 부분은 상기 정의된 바와 같고, 상기 알킬 그룹과 관련하여 예시된 바와 같고, 할로겐 원자는 염소, 불소, 브롬 또는 요오드인 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4의 할로겐화 알킬그룹, 예를 들면 2,2,2-트리클로로에틸, 2-할로에틸(예로써, 2-클로로에틸, 2-플로오로에틸, 2-브로모에틸 또는 2-아이오도에틸), 2,2-디브로에틸 및 2,2,2-트리브로드에틸 그룹;
알킬부분은 상기 정의된 바와 같고, 상기 예시된 바와 같고, 실릴 그룹은 C1∼C6알킬그룹, 및 정의되고 예시된 치환체 α로부터 선택된 최소한 하나의 치환체를 가지거나 치환되지 않은 페닐그룹에서 선택된 치환체 3개까지 가지는 치환된 실릴알킬그룹, 예를 들면 2-트리메틸실릴에틸 그룹; 치환되지 않거나 최소한 하나의 C1∼C4알킬 그룹 또는 아실아미노 그룹으로 치환된 페닐그룹, 예를 들면 페닐, 토릴 및 벤자미도페닐 그룹;
치환되지 않거나 상기 정의되고 예시된 최소한 하나의 치환체 α를 가지는 펜아실 그룹, 예를 들면 펜아실 그룹 그 자체 또는 p-브로모펜아실 그룹;
환식과 비환식 테르페닐 그룹, 예를 들면 제나릴, 네릴, 리나닐, 피틸, 멘틸(특히 m- 및 p-멘틸), 튜질, 카릴, 피나닐, 보닐, 노트카릴, 노피나닐, 노보닐, 멘테닐, 캄페닐 및 노보네닐 그룹;
단일 비치환 알콕시 그룹에 의해 치환될 수 있는 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4의 알콕시 부분을 가진 알콕시메틸 그룹, 예를 들면 메톡시메틸, 에톡시메틸, 프로폭시메틸, 이소프로폭시메틸, 부톡시메틸 및 메톡시에톡시메틸 그룹;
아실그룹이 바람직하게는 알카노일 그룹, 더욱 바람직하게는 C2∼C6의 알카노일 그룹이고, 알킬부분이 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4인 지방족 아실옥시알킬 그룹, 예를 들면 아세톡시메틸, 프로피오닐옥시메틸, 부티릴옥시메틸, 이소부티릴옥시메틸, 피바로일옥시메틸, 1-피바로일옥시에틸, 1-아세톡시에틸, 1-이소부티릴옥시에틸, 1-피바로일옥시프로필, 2-메틸-1-피바로일옥시프로필, 2-피바로일옥시프로필, 1-이소부티리로옥시에틸, 1-이소부티릴옥시프로필, 1-아세톡시프로필, 1-아세톡시-2-메틸프로필, 1-프로피오닐옥시에틸, 1-프로피오닐옥시프로필, 2-아세톡시프로필 및 1-부티릴옥시에틸 그룹;
아실그룹이 바람직하게는 알카노일 그룹이고 더욱 바람직하게는 C2∼C6의 알카노일 그룹이고, 시클로알킬 치환체는 C3∼C7이고, 알킬부분은 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4인 시클로알킬 치환 지방족 아실옥시알킬그룹이고, 예를 들면 (시클로헥실아세톡시) 메틸, 1-(시클로헥실아세톡시)에틸, 1-(시클로헥실아세톡시)프로필, 2-메틸-1-(시클로헥실아세톡시)프로필, (시클로펜틸아세톡시)메틸, 1-(시클로펜틸아세톡시)에틸, 1-(시클로펜틸아세톡시)프로필 및 2-메틸-1-(시클로펜틸아세톡시)프로필 그룹;
알콕시부분은 C1∼C10, 바람직하게는 C1∼C6, 더욱 바람직하게는 C1∼C4이고, 알킬부분은 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4인 알콕시카르보닐옥시알킬그룹, 특히 1-(알콕시카르보닐옥시)에틸 그룹, 예를 들면 1-메톡시카르보닐옥시에틸, 1-에톡시카르보닐옥시에틸, 1-프로폭시카르보닐옥시에틸, 1-이소프로폭시카르보닐옥시에틸, 1-부톡시카르보닐옥시에틸, 1-이소부톡시카르보닐옥시에틸, 1-sec-부톡시카르보닐옥시에틸, 1-t-부톡시카르보닐옥시에틸, 1-(1-에틸프로폭시카르보닐옥시)에틸 및 1-(1,1-디프로필부톡시카르보닐옥시)에틸 그룹, 및 알콕시 및 알킬그룹이 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4인 기타 알콕시카르보닐알킬 그룹, 예를 들면, 2-메틸-1-(이소프로폭시카르보닐옥시)프로필, 2-(이소프로폭시카르보닐옥시)프로필, 이소프로폭시카르보닐옥시메틸, t-부톡시카르보닐옥시메틸, 메톡시카르보닐옥시메틸 및 에톡시카르보닐옥시메틸 그룹;
시클로알킬 그룹이 C3∼C10, 바람직하게는 C3∼C7이고, 모노- 또는 폴리-환이고 선택적으로 최소한 하나의(바람직하게는 단 하나의) C1∼C4알킬(예를 들면, 상기 예시된 알킬 그룹으로부터 선택)에 의해 치환되고, 알킬부분은 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4(예를 들면 상기 예시된 알킬 그룹으로부터 선택), 가장 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 프로필인 시클로알킬카르보닐옥시알킬 및 시클로알킬옥시카르보닐옥시알킬 그룹, 예를 들면 1-메틸시클로헥실카르보닐옥시메틸, 1-메틸시클로헥실옥시카르보닐옥시메틸, 시클로펜틸옥시카르보닐옥시메틸, 시클로펜틸카르보닐옥시메틸, 1-시클로헥실옥시카르보닐옥시에틸, 1-시클로헥실카르보닐옥시에틸, 1-시클로펜틸옥시카르보닐옥시에틸, 1-시클로펜틸카르보닐옥시에틸, 1-시클로헵틸옥시카르보닐옥시에틸, 1-시클로헵틸카르보닐옥시에틸, 1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시메틸, 1-메틸시클로펜틸옥시카르보닐옥시메틸, 2-메틸-1-(1-메틸시클로헥실카르보닐옥시)프로필, 1-(1-메틸시클로헥실카르보닐옥시)프로필, 2-(1-메틸시클로헥실카르보닐옥시)프로필, 1-(시클로헥실카르보닐옥시)프로필, 2-(시클로헥실카르보닐옥시)프로필, 2-메틸-1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시) 프로필, 1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필, 2-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필, 1-(시클로펜틸카르보닐옥시)프로필, 2-(시클로펜틸카르보닐옥시)프로필, 1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)에틸, 1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필, 아니만틸옥시카르보닐옥시메틸, 아다만틸카르보닐옥시메틸, 1-아다만틸옥시카르보닐옥시에틸 및 1-아다만틸카르보닐옥시에틸그룹;
알콕시 그룹이 C3∼C10, 바람직하게는 C3∼C7인 모노 또는 폴리환 시클로알킬 단일 치환체인 시클로알킬알콕시카르보닐옥시알킬 그룹, 예를 들면 시클로프로필메톡시카르보닐옥시메틸, 시클로부틸메톡시카르보닐옥시메틸, 시클로펜틸메톡시카르보닐옥시메틸, 시클로헥실메톡시카르보닐옥시메틸, 1-(시클로프로필메톡시카르보닐옥시)에틸, 1-(시클로부틸메톡시카르보닐옥시)에틸, 1-(시클로펜틸메톡시카르보닐옥시)에틸 및 1-(시클로헥실메톡시카르보닐옥시)에틸 그룹;
테르페닐 그룹은 상기 예시한 바이고, 바람직하게는 환테르페닐 그룹인 테르페닐카르보닐옥시알킬 및 테르페닐옥시카르보닐옥시알킬 그룹이고α 예를 들면 1-(메틸옥시카르보닐옥시)에틸, 1-(메틸카르보닐옥시)에틸, 멘틸옥시카르보닐옥시메틸, 멘틸카르보닐옥시메틸, 1-(3-피나닐옥시카르보닐옥시)에틸, 1-(3-피나닐카르보닐옥시)에틸, 3-피나닐옥시카르보닐옥시메틸 및 3-피나닐카르보닐옥시메틸 그룹;
동일 또는 상이한 알킬그룹은 C1∼C6, 바람직하게는 C1∼C4인 [상기 정의되고 예시된 최소한 하나의 치환체 α에 의해 치환될 수 있는] 5-알킬 또는 5-페닐(2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)알킬그룹, 예를 들면 (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)메틸, (5-페닐-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)메틸, (5-이소프로필-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)-메틸, (5-t-부틸-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)메틸 및 1-(5-메틸-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일)에틸 그룹;
특히 생체내에서 용이하게 제거되는, 프타리딜, 인다닐, 및 2-옥소-4,5,6,7-테트라히드로-1,3-벤조디옥소렌-4-일 그룹과 같은 기타 그룹이다.
상기 그룹에서, 생체내에서 쉽게 제거되는 그룹들이 선호되며, 가장 바람직한 것은 지방족 아실콕시알킬 그룹, 알콕시카르보닐옥시알킬 그룹, 시클로알킬카르보닐옥시알킬 그룹, 프탈리딜 그룹 및 (5-치환-2-옥소-1,3-디옥소렌-4-일) 메틸 그룹이다.
그러나, R1, R4, R5, R6와 R7이 모두 수소인 것이 바람직하다.
일반적으로 그룹 Z가 존재하지 않는 것, 즉 n이 0인 것이 바람직하나존재하는 경우 방향족 잔기(residue)에 해당하는 것이 바람직하며, 소수성 방향족, 아미노산이 바람직하고, 히스티딘, 피닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 페닐글리신과 같은 α-아미노산이 더 바람직하며, 그중에서 페닐알란닌 또는 티로신이 가장 바람직하다.
Rc는 1 또는 2개의 알킬그룹에 의해, 바람직하게는 메틸에 의해 치환되는 저급 알킬렌 그룹이다. 이러한 저급 알킬렌 그룹은 직쇄상 C3∼C4이고, 선택적으로, 1 또는 2개의 알킬그룹, 바람직하게는 메틸로 치환된다. 이러한 그룹의 예로는, 메틸렌, 에틸렌, 메틸에틸렌, 1-, 2- 또는 3- 메틸트리메틸렌, 트리메틸렌, 프로필렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌 및 헥사메틸렌 그룹이며, 트리메틸렌 및 테트라메틸렌 그룹이 일반적으로 바람직하다.
본 발명에 있어 바람직한 화합물은 하기 화학식 A 내지 D의 화합물이다.
화학식 A의 화합물:
화학식 B의 화합물:
화학식 C의 화합물:
화학식 D의 화합물:
화학식 E의 화합물:
화학식 F의 화합물:
화학식 G의 화합물:
화학식 H의 화합물:
화학식 I의 화합물:
이 중에서, 화학식 A,D,E,F,G,H 및 I의 화합물이 특히 바람직한데, 화학식 A와 D의 화합물이 더 바람직하며, 화학식 A의 화합물이 가장 바람직하다.
본 발명의 화합물은 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 처리과정에 의해 제조되는데, 선택적으로 하기 절차에 의해 제조될 수 있다.
왕(Wang) 레진(0.03 mmol)은 무수 테트라히드로퓨란(1.0 ml)에서 팽창되고, 카르보닐 디미다졸(4 당량, 0.12 mmol)이 첨가(portion-wise)된다. 혼합물은 16시간동안 상온에서 교반, 여과된 후, 테트라하이트로퓨란, 에탄올 및 디클로로메탄으로 세척된다. 그후, 레진은 진공 건조된다.
레진은 무수 디클로로메탄(1.0 ml)에서 재팽창되고, 1,3-디아미노프로판(10 당량, 0.3 mmol)에 첨가된다. 혼합물은 2시간동안 교반, 여과된 후, (디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄)으로 세척된 후에 진공 건조된다.
레진은 무수 디클로로메탄(1.0 ml)에서 재팽창(re-swollen)되고 2,6-루티딘(5 당량, 0.12 mmol)이 첨가되고, 조심스럽게 2,4-디니트로벤젠설포닐 클로라이드(4 당량, 0.12 mmol)가 첨가된다. 혼합물은 2시간동안 비활성 분위기하에서 교반된 후, (디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로) 세척되고 진공 건조된다.
상기 건조된 레진은 무수 테트라하이드로퓨란(1.0 ml)에서 팽창되고 트리페닐포스핀(4 당량, 0.12 mmol), 디디이-프로텍티드 아미노알콜(Dde-protected aminoalcohol, 4 당량, 0.1,2 mmol)이 첨가되고 교반되어 용해된다. 디에틸아조디카르복실레이트(4 당량, 0.12 mmol)이 점적(dropwise)되고, 혼합물이 12시간 교반된 후 여과되고, 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고, 진공 건조된다.
그 후, 레진은 디클로로메탄(1.0 mm)에서 팽창되고 프로필아민(5 당량, 0.15 mmol)이 첨가되고, 혼합물이 1시간 교반된 후, 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고 진공 건조된다.
레진은 다시 디클로로메탄(1.0 ml)에서 팽창되고 디-t-부틸 디카르보네이트(10 당량, 0.3 mmol) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(5 mol%, 0.0015 mmol)이 첨가된다. 이후, 16시간동안 혼합물이 교반된다. 레진은 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고 진공 건조된다.
그 후 레진은 2% 히드라진 수화물/디메틸포름아미드(1.0 ml)에서 1시간동안 교반되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고 진공 건조된다.
Fmoc AA(4 당량, 0.12 mmol), TBTU(4 당량, 0.12 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(8 당량, 0.48 mmol)이 무수 디메틸포름아미드(1.0 ml)에서 용해되고, 혼합물이 레진에 첨가된다. 그 후, 12시간동안 교반하여 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고 진공 건조된다.
레진에 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(1.0 ml)가 첨가되고 혼합물이 30분간 교반되고 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로메탄으로 세척한 후 진공 건조된다.
Boc AA(4 당량, 0.12 mmol), TBTU(4 당량, 0.12 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(8 당량, 0.48 mmol)이 디메틸포름아미드(1.0 ml)에서 용해되고, 혼합물이 레진에 첨가된다. 그 후, 12시간 교반 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척된 후, 진공 건조된다.
50%TFA/45%디클로로메탄/2.5%H2O/2.5%트리이소프로필실란(1.0 ml)이 레진에 첨가되고, 혼합물이 1시간동안 교반된다. 레진은 여과되고 디클로로메탄(1.0 ml)으로 세척되고 여과액은 진공상태에서 농축된다. 결국 점성을 띤 노란 오일이 무수 디에틸 에테르(3×2 ml)와 균질화(triturate)되어 요구되는 화합물을 제조한다.
신경보호 활성 뿐 아니라, 본 발명의 화합물을 제조하는 방법이 하기 실시예에서 제시된다. 그러나 본 발명의 범위가 실시예에만 한정되는 것은 아니다. 본 실시예에는, 다음과 같은 약어가 사용된다:
Arg 아르기닌;
Boc t-부톡시카르보닐(t-butoxycarbonyl);
DIC 디-이소프로필카르보디이미드(di-isopropylcarbodiimide);
EDT 에탄-1,2-디올(ethane-1,2-diol);
Fmoc N-플루오레닐메톡시카르보닐(N-fluorenylmethoxycarbonyl);
HOBt 히드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole);
Lys 리신(Lysine);
ODS 옥타데실실란(octadecylsilane);
Orn 오르니틴(ornithine);
Phe 페닐알라닌(phenylalanine);
Pmc NG-2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-일술포닐
(NG-2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-ylsulphonyl);
RP-HPLC 역상 고압 액체 크로마토그라피(reverse phase high
performance liquid chromatography)
TFA 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid);
화합물 합성
실시예 1
N1-L-아르지닐스페르미딘(Arginylspermidine)[화학식A]
N1-플루오레닐메톡시카르보닐-N4-(4'-벤조일옥시카르보닐-(1'-페녹시)에타노아미도 레진)-N8-t-부톡시카르보닐스페르미딘(N1-fluorenylmethoxycarbonyl-N4-(4'-benzoyloxycarbonyl-(1'-phenoxy)ethanoamido resin)-N8-t-butoxycarbonylspermidine)의 0.152g이 디메틸포름아미드에서 5 ml의 20% v/v 피페리딘 용액으로 처리되었다. 레진은 여과되었고, 다시 30분동안 디메틸포름아미드에서 5 ml의 20% v/v 피페리딘 용액으로 처리되었다. 경과시, 레진은 여과되고 10 ml의 디메틸포름아미드, 5 ml의 메탄올과 세척되고, 각각 10 ml의 메틸렌 클로라이드와 최종적으로 두 번 세척되었다. Fmoc-Arg(Pmc)OH(0.1027 g, 0.154 mmol)이 메틸렌 클로라이드(9 ml)에서 용해되고, HOBt(0.021 g, 0.155 mmol)이 첨가되었다. 상온에서 10분 후, N4-(4'-벤조일옥시카르보닐(1'-페녹시)에타노아미도 레진)-N8-t-부톡시카르보닐스페르미딘(0.132 g, 0.031 mmol)이 첨가되고, 이후 DIC(24 ml, 0.155 mmol)이 첨가되었다. 혼합물은 20시간동안 상온에서 온화하게 교반되었다. 음성 닌히드린(negative ninhydrin) 테스트 후, 레진은 여과되고 메틸렌 클로라이드(1x10 ml), 메탄올(1x5 ml), 메틸렌 클로라이드(2x10 ml)로 세척되고 진공 건조되었다. Fmoc 제거는 상기와 같이 해하여졌다. N1-Arg(Pmc)-N4-(4'-벤조일옥시카르보닐-(1'-페녹시)에타노아미도 레진)-N8-t-부톡시카르보닐스페르미딘은 TFA-페놀-물-트리이소프로필실란-에탄-1,2-디티올(EDT)(TFA-phenol-water-triisopropylsilane-ethane-1,2-dithiol, 부피비로 81.5:5:5:1:2.5; 2.5 ml)를 사용하여 상온에서 5시간동안 비보로/털어지도록(deprotect/cleave)하였다. 레진은 유리솜(glass wool)으로 충진된 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 통과시켜 제거되고 메틸렌 클로라이드(4x4 ml)로 세척되었다. 용매는 진공상태에서 제거되고, CH3CN(1 ml)로 용해된 잔사는 냉각된 디에틸 에테르(diethyl ether, 25 ml)에 주입되어 원심분리된 흰 침전물을 생성하며, 상층액(supermatant)은 기울여 따라버리고, 고형물은 디에틸 에테르(25 ml)에서 재분산시켰고, 고형물은 다시 원심분리에 의해 분리되며 이런 절차가 두 번 반복되었다. 최종물은 냉각건조되기 전에 물(water)에서 용해된다. 최종물(19.2 mg)은 RP-HPLC(물/0.1%TFA으로 균등하게(isocratically) 용출되는, ODS)에 의해 분석되고 정제되었다.
실시예 2
화합물 B, C, Z1, Z2및 Z3
이들 화합물은 각각 Fmoc-L-Lys(t-부톡시카르보닐), Fmoc-L-Orn(t-부톡시카르보닐), Fmoc-D-Arg(Pmc), Fmoc-D-Lys(t-부톡시카르보닐) 및 Fmoc-D-Orn(t-부톡시카르보닐)을 이용하여 유사한 방법으로 제조되었다.
화합물 분석
N-L-아르기닐스페르마딘(화학식 A)
N1-D-아르기닐스페르미딘(화학식 Z1)
N1-L-리시닐스페르미딘(화학식 B의 화합물)
N1-D-리시닐스페르미딘(화학식 Z2)
N1-L-오르니틸스페르미딘(화학식 C의 화합물)
N1-D-오르니틸스페르미딘(화학식 Z3)
HPLC 분석
본 발명의 화합물은 HPLC에 의해 분석되었다. 결과적으로 본 발명의 바람직한 과정에 의하여 제조될 때의 화합물은 본래의 반응물(reactant)이 없어진다는 것을 보여주었다.
실시예 3
아르기닌-L-페닐알라닌-스페르미딘: 화학식 G의 화합물
왕(Wang) 레진(0.03 mmol, 50 mg)은 무수 테트라하이드로푸란(1.0 ml)에서 팽창되고, 카르보닐 디이미다졸(4 당량, 0.12 mmol, 19 mg)이 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 16시간 교반되고, 필터되고 테트라하이드로푸란, 에탄놀 및 디클로로메탄에 의해 세척되었다. 레진은 이후 진공건조되었다.
레진은 무수 디클로로메탄(1.0 ml)에서 재팽창되고, 2,6-루티딘(lutidine, 5 당량, 0.15 mmol, 16 mg)이 첨가되고, 2,4-디니트로벤젠술포닐 클로라이드(4 당량, 0.12 mmol, 32 mg)가 조심스럽게 첨가된다. 혼합물은 비활성화 분위기에서 2시간 교반되고, 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고, 진공건조되었다.
건조된 레진은 무수 테트라하이드로푸란(1.0 ml) 및 트리페닐포스핀(4 당량, 0.12 mmol, 32 mg)에서 팽창되었다. Dde-보호 아미노알콜(Dde-protected aminoalcohol, 4 당량, 0.12 mmol, 29 mg)이 첨가되고 교반되어 용해되었다. 디에틸 아조디카르복실레이트(4 당량, 0.12 mmol, 21 mg)가 점적되고, 혼합물은 12시간 교반되며 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되었다. 그 후 진공건조되었다.
그 후, 레진은 디클로로메탄(1.0 ml)에서 팽창되고, 프로필아민(5 당량, 0.15 mmol, 13 mg)이 첨가되었다. 혼합물은 1시간 동안 교반된 후 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척된 후, 진공건조되었다.
레진은 다시 디클로메탄(1.0 ml)에서 팽창되고 디부틸 디카르보네이트(10 당량, 0.3 mmol, 33 mg) 및 N,N-디메틸아미노피리딘(5 mol%, 0.0015 mmol, 0.2 mg)이 첨가되고, 혼합물은 16시간동안 교반되었다. 레진은 여과되고, 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고, 진공건조되었다.
레진은 2% 히드라진 수화물/디메틸포름아미드(1.0 ml)에서 1시간 교반되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척된 후, 진공건조되었다.
Fmoc-Phe-OH(4 당량, 0.12 mmol, 46 mg), TBTU(4 당량, 0.12 mmol, 39 mg) 및 디이소프로필에틸아민(8% 0.48 mmol, 62 mg)이 무수 디메틸포름아미드(1.0 ml)에서 용해되고, 혼합물은 레진에 첨가되었고, 그 후 12시간 교반되고, 여과되고, 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고, 진공건조되었다.
레진에 20%피페리딘/디메틸포름아미드(1.0 ml)가 첨가되고 혼합물이 30분간 교반되었고, 그 후 여과되고 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척되고 진공 건조되었다.
Boc-Arg(Phe-OH(4 당량, 0.12 mmol, 63 mg), TBTU(4 당량, 0.12 mmol, 39 mg) 및 디이소프로필에틸아민(8 당량, 0.48 mmol, 62 mg)이 디메틸포름아미드(1.0 ml)에서 용해되고, 혼합물은 레진에 첨가되었다. 그 후 12시간동안 교반되고, 여과되고, 디메틸포름아미드, 메탄올, 디클로로메탄으로 세척된 후, 진공 건조되었다.
50%TFA/45%디클로로메탄/2.5%H2O/2.5% 트리이소프로필실란(50%TFA/45%dichloromethane/2.5%H2O/2.5% triisopropylsilane, 1.0 ml)이 레진에 첨가되고, 혼합물은 1시간 교반되었다. 레진은 여과되고, 디클로로메탄(1.0 ml)으로 세척되고 여과액(filtrate)은 진공상태에 농축되었고, 결국 점성의 노란 오일이 무수 디에틸 에테르(diethyl ether, 3x2k ml)와 균질화되어 테트라키스(tetrakis) TFA염과 같은 표제 화합물을 제조하였다.
분석 :
LCMS
90%(ELS 검출), M/z 449 (ES+).
NMR:
1H NMR이 상기 구조와 일치하였다.
Dde 보호 아미노알콜(Dde protected aminoalcohol):
Dde=N-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)에틸(N-1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl)
Dde 보호 아미노알콜(Dde protected aminoalcohol) 제조방법
에탄올에서 3-아미노-1-프로판올(1.5 g, 20 mmol)용액에 2-아세틸 디메돈(2-acetyl dimedone)이 첨가되고, 혼합물은 1시간동안 50℃로 가열되었다. 이 용액은 진공상태에서 농축되어 하얀색이 아닌 적색 결정체 고형물(crystalline solid)을 생성하며, 이것이 핵산과 균질화되어 백색이 없는 고형물을 만들었다.
실시예 4
화학식 D
PTFE 2 ml 실린지(syringe)에 N1-플루오레닐메톡시카르보닐-N4-(4'-벤조일옥시카르보닐(1'-페녹시)에타노아미도 레진)-N8-Boc스페르미딘(??31 mg, 0.263 mmol/g)(N1-Fluorenylmethoxycarbonyl-N4-(4'-benzoyloxycarbonyl(1'-phenoxy)ethanoamido resin)-N8-Bocspermidine)으로 충진되고, 디메틸포름아미드(2 ml) 용액에서 20% 피페리딘으로 30분동안 3번 처리되고, 디메틸포름아미드(2x2 ml) 및 CH2CI2(4x2 ml)로 세척되었다.
생성된 일차 아민(amine)은 CH2CI2/디메틸포름아미드(1 ml/1 drop)에서 DIC/HOBt 활성을 가진 Fmoc-카르바모일산(carbamoyl acid, 5 당량(0.041 mmol))을 이용하여 Fmoc-Phe)과 커플링되었다. 간헐적인 교반 4시간 후, 닌히드린 테스트는 커플링이 완료되었음을 보여주었다. 디메틸포름아미드(2 ml, 2x30 mm)에서 20%피페리딘으로 처리한 후, 디메틸포름아미드(2x2 ml)로 세척하고, CH2CI2(4x2 ml)Di(Boc)-보호 구아니디노 카르복실산(CH2CI2(4x2 ml)Di(Boc)-protected guanidino carboxylic acid)을 샘플에 커플링시켰다. 커플링반응은 CH2CI2/디메틸포름아미드(1 ml/1 drop)에서DIC/HOBt 활성을 가진 카르복실산 3당량(0.025 mmol)을 이용하여 달성되었다. 간헐적인 5시간의 교반작업 후, 닌히드린 테스트로 커플링반응이 종결되었음을 확인하였다.
디메틸포름아미드(2x2 ml) 및 CH2CI2(4x2 ml)로 세척한 후, 화합물은 고형지지대(solid support)로부터 비보로-떨어지게 하고, 레진은 TFA-H20(95:5, 0.4 ml)와 처리하기 전 CH2CI2용액에서 1.5시간 예비팽창되었다.
레진 샘플은 TFA-CH2CI2(1:1, 2 ml)로 세척되고, 세척액은 바이얼(vial)내로 여과되었다. 용매는 진공상태에서 줄이고(reduced), 잔사는 물에 용해되고 냉각, 건조되었다. 화합물은 ES MS에 의해 분석되었고 주요 피크(major peak)로 원하는 분자 이온을 보여주었다.
M/Z:(ES+)448.4
실시예 5
저산소증 신경손상(Hypoxic Neuronal Damage) 연구를 위한 프로토콜(protocol)
저산소증 신경손상은 유기형질 해마 절편배양(organotypic hippocampal slice cultures)[Pringle A. K. et al. (1996 Stroke 27 2124-2130)]을 이용하여 연구되었다.
배양은 스토피니(Stoppini)(1991 J. Neurosci. Meth. 37 173-182)등에 의한 방법에 따라 8-10일된 위스터 쥐 펍스(Wister rat pups, Bioresources Unit, University of Southampton))를 이용하여 준비하였다. 배양은 14일간(37℃, 5%CO2) 시험관에서 배양되며, 그동안 배양배지(1 mM 글루타민(glutamine), 5 mg/ml 글루코즈(glucose) 및 1.5% 푼지존(fungizone)으로 보충된 50%최소요구배양배지(minimum essential medium, MEM), 25%행크스 평형염용액(Hank's balanced salt solution, HBSS), 25%열-비활성 말 형청(heat-inactivated horse serum))가 3일마다 교체되었다. 저산소증은 배양배지를 95%N2/5%CO2(무산소)로 포화된 무혈청(SF)배지(75%MEM, 25%HBSS, 1mM 글루타민, 5mg/ml 글루코즈, 1.5% 푼지존)로 교체함으로써 유도하고 기체가 N2/CO2로 충진된 챔버에 위치시켰다. 180분간 저산소 처리 후, 배양이 정상산소(normoxic) SF 배양배지에서 도말되고 24시간 인큐베이터에 재배치되었다. 화합물은 저산소증 전, 동안 또는 후(이후 "pdp"로 중략) 어느 한 때 또는 저산소증 회복기("post")[Johnson, T. D. (1996 Trends Pharmacol. Sci. 22-27)]에 배양에 첨가되었다. 세포 장애는 건강한 세포로부터 정상적으로 배제된 형광 배제 염색 프로피디움 요오드화물(fluorescent exclusion dye propidium iodide, PI, 5 ug/ml)을 이용하여 평가되지만, 장애 혈장 세포로 유입되고 DNA에 결합될 때 상당한 형광체가 된다. 신경세포장애는 "NIH 이미지 1.55" 소프트웨어(미국 보건연구기관(US National Institute for Health)의 와인 라스밴드(Wayne Rasband)에 의한 개시, 인터넷 zippy.nimh.nih.gov를 클릭하면 누구나 접근가능)를 이용하여 정량화되었다. 요약하면, CA1, CA3 및 덴테이트 자이러스(dentate gyrus, DG) 셀 층이 트랜스미션 이미지로부터 측정되었다. 저산소증이 시작한 후 24시간 만에, 형광 이미지가 로다민 필터 세트로 고정된 표준 레이카 역상 형광 현미경(standard Leica inverted fluorescence microscope)을 사용하여 표착되었다. 신경세포 층의 배경상 PI 형광부위는 이미지의 밀도 절편기능(dencity slice function)에 의해 결정되었다. 세포장애는 PI 형광이 감지되는 세포층 부위의 퍼센트로 나타낼 수 있다. 이미지화작업 후, 배양은 밤새 티오닌으로 염색된 4%준포름알데히드(paraformaldehyde)용액에서 고정되었다.
산출된 데이터는 평균±오차로 표현된다. 비약물(non-drug) 그룹에서 산출된 데이터는 분석전에 수집하였다. 통계적 중요성은 원웨이 분산 분석(one-way analysis of variance(ANOA))과 포스트-호크 단일 스튜던트 티-테스트(post-hoc non-paired Student's t-test)를 이용하여 결정되었다. CA1 부위 내 유일한 세포는 저산소증-유도 장애를 받기 쉬우므로, 이 부위만에 대한 모든 약리학적 데이터가 계산되었다.
NMDA 수용체-전달 신경유독성(NMDA receptor-mediated neurotoxicity) 연구를 위한 프로토콜
유기형질 해마 절편배양은 상기에서 설명한 대로 준비되고 유지되었다. NMDA는 증류수에서 50 mM 저장용액으로 준비되고 SF 배양배지에서 필요한 만큼 희석된다. 신경유독성은 10 μM 또는 30 μM NMDA를 포함한 SF 배양배지에 배양을 180분간 위치함으로써 유도되었다. 그 후, 배양은 SF-배양배지에서 도말되고 24시간 인큐베이터에서 유지되었다. 300 μM L-ArgSp 또는 비이클(vehicle, SF 배양배지)이 NMDA 노출전기간 중 어느 한 때 배양배지에 첨가되었다. 실험동안, 5 ug/ml PI가 배양배지에 포함되었다. 24시간 경과 후, 신경손상이 PI 형광 이미지과정에 의해 결정되고 상기 설명처럼 정량화되었다.
혈류 흐름(Blood Flow) 연구
성장 완료한 수컷 위스터 쥐(250-300 g)가 4%핼로탄(halothane)으로 전신마취되고 O2용액 7%N2O에 혼합된 1.5%핼로탄으로 유지되었다. 대퇴부 동맥은 지속적인 혈압 측정을 위하여 캐뉼레이트(cannulate)되었다. 대퇴부 정맥은 또한 화합물의 주입이 이루어질 수 있도록 캐뉼레이트되었다. 동물은 15-30분간 안정(stablize)되고 L-ArgSp 1 mg/ml 용액의 0.25-0.3% ml가 주입되었고, 화합물 주입 후, 쥐는 지속적으로 60분간 모니터되었다. 그 후, 전신마취가 끝나고 쥐는 깨어났다. 이 연구에서, 1 mg/kg L-ArgSp를 전신마취된 수컷 위스터 쥐에게 주입한 후 유도된 평균 동맥혈압(mean arterial blood pressure, MABP)이 측정되었고, MABP는 L-ArgSp 주입 바로 전(pre-injection)에 계산되고, 주입 후에는 10분 30초만에 계산되었다. 데이터는 4번의 관찰에서의 평균±오차이다.
전뇌 국소빈혈(Global Forebrain Ischaemia)
동물은 상기에서처럼 전신마취되고, 서미스터(thermistor)가 체온을 측정할 수 있도록 왼쪽 측두골 근(temporal muscle)에 삽입되었다. 척주 중부 피부 절개(dorsal midline skin incision)는 미세외과적 수술에 의해 목부위에 이루어지며, 척추 동맥이 확인되고, C1 레벨에서 단극성 전극(monopolar electrode)을 사용하여 폐색되었다. 절개는 폐색되고, 동물은 전신마취로부터 깨어나 우리에 되돌아와 24시간 유지된다. 그 후, 동물은 다시 전신마취되고 일반 경동맥(common carotid arteries, CCAs)이 노출되었다. 동물은 두 그룹으로 분리되어, 그룹 1은 L-ArgSp 1 mg/mg용액의 0.25-0.3 ml를 수여받고, 그룹 2는 살균 증류수의 0.25-0.3 ml를 수여받았다. 샘플은 주입되기 전에 개별적으로 준비되고 무작위적으로 선별되었다. 동물에게 미세혈관 클립(clip)으로 CCAs가 15분간 폐색되기 전에 15분간 주입되었다. 그 후, 피부는 폐색되고, 동물은 깨어날 수 있었다. 24시간 후 동물은 마지막으로 전신마취되고 1%파라포름알데히드가 살포되고 뇌가 제거되고 조직학(histology)적으로 처리(process)되었다. 한 관찰자가 계기를 이용하여 각 세포층의 CA1, CA3 부위에 생존하거나 사멸된 세포수를 결정하고, 해마톡실린 및 에오신 염색 두정(eosin stained coronal) 부위에서 덴테이트 자이러스 그래뉼(dentate gyrus granul) 세포층을 결정하였다.
결과
(1) 대조군 절차
진공상태에서 14일 경과후, 유기형질 해마 절편 배양은 생체내 해마(in vivo hippocampus)의 구조와 몰포로지를 상당히 보유하였다. 특히,명백하게 구분되는 각추(pyramidal, CA1 및 CA3/4)와 덴테이트 자이러스 그래뉼 세포층이 티오닌 염색 부위에서 감지되었다. 신경세포가 건강하게 보이고, 큰 명-염색 핵(lightly-stained nuclei)이 암-염색(intensely-staining) 세포질(도 1)로 둘러싸여 있다.
3시간 저산소 처리 후 24시간 경과시, PI 형광이 각추 세포층(35.6±1.43%장애, n=108)의 CA1 부위에서 감지되고, 소량의 통계상 중요하지 않은 PI가 CA3 각추 세포(7.1±1.3%) 또는 덴테이트 그래뉼 세포(3.9±2.9%)에서 표지(label)되었다. 소량의 PI 형광은 무혈청 배양배지에서 24시간 유지된 비처리 대조군에서 발견되었다. 티오닌-염색후, 대조군 배양은 비처리 절편과 구분되지 않고, 신경세포는 크고 건강해 보였다. 반대로, 180분간 저산소증에 노출된 배양에서의 CA3 각추 세포와 덴테이트 그래뉼 세포는 정상적으로 보이나, CA1에서의 세포는 작고 암-염색되고, 피크노틱(pyknotic) 핵은 작은 원형질을 보유하여 도 1 에서 도시된 것처럼 신경세포 사멸을 드러냈다. 도 1 은 비처리된 대조군 배양(A) 또는 3시간 저산소증 후 24시간 배양(B)의 PI 형광 이미지를 도시한다. 비처리된 배양에서는 아무 PI 형광도 감지되지 않으나, 암 염색이 저산소-처리된 배양의 CA1 각추 세포층에서 발견된다. (C+D)배양의 CA1 부위 티오닌염색 섹션이 A+B에 보인다. (C)신경세포는 암-염색(darkly-staining) 원형질로 둘러싸인 명-염색(lightly-stained) 핵을 포함한다. (D)반대로, 저산소증-처리 배양에서의 신경세포는 작고, 암염색 피크노틱 핵(검은 화살표)으로 보인다. 도면에서는, 측정 막대(scale bar)가: A,B:1 mm; C,D: 100 μM이다.
(2)L-아르기닐스페르미딘(L-Arginylspermidine, 화합물 A)의 효과
300 μM L-ArgSp를 24시간 인큐베이터에 넣은 후, 기준선 위로 PI 형광 증가는 보이지 않았다. 저산소 처리전, 저산소증 에피소드 진행중 및 회복기 24시간 경과 후 30분간 300 μM L-ArgSp를 추가함으로써 완벽하게 신경보호(neuroprotective)하였다. PI 형광은 CA1(n=12, p＜0.001 대 저산소증 대조군)의 0.2±0.02%에서 감지되었다. 티오닌 염색 절편에서, 신경세포는 비처리된 배양 또는 대조군 배양에서의 신경세포와 구분되지 않았다.
저산소 처리 직후까지 L-ArgSp의 첨가가 이루어지지 않아도, 상당한 신경보호 효과가 여전히 관찰되었다. 이것은 EC50이3 μM 및 30 μM 사이에 위치하는 농축 종속 상태(concentration dependent, 0.3-300 μM)를 보이는 것이다. 본 배양의 CA1 하부에 발견되는 장애는 감소되어(도 1, 표 1-하기 참조), 화합물의 첨가지연이 신경보호 효과를 상당히 감소시키지 않음을 알 수 있었다.
표 1
표 1 은 PI 형광이 3시간동안의 저산소 처리(%장애 CA1) 후 24시간 경과시 감지되는 CA1 각추 세포층 부위를 퍼센트로 정량화한 것이다. 저산소증에 노출된 모든 배양으로부터 산출된 데이터는 (((%장애 대조군 저산소증-%장애 약물처리)/%장애 대조군 저산소증)*100)으로 계산되었다. 데이터는 평균±오차, n=배양수, *p＜0.05, **＜0.01, ***p＜0.001 대 저산소증 대조군으로 표현된다.
L-ArgSp의 스페르미딘(spermidine)과 아르기닌(arginine) 화합물이 신경보호 효과에 중요한 영향을 미치는지를 결정하기 위하여, 저산소 처리 후 300 μM 스페르미딘과 300 μM L-아르기닌의 추가 효과를 평가하였다.
스페르미딘 또는 L-아르기닌 어떤 것도 개별적으로 장애 감소를 유발하지는 않는다(표 1 참조). 이러한 데이터는 신경보호 효과를 위해서는 L-아르기닌과 스페르미딘을 결합하는 등의 상기 서술한 구조를 갖는 화합물이 신경보호 효과를 위해서는 필요하다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 스페르미딘이 칼슘 컨덕턴스(conductances)를 직접 방해한다고 주장한 공개번호 WO 91/00853의 진술과는 반하는 것이다. 본 발명에서, 분석 결과 순수 스페르미딘은 아무런 신경보호 효과를 갖지 않는다는 것을 밝혔다. 이러한 결과의 차이는 공개번호 WO 91/00853에서 스페르미딘에 아무런 정제(purification)가 시도되지 않았고 사용된 스페르미딘이 비정제된 것이어서 초래된 것으로 추정된다.
(3)카르바모일산 곁사슬(carbamoyl acid side chain) 교체의 효과
아르기닌 잔사가 도말된 카르바모일산 리신(cabamoyl acids lysine) 또는 오니틴(ornithine)으로 교체될 때, 화합물의 신경보호 효과는 L-ArgSp보다 미미하다. 그럼에도 불구하고, 신경보호 효과는 여전히 관찰된다. 저산소 처리 직후 300 μM L-리시닐스페르미딘(L-lysinylspermidine, L-LysSp)의 첨가로 CA1 부위(표 1 참조)에서 소량이지만 중요한 PI 형광 감소가 일어난다. 저산소증 처리후 300 μM-L-오니틸스페르미딘(L-ornithylspermidine, L-OrnSp)의 첨가로 소량의 중요한 장애 감소가 이루어진다.
(4)신경보호 효과의 특성
저산소증 처리 후 300 μM D-ArgSp, D-LysSp 또는 D-OrnSp 첨가로 PI 형광이 감소되는 것을 관찰할 수 없으므로(표 1 참조), L-카르바모일산을 각각의 D-엔안티오머(enantiomer)와 교체하면 L-엔안티오머에 관한 화합물의 신경보호 효과가 상당히 감소한다. 또한, CA1 하부 세포가 위축되고, 암-염색되는 것으로 보이고, 피크노틱 핵(pyknotic nuclei)이 신경세포 사멸을 암시한다. 결국 L 광학 활성이 신경보호 효과에 중요하다는 것을 알 수 있다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 화합물은 L 광학 활성을 갖는다. 그리고, WO 92/00853에서의 내용과는 달리, 아르기닌(화합물 A와 B) 대신 리신을 대체함으로써 신경보호 효과를 감소시키지만 신경보호 활동에 역행하지는 않는다.
(5)막대 그래프
도 2 는 저산소 처리 직후 첨가된 L-ArgSp(0.3-300 μM)의 농축-종속하는 신경보호 효과를 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 신경손상이 PI 형광이 3시간의 저산소증 처리(%장애CAT) 후 24시간 경과시 측정되는 CA1의 부위를 퍼센트로 표시한 것이다. (***p＜0.001, **p＜0.01, *p＜0.5 대 대조군 저산소증(대조군)).
n=108 대조군. n=14 0.3 μM, n=7 3 μM, n= 14 30 μM, n=16 300 μM).
(6)L-ArgSp는 NMDA 유도 신경손상을 막지 않는다.
180분간 10 μM NMDA에 노출된 후 24시간 경과시, PI 형광은 각추 세포층의 CA1 하부에서 감지되지만, 배양의 다른 부위의 어느 부분에서도 감지되지 않는다. NMDA의 농축을 30 μM으로 증가시키면 심각한 손상을 일으키고, 각추 세포층의 CA1 및 CA3에 엄청난 신경손상이 발생하지만, 덴테이트 자이러스의 그래뉼 세포가 보충된다. 실험시 배양배지에 300 μM L-ArgSp를 첨가해도 10 μM 또는 30 μM NMDA에 의한 손상을 감소시키지 않는다. 도 3 은 NMDA 후 첨가될 때 NMDA-유도 신경유독성에 대한 L-ArgSp의 신경보호 효과의 결핍을 증명하는 막대그래프가 도시된다. 신경손상은 PI 형광이 180분간 NMDA에 노출된 후 24시간 경과시 측정되는 CA1(막힌 막대) 또는 CA3(마름모 막대) 부위의 퍼센트로 표시된다(평균±오차, 각 그룹에 대한 n=8).
(7)혈류 흐름 연구
본 실험의 결과는 하기 표 2에 보여진다.
표 2
쥐가 깨기 직전, 주입 후 60분 경과시 이루어진 혈압기록은 약물 투여 후 10분 경과시 이루어진 혈압기록과 동일하다. L-ArgSp에 의해 생산된 MABP의 소량 감소는 통계상 중요하다. L-ArgSp의 투여후 동물들의 체온 또는 박동률에 미치는 영향은 없다. 깨어난 후, 동물들에 대한 화합물의 부작용은 발견되지 않았다. 1 mg/kr L-ArgSp의 투여 후 3일이 경과하는 동안 5마리의 쥐가 더 의식을 회복하였으나 장기적인 행동결함은 발견되지 않았다.
(8)L-ArgSp는 진공상태에서 전뇌 국소빈혈(forebrain ischaemia) 후 신경손상을 감소한다.
15분 후 전뇌 국소빈혈는 심각한 손상을 받고 해마 형성동안 신경손상을 일으킨다. 국소빈혈 후 24시간 평가한 결과, 비이클(vehicle)을 수여받은 동물은 CA1 및 CA3에 신경손실을 보이고, 덴테이트 자이러스는 부위별로 강한 종속성을 띤다(CA1＜CA3＜DG). 이쉬매이아의 주입 전 15분경에 1 mg/kr L-ArgSp 처리된 동물의 경우, 특히 손상받기 쉬운 CA1 부위에서 신경손실이 상당히 지연된다. 이러한 데이터는 조직학적으로 결정된 CA1 및 CA3에서의 생존 신경세포(%생존 신경세포)와 비이클-처리(막힌 막대)와 L-ArgSp 처리(마름모 막대)된 동물의 덴테이트 자이러스(DG)를 퍼센트로 표시한 히스토그램을 나타내는 도 4 에 도시된다.
(**p＜0.01, *p＜0.05 대 비이클-처리 대조군; 데이터는 평균±오차, n=5 대조군, n=7 L-ArgSp).
실시예 토론
고형 단계의 화학기술을 사용하여 다른 것 중 아르기닐스페르미딘을 합성하였다. 비록 화합물의 첨가를 저산소증 에피소드 종결까지 지연해도 이러한 화합물, 특히 L-엔안티오머는 상당한 신경보호 효과를 띤다.
데이터는 예를 들어 스페르미딘과 L-Arg를 결합하여 신경보호 효과를 보유하도록 하는 것과 같이 본 발명의 화합물이 아미이드 결합에 의하여 상기 언급한 일차 화합물을 이차 화합물에 결합하는 것을 보여준다. 이 경우, 스페르미딘과 L-Arg를 개별적으로 사용하면 아무 효과도 일어나지 않는다. 따라서, 결론적으로, 본 발명의 화합물, 특히 L-ArgSp의 활동은 일차 및 이차 화합물의 존재를 하나의 분자에 요구하는 수용체 사이트(site)를 통해 성립된다.
L-아르기닌을 L-리신(L-LysSp) 또는 오르니틴(L-OrnSp)으로 교체하면 여전히 활성 화합물을 획득할 수 있다. 이것은 구아니디니움(guanidinium) 기능이 최적 활성에 적합하지만 다른 바람직한 그룹도 상대적으로 성공적으로 대체될 수 있다는 것을 보여준다.
따라서, 활성에 바람직한 특징은 구아니디니움 또는 암모니아 이온(ammonium ion) 및 알파-카르바모일(alpha-carbamoyl) 그룹에 말단 양성 전하(termianl positive charge)를 배치하는 것이다. 이것은 곁사슬(side chain)의 상대적 길이와 Arg에서 Lys로 그리고 Orn에로의 전체 길이 감소에 의해 표시되며 화합물은 두 기능적 결합을 표시할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 결합 사이트(site)는 광학특이적이며, 카르바모일산은 광학활성을 위해 L-결합이 요구된다. D-ArgSp 및 D-LysSp는 상대 L-엔안티오머와 관련하여 비활성이다.
혈류의 흐름은 본 발명의 화합물이, 특히 화확식 A에서, FTX보다 혈류 흐름에 부작용을 덜 일으킨다.
실시예 6
실시예 5의 절차가 반복되지만, 일군의 화학물 A의 투약량을 달리한다. 그 결과는 하기 표 3에 도시된다.
표 3
실시예 7
실시예 5의 절차가 반복되지만, 알파-아미노 그룹에서 치환함으로써 화합물 A로부터 유도된 다양한 화합물을 사용한다. 결과는 하기 표 4에 도시된다.
표 4
*p〈.0.5, **p〈0.01
실시예 8
실시예 5의 과정이 반복되나, 화합물 A의 아르기닌이 피리딜알라닌(pyridylalanine)에 의해 교체되는 화합물(PyrAla3,4)을 사용한다. 결과는 하기 표 5에 도시된다.
표 5
이러한 화합물은 역보호 효과(negative protective effect)를 갖는 것으로 간주할 수 있다.
실시예 9
실시예 5의 과정이 반복되나, 화합물 A의 아르기닌이 사이트룰린(citrulline)으로 치환되는 화합물 I 또는 화합물 A의 아르기닌이 글루타민(glutamine, Gln3,4)으로 치환되는 화합물을 사용한다. 결과는 하기 표 6에 도시된다.
표 6
화합물 I가 상당한 보호 효과를 나타내는 반면, Gln3,4는 아무 효과도 보이지 않음을 알 수 있다.
실시예 10
실시예 5의 과정이 반복되나, 화합물 A 또는 Rc가 테트라메틸렌 그룹, 예를 들어 Rb및 Rc에 있는 총 탄소 원자(atoms)수가 8인 화합물(Arg4,4)을 사용한다. 결과는 하기 표 7에 도시된다.
표 7
화합물 A가 상당한 보호 효과를 가지는 반면 Arg4,4는 아무 영향을 미치지 못함을 알 수 있다.
결론적으로, 화합물에 기초한 스페르미딘(폴리아민(polyamine))은 새로운 고형 상 접근(solid phase approach)을 사용하여 합성되고, 해마 절편 배양에서의 저산소증-유도 신경손상에 대한 보호 효과가 평가되었다. 300 μM L-아르기닐스페르미딘의 신경보호 효과는 저산소-처리 전 첨가시 관찰될 때 현저히 드러났다. 저산소증-처리 후 첨가되면, 보호가 농축-종속 방식으로 3-30 μM의 EC 50으로 300 μM에서(＞70%) 보호효과가 드러났다. L-리시닐스페르미딘 및 L-아르기닐스페르미딘 또한 아르기닐스페르미딘보다는 적지만, 상당한 보호 효과를 보였다. 모든 3가지 화합물의 D-엔안티오머는 신경보호 활성 제공에 있어 L-엔안티오머보다 비활성이었다.
고형 상/결합 화학(solid-phase/combinational chemistry) 및 시험관에서의 신경손상 모델(예를 들어, 손상에 관련한 국소빈혈)은 많은 잠재적 신경보호 화합물을 조사하고 합성할 수 있는 바람직한 방법을 제공한다. 이러한 접근은 뇌졸중 등의 발작 후 발생되는 심각한 신경손상을 치료할 수 는 화합물 제조를 가능하게 한다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식(I)로 표시되는 실질적으로 순수한 화합물.
    화학식(I)
    상기 화학식(I)에서,
    Q는 아미디노(amidino) 그룹, 시아노(cyano) 그룹 또는 화학식 XYN- 그룹을 나타내며, X, Y는 동일하거나 상이하고, 각각은 수소원자, 저급 알킬 그룹, 또는 간단한 헤테로-원자를 포함하는 그룹을 나타내거나 질소 원자와 함께 질소를 포함하는 헤테로사이클릭 그룹을 형성하고;
    Ra는 C1~C6의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌(alkylene) 또는 알케닐렌(alkenylene) 그룹을 나타내며, 각각은 C1~C6의1 내지 4개의 알킬 그룹들에 의해 선택적으로 치환되고;
    Rb및 Rc각각은 직쇄 C3~C4의 알킬렌 또는 알케닐렌 그룹이도, 각각은 C1~C3의 1 내지 2개의 알킬 그룹에 의해 선택적으로 치환되고, 상기 Rb및 Rc직쇄에서의 총 탄소 원자의 수는 7이고;
    R2및 R3는 동일하거나 상이하며, 각각은 수소 원자 또는 화학식 R, RCO-, ROCO-, 또는 RNHCO- 그룹을 나타내며,
    여기서 R은 저급의 알킬 그룹 또는 아릴(aryl) 그룹이고, 상기 알킬 또는 아릴 그룹은 하기 정의된 하나 또는 그 이상의 치환체 α에 의해 선택적으로 치환되고;
    별표(asterisk)로 표시된 키랄(chiral) 탄소 원자는 L 구조이고;
    Z는 방향족 아미노산 잔사이고;
    n은 0 또는 1이고;
    R1은 수소 원자, 저급 알킬 그룹 또는 아릴 그룹이며, 상기 알킬 또는 아릴 그룹은 하기 정의된 하나 또는 그 이상의 치환체 α에 의해 선택적으로 치환되고;
    W는 수소 원자, 알킬 또는 아릴 그룹을 나타내고;
    치환체 α는 할로겐 원자, 아미노 그룹, 알킬아미노 그룹, 디알킬아미노 그룹, 시아노(cyano) 그룹, 히드록시 그룹, 알킬 그룹(치환된 그룹이 알킬인 경우를 제외하고), 아릴 그룹, 카르바모일 그룹, 알킬카르바모일 그룹, 디알킬카르바모일 그룹 및 카르복시 그룹과 그의 에스테르에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 화학식(Ia)로 표시되는 실질적으로 순수한 화합물.
    화학식(Ia)
    상기 화학식(Ia)에서 Q, Ra, Rb, Rc, R2, R3, n 및 R1은 제1항에서 정의된 바와 같다.
  3. 제1항에 있어서,
    화학식(Ib)로 표시되는 실질적으로 순수한 화합물.
    화학식(Ib)
    상기 화학식에서,
    X, Y, Z, n 및 R1은 제1항과 같이 정의되고;
    x는 1 내지 5의 정수이고;
    y는 3 또는 4이고;
    R4, R5, R6및 R7은 동일하거나 상이하며, 각각은 질소 원자 또는 저급 알킬 그룹을 나타내고;
    별표로 표시된 키랄 탄소 원자는 L 구조이다.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    Z는 L 구조의 방향족 아미노산 잔사를 나타내는, 실질적으로 순수한 화합물.
  5. 제1항에서 정의된 화학식(I)로 표시되는, 비독성 화합물.
  6. 제2항에 정의된 화학식(Ia)로 표시되는, 비독성 화합물.
  7. 제3항에 정의된 화학식(Ib)로 표시되는, 비독성 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  12. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  13. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  14. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  16. 제1항에 있어서, 화학식(I)의 화합물은
    인
    실질적으로 순수한 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
    국소빈혈로 유발되는 포유류의 신경손상 보호용의 약 제조에서의 제1항 내지 제16항중 어느 한 항의 화합물 용도.
  18. 국소빈혈 전, 후, 또는 중간에 제1항 내지 제16항중 어느 한 항의 비독성 화합물의 유효량을 포유류에 투여하여, 국소빈혈로 유발되는 신경손상으로부터 상기 포유류를 보호하기 위한 포유류 치료방법.
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