KR20010024899A - Ｆｃ 수용체의 삼차원 구조 및 모델 및 그의 용도 - Google Patents

Ｆｃ 수용체의 삼차원 구조 및 모델 및 그의 용도 Download PDF

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KR20010024899A
KR20010024899A KR1020007008582A KR20007008582A KR20010024899A KR 20010024899 A KR20010024899 A KR 20010024899A KR 1020007008582 A KR1020007008582 A KR 1020007008582A KR 20007008582 A KR20007008582 A KR 20007008582A KR 20010024899 A KR20010024899 A KR 20010024899A
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fcr
seq
fcγriia
dimensional
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KR1020007008582A
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피.마크 호거드
마리에스. 포웰
이안에프.씨. 멕켄지
켈리에프. 맥스웰
토마스피.제이. 가렛
비다나 에파
죠나단비. 바엘
베리알. 매튜스
토마스디. 맥카디
저프레이에이. 피에터즈
Original Assignee
일렉서스 피티와이 리미티드
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Abstract

결정, 결정 구조 FcγRIIa 단백질, FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표 및 FcγRIIa 구조로부터 유도된 구조 및 모델이 개시되어 있다. FcγRIIa 구조로부터 유도된 FcεRI 단백질의 결정 및 FcεRI 단백질 모노머 및 다이머의 삼차원 구조 역시 개시되어 있다. 또한 FcγRIIa 구조로부터 유도한 FcγRIIIb 단백질의 삼차원 구조 및 FcγRIIIb의 모델이 개시되어 있다. 본 발명은 또한 그러한 결정, 결정 구조 및 모델을 생성하는 방법을 포함한다. 구조에 기초한 약물 디자인 및 치료용 조성물을 포함하는 그러한 결정, 결정 구조 및 모델의 용도를 또한 개시하였다.

Description

Ｆｃ 수용체의 삼차원 구조 및 모델 및 그의 용도{Three dimentional structures and models of Fc receptors and uses thereof}
SEQUENCE LISTING
＜110＞ Hogarth, P. Mark
Powell, Maree S.
McKenzie, Ian F.C.
Maxwell, Kelly F.
Garrett, Thomas P.J.
Epa, Vidana
＜120＞ THREE DIMENSIONAL STRUCTURES AND MODELS OF Fc RECEPTORS
AND USES THEREOF
＜130＞ 4102-4-pct
＜140＞ Not Yet Assigned
＜141＞ 1999-02-04
＜150＞ 60/099,994
＜151＞ 1998-09-11
＜150＞ 60/073,972
＜151＞ 1998-02-06
＜160＞ 15
＜170＞ PatentIn Ver. 2.0
＜210＞ 1
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence:PRIMER
＜400＞ 1
tacgaattcc tatggagacc caaatgtctc 30
＜210＞ 2
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence:PRIMER
＜400＞ 2
cattctagac tattggacag tgatggtcac 30
＜210＞ 3
＜211＞ 171
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 3
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Phe Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys
115 120 125
Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val
165 170
＜210＞ 4
＜211＞ 8
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 4
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys
1 5
＜210＞ 5
＜211＞ 170
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 5
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys
115 120 125
Phe Ser Arg Ser Ile Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
＜210＞ 6
＜211＞ 170
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 6
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys
115 120 125
Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
＜210＞ 7
＜211＞ 261
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 7
Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Val Phe
1 5 10 15
Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu Pro Gly
20 25 30
Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Val Asn Gly Thr Ala Thr Gln Thr Ser
35 40 45
Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser Gly Glu
50 55 60
Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile Gln Leu
65 70 75 80
Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg Val Phe
85 90 95
Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys Asp Lys
100 105 110
Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Phe Lys Phe Phe
115 120 125
His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile Ser His Asn
130 135 140
Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr Thr Ser Ala
145 150 155 160
Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro Val Leu Asn
165 170 175
Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val Thr Leu Ser
180 185 190
Cys Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu Tyr Phe
195 200 205
Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn Thr Ser Ser
210 215 220
Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Trp
225 230 235 240
Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu
245 250 255
Leu Glu Leu Gln Val
260
＜210＞ 8
＜211＞ 174
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 8
Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp
1 5 10 15
Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala
20 25 30
Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu
35 40 45
Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asn
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp
65 70 75 80
Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro
85 90 95
Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser
100 105 110
Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys
115 120 125
Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys Ala
130 135 140
Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170
＜210＞ 9
＜211＞ 172
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 9
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1 5 10 15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20 25 30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35 40 45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85 90 95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100 105 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115 120 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130 135 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala
165 170
＜210＞ 10
＜211＞ 170
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 10
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys
115 120 125
Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
＜210＞ 11
＜211＞ 170
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 11
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Trp Gly Ala Arg Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Phe Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys
115 120 125
Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
＜210＞ 12
＜211＞ 170
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 12
Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn Val
1 5 10 15
Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Trp Gly Ala Arg Ser Pro
20 25 30
Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr
35 40 45
His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly
50 55 60
Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu Phe Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu
85 90 95
Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp
100 105 110
Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys
115 120 125
Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser
130 135 140
His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe
145 150 155 160
Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
＜210＞ 13
＜211＞ 287
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 13
Met Asp Pro Lys Gln Thr Thr Leu Leu Cys Leu Val Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ile Gln Ala Gln Glu Gly Asp Phe Pro Met Pro Phe Ile Ser
20 25 30
Ala Lys Ser Ser Pro Val Ile Pro Leu Asp Gly Ser Val Lys Ile Gln
35 40 45
Cys Gln Ala Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gln Leu Met Ile Ile Lys
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Glu Ile Gly Arg Arg Leu Lys Phe Trp Asn Glu
65 70 75 80
Thr Asp Pro Glu Phe Val Ile Asp His Met Asp Ala Asn Lys Ala Gly
85 90 95
Arg Tyr Gln Cys Gln Tyr Arg Ile Gly His Tyr Arg Phe Arg Tyr Ser
100 105 110
Asp Thr Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Leu Tyr Gly Lys Pro Phe Leu
115 120 125
Ser Ala Asp Arg Gly Leu Val Leu Met Pro Gly Glu Asn Ile Ser Leu
130 135 140
Thr Cys Ser Ser Ala His Ile Pro Phe Asp Arg Phe Ser Leu Ala Lys
145 150 155 160
Glu Gly Glu Leu Ser Leu Pro Gln His Gln Ser Gly Glu His Pro Ala
165 170 175
Asn Phe Ser Leu Gly Pro Val Asp Leu Asn Val Ser Gly Ile Tyr Arg
180 185 190
Cys Tyr Gly Trp Tyr Asn Arg Ser Pro Tyr Leu Trp Ser Phe Pro Ser
195 200 205
Asn Ala Leu Glu Leu Val Val Thr Asp Ser Ile His Gln Asp Tyr Thr
210 215 220
Thr Gln Asn Leu Ile Arg Met Ala Val Ala Gly Leu Val Leu Val Ala
225 230 235 240
Leu Leu Ala Ile Leu Val Glu Asn Trp His Ser His Thr Ala Leu Asn
245 250 255
Lys Glu Ala Ser Ala Asp Val Ala Glu Pro Ser Trp Ser Gln Gln Met
260 265 270
Cys Gln Pro Gly Leu Thr Phe Ala Arg Thr Pro Ser Val Cys Lys
275 280 285
＜210＞ 14
＜211＞ 171
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 14
Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn
1 5 10 15
Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro
35 40 45
Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val
65 70 75 80
His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu
85 90 95
Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys
100 105 110
Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln
115 120 125
Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His
130 135 140
Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu
145 150 155 160
Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
＜210＞ 15
＜211＞ 171
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 15
Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn
1 5 10 15
Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro
35 40 45
Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val
65 70 75 80
His Leu Thr Val Leu Phe Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu
85 90 95
Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys
100 105 110
Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln
115 120 125
Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His
130 135 140
Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu
145 150 155 160
Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln
165 170
Fc 수용체(FcR)들은 면역글로불린(Ig)의 Fc 부분에 특이적인 고도로 관련된 수용체의 한 집단(family)이다. 이들 수용체는 정상 면역 및 감염에 대한 내성에 있어서 주된 역할을 하며 세포성 효과기 암(arm)에 액성 면역 시스템을 제공한다. 수용체들은 각각의 면역글로불린 클래스에 대하여 정의되어 왔으며 그러한 것들은 이들이 결합하는 Ig의 클래스에 의해 정의된다(즉, Fc 감마 수용체(Fcγ)는 감마 면역글로불린(IgG)에 결합하고, Fc 엡실론 수용체(Fcε)는 엡실론 면역글로불린(IgE)에 결합하며, Fc 알파 수용체(Fcα)는 알파 면역글로불린(IgA)에 결합한다). FcγR 수용체 중에서, 3개의 소집단(subfamily) 원들이 정의되었는데; FcγRI은 IgG에 대한 고친화 수용체이고, FcγRII는 활발하게 결합하여 면역 복합체들을 응집시키는 IgG에 대한 저친화 수용체이며; FcγRIII은 면역 복합체에 결합하는 저친화 수용체들이다. 이들 수용체들은 구조적으로 고도로 관련되어 있으나, 다른 기능을 수행한다. FcγRIIa의 구조 및 기능은 그의 면역 복합체와의 상호 작용 및 그의 질병과의 관련으로 인해 중요하다.
FcγR은 대부분의 조혈 세포 상에서 발현되어, IgG와의 결합을 통해 면역계의 항상성 및 감염에 대한 숙주 방어에 있어서 중요한 역할을 수행한다. FcγRII는 본질적으로 IgG 면역 복합체에만 결합하여 예를 들면 단핵구, 대식구, 호중구, 호산구, 혈소판 및 B 임파구를 포함하는 다양한 세포 타입 상에서 발현되는 IgG에 대한 저친화 수용체이다. FcγRII는 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 면역 복합체의 정화, 염증성 매개체의 방출 및 항체 생산의 조절을 포함하는 다양한 면역 및 염증성 응답에 수반된다. IgG의 FcγR에의 결합은 FcγR에 의한 조절을 수반하는 질병 증후를 초래한다. 예를 들면, 자가면역 질환 혈소판감소성 자반병은 혈소판의 FcγR-의존성 IgG 면역 복합체 활성화 또는 FcγR+ 식세포에 의한 이들의 파괴에 기인한 조직(혈소판) 손상을 수반한다. 또한, 다양한 염증성 질환들은 타입 II 및 타입 III 과민 반응을 포함한 IgG 면역 복합체(예, 류머티즘 관절염, 전신성 홍반성 루푸스)를 수반하는 것으로 알려졌다. 타입 II 및 타입 III 과민 반응은 IgG에 의해 매개되며, 이는 보체-매개된 또는 식세포의 효과기 기전 중 하나를 활성화시켜서 조직 손상을 유발할 수 있다.
FcγRIIa, FcεRI 또는 실제로 임의의 FcR의 단백질 구조의 해명은 질병 처치용 치료 및 진단 시약의 제제화에 있어서 중요하다. 본 발명의 발견 이전까지, FcγRIIa가 면역 응답을 조절하는 구조 및 결과의 기전은 알려지지 않았다. 따라서 FcγRIIa의 전반적인 다기능에도 불구하고, 질병의 치료 및 진단용으로 유용한 시약의 개발은 수용체의 구조적 정보의 부족에 의해 방해를 받았다. FcγRIIa의 선형 핵산 및 아미노산은 이전에 보고되었다(참조문헌: Hibbs et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, pp. 2240-2244, 1988). 인간 FcγRIIa(참조문헌: Hulett et al., Eur. J Immunol., vol. 23, pp 40-645, 1993; Hulett et al., J. Biol. Chem., vol. 69, pp 15287-15293, 1994; and Hulett et al., J. Biol. Chem., vol. 270, pp 21188-21194, 1995), 인간 FcγRIIb(참조문헌: Hibbs et al., J Immunol., vol. 152, p. 4466, 1994; and Tamm et al., J. Biol. Chem., vol. 271, p. 3659, 1996) 및 쥐 FcγRI(참조 문헌: Hulett et al., J. Immunol., vol. 148, pp 1863-1868, 1991)의 영역들을 동정하려는 돌연변이유발 연구는 FcγR에 대한 IgG의 결합의 중요한 영역을 규정하였다. 그러나, 선형 서열에 기초한 정보는 단백질의 삼차원 구조 및 그의 기능성 도메인들을 정확히 예측할 수 없었다. 후버 등[참조: Huber et al., J. Mol＞ Biol., vol. 230, pp. 1077-1083, 1993]은 신생 쥐 Fc 수용체 단백질(FcRn)의 결정 형성을 기술하였다. 버메이스터 등[참조: Burmeister et al., Nature, vol., 372, pp. 336-343, 1994; and Nature, vol. 372, pp. 379-383, 1994]은 FcRn 결정들의 구조를 기술하였다. 그러나, FcRn은 기능 및 구조상으로 주요 조직적합성 단백질 복합체에 밀접하게 관련되어 있고 백혈구 FcγR 집단에는 관련되어 있지 않다. 따라서, FcRn의 단백질 구조로는 본 발명의 FcR 구조를 예측할 수 없다.
FcεR은 유선 세포에서 발현되어 IgE의 결합을 통해 염증성 면역 응답을 유발하며, 이는 우선적으로 유선 세포의 탈과립화(degranulation)(예, 히스타민 및 세로토닌)시 염증성 매개체의 방출에 기인한다. 이들 매개체의 방출은 국재화된 혈관 투과성 및 다형핵 세포의 이 부위로의 유입을 포함하는 국부 조직에서의 유체의 증가를 유발한다. 따라서 IgE의 FcεRI에의 결합은 장으로 부터의 유체의 방출, 및 증가된 점액 분비 및 기관지 수축을 수반하는 질병 증후를 유발하며, 그러한 증후는 통상적으로 앨러지성 염증을 수반하는 질병과 관련되어 있다. 따라서, FcεRI의 단백질 구조의 해명은 질병 처치, 특히 알러지성 염증 및 기타 Th2-기초 면역 응답에 관련된 질병의 처치를 위한 치료 및 진단 시약의 제제화에 있어서 중요하다. 상기한 FcγR에 대하여, 인간 FcεR의 선형 핵산 및 아미노산 서열은 이전에 보고되었다[참조문헌: Kochan et al., 1998, Nucl. acid. Res. 16:3584]. 그러나 본 발명의 발견시까지 FcεR이 면역 응답을 조절하는 구조 및 결과의 기전은 알려져 있지 않았다. 따라서, FcεRI의 전반적인 지식에도 불구하고, 앨러지성 염증과 관련된 질환 등의 질병의 치료 및 진단용의 유용한 시약의 개발은 이 수용체의 구조적 정보의 부족으로 인하여 장애를 받았다.
따라서, 당업계에는 Fc 수용체의 삼차원 구조 및 모델을 밝히고 그러한 구조 및 모델을 약물 디자인 등의 치료적 전략에 사용할 필요성이 있다.
본 발명은 결정형 FcγRIIa, 결정형 FcεRI를 포함하는 Fc 수용체(FcR)의 삼차원 구조, FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표, FcγRIIa의 삼차원 구조, FcR 및 특히 FcγRIIa로부터 유도된 FcεRI 및 FcγRIIIb의 삼차원 구조, 이들의 모델 및 그러한 구조 및 모델들의 용도에 관한 것이다.
도 1은 정제 과정 동안 PsFcγRIIa 단백질의 SDS-PAGE 분석의 스캔 이미지이다.
도 2는 정제된 PsFcγRIIa 단백질의 2차원 NEPHGE 분석의 스캔 이미지이다.
도 3은 인간 면역글로불린 G의 상이한 아이소타입에 결합하는 정제된 PsFcγRIIa 단백질의 랭뮤어(Langmuir) 플롯을 나타낸다.
도 4는 PFcγRIIa의 다이머의 도식적 표시를 나타낸다.
도 5는 FcγRIIa 도메인들 1 및 2에서 베타 시이트의 부분을 나타내며 FcγRII의 동형체의 아미노산 서열과 비교한다.
도 6은 도 4에 나타낸 FcγRIIa 구조의 입체적 관찰을 나타낸다.
도 7은 FcγRIIa의 IgG에의 결합에 수반되는 아미노산들의 위치를 나타낸다.
도 8은 IgG 결합 영역을 나타내는 위치 및 수반된 아미노산들의 측쇄의 확대도를 나타낸다.
도 9는 알라닌으로 돌연변이 되었을 때 FcγRIIa에 대한 IgG 결합을 증대시키는 IgG 결합 영역을 나타내는 아미노산들의 확대도를 나타낸다.
도 10은 다이머 경계에 기여하는 하나의 FcγRIIa 모노머의 영역의 확대도를 나타낸다.
도 11은 FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열과 FcγRI, FcγRIIIb 및 FcεRI 단백질의 아미노산 서열들의 비교를 나타낸다.
도 12는 FcγRIIa, FcγRI, FcγRIIIb 및 FcεRI 단백질에 의해 공유되는 구조적 특정의 비교를 나타낸다.
도 13은 FcγRIIa 및 FcεRI의 아미노산의 서열의 서열 배좌를 나타낸다.
도 14는 FcεRI 모노머의 구조의 웜(worm) 표시를 나타내는 스캔 이미지를 나타낸다.
도 15는 FcεRI 다이머의 구조의 웜(worm) 표시를 나타내는 스캔 이미지를 나타낸다.
도 16은 FcεRI 다이머 모델의 분자 표면 표시를 설명하는 스캔 이미지를 나타낸다.
도 17은 약물 디자인을 위한 FcR 구조에서 표적 부위에 대한 개략도이다.
도 18은 FcγRIIa 및 FcγRIIIb의 아미노산 서열의 서열 배좌를 나타낸다.
본 발명은 Fc 수용체 (FcR) 단백질의 삼차원 구조의 발견, 그러한 삼차원 구조의 모델들, 그러한 구조를 사용하여 구조에 기초한 약물 디자인하는 방법, 그러한 방법에 의해 동정된 화합물들 및 치료 조성물에 있어서 그러한 화합물의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 Fc 감마 수용체 IIa (FcγRIIa)의 신규 결정들, Fc 엡실론 수용체 I (FcεRI)의 신규 결정들, 그러한 결정들의 생산 방법, FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표, FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조, FcεRI 및 FcγRIIIb를 포함하는 FcγRIIa 구조로부터 유도된 FcR 구조 및 모델들, 및 다른 FcR 구조를 유도하는 및 약물 디자인 전략에 있어서 그러한 구조 및 모델들의 용도에 관한 것이다. 용어 "하나의" 실체(entity)는 하나 이상의 그 실체를 의미하며; 예를 들면 한 화합물은 하나 이상의 화합물들 또는 적어도 한 화합물을 의미함에 유의해야 한다. 그러므로, 용어들 "하나의", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 용어 "포함하는", "함유하는" 및 "갖는"은 상호 교환적으로 사용될 수 있음에 유의해야 한다. 또, " ∼으로 이루어진 군 중에서 선택된" 화합물은 둘 이상의 화합물들의 혼합물(즉, 조합)을 포함하는 후속되는 리스트에서 하나 이상의 화합물을 의미한다. 본 발명에 따르면 단리된 또는 순수한 단백질은 그의 천연 환경으로부터 제거된 단백질이다. 그러므로, "단리된" 및 "생물학적으로 순수한"은 단백질이 정제된 정도를 반영할 필요까지는 없다. 본 발명의 단리된 단백질은 그의 천연 원으로부터 얻을 수 있거나, 재조합 DNA 기법을 사용하여 생산할 수 있거나 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 또한 용어 "삼차" 및 "삼차원"은 상호교환적으로 사용될 수 있음에 유의해야한다. 또 "FcR 단백질"에 대한 언급은 단순히 "FcR"로서 인용될 수 있으며 그러한 용어들은 FcR 단백질의 폴리펩티드 및(또는) 모노머 또는 다이머 등의 완전한 FcR 단백질, FcR 단백질의 일부를 의미하는데 사용될 수 있음에 유의해야 한다. 예를 들면, 모노머 또는 다이머에 대하여 구체적으로 언급할 경우, 그러한 용어는 대표적으로 FcR 단백질 명과 연관되어 사용된다.
FcγRIIa의 결정 구조의 생성은 1998년 2월 6일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제 60/073,972호에 상세히 기술되어 있다. 미국 임시 특허 출원 제 60/073,972호의 전문을 본 명세서서에 참고로 인용한다.
본 발명의 한 실시태양은 모델이 Fc 수용체 (FcR) 단백질의 삼차원 구조를 나타내는 Fc 수용체의 모델을 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양은 FcR 단백질의 삼차원 구조를 포함한다. 본 발명에 포함되는 FcR 단백질의 삼차원 구조는 표 1-5중 어느 하나에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. 본 발명에 따르면 용어 "실질적으로 일치한다"의 사용은 특정 세트의 원자 좌표(예컨대, 표 1로 나타낸 것들)의 구체화된 삼차원 배좌(conformation)의 적어도 일부에 충분히 공간적으로 유사하여 FcR 단백질의 삼차원 구조가 FcR 단백질의 삼차원 배좌를 규정하는 원자 좌표를 결정하기 위한 기초로서 특정 세트의 원자 좌표를 사용하여 모델링 되거나 계산되는 것(즉, 분자 치환에 의해)을 허용하는 FcR 단백질의 삼차원 구조의 적어도 일부를 의미한다. 본 발명에 따르면, 제 1 FcR의 다이머의 삼차원 구조는 제 2 FcR의 모노머의 삼차원 구조를 나타내는 원자 좌표에 실질적으로 일치하며 그 역도 성립한다. 첫 번째 예로서, 제1 FcR 단백질(즉, 제 1 FcR 단백질 다이머의 모노머)의 구조의 적어도 일부는 제2 FcR 모노머의 삼차원 배좌를 나타내는 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. 두 번째의 반대 경우에 있어서, 제1 모노머의 FcR 단백질은 제2 FcR단백질(즉, 제2 FcR 단백질 다이머)의 적어도 일부에 실질적으로 일치한다. 마찬가지로, 제1 FcR의 주어진 부분 또는 사슬의 삼차원 구조는 제2 FcR의 삼차원 배좌를 나타내는 원자 좌표의 적어도 일부에 실질적으로 일치될 수 있다.
더욱 구체적으로, 주어진 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 구조는 적어도 그러한 구조의 약 50%가 각 도메인 중의 2차 구조 원소들 중의 골격 원자에 대해 약 1.5 Å 이하의 평균 제곱근-평균-제곱 편차(RMSD), 및 더욱 바람직하게는 각 도메인 중의 2차 구조 원소들 중의 골격 원자에 대해 약 1.3 Å 이하, 점차 바람직하게는 약 1.0 Å 이하, 약 0. 7 Å 이하, 약 0.5 Å 이하, 및 가장 바람직하게는 각 도메인 중의 2차 구조 원소들 중의 골격 원자에 대해 약 0.3 Å를 가지는 구조이다. 더욱 바람직한 실시태양에 있어서, 주어진 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 구조는 적어도 그러한 구조의 약 75%가 상기 인용된 평균 제곱근-평균-제곱 편차(RMSD), 및 더욱 바람직하게는 그러한 구조의 적어도 약 90%가 상기 인용된 평균 제곱근-평균-제곱 편차 (RMSD) 값, 및 가장 바람직하게는 약 100%의 그러한 구조가 상기 인용된 평균 제곱근-평균-제곱 편차 (RMSD) 값을 갖는 구조이다.
더욱 더 바람직한 실시태양에 있어서, "실질적으로 일치하는"의 상기 정의는 아미노산 측쇄의 원자들을 포함하는 것으로 확장될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바의 구 "공통 아미노산 측쇄"는 주어진 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 구조 및 그러한 원자 좌표로 실제로 표시되는 구조 모두에 공통적인 아미노산 측쇄를 의미한다. 바람직하게는 주어진 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조는 적어도 약 50%의 공통 아미노산 측쇄들이 약 1.5 Å 이하, 및 더욱 바람직하게는 약 1.3 Å 이하, 점차 바람직하게는 1.0 Å 이하, 0.7 Å 이하, 0.5 Å 이하, 및 가장 바람직하게는 0.3 Å 이하의 평균 평균 제곱근-평균-제곱 편차 (RMSD) 값을 갖는 구조이다. 가장 바람직한 실시태양에 있어서, 주어진 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 구조는 공통 아미노산 측쇄의 적어도 약 75%가 상기 인용된 평균 제곱근-평균-제곱 편차(RMSD), 및 더욱 바람직하게는 공통 아미노산 측쇄의 적어도 약 90%가 상기 인용된 평균 제곱근-평균-제곱 편차 (RMSD) 값, 및 가장 바람직하게는 약 100%의 공통 아미노산 측쇄가 상기 인용된 평균 제곱근-평균-제곱 편차 (RMSD) 값을 갖는 구조이다.
특정 세트의 원자좌표에 실질적으로 일치하는 FcR 단백질의 삼차원 구조는 예를 들면 다음의 데이터: (1) FcR 단백질의 아미노산 서열; (2) 특정 세트의 삼차원 배좌를 갖는 원자 좌표로 표시되는 단백질의 관련된 부분(들)의 아미노산 서열 및 (3) 특정 삼차원 배좌의 원자 좌표로부터 유도한 정보를 사용하여, MODELER (Insight II Homology software package (Insight II (97.0). MSI, San Diego)에 삽입된 바의 A. Sali and T.L. blundell, J. Mol. Biol., vol. 234:779-815, 1993) 등의 적합한 모델링 컴퓨터 프로그램에 의해 모델링시킬 수 있다. 특정 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 FcR 단백질의 삼차원 구조는 또한 이하 상세히 설명하는 분자 치환 등의 방법에 의해서도 계산될 수 있다.
다른 FcR 단백질의 삼차원 구조를 모델링하거나 계산하는데 사용하기 위한 FcR 단백질의 적합한 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 세트의 원자 좌표를 포함한다. 표 1에 나타낸 세트의 삼차원 좌표는 표준 단백질 데이터 은행 포맷(standard Protein Data Bank format)으로 표시된다. 본 발명에 따르면, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIb, FcεRI 및 FcαRI로부터 선택된 FcR 단백질은 표 1에 나타낸 세트의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 삼차원 구조는 한 세트의 원자 좌표를 갖는 가장 유망하거나, 중요한 피트(fit)이다. 본 발명에 의하면, 가장 유망하거나, 중요한 피트는 특정 FcR 단백질이 그 특정 FcR 단백질로부터 유도된 한 세트의 원자 좌표를 갖는 피트를 의미한다. 그러한 원자 좌표들은, 예를 들면 본 명세서에서 제공되는 FcγRIIa 구조에 대해 결정된 좌표 등의 단백질의 결정 구조로부터, 또는 FcεRI 및 FcγRIIIb에 대해 본 명세서에서 결정된 바의 단백질의 구조의 모델로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 천연 발생 또는 재조합에 의해 생산된 FcγRIIa 단백질을 포함하는 모노머성 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하면서 가장 적합한 피트 또는 중요한 피트이다. 본 발명자들에 의해 결정된 FcγRIIa의 삼차원 결정 구조는 표 1의 원자좌표를 포함한다. 또한, 일례로서 FcεRI 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하면서 표 3의 원자 좌표에 모두 실질적으로 일치하며 이것을 갖는 가장 적합한 피트 또는 중요한 피트이며, 본 발명자들에 의해 결정된 FcεRI 모노머의 모델의 삼차원 구조는 표 3의원자 좌표를 포함한다. 이 정의는 유사한 방식으로 기타의 FcR 단백질에도 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 FcR 단백질의 바람직한 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표들, B-값 및(또는) 열적 변수에 실질적으로 일치한다. 표 1에 열거한 그러한 값들은 당업계의 숙련가에 의해 해석될 수 있다. FcR 단백질의 더욱 바람직한 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 삼차원 좌표에 실질적으로 일치한다. FcR 단백질의 더욱 바람직한 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 삼차원 좌표들을 갖는 가장 가망성 있는 피트이다. 실질적으로 일치하고 가망성 있는 피트를 결정하는 방법은 당업계의 전문가에 속하는 것이며 본 명세서의 실시예 부분에서 기술한다.
표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조를 갖는 가장 바람직한 FcR 단백질은, 정렬을 예를 들면 그러한 정렬 프로그램을 수반하는 표준 디폴트 값을 사용하여 수행하는, 예를 들면 DNAsis™프로그램 (Hitachi Software, San Bruno, CA로부터 입수가능함) 또는 MacVector™프로그램(Eastman Kodak Company, New Haven, CT로부터 입수가능함) 또는 GCγ™프로그램(WI, Madison, University of Wisconsin, "GCγ"로부터 입수가능함) 등의 서열 정렬 프로그램을 사용하였을 때, FcR 서열의 전장 길이에 걸쳐서, FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열에 대해, 바람직하게는 서열 번호: 3, 서열 번호: 10, 서열 번호 11 및(또는) 서열 번호: 12를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 25%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 FcR 단백질을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양은 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 포함한다. FcγRIIa 단백질의 적합한 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표들에 실질적으로 일치한다. FcγRIIa의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 2-5에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. FcγRIIa 단백질의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 1에 나타낸 세트의 원자 좌표를 포함한다. FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표의 세트는 표준 단백질 데이터 뱅크 포맷으로 표시된다. FcγRIIa 단백질의 바람직한 구조는 표 1(모노머성 FcγRIIa) 및 표 2 (다이머성 FcγRIIa)에 나타낸 원자 좌표, B-값 및(또는) 열적 변수에 실질적으로 일치한다. 표1에 열거한 바의 그러한 값들은 당업계의 전문가에 의해 해석될 수 있다. FcγRIIa 단백질의 더욱 바람직한 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 삼차원 구조를 가진 가장 가망성 있는 피트를 갖는다. FcγRIIa 단백질의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 2-5에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. FcγRIIa 단백질의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다.
본 발명의 한 실시태양은 FcεRI 단백질의 삼차원 구조를 포함한다. FcεRI 단백질의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 또는 표 5에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. FcεRI 단백질의 더욱 적합한 삼차원 구조는 표 3 (모노머성) 또는 표 4(다이머성 FcεRI)에 나타낸 원자 좌표의 세트와 실질적으로 일치한다. FcεRI 단백질의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 3 또는 표 4에 나타낸 원자 좌표들에 실질적으로 일치한다. FcεRI 단백질의 삼차원 좌표의 세트는 표준 단백질 데이터 뱅크 포맷으로 표시된다. 표 1 내지 5에 열거한 바의 그러한 좌표들은 당업계의 전문가에 의해 해석될 수 있다. FcεRI 단백질의 더욱 바람직한 삼차원 구조는 표 3 또는 4에 나타낸 삼차원 구조를 가진 가장 가망성 있는 피트를 갖는다. 본 발명의 한 실시태양은 FcγRIIIb 단백질의 삼차원 구조를 포함한다. FcγRIIIb 단백질의 적합한 삼차원 구조는 표 2, 표 3, 표 4 또는 표 5에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. FcγRIIIb 단백질의 더욱 적합한 삼차원 구조는 표 5에 나타낸 원자 좌표의 세트와 실질적으로 일치한다. FcγRIIIb 단백질의 적합한 삼차원 구조는 또한 표 5에 나타낸 원자 좌표들을 포함한다. FcγRIIIb 단백질의 삼차원 좌표의 세트는 표준 단백질 데이터 뱅크 포맷으로 표시된다. FcγRIIIb 단백질의 더욱 바람직한 삼차원 구조는 표 5에 나타낸 삼차원 구조를 가진 가장 가망성 있는 피트를 갖는다. 임의의 FcR 단백질의 삼차원 구조는 FcγRIIa 결정의 분석으로 또는 FcγRIIa 결정으로부터 유도한 다른 FcR 구조들로 얻은 정보에 기초하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 모델링할 수 있다. 하기 실시예 부분은 FcγRIIa 결정의 분석으로부터 얻은 정보에 기초하여 당업계에서 일반적으로 공지된 방법을 사용하는 FcγRIIa 결정의 생산, FcεRI 결정의 생산, FcγRIIa 결정으로부터 유도된 FcγRIIa 단백질 모노머 및 다이머의 삼차원 구조 및 FcεRI 단백질 모노머 및 다이머의 삼차원 구조의 모델의 생산을 기재한다. 결정성 FcγRIIa 등의 결정성 FcR의 삼차원 구조가 본 명세서에 기재된 바의 FcεRI 등의 임의의 다른 FcR의 삼차원 구조를 유도하는데 사용될 수 있음은 본 발명의 한 실시태양이다. 후속적으로, FcγRIIa의 결정성 구조로부터 유도된 그러한 FcR(예, FcεRI)의 유도된 삼차원 구조는 FcγRIII 등의 다른 FcR의 삼차원 구조를 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서 본명세서에서의 결정성 FcγRIIa 및 FcγRIIa의 삼차원 구조의 새로운 발견은 이제 당업자로 하여금 임의의 FcR의 삼차원 구조 및 그의 모델들을 유도화하는 것을 가능케한다. 임의의 FcR의 구조의 유도화(derivation)는 그러한 다른 FcR에 대한 결정 구조를 갖지 않고서도 성취할 수 있으며 다른 FcR 결정 구조가 입수가능할 경우, 새로운 FcR의 삼차원 구조의 모델링은 FcγRIIa 구조로부터 이미 얻은 지식을 사용하여 개량할 수 있다. 다른 FcR 단백질에 대한 결정 구조 데이터에 대한 부재하에 다른 FcR 단백질의 삼차원 구조들을 다른 FcR의 아미노산 서열에 있어서 차이를 고려하여 모델링할 수 있는 것은 본 발명의 이점이다. 실제로, 본 출원의 우선권 출원일 이후의 모노머성 FcεRI의 결정화 및 이 수용체의 모델의 공표의 최근의 보고 (Garman et al., 1998. 12. 23, Cell 95:951-961)는 표 3에 나타낸 원자 좌표를 포함하는 본 발명자들에 의해 결정된 모노머성 FcεRI 단백질이 Garman et al에서 보고된 결정성 FcεRI 의 삼차원 구조의 전제적인 거대 구조적 특징을 가짐을 확인하였다. Garman et al의 결정성 FcεRI 구조의 원자 좌표들은 현재 공공 입수가 불가능하나 Garman et al 의 구조적 묘사(representations) 및 논의에 대한 검토는 결정성 FcεRI의 삼차원 구조는 표 3에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 것으로 예측됨을 나타낸다. 더욱이, 본 바명의 신규한 발견들은 궁극적으로 임의의 FcR, 및 특히 FcγR 및 FcεRI의 활성에 영향을 미치는 화합물의 구조에 기초한 약물 디자인을 허용한다.
결정들은 Pt, Hg, Au 및 Pb의 착물 또는 염 등의 무거운 원자 화합물로 유도체화되며 X-선 회절 데이터는 천연 및 유도체화된 결정들에 대하여 측정한다. 천연 결정들 및 유도체화된 결정들에 대한 회절 강도들에 있어서 차이는 MIR(multiple Isomophorus Replacement) 또는 SIRAS(single isomophous replacement with anomolous scattering)의 방법들에 의해 이들 데이터에 대한 상들을 결정하는데 사용될 수 있다. 이들 데이터의 푸리에(Fourier) 변환은 단백질에 대한 낮은 해상 전자 밀도를 생성한다. 이 전자 밀도는 이미지 증강 기법에 의해 변형될 수 있다. 이어서 단백질에 대한 분자 모델을 전자 밀도 내에 위치시킨다. 이 초기의 (부분적) 구조는 이 구조를 기술하는 변수들을 변형시켜 측정된 회절 패턴 및 계산된 회절 패턴 사이의 차이를 최소화키는 한편, 동시에 모델을 단백질의 공지된 기하학적 및 화학적 특성에 일치시키도록 구속함으로써 컴퓨터 프로그램(XPLOR 등)을 사용하여 개량할 수 있다. 새로운 상들 및 따라서 새로운 전자 밀도 지도는 단백질에 대해서 계산할 수 있다. 이 지도를 구조의 분자 모델에 대한 가이드로 사용하는 것은 수동으로 개선시킬 수 있다. 이 절차를 반복하여 표 1에 나타낸 한 세트의 원자 좌표로서 FcγRIIa에 대해 본 명세서에 나타낸 단백질의 구조를 얻는다.
본 발명의 한 실시태양은 FcγRIIa에 단백질에 대한 원자 좌표가 (a) 결정형의 FcγRIIa 단백질을 제공하고; (b) 결정형 FcγRIIa 단백질의 전자 밀도-지도를 발생시키고; (c) 전자-밀도 지도를 분석하여 원자 좌표를 생성시키는 것을 포함하는 방법에 의해 발생된, FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조는 다른 FcR 단백질의 삼차원 구조(예컨대, 모델링되는 구조)의 모델을 유도하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바의 단백질의 "구조"는 단백질을 구성하는 성분들 및 성분들의 정렬 방식을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바의 용어, "모델"은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 삼차원 구조의 확질한 매체로 표시를 의미한다. 예를 들면, 모델은 컴퓨터 스크린 상의, 한 조각의 서면(즉, 2차원 매체 상에) 상의 및(또는) 공-및-막대(ball-and-stick) 그림으로서 전자 파일의 삼차원 구조의 표시일 수 있다. 물리적 삼차원 모델들은 실체적이며, 이들에 한정되지 않고 막대 모델(stick model) 및 공간 채움 모델(space-filling model)을 포함한다. 구 "컴퓨터 스크린 상에 모델을 이미지화하는 것"은 업계의 전문가에게 공지된 적절한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어 기술을 사용하여 컴퓨터 스크린 상에 모델을 표현(또는 나타냄) 및 조작하는 능력을 의미한다. 그러한 기술은 예를 들면, Evans and Sutherland(Salt Lake Cite, Utah) 및 Biosym Technologies(San Diego, CA)를 포함하는 다양한 원들로부터 입수 가능하다. 구 "모델의 그림을 제공하는 것"은 모델의 "하드카피"(hard copy)를 발생시키는 능력을 의미한다. 하드 카피들은 이동 사진 및 스틸(still) 사진 모두를 포함한다. 모델의 컴퓨터 스크린 이미지 및 사진들은 공간 채움 표시, α 탄소 추적(carbon traces), 리본 다이아그램 (ribbon diagram, 예를 들면 인간 FcεRI 단백질의 삼차원 구조의 2차원 리본 다이아그램 모델은 도 14를 참조) 및 전자 밀도 지도를 포함하는 다수의 포맷으로 가시화할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용한 모델에 대한 적합한 표적 FcR 구조는 실질적으로 구조적으로 FcγRIIa 단백질에 관련된, FcR 단백질의 모노머, 이량체 및 다량체를 포함하는 임의의 FcR 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다. 실질적으로 구조적으로 FcγRIIa 단백질에 관련된 바람직한 표적 FcR 구조는 배좌를 예를 들면 그러한 정렬 프로그램을 수반하는 표준 디폴트 값을 사용하여 수행하는, 예를 들면 DNAsis™프로그램 (Hitachi Software, San Bruno, CA로부터 입수가능함), MacVector™프로그램(Eastman Kodak Company, New Haven, CT로부터 입수가능함) 또는 GCγ™프로그램(WI, Madison, University of Wisconsin, "GCγ"로부터 입수가능함) 등의 서열 정렬 프로그램을 사용하였을 때, FcR 서열의 전장 길이에 걸쳐서, FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호: 3, 서열 번호: 10, 서열 번호 11 및(또는) 서열 번호: 12, 서열 번호: 14 및(또는) 서열 번호 15를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 25%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 36%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 표적 FcR 구조를 포함한다. 모델에 대한 더욱 바람직한 표적 FcR 구조들은, 본 명세서에 기재된 DNA 정렬 프로그램을 사용하여 아미노산 서열들을 배좌시켰을때, 임의의 아미노산 서열들의 도메인 1 및 도메인 2에 대한 아미노산 등의 서열의 바람직한 영역들을 비교하였을 때, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 및 서열번호: 13의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열들을 포함하는 단백질들을 함유한다. 모델에 대한 더욱 바람직한 표적 FcR구조는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIb, FcεRI 또는 FcαRI 단백질을 포함하는 구조, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 구조, 및 더욱 바람직하게는 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열번호: 13의 아미노산 서열로 이루어진 구조을 포함한다.
모델에 대한 바람직한 표적 FcR 구조들은 또한 이들에 제한되지 않고 하나 이상의 아미노산 잔기들이 치환, 결실 또는 부가된 Fc 수용체(이하, Fc 수용체 변이체로 언급한다) 등의 Fc 수용체 단백질들의 유도체 또는 Fc 수용체를 코드하는 핵산 분자의 천연 대립형 변이체에 의해 코드되는 단백질을 포함한다. 모델에 대한 바람직한 Fc 수용체 단백질은 FcγRIIaγTm (즉, 막투과 도메인이 결실된 FcγRIIa 단백질) 및 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIb, FcεRI, FcαRI 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이체 또는 천연 대립인자 변이체를 포함한다. 모델에 대한 더욱 바람직한 Fc 수용체 단백질은 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열번호: 13을 포함하는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열번호: 13의 돌연변이체 또는 천연 대립인자 변이체를 갖는 Fc 수용체 단백질을 포함한다. 본 발명에 따르면, FcγRIIa의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호: 5로 표시되며, FcγRIIc의 아미노산은 서열 번호: 6으로 표시되며, FcγRI의 아미노산 서열은 서열 번호: 7로서 표시되며, FcγRIII의 아미노산 서열은 서열 번호: 8로서 표시되며, FcεRI의 아미노산 서열은 서열 번호: 9 및 도 1에 표시되며, FcαRI의 아미노산 서열은 본 명세서의 서열 번호: 13으로 표시된다. 상기 모든 공지의 FcR에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며 공공 입수가 가능함을 유의해야 한다. 모델에 대한 바람직한 대립형질 변이체들은, 이들에 한정되지 않고, 본 명세서에서 서열 번호: 10으로 표시되는, 서열 번호: 3의 잔기 27에 글루타민 및 서열 번호: 3의 잔기 131에 아르기닌; 본 명세서에서 서열 번호: 11로 표시되는, 서열 번호: 3의 잔기 27에 트립토판 및 서열 번호: 3의 잔기 131에 히스티딘; 또는 본 명세서에서 서열 번호: 12로 표시되는, 서열 번호: 3의 잔기 27에 트립토판 및 서열 번호: 3의 잔기 131에 아르기닌을 갖는 FcγRIIa 대립형질의 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바의 "천연 대립형질 변이체"는 상동성 염색체 상의 대응하는 유전자좌들을 점유하는 유전자의 별도의(alterntive) 형태를 의미한다. 대립형질 변이체들은 대표적으로 이들이 비교되는 유전자에 의해 코드되는 단백질의 것에 유사한 활성을 갖는 단백질을 코드한다. 대립형질 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3' 비번역 영역(예컨대, 조절성 콘트롤 영역에서)에서 변경을 포함한다. 대립형질 변이체들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 주어진 동물 중에서 Fc 수용체를 코딩하는 주어진 그룹 내에서 발견되는 것으로 예측될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된 바의 "Fc 수용체를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이체"는 뉴클레오티드 삽입, 결실 및(또는) 치환에 의해 변형된 핵산 분자들을 의미한다. 바람직하게는 Fc 수용체 핵산 분자의 돌연변이체는 Fc 수용체 핵산 분자의 돌연변이체에 의해 코드되는 단백질(즉, Fc 수용체 단백질 돌연변이체)가 비돌연변이된 Fc 수용체 단백질에 대하여 액성 또는 세포성 면역 응답에 의해 유발될 수 있는 하나 이상의 에 피토프들을 갖는 변형체들을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 돌연변이 Fc 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 긴축 하이브리다이제이션 조건하에서 비-돌연변이된 Fc 수용체 핵산 분자를 코딩하는 핵산서열과 적합한 하이브리드를 형성할 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 돌연변이 Fc 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열번호: 13을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열과 긴축 하이브리다이제이션 조건 하에서 안정된 하이브리드를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바의, 긴축 하이브리다이제이션 조건은 핵산 분자들이 유사한 핵산 분자들을 동정하는데 사용되는 표준 하이브리다이제이션 조건을 의미한다. 그러한 표준 조건들은 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989]에 기재되어 있다. Sambrook et al. (상기함)은 그의 전문을 본 명세서에서 참고로 인용한다(구체적으로 페이지 9.31-9.62, 11.7 및 11.45-11.61). 또한, 다양한 정도의 뉴클레오티드의 오결합(mismatch)을 허용하는 하이브리다이제이션을 얻기 위한 적절한 하이드리다이제이션 및 세척 조건을 계산하기 위한 식은, 예를 들면 문헌[Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284]에 기재되어 있으며, Meinkoth et al., (상기함)은 그의 전문을 본 명세서에서 참고로 인용한다.
더욱 구체적으로, 본 명세서에서 언급하는 바의 긴축 하이브리다이제이션은 하이브리다이제이션 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자의 서열과 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 허용하는 조건을 의미한다. 그러한 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 하이브리드들이 형성되는지에 따라 다양할 것이다. DNA:RNA 하이브리드에 대한 계산된 융점은 DNA:RNA 하이브리드에 대해서보다 낮은 10℃이다. 구체적인 실시 태양에 있어서, DNA:DNA 하이드리드에 대한 긴축 혼성화 조건들은 약 20℃ 및 약 35 ℃ 사이의 온도, 더욱 바람직하게는, 약 28 ℃ 및 약 40℃ 사이의 온도 및 더욱 더 바람직하게는 약 35 ℃ 및 약 45 ℃ 사이의 온도에서 약 0.1X SSC의 이온 강도(0.157 M Na+)에서 하이브리다이제이션을 포함한다. 구체적인 실시태양에 있어서, DNA:RNA 하이드리드에 대한 긴축 혼성화 조건들은 약 30℃ 및 약 45 ℃ 사이의 온도, 더욱 바람직하게는, 약 38 ℃ 및 약 50℃ 사이의 온도 및 더욱 더 바람직하게는 약 45 ℃ 및 약 55 ℃ 사이의 온도에서 약 0.1X SSC의 이온 강도(0.157 M Na+)에서 하이브리다이제이션을 포함한다. 이들 값들은 약 100 뉴클레오티드 이상의 분자들에 대한 융점, 0% 포름아미드 및 약 50%의 G+C 함량의 계산에 기초한다. 별법으로, Tm은 Sambrook et al(상기함, pages 11.55 내지 11.57)에 나타낸 바와 같이 경험적으로 계산할 수도 있다.
본 발명의 모델은 FcγRIIa 등의 한 FcR 단백질의 공지의 삼차원 구조 및 다른 표적 FcR구조 사이의 보존된 구조적 특징들을 사용하여 유도할 수 있다. 그러한 구조적 특징들은, 이들에 한정되지 않고, 아미노산 서열, 보존된 이황화 결합 및 면역 글로불린 수퍼패밀리 원들에 고도로 보존된 β-가닥들 또는 β-시이트들을 포함한다. 예를 들면, 도 5, 11 및 12는 β-가닥들과 다양한 Fc 수용체 단백질의 아미노산 서열과의 관계를 설명한다. 바람직하게는, 본 발명의 모델은 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조의 골격으로 출발함으로써 유도할 수 있다. 이어서 개별 잔기들은 FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열과는 다른 잔기에서 표적 FcR구조의 아미노산 서열에 따라서 치환시킨다. 잔기들의 치환(replacement)이 골격의 삼차 구조를 교란시키지 않도록 주의를 기울여야 한다. 표적 FcR 구조들을 모델링하는 절차들은 당업계에 일반적으로 알려지 있는 반면, 본 발명은 FcγRIIa 단백질의 최초의 삼차원 구조 및 FcR 수용체의 집단의 일원, FcεRI 및 FcγRIIIb에 실질적으로 관련된 단백질의 최초의 삼차원 구조를 제공한다. 따라서, 본 발명은 FcγR 수용체들의 일원의, FcεRI 수용체 및 FcγRIIIb 수용체의 정확하고 따라서 유용한 모델들을 생성하기 위한 필수적인 정보를 제공한다. 상기 논의한 바와 같이, 일단 제2 FcR의 삼차원 구조가 본 명세서에 기재된 바의 FcγRIIa 등의 제1 FcR의 결정된 삼차원 구조로부터 유도되게 되면, 제2 FcR의 삼차원 구조는 다른 FcR의 삼차원 구조를 유도(즉, 모델링하거나 또는 계산)하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 한 구조는, 예를 들면 문헌[Sali, Current Opinions in Biotechnology, vol. 6, pp. 437-451, 1995]에 일반적으로 기술된 바와 같은 기술을 사용하여 모델링시킬 수 있으며 알고리즘은 Homlogy 95.0 (CA, San Diego, Biosym/MSI으로부터 입수가능한 프로그램 Insight II에서) 등의 프로그램 패키지에 주입시킬 수 있다. Homology 95.0의 사용은 공지의 삼차원 구조를 갖는 공지의 구조의 아미노산 서열과 모델링되는 표적 구조의 아미노산 서열의 정렬을 요한다. 이 정렬은 한 쌍의(pairwise) 정렬 또는 다른 관련된 서열을 포함하는 다중 서열 정렬(예를 들면, Rost, Meth. Enzymol., vol. 266, pp. 525-539, 1996)에 일반적으로 기술된 방법을 사용하여)로 하여 정확도를 높일 수 있다. 구조적으로 보존된 영역들은 관련된 구조적 특징들을 비교함으로써 또는 공지의 구조 및 표적 구조의 서열 상동성의 정도를 검사함으로써 확인할 수 있다. 표적 구조에 대한 특정 좌표는 공지의 구조로부터의 공지의 구조들을 사용하여 할당할 수 있다. 표적 구조의 다른 영역에 대한 좌표는 예를 들면 Brookhaven National Laboratory(Upton, NY)에 유지된 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에서 발견되는 것 등의 공지의 구조로부터 얻은 단편들로부터 발생될 수 있다. 표적 구조의 측쇄들의 배좌(conformation)는 입체적으로 허용가능한 것을 참고로 하고 (Ponder and Richards, J. Mol. Biol., vol. 193, pp. 775-791, 1987에 일반적으로 기재된 바와 같이) 회전이성체의 라이브러리 및 이들의 발생 빈도를 사용하여 할당할 수 있다. 결과적인 표적 구조의 모델은 분자 메카닉스(Biosym/MSI로부터 입수 가능한 프로그램 Discover에 구체화된 것과 같은)에 의해 개량시켜 이 모델이 화학적으로 및 형태학적으로 합리적임을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양은 (a) FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열 및 표적 FcR 구조의 아미노산 서열을 제공하고; (b) FcγRIIa 아미노산 서열 및 표적 FcR구조 아미노산 서열 사이에 공유된 구조적으로 보존된 영역들을 동정하고; (c) 상기 표적 FcR 구조의 구조적으로 보존된 영역들을 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 사용하여 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치되는 원자 좌표에 기초하여 삼차원 구조로 할담함으로써 표적 FcR 구조에 대한 원자 좌표를 결정하여 표적 구조 아미노산 서열의 삼차원 구조의 모델을 유도하는 것을 포함하는, 표적 FcR 구조의 삼차원 구조의 모델을 유도하는 방법이다. 본 발명에 따른 모델은 본 명세서에 이미 기재하였다. 바람직하게는 이 모델은 컴퓨터 모델을 포함한다. 이 방법은 구조적 할당을 전자공학적으로 시뮬레이팅시켜 표적 구조 아미노산의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. 모델링하기 위한 적당한 표적 구조들은 본 명세서에 기재된 Fc 수용체(그러한 수용체의 모노머 및 다이머를 포함함)의 단백질, 폴리펩티드 및 펩디드를 포함한다. 모델링하기 위한 바람직한 아미노산은 본 명세서에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 실시태양은 결정이 생산되는 표적 FcR 구조(이하, "결정화된 표적 구조"로서 언급한다)의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델을 유도하는 방법이다.
그러한 모델을 생산하는 적합한 방법은 분자 치환(replacement)을 포함하는 방법을 포함한다. 분재 치환의 방법은 당업자에 의해 일반적으로 알려져 있으며(일반적으로 Brunger, Meth. Enzym., vo. 276, pp. 558-580, 1997; Navaza and Saludjian, Meth. Enzym., vol. 276, pp. 581-594, 1997; Tong and Rossmann, Meth. Enzym., vol. 276, pp. 594-611, 1997; and Bentley, Meth. Enzym., vol. 276, pp. 611-619, 1997에 일반적으로 기재됨, 이들 각각은 그 전문을 본 명세서에 참고로 인용함), 예를 들면 XPLOR을 포함하는 소프트웨어 프로그램에서 수행된다. 본 발명에 따르면, X-선 회절 데이터는 결정화된 표적 구조의 결정으로부터 수집한다. X-선 회절 데이터는 변환시켜 패터슨 함수(Patterson function)를 계산한다. 결정화된 표적 구조의 패터슨 함수는 검색 구조 패터슨 함수 상에서 회전시켜 결정에 있어서 결정화된 표적 구조의 올바른 방향보정한다. 이어서, 번역 기능을 계산하여 결정 축에 관련하여 표적 구조의 위치를 결정한다. 일단 결정화된 표적 구조가 단위 셀 중에 올바르게 위치되면 실험 데이터에 대한 초기 상들을 계산할 수 있다. 이들 상들은 구조적 차이가 관찰되는 전자 밀도 지도의 계산 및 구조의 개량(refinement)에 필요하다. 바람직하게는 검색 분자의 구조적 특징(예, 아미노산 서열, 보존된 이황화 결합, 및 β-가닥 및 β-시이트)은 결정화된 표적 구조에 관련시킨다. 바람직하게는 본 발명에 따른 분자 치환(replacement)의 방법에 있어서 유용한 결정화된 표적 FcR 구조는 두 아미노산 서열들을 본 명세서에 기재된 DNA 정렬(alignment) 프로그램을 사용하여 비교하였을 때 검색 구조(예, FcγRIIa)의 아미노산에 대하여 적어도 약 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%,더욱 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 바람직한 검색 구조는 서열 번호: 3, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 14, 또는 서열 번호; 15를 함유하는 아미노산을 포함하는 FcγRIIa 단백질을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 검색 구조는 표 1에 열거한 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조를 갖는 FcγRIIa 단백질을 포함한다. 바람직하게는 결정성 FcγRIIa 단백질의 패터슨 함수는 본 발명의 FcγRIIa 단백질 결정의 X-선 회절로부터 유도된다. 본 발명의 분자 치환에 사용하기 위한 바람직한 표적 FcR 구조는 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIII, FcεRI, 및(또는) FcαRI를 포함하며 가장 바람직하게는 FcαRI 및 FcγRIIa를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 (a) 결정화된 표적 FcR 구조의 패터슨 함수를 결정성 FcγRIIa 단백질의 패터슨 함수와 비교하여 상기 결정화된 표적 FcR 구조의 전자-밀도 지도를 생성하고; (b) 이 전자-밀도 지도를 분석하여 결정화된 표적 FcR 구조의 삼차원 구조를 생성시키는 것을 포함하는 결정화된 표적 FcR 구조(즉, 결정화된 FcR 단백질)의 삼차원 구조를 유도하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은, 표적 FcR 구조의 삼차원 구조가 알려지지 않은, 표적 구조의 삼차원 구조를 결정하는 방법이다. 그러한 구조는 단지 표적 구조의 삼차원 구조에만 기초하여 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조에 관련된 구조를 동정하는데 유용하다. 따라서, 본 방법은 FcγRIIa 단백질과 고도의 아미노산 일치성(identity)은 가지지 않으나 삼차원 구조 유사성을 공유하는 구조의 동정(identification)을 가능케한다. 표적 FcR구조의 삼차원 구조를 결정하는 바람직한 방법은 (a) 표적 구조의 삼차원 구조가 알려지지 않은 표적 구조의 아미노산 서열을 제공하고; (b) 접힘 인식(fold recognition)에 의해 삼차원 배좌의 아미노산 서열의 접힘의 패턴을 분석하고; (c) 표적 구조 아미노산 서열의 접힘(folding) 패턴을 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조 (여기서, FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조가 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 것임)와 비교하여 표적 구조의 삼차원 구조를 결정하는 것을 포함한다. 바람직한 접힘 인식 방법은 문헌[Jones, Curr. Opinion Struc. Biol., vol. 7, pp. 377-387, 1997]에 일반적으로 기술된 방법을 포함한다. 그러한 접힘은 표적 구조의 소수성 및(또는) 친수성 특성에 기초하여 분석할 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양은 FcR 단백질의 삼차원 구조의 삼차원 컴퓨터 이미지를 포함한다. 삼차원 컴퓨터 이미지를 생성하는 적합한 구조들을 여기서 기술한다. 바람직하게는 컴퓨터 이미지는 표 1에 열거된 삼차원 좌표와 실질적으로 일치되는 구조를 창제한다. 본 발명의 컴퓨터 이미지는, 이들에 한정되지 않고, MOLSCRIPT 2.0 (Avator Software AB, Heleneborgsgatan 21C, SE-11731 Stockholm, Sweden), 그래픽 디스플레이 프로그램 O (Jones et al., Acta Crystallography, vo1. A47, p. 110, 1991) 또는 그래픽 디스플레이 프로그램 GRASP를 포함하는 임의의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생성할 수 있다. 본 발명의 이미지를 생성하기에 유용한 적합한 컴퓨터 하드웨어는 당업자에게 알려져 있다. 바람직한 컴퓨터 하드웨어는 실리콘 그래픽스 워크스테이션(Silicon Graphics Workstation)을 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양은 표 1에 나타낸 삼차원 좌표, 표 2에 나타낸 삼차원 좌표, 표 3에 나타낸 삼차원 좌표, 표 4에 나타낸 삼차원 좌표, 및 표 5에 나타낸 삼차원 좌표로 이루어진 군 중에서 선택된 삼차원 좌표들의 세트로 코드화된 컴퓨터-판독형 매체에 관한 것으로서, 여기서 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여 삼차원 좌표들은 전자 파일을 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 삼차원 이미지로서 가시화될 수 있는 전자 파일을 창제한다. 바람직하게는, 삼차원 구조는 FcγRIIa, FcεRI, 및 FcγRIIIb의 군으로부터 선택된 FcR 단백질의 것이다.
본 발명의 또 다른 실시 태양은 표 1에 나타낸 삼차원 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조의 삼차원 좌표의 세트로 코드된 컴퓨터-판독형 매체에 관한 것으로서, 여기서 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 삼차원 좌표들의 세트는 전자 파일을 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 삼차원 이미지로서 가시화될 수 있는 전자 파일을 창제한다. 바람직하게는, 삼차원 구조는 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIII, FcεRI, 및 FcαRI의 군으로부터 선택된 FcR 단백질의 것이다.
본 발명의 다른 실시태양은 도 4, 도 6, 도7, 도 8, 도 9, 도 10, 도 14, 도 15, 도 15 또는 도 16에 설명된 것들을 포함하는 FcR의 이차원 이미지에 관한 것이다. 대부분의 이들 도면은 MOLSCRIPT 2.0 (Avator Software AB, Heleneborgsgatan 21C, SE-11731 Stockholm, Sweden)로 그렸다.
본 발명의 한 실시 태양은 표 1에 나타낸 삼차원 좌표를 포함하는 삼차원 좌표의 세트를 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여 컴퓨터 상에서 분석하여 상기 이미지의 전자 파일을 창제하고 상기 전자 파일을 삼차원 이미지로서 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 상기 전자 파일을 가시화시켰을 때 발생하는 FcR 단백질의 이미지를 포함한다. 적합한 그래픽 소프트웨어 디스플레이 프로그램은 MOLSCRIPT 2.0, 그래픽 디스플레이 프로그램 O 및 GRASP를 포함한다. 그러한 이미지를 가시화 하기 위한 적합한 컴퓨터는 실리콘 그래픽스 워크스테이션(Silicon Graphics Workstation)을 포함한다. 이미지에 대한 적합한 구조 및 모델들을 여기에 기술한다. 바람직하게는 삼차원 구조 및(또는) 모델들은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIII, FcεRI, 및 FcαRI로부터 선택된 FcR 단백질의 것들이다.
본 발명은 또한 삼차원 모델이 (a) FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열 및 표적 FcR 구조의 아미노산 서열을 제공하고; (b) FcγRIIa 아미노산 서열 및 표적 FcR 구조 아미노산 사이에 공유된 구조적으로 보존된 영역들을 동정하고; (c) 표적 FcR 구조의 구조적으로 보존된 영역들을 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 원자 좌표에 기초하여 FcγRIIa단백질의 삼차원 구조를 사용하여 삼차원 구조로 할당 하여 표적 FcR 구조 아미노산 서열의 삼차원 모델을 유도함으로서 FcR 단백질에 대한 원자 좌표들을 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성되는, FcγRI 단백질, FcγRIIa 단백질, FcγRIIb 단백질, FcγRIIc 단백질, FcγRIIIb 단백질, 및 FcεRI 단백질 및 FcαRI을 포함하는 표적 구조의 삼차원 구조의 삼차원 모델을 포함한다. 바람직하게는 이 모델은 컴퓨터 모델을 포함한다. 바람직하게, 이 방법은 구조적 할당을 전자공학적으로 시뮬레이팅시켜 표적 구조 아미노산의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. FcγRI 단백질, FcγRIIb 단백질, FcγRIIc 단백질, FcγRIIIb 단백질, 및 FcεRI 단백질의 바람직한 아미노산 서열을 여기에 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시 태양은 FcγRIIa 단백질을 모액과 혼합하고 결정형성을 유도하여 FcγRIIa 결정들을 생성하는 것을 포함하는 FcγRIIa의 결정들을 생성하기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 태양은 FcεRI 단백질을 모액과 혼합하고 결정형성을 유도하여 FcεRI 결정들을 생성하는 것을 포함하는 FcεRI의 결정들을 생성하기 위한 방법을 포함한다. FcγRIIa 및 FcεRI의 결정들의 생산은 본 명세서에 상세히 기술되어 있으나 본 명세서에 기재된 바의 그러한 공정들은 당업자에 의해 기타 Fc 수용체(FcR), 특히 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIb, 및 FcαRI의 결정들을 생산하는데 채용될 수 있고, 이들의 삼차원 구조들도 또한 본 발명에 포함됨을 유의해야 한다.
바람직하게는, FcγRIIa의 결정들은 모액 중의 FcγRIIa 단백질을 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 더욱 바람직하게는 2 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 더더욱 바람직하게는 3 mg/ml 내지 약 6 mg/ml의 범위로 포함하는 용액을 사용하여 형성되며, 모액 중의 3 mg/ml 내지 약 6 mg/ml의 FcγRIIa 단백질이 가장 바람직하다. 바람직하게는, 결정들은 3 ㎍ 방울 당 약 1 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 및 더욱 바람직하게는 약 4.5 ㎍ 내지 약 9 ㎍의 FcγRIIa 단백질을 함유한 방울들을 사용하여 형성한다.
본 발명의 적합한 모액은 아세테이트 염 완충액을 포함한다. 본 발명의 바람직한 아세테이트 염 완충액은 암모늄 아세테이트를 포함한다. 결정화 전의 완충액 중의 암모늄 아세테이트의 농도는 약 100 mM 내지 약 500 mM 암모늄 아세테이트의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 완충액 중의 암모늄 아세테이트의농도는 약 150 mM 내지 약 300 mM 암모늄 아세테이트의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 완충액 중의 암모늄 아세테이트의 농도는 200 mM 암모늄 아세테이트이다. 적합한 아세티이트 염 완충액은 바람직하게는 약 5 내지 약 7, 더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 및 더욱 바람직하게는 약 5.6의 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 아세테이트 염 완충액의 pH는 소듐 시트레이트를 사용하여 조절한다. 적합한 아세테이트 염 완충액은 약 0.01 M 소듐 시트레이트, 더욱 바람직하게는 0.05 M 소듐 시트레이트 및 더욱 바람직하게는 0.1 M 소듐 시트레이트의 농도의 소듐 시트레이트를 포함한다. 적합한 아세테이트 염 완충액은 임의의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함하며, PEG 4000이 더욱 바람직하다. 본 발명의 아세테이트 염 완충액 중의 적합한 PEG 4000 농도는 약 25%, 더욱 바람직하게는 약 20%, 및 가장 바람직하게는 약 30% PEG 4000을 포함한다.
본 발명의 다른 적합한 모액은 설페이트 완충액을 포함한다. 바람직한 본 발명의 설페이트 완충액은 리튬 설페이트를 포함한다. 결정화 전의 리튬 설페이트의 농도는 약 100 mM 내지 약 2.5 M 리튬 설페이트의 범위일 수 있다. 바람직하게는 완충액 중의 리튬 설페이트의 농도는 약 500 mM 내지 약 2 M 리튬 설페이트의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 완충액 중의 리튬 설페이트이 농도는 약 1.5 M 리튬 설페이트이다. 적합한 설페이트 완충액은 바람직하게는 약 5 내지 9, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 7, 더욱 바람직하게는 약 7.5의 pH를 갖는 완충액을 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 설페이트 완충액의 pH는 HEPES를 사용하여 조절한다. 적합한 설페이트 완충액은 약 0.1 M HEPES, 더욱 바람직하게는 약 0.05 M HEPES 및 가장 바람직하게는 약 0.1 M HEPES의 농도로 HEPES를 포함한다.
FcγRIIa 단백질의 과포화 용액은, 이들에 제한되지 않고, 증기 확산, 액체 확산, 뱃취 결정화, 항온 및 온도 유도 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 방법에 의해 결정화하도록 유도된다. 바람직하게는, FcγRIIa 단백질의 과포화 용액은 증기 확산(즉, 현수 적하법(hanging drop menthod)에 의해 결정화를 유도한다. 증기 확산법에 있어서, FcγRIIa 단백질은 본 발명의 모액과 합해지며 이는 FcγRIIa 단백질 용액이 과포화되는 것을 유발하고 일정 온도에서 FcγRIIa 결정을 형성할 것이다. 증기 확산은 바람직하게는 약 15 ℃ 내지 약 30 ℃, 더욱 바람직하게는 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도 범위, 및 더욱 바람직하게는 약 22 ℃의 일정 온도의 제어된 온도하에서 수행한다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 아세테이트 염 완충액 중의 FcγRIIa 단백질의 약 3 mg/ml 용액을 제조하여 과포화 용액을 형성하고, 여기서 완충액은 약 200 mM 암모늄 아세테이트, 약 100 mM 암모늄 시트레이트 및 약 30% PEG 4000을 포함하며, 약 pH 5.8의 pH를 가지며; (b) 과포화 제제의 약 3 ㎕ 방울들을 커버슬립 상에 적하하고 이것을 아세테이트 염 완충액 약 1 ml을 함유하는 웰 상에서 역전시키고; (c) FcγRIIa의 결정이 형성될 때까지 인큐베이팅시키는 단계들을 포함하는 FcγRIIa의 결정을 생산하는 방법을 포함한다.
또다른 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 설페이트 완충액 중의 FcγRIIa 단백질의 약 3 mg/ml 용액을 제조하여 과포화 용액을 형성하고, 여기서 완충액은 약 0.15 M HEPES 및 약 1.5 M 리튬 설페이트를 포함하며, 약 pH 7.5의 pH를 가지며; (b) 과포화 제제의 약 3 ㎕ 방울들을 커버슬립 상에 적하하고 이것을 설페이트 완충액 약 1 ml을 함유하는 웰 상에서 역전시키고; (c) FcγRIIa의 결정이 형성될 때까지 인큐베이팅시키는 단계들을 포함하는 FcγRIIa의 결정을 생산하는 방법을 포함한다.
상기 간단히 논의한 바와 같이, 본 발명의 다른 실시태양은 FcεRI 결정의 생산 방법 및 이에 의해 생산된 FcεRI 결정에 관한 것이다. 바람직하게는, FcεRI의 결정들은 모액 중의 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 2 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 더더욱 바람직하게는 약 3 mg/ml 내지 약 6 mg/ml의 FcεRI 단백질의 FcεRI 단백질 범위를 포함하는 용액을 사용하여 형성하며, 모액 중의 3 mg/ml 및 6 mg/ml FcεRI 단백질이 가장 바람직하다. 바람직하게는, 결정들은 방울 3 ㎍ 당 약 1 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎍ 내지 약 25 ㎍, 및 더욱 바람직하게는 약 4.5 ㎍ 내지 약 9 ㎍의 FcεRI 단백질을 포함하는 방울들을 사용하여 형성한다.
본 발명의 적합한 모액은 아세테이트 염 완충액을 포함한다. 본 발명의 바람직한 아세테이트 염 완충액은 칼슘 아세테이트를 포함한다. 결정화전의 완충액 중의 칼슘 아세테이트의 농도는 약 100 mM 내지 약 500 mM 칼슘 아세테이트의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 완충액 중의 칼슘 아세테이트의 농도는 약 150 mM 내지 약 300 mM 암모늄 아세테이트의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 완충액 중의 칼슘 아세테이트의 농도는 200 mM 칼슘 아세테이트이다. 적합한 아세테이트 염 완충액은 바람직하게는 약 5.5 내지 약 7.5, 더욱 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.0, 및 더욱 바람직하게는 약 6.5의 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 아세테이트 염 완충액의 pH는 소듐 카코딜레이트를 사용하여 조절한다. 적합한 아세테이트 염 완충액은 약 0.01 M 소듐 카코딜레이트, 더욱 바람직하게는 0.05 M 소듐 카코디에이트 및 더욱 바람직하게는 0.1 M 소듐 카코디에이트의 농도의 소듐 카코디에이트를 포함한다. 적합한 아세테이트 염 완충액은 임의의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함하며, PEG 8000이 더욱 바람직하다. 본 발명의 아세테이트 염 완충액 중의 적합한 PEG 8000 농도는 약 10%, 더욱 바람직하게는 약 15%, 및 가장 바람직하게는 약 20% PEG 8000을 포함한다.
본 발명의 다른 적합한 모액은 2-프로판올 및 폴리에틸렌글리콜과 함께 소듐 카코딜레이트를 함유하는 완충액을 포함한다. 본 발명의 바람직한 소듐 카코딜레이트 완충액은 0.01 M 소듐 카코딜레이트, 더욱 바람직하게는 0.05 M 소듐 카코딜레이트 및 가장 바람직하게는 0.1 M 소듐 카코딜레이트의 결정화전의 완충액 중의 소듐 콜로데이트의 소듐 카코딜레이트의 농도를 포함한다. 적합한 소듐 카코딜레이트 염 완충액은 바람직하게는 약 5 내지 약 7, 더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.5, 및 더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 6.0의 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 적합한 소듐 카코딜레이트 완충액은 약 5% v/v, 더욱 바람직하게는 7% v/v, 및 더욱 바람직하게는 10% v/v의 농도의 2-프로판올을 함유한다. 적합한 소듐 카코딜레이트 완충액은 임의의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함하며, PEG 4000이 더욱 바람직하다. 본 발명의 아세테이트 염 완충액 중의 적합한 PEG 4000 농도는 약 10%, 더욱 바람직하게는 약 15%, 및 가장 바람직하게는 약 20% PEG 4000을 포함한다.
본 발명의 다른 적합한 모액은 소듐 카코딜레이트 및 2-프로판올과 함께 소듐 시트레이트 디하이드레이트를 함유하는 소듐 시트레이트 완충액을 포함한다. 본 발명의 바람직한 소듐 시트레이트 완충액은 약 0.05 M 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트, 더욱 바람직하게는 0.1 M 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트, 및 더욱 바람직하게는 0.2 M 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트의 결정화전의 완충액 중의 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트의 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트의 농도를 포함한다. 적합한 소듐 시트레이트 완충액은 바람직하게는 약 5.5 내지 약 7, 더욱 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.0, 및 더욱 바람직하게는 약 6.5의 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 본 발명의 바람직한 소듐 시트레이트는 완충액은 약 0.01 M 소듐 카코딜레이트, 더욱 바람직하게는 0.05 M 소듐 카코딜레이트, 및 더욱 바람직하게는 0.1 M 소듐 카코딜레이트의 결정화전의 완충액 중의 소듐 카코딜레이트의 농도를 포함한다. 적합한 소듐 시트레이트 완충액은 약 15% v/v, 더욱 바람직하게는 20% v/v, 및 더욱 바람직하게는 30% v/v의 농도의 2-프로판올을 함유한다.
FcεRI 단백질의 과포화 용액은, 이들에 제한되지 않고, 증기 확산, 액체 확산, 뱃취 결정화, 항온 및 온도 유도 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 방법에 의해 결정화하도록 유도된다. 바람직하게는, FcεRI 단백질의 과포화 용액은 증기 확산(즉, 현수 적하법(hanging drop menthod)에 의해 결정화를 유도한다. 증기 확산법에 있어서, FcεRI 단백질은 본 발명의 모액과 합해지며 이는 FcεRI 단백질 용액이 과포화되는 것을 유발하고 일정 온도에서 FcεRI 결정을 형성할 것이다. 증기 확산은 바람직하게는 약 15 ℃ 내지 약 30 ℃, 더욱 바람직하게는 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도 범위, 및 더욱 바람직하게는 약 22 ℃의 일정 온도의 제어된 온도하에서 수행한다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 아세테이트 염 완충액 중의 FcεRI 단백질의 약 3 mg/ml 용액을 제조하여 과포화 용액을 형성하고, 여기서 완충액은 약 200 mM 칼슘 아세테이트, 약 100 ml 소듐 카코딜레이트 및 약 18% PEG 8000을 포함하며, 약 pH 6.5의 pH를 가지며; (b) 과포화 제제의 약 3 ㎕ 방울들을 커버슬립 상에 적하하고 이것을 아세테이트 염 완충액 약 1 ml을 함유하는 웰 상에서 역전시키고; (c) FcγRIIa의 결정이 형성될 때까지 인큐베이팅시키는 단계들을 포함하는 FcεRI의 결정을 생산하는 방법을 포함한다.
또다른 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 소듐 카코딜레이트 완충액 중의 FcεRI 단백질의 약 3 mg/ml 용액을 제조하여 과포화 용액을 형성하고, 여기서 완충액은 약 100 mM 소듐 카코딜레이트 및 약 10% v/v 2-프로판올 및 약 20% w/w PEG 4000을 포함하며, 약 pH 5.5-6.0의 pH를 가지며; (b) 과포화 제제의 약 3 ㎕ 방울들을 커버슬립 상에 적하하고 이것을 설페이트 완충액 약 1 ml을 함유하는 웰 상에서 역전시키고; (c) FcεRI의 결정이 형성될 때까지 인큐베이팅시키는 단계들을 포함하는 FcεRI의 결정을 생산하는 방법을 포함한다.
또다른 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 소듐 시트레이트 완충액 중의 FcεRI 단백질의 약 3 mg/ml 용액을 제조하여 과포화 용액을 형성하고, 여기서 완충액은 약 200 mM 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트 및 약 100 mM 소듐 카코딜레이트 및 약 30% v/v 2-프로판올을 포함하며, 약 pH 6.5의 pH를 가지며; (b) 과포화 제제의 약 3 ㎕ 방울들을 커버슬립 상에 적하하고 이것을 설페이트 완충액 약 1 ml을 함유하는 웰 상에서 역전시키고; (c) FcεRI의 결정이 형성될 때까지 인큐베이팅시키는 단계들을 포함하는 FcεRI의 결정을 생산하는 방법을 포함한다.
임의의 단리된 FcR 단백질은 본 방법으로 사용할 수 있다. 단리된 FcR 단백질은 그의 천연 환경으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 DNA 기술(예, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성을 사용하여 생성할 수 있다. 재조합 FcR 단백질을 생산하기 위하여, FcR 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포에서 핵산 분자를 전달할 수 있는 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터에 포함되는 적합하고 바람직한 핵산 분자를 여기서 설명한다. 본 발명의 바람직한 핵산 분자는 인간 FcR 단백질 및 더욱 바람직하게는 인간 FcγRIIa 단백질, 인간 FcεRI 단백질 또는 인간 FcγRIIIb 단백질을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 FcR 단백질의 임의의 부분, 바람직하게는 전장 FcR 단백질 및 더욱 바람직하게는 가용성 형태의 FcR 단백질(즉, 그러한 단백질을 생산하는 세포에 의해 분비될 수 있는 형태의 FcR 단백질)을 코드할 수 있다. 재조합 벡터, 및 특히 재조합 분자에 포함되는 더욱 바람직한 핵산 분자는 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 또는 서열 번호: 13으로 표시되는 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자들을 포함한다. 재조합 분자에 포함되는 바람직한 핵산 분자는 그의 생산에 대하여 실시예 부분에 기술한 sFcγRIIa 및 sFcεRI을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 RNA 나 DNA 중 어느 것, 원핵성 또는 진핵성의 어느 것일 수 있으며 대표적으로는 바이러스 또는 플라스미드이다. 바람직하게는 FcR 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터를 포함하는 벡터 내로 삽입되어 재조합 분자를 형성한다. 본 명세서에서 사용된 바의, 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있으며 특정 핵산 분자를 발현시킬 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터이다. 본 발명의 발현 벡터는 박테리아, 진균, 내부기생충, 곤충, 기타 동물 및 식물 세포를 포함한 본 발명의 재조합 세포에서 작용(즉, 직접 유전자 발현)하는 임의의 벡터들을 포함한다. 본 발명의 바람직한 발현 벡터는 pVL1392 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 재조합 분자는 pVL-sFcγRIIa(a), pVL-sFcγRIIa(b), 및 pVL-sFcεRI (c)를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 임의의 적합한 숙주 세포 내로 형질전화되어 재조합 세포를 형성할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 발현 벡터 내로 삽입된 핵산 분자를 발현할 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 예를 들면, 원핵성 발현 벡터는 세균 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 바쿨로바이러스, 특히 곤충 세포를 발현 시킬 수 있는 세포를 포함하며 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포가 바람직하다. 본 발명의 바람직한 재조합 세포는 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγ RIIa(a)/pVL-sFcγRIIa(b), 및 에스프루기페르다:pVL-sFcεRI (c)를 포함하며, 그의 생산에 대하여 여기에 기술한다.
FcR 결정의 생산에 유용한 FcR 단백질을 단리하는 한 방법은 그러한 FcR 단백질을 발현하는 재조합 세포들의 세포 배양물로부터 재조합 단백질의 회수를 포함한다. 한 바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 단리된 재조합 FcR 단백질은 단백질을 생산하는데 효율적인 조건 하에서 단백질을 발현할 수 있는 세포를 배양하고 단백질을 회수함으로써 생산된다. 배양에 바람직한 세포는 본 발명의 재조합 세포이다. 효율적인 배양 조건은, 이들에 한정되지 않고, 효율적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건 및 단백질 생산을 허용하는 배양 배지를 포함한다. 그러한 배양 조건은 당업자의 전문성 이내에 있다. 적합한 조건의 예를 실시예에 포함시켰다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 세포는 분비형의 FcR 단백질을 발현한다. 본 발명의 FcR 단백질은, 이들에 한정되지 않고, 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 위상차 가용화 등의 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 바람직하게는, FcR 단백질의 단백질이 FcR 단백질의 삼차원 구조에 관련된 정보를 얻기에 유용한 결정의 형성에 충분하도록 정제되는 방식으로 정제되는 것이 좋다. 바람직하게는 FcR 단백질의 조성은 약 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85% 및 더욱 바람직하게는 90% 순도가 좋다.
한 실시태양에 있어서, 재조합 FcR 단백질은 약 20 시간 내지 약 60 시간 후-감염(post-infection) , 바람직하게는 약 30 내지 약 50 시간 후-감염 및 더욱 바람직하게는 약 40 시간 후-감염 사이에서 수확된 세포 배지 상층액으로부터 정제된다. 바람직하게는 FcγRIIa 단백질은 (a) 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/pVL-sFcγRIIa(b) 세포로부터의 상층액을 부하하고; (b) 미결합 단백질을 이온 교환 칼럼으로부터 수집하고 미결합 단백질을 면역-친화 크로마토그래피 칼럼에 부하하고; (c) 면역 친화 크로마토그래피 칼럼에 결합된 단백질을 용출하여 용출된 단백질을 겔 여과 칼럼에 가하고 (d) 여과된 단백질을 겔 여과 칼럼으로부터 수집하여 FcγRIIa 단백질을 얻는 것을 포함하는 방법에 의해 상층액으로부터 정제된다. 바람직하게는 FcεRI 단백질은 (a) 에스. 프루기페르다:pVL-sFcεRI 세포로부터의 상층액을 부하하고; (b) 미결합 단백질을 이온 교환 칼럼으로부터 수집하고 미결합 단백질을 면역-친화 크로마토그래피 칼럼에 부하하고; (c) 면역 친화 크로마토그래피 칼럼에 결합된 단백질을 용출하여 용출된 단백질을 겔 여과 칼럼에 가하고 (d) 여과된 단백질을 겔 여과 칼럼으로부터 수집하여 FcεRI 단백질을 얻는 것을 포함하는 방법에 의해 상층액으로부터 정제된다.
인간 FcγR 단백질 및 단백질의 FcγR 집단의 기타 원들 사이의 고도의 아미노산 서열 상동성에 비추어, 본 발명의 정제 방법은 FcγR 집단의 각각의 일원에 대해서 적용가능하다. 또한, 당업자는 본 발명의 정제 방법이 일반적으로, 면역-친화 크로마토그래피 정제의 단계에서 IgG 보다 IgE를 사용하는 것을 제외하고는 cεRI 단백질 등의 및 정제 단계에서 IgG 보다도 IgA를 사용하는 것을 제외하고는 FcαRI 단백질 등의, 임의의 FcR 단백질의 정제에 유용함을 인식할 것이다. 단백질의 FcγR 집단, FcεRI 단백질 및 FcαRI 단백질의 원들의 단리된 단백질은 재조합 DNA 기술을 통하여 얻을 수 있거나, 이들에 한정되지 않고, 단핵구, 대식구, 호중구, 호산구, 혈소판 및 B 임파구(즉, B 세포)를 포함하는 천연원으로부터 정제해도 좋다. 단리된 FcγRIIa 및 FcεRI 단백질의 재조합 생산은 실시예 부분에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 실시태양은 결정형의 FcR 단백질(즉, FcR 결정)을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "결정성 FcR" 및 "FcR 결정"은 모두 결정화된 FcR 단백질을 의미하며 상호 교환적으로 사용되도록 의도하였다. 바람직하게는, 결정성 FcR은 본 명세서에 기술된 결정 형성 방법을 사용하여, 특히 실시예 6 또는 실시예 9에 기술된 방법에 따라 생산된다. 본 발명의 FcR 결정은 임의의 결정 구조 및 바람직하게는 사방정계로서 석출물을 포함할 수 있다. 본 발명의 적합한 결정성 FcR은 FcR 단백질의 모노머 또는 멀티머를 포함한다. 바람직한 결정성 FcR은 비대칭 단위의 한 FcR 단백질을 포함한다. 더욱 바람직한 결정형 FcR은 FcR 단백질의 다이머를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양은 결정형의 FcγRIIa 단백질(즉, FcγRIIa 결정)을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "결정성 FcγRIIa" 및 "FcγRIIa 결정"은 모두 결정화된 FcγRIIa 단백질을 의미하며 상호 교환적으로 사용되도록 의도하였다. 바람직하게는, 결정성 FcγRIIa은 본 명세서에 기술된 결정 형성 방법을 사용하여, 특히 실시예 6에 기술된 방법에 따라 생산된다. 본 발명의 FcγRIIa 결정은 임의의 결정 구조 및 바람직하게는 사방정계로서 석출물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 단위 셀의 치수 a= 78.80 Å, b =100.55 Å, c=27.85 Å를 형성하도록 공간 그룹 P21212에서 결정으로 배열된 FcγRIIa 단백질 분자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 결정은 약 3.0Å, 바람직하게는 약 2.4 Å, 및 더욱 바람직하게는 약 1.8 Å의 해상도로 FcγRIIa 단백질의 원자 좌표의 결정을 위한 X-선 회절 데이터를 포함한다.
본 발명의 적합한 결정성 FcγRIIa은 FcγRIIa 단백질의 모노머 또는 멀티머를 포함한다. 바람직한 결정성 FcγRIIa는 비대칭 단위의 한 FcγRIIa 단백질을 포함한다. 더욱 바람직한 결정형 FcγRIIa는 FcγRIIa 단백질의 다이머를 포함한다.
본 발명의 다른 특정 실시태양은 결정형의 FcεRI 단백질(즉, FcεRI 결정)을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "결정성 FcεRI" 및 "FcεRI 결정"은 모두 결정화된 FcεRI 단백질을 의미하며 상호 교환적으로 사용되도록 의도하였다. 바람직하게는, 결정성 FcεRI는 본 명세서에 기술된 결정 형성 방법을 사용하여, 특히 실시예 9에 기술된 방법에 따라 생산된다. 본 발명의 FcεRI 결정은 임의의 결정 구조 및 바람직하게는 사방정계로서 석출물을 포함할 수 있다. 본 발명의 적합한 결정성 FcεRI은 FcεRI 단백질의 모노머 또는 멀티머를 포함한다. 바람직한 결정성 FcεRI은 비대칭 단위의 한 FcεRI 단백질을 포함한다. 더욱 바람직한 결정형 FcεRI은 FcεRI 단백질의 다이머를 포함한다.
본 발명에 따르면, 결정성 FcR은 본 발명의 화학적 화합물이 본 발명의 구조에 기초한 약물 디자인 방법에 의해 예견된 방식으로 FcγRIIa 단백질에 결합하는 능력을 결정하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, FcγRIIa 결정을 본 발명의 화학적 화합물을 함유하는 용액 중에 적신다. 이어서 결정에 대한 화학적 화합물의 결합을 업계의 표준적인 방법에 의해 결정한다.
본 발명의 한 실시태양은 치료용 조성물이다. 본 발명의 치료용 조성물은 하나 이상의 치료학상 화합물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 치료학상 화합물은 억제용 화합물 및 자극성 화합물을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양은 IgG-매개 조직 손상을 감소시킬 수 있는 치료용 조성물이다. 적합한 치료용 조성물은 IgG-매개 과민증 또는 FcγR 단백질을 수반하는 염증성 세포의 IgG-매개 회복(recruitment)에 수반되는 기타의 생물학적 기전으로부터 초래된 IgG-매개 조직 손상을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 치료 조성물은 (1) FcγR 단백질의 IgG 결합 부위를 방해함으로써 FcγR 단백질을 갖는 세포 (예, B-세포, 대식구, 호중구, 호산구, 혈소판 세포) 상의 FcγR 단백질의 결합을 방해(예컨대, 방지, 차단)할 수 있고, (2) IgG의 Fc 부분에 결합하여 IgG 분자의 보체 결합 부위를 방해하으로써 FgG 면역 복합체에 의한 보체 고정화를 억제하고; (3) IgG 또는 IgG 면역 복합체의 침전을 억제할 수 있고(즉, 두 IgG 사이의 Fc:Fc 상호작용을 방지할 수 있고), (4) IgG의 세포 표면 수용체에의 결합을 방해함으로써 면역글로불린-매개 세포의 신호 전달을 억제할 수 있고, (5) 세포 신호 유도 분자(예컨대, FcγR 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 유도하는 분자)의 FcγR 단백질에의 결합을 방해함으로써 FcγR-매개 세포의 신호 전달을 억제할 수 있고; (6) 병원체에 결합된 IgG의 식균 세포 상의 FcγR 단백질에의 결합을 억제함으로써 병원체의 옵시니제이션 (opsinization)을 억제하고 (즉, 플라비바이러스 및 덴구 바이러스 등의 바이러스 감염의 항체 의존정 증강(enhancement)(ADE)을 억제하고); 및 (7) FcγR 단백질에 대한 바이러스 분자(예컨대, 홍역 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질)의 결합을 억제할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바의, 용어 "면역 복합체"는 항체가 가용성 항원에 결합할 때 형성되는 복합체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바의 "보체 고정화"는 대표적으로는 C3a 및 C5a를 포함하는 복합체의 어셈블리 또는 절단된 C4의 발생에 의해 염증성 세포의 회복을 초래하는 항원:항체 복합체에 의한 보체 활성화를 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "결합부위"는 다른 분자가 특이적으로 결합하는 분자(예, 단백질)의 영역을 의미한다. 그러한 치료용 조성물은 IgG의 FcγR 단백질, IgG의 보체, IgG의 IgG, IgG의 세포 표면 수용체, 세포 신호 유도 분자의 FcγR 단백질, FcγR 단백질의 바이러스로의 결합을 억제하거나 또는 옵시나이제이션을 억제하는 하나 이상의 화합물들을 포함한다. 또한 본 발명에는 IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 방법이 포함된다. 이 방법은 동물에 본 발명의 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 동물에서 IgG 액성 면역 반응을 자극할 수 있는 치료용 조성물이다. 본 발명의 더욱 다른 실시태양은 동물에 투여되어 옵시니제이션 (opsinization) 또는 FcR-의존성 효과기 기능들 (예, 항체-의존성 FcγR-매개 세포독성, 식세포작용 또는 세포성 매개자의 방출)에 의해, 이들에 한정되지 않고, 암 또는 감염성 질환(예, HIV, 포진, 세균 감염, 효모 감염 또는 기생충 감염)을 포함하는 특정 질병을 치료하는 항체의 치료 영향을 증대시키는 치료용 조성물이다. 그러한 치료 조성물은 IgG에 대한 증가된 결합을 갖고, IgG의 FcγR에의 결합을 증대시키며, FcγRI의 다이머 형성을 증대시키고(또는) FcγR을 통한 신호 전달을 증대시키는 하나 이상의 자극성 화합물을 포함한다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 액성 면역 응답을 자극하는 방법이다. 이 방법은 동물에 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 적합한 억제용 화합물은 FcγR 단백질, 바람직하게는 FcγRIIa 단백질 또는 FcγRIIIb 단백질과 상호작용하여 IgG가 FcγR에 결합할 수 없도록 (예컨대 알로스테릭 상호작용에 의해) FcγR(이하 기질 유사체라고 함)의 IgG 결합 부위를 차단하거나 또는 FcγR 단백질의 다른 영역(FcγR 다이머의 모노머들 상이의 IgG 결합 클레프트의 상부 그루부에서, 다이머 경계면에서, 각 모노머 상의 D1 및 D2 사이의 클레프트 또는 힌쥐 영역 또는 FcγR 다이머의 모노머들에 의해 형성된 하부 그루부에서 IgG 결합 클레프트의 하부에서와 같은)을 변형시킴으로써 IgG의 FcγR 단백질에의 결합을 억제하는 화합물이다. FcγR 기질 유사체는 FcγR 단백질의 IgG 결합 부위와 상호 작용(예컨대, 이것에 결합, 이것과 연합, 변형)하는 화합물을 의미한다. FcγR 기질 유사체는, 예를 들면 IgG의 Fc 부분을 모방하는, 또는 FcγR의 IgG 결합 부위에 특이적으로 결합하지만 IgG의 Fc 부분을 모방하지는 않는 화학적 화합물을 포함한다. 본 발명의 억제용 화합물은 또한 본질적으로 IgG에 결합하는 FcγRIIa 단백질의 적어도 일부를 모방하는 화합물(본 명세서에서는 펩티드모방 화합물로 언급한다)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 적합한 억제용 화합물은 FcγR 단백질의 IgG 이외의 세포 신호 유도 분자에의 결합을 억제하는 화합물을 포함한다. 그러한 세포 신호 유도 분자의 예로는 다른 FcγR (즉, FcγR 단백질의 다이머를 형성하는), 또는 세포 표면 부속 분자, 세포내 부속 분자 또는 바이러스(예, 홍역 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질)을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양은 IgE-매개된 응답을 줄일 수 있는 치료 조성물이다. 적합한 치료 조성물은 IgE-매개 과민증, 염증성 모듈레이터들의 IgE-매개된 방출, 또는 FcεR 단백질을 수반하는 염증 세포들의 IgE-매개된 회복(recruitment)에 수반되는 기타 생물학적 기작으로부터 기인한 IgE-매개 응답들을 감소시킬 수 있다. 예를 들면 본 발명의 치료 조성물은 (1) FcεR 단백질의 IgE 결합 부위를 방해함으로써 FcεR 단백질을 갖는 세포 (즉, 유선 세포) 상의 FcεR 단백질의 IgE 면역 복합체에의 결합을 방해(예컨대, 방지, 차단)할 수 있고, (2) IgE 또는 IgE 면역 복합체의 침전을 억제할 수 있고(예컨대, 두 IgE 사이의 Fc:Fc 상호작용을 방지할 수 있고), (3) IgE의 세포 표면 수용체에의 결합을 방해함으로써 면역글로불린-매개 세포의 신호 전달을 억제할 수 있고, (4) 세포 신호 유도 분자(예컨대, FcεR 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 유도하는 분자)의 FcεR 단백질로의 결합을 방해함으로써 FcεR-매개 세포의 신호 전달을 억제할 수 있다. 그러한 치료 조성물은 IgE의 FcεR 단백질로의, IgE의 IgE로의, IgE의 세포 표면 수용체로의, 또는 세포 신호 유도 분자의 FcεR 단백질로의 결합을 억제하는 하나 이상의 억제용 화합물들을 포함한다. 본 발명에 또한 포함되는 것들은 IgE-매개 염증 등의 IgE-매개 응답을 유발하는 방법들이다. 이 방법은 본 발명의 치료용 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 동물에서 IgE 액성 면역을 자극할 수 있는 치료용 조성물이다. 본 발명의 더욱 다른 실시태양은 동물에 투여되어 옵시니제이션 (opsinization) 또는 FcεR-의존성 효과기 기능들 (예컨대, 식세포작용 또는 세포성 매개자의 방출)에 의해, 특정 질병을 치료하는 항체의 치료 영향을 증대시키는 치료용 조성물이다. 그러한 치료 조성물은 IgE에 대한 증가된 결합을 갖고, IgE의 FcεRI에의 결합을 증대시키며, FcεRI의 다이머 형성을 증대시키고(또는) 달리 FcεRI을 통한 신호 전달을 증대시키는 하나 이상의 자극성 화합물들을 포함한다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 액성 면역 응답을 자극하는 방법이다. 이 방법은 동물에 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 적합한 억제용 화합물은 FcεR 단백질과 상호작용하여 IgE가 FcεR에 결합할 수 없도록 (예컨대 알로스테릭 상호작용에 의해) FcεR(이하 기질 유사체라고 함)의 IgE 결합 부위를 차단하거나 또는 FcεR 단백질의 다른 영역(FcεRI 다이머의 모노머들 사이의 IgE 결합 클레프트의 상부 그루부에서, 다이머 경계면에서, 각 모노머 상의 D1 및 D2 사이의 클레프트 또는 힌쥐 영역 또는 FcγR 다이머의 모노머들에 의해 형성된 하부 그루부에서 IgE 결합 클레프트의 하부에서와 같은)을 변형시킴으로써 IgE의 FcεR 단백질에의 결합을 억제하는 화합물이다. FcεR 기질 유사체는 FcεR 단백질의 IgE 결합 부위와 상호 작용(예컨대, 이것에 결합, 이것과 연합, 변형)하는 화합물을 의미한다. FcεR 기질 유사체는, 예를 들면 IgE의 Fc 부분을 모방하는, 또는 FcεR의 IgE 결합 부위에 특이적으로 결합하지만 IgE의 Fc 부분을 모방하지는 않는 화학적 화합물을 포함한다. 본 발명의 억제용 화합물은 또한 본질적으로 IgE에 결합하는 FcεR 단백질의 적어도 일부를 모방하는 화합물(본 명세서에서는 펩티드모방 화합물로 언급한다)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 적합한 억제용 화합물은 FcεRI 단백질의 Ig 이외의 세포 신호 유도 분자에의 결합을 억제하는 화합물을 포함한다. 그러한 세포 신호 유도 분자의 예로는 다른 FcεR (즉, FcεR 단백질의 다이머를 형성하는), 또는 세포 표면 부속 분자, 세포내 부속 분자 또는 바이러스(예, 홍역 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질)을 포함한다.
본 발명의 억제용 화합물은 당업자에게 잘 알려진 다양한 수단에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 억제용 화합의 FcR 단백질에 대한 결합 또는 달리 이것과의 상호 작용은 예를 들면 효소면역흡수분석(ELISA) 및 방사면역분석법(RIA) 등의 면역 분석 또는 비아코어(Biacore) 분석 등의 결합 분석을 사용하여 용액 중 또는 세포 상의 FcR 단백질로 결정될 수 있다. 세포-기초 분석법은 예를 들면, 사이토카인(예, IL-4, IL-6 또는 IL-12) 분비 분석, 또는 예를 들면 세포 신호 유도 분자에 대한 FcR 결합시 단백질 또는 지질 인산화, 매개체 방출 또는 세포내 Ca++모빌화(mobilization)를 결정하는 세포내 신호 전달 분석을 포함한다.
본 발명의 적합한 자극성 치료용 화합물은 Ig에 결합하는 천연 FcR 단백질(예컨대 그의 천연 환경으로부터 단리된 FcR 단백질)에 비교했을 때 Ig에 대한 개선된 결합을 나타내는 화합물들이며, 또한 그의 FcR에 대한 Ig의 결합을 증대시키거나 또는 FcR을 통해 신호 전달을 증가시키는 화합물들을 포함한다. 본 발명의 자극성 화합물은 (1) 예를 들면 천연 FcR 단백질보다 높은 수준에서 Ig에 결합하거나 또는 달리 상호작용하는; (2) 그의 FcR에 대한 Ig의 결합을 증대시키는; (3) FcR, FcR에 결합하는 Ig 또는 FcR에 결합된 Ig의 조합 중 어느 하나에 결합함으로써 FcR의 다이머 형성을 증대시키는; 및(또는) (4) FcR을 통한 신호 전달을 증대시키는 그의 능력에 의해 동정된다. 예를 들면, 천연 FcR에 비하여 Ig의 본 발명의 자극성 화합물에 대한 증가된 결합을 결정하는 방법은 Ig가 자극성 화합물 및 천연 FcR 단백질에 결합하는 곳에서의 결합의 안정성, 친화도 및 동역학을 결정하는 결합 분석들을 포함한다. 그러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본 발명의 실시예 부분에 기술되어 있다. 본 발명의 자극성 화합물은 또한 Ig 또는 FcR 단백질에 결합하여 FcR 단백질에 대한 Ig의 결합을 증대시키거나 또는, 예를 들면 FcR의 Ig-결합 부위 또는 FcR 단백질에 결합하는 Ig의 Fc 부분을 변형하는 알로스테릭 상호작용에 의해 FcR 또는 Ig의 다른 영역을 변형시킴으로써, FcR 단백질에 대한 Ig의 결합 동안 또는 후에 세포 신호 전달을 증진시키는 화합물을 포함한다. 본 발명의 다른 자극성 화합물은 FcR-매개 세포의 신호 전달이 모방하는되는 방식으로 Ig의 부재하에서 FcR 단백질에 결합하는 화합물을 포함할 수 있다.
당업자는 억제용 또는 자극용 화합물이 FcγR 단백질 및 IgG 및 FcεRI, IgE에 대해서 기술한 바와 같이, 임의의 FcR 및 그의 리간드의 구조에 기초하여 개발될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 적합한 치료용 화합물은 펩티드 또는 기타 유기 분자 및 유기 분자들을 포함한다. 적합한 유기 분자들은 소형 유기 분자들을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 화합물은 그러한 화합물을 동물에 투여했을 때 동물에 해롭지(예컨대, 독성을 갖고 있지) 않는 것이 좋다. 펩티드들은 분자량이 적은 화합물의 부류에 속하며, 가수분해시 둘 이상의 아미노산을 생성한다. 폴리펩티드는 둘 이상의 펩티드로 구성된다. 본 명세서에서 사용된 바의, 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된다. 디자인하기에 바람직한 치료용 화합물은 선형 또는 분지형 배좌의 정상의 또는 레트로인버소 펩티드, 펩티드모방 화합물, 작은 유기 분자들, 또는 그의 호모- 또는 헤테로-폴리머로서 배좌된 "L" 및(또는) "D" 아미노산들로 구성된 펩티드들을 포함한다.
본 발명의 치료용 화합물은 구조에 기초한 약물 디자인을 사용하여 디자인 될 수 있다. 본 발명의 삼차원 구조의 발견까지는 FcR 단백질의 구조에 기초한 치료용 화합물의 구조에 기초한 개발에 유용한 정보는 입수가 가능하지 않았다. 지금까지 그러한 합리적인 개발은 입수가능한 선형 아미노산 서열 정보로부터 새로이(de novo) 수행할 수 없었다. 구조에 기초한 약물 디자인은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질의 형태 또는 펩티드 또는 단백질 및 치료용 화합물 사이의 형태학적 상호작용을 예측하는 컴퓨터 시뮬레이션의 사용을 의미한다. 예를 들면, 일반적으로, 치료 화합물과 효율적으로 상호작용하는 단백질에 대해서, 치료용 화합물의 삼차원 구조는 결합시 바람직한 결과가 얻어지는 방식으로 화합물이 단백질에 결합하는 것을 허용하는 호환성(compatible) 배좌를 가정하는 것이 필요하였다. 단백질의 삼차원 구조의 지식으로 인하여 당업자는 그러한 허용가능한 배좌를 갖는 치료용 화합물을 디자인하는 것이 가능하다. 예를 들면 FcγRIIa 단백질의 IgG 결합 부위의 삼차원 구조에 대한 지식으로 인해 당업자는 FcγRIIa에 결합하고 안정되며, FcγR을 갖는 세포에 대한 IgG 결합 또는 그러한 결합시 세포의 신호 전달 등의 생물학적 응답의 억제를 초래하는 치료용 화합물을 디자인하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, FcγRIIa 단백질의 IgG 결합 부위에 대한 삼차원 구조에 대한 지식은 당업자로 하여금 FcγRIIa 단백질의 기질 유사체를 디자인하는 것을 가능케 한다.
구조에 기초한 약물 디자인에 유용한 적합한 구조 및 모델들을 이하 기술한다. 구조 기초한 약물 디자인의 방법에 사용하기 위한 바람직한 구조는 FcγRIIa 단백질의 구조, FcεRI 단백질의 구조, FcγRIIIb 단백질의 구조, 표적 FcγR 구조의 모델을 포함한다. 구조에 기초한 약물 디자인의 방법에 사용하기 위한 표적 구조의 바람직한 모델은 분자 치환 및 겹침 인식 관련된 방법들을 포함한 본 명세서에 기재된 임의의 모델링법들에 의해 생성된 모델들을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양은 (a) FcR 단백질의 삼차원 구조를 포함하는 단백질의 구조 또는 본 발명의 모델을 제공하고; (b) 삼차원 구조 또는 모델을 사용하여 화학적 화합물을 디자인하고; (c) 화학적 화합물을 화학적으로 합성하는 것을 포함하는 컴퓨터-보조 생물활성 화합물의 구조에 기초한 약물 디자인의 방법이다. 그러한 방법은 추가로 (d) 합성된 화학적 화합물의 생활성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 FcR 단백질의 삼차원 구조 및 모델을 여기에서 기술한다. 본 발명에 따르면, 디자인하는 단계는 새로운 화학적 화합물을 창제하거나 공지의 화합물(예컨대, 공지의 화합물의 삼차원 구조들을 함유한 컴퓨터에 이한 스크리닝 데이터베이스에 실린 화합물)의 라이브러리의 데이터베이스의 검색을 포함한다. 디자인은 또한 특정 구조적 특징부에서 대체 부분을 갖는 화학적 화합물을 시뮬레이션함으로써 수행할 수 있다. 디자인하는 단계는 화합물의 공지의 기능에 기초하여 화학적 화합물을 선별하는 것을 포함할 수 있다. 디자인하는 단계의 바람직한 방법은 컴퓨터에 의해 화합물의 삼차원 구조가 알려지고 FcR 단백질의 삼차원 구조와 상호작용하는(예컨대, 도킹되거나, 정렬되거나, 매치되거나, 결부되는) 화합물에 대한 하나 이상의 데이터베이스의 컴퓨터에 의한 스크리닝을 포함한다(예컨대, Humblet and Dunbar, Animal Reports in Medicinal Chemistry, vol. 28, pp. 275-283, 1993, M Venuti, ed., Academic Press 참조). 적합한 화학적 화합물을 합성하는 방법들은 당업자에게 공지되어 있으며 합성되는 화학물질의 구조에 의존한다. 합성된 화합물의 생활성을 평가하는 방법은 화합물의 생활성(예컨대, 억제성 또는 자극성)의 생활성에 의존하여 본 명세서에 개시되어 있다.
구조-기초한 약물 디자인의 다양한 다른 방법들은 문헌[Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Application and Strategies, Wiley-Liss, Inc.)에 기재되어 있으며, 이것의 전문을 본 명세서에 참고로 인용한다. 마울릭 등(Maulik et al.)은 예를 들면 사용자가 적절히 선택된 단편들의 단편 라이브러리보룹터의 신규한 분자를 창제하는 공정을 지시하는 정향(directed) 디자인 방법; 사용자가 유전적 또는 기타 알고리즘을 사용하여 단편들 및 이들의 조합을 무작위 돌연변이 시키는 한편 동시에 선별 규준을 적용하여 후보자 리간드들의 적합성을 평가하는 무작위 디자인; 및 사용자가 삼차원 수용체 구조 및 작은 단편 프로브들 사이의 상호작용 에너지를 계산하고 이어 바람직한 프로브 사이트들을 함께 연결하는 격자-기초 접근법을 개시한다.
바람직하게는, FcR 단백질의 Ig 결합 부위에 결합하는 본 발명의 화학적 화합물은 FcR 단백질 및(또는) Ig와 화학적 및(또는) 입체화학적 상보성을 갖는 화학적 화합물로부터 유래되는 것으로 알려져 있다. 그러한 상보성은 화학물질 그룹의 모양 또는 배좌 중 어느 하나에 있어서 수용체의 표면과 조화를 이루고 FcR 단백질과 결합하여 FcR 단백질에 대한 Ig 결합을 자극 또는 억제하거나 또는 FcR 단백질에 결합시 세포의 신호 전달을 유도하는 화학적 화합물의 특징이다. 더욱 구체적으로, FcR 단백질의 IgG 결합 부위에 결합하는 화학적 화합물은 적어도 약 10-6M의 친화도, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 10-8M의 친화도로 결합한다.
바람직하게는, FcR 단백질의 5개의 부위는 구조에 기초한 약물 디자인의 표적들이다. 이들 부위들은 FcR 단백질의 Ig-결합 부위, 두 FcR 모노머들 사이의 상부 그루부, 두 FcR 단백질 모노머들 사이의 다이머화 계면, 두 FcR 모노머들 사이의 하부 그루부, 계면, FcR 단백질의 도메인 1 및 2 사이의 클레프트 또는 힌지 영역, 이들 부위들의 임의의 것의 조합(예컨대, Ig-결합 부위와 모노머들 사이의 상부 그루부 사이의 동시적인 상호작용)을 포함한다. 이들 부위들의 개략적 표시를 도 17에 나타내었으며, "a"는 FcR의 Ig-결합 부위를 나타내고, "b"는 두 FcR 모노머 사이의 상부 그루브를 나타내고, "c"는 두 FcR 단백질 모노머들 사이의 다이머화 계면을 나타내고, "d"는 FcR 단백질의 도메인 1 및 2 사이의 클레프트 또는 힌지 영역을 나타내며, "e"는 두 FcR 모노머들 사이의 하부 그루브를 나타낸다. 다음의 논의는 FcR의 표적 부위를 사용한 약물-디자인에 대한 구체적인 세목을 제공하며, 일례로서 FcγRIIa 구조 상의 바람직한 표적 부위들을 언급한다. 그러나, 당업자는 본 명세서에서 제공된 FcεRI 구조 및 FcγRIIIb 구조의 기재를 사용하여 구조 기초한 약물 디자인을 위한 FcεRI 단백질 모노머 및 다이머 상의 유사한 표적 부위들을 효율적으로 선별할 수 있음을 이해해야 한다. 추가로, 이제 본 명세서에 제공된 정보에 기초하여 다른 FcR 단백질을 모델링할 수 있는 당업자는 구조에 기초한 약물 디자인을 위한 다른 FcR 단백질 상의 유사한 표적 부위들을 효율적으로 선별할 수 있을 것이다.
Ig-결합 부위(도 17, "a))은 Ig에 대한 FcR의 결합에 직접적으로 영향을 미치도록 표적화되었다. 예를 들면 FcγRIIa 단백질의 IgG 결합 부위는, 이들에 한정되지 않고, 서열 번호: 3의 잔기 155, 156, 158-160, 113-116, 129, 131, 133 및 134을 포함하고, 또한 상기한 제2부위의 적어도 일부(도 17 "b"), FcγRIIa 단백질의 다이머화시 형성하는 두 IgG 결합 부위 사이의 그루브를 포함할 수 있다. IgG 결합에서 포함되는 부위 "b"로 부터의 잔기들은, 이들에 한정되지 않고, 서열 번호: 3의 잔기 117-121, 125-129, 150-154 및 157-161을 포함한다. FcγRIIa 단백질의 IgG 결합 부위를 포함하는 구조에 기초한 약물 디자인을 위한 적합한 표적 부위는 도 7에 설명되어 있다. 더욱 구체적으로, 돌연변이 연구에 의해 IgG의 결합에 영향을 미치는 몇 개의 잔기들이 동정되었고 여기에 개시된 삼차원 구조들은 어느 잔기가 표면 노출되었는지를(즉, IgG의 결합에 참가할 것 같은지 및 알로스테릭 효과를 단지 가지지 않을 것인지를) 명확히 동정할 수 있다. 이들 잔기들은 3개의 공간적인 그룹: (1) Phe129, His131, Lys113, Pro114, Leu115, Val116; (2) Pro134 및 Asp133; 및 (3) Leu 159 및 Ser161로 분류될 수 있다. 그룹 (1)은 결합 표면 "a"( 도 17)를 가로질러 그루브 "b"(도 17)의 립(lip)으로부터 선도되는 연속 표면을 형성하며 IgG 결합의 부위에서 디자인 작업의 가장 바람직한 표적을 나타낸다. 그룹 (2)는 Leu132에 의해 그룹 (1)과 분리되어 있는데, 현재로서는 IgG의 결합에 있어서 중요성은 알려지지 않았으며, 표면 노출된 잔기의 일부일 수도 있다. 그룹 (3)은 다른 두 그룹과는 떨어진 잔기들을 포함하며 다이머 구조에 의한 IgG의 결합에는 참여하는 것이 가능한 것으로 보이지는 않는다.
FcR의 두 모노머 사이의 상부 그루부(도 17; "b")는 또한 표적화되어 Ig에 대한 FcR의 결합에 직접적으로 영향을 미친다(즉 억제 또는 증대). 이 상부 그루브는 평면 단백질 표면을 표적화하는 것과는 대조적으로 구축하기 위한 매력적인 부위를 제공한다. FcγRIIa 단백질의 다이머 구조는 C2 또는 슈도(pseudo) C2 대칭 억제제를 표적화하는 것을 제시한다. FcγRIIa 단백질에 있어서 표적화하기 위한 바람직한 잔기는 Lys117, His131, Phe129, Asn154, Ser161, Leu159, Thr152 및 Phe121을 포함하며, Phe129, Lys117 및 His131이 가장 바람직하다. 한 실시 태양에 있어서, 상부 그루브 "b" 및 IgG 결합 표면 "a" 모두와 동시에 상호작용을 하는 화합물들을 디자인할 수 있다. 예를 들면, 개선된 Ig 조절성 화합물들은 그루브의 밖으로 흘러가서 상기한 바의 "a"의 결합 표면에 결합하는 조절성 화합물을 디자인함으로서 얻을 수 있다. 별법으로, "b"에 결합하는 조절성 화합물들은 "a" 결합 표면과 실제로 상화작용하지 않고 "a"에 대한 IgG의 결합을 입체적으로 방해할 수 있다.
수용체 다이머 표면 (도 17; "c")는 표적화되어 다이머를 형성하는 두 FcR 단백질의 능력에 직접적으로 영향을 미침으로써 FcR 단백질들의 하나 또는 모두를 통하여 세포의 신호 전달에 영향을 미친다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 다이머 형성이 세포의 신호 전달에 영향을 미치거나 다이머 내에 수반된 FcR 단백질의 하나 또는 모두의 Ig 결합의 형태에 영향을 미침으로써 세포의 신호 전달에 영향을 미칠 수 있을 것으로 믿는다. 또한, 다이머 계면은 한 모노머가 다른 모노머에 대한 리간드 정보를 제공하거나 그 역이어서 뛰어난 표적 부위를 나타낸다. 두 FcγRIIa 단백질 사이의 다이머화 계면을 포함하는 구조에 기초한 약물 디자인을 위한 적합한 표적 부위는 도 10에 나타내었다. 더욱 구체적으로, 잔기 117-131 및 잔기 150-164는 FcγRIIa 다이머의 경계면의 영역을 보충하며 이들 서열로부터의 펩티드 또는 모조체(mimics)는 결합 억제자일 수 있다. FcγRIIa의 결정 구조로부터 수소 결합 상호작용의 검사는 경계면 영역에서의 모노머들 사이의 비교적 낮은 상호작용을 나타내지만, 두드러진 클러스터는 헥사펩티드 Phe121-Gln122-Asn123-Gy124-Lys125-Ser126에 걸쳐 있다. 추가로 Gly124-Ser561 및 Ser126-Leu559를 수반하는 모노머들 사이의 수소 결합이 있다.
도메인 1 및 2 (도 17; "d") 사이의 계면은 표적화하여 FcγRIIa 단백질에 대한 IgG 결합에 영향을 미친다. 본 발명자들은 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조에 있어서, 도메인 1은 도메인 2와 밀접하게 접촉하고 있음을 발견하였다. 특히 도메인 1에서 서열 번호: 3의 잔기 17-20을 포함하는 루프는 도메인 2의 루프에 밀접하게 위치하여 적어도 한 부분의 IgG-결합 부위를 형성한다. IgG와의 상호작용들은 D1D2 계면에 인접하여 일어나며 이 부위에서 그러한 변형은 Ig 결합에 영향을 미칠 수도 있다. 추가로, 클레프트는 잔기 12-14(기초), 6-10 및 77-80(D1 면) 및 93-96 및 102(D2 면)에 의해 규정되며 이는 억제제 디자인을 위한 잠재적인 부위를 나타낸다. FcγRIIa 단백질의 도메인 1 및 도메인 2 사이의 계면을 포함하는 구조에 기초한 약물 디자인을 위한 적합한 표적 부위는 도 5에 나타낸다.
FcR의 두 모노머들 사이의 하부 그루브(도 17; "e")는 또한 표적화되어 Ig에 대한 FcR의 결합에 직접적으로 영향을 미친다(즉, 억제 또는 증대). 상부 그루브 "b"에 대해 상기한 바와 유사한 디자인 전략을 이 부위에 결합하는 화합물들이 억제성인지 또는 더욱 가능하게는 FcγR에 대한 IgG 결합을 증대시키는지는 덜 명확하지만 이 부위에 사용할 수 있다.
FcγRIIa 모노머 및 다이머의 잔기 및 영역에 관련하여 앞서 구체적으로 기재한 약물 디자인 전략은 FcγRIIIb 및 FcεRI 구조들을 포함하는 본 명세서에 기재한 다른 FcR 구조에도 유사하게 적용될 수 있다. 당업자는, 이들 대부분을 본 명세서에서 기술한 바의 업계 인식된 모델링 프로그램 및 약물 디자인 방법들을 사용하여, 아미노산 서열 및 더욱 선호하는 구조, 예를 들면 다른 FcR에서의 차이에 따른 FcγRIIa 디자인 전략을 변형하여 다른 FcR작용을 조절하는 약물을 유사하게 디자인 할 수 있을 것이다. 또한 당업자는 FcγRIIa 단백질 등의 한 FcR로부터 유도된 선도 화합물(lead compound)을 사용하고, FcεRI 등의 다른 FcR 단백질의 아미노산 잔기에 있어서 차이들을 고려하여, FcγRIIa 선도 화합물을 변형하여 FcεRI 단백질의 조절용 선도 화합물 구조를 디자인할 수 있을 것이다. 예를 들면 상부 그루브 파마코포어(pharmacophore)에서 His131＞Tyr131은 FcγRIIa 선도 화합물 구조에서 산성 부분을 전자 결핍 케톤 부분으로 변화시킴으로써 수용할 수 있다.
본 구조에 기초한 약물 디자인의 방법에 있어서, 후보의 화학적 화합물(예를 들면, 본 발명의 컴퓨터에 의한 스크리닝법으로 분석되는 화학적 화합물)을 표적 부위의 각 잔기에 정렬할 필요는 없다. 적합한 후보의 화학적 화합물들은 표적 부위에 대해 기술한 잔기의 서브셋트에 정렬할 수 있다. 바람직하게는, 후보의 화학적 화합물은 표적 부위 및 후보의 화학적 화합물 사이의 공유 또는 비공유 가교결합의 형성을 촉진하는 형태를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 후보의 화학적 화합물은 표적 부위에 인접한 표면에 결합하여 복합체 중의 상호작용의 추가의 부위를 제공한다. 길항질(즉, 결합 부위 또는 계면을 차단함으로써 FcR 단백질에 대한 리간드의 결합을 억제하는 화학적 화합물)을 디자인하는 경우에, 길항질은 결합 부위에 대하여 또는 표적 영역에 대한 결합으로부터 리간드(즉, 표적 부위에 특이적으로 결합하는 분자)를 실질적으로 억제하기에 충분한 친화도로 결합해야 한다. 당업자는 후보의 화학적 화합물 및 표적 부위 사이의 상보성이 리간드의 결합을 억제하거나 또는 촉진하기 위해 본 명세서에 기재된 모든 잔기에 걸쳐서 확장될 필요가 없음을 이해해야 할 것이다.
일반적으로, 입체화학적 상보성을 가지는 화학적 화합물의 디자인은 화학적 화합물 및 표적 부위 사이의 "핏(fit)"를 화학적으로 또는 기하학적으로 최적화하는 기법의 수단에 의해 성취될 수 있다. 그러한 기술들은 이들의 전문을 본 명세서에 참고로 인용하는 문헌[Sheridan and Venkataraghavan, Acc. Chem Res., vol. 20, p. 322, 1987: Goodford, J. Med. Chem., vol. 27, p. 557, 1984; Beddell, Chem. Soc. Reviews, vol. 279, 1985; Hol, Angew. Chem., vol. 25, p. 767, 1986; and Verlinde and Hol, Structure, vol. 2, p. 577, 1994]에 개시되어 있다.
구조에 기초한 약물 디자인을 위한 본 발명의 바람직한 실시태양은 FcR 단백질의 형태 또는 FcR 단백질에 관련된 구조를 보충하는 화학적 화합물을 동정하는 것을 포함한다. 그러한 방법들은 본 명세서에서 "기하학적 접근법"이라고 부른다. 본 발명의 기하학적 접근법에 있어서, 내부 자유화도의 수(및 분자 형태 공간에서 대응하는 국부적 최소)는 두 단단한 체들의 기하학적(단단한-구) 상호작용을 고려함으로써 감소되는 반면, 한 체(활성 부위)는 두 번째 체(리간드 등의 보체화 분자)에 대한 결합 부위를 형성하는 "포켓" 또는 "그루브"를 함유한다.
기하학적 접근법은 그의 전문을 본 명세서에 참고로 인용하는 문헌[Kunts et al., J. Mol. Biol., vol. 161, p. 269, 1982]에 기술되어 있다. 화학적 화합물 디자인을 위한 알고리즘은 소프트웨어 프로그램 DOCK Package, Version 1.0(Regents of the University of California로부터 입수 가능함)을 사용하여 보충할 수 있다. 쿤츠 알고리즘에 따르면, 결합 부위 또는 계면에 있어서 한 구조(예, FcγRIIa)의 표면 상의 강(cavity) 또는 그루브의 형상은 상이한 반경의 중복되는 일련의 구로서 정의된다. 결정학적 데이터의 하나 이상의 현존하는 데이터베이스(예컨대 University Chemical Laboratory, Cambridge University, Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, U.K. 에 의해 유지되는 Cambridge Structural Database) 또는 부룩헤이븐 내셔널 래보라토리(Brookhaven National Laboratory)에 의해 유지되는 프로테인 데이터 뱅크를 이와 같이 규정한 형상에 근접하는 화학적 화합물에 대해서 검색한다. 기하학적 접근법에 의해 동정된 화학적 화합물은 수소 결합, 이온 상호작용 또는 반데르 발스 상호작용 등의 화학적 상보성에 연관된 규준을 만족시키도록 변형시킬 수 있다.
구조에 기초한 약물 디자인을 위한 본 발명의 다른 실시 태양은 화학물질 그룹들("프로브")와 결합 부위 또는 계면 내의 및 주변에서 시료 위치의 활성 부위와의 상호작용을 결정하여, 선택된 에너지 레벨에서 삼차원 윤곽 표면들이 발생될 수 있는 에네지 값의 정렬을 초래하는 것을 포함한다. 이 방법은 본 명세서에서 "화학 물질-프로브 접근법"으로 언급한다. 본 발명의 화학적 화합물의 디자인에 대한 화학물질-프로브 접근법은 예를 들면, 그의 전문을 본 명세서에 참고로 인용하는 문헌[Goodford, J. Med. Chem., vol. 28, p. 849, 1985]에 기재되어 있으며, 예를 들면 GRID(Molecular Discovery Ltd., Oxford OX2 (9LL, U.K.로부터 입수 가능함)를 포함하는 적절한 소프트웨어 패키쥐를 사용하여 보충한다. 부위-보체화 분자에 대한 화학적 선행요건은 FcγRIIa 단백질의 활성 부위를 예를 들면, (표 1에 나타낸 원자 좌표로 나타낸 바의) 상이한 화학적 프로브, 예컨대 물, 메틸 그룹, 아민 질소, 카르복실 산소 및(또는) 히드록실로 프로브화 함으로써 당초에 동정할 수 있다. 활성 부위 및 프로브의 상호작용을 위한 바람직한 부위를 결정한다. 추정되는 상보성 화학적 화합물은 얻어진 그러한 부위의 삼차원 패턴을 사용하여 생성시킬 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 하나 이상의 본 발명의 치료용 화합물을 포함한다. 치료용 조성물은 Ig-매개 응답들을 감소시키거나 또는 액성 면역 응답을 증가시킬 수 있는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들면, 조직 손상을 감소시키는데 유용한 본 발명의 치료용 화합물은 또한 예를 들면 보체 고정화를 차단, 혈액침출(extravasation), 바이러스 단백질의 FcR에의 결합의 차단, 옵시니제이션을 차단 또는 정상 및 수동 항체 면역성을 증대시킴으로써 염증성 세포의 회복을 차단하는 화합물을 포함할 수 있다. Ig-매개된 염증을 감소시키는데 유용한 본 발명의 치료용 조성물은 염증성 세포의 회복을 차단하거나 및(또는) 신호 전달 경로를 차단하여 염증성 매개자들의 방출을 초래하는 화합물들을 포함할 수 있다.
액성 응답을 감소시키는데 유용한 본 발명의 치료용 조성물은 또한, 이들에 제한되지 않고 사이토카인류, 케모카인류를 포함하는 항원에 대한 항체 생성을 증대시키는 화합물(예, 면역보조제) 및 사이토카인류 및 케모카인류의 생산을 유도하는 화합물(예, 과립구 대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 대식구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 콜로니 자극 인자(CSF), 에리쓰로포이에틴(EPO), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 5 (IL-5), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), 인터류킨 12 (IL-12), 인테페론 감마, 인터페론 감마 유도 인자 I (IGIF), 형질전환 성장 인자 베타, RNATES(활성시 조절되고, 발현 및 추정시 분비되는 정상의 T 세포, regulated upon activation, normal T cell expressed and presumbaly secreted), 대식구 염증성 단백질(예, MIP-1 알파 및 MIP-1 베타), 세균성 성분(예, 내독소류, 특히 수퍼항원류, 외독소류 및 세포 벽 성분들); 알루미늄-기재 염; 칼슘-기재 염; 실리카; 폴리뉴클레오티드류; 독소류; 혈청 단백질류; 바이러스 코트 단백질류; 블록 공중합체 면역보조제류(예, Hunter's Titermax™보조제 (Vaxcel™, Inc. Norcross, GA). 리비 보조제류(Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); 및 사포닌류 및 이들의 유도체(예, Quil A(Superfos Biosector A/S, Denmark)을 포함한다.
본 발명의 치료용 조성물은 그러한 조성물을 목적하는 치료 결과가 얻어지는 방식으로 동물에 투여함으로써 동물에서 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료에 바람직한 동물들은 인간, 애완동물, 식용 동물, 동물원 동물 및 기타 경제적으로 관련있는 동물(예, 경주마 및 친칠라 및 밍크 등의 이들의 외피가 가치있는 동물)과 함께 포유류, 유대류, 파충류, 및 조류를 포함한다. 치료에 더욱 바람직한 동물들은 인간, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 닭, 타조, 에뮤(emus), 칠면조, 코알라 및 캉가류를 포함한다. 보호에 가장 바람직한 동물들은 인간, 개 및 고양이이다.
본 발명의 바람직한 치료 조성물은 또한 부형제, 보조제 및(또는) 담체를 포함한다. 적합한 부형제는 치료받는 동물이 견딜수 있는 화합물들을 포함한다. 그러한 부형제의 예로는 물, 식염수, 링거 용액, 포도당 용액, 한크스액(Hank's solution), 및 기타 수용성의 생리학적으로 균형을 이룬 염 용액들을 포함한다. 고정 유, 참깨유, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드 등의 비수용성 부형제도 또한 사용해도 좋다. 기타 유용한 제형들은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란 등의 점도 증진제를 함유한 현탁제를 포함한다. 부형제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 증대시키는 물질 등의 소량의 첨가제를 함유할 수 있다. 완충액의 예로는 인산염 완충액, 중탄산염 완충액 및 트리스 완충액을 포함하며, 보존제의 예로는 티메로살, o-크레졸, 포르말린 및 벤질 알코올을 포함한다. 표준 제형은 주사용 액제이거나 현탁액 주사용액으로서 적합한 액체 중에 용해될 수 있는 고체 중 어느 하나 일 수 있다. 따라서, 비액체 제형에 있어서, 부형제는 멸균수 또는 식염수를 투여전에 첨가할 수 있는 덱스트로스, 인간 혈청 알부민, 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에 있어서, 치료용 조성물은 담체를 포함할 수 있다. 담체는 치료되는 동물에서 조성물의 반감기를 증가시키는 화합물을 포함할 수 있다. 적합한 담체는, 이들에 한정되지 않고, 중합체성 방출 제어 부형제들, 생분해성 주입물, 리포좀류, 세균, 바이러스, 기타 세포, 오일류, 에스테르류 및 글리콜류를 포함한다.
본 발명의 치료용 조성물을 효율적인 방식으로 투여하는 허용 가능한 프로토컬은 개별 투여량 크기, 투여량의 수, 투여량 투여 빈도 및 투여 모드를 포함한다. 그러한 프로토컬의 결정은 당업자에 의해 성취될 수 있다. 투여 모드는, 이들에 제한되지 않고, 피하, 피부내, 정맥내, 비내, 경구, 경피, 안내 및 근육내 경로들을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 비정상 면역 또는 염증을 가진 환자로부터 얻은 세포 상에서 또는 이들로부터 단리된 변경된 FcR 단백질을 검출할 수 있는 진단용 화합물들이다. 본 명세서에 기재된 구조에 기초한 약물 디자인의 방법을 사용하여, FcR 단백질에 결합하는 진단용 시약을 FcR 단백질의 삼차원 구조를 사용하여 개발할 수 있다. 본 발명의 바람직한 진단용 시약은 Ig에 결합할 수 있는 FcR 단백질의 Ig 결합 부위에 대해 결합 가능한 분자 및 염증을 가진 환자로부터 얻은 순환하는 FcR 단백질에 결합할 수 있는 분자들을 포함한다. 바람직한 진단용 시약들은 면역원이거나 또는 방사성 동위원소, 효소, 염료 또는 비오틴 등의 검출 가능한 화합물에 화학적으로 커플링될 수 있는 분자들을 포함한다.
바람직한 실시 태양에 있어서, 본 발명의 치료용 화합물은 재조합 DNA 방법에 의해 공학적으로 처리된 단백질을 포함한다.
＜표 1＞
＜표 2＞
＜표 3＞
＜표 4＞
＜표 5＞
본 발명은 결정형 FcγRIIa, 결정형 FcεRI, FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표, FcγRIIa의 삼차원 구조, FcεRI 및 FcγRIIIb를 포함하는 FcγRIIa로부터 유도된 Fc 수용체 (FcR)의 삼차원 구조, 및 모델 및 그러한 구조 및 모델들의 용도에 관한 것이다. 그러한 결정들을 얻는 것은 예기치 못한 결과이다. 단백질 결정학 기술 분야에서 단백질의 구조를 결정하기에 충분한 품질의 결정들을 얻는 것은 예측불가능한 것으로 잘 알려져 있다. 특히, FcγRIIa 의 삼차원(3D) 구조를 결정하기에 충분한 품질의 결정들을 얻는 것은 본 출원에 개시된 FcγRIIa의 결정화 전에는 성취할 수 없었다. 그러므로 FcγRIIa 의 삼차원 구조의 결정은 본 발명의 발견 이전까지는 가능하지 않았다. 또, 본 발명의 발견 이전가지, 기타 Fc 수용체 (FcR) 단백질의 삼차원 구조 및 모델의 유도는 가능하지 않았다. 본 발명자들은 또한 처음으로 FcεRI 및 FcγRIIIb에 대한 삼차원 구조를 정의하고 이들에 대한 약물 디자인을 위한 삼차원 모델을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 FcγRIIa의 삼차원 구조의 결정을 고해상도로, 바람직하게는 약 1.8 Å의 해상도를 얻기에 충분한 품질의 결정을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 결정성 FcγRIIa를 생산하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바람직하게는 FcεRI의 삼차원 구조의 결정을 고 해상도로 얻기에 충분한 양의 FcεRI 단백질의 결정을 제공하는데 있다. 본 발명은 또한 결정성 FcεRI를 생산하기 위한 방법을 포함한다.
FcγRIIa 및 FcεRI의 결정의 가치는 단순히 그러한 결정들을 얻을 수 있는 것을 넘어선다. FcγRIIa 결정 구조에 관련하여 얻은 지식은, 예를 들면 본 발명자들에 의해 지금까지 알려지지 않았던 FcγRIIa 단백질의 3차 구조를 정의하고, 지금까지 알려지지 않았던 FcεRIIa 단백질의 3차 구조 및 지금까지 알려지지 않았던 FcγRIIIb 단백질의 3차 구조에 대한 원자 좌표를 모델링하고 유도하는데 사용되었고, 추가로 FcγR 단백질 집단 및 FcαRI 단백질의 다른 원들과 같은 실질적으로 관련된 선형 아미노산 서열을 갖는 기타의 FcR 단백질들의 지금까지 알려지지 않았던 3차 구조를 모델링하는데 사용될 수 있다. FcγR 집단의 단백질에는 3개의 원이 있는데, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII로서 이들 모두는 면역조절성 분자로서 작용하며, 이들 모두는 IgG에 결합한다.
수용체들의 FcγR 집단의 핵산 및 아미노산 서열의 비교는 수용체들이 고도로 상동성임을 나타낸다. 또, 수용체의 FcγR 집단의 각 원은 분자의 Ig 수퍼 집단에 속하며, 이러한 지정은 잘 확립된 기준에 근거한다(Hulett et al. 1994, 상기함). 더욱이, FcγRII, FcγRIII, FcεRI 및 FcαRI 각각은 Ig-유사 도메인은 함유하는데 이는 이들 수용체들 사이의 유사성을 나타낸다. FcγRI은 3개의 Ig-유사 도메인을 함유한다. 그러나, FcγRI의 제1 및 제2 도메인은 FcγRII, FcγRIII, FcεRI 및 FcαRI의 Ig-유사 도메인과 실질적으로 상동성이다. x-선 회절 기술에 의존하지 않고 단백질의 결정화를 요하지 않는 현재의 3차 구조 결정 기술(예, 컴퓨터 모델링 및 핵자기공명 기술)은 FcγRIIa 단백질의 3차원 구조로부터 외삽시켜 다른 FcγR 단백질, FcγRI, 및 FcαRI 단백질의 모델들의 유도 및 개량을 가능케한다. 따라서, FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조의 지식은 모든 이들 단백질의 구조의 연구에 대한 출발점을 제공하였다.
따라서, 본 발명의 두 번째 목적은 FcγRIIa 단백질의 구조 및 모델, FcγR 집단의 단백질의 다른 원들, FcεRI 및 FcαRI 단백질의 원자 좌표 및 유도된 삼차원 구조에 관한 정보를 제공하는 것이다.
FcγRIIa의 삼차원 구조 및 다른 FcR의 모델들에 관한 지식은 인간을 포함한 동물에 있어서 면역 기능 및 염증을 조절하는 화합물을 디자인하고 생산하기 위한 수단(즉, 구조에 기초한 약물 디자인)을 제공한다. 예를 들면, 화학적 화합물들은 다양한 컴퓨터 프로그램 및 모델들을 사용하여 면역글로불린의 Fc 수용체에 대한 결합을 방지하도록 디자인할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양은 FcR의 삼차원 구조의 삼차원 컴퓨터 이미지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 표 1에 나타낸 삼차원 좌표, 표 2에 나타낸 삼차원 좌표, 표 3에 나타낸 삼차원 좌표, 표 4에 나타낸 삼차원 좌표, 및 표 5에 나타낸 삼차원 좌표 (여기서, 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 이 삼차원 좌표들은 전자 화일을 삼차원 이미지로서 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 가시화 될 수 있는 전자 화일을 생성한다)의 군 중에서 선택된 한 세트의 삼차원 좌표로 코드된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 세 번째 목적은 예를 들면 FcR 단백질에 결합하거나 또는 이것의 작용을 모방함으로써, 면역글로불린(Ig)에 결합하거나 또는 이것의 작용을 모방함으로써, 예를 들면, 두 FcR 단백질의 다이머화를 방해함으로써 FcR 단백질을 통한 세포의 신호 전달을 파괴함으로써 또는 예를 들면, 두 FcR 단백질들의 다이머화를 증대시킴으로써 세포 신호 전달을 증대시키거나 또는 FcR에 대해 결합함으로써 질병의 치료 및 진단을 위한 시약을 디자인하는데 FcγRIIa 등의 FcR의 삼차원 구조 및 그러한 구조를 사용하여 유도한 구조들, 좌표 및 모델들을 이용하는 방법을 제공한다.
FcR의 삼차원 구조의 지식은 또한 단백질의 구조 및 개별 아미노산 사이의 상호작용을 분석함으로써 변경된 이로운 기능을 가진 단백질을 디자인하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들면, Ig 또는 Ig의 면역 복합체에 대한 개선된 결합을 갖는 치료용 단백질을 디자인하여 치료제로 사용하여 세포에 대한 면역 복합체의 결합을 방지하거나 FcR의 Ig 또는 그의 면역 복합체로의 결합시 세포의 신호 전달 등의 생물학적 반응을 증대시킬 수 있다. 따라서, 개선점을 포함하도록 공학처리된 재조합 가용성 FcR을 삼차원 구조의 지식을 토대로 생산할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제4의 목적은 FcR의 삼차원 구조를 외삽시켜 변경된 생물학적 활성을 가진 재조합 단백질을 창출하는데 있다.
본 발명의 한 실시태양은 FcR 단백질의 모델이며, 여기서 이 모델은 FcR 단백질의 삼차원 구조를 나타내고, 이 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치한다. 본 발명의 다른 실시태양은 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조; 표 2에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 다이머성 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조; 표 3에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 모노머성 FcεRI 단백질의 삼차원 구조; 표 4에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 다이머성 FcεRI 단백질의 삼차원 구조; 표 5에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 다이머성 FcγRIIIb 단백질의 삼차원 구조 및 그러한 구조들을 나타내는 모델들이다. 본 발명의 추가의 실시태양은 FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표의 세트(여기서, 상기 좌표들은 표 1에 나타냈다); 다이머성 FcγRIIa 단백질의 삼차원 좌표의 세트(여기서, 상기 좌표들은 표 2에 나타냈다); FcεRI 단백질의 삼차원 좌표의 세트(여기서, 상기 좌표들은 표 3에 나타냈다); FcεRI 단백질의 삼차원 좌표의 세트(여기서, 상기 좌표들은 표 4에 나타냈다); 및 FcγRIIIb 단백질의 삼차원 좌표의 세트(여기서, 상기 좌표들은 표 5에 나타냈다)에 관련된다. 본 발명은 또한 구조 기초한 약물 디자인을 포함하는 그러한 구조를 사용하는 방법 및 표적 FcR 구조들의 모델 및 이미지들을 유도하는 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양은 결정형의 FcγRIIa 단백질을 포함하는 조성물에 있다. 본 발명의 더욱 다른 실시태양은 결정형의 FcεRI을 포함하는 조성물에 있다.
본 발명의 더욱 다른 실시태양은 FcγRIIa 단백질을 아세테이트 염 완충액 및 설페이트 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 모액 완충액과 혼합하고 결정 형성을 유도하여 FcγRIIa 결정을 생산하는 것을 포함하는 FcγRIIa의 결정을 생산하는 방법이다.
본 발명은 또한 FcεRI 단백질을 아세테이트 염 완충액 및 소듐 카코딜레이트 완충액, 및 소듐 시트레이트 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 모액 완충액과 혼합하고 결정 형성을 유도하여 FcεRI 결정을 생산하는 것을 포함하는 FcεRI의 결정을 생산하는 방법이다.
본 발명은 또한 FcγRIIa 단백질의 활성을 억제하는 억제용 화합물을 포함하고, 상기 억제용 화합물은 (a) FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 제공하고, (b) 상기 삼차원 구조를 사용하여 FcγRIIa 단백질의 IgG에 대한 결합을 억제하는 화합물, FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 실질적으로 모방하는 화합물 및 FcγRIIa 단백질과 FcγRIIa 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 자극하는 분자와의 결합을 억제하는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물을 디자인하고, (c) 상기 화합물을 화학적으로 합성하고, (d) 상기 합성된 화합물이 IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 능력을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정되는, 동물에 투여되었을 때, IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 치료용 조성물을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 동물에서 IgG 액성 면역 응답을 자극할 수 있는 치료용 조성물이다. 본 발명의 더욱 다른 실시태양은 동물에 투여되어 옵시니제이션 (opsinization) 또는 FcR-의존성 효과기 기능들 (예, 항체-의존성 FcγR-매개 세포독성, 식세포작용 또는 세포성 매개자의 방출)에 의해, 이들에 한정되지 않고, 암 또는 감염성 질환(예, HIV, 포진, 세균 감염, 효모 감염 또는 기생충 감염 등의 경구 감염증)을 포함하는 특정 질병을 치료하는 항체의 치료 영향을 증대시키는 치료용 조성물이다. 그러한 치료 조성물은 IgG에 대한 증가된 결합을 갖고, IgG의 FcγR에의 결합을 증대시키며, FcγR의 다이머 형성을 증대시키고(또는) FcγR을 통한 신호 전달을 증대시키는 하나 이상의 자극성 화합물을 포함한다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 액성 면역 응답을 자극하는 방법이다. 이 방법은 동물에 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 동물에 투여했을 때, IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 FcγRIIIb 단백질 활성을 억제하는 억제용 화합물을 포함하고, 상기 억제용 화합물은 (a) FcγRIIIb 단백질의 삼차원 구조를 제공하고, (b) 상기 삼차원 구조를 사용하여 FcγRIIIb 단백질의 IgG에 대한 결합을 억제하는 화합물, FcγRIIIb 단백질의 삼차원 구조를 실질적으로 모방하는 화합물 및 FcγRIIIb 단백질과 FcγRIIIb 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 자극하는 분자와의 결합을 억제하는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물을 디자인하고, (c) 상기 화합물을 화학적으로 합성하고, (d) 상기 합성된 화합물이 IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 능력을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정된다.
본 발명의 한 실시태양은 IgE-매개된 응답을 줄일 수 있는 치료 조성물이다. 그러한 조성물은 IgE-매개 과민증, 염증성 모듈레이터들의 IgE-매개된 방출, 또는 FcεR 단백질을 수반하는 염증 세포들의 IgE-매개된 회복(recruitment)에 수반되는 기타 생물학적 기작으로부터 기인한 IgE-매개 응답들을 감소시킬 수 있다. 그러한 본 발명의 치료용 조성물은 (1) FcεR 단백질의 IgE 결합 부위를 방해함으로써 FcεR 단백질을 갖는 세포 (즉, 유선 세포) 상의 FcεR 단백질의 IgE 면역 복합체에의 결합을 방해(예컨대, 방지, 차단)할 수 있고, (2) IgE 또는 IgE 면역 복합체의 침전을 억제할 수 있고(예컨대, 두 IgE 사이의 Fc:Fc 상호작용을 방지할 수 있고), (3) IgE의 세포 표면 수용체에의 결합을 방해함으로써 면역글로불린-매개 세포의 신호 전달을 억제할 수 있고, (4) 세포 신호 유도 분자(예컨대, FcεR 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 유도하는 분자)의 FcεR 단백질로의 결합을 방해함으로써 FcεR-매개 세포의 신호 전달을 억제할 수 있다. 그러한 치료 조성물은 IgE의 FcεR 단백질로의, IgE의 IgE로의, IgE의 세포 표면 수용체로의, 또는 세포 신호 유도 분자의 FcεR 단백질로의 결합을 억제하는 하나 이상의 억제용 화합물들을 포함한다. 본 발명에 또한 포함되는 것들은 IgE-매개 염증 등의 IgE-매개 응답을 감소시키는 방법들이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 동물에서 IgE 액성 면역을 자극할 수 있는 치료용 조성물이다. 본 발명의 더욱 다른 실시태양은 동물에 투여되어 옵시니제이션 (opsinization) 또는 FcεR-의존성 효과기 기능들 (예컨대, 식세포작용 또는 세포성 매개자의 방출)에 의해, 특정 질병을 치료하는 항체의 치료 영향을 증대시키는 치료용 조성물이다. 그러한 치료 조성물은 IgG에 대한 증가된 결합을 갖고, IgG의 FcεR에의 결합을 증대시키며, FcεR의 다이머 형성을 증대시키고(또는) 달리 FcεR을 통한 신호 전달을 증대시키는 하나 이상의 자극성 화합물들을 포함한다. 또한 본 발명에 포함되는 것은 액성 면역 응답을 자극하는 방법이다. 이 방법은 동물에 본 발명의 치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다음의 실시예는 설명할 목적으로 제공되었으며 본 발명의 범위를 한정하려고 의도한 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 가용성 FcγRIIa 단백질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스의 작제 및 그러한 단백질의 생산을 기술한다.
바쿨로바이러스 폴리헤드론 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 가용화형의 인간 FcγRIIa (sFcγRIIa)를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 재조합 분자 pFcγRIIa는 다음과 같이 생성시켰다. 핵산 분자 sFcγRIIa은 표준 PCR 법을 사용하여, 핵산 서열 5'-TAC GAA TTC CTA TGG AGA CCC AAA TGT CTC-3'(서열 번호: 1로 나타냄)를 갖는 프라이머 NR1 및 핵산 서열 5'-CAT TCT AGA CTA TTG GAC AGT GAT GGT CAC-3'(서열 번호: 2로 나타냄)을 갖는 프라이머 FI2 약 100 ng을 사용하여 FcγRIIaLRcDNA (Ierino, et al., J. Exp. Med., vol. 178, pp. 1617-1628, 1993에 상세히 기술됨) 약 10 ng으로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭시켰다. 얻어진 PCR 생성물은 510 염기쌍(이하 sFcγRIIa(a)으로서 언급함)이며 서열 번호: 3으로 나타낸 아미노산 서열을 코드한다. 실시예 7에 기재된 질량 분광기 시험에서 얻은 결과들을 기초로 하여, 두 번째 단백질 생성물은 본 실시예의 PCR 생성물을 포함하는 재조합 분자의 발현시 존재한다. 이 데이터는 두 PCR 생성물이 본 방법으로부터 생성되었음을 의미한다. 제2 PCR 생성물은 513 염기쌍을 가지는 것으로 예측되며(이하, sFcγRIIa(b)로서 언급함), 서열 번호: 12에 나타낸 아미노산 서열을 코드한다. 이 PCR 생성물을 제한 효소 EcoRI 및 XbaI으로 분해시키고 pVL1392 바쿨로바이러스 셔틀 플라스미드(Pharmingen, San Diego, CA로부터 입수가능함)의 유일한 EcoRI 및 XbaI 부위들 내로 연결시켜, 이하 pVL-sFcγRIIa(a) 및 pVL-sFcγRIIa(b)로 언급하는 재조합 분자들을 생성시켰다.
이 재조합 분자 pVL-sFcγRIIa(a) 및 pVL-sFcγRIIa(b)을 바쿨로바이러스 균주 AcMNPV(Pharmingen으로부터 입수 가능함)과 함께 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf-21) 세포(Invitrogen Corp., San Diego, CA로부터 입수 가능함) 내에 동시형질감염시켜 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/sFcγRIIa(b) 세포를 생성하였다. 추정되는 재조합 바이러스 단리물들을 무혈청 Sf900-II 배지(Gibco, New York으로부터 입수가능함)을 사용하여 감염용 Sf-21 세포의 모노레이어 상에서 성장시키고 후-감염 약 40 시간에 수학하였다. 이후, PsFcγRIIa로 언급하는 재조합 단백질의 존재는 상층액 중에서 표준 방법을 사용하여 안티-FcγRII 단일 클론 항체 8.26 및 8.7(상기한 Ierino, et al.에 상세히 기재됨)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 실시예 7에 기술된 결과를 기초로 하여, 재조합 단백질 PsFcγRIIa는 서열 번호: 3 및 서열 번호: 12를 갖는 두 종의 단백질을 포함한다.
실시예 2
본 실시예는 단백질의 결정화를 위한 PsFcγRIIa의 정제에 관하여 기술한다.
상기 실시예 1에 기술한 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/sFcγRIIa(b) 로 부터의 상층액을 수확하고 약 x2000 rpm에서 원심분리시켜 세포 파쇄물을 제거하였다. 원심분리로 부터의 상층액을 Minitan™한외 여과 시스템(Millipore, Bedford, MA로부터 입수 가능함)을 사용하여 5배 농축시키고 이어서 10 mM Tris-HCl pH 8.5 및 50 mM NaCl을 함유하는 완충액에 대하여 강하게 투석시켰다. 투석된 용액을 Q-세파로오스, 급속-흐름 이온 교환 칼럼(Pharmacia, Uppsala, Sweden으로부터 입수가능함)에 가하였다. 칼럼을 10 mM Tris-HCl, pH 8.5로 세척하고, 이어서 단백질을 약 0 내지 약 500 mM NaCl 까지의 염 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출시키고, 약 4 시간에 걸쳐 칼럼 상에 통과시켰다. PsFcγRIIa를 대략 150 mM NaCl에서 칼럼으로부터 용출하였다. 부분적으로 정제된 생성물을 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 및 30 mM NaCl을 함유하는 완충액에 대하여 투석하였다. 투석물을 HAGG 면역-친화 크로마토그래피 칼럼(Ierino et al,.에 상세히 기술됨, 상기함)에 가하였다. 칼럼을 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 및 30 mM NaCl을 함유하는 완충액으로 세척하였다. PsFcγRIIa을 0.1 M 소듐 아세테이트 pH 4.0 및 0.5 M NaCl을 함유하는 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출물을 3M Tris pH 8.0을 사용하여 중화시키고 PBS(3.5 M NaH2PO4·2H2O, 16 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl)에 대하여 투석하였다. 투석물을 이어서 마크로 및 나노셉-10 한외 여과 농축 장치(Filtron, Northborough, MA로부터 입수 가능함)를 사용하여 대략 50배 농축시켜키고 PBS(Pharmacia, Uppsala, Sweden으로부터 입수가능함)으로 평형화시킨 G75 Superdex 겔 여과 칼럼 상에 가하였다. 여과된 PsFcγRIIa를 1 mM Tris-HCl pH 7.4에 대하여 투석시키고 마크로 및 나노셉-10 한외여과 농축 장치를 사용하여 단백질 약 6 밀리리터 당 밀리그램(mg/ml)으로 농축시켰다. PsFcγRIIa의 순도는 SDS-PAGE에 의해 농축 단백질을 녹이고 크로세인 스칼렛으로 단백질을 염색시킴으로써 평가하였다.
결과의 겔의 전자 스캔을 도 1에 나타냈는데, 여기서 레인 A는 이온교환 단계에 앞서 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/sFcγRIIa(b) 세포 배양물로부터 수확된 상층액을 포함하고, 레인 B는 친화 칼럼으로부터 용출된 단백질을 포함하고, 레인 C는 겔 여과 크로마토그래피 단계로부터 단리된 단백질을 포함하며 레인 D는 6 mg/ml로 농축시킨 PsFcγRIIa의 시료를 포함하는데 이들을 다음의 결정화 연구에 사용하였다. 분자량 마커는 도면의 왼측에 나타내었다. 결과들은 정제된 PsFcγRIIa가 25,000 달톤의 겉보기 분자량을 갖는 약 90%의 순도이었음을 나타낸다.
실시예 3
본 실시예는 정제된 PsFcγRIIa의 2차원 비평형 pH 겔 전기영동 분석을 기술한다.
에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/sFcγRIIa(b) 세포로 부터의 상층액을 안티-FcγRII 단일클론 항체 9.26(IgG2b)의 F(ab') 단편(그의 생성은 J. Immunol., vol. 150, pp. 1-10, 1993에 상세히 기재되어 있음)로 콘쥬게이트된 약 20 마이크로리터 (㎕)의 패킹된 세파로오스 4B 비이드로 4℃에서 약 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 비이드들을 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 2% wt/vol 소 혈청 알부민(Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne, Australia로부터 입수가능함), 1 mM PMSF(Sigma Chemicl Co., St. Louis, MO로부터 입수가능함), 0.1% vol/vol 아프로티닌(Sigma Chemical Co.로부터 입수가능함)을 포함하는 완충액에 이어서 10 mM Tris-HCl pH 7.4로 세척하였다. 비이드들을 약 50 ml 등전점 포커싱 변성 완충액(9.5 M 우레아, 4% 아크릴아미드, 2% wt/vol NP-40, 2% 전체 암포린 및 50 mM 디티오트레이톨) 중에 재현탁시키고, 약 x13,000 rpm으로 약 2 분 동안 원심분리시키고, 4% 튜브 겔 상에 부하하고 오버레이 완충액(9M 우레아, 1% 전체 암포린) 및 음극 완충액( 0.01 M 인산)으로 오버레이시키고, 약 550 볼트에서 약 5 시간 동안 전기영동시켰다. 이어서 겔들을 유리 튜브로부터 제거하고 SDS-PAGE 시료 완충액(62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 50 mM 디티오트레이톨 및 10% 글리세롤) 중에서 실온에서 약 2 시간 동안 평형화시키고 SDS-PAGE 용 13% 슬랩 겔의 상부에 부착시켰다.
전기영동된 단백질들은 반-건조 전이 셀(Millipore로부터 입수 가능함)을 사용하여 Immobilon-P PVDF 멤브레인(Biorad, Australia)으로 20 mA 전류하에 약 30 분 동안 전이시켰다. 이 막을 5% wt/vol 탈지유를 함유하는 PBS 중에 약 1 시간 동안 차단시켰다. 이이어서 막을 토끼 항-FcγRII 폴리클로날 항혈청(5% wt/vol 탈지유를 함유하는 PBS 중에 1:10,000 희석함)로 밤새 인큐베이션시키고 이어서 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20)으로 세척하였다. 폴리클로날 항혈청을 재조합 FcγRII 단백질을 사용한 면역화에 의해 토끼에서 길렀다. 동물들을 FcγRII 단백질 약 1 mg으로 면역화시켰다. 제 1 면역화를 위해, FcγRII 단백질을 완전 프로이드 보조제(complete Freunds adjuvant)중에 에멀젼화하였다. 후속 면역화는 완전 프로이드 보조액 중에 에멀젼화된 FcγRII 단백질을 사용하여 수행하였다. 이어서 막을 퍼록시다아제-결합된 돼지 항-토끼 항혈청(Dako Corp., Denmark로부터 입수 가능함)(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 중에 1:5000 희석됨)으로 실온에서 약 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 막들을 증강된 화학발광 시스템(Amersham International, Australia로 입수 가능함)을 사용하여 전이된 단백질의 검출에 앞서 세척하였다.
결과의 겔들의 전자 스캔을 표 2A 및 2B에 나타냈다. 도 2A는 34 시간 후의 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/sFcγRIIa(b) 세포 배양물로부터의 상층액으로부터 단리된 단백질의 이동을 나타낸다. 도 2B는 73 시간 후의 에스. 프루기페르다:pVL-sFcγRIIa(a)/sFcγRIIa(b) 세포 배양물로부터의 상층액으로부터 단리된 단백질의 이동을 나타낸다. 분자량 마커는 도면의 왼측에 나타냈다. 결과들은 정제된 PsFcγRIIa가 25,000 달톤이 겉보기 분자량 및 약 pH 6에서 pH를 가짐을 나타낸다.
실시예 4
본 실시예는 PsFcγRIIa의 N-말단 펩티드 서열을 기술한다.
어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 470A 가스상 서열결정 장치를 사용한 표준 순차 에드만 분해법을 사용한 실시예 2에 기재된 정제된 PsFcγRIIa의 아미노산 서열을 처음의 8개의 아미노산의 자동 온라인 분석을 위해 어플라이드 바이오시스템 130 분리 시스템(Applied Biosystems, CA로 부터 입수 가능함)에 커플링시켰다. n-말단 서열은 Ala-Pro-Pro-Lys-Ala-Val-Leu-Lys (서열 번호: 4로 표시함) 인 것으로 결정되었다.
실시예 5
본 실시예는 PsFcγRIIa의 모노머성 면역글로불린에의 결합을 기술한다.
PsFcγRIIa 및 모노머성 면역글로불린 사이의 상호작용의 분석은 약 22℃에서 Hepes 완충된 염수(HBS; 10 mM Hepes[Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Australia로부터 입수 가능한 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산], pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA 및 0.005% 계면 활성제, Pharmacia로부터 입수 가능함) 중에서 BIAcorea2000 바이오센서(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden으로부터 입수 가능함)을 사용하여 수행하였다. 모노머성 인간 면역글로불린 서브클라스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgE의 약 4000 내지 약 6000 응답 단위들(각각 50㎕/ml)을 공유적으로 커플링시켜 아민 커플링 킷트(BIAcore로부터 입수 가능함)을 사용하여 제조원의 지시에 따라 각각의 CM5 센서-칩(BIAcore, Uppsala, Sweden으로부터 입수 가능함)의 카르복시메틸화된 덱스트란 표면을 분리하였다. 일련의 PsFcγRIIa 농도 (약 0.001 내지 약 1 mg/ml 단백질)을 약 1 분 동안 약 20 ㎕/분에 이어서 약 3 분 해리상으로 각 센서-칩 상에 주입시켰따. 단백질의 투여후, 면역글로불린 표면을 50 mM 디에틸아민 pH 11.5 및 1 M NaCl을 함유하는 완충액을 사용하여 각각의 칩 상에 재생시켰다. PsFcγRIIa 및 면역글로불린 사이의 상호작용을 위한 평형 해리 상수 (KD)는 단일 부위 결합 방정식 [결합 RU=(B1max.C)/(KD1+C)]; 또는 두 부위 결합 방정식 [결합 RU= ((B1max.C)/(KD1+C)) + ((B2max.C)/(KD2+C))], 여기서 (B1max는 부위 1에서 표면의 최대 결합 능력을 의미하고, B2max는 부위 2에서 표면의 최대 결합 능력을 의미하고, C는 PsFcγRIIa의 농도를 의미한다)의 비선형 곡선 핏팅(fitting)에 의해 및 스캐챠드 플롯(Scatchard plots)에 핏팅시킨 선형 곡선에 의해 얻었다. IgE 채널로부터 얻은 데이터 포인트들은 감하여 반사 지수 차이에 대하여 보정하였다. 50 및 60초 사이의 데이터 포인트들을 평균화하여 각 PsFcγRIIa 농도에 대한 평형에서 결합된 PsFcγRIIa의 양을 얻었다.
PsFcγRIIa 및 고정화된 면역글로불린 사이의 상호작용의 특이성을 결정하기 위하여, PsFcγRIIa와 모노머성 면역글로불린 사이의 상호작용은 과량의 모노머성 IgG(Sandaglobulin, Sandoz, Basel, Switzerland로부터 입수 가능함)의 존재에 의해 억제시켰다. 고정된, 반 최대 투여량의 PsFcγRIIa (50 ㎍/ml)을 사용하여, 증가된 농도의 모노머성 IgG(0 내지 2 mg/ml IgG)를, IgG1으로 코딩된 센서-칩 상에 PsFcγRIIa을 통과시키기 전에 약 22℃에서 약 1 시간 동안 PsFcγRIIa와 혼합시켰다.
결과들은 IgG3 및 IgG1에 대한 PsFcγRIIa의 결합이 넓은 범위의 단백질 농도에 걸쳐서 포화가능함을 나타냈다. 단백질 농도 당 최대 반응 단위들은 단백질의 몰 농도에 대하여 플롯팅하고 곡선 핏팅(fitting) 분석을 수행하였다. 최상의 핏트의 곡선은 IgG3과 상호작용하는 PsFcγRIIa의 두 영역이 있음을 제시한다. 부위들의 50%에서, IgG3에 대한 친화도는 약 2.7 x 106M-1이었고, 나머지 50%의 부위에서 친화도는 1.2 x 104M-1이었다(도 3A). PsFcγRIIa 및 IgG1 사이의 상호 작용은 또한 두 영역에서 일어났지만 상호작용은 IgG3와는 달랐다. 더욱이, 리간드 결합 부위의 90%에서, IgG1에 대한 PsFcγRIIa 의 친화도는 약 2.1 x 106M-1이었고 나머지 10%의 부위에서 친화도는 약 2.3 x 104M-1이었다(도 3B). 이 상호작용은 6배 몰 과량의 IgG가 IgG에 대한 PsFcγRIIa의 결합을 완전히 방해하였으므로 PsFcγRIIa에 대해 특이적이었다. IgG2 결합의 분석을 또한 수행하였으며 약 8 x 10-5M-1의 Kd 값을 얻었다(도 3C).
실시예 6
본 실험은 PsFcγRIIa의 결정화 및 X-선 회절에 관하여 기술한다.
A. 결정성 PsFcγRIIa의 생산
일련의 별도의 완충액들을 사용하여 현수 적하 증기 확산에 의해 PsFcγRIIa의 결정들을 생성하려고 시도하였다. 표 6은 사용된 상이한 모액 제형 및 얻은 결과를 나타낸다.
＜표 6＞
모액 조건 및 3 mg/ml PsFcγRIIa 결정화 시험의 결과
번호 염 완충액 침 전a pH 결 과
1 0.2M 염화칼슘 0.1M 아세테이트 30% MPD 4.6 맑은 방울
2 - - 0.4M Na K 타르트레이트 - 양호한 침전
3 - - 0.4M 암모늄포스페이트 - 맑은 방울
4 - 0.1M Tris 2.0M 암모늄 설페이트 8.5 맑은 방울
5 0.2M 소듐 시트레이트 0.1M Hepes 40% MPD 7.5 상분리
6 0.2M MgCl 0.1M Tris 30% PEG 4000 8.5 건조됨
7 - 0.1M 카코딜레이트 1.4M 소듐 아세테이트 6.5 맑은 방울
8 0.2M 소듐 시트레이트 0.1M 카코딜레이트 30% 이소프로판올 6.5 맑은 방울
9b 0.2M 암모늄 아세테이트 0.1M 소듐 시트레이트 30% PEG 4000 5.6 상분리 및 결정
10 0.2M 암모늄 아세테이트 0.1M 아세테이트 30% PEG 4000 4.6 맑은 방울
11 - 0.1M 시트레이트 1.0M 암모늄 포스페이트 5.6 맑은 방울
12 0.2 M MgCl 0.1M Hepes 30% 이소프로판올 7.5 맑은 방울
13 0.2 M 소듐 시트레이트 0.1M Tris 30% PEG 4000 8.5 상 분리
14 0.2 M 염화칼슘 0.1M Hepes 28% PEG 4000 7.5 침전
15 0.2M 암모늄 설페이트 0.1M 카코딜레이트 30% PEG 8000 6.5 침전
16c - 0.1M Hepes 1.5 M 리튬 설페이트 7.5 조각
17 0.2M 리튬 설페이트 0.1M Hepes 30% PEG 4000 7.5 상분리
18 0.2M Mg 아세테이트 0.1M 카코딜레이트 20% PEG 8000 6.5 맑은 방울
19 0.2M 암모늄 아세테이트 0.1M Tris 30% 이소프로판올 8.5 맑은 방울
20 0.2M 암모늄 설페이트 0.1M 아세테이트 25% PEG 4000 4.6 심한 침전
21 0.2M Mg 아세테이트 0.1M 카코딜레이트 30% MPD 6.5 양호한 침전
22 0.2M 소듐 아세테이트 0.1M Tris 30% PEG 4000 8.5 양호한 침전
23 0.2M MgCl 0.1M Hepes 30% PEG 400 7.5 스킨 오버 드롭
24 0.2M 염화칼슘 0.1M 아세테이트 20% 이소프로판올 4.6 맑은 방울
25d - 0.1M 이미다졸 0.1M 소듐 아세테이트 7.5 결정
26 0.2M 암모늄 아세테이트 0.1M 시트레이트 30% MPD 5.6 맑은 방울
27 0.2M 소듐 시트레이트 0.1M Hepes 20% 이소프로판올 7.5 맑은 방울
28 0.2M 소듐 아세테이트 0.1M 카코딜레이트 30% PEG 8000 6.5 맑은 방울
번호 염 완충액 침 전a pH 결 과
29 - 0.1M Hepes 0.8M Na K 타르트레이트 7.5 맑은 방울
30 0.2M 암모늄 설페이트 - 30% PEG 8000 - 침전
31 0.2M 암모늄 설페이트 - 30% PEG 4000 - 침전
32 - - 2.0M 암모늄 설페이트 - 맑은 방울
33 - - 4.0M 소듐 포르메이트 - 침전
34 - 0.1M 아세테이트 2.0M 소듐 포르메이트 4.6 침전
35 - 0.1M Hepes 2.0M Na K 포스페이트 7.5 침전
36 - 0.1M Tris 8% PEG 8000 8.5 침전
37 - 0.1M 아세테이트 8% PEG 4000 4.6 응집
38 - 0.1M Hepes 1.4M Na 시트레이트 7.5 심한 침전
39 - 0.1M Hepes 2.0M 암모늄 설페이트 2%PEG 400 7.5 양호한 침전
40 - 0.1M 시트레이트 20% PEG 4000, 20% 이소프로판올 5.6 양호한 응집
41 - 0.1M Hepes 20% PEG 4000, 10% 이소프로판올 7.5 맑은 방울
42 0.05M K 포스페이트 - 20% PEG 8000 - 맑은 방울
43 - - 30% PEG 1500 - 맑은 방울
44 - - 0.2M Mg 포르메이트 - 맑은 방울
45 0.2M Zn 아세테이트 0.1M 카코딜레이트 18% PEG 8000 6.5 심한 침전
46 0.2M Ca 아세테이트 0.1M 카코딜레이트 18% PEG 8000 6.5 양호한 침전
47 - 0.1M 아세테이트 2.0M 암모늄 설페이트 4.6 심한 침전
48 - 0.1M Tris 2.0M 암모늄 설페이트 8.5 양호한 침전
49 1.0M Li 설페이트 - 2% PEG 8000 - 중간 침전
50 1.0M Li 설페이트 - 15% PEG 8000 - 심한 침전
a. 열거된 결과를 얻는데 사용된 침전물의 최종 농도
b. 조건 9는 단일 방울의 두 결정을 생성했다.
c. 조건 16은 방울내의 수많은 핵형성점으로부터 야기된 많은 조각들을 생성했다.
d. 조건 25는 드문 결정들을 생성하였다. 수많은 결정형 판들이 함께 결합되어 이 결정을 형성한 것으로 보인다. 이 결정의 X-선 회절 분석은 성공하지 못했다.
신속한 스크리닝 방법(일반적으로 McPherson, 1982, In: Preparation and Analysis of Protein Crystals, 1982, pp. 94-97, John Wiley and Sons, pub.; and J. Crystal Growth, vol. 122, pp. 161-167, 1992에 기술됨)를 사용하였다. 간단하게 설명하자면, 현수 적하 증기 확산 실험을 24-웰 배양 플레이트를 사용하여 수행하였다. 동일한 모액 부피 중의 PsFcγRIIa 약 3 mg/ml을 함유하는 방울들(약 3 ㎕)을 24-웰 조직 배양 플레이트 웰 중에 도립시킨 실리콘화 커버 슬립으로부터 현탁시켰다. 방울들을 약 22 ℃에서 약 1 ml 모액에 대하여 평형화시켰다. 제어된 온도 인큐베이션을 약 22 ℃에서 챔버(Linbro Inc, ICN Inc.에 의해 분배됨, Costa Mesa CA로부터 입수가능함) 중에서 수행하였다. 성공적인 PsFcγRIIa 결정화를 0.2 M 암모늄 아세테이트, 0.1 M 시트레이트 pH 5.6 및 30% PEG 4000을 포함하는 모액을 사용하여 22 ℃에서, PsFcγRIIa의 순도 및 농도에 따라서 약 3 내지 약 9일 사이 또는 약 9 개월까지 수행하여 사방정계의 결정들의 생산을 초래하였다.
성공적인 PsFcγRIIa 결정화는 또한 0.1 M HEPES pH 7.5, 1.5 M 리튬 설페이트를 포함하는 모액을 사용하여 22 ℃에서, PsFcγRIIa의 순도 및 농도에 따라서 약 3 내지 약 9일 사이 또는 약 9 개월까지 수행하여 규정된 구조의 일련의 막대상 조각들의 생산을 초래하였다. 막대상 조각들은 X-선 회절에 의해 분석하였다.
B. 결정성 PsFcγRIIa의 X-선 회절 및 전자 밀도 지도의 결정
상기 A 부에 기술된 바와 같이 생성된 PsFcγRIIa 결정들을 레이욘 루프 상에 집적시키고 20% 글리세롤을 함유하는 모액 중에서 -165℃까지 저온 냉각시켰다. 넓은 범위의 활성들을 샘플링한 12개의 중원자(heavy atom) 화합물들을 PsFcγRIIa에 대한 결합에 대해 시험하였다. PIP(디-μ-요오도 비스[에틸렌디아민]디 플라티넘(II) 니트레이트)가 반응성인 것으로 밝혀졌다. 결정들은 약 5 mM PIP를 함유하는 모액 중에서 밤새 담금으로써 유도체화시켰다. 회절 측정은 약 40 KV 및 약 50 mA에서 작동하고 Ni 여과된 CuKγ 방사를 이용하는 M18XHF 회전 음극 발생기(Siemens, Germany)로 수행하였다. 이 발생기는 프랭크(Frank) 거울(Molecular Structure Corporation, USA), 저-온 시스템((Molecular Structure Corporation, USA), RAXIS IIC 및 IV 화상 플레이트 검출기(Rigaku, Japan)을 구비하였다.
결정들은 공간그룹 P21212 (a = 78.80 Å, b = 100.55 Å, c = 27.85 Å)에 속하였으며 0.065의 R(합병)을 갖는 약 2.4 Å 해상력으로 회절되었다. R(합병) = S(Ii-(IS))/Ii는 모든 독립 반사들을 합한 것이며 여기서, I는 강도이다. 천연 및 유도체 데이터를 약 1。의 진동 범위로 45분의 노출에서 수집하였다. 회절 강도들은 DENZO(Otwinowski, et al., Methods in Enzymoogy, vol. 276, P. 307, 1996)을 사용하여 통합시키고 SCALEPACK (Otwinowski et al., 상기함)으로 쟀다. 단일의 중원자 결합 부위는 동형 및 변칙적인 차이점 패터슨 맵(Blundell, et al., In: Protein Crystallography., Horecker, B., Kaplan, N. O., Marmur, J., Scheraga, H. A., Eds., Academic Press, New York 1976)의 검색에 의해 찾아내고, PROTEIN 시스템(Steigeman, Ph. D. Thesis, Technical University, Munich, 1974)으로 계산하였다. 중원자 변수들을 개량하고 상들을 프로그램 SHARP (Statistical Heavy-Atom Refinement and Phasing)(de La Fortelle, et al., Methods in Enzymolgy, vol. 276, p. 472, 1996)을 사용하여 변칙적인 스캐터링을 사용한 단일 동형 치환의 방법(a method of Single Isomorphous Replacement with Anomalous Scattering)으로 결정하였다. 약 18 내지 약 2.7 Å 해상도의 범위로 병합된 데이터는 약 0.162의 동형 R-인자, 중심 반사 0.308 및 비중심 반사 0.247의 값의 형태(figure) 및 중심 반사에 대한 1.127 및 비중심 반사에 대한 1.081에 대한 페이싱 파워(phasing power)를 가졌다(Blundell, 상기함). 상들을 용매 평평화(solvent flattening)의 프로토컬(Wang, Methods in Enzymology, vol. 115, p. 90, 1985) 및 막대그래피 맵핑(histographic mapping)(Zhang, et al., Acta Crystallography, vol. A46, p. 377, 1990)에서, 밀도 변형 패키지 DM (Cowtan, Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein Crystallography, vol. 31, p. 34, 1994), 프로그램의 CCP4 스위트(suite)(Cowtan, 상기함)에서 변형시켰다. 2Fo-Fc 전자-밀도 지도들은 그래픽 디스플레이 프로그램 O(Jones et al., Acta Crystallography, vol. A47, p. 110, 1991)을 사용하여 나타내었다. 2차 구조적 특징은 이 단계에서 동정될 수 있었으나, 이 지도를 완전히 해석하고 단백질을 추적하기는 어려웠다. 전자 밀도를 단순하게 표시하기 위하여, 이 지도를 프로그램 BONES (Jones, et al., 상기함)을 사용하여 골격화했다(Greer, J. Mol. Biol., vol. 82, p. 279, 1974). 킬러 억제제 수용체의 좌표(Fan, et al., Nature, vol. 389, p. 96, 1997)의 좌표들을 폴리펩티드를 추적하기 위한 표준으로 사용하여 부분적 모델을 발생시켰다. 후속 지도 밀도를 계산하기 위해 변형된 상들 및 모델로부터 계산된 상들을 Free-Sim 방법(Sim, Acta Crystallography, vol. 13, p. 511, 1960)에 의해 합하였다.
구조 개량을 위한 추가의 데이터들을 브룩헤이븐 내셔널 라보라토리 (Brookhaven National Laboratory, Uptown, New York)의 내셔널 신크로트론 라이트 소스(National Synchrotron Light Source)의 비임 라인 X4A에서 수집하였다. 약 1.058 Å의 파장의 조사를 이용하여, 데이터를 약 100 초의 노출 및 약 1。의 진동으로서 후지(Fuji) 이미지 플레이트 상에 합하였다. 회절 이미지들을 BAS 2000 스캐너(Fuji, Japan)으로 디지털화하고 상기한 바와 같이 가공하여 약 10 Å 및 약 1.7 Å 해상도 사이의 0.038의 R(병합)을 얻었다. 구조 개량(refinement)은 벌크 용매 보정과 함께 개별 온도 인자, 에너지 최소화 및 느린-냉각 시뮬레이션한 어닐링 개량을 포함한 프로토컬들을 사용하여 XPLOR 시스템(Brunger, et al., Science, vol. 235, p. 458, 1987)으로 수행하였다.
PsFcγRIIa의 개량된 구조는 33 용매 분자와 함께 1 내지 170까지의 모든 아미노산 잔기들을 포함하였다. 결정학적 잔류 R-인자 및 유리 R-인자들은 약 7 Å 및 약 2.0 Å 해상도 까지의 데이터에 대하여 각각 약 0.253 및 약 0.326이었다(Brunger, 1987, 상기함). 결합 길이에 대한 이상성(ideality)으로 부터의 제곱근 평균 편차는 각에 대하여 약 0.01Å 및 약 1.45 Å이었다. 얻어진 PsFcγRIIa에 대한 원자 좌표의 데이터 세트는 도 4에 나타낸다.
C. PsFcγRIIa 구조
표 1에 열거한 원자 좌표들을 사용하여, PsFcγRIIa의 다이머의 구조를 유도하였다. 이 구조들은 MOLSCRIPT 2.0 프로그램(Avatar Software AB, Heleneborgsgatan 21C, SE-11731 Stockholm, Sweden으로부터 입수 가능함)을 사용하여 컴퓨터 생성시켰다. 이 결정 구조는 두 개의 170 아미노산 모노머들을 갖는 다이머의 형태의 PsFcγRIIa을 나타낸다. 두 모노머들은 구조적으로 동일하다.
PsFcγRIIa 잔기 1 내지 170의 구조는 두 면역글로불린 불변 영역 2 (C2) 타입 면역글로불린 도메인들로 이루어져 있으며 각각의 도메인은 이황화 결합에 의해 함께 고정된 두 개의 역평행(antiparallel) b-시이트로 이루어져 있다. 각 도메인의 첫 번째 가닥(A 가닥)은 중간에서 절단되며, 시이트 I을 형성하는 부분(ABE 가닥) 및 시이트 II를 형성하는 부분(A'GFCC' 가닥)을 갖는다. 이 구조적 특징은 면역글로불린 가변 영역(V) 타입 도메인 및 천연 킬러 억제제 수용체(KIR)에서도 발생하지만 다른 C2 도메인에서는 일어나지 않는다. PsFcγRIIa의 두 면역글로불린-유사 영역들은 서로 아주 유사하며 68 잔기들에 대해 1.28Å의 Ca 위치에서의 rms 차이를 갖는다. 주된 차이들은 각 분자의 N-말단에서의 루우프(BC, C'E 및 FG 루우프) 및 C' 가닥 상의 위치에 있다. 이들 루우프중 일부는 Fc 결합에 수반되었다.
PsFcγRIIa 구조에서 두 도메인의 결합의 영역은 심하게 굽어져 있으며 도메인들의 주된 축 사이의 각은 대략 52。이다. 이 굽어짐은 KIR에 대한 60。를 포함하는 다른 면역글로불린 수퍼집단 원들보다 더 심하다. 도메인 경계면은 도메인 1로 부터의 가닥 A' 및 도메인 2로 부터의 A ＆ B로 구성되며, 여기서 각 도메인의 시이트 II가 계면을 형성한다. 비수소 원자인 잔기들은 다른 도메인의 4。 이내에 위치한다. 물 분자 201, 211, 217-220, 227 및 232는 또한 경계면 영역에도 존재한다.
특정 구조적 특징들은 결정 중의 두 PsFcγRIIa 분자 사이의 다이머 형성은 바람직한 상호작용임을 의미한다. 결정의 단 하나의 PsFcγRIIa 분자(잔기 1 내지 170)의 구조는 결정되었지만, 결정 중의 다이머를 포함하는 각각의 PsFcγRIIa 분자는 2배 결정학적 축에 의해 결정 중의 다른 PsFcγRIIa 분자에 관련된다. 변환:
(-1 0 0 ) (x) ( 0. )
(0 -1 0 ) . (y) + ( 100.55 )
(0 0 1 ) (z) ( 0. )
을 표 1에 주어진 좌표에 적용함으로써, 각각 PsFcγRIIa 분자로 부터의 시이트 II로 구성된 계면을 갖는 다이머가 형성된다(도 4). FcγRIIa 다이머의 좌표는 표 2에 나타낸다. 접촉 영역은 실재적이며(∼400 Å2)이며 이 경계면은 도메인 1-도메인 2 경계면 보다 더욱 소수성 특징을 갖는다. 비수소 원자가 다른 분자의 4。 이내 또는 축상의 물분자 207에 위치하는 잔기들은 119, 121, 124-126, 150, 152 및 158-161이며, 잔기 148, 163 및 164는 또한 밀접히 접근해있다. 이 타입의 도메인 상호작용은 면역글로불린에 대해 새로운 것은 아닌데 항체 쌍의 V 영역이 비슷한 방식으로 쌍을 이루기 때문이다. 그러나 이 타입의 상호작용은 C2 도메인에서는 관찰되지 않고 있다. 이 접촉의 크기 및 특징으로 인해 지금까지 알려지지 않았던 상호작용이 생리학적인 관련성을 갖는 것이 제시되었다.
추가의 구조적 고찰은 이 결론을 지지한다. 상기한 결정 구조는, FcγRIIa 분자가 이 수용체를 함유하는 세포 막을 향하여 C-말단과 함께 방향이 지워졌다면, 수용체의 추정적인 Fc 결합 영역은 세포로부터 탈선하지 않고 한 측을 향한다. 따라서, 세포 막에서 두 FcγRIIa 분자 사이의 다이머를 형성하면, 두 잠재적인 Fc 결합 영역은 서로 인접되게 데려오게 되어 세포로부터 벗어나게 되는데 다이머 축이 세포로부터 벗어나기 때문이다. 이 배향은 이상적으로 리간드(즉, IgG)와의 상호작용을 위해 잠재적인 Fc 결합 부위들을 위치시키며 리간드 결합 부위가 두 수용체 분자로부터의 영역으로 구성되게 한다. 결합 이벤트에의 두 수용체 분자의 수반은 세포의 신호 전달에 관련을 가지고 있는데 세포외 도메인의 다이머화는 두 수용체의 세포질 도메인을 가깝게 하여 세포의 신호 전달 응답을 하게 할 것이기 때문이다.
도 4는 PsFcγRIIa의 다이머의 그래프 표시를 나타낸다. 두 Ig-유사 도메인 (도메인 1 및 2)은 각 다이머의 각 모노머로 나타낸다. 단백질의 아미노(NH2) 말단의 처음의 아미노산 잔기는 잔기 번호 0으로 나타냈다. 단백질의 카르복실(COOH) 말단의 마지막 아미노산 잔기는 잔기 170으로 나타냈다. NH2말단으로부터 COOH 말단까지의 아미노산 잔기의 번호 매김은 가능한한 나타냈다. 특정 잔기들은 명확성이 부족하였다. 도 5는 PsFcγRIIa의 도메인 1 및 도메인 2의 각각의 베타 시이트를 포함하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 도메인 1에서, 가닥 A는 잔기 5-10을 포함하며, 가닥 A'는 잔기 14-17을 포함하며, 가닥 B는 잔기 20-28을 포함하며, 가닥 C는 잔기 37-41을 포함하며, 가닥 C'는 잔기 44-46을 포함하며, 가닥 E는 잔기 52-58을 포함하며, 가닥 F는 잔기 63-70을 포함하며, 가닥 G는 잔기 78-84를 포함한다. 도메인 2에서, 가닥 A는 잔기 87-22을 포함하며, 가닥 A'는 잔기 95-97을 포함하며, 가닥 B는 잔기 102-110을 포함하며, 가닥 C는 잔기 117-122을 포함하며, 가닥 C'는 잔기 125-131을 포함하며, 가닥 E는 잔기 134-139를 포함하며, 가닥 G는 잔기 158-162를 포함하며, 가닥 F는 잔기 145-155를 포함하며, 가닥 G'는 잔기 163-169를 포함한다. 도 6은 도 4에 나타낸 폴리펩티드의 구조의 입체도를 입체적으로 나타낸다.
도 4에 나타낸 삼차원 구조의 그래프에 의한 표시를 사용하여 FcγRIIa의 IgG에 대한 결합에 수반되는 아미노산 잔기들의 위치를 결정하였다. 도 7은 FcγRIIa의 IgG에 대한 결합의 손실에 수반되는 돌연변이된 알라닌의 위치(검은 공으로 나타냄)을 나타낸다. 도 7에 나타낸 잔기들은 FcγRIIa의 재조합 돌연변이체를 사용하여 동정하였으며, 여기서 잔기들은 알라닌으로 대체되었으며 IgG의 FcγRIIa에 대한 결합을 파괴하거나 감소시키는 것으로 나타났다(Hulett, et al., 1994, 상기함; Hulett, et al., 1995 상기함). 도 8은 IgG에 대한 감소된 결합을 갖는 FcγRIIa을 코드하는 이 영역에 있어서 돌연변이를 갖는 핵산 분자의 생성에 의해 나타낸 바와 같이, IgG의 FcγRIIa에 대한 결합에 수반되는 아미노산의 위치 및 측쇄를 나타내는 IgG 결합 영역의 확대도이다.
도 9는 IgG 결합 영역 및 아미노산 잔기의 확대도로서, 알라닌으로 돌연변이 되었을 때, IgG 결합을 증대시킨다.
도 4에 나타낸 삼차원 구조의 그래프에 의한 표시로 설명된 두 다이머들 사이의 경계면을 더욱 분석하였다. 도 10은 다이머 경계면에 기여하는 한 FcγRIIa 모노머의 영역의 확대도이다. 도 10에 있어서, 이 영역은 x에 있어서 약 90°회전시켰으며, 여기서 x는 페이지에 대해 수평이다. 경계면에 기여하는 아미노산 잔기의 γ탄소는 검은 공으로서 나타내며 서열 번호: 3의 잔기 번호 매김에 따라 번호를 매겼다.
실시예 7
본 실시예는 전자분무 이온화 질량 분광계에 의한 PsFcγRIIa 단백질의 N-말단 서열의 분석에 관하여 기재한다.
PsFcγRIIa 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 결정하기 위해, N-연결된 글리코실화 질량 분광기의 이종성을 다음과 같이 수행하였다. 다양한 시료들은 FcγRIIa 단백질 약 1 내지 100 피코몰(pmol)을 0.1% 아세트산을 함유하는 50% CH3CN 약 2 ㎕ 내지 약4 ㎕에 합하여 제조하였다. 시료들을 약 0.2 ㎕/분의 유속으로 마이크로-이온분무 원을 설치하고 Q1 스캔 모드에서 작동하는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) Sciex API-300 삼중 사중극 질량 분광기 내로 주입하였다. 질량 스케일을 단일 하전된 폴리(프로필렌 글리콜) 이온들을 사용하여 ±0.01%에 상당하는 정확도까지 8 점에서 3000 u 질량 범위에 걸쳐서 보정하였다. 질량 스펙트럼(대표적으로 30-100 스캔)은 0.6 u의 일정 피이크 폭(절반 높이에서 피이크 폭)으로 질량 랜드(rand) m/z 200 내지 3000 u 에 걸쳐서 기록하고, PE-Sciex Biomultiview 소프트웨어를 사용하여 신호-평균화, 수동 질량 결정 및 변환에 의해 가공하였다. 결과는 상이한 N-말단 서열을 갖는 단백질의 두 주된 종들이 정제된 PsFcγRIIa 단백질의 용액 중에 존재함을 나타냈다. 한 종은 서열 번호; 4를 포함하는 N-말단 서열을 가졌고 다른 종은 단백질의 5' 말단에 추가의 알라닌을 갖는 N-말단 서열(예컨대, Ala-Ala-Pro-)을 가졌다.
실시예 8
본 실시예는 모노머형 및 다이머형 모두에 있어서 Fcε 수용체 I (FcεRI )의 삼차원 구조의 모델링을 기재한다.
인간 Fc 엡실론 수용체 타입 I(FcεRI ) 및 인간 Fc 감마 수용체 타입 II a (FcγRIIa)의 세포외 영역은 약 38% 서열 동일성(172 잔기에 대하여)을 보인다. 이 모델링 작업에서 사용된 최종 서열 정렬은 도 13에 나타낸다. 인간 FcγRIIa의 X-선 결정학적인 구조는 본 발명자들에 의해 결정되었다(표 1). 표 1의 FcγRIIa의 삼차원 좌표는 His 108의 이미다졸 고리의 배향 및 일회의 개량에 의해 인간 FcεRI 의 3-차원 모델을 조립하기 위한 주형에 사용된 것과는 다르다.
도 13에 주어진 정렬의 타당성을 확인하였으며 β가닥의 패턴을 나타낸 FcεRI 상에 수행된 이차 구조 예측은 FcεRI 및 FcγRIIa 모두에 있어서 동일하였다. 사용된 이차 구조 예측 방법은 PHD(B. Rost et al., CABIOS, vol. 10, 266-275(1994)) 및 PREDATOR (D. Frishman and P. Argos, Proteins, vol. 27, 329-335(1997)이었다.
InsightII_Homology 소프트웨어 패키쥐(Insight II (97.0), MSI, San Diego)에 주입시킨 바의 MODELER (A. Sali and T.L. Blundell, J. Mol. Biol., vol. 234, 779-815(1993)을 다수의 상이한 초기 서열 정렬 및 FcγRIIa의 두 구조적 주형을 사용하여 FcεRI 의 삼차원 모델을 발생시키는데 사용하였다. 구조적 주형 중 하나는 FcγRIIa의 3-차원 좌표이었고, 여기서 별도의 측쇄 배좌를 갖는 잔기들(잔기 번호 10, 21, 33, 57, 60, 61, 65 및 89)에 대해서, 'A'로 표지된 배좌를 선택한 반면 다른 주형에 있어서는 'B'로 표지된 배좌들을 선택하였다. 각각의 Modeler 전개에 있어서 5개의 FcεRI의 구조적 모델들을 발생시켰다. 다음의 변수 값 또는 옵션을 사용하였다: 1의 'library_schedule', 300의 'max_var_iteration', 'refine1'의 'md_level', 3의 'repeat_optimization', 및 1e6의 'max_molpdf'. 이들 전개로부터 최상의 모델은 도 13에 주어진 서열 정렬을 가졌으며, FcγRIIa의 구조적 주형을 사용하였는데, 여기서 잔기 10, 21, 33, 57, 60, 61, 65 및 89는 'A' 배좌의 측쇄를 가졌다. 최상의 모델을 판단하는 규준은 Modeler 목표 함수의 가장 낮은 값(또는 -1.0xln (분자 가능성 밀도 함수=Mpdf)), 'well-behaved' PROSAII(M. Sipple, Proteins, vol. 17, 355-362 (1993)) 모델에 대한 잔류 에너지 플롯(예컨대, 서열에 걸친 음성 잔류 에너지 스코어), 및 'well behaved' PROFILES-3D(J. U. Bowie et al., Science, vol. 253, 164-170 (1991) 국부 3D-1D 호환성 스코어 플롯(예를 들면, 서열에 걸친 양성 플롯 스코어)을 포함하였다.
다음에, 모델러(Modeler)를 사용하여 20개의 상이한 FcεRI의 구조적 모델들을 서열 정렬 및 상기 선택한 주형을 사용하고 상기 열거한 변수 값 및 옵션들을 사용하여 발생시켰다. 이어서 최저 -ln(Mpdf) 값(즉, 957,2)를 갖는 모델을 주형으로 선택하여 모델러 전개의 다음 사이클에서 FcεRI 서열의 구조적 모델들을 발생시켰다. 4회의 그러한 사이클의 결과, FcεRI 구조의 '최상의' 삼차원 모델은 643.2의 -ln(Mpdf)값을 가졌다. 이것을 FcεRI 모노머의 최종 구조적 모델로 선택하였고 대응하는 중(비수소) 원자 데카르트식(cartesian) 좌표를 표 3에 나타냈다. 이 구조의 '웜(worm)' 표시는 도 14에 나타낸다. 이 구조는 프로그램 PROSAII, PROFILES-3D 및 PROCHECK(R. M. Laskowsky et al., J. Appl. Cryst. vol. 26, 283-291 (1993))으로 확인하였다.
마지막으로, FcγRIIa 모노머로부터의 다이머를 발생시키는 동일한 좌표 변환을 FcεRI 모노머의 상기 모델에 적용하였다. 결과의 다이머의 경계면은 InsightII_Homology 모듈(MSI, San Diego)의 Auto_Rotamer 옵션으로 Glu 161 및 Tyr 150 잔기에 대한 별도의 로타머(rotamer)를 선택하고, 이어서 수소 원자들을 다이머 모델에 첨가하고, 골격 원자들만이 고정된 Tyr 150 및 Glu 161을 제외하고는, 모든 중원자를 고정시켜 에너지 최소화시켜 최적화하였다. 프로그램 Discover v. 2.98 (MSI, San Diego)를 CFF91 역장(force field) 및 1.0 x r의 거리-의존성 유전상수로 에너지 최소화에 사용하고 최소화는 최대 에너지 구배가 0.10 kcal/Å 이하가 될 때까지 콘쥬게이트 구배로 행하였다. FcεRI 다이머의 결과의 모델의 데카르트식 좌표는 표 4에 나타냈으며 다이머 모델의 '웜' 표기는 도 15에 나타냈다. 이 FcεRI 다이머의 모델은 0.64의 모노머-모노머 경계면에서 형상 상보성 또는 Sc 값(참조, M. C. Lawrence and P.M. Colman, J. Mol. Biol., vol. 234, 946-950(1993) 및 0.08의 모노머-모노머 경계면에서 정전 상보성 값-완전히 용매화된 경우에 대해서 Spearman 상관 계수를 사용하여-(참조 A. J. McCoy, V. C. Epa, and P. M. Colman, J. Mol. Biol., vol. 268, 570-584(1997)) 또는 ECSFC를 가졌다. 이들은 FcγRIIa 다이머에 대하여 0.80 및 0.32로 비교된다. FcγRIIa 다이머에 비하여 FcεRI 다이머에 대한 이들 감소된 상보성 값은 여기에서 제작된 바의 FcεRI 다이머의 형성이 FcγRIIa 경우에 있어서 보다 에너지적으로 덜 선호적인 것임을 나타낸다. 그러나, 본 발명자들은 FcεRI의 β 또는 γ쇄와의 상호작용은 고려되지 않았음을 주목한다. 도 16은 FcεRI 다이머 모델의 분자 표면 표시를 나타낸다.
표 3의 좌표로 나타낸 FcεRI 모노머 또는 표 4의 좌표로 나타낸 FcεRI 다이머의 삼차원 구조의 모델은 본 명세서의 FcγRIIa의 결정학적 좌표에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 약물 디자인에 대한 기초로서 사용될 수 있다.
실시예 9
다음의 실시예는 Fcε수용체 I (FcεRI)의 결정화에 대하여 설명한다.
바쿨로바이러스 폴리헤드론 전사 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 가용형의 인간 FcεRI (sFcεRI)를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 재조합 분자 pFcεRI를 실시예 1-3의 pFcγRIIa 분자에 대해 기술한 바 대로 생성하였다. 간단하게 설명하자면, 재조합 가용성 FcεRI는 도 13으로 표시되는 서열로 나타낸 바와 같은 제 2 도메인의 C-말단에서 서열 ILe, Lys, Ala, Pro에서 정상적으로 Pro를 코드하는 위치 173에서 번역 종료 코돈을 위치시킴으로써 발생시켰다. 가용성 FcεRI을 GIBCO에 의해 공급된 바쿨로바이러스 발현계 'Bac to Bac' 중에서 발현시켰다. SF21 또는 Sf9 세포의 감염은 제조원에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하자면, 재조합 FcγRIIa 분자를 pVL1392 바쿨로바이러스 셔틀 플라스미드(Pharmingen, San Diego, CA로부터 입수가능함) 내에 연결시켜 본 명세서에서 pVL-sFcεRI으로 언급하는 재조합 분자를 생성시켰다. 재조합 분자 pVL-sFcεRI을 후속적으로 바쿨로바이러스 균주 AcMNPV(Pharmingen으로부터 입수가능함)과 함께 스포돕테라 프루기페르다 21(Sf-21) 세포(Invitrogen Corp., San Diego, CA) 내로 동시형질감염시켜 에스. 프루기페르다:pVL-sFcεRI 세포를 얻었다. 감염후 65-70 시간에, 상층액들을 수확하고 가용성 수용체들을 실시예 5에 FcγRIIa에 대해 기술한 공정과 유사하게 앤티-FcεRI 항체(3B4) 단일 클론 항체-세파로오스 4B 친화 칼럼 상의 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 칼럼을 10 mM Tris pH 7.5 로 세척하고 0.1 M 소듐 아세테이트, 0.5 M 소듐 클로라이드, pH 4.0으로 용출하였다. 정제된 단백질을 농축시키고 상기 FcγRIIa에 대하여 기술한 결정화 시험(실시예 6)에 사용하였다. 결정들은 다음과 같은 몇가지 조건하에서 생성되었다:
(a) 0.2 M 칼슘 아세테이트; 0.1 M 소듐 카코딜레이트, pH 6.5; 18% w/v 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000;
(b) 0.1 M 소듐 카코딜레이트, pH 6.0 또는 pH 5.5; 10% v/v 2-프로판올; 20% w/v PEG 4000;
(c) 0.2 M 트리 소듐 시트레이트 디하이드레이트; 0.1 M 소듐 카코딜레이트 pH 6.5; 30% v/v PEG 4000.
이들 시험에 의해 얻은 FcεRI 결정 구조는 상기한 바와 같이 X-선 회절 분석 및(또는) 분자 치환 및 모델링 전략에 사용될 수 있다.
실시예 10
본 실시예는 모노머형의 Fcγ수용체 III (FcγRIIIb)의 삼차원 구조의 모델링을 기재한다.
인간 Fc 감마 수용체 타입 III(FcγRIIIb ) 및 인간 Fc 감마 수용체 타입 II a (FcγRIIa)의 세포외 영역은 약 53% 서열 동일성(174 잔기에 대하여)을 보인다. 이 모델링 작업에서 사용된 최종 서열 정렬은 도 18에 나타낸다. 인간 FcγRIIa의 X-선 결정학적인 구조는 실시예 1-7에 기술한 바와 같이 본 발명자들에 의해 결정되었다(표 1). 표 1의 FcγRIIa의 삼차원 좌표는 His 108의 이미다졸 고리의 배향 및 일회의 개량에 의해 인간 FcεRI 의 3-차원 모델을 조립하기 위한 주형에 사용된 것과는 다르다.
InsightII_Homology 소프트웨어 패키쥐(Insight II (97.0), MSI, San Diego)에 주입시킨 바의 MODELER (A. Sali and T.L. Blundell, J. Mol. Biol., vol. 234, 779-815(1993)을 다수의 상이한 초기 서열 정렬 및 FcγRIIa의 두 구조적 주형을 사용하여 FcγRIIIb의 삼차원 모델을 발생시키는데 사용하였다. 사용된 구조적 주형은 FcγRIIa의 3-차원 좌표이었고, 여기서 별도의 측쇄 배좌를 갖는 잔기들(잔기 번호 10, 21, 33, 57, 60, 61, 65 및 89)에 대해서, 'A'로 표지된 배좌들을 선택하였다. 각각의 Modeler 전개에 있어서 FcγRIIIb의 5개의 구조적 모델들을 발생시켰다. 다음의 변수 값 또는 옵션을 사용하였다: 1의 'library_schedule', 300의 'max_var_iteration', 'refine1'의 'md_level', 3의 'repeat_optimization', 및 1e6의 'max_molpdf'. 이들 전개로부터 최상의 모델은 도 18에 주어진 서열 정렬을 가졌으며, FcγRIIa의 구조적 주형을 사용하였는데, 여기서 잔기 10, 21, 33, 57, 60, 61, 65 및 89는 'A' 배좌의 측쇄를 가졌다. 최상의 모델을 판단하는 규준은 Modeler 목표 함수의 가장 낮은 값(또는 -1.0xln (분자 가능성 밀도 함수=Mpdf)), 'well-behaved' PROSAII(M. Sipple, Proteins, vol. 17, 355-362 (1993)) 모델에 대한 잔류 에너지 플롯(예컨대, 서열에 걸친 음성 잔류 에너지 스코어), 및 'well behaved' PROFILES-3D(J. U. Bowie et al., Science, vol. 253, 164-170 (1991) 국부 3D-1D 호환성 스코어 플롯(예를 들면, 서열에 걸친 양성 플롯 스코어)을 포함하였다.
다음에, 모델러(Modeler)를 사용하여 20개의 상이한 FcεRI의 구조적 모델들을 서열 정렬 및 상기 선택한 주형을 사용하고 상기 열거한 변수 값 및 옵션들을 사용하여 발생시켰다. 이어서 최저 -ln(Mpdf) 값(즉, 933.3)를 갖는 모델을 FcγRIIIb 모노머의 최종 구조적 모델로서 선택하고, 주형으로 선택하여 모델러 전개의 다음 사이클에서 FcγRIIIb 서열의 구조적 모델들을 발생시켰다. 대응하는 중(비수소) 원자 데카르트식(cartesian) 좌표를 표 5에 나타냈다. 이 구조는 프로그램 PROSAII, PROFILES-3D 및 PROCHECK(R. M. Laskowsky et al., J. Appeal. Cryst. vol. 26, 283-291 (1993))으로 확인하였다.
표 5의 좌표로 나타낸 FcγRIIIb 모노머의 삼차원 구조의 모델은 본 명세서의 FcγRIIa의 결정학적 좌표에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 약물 디자인에 대한 기초로서 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양을 상세히 기술하였으나 그러한 실시태양의 변형 및 채택이 당업자에게 일어날 수 있음은 명백하다. 그러나 그러한 변형 및 채택은 다음의 청구범위에 나타낸 본 발명의 범위 내에 포함되는 것을 분명히 이해해야 한다.

Claims (81)

  1. 모델이 표 1의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조를 나타내는 Fc 수용체 (FcR) 단백질의 모델.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구조가 표 1에 나타낸 원자 좌표 및 B-값에 실질적으로 일치하는 모델.
  3. 제1항에 있어서, 상기 구조가 모노머성인 모델.
  4. 제1항에 있어서, 상기 구조가 다이머성인 모델.
  5. 제1항에 있어서, 상기 구조가 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5로 이루어진 군 중에서 선택된 하나의 표의 원자 좌표들에 실질적으로 일치하는 모델.
  6. 제1항에 있어서, 상기 구조의 적어도 약 50%가 상기 구조의 각 도메인의 2차 구조 원소들 중의 골격 원자에 대해 약 1.5 Å 이하의 평균 제곱근-평균-제곱 편차(RMSD)를 갖는 모델.
  7. 제1항에 있어서, 상기 구조 및 상기 원자 좌표를 포함하는 구조 사이의 공통 아미노산 측쇄의 적어도 약 50%가 약 1.5 Å 이하의 평균 제곱근-평균-제곱 편차(RMSD)를 갖는 모델.
  8. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 서열번호: 3, 서열번호 : 10, 서열번호: 11 및 서열 번호: 12로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 약 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 모델.
  9. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 서열번호: 3, 서열번호 : 10, 서열번호: 11 및 서열 번호: 12로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 약 40% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 모델.
  10. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 서열번호: 3, 서열번호 : 10, 서열번호: 11 및 서열 번호: 12로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 모델.
  11. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 및 서열번호: 13으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열의 임의의 변이체 및 상기 아미노산 서열의 대립형질 변이체를 포함하는 모델.
  12. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 및 서열번호: 13으로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열; 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 및 서열번호: 13의 변이체; 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호; 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 및 서열번호: 13의 대립형질 변이체로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 모델.
  13. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRI 단백질, FcγRIIa 단백질, FcγRIIb 단백질, FcγRIIc 단백질, FcγRIII 단백질, FcεRI 단백질 및 FcαRI 단백질, 및 상기 FcR단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  14. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRI 단백질, FcγRIIa 단백질, FcγRIIb 단백질, FcγRIIc 단백질, FcγRIII 단백질, FcεRI 단백질 및 FcαRI 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  15. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRIIa 단백질 모노머, FcγRIIa 단백질 다이머, 및 상기 FcγRIIa 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  16. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcεRI 단백질 모노머, FcεRI 단백질 다이머, 및 상기 FcεRI 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  17. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRI 단백질 모노머, FcγRI 단백질 다이머, 및 상기 FcγRI 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  18. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRIIb 단백질 모노머, FcγRIIb 단백질 다이머, 및 상기 FcγRIIb 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  19. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRIIc 단백질 모노머, FcγRIIc 단백질 다이머, 및 상기 FcγRIIc 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  20. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRIIIb 단백질 모노머, FcγRIIIb 단백질 다이머, 및 상기 FcγRIIIb 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  21. 제1항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcαRI 단백질 모노머, FcαRI 단백질 다이머, 및 상기 FcαRI 단백질의 구조적 상동체로 이루어진 군 중에서 선택되는 모델.
  22. 제1항에 있어서, 상기 원자 좌표가 (a) 결정형의 FcγRIIa 단백질을 제공하고; (b) 결정형 FcγRIIa 단백질의 전자 밀도-지도를 발생시키고; (c) 전자-밀도 지도를 분석하여 상기 원자 좌표를 생성시키는 것을 포함하는 방법에 의해 발생된 모델.
  23. 제22항에 있어서, 상기 결정형 FcγRIIa 단백질이 FcγRIIa 단백질을 아세테이트 염 완충액 및 설페이트 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 모액 완충액과 혼합하고 결정 형성을 유도하여 상기 결정형 FcγRIIa 단백질을 생산하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산되는 모델.
  24. 제23항에 있어서, 상기 아세테이트 완충액이 약 200 mM 암모늄 아세테이트, 약 100mM 소듐 시트레이트 및 약 30% PEG 4000을 포함하고 약 5.6의 pH를 갖는 완충액인 모델.
  25. 제23항에 있어서, 상기 설페이트 완충액이 약 0.1 M HEPES 및 약 1.5 M 리튬 설페이이트를 포함하고 약 7.5의 pH를 갖는 완충액인 모델.
  26. 제22항에 있어서, 상기 전자-밀도 지도를 발생시키는 단계가 상기 결정성 FcγRIIa 단백질을 X-선 회절에 의해 분석하는 것을 포함하는 모델.
  27. 제22항에 있어서, 상기 결정성 FcγRIIa 단백질이 상기 X-선 회절에 앞서 P(디-γ-요오도 비스[에틸렌디아민]디 플라트넘(II) 니트레이트 중에서 유도체화되는 것인 모델.
  28. 제22항에 있어서, 상기 결정성 FcγRIIa 단백질이 상기 X-선 회절에 앞서 약 5 mM의 디-γ-요오도 비스[에틸렌디아민]디 플라트넘(II) 니트레이트 중에서 유도체화되는 것인 모델.
  29. 제1항에 있어서, 상기 모델이 상기 삼차원 구조의 삼차원 좌표의 세트로 코드된 컴퓨터-판독형 매체에 의해 발생된 컴퓨터 이미지이고, 여기서, 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 상기 삼차원 좌표들의 세트는 전자 파일을 삼차원 이미지로서 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 가시화될 수 있는 전자 파일을 창제하는 것인 모델.
  30. a. Fc 수용체 (FcR) 단백질의 모델을 제공하고, 여기서 상기 모델은 표 1의 원자 좌표에 실질적으로 일치되는 삼차원 구조를 나타내며;
    b. 상기 모델을 사용하여 화학적 화합물을 디자인하고;
    c. 상기 화학적 화합물을 화학적으로 합성하는 것을 포함하는 생활성 화합물의 구조에 기초한 컴퓨터 보조 약물 디자인의 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 방법이 추가로 (d) 합성된 화학적 화합물의 생활성을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 삼차원 구조가 표 1에 열거된 원자 좌표를 포함하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 삼차원 구조가 다이머성인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 삼차원 구조가 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5로 이루어진 군 중에서 선택된 표에 열거된 원자 좌표를 포함하는 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 모델이 표 1에 나타낸 원자 좌표를 포함하는 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여 컴퓨터 상에서 분석하여 상기 이미지의 전자 파일을 창제하고 상기 전자 파일을 삼차원 이미지로서 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 상기 전자 파일을 가시화시켰을 때 발생되는 컴퓨터 이미지를 포함하는 방법.
  36. 제30항에 있어서, 상기 디자인하는 단계가 상기 화합물의 삼차원 구조가 알려진 화학적 화합물의 하나 이상의 데이터베이스를 컴퓨터에 의해 검색하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 스크리닝 단계에 의해 동정된 화합물을 상기 컴퓨터에 의한 상기 모델과 상호작용시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제30항에 있어서, 상기 디자인하는 단계가 정향 약물 디자인을 포함하는 방법.
  39. 제30항에 있어서, 상기 디자인하는 단계가 무작위 약물 디자인을 포함하는 방법.
  40. 제30항에 있어서, 상기 디자인하는 단계가 그리드-기초 약물 디자인을 포함하는 방법.
  41. 제30항에 있어서, 상기 디자인하는 단계가 상기 FcR 단백질의 상기 삼차원 구조를 모방하는 것으로 예측되는 화합물을 선별하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제30항에 있어서, 상기 디자인하는 단계가 상기 FcR 단백질의 상기 삼차원 구조에 결합하는 것으로 예측되는 화합물을 선별하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제30항에 있어서, 상기 생활성이 상기 FcR 단백질의 면역글로불린 단백질에의 결합, 상기 FcR 단백질에의 결합, 상기 FcR 단백질에 결합할 수 있는 면역글로불린에의 결합을 억제, 상기 면역글로불린 단백질의 식작용을 억제, 상기 FcR 단백질의 다이머화의 억제, 상기 FcR 단백질을 통한 세포의 신호 전달의 자극 및 상기 FcR 단백질을 통한 사이토카인의 방출을 자극하는 것으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  44. 제30항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRIIa 이고, 상기 생활성이 상기 FcγRIIa 단백질의 IgG 단백질에의 결합의 억제, IgG의 식작용을 억제, FcγRIIa 단백질의 다이머화의 억제, FcγRIIa 단백질을 통한 세포의 신호 전달의 자극 및 IL-6 및 IL-12로 이루어진 군 중에서 선택된 사이토카인의 방출을 자극하는 것으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  45. 제30항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcγRIIIb 이고, 상기 생활성이 FcγRIIIb 단백질의 IgG 단백질에의 결합의 억제, IgG의 식작용의 억제, FcγRIIIb 단백질의 다이머화의 억제, FcγRIIIb 단백질을 통한 세포의 신호 전달의 자극 및 IL-6 및 IL-12로 이루어진 군 중에서 선택된 사이토카인의 방출을 자극하는 것으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  46. 제30항에 있어서, 상기 FcR 단백질이 FcεRI 이고, 상기 생활성이 상기 FcεRI 단백질의 IgG 단백질에의 결합의 억제, IgG의 식작용의 억제, FcεRI 단백질의 다이머화의 억제, FcεRI 단백질을 통한 세포의 신호 전달의 자극 및 IL-6 및 IL-12로 이루어진 군 중에서 선택된 사이토카인의 방출을 자극하는 것으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
  47. a. Fc 수용체 (FcR) 단백질의 모델을 제공하고, 여기서 상기 모델은 표 1로 나타낸 원자 좌표; 표 2로 나타낸 원자 좌표; 표 3으로 나타낸 원자 좌표; 표 4로 나타낸 원자 좌표; 및 표 5로 나타낸 원자 좌표로 이루어진 군 중에서 선택된 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조를 나타내며;
    b. 상기 모델을 사용하여 화학적 화합물을 디자인하고;
    c. 화학적 화합물을 화학적으로 합성하는 것을 포함하는
    생활성 화합물의 구조에 기초한 컴퓨터-보조 약물 디자인의 방법.
  48. a. FcγRIIa, FcγRIIIb 및 FcεRI으로 이루어진 군 중에서 선택된 Fc 수용체 (FcR) 단백질의 삼차원 모델을 제공하고,
    b. 상기 모델을 사용하여 화학적 화합물을 디자인하고;
    c. 상기 화학적 화합물을 화학적으로 합성하는 것을 포함하는
    생활성 화합물의 구조에 기초한 컴퓨터-보조 약물 디자인의 방법.
  49. FcR 단백질의 삼차원 구조의 삼차원 컴퓨터 이미지.
  50. 제49항에 있어서, 상기 구조가 표 1에 열거한 삼차원 좌표; 표 2에 열거한 삼차원 좌표; 표 3에 열거한 삼차원 좌표; 표 4에 열거한 삼차원 좌표; 및 표 5에 열거한 삼차원 좌표로 이루어진 군 중에서 선택된 삼차원 좌표에 실질적으로 일치하는 이미지.
  51. 제49항에 있어서, 상기 컴퓨터 이미지가 상기 삼차원 좌표들을 포함하는 삼차원 좌표의 세트를 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여 컴퓨터 상에서 분석하여 상기 이미지의 전자 파일을 창제하고 전자 파일을 삼차원 이미지로서 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 상기 전자 파일을 가시화시켰을 때 생성되는 이미지.
  52. 제49항에 있어서, 상기 삼차원 컴퓨터 이미지가 도 4, 도 6, 도 7, 도 8, 도 9, 도 10, 도 14, 도 15 및 도 16으로 이루어진 군 중에서 선택된 이차원 이미지에 의해 나타내어지는 이미지.
  53. 제49항에 있어서, 상기 삼차원 컴퓨터 이미지가 치료용 화합물을 디자인하는데 사용되는 이미지.
  54. 표 1의 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 삼차원 구조를 갖는 FcR 단백질의 삼차원 좌표의 세트로 코드되고, 여기서 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 삼차원 좌표는 상기 전자 파일을 삼차원 이미지로 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 가시화될 수 있는 전자 파일을 창제하는 것인 컴퓨터-판독형 매체.
  55. 표 1에 열거한 삼차원 좌표; 표 2에 열거한 삼차원 좌표; 표 3에 열거한 삼차원 좌표; 표 4에 열거한 삼차원 좌표; 및 표 5에 열거한 삼차원 좌표로 이루어진 군 중에서 선택된 삼차원 좌표의 세트로 코드되고, 여기서 그래픽 디스플레이 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 상기 삼차원 좌표는 상기 전자 파일을 삼차원 이미지로 나타낼 수 있는 컴퓨터 상에서 가시화될 수 있는 전자 파일을 창제하는 것인 컴퓨터-판독형 매체.
  56. 모델이
    (a) FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열 및 FcR 단백질의 아미노산 서열을 제공하고;
    (b) 상기 FcγRIIa 아미노산 서열 및 상기 FcR 단백질 아미노산 사이에 공유된 구조적으로 보존된 영역들을 동정하고;
    (c) 상기 FcR 단백질의 상기 구조적으로 보존된 영역들을 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치되는 상기 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 사용하여 삼차원 구조로 할담함으로써 상기 FcR 단백질 아미노산 서열의 삼차원 구조의 모델을 유도하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성되는,
    FcγRI 단백질, FcγRIIb 단백질, FcγRIIc 단백질, FcγRIIIb 단백질, FcεRI 단백질 및 FcαRI 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 FcR 단백질의 삼차원 구조의 모델.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 FcγRI 단백질 아미노산 서열은 서열 번호: 7을 포함하고; 상기 FcγRIIb 단백질 아미노산 서열은 서열 번호: 5를 포함하고; 상기 FcγRIIc 단백질 아미노산은 서열 번호: 6을 포함하고; 상기 FcγRIIIb 단백질 아미노산 서열은 서열 번호: 8을 포함하고; 상기 FcεRI 단백질 아미노산 서열은 서열 번호: 9를 포함하고; 상기 FcαRI 단백질 아미노산 서열은 서열 번호: 13을 포함하는 것인 모델.
  58. Fcγ수용체 (FcγR) 단백질의 활성을 억제하는 억제용 화합물을 포함하고, 상기 억제성 화합물은
    (a) FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, 및 FcγRIIIb로 이루어진 군 중에서 선택되는 FcγR 단백질의 삼차원 구조를 제공하고, 여기서 상기 FcγR 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표들에 실질적으로 일치하며;
    (b) 상기 FcγR 단백질의 삼차원 구조를 사용하여 FcγR 단백질의 IgG에 대한 결합을 억제하는 화합물, FcγR 단백질의 삼차원 구조를 실질적으로 모방하는 화합물 및 FcγR 단백질과 FcγR 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 자극하는 분자와의 결합을 억제하는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물을 디자인하고,
    (c) 상기 화합물을 화학적으로 합성하고,
    (d) 상기 합성된 화합물이 IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 능력을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정되는,
    동물에 투여되었을 때, IgG-매개 조직 손상을 감소시키는 치료용 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 IgG-매개 조직 손상이 IgG-매개 과민증, 또는 염증성 세포들의 IgG-매개된 회복 및 염증성 모듈레이터들의 IgG-매개된 방출로 이루어지는 군 중에서 선택되는 생물학적 응답으로부터 초래되는 것인 조성물.
  60. 제58항에 있어서, 상기 구조가 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 조성물.
  61. 제58항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 무기 화합물 및 유기 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 조성물.
  62. 제58항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 올리고뉴클레오티드류, 펩티드류, 펩티드모방 화합물들 및 작은 유기 분자들로 이루어진 군 중에서 선택되는 조성물.
  63. 제58항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 상기 FcγR 단백질의 유사체, 상기 FcγR 단백질의 기질 유사체 및 상기 FcγR의 펩티도모방 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 조성물.
  64. 제58항에 있어서, 상기 조성물이 부형제, 보조제 및 담체로 이루어진 군 중에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  65. Fcγ수용체 (FcγR) 단백질의 활성을 자극하는 자극성 화합물을 포함하고, 상기 자극성 화합물은
    (a) FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, 및 FcγRIIIb로 이루어진 군 중에서 선택되는 FcγR 단백질의 삼차원 구조를 제공하고, 여기서 상기 FcγR 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표들에 실질적으로 일치하며;
    (b) 상기 FcγR 단백질의 삼차원 구조를 사용하여 FcγR 단백질의 IgG에 대한 결합을 자극하는 화합물, FcγR 단백질의 삼차원 구조를 실질적으로 모방하는 화합물 및 FcγR 단백질과 FcγR 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 자극하는 분자와의 결합을 자극하는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물을 디자인하고,
    (c) 상기 화합물을 화학적으로 합성하고,
    (d) 상기 합성된 화합물이 IgG-매개 응답들을 증대시키는 능력을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정되는,
    동물에 투여되었을 때, IgG-매개 응답을 증대시키는 치료용 조성물.
  66. FcεR 수용체 I (FcεRI) 단백질의 활성을 억제하는 억제용 화합물을 포함하고, 상기 억제성 화합물은
    (a) FcεRI 단백질의 삼차원 구조를 제공하고, 여기서 상기 FcεRI 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표들, 표 2에 나타낸 원자 좌표들, 표 3에 나타낸 원자 좌표들, 표 4에 나타낸 원자 좌표들, 표 5에 나타낸 원자 좌표들로 이루어진 군 중에서 선택된 원자 좌표들에 실질적으로 일치하며;
    (b) 상기 FcεRI의 삼차원 구조를 사용하여 FcεRI 단백질의 IgE에 대한 결합을 억제하는 화합물, FcεRI 단백질의 삼차원 구조를 실질적으로 모방하는 화합물 및 FcεRI 단백질과 FcεRI 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 자극하는 분자와의 결합을 억제하는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물을 디자인하고,
    (c) 상기 화합물을 화학적으로 합성하고,
    (d) 상기 합성된 화합물이 IgE-매개 응답을 감소시키는 능력을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정되는,
    동물에 투여되었을 때, IgE-매개 응답을 감소시키는 치료용 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 IgE-매개 응답이 IgE-매개 과민증, 또는 염증성 세포들의 IgE-매개된 회복 및 염증성 모듈레이터들의 IgE-매개된 방출로 이루어지는 생물학적 응답으로부터 초래되는 것인 조성물.
  68. 제66항에 있어서, 상기 구조가 표 3에 나타낸 원자 구조를 포함하는 조성물.
  69. 제66항에 있어서, 상기 구조가 표 4에 나타낸 원자 구조를 포함하는 조성물.
  70. 제66항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 무기 화합물 및 유기 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 조성물.
  71. 제66항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 올리고뉴클레오티드류, 펩티드류, 펩티드모방 화합물들 및 작은 유기 분자들로 이루어진 군 중에서 선택되는 조성물.
  72. 제66항에 있어서, 상기 화학적 화합물이 상기 FcεRI 단백질의 유사체, 상기 FcεRI 단백질의 기질 유사체 및 상기 FcεRI의 펩티도모방 화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 조성물.
  73. 제66항에 있어서, 상기 조성물이 부형제, 보조제 및 담체로 이루어진 군 중에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  74. FcεR 수용체 I (FcεRI) 단백질의 활성을 자극하는 자극용 화합물을 포함하고, 상기 자극용 화합물은
    (a) FcεRI 단백질의 삼차원 구조를 제공하고, 여기서 상기 FcεRI 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표들, 표 2에 나타낸 원자 좌표들, 표 3에 나타낸 원자 좌표들, 표 4에 나타낸 원자 좌표들, 표 5에 나타낸 원자 좌표들로 이루어진 군 중에서 선택된 원자 좌표들에 실질적으로 일치하며;
    (b) 상기 FcεRI의 삼차원 구조를 사용하여 FcεRI 단백질의 IgE에 대한 결합을 자극하는 화합물, FcεRI 단백질의 삼차원 구조를 실질적으로 모방하는 화합물 및 FcεRI 단백질과 FcεRI 단백질을 통하여 세포의 신호 전달을 자극하는 분자와의 결합을 자극하는 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 화합물을 디자인하고,
    (c) 상기 화합물을 화학적으로 합성하고,
    (d) 상기 합성된 화합물이 IgE-매개 응답을 증대시키는 능력을 평가하는 것을 포함하는 방법에 의해 동정되는,
    동물에 투여되었을 때, IgE-매개 응답을 증대시키는 치료용 조성물.
  75. (a) FcR 단백질의 삼차원 구조가 알려지지 않은, FcγRI 단백질, FcγRIIb 단백질, FcγRIIc 단백질, FcγRIIIb 단백질, FcεRI 및 FcαRI 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 FcR 단백질의 아미노산 서열을 제공하고;
    (b) 접힘 인식(fold recognition)에 의해 삼차원 배좌의 상기 아미노산 서열의 접힘의 패턴을 분석하고;
    (c) 상기 FcR 단백질 아미노산 서열의 접힘(folding) 패턴을 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조와 비교하여 상기 FcR 단백질의 삼차원 구조를 결정하고, 여기서, 상기 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조는 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치하는 것인 단계를 포함하는
    FcR 단백질의 삼차원 구조를 결정하는 방법.
  76. (a) FcγRIIa 단백질의 아미노산 서열 및 FcR 단백질의 아미노산 서열을 제공하고;
    (b) 상기 FcγRIIa 아미노산 서열 및 상기 FcR 단백질 아미노산 서열 사이에 공유된 구조적으로 보존된 영역들을 동정하고;
    (c) 표 1에 나타낸 원자 좌표에 실질적으로 일치되는 원자 좌표에 기초하여 FcγRIIa 단백질의 삼차원 구조를 사용하여 상기 FcR 단백질의 구조적으로 보존된 영역들을 삼차원 구조로 할당함으로써 상기 표적 구조에 대한 원자 좌표를 결정하여 상기 FcR 단백질 아미노산 서열의 삼차원 구조의 모델을 유도하는 것을 포함하는, FcR 단백질의 삼차원 구조의 모델을 유도하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 추가로 로타머의 라이브러리를 사용하여 입체적으로 허용가능한 위치들을 결정함으로써 상기 FcR 단백질의 측쇄에 대한 원자 좌표를 할당하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  78. (a) 결정화된 FcR 단백질의 패터슨 함수를 결정성 FcγRIIa 단백질의 패터슨 함수와 비교하여 상기 결정화된 FcR 단백질의 전자-밀도 지도를 생성하고;
    (b) 상기 전자-밀도 지도를 분석하여 상기 결정화된 FcR 단백질의 삼차원 구조를 생성시키는 것을 포함하는 단계를 포함하는
    결정화된 FcR 단백질의 삼차원 구조를 유도하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 추가로 상기 결정화된 FcR 단백질의 상기 삼차원 구조를 전자공학적으로 시뮬레이션시켜 상기 결정화된 FcR 단백질의 상기 삼차원 구조의 컴퓨터 이미지를 유도하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  80. 제78항에 있어서, 추가로 상기 결정화된 FcR 단백질의 패터슨 함수를 상기 결정성 FcγRIIa 단백질의 패터슨 함수 상에서 회전시켜 상기 결정화된 FcR 단백질의 결정에 있어서 상기 결정화된 FcR 단백질의 올바른 방향을 결정하여 상기 결정화된 FcR 단백질의 초기 상들을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  81. 결정성 형태의 FcγRIIa 단백질을 포함하는 조성물.
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