KR20010017486A - 수용성 아조염료와 그의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수용성 아조염료(water soluble azo dyes)와, 이 염료들간의 합성법 및 이들 염료의 용액을 사용하여 수용액에 들어 있는 글루코오스의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 수용성 아조염료 분자식으로 탄소수 1내지 4의 알킬기(alkyl), 하이드록시알킬기(hydroxy alkyl), 카르복실기를 함유하는 알킬기(alkyls with carboxyl), 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기(alkyls with sulfoyl)를 포함하는 것으로, 수용성 아조 염료와 m-니트로페닐붕소산(m-nitrophenylboronic acid)의 수용액은 글루코오스와 결합하여 540mm에서 흡수를 나타내고 흡수도(absorptivity)는 글루코오스의 농도에 따라 일정한 변화를 한다. 따라서, 이를 이용하여, 수용액, 특히 혈중 글루코오스를 측정할 수 있다.

Description

수용성 아조염료와 그의 응용 {synthesis and application of water soluble azo dyes}
본 발명은 수용액 중의 글루코오스의 농도를 측정할 수 있는 염료와 그 염료의 합성에 관한 것으로서, 특히 하기 구조식 (I) 과 (II)의 화합물 및 이들의 합성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화합물 (I) 또는 (II) 와 화합물 (III)을 사용하여 수용액 중 글루코오스의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
상기식 (I) 과 (II) 에서 R은 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 하이드록시알킬기, 카복실기를 함유하는 알킬기, 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기를 나타낸다.
혈중 글루코오스의 농도 측정(measurement of blood glucose concentration)은 당뇨의 진단 및 치료의 기초자료로서 또한 당뇨병 환자의 식사 조절에 매우 중요한 작업이다.
혈중 글루코오스의 농도는 몇 가지의 방법에 의하여 측정해 왔으며 이들 방법은 기술문헌이나 특허에 잘 기술이 되어 있다.
USP 5.605.152 에는 광섬유(optical fibers)로 이루어진 검출장치(sensor)를 환자의 혈관 내에 이식(implant)하여 혈중 글루코오스의 농도를 측정하는 방법이 기술되어 있다. 이 특허에서 제시된 검출 장치는 산소 존재 하에 글루코오스를 산화하여 글루콘산(gluconic acid)과 과산화수소(hydrogen peroxide)를 생성할 수 있는 글루코오스 산화효소(glucose oxidasc)가 코팅되어 있는 옵토드(optode)로 이루어져 있으며 글루코오스가 산화(oxidize)되고 산소가 소모되는 정도로 글루코오스의 농도를 알아내는 간접적인 방법을 이용하고 있다. 이러한 방법은 환자의 혈중 글루코오스의 농도를 다소 정확히 측정할 수 있지만 환자의 혈관 내에 검출장치를 이식하여야 하므로 장기적, 주기적으로 환자를 관찰해야 하는 병원에서나 가능한 방법이다.
병원에 입원을 하지 않아도 되는 정도의 경증 당뇨병 환자가 사용할 수 있는, 휴대가 용이한 글루코오스 검출장치에 대한 필요성을 매우 절실하다.
USP 5.779.867에서는 이러한 요구에 적합한 검출장치가 기술되어 있다. 이 특허에서는 띠 모양의 전극을 사용하여 전극사이의 전위차(potential difference between two electrodes)를 측정함으로써 글루코오스의 농도를 측정하고 있다. 검출용 띠는 두 개의 전극으로 이루어져 있으며 그 중 한 전극은 고분자막(polymer membrane)에 전도성(conductive) 물질으로서 산화-환원(oxidation-reduction)이 가능한 유기물질을 코팅한 활성 표면으로 이루어져 있으며 다른 전극은 은/염화은(silver/silver chloride)으로 이루어진 기준 전극(reference electrode)을 사용하고 있다. 두 전극 사이에는 수용액을 잘 흡수하는 종이나 필름이 채워져 있으며 이것은 효소(enzyme)와 산화가 가능한 염료(oxidizable dye)가 포함되어 있다. 이 장치는 비교적 낮은 농도에서도 글루코오스의 검출이 가능하며 농도에 따른 전위차(potential difference)가 일정하여 매우 정확한 농도를 알아낼 수 있는 장점은 있으나 비교적 고가로 제조가 되는 전극을 한 번 사용하고 버림으로써 환자에게는 경제적인 부담이 되는 단점이 있다.
USP 5.059.394와 USP 5,179,005에는 글루코오스 산화효소(glucose oxidase), 과산화효소(peroxidase) 그리고 과산화수소와 반응하여 색상이 변화하는 염료로 이루어진 글루코오스 검출용기를 사용하는 측정장치에 대하여 기술하고 있다. 이 측정장치에서 이용하는 원리는 글루코오스가 산화효소에 의하여 산화되면서 과산화수소가 생성되는 데 이것과 염료가 반응하여 일으키는 색상변화를 광학센서(optical sensor)를 사용하여 글루코오스의 농도를 측정한다. 그러나 이 방법은 반응 단계가 많은 간접적인 검출 방법으로서 오차의 범위가 약 10%정도로 매우 크다는 단점이 있다.
상기의 방법들은 글루코오스의 농도를 직접적으로 측정하는 것이 아니라 간접적으로 측정하는 방법을 쓰고 있다.
본 발명자들은 글루코오스와 직접적으로 반응하여 그 농도를 측정할 수 있는 시스템을 구성하고자 다양한, 많은 문헌을 조사 하였다.
최근에, Supramolecular Chemistry 9, 203 (1998)에서 Koumoto 등은 니트로기가 치환되어 있는 페닐붕소산 (phenylboronic acid substituted with nitro group)이 리보오스 (ribose), 만노오스 (mannose), 퓨코오스 (fucose), 자이로오스 (xylose), 아라비노오스 (arabinose), 프럭토오스 (fructose) 및 람노오스 (ramnose)화합물과 반응을 하여 에스테르(ester)를 형성하면 붕소의 산성도(acidity)가 증가한다는 사실과 피리딘(pyridine) 고리를 가진 염료는 염기성을 띠고있으므로 붕소산 (boronic acid)과 루이스(Lewis)산-염기 반응을 하며 이때 붕소산의 산성도에 따라 염료의 색상이 변화한다는 실험 결과를 발표하였다.
이 논문에서 저자들은 물에 불용성인 염료를 메탄올(methanol) 같은 유기용매(organic solvent)를 사용하여 용액(solution)을 만든 뒤 상기의 당류(saccharides)화합물의 농도에 따른 염료의 흡수 스펙트럼(absorption spectrum)을 측정하였으며 흡수도(absorptivity)는 상기 화합물의 농도에 따라 일정한 변화를 나타내었다. 그러나 혈액은 대부분이 물로 이루어져 있으며 혈액의 글루코오스 농도를 측정하기 위하여서는 물에 용해할 수 없는 염료를 사용할 경우 실제 농도를 측정하기는 거의 불가능하다.
이에 본 발명자들은 선행 기술의 상술한 여러 가지 문제점들을 개선하기 위한 노력을 거듭한 결과 염료의 수용성 작용기를 도입함으로써 염료가 수용액에 녹을 수 있고 이럼으로써 혈중 글루코오스 농도를 측정하기에 적절한 염료의 구조를 개발할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 효소(enzyme)를 사용하는 간접적인 방법과는 달리 염료 시스템과 직접적으로 반응하여 색상을 변화시키는 Koumoto 등의 연구 논문을 토대로 하여, 물에 용해가 가능하고 염료 분자 내에 붕소산과 반응하여 붕소산의 산성도에 따라 색상이 변화할 수 있는 염료를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 수용액 속의 글루코오스와 반응하여 색상이 변화하는 염료를 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수용액 속의 글루코오스 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 관점에 따라서, 하기 구조식(I) 또는 (II)로 표시되는, 수용성 아조 화합물을 제공한다.
상기식에서 R은 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 하이드록시알킬기, 카르복실기를 함유하는 알킬기, 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기이다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 4-아미노피리딘을 다이아조화하여 다이아조 중간체를 생성하는 단계, 다이아조 중간체를 알킬화된 메타닐산(alkylated metanilic acid) 또는 알킬화된 오타닐 산과 커플링 반응하여 염료를 합성하는 단계, 및 합성된 염료를 염석으로 분리하는 단계를 포함하는, 상기 구조식 (I) 또는 (II)로 표시되는 수용성 아조 염료를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점에 있어서, 상기 구조식 (I) 또는 (II)로 표시되는 화합물과 페닐붕소산의 상대적인 비가 50~150배인, 수용액 글루코오스 농도 측정용 혼합물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점에 있어서, 상기 구조식 (I) 또는 (II)의 화합물의, 수용액 글루코오스 농도 측정으로의 용도를 제공한다.
도 1은 실시예 3 용액에 대한 글루코오스의 농도에 따른 흡광 스펙트럼 (absorption spectrum)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 3에 의한 글루코오스 농도에 대한 상대 흡광도 비 (relative absorption ratio)를 나타낸 그래프이다.
도 3는 실시예 4 용액에 대한 글루코오스의 농도에 따른 흡광 스펙트럼 (absorption spectrum)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 4에 의한 글루코오스 농도에 대한 상대 흡광도 비 (relative absorption ratio)를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서 합성된 염료는 피리딘(pyridine)구조를 가지고 있는 아조계 염료로서 화합물 (III)과는 수용액에서 아래 화학식 (IV)에서 나타난 바와 같은 상호작용을 하는 것으로 추정이 된다.
이는 아조 발색단(azo chromophore)의 피리딘 고리를 형성하고 있는 질소(nitrogen)가 비공유 전자쌍을 내어놓는 염기로서 작용을 하고, 원자가 껍질(valence shell)에 전자가 완전히 채워지지 않는 붕소는 산으로서 행동하는 루이스(Lewis)산-염기 반응(acid-base reaction)으로 표현될 수 있다. 반면에 혼합물에 글루코오스와 같은 1,2-다이올(1,2-diol)을 가하게 되면 다음 화학식 (V)에서 나타난 바와 같이 글루코오스는 붕소산과 에스테르를 형성하게 된다.
이때 형성되는 붕소산 에스테르(boronate)는 붕소산에 비하여 루이스 산성도가 증가하므로 염료를 형성하는 피리딘으로부터 전자를 끌어당기는 역할(electron withdrawing effect)을 하게 되며 결과적으로 염료의 흡수 파장(absorption band)이 변화하게 된다.
본 발명에서 목적하는 화합물(I)은 붕소산과 산-염기 반응을 할 수 있는 성분인 4-아미노피리딘(4-aminopyridine)을 다이아조화(diazotization)한 후, 이를 알킬화된 메타닐산(alkylated metanilic acid)과 커플링 반응(coupling reaction)을 하면 얻을 수 있다. 또한 화합물 (II)는 4-아미노피리딘을 다이아조화(diazonite)한 후, 이를 알킬화된 오타닐산(orthanilic acid)과 커플링 반응을 하면 얻을 수 있다. 다이아조화는 염산(hydrochloric acid), 황산(sulfuric acid), 인산(phosphoric acid) 또는 황산-아세트산-프로피온산(sulfuric acid-acetic acid-propionic acid) 혼합물과 아질산 나트륨(sodium nitrite)을 0-5 ℃에서 4-아미노피리딘 존재하에서 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 커플링 반응의 경우는 0-5 ℃에서 알킬화된 메타닐산(alkylated metanilic acid) 또는 알킬화된 오트닐산(alkylated orthanilic acid)을 물에 분산(disperse)한 뒤 다이아조 중간체(intermediate)를 서서히 가하면서 NaOH 용액을 사용하여 pH 3-5로 조절함으로써 이루어진다. 반응 생성물인 염료는 물에 잘 용해하는 물질로서 통상적인 분리 방법인 크로마토그라피(chromatography)에 의하여 얻을 수는 없고, 염석(saltingout)을 통하여 고체로 얻을 수 있다. 이때 사용되는 염(salt)은 통상적으로 알려진 KCl 또는 NaCl 등을 사용할 수 있다. 이렇게 얻어진 염료와 무기염(inorganic salt)의 혼합물로부터 순수한 염료를 분리하기 위해서는 건조된 혼합물을 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 아세톤(acetone)류의 극성 유기용매(polar solvent)로 씻어주면 된다.
글루코오스의 농도를 측정하기에 적합한, 본 발명에 따른 염료와 화합물 (III)의 혼합용액은 수용액의 형태로 얻을 수 있다. 이들 혼합물의 구성비는 의도하는 흡수 파장이나 흡수도에 따라서 적절하게 조절할 수 있고, 글루코오스의 농도에 따른 바람직한 흡수도 경향을 가질 수 있는 혼합물 수용액은 염료 (I) 또는 (II)를 1 x 10-4 ~ 1 x 10-4 mole/L의 농도와 화합물 (III)을 5 x 10-4~1.5 x 10-3 mole/L의 농도가 되도록 조절하여 사용할 수 있다. 이때, 화합물(III)의 용해도를 증가시키기 위하여, 물과 혼합될 수 있고, 화합물(III)을 용해할 수 있는 극성 용매를 0~10% 첨가 할 수도 있다. 또한 혈액의 pH와 비슷한 pH=7.4로 용액의 산성도를 조절하기 위하여 완충용액(buffer solution)을 사용할 수도 있다. 이렇게 만들어진 혼합 용액은 수용액 중에 있는 글루코오스에 의하여 새로운 흡수밴드(absorption band)가 형성되며 이 흡수 밴드에서의 흡수도는 농도에 따라 증가를 하는 경향을 가지고 있다.
이하 본 발명은 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하느 것은 아니다.
〈실시예1〉
구조식 (I)의 화합물(R=에틸)을 다음과 같이 합성하였다.
아닐린-3-설폰 산(aniline-3-sulfonic acid) 10.42g과 NaHCO3 24.0 g 그리고 물 20.0 mL를 3구 플라스크(3-neck flask)에 투입하고 이산화탄소(carbon dioxide)가 완전히 발생할 때까지 교반한다. 이산화탄소가 더 이상 발생하지 않으면 2개의 투입구에 각각 냉각기(condenser)와 적하 깔때기(dropping funnel)를 장착하고 반응용기를 100 ℃로 가열한 뒤 다이에틸 설페이트 (diethyl sulfate) 24.6mL를 2 시간에 걸쳐서 투입하고 약 2시간동안 100 ℃에서 교반하여 반응이 완료시켰다. 이렇게 합성된 N,N-디에틸아미노벤젠-3-설폰 산 (N,N-diethylaminobenzene-3-sulfonic acid)는 정제하지 않고 그대로 다음 반응에 사용한다.
황산(sulfuric acid) 36 mL을 플라스크에 넣고 0 ℃로 냉각하고 기계식 교반기(mechanical stirrer)로 교반하면서 NaNO3 4.97 g을 투입하여 니트로실설폰 산(nitrosylsulfuric acid)을 생성하였다. 다음, 4-아미노피리딘 5.65g을 아세트산(acetic acid) 12 mL와 프로피온산(proplonic acid) 48 mL에 녹인 용액을 0~5 ℃에서 투입하여 4-아미노피리딘의 다이아조늄 염(diazonium salt)을 생성하였다. 앞에서 합성한 N.N-디에틸아미노벤젠-3-설폰 산(N,N-diethylaminobenzene-3-sulfonic acid)용액을 플라스크에 넣고 pH=4.6-4.7이 되게 조절하면서 다이아조늄 염(diazonium salt)을 0-5 ℃에서 서서히 투입하여 구조식 (I)의 염료를 생성하였다. 합성된 염료는 염석(saltingout)으로 처리하여 고형 침전물로 수득하였다. 이 고체는 NaCl 및 Na3SO4를 함유하고 있으므로 메탄올(methanol)을 사용하여 재결정화(recrystallization)하면 순수한 물질을 65%의 수율로 얻었다.
〈실시예2〉
구조식 (II)의 화합물 (R=에틸(ethyl))을, 아닐린-2-설폰 산을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 방법으로 합성하였다. 합성된 염료를 염석-재결정(salting out-recrystallization)의 과정을 통해 분리하였다. 수율 60%.
〈실시예3〉
화합물 (I) (R=에틸)과 화합물 (III)의 혼합 수용액은 다음과 같이 만든다.
화합물 (I) (R=에틸) 0.04g 및 화합물 (III)(m-nitrophenylboronic acid) 0.167 g을 pH=7.4인 포스페이트 완충 용액(phosphate buffer)을 사용하여 최종 부피 1000 mL로 만들어 주고 잘 교반한다.
〈실시예4〉
화합물 (I) (R=에틸) 0.2g 및 화합물 (III) (m-nitrophenylboronic acid) 0.84g을 pH=7.4인 포스페이트 완충 용액(phosphate buffer)을 사용하여 최종 부피 1000mL로 만들어 주고 잘 교반한다.
〈실험예1〉
실시예 3에서 얻은 용액에 글루코오스를 첨가하여 농도가 각각 10, 20 및 30 mM인 용액을 얻었다. 이의 흡광 스펙트럼을 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 그래프에서 나타난 바와 같이, 글루코오스의 농도가 0 mM일 경우에는 노란색 용액으로서 염료의 최대 흡수 파장이 450mm에서 판독되었지만,글루코오스의 농도가 10, 20 및 30 mM로 증가함에 따라 540mm에서 새로운 흡수대가 나타나 용액의 색상이 노란색에서 자주색으로 변화함을 알 수 있으며 이는 육안으로도 쉽게 그 변화를 알 수 있다. 글루코오스의 농도에 따른 540 mm에서의 상대 흡광도 비를 그래프로 나타내면 도 2와 같다.
〈실험예2〉
실시예 4에서 얻어진 용액에 글루코오스를 첨가하여 농도가 각각 10, 20 및 30 mM 농도가 되도록 하여 각각에 대한 흡광 스펙트럼을 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 그래프에서 나타난 바와 같이, 글루코오스의 농도가 0 mM일 경우에는 염료의 최대 흡수 파장이 540 mm로서 자주색의 용액이다. 글루코오스의 농도가 10, 20 및 30 mM로 증가함에 따라 540 nm의 흡수도가 증가함을 알 수 있으며 이는 육안으로도 쉽게 그 변화를 알 수 있다. 글루코오스의 농도에 따른 540nm에서의 상대 흡광도 비를 그래프로 나타내면 도 4와 같다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 염료는 전술한 공지의 방법 [Kuomoto et al., Supramolecular Chemisty 9,203(1998)]에서 사용된 염료에 비하여 물에 대한 용해도가 매우 크다는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명에 의한 염료와 화합물 (III)의 혼합용액은 혈액과 마찬가지로 수용액이므로 전술한 공지의 혼합물에 비하여 혈중 글루코오스의 농도를 측정하기가 용이하다.
따라서, 본 발명에 의한 염료와 혼합물 용액은 최근에 급증하고 있는 당뇨병 환자의 혈중 글루코오스 농도를 측정하는 데 효과적으로 사용될 수 있다는 장점을 가지고 있다.

Claims (10)

  1. 하기 구조식(I)로 표시되는, 수용성 아조 화합물,
    상기식에서 R은 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 하이드록시알킬기, 카르복실기를 함유하는 알킬기, 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기이다.
  2. 하기 구조식(II)로 표시되는, 수용성 아조 화합물,
    상기식에서 R은 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 하이드록시알킬기, 카르복실기를 함유하는 알킬기, 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기이다.
  3. 4-아미노피리딘을 다이아조화하여 다이아조 중간체를 생성하는 단계;
    다이아조 중간체를 알킬화된 메타닐산(alkylated metanilic acid)과 커플링 반응하여 염료를 합성하는 단계; 및
    합성된 염료를 염석으로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 구조식 (I)으로 표시되는 수용성 아조 염료를 제조하는 방법,
    상기식에서 R은 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 하이드록시알킬기, 카르복실기를 함유하는 알킬기, 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기이다.
  4. 4-아미노피리딘을 다이아조화하여 다이아조 중간체를 생성하는 단계;
    상기 다이아조 중간체를 알킬화된 오타닐 산과 커플링 반응을 수행하여 염료를 합성하는 단계; 및
    합성된 염료를 염석으로 분리하는 단계를 포함하는, 상기 구조식 (II)로 표시되는, 수용성 아조 염료를 제조하는 방법,
    상기식에서 R은 탄소수 1 내지 4의 알킬기, 하이드록시알킬기, 카르복실기를 함유하는 알킬기, 또는 설포닐기를 함유하는 알킬기이다.
  5. 제 3 또는 4 항에 있어서, 다이아조화 반응은 염산(hydrochloric acid), 황산(sulfuric acid), 인산(phosphoric acid) 및 황산-아세트산-프로피온산(sulfuric acid-acetic acid-propionic acid) 혼합물로 구성되는 군에서 선택된 산과 아질산 나트륨(sodium nitrite)을 0-5 ℃에서 4-아미노피리딘 존재하에서 반응시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수용성 아조 염료를 합성하는 방법.
  6. 제 3 또는 4 항에 있어서, 커플링 반응은 0-5 ℃에서 알킬화된 메타닐산 또는 알킬화된 오트닐산을 물에 분산하고, 상기 다이아조 중간체(intermediate)를 서서히 가하면서 NaOH 용액을 사용하여 pH 3-5로 조절하는 것을 특징으로 하는, 수용성 아조 염료를 합성하는 방법.
  7. 제 3 또는 4 항에 있어서, 상기 염석은 KCl 또는 NaCl을 사용하여 염료와 무기염의 혼합물을 얻고, 이를 에탄올, 메탄올 및 아세톤류로 구성된 군으로부터 선택된 극성 유기용매로 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 2 항의 화합물과 하기 구조식(III)의 화합물의 상대적인 비가 50∼150배인, 수용액 글루코오스 농도 측정용 혼합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 완충 용액으로 pH 7.4로 조절된, 혈중 글루코오스를 측정하는 혼합물.
  10. 제 8 또는 9 항의 수용성 혼합물을 사용하여 수용액의 글루코오스 농도를 500 내지 560 nm 범위 파장의 빛으로 측정하는, 수용액 글루코오스 농도 측정 방법.
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