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Neue Aminoantipyrin-Verbindungen und ihre Verwendung
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Die Erfindung betrifft neue Aminoantipyrin-Verbindungen der allgemeinen
Formel
in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 C-Atomen oder die Gruppe N(R2)2, in der R2
ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 C-Atomen oder eine Acylgruppe
mit 1 bis 3 C-Atomen bedeutet, darstellt und R1 die gleiche Bedeutung wie R hat
oder ein Wasserstoffatom ist, und deren Verwendung als Chromogene.
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11202 ist das Reaktionsprodukt zahlreicher enzymatischer Reaktionen,
an denen Oxidasen beteiligt sind. Solche Reaktionen, wie beispielsweise die Oxidation
von Glycerin durch Glycerinoxidase oder von Cholesterin durch Cholesterinoxidase,
sind für die Analytik und'hier besonders für die medizinische Diagnostik von großer
Bedeutung.
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Bekannte Verfahrenzur Bestimmung von enzymatisch gebildetem H202 basieren
auf titrimetrischen, potentiometrischen, polarographischen und colorimetrischen
Methoden, sowie auf enzymatischen Methoden, wobei die Enzyme Katalase oder Peroxidase
verwendet werden. Bei der enzymatischen Bestimmunq mittels Peroxidase werden als
Indikatoren Chromogene eingesetzt, die mit H2°2 in Gegenwart der Peroxidase unter
Bildung eines Farbstoffs reagieren, der photometrisch bestimmt werden kann. Ein
bekanntes derartiges Reagenz zur H202-Bestimmung enthält das Indikatorsystem nach
Trinder (amin. Clin. Biochem. 6 (1969), 24-27), beim dem Phenol mit 4-Aminoantipyrin
als Chromogene in Gegenwart von Peroxidase unter Einwirkung von H202 oxidativ zu
einem Farbstoff gekuppelt werden, der photometrisch bestimmt wird. Anstelle von
Phenol können auch andere phenolische Verbindungen verwendet werden.
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Ein Nachteil des 4-Aminoantipyrins als Chromogen in der oben beschriebenen
H202-Bestimmung besteht in einer mangelhaften Stabilität des gebildeten Farbstoffs.
Da bei Testsystemen angestrebt wird, gegen den Reagenzienleerwert zu messen, bedeutet
selbst eine scheinbar geringe Verbesserung der Farbstabilität einen großen Praktikabilitatsvorteil,
z. B. durch die Ermöglichung längerer Ablesezeiten.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen
zu schaffen, die als Chromogene bei der HZ02-Bestimmung anstelle von 4-Aminoantipyrin
verwendet werden können und bessere Farbstabilitäten der bei der oxidativen Kupplung
mit einer phenolischen Verbindung gebildeten Farbstoffe aufweisen.
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Gelöst wird diese Aufgabe durch die oben beschriebenen
neuen
Verbindungen; bei denen es sich um Derivate des 4-Aminoantipyrins handelt. In diesen
Verbindungen können die Substituenten R und Ra jede Position im Phenylrest einnehmen.
Bevorzugt werden auf grund der leichteren Zugänglichkeit Verbindungen, in denen
die Reste R und R1 in p- oder/und o-Position stehen.
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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann nach an sich
bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise durch Nitrierung von Antipyrin mit zwei
Äquivalenten Salpetersäure unter Bildung von Dinitroantipyrin und Reduktion der
Nitrogruppen zu den entsprechenden Aminogruppen, beispielsweise mittels Zinkstaub.
Die Wasserstoffatome der phenylischen Aminogruppe lassen sich nach Maskierung der
Aminogruppe in Position 4 des Antipyrins, beispielsweise durch Bildung der Schiff'schen
Base mit Benzaldehyd, mit einem Alkylierungsmittel, wie Alkyljodid, oder mit einem
Acylierungsmittel, wie z. B. Essigsäureanhydrid, alkylieren bzw. acylieren. Die
erfindungsgemäßen Derivate, in denen R oder R1 eine Alkylgruppe darstellt, werden
zweckmäßig von den entsprechenden alkylierten Phenylpyrazolonen ausgehend in analoger
Weise hergestellt.
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Aufgrund der besseren Farbstabilität der Farbstoffe, die durch die
erfindungsgemäßen Verbindungen bei der oxidativen Kupplung mit einer phenolischen
Verbindung und H202 und Peroxidase gebildetet werden, eignen sich die erfindungsgemäßen
Verbindungen besonders zur Verwendung in Verfahren und Reagenzien zur enzymatischen
Bestimmung von H202. Bei dieser Verwendung können die üblichen phenolischen Verbindungen,
die mit 4-Aminoantipyrin unter Farbstoffbildung gekuppelt werden können, verwendet
werden. Bevorzugt wird als phenolische Verbindung p-Chlorphenol. Beispiele für andere
geeignete Verbindungen sind Phenol selbst, andere Phenolderivate, Anilinderivate,
Naphthol,
Naphtholderivate, Naphthylamin, Naphthylaminderivate, Aminochinoline, Hydroxychinoline,
Dihydroxyphenylessigsäure und ähnliche. Die Umsetzung wird in gepufferter Lösung
durchgeführt. Als Puffersubstanzen und pH-Werte eignen sich die für Peroxidase bekannten
diesbezüglichen Bedingungen. Bevorzugt werden pH-Werte zwischen 6 und 9. Im übrigen
ist die Wahl des Puffers und des pH-Werts im Falle einer vorgeschalteten, H2°2 bildenden
enzymatischen Reaktion vor allem durch die Anforderungen hinsichtlich Puffer und
pH-Wert der daran beteiligten Enzyme bedingt. Diese Bedingungen sind sämtlich dem
Fachmann bekannt und bedürfen daher hier keiner näheren Erläuterung.
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Ein Reagenz zur Bestimmung von H2O2 auf Basis Peroxidase, wenigstens
einer erfindungsgemäßen Verbindung, wenigstens einer phenolischen Verbindung und
Puffersubstanz kann zusätzlich noch übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/
und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Besonders geeignet erwiesen sich dabei
folgende Mengenverhältnisse der essentiellen Bestandteile dieses Reagenz: o,5 bis
loo U/ml Peroxidase, o,o5 bis 20 mMol/l erfindungsgemäße Verbindung, o,5 bis 50
mMol/l phenolische Verbindung.
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Oberflächenaktive Mittel werden, wenn sie zugegen sind, vorzugsweise
in Mengen von o,ool bis o,i g/ml, bezogen auf gebrauchsfertige Reagenzlösung, eingesetzt.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
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B e i s p i e 1 1.
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A. Dinitroantipyrin
Chemikalien: 5 g (# o,o268 mol) Antipyrin 3,7 ml = 3,38 g (- 2xo,o268 mol) 65 %
HNO3 36 ml konzentrierte Schwefelsäure Ausführung: 5 g Antipyrin in 30 ml konzentrierter
H2S04 lösen, dazu 3,7 ml konzentrierte HNO3 und 6 m H2S04 (Antipyrin erhitzt sich
beim Lösen in H2SO4 auf # 40°C), HN03/H2S04 unter Eiskühlung eintropfen (Temperatur
max.
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+ 10°C). Anschließend langsam erwärmen und 30 Minuten auf kochendem
Wasserbad halten (Ansatz wird immer dunkler), abkühlen, auf Eis gießen (~ 1 1),
roter Niederschlag, absaugen, aus Eisessig umkristallisieren.
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Ausbeute: 4,9 g
B. Diaminoantipyrin
Chemikalien: 4 g Dinitroantipyrin (# o,o144 mol) 8 g Zinkstaub (# o,123 mol) Ausführung:
4 g Dinitroantipyrin in 50 ml konzentrierter HCI lösen unter Kühlung (max. 20°C),
Zugabe von Zinkstaub (N 8 g) bis Lösung farblos ist. Mit 40 %-iger NaOH/NaOH-Plätzchen
bis pH 7, dicker Niederschlag fällt aus, läßt sich schlecht absaugen (mit CHCl3
läßt sich nicht mehr viel extrahieren).
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Mutterlauge auf pH 11,5 stellen mit CHCl extrahieren, 3 einengen.
Probe löst sich in H20, gibt mit DCP/FEC13 dunkelrote Farbe.
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Ausbeute: o,4 g
B e i s p i e l 2 A. Herstellung der
4-Benzalverbindung des 1-(p-Aminophenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-pyrazolon-5 (II).
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1,o9 g (5 mmol) Diaminoantipyrin (I) werden in 15 ml H20 gelöst und
mit 1 n Natronlauge auf pH 1o eingestellt. Dazu werden o,53 ml (5 mmol) Benzaldehyd
gegeben. Die Mischung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Danach
wird das kristalline Produkt abgesaugt und mit Wasser und Äther nachgewaschen.
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Ausbeute: 82 t.
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Die erhaltene Substanz (II) wird ohne weitere Reinigungsschritte für
die folgenden Umsetzungen verwendet.
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B. 4-Benzalverbindung des 1- (p-Diäthylamino-phenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-pyrazolon-5
9,18 g 4-Benzalverbindung des Diaminoanipyrins (o,o3 mol) werden unter Rückfluß
in 250 ml Äthylenglykoldimethylä.ther gelöst. Anschließend wird auf 600 abgekühlt.
Danach erfolgt die Zugabe von
56 g Kaliumcarbonat sowie 14,6 ml
= 28,o g Athyljodid (o,18 mol).
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Es wird 9 Stunden unter Rückfluß gekocht, und danach vom Kaliumcarbonat
abgesaugt. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne gebracht.
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Rückstand: 12,16 g Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule chromatographiert
(Äthanol). Die chromatographisch reinsten Fraktionen werden aus Diäthyläther zur
Kristallisation gebracht.
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Ausbeute: 3,1 g DC-Befund: einheitlich.
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C. 1 - (p-Diäthylamino-phenyl) -2, 3-dimethyl-4-amino-pyrazolon-5
1,0 g des Pro@@@@ von Stufe 2 werden in 35 ml Salzsäuren @@@ bei Raumtemperatur
gelöst und anschließend 2,5 Stunden verrührt. Die eintretende BV-Spaltung wird chromatographisch
verfolgt.
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Zur Abtrennung des Benzaldehyds wird dreimal mit je 30 ml Chloroform
angerührt. Danach wird die saure, wäßrige Phase mit @@@@nlauge (33 %) auf den pH-Wert
10,0
gebracht und erneut mit Chloroform (dreimal je 30 ml) extrahiert.
Das Chloroform wird im Vakuum abgezogen.
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Rückstand: o,855 g Dieser wird einer erneuten Kieselgelbehandlung
unterzogen (Chloroform/Äthanol 1 : 1).
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Die Ausbeute an chromatographisch einheitlicher Substanz beträgt o,356
g MS: 274 Beispiel 3 A. 4-Benzalverbindung des 1-(p-Acetamino-phenyl)-2,3-dimethyl-
4-aminopyrazolon- 5 15,3 g Benzalverbindung des Diaminoantipyrins (1/20 Mol) werden
in 60 ml Dimethylformamid bei 45 bis So0 gelöst.
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Bei Raumtemperatur erfolgt die Zugabe von 10,2 g Acetanhydrid. Dabei
steigt die Temperatur auf So0 an, und es tritt spontane Kristallisation ein. Nach
2 Stunden wird das Kristallisat abgesaugt und mit DMF gewaschen.
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Die Substanz ist chromatographisch rein.
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Ausbeute: 14,6 g Fp. 279 bis 2820 MS: 348 B. 1-(p-Acetamino-phenyl)-2,3-dimethyl-4-aminopyrazolon-5
10,0 g des Produkts der Stufe A. werden in 350 ml Salzsäure (2
n) bei Raumtemperatur gelöst und anschließend auf loOC abgekühlt. Dabei tritt die
Spaltung der Benzalverbindung ein. Sie ist nach einer Stunde beendet.
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Zur Entfernung des Benzaldehyds wird die saure Lösung mit Chloroform
extrahiert. Anschließend wird bei Raumtemperatur mit Natronlauge der pH-Wert auf
10,0 bis 11,o eingestellt und die alkalische Lösung mit NaCl gesättigt. Anschließend
erfolgt eine erneute Chloroformextraktion. Das Chloroform wird im Vakuum abgezogen.
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Rückstand: 6,1 g.
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Es wird aus 36 ml Äthanol umkristallisiert.
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Ausbeute: 3,6 g Fp. 2100 (Z) MS: 260 Chromatographisch einheitlich.
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Beispiel 4 1-(Amino-p-tolyl)-2,3-dimethyl-4-amino-pyrazolon-5 Die
Synthese erfolgt gemäß nachstehendem Reaktionsschema:
Ausgangsmaterial (Hoechst) Fp 128-1320 Fp 132-1340 Fp 274-275° Fp 165-169 MG 202
MG 292 MG 232
A. 1-(p-Tolyl)-2,3-dimethyl-pyrazolon-5 18,8 g 1-(p-Tolyl)-3-methyl-pyrazolon-5
werden bei 11o bis 1150C teilweise geschmolzen und innerhalb von 30 Minuten mit
10,5 ml Dimethylsulfat (o,11 Mol) tropfenweise versetzt. Danach wird 5 Stunden auf
17o0C erhitzt.
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Anschließend erfolgt nach dem Abkühlen unter looOC die Zugabe von
35 ml Wasser. Danach wird weitere 5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen
auf 3o0C erfolgt die Zugabe von 25 ml Natronlauge (33 %). pH-Wert = 1o,o bis 11,o.
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Es wird erneut 5 Stunden bei 9o bis 950C gerührt. Danach wird auf
Raumtemperatur abgekühlt und mit Chloroform (viermal je loo ml) extrahiert. Das
Chloroform wird im Vakuum abdestilliert.
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Rückstand: 19,9 g Fp. 132-1340 MS: 202 DC-Befund: einheitlich.
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B. Dinitroverbindung des 1-(p-Tolyl)-2,3-dimethylpyrazolon-5 10,73
g des Produkts von Stufe A. werden bei 250C in 60 ml Schwefelsäure (konz) eingetragen.
Anschließend wird innerhalb von 2 Stunden ein Nitriergemisch von 8,oS ml Salpetersäure
(65 %) sowie 12 ml Schwefelsäure (konz) zugetropft unter Eiskühlung. Die Temperatur
soll 5 bis 7°C betragen. Im Anschluß daran wird 30 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt
sowie weitere 30 Minuten auf looOC erhitzt.
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Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Lösung auf o,5 kg Eis gegeben.
Nach einer weiteren Stunde wird das Kristallisat abgesaugt. Es wird aus 280 ml Eisessig
um-
kristallisiert.
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Ausbeute: 11,5 g Fp. 274-2750 MS, 292 C. 1-(Amino-p-tolyl)-2,3-dimethyl-4-aminopyrazolon-5
10,3 g des Produkts von Stufe B werden in 95 ml Salzsäure (konz)-bei Raumtemperatur
gelöst. Unter Rühren werden zwischen 5-25 0C (Eiswasserkühlung) innerhalb von 1,5
Stunden 30 g Zinkstaub bis zur Entfärbung der Lösung eingetragen. Danach werden
bei Raumtemperatur 20 g Soda sowie insgesamt 45 g Ätznatron (Schuppen) zugesetzt.
Der pH-Wert soll über 10,0 liegen.
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Der dicke Brei wird bei 40°C im Vakuumschrank zur Trockne gebracht.
Der trockene Rückstand wird pulverisiert und anschließend mit Chloroform 3 Stunden
extrahiert.
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Rückstand: 7,47 g Die Umkristallisation erfolgt aus 27,5 ml Äthanol.
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Ausbeute: 4,o g Fp. 165-1690 MS: 232 DC-Befund: einheitlich.
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B e i s p 1 e 1 5 1-(o-Äthyl-amino-phenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-pyrazolon-5
Die Synthese erfolgt gemäß nach stehendem Reaktionsschema:
Ausgangsmaterial (Hoechst) Fp 128-130 Fp 61-61,50 Fp 269-272° Fp 179-181° MG 216
MG 306 MG 246 A. 1-(o-Äthyl-phenyl)-2,3-dimethyl-pyrazolon-5-Die Methylierung in
2-Position erfolgt wie in Beispiel 4, A. beschrieben.
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Einsatz: 20,2 g 1-(o-Äthyl-phenyl)-3-methyl-pyrazolon-5 (o,1 Mol),
10,5 ml Dimethylsulfat (o,11 Mol).
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Die Substanz wird beim Erhitzen auf 170°C (5 Stunden) fest. Die zum
Lösen notwendige Wassermenge beträgt 60 ml. Rückstand nach der Chloroform-Extraktion
= 20,4 g.
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Die Reinigung erfolgt an einer Kieselgelsäule.
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Ausbeute: 16,7 g. ' Fp. 61-61,5° MS: 216 DC-Befund: einheitlich.
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B. Dinitroverbindung des 1-(o-Äthyl-phenyl)-2,3-dimethyl-pyrazolon-5
Die Nitrierung wurde wie in Beispiel 4, B beschrieben durchgeführt.
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Einsatz: 11,47 g 1-(o-Äthyl-phenyl)-2,3-dimethyl-pyrazolon-5 60 ml
Schwefelsäure (konz) 8,o5 ml Salpetersäure (65 %) 12 ml Schwefelsäure (konz)
Nitriergemisch Rückstand: 14,7 g Die Umkristallisation erfolgte aus Eisessig (390
ml).
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Ausbeute: 11,o7 g Fp. 269-272° MS: 306 C. 1-(o-Äthyl-amino-phenyl)-2,3-dimethyl-4-aminopyrazolon-5
Die Reduktion der Dinitroverbindung wurde wie in Beispiel 4, C beschrieben durchgeführt.
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Einsatz: 10,8 g Dinitroverbindung, 235 ml Salzsäure 36,5 g Zinkstaub
20 g Soda
100 g Ätznatron (Schuppen) Chloroformrückstand: 7,7 g
Umfällung aus Chloroform/Diisopropyläther. Dazu werden 6,o g des Rückstands in 140
ml Chloroform gelöst und anschließend mit 200 ml Diisopropyläther gefällt.
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Ausbeute: 5,3 g Fp. 179-181° MS: 246 DC-Befund: einheitlich.
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Beispiel 5 Bestimmung der H2O2-Bildung bei der Oxidation von Glycerin
durch Glycerinoxidase.
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Es werden zwei Reagenzien hergestellt: Reagenz 1: o,1 Mol/l Triäthanolamin/KCl-Puffer,
pH 8,o 3,6 mMol/l bzw. 2 g/l Isotridecyläther 4,7 mMol/l bzw. 2 g/l Natriumcholat
10 mMol/l p-Chlorphenol o,5 mMol/l aminosubstituiertes 4-Aminoantipyrin 10 U/ml
Peroxidase Reagenz 2: 500 U/ml Glycerinoxidase Zur Durchführung der Bestimmung werden
2 ml Reagenz 1 und 0,2 ml Reagenz 2 in eine Küvette pipettiert. Die Extinktion E1
wird am Photometer bei 546 nm abgelesen.
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Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 20 Al Probe gestartet.
Nach 20 Minuten Reaktlonszeit wird die Extinktion E2 abgelesen. Die Inkuhationstemperatur
beträgt
250C.
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Die Auswertung erfolgt über eine Eichgerade, bei der die gemessene
Extinktionsdifferenz AE = E2 - E1 einer Glycerinstandardlösung zur Glycerinkonzentration
in Beziehung gesetzt wird.
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Die Konzentrationen im Testansatz betragen: o,o9 Mol/l TriäthanolaminjHCl-Puffer,
pH 8,o 1,8 g/l (3,2 mMol/l) Isotridecyläther 4,3 mMol/l Natriumcholat 9 mMol/l p-Chlorphenol
o,45 mMol/l aminosubstituiertes 4-Aminoantipyrin 9 U/ml Peroxidase 45 U/ml Glycerinoxidase.
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Beispiel 7 Es wurde die Farbstabilität von fünf erfindungsgemäßen
Verbindungen untersucht. Als Vergleichsverbindungen wurden eingesetzt: 4-Aminoantipyrin
und sulfoniertes 4-Aminoantipyrin.
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Mit diesen Vergleichsverbindungen und den neuen Verbindungen wurden
bei Einsatz von p-Chlorphenol 2,4-Dichlorphenol und Äthylhydroxytoluidin (sulfoniert)
als phenolischer Kupplungspartner die Extinktion #, die Stabilität des entstaidenen
Farbstoffs und Ä max ermittelt.
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Das Testsystem bestand aus H2O2/POD/Farbkommponenten.
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Testdurchführune3: Es wurden folgende Reagenzien verwendet: Reagenz
1: o,1 Molil kaliumphosphatpuffer, pH 8,o 0,1 mMol/l 4-Aminoantipyrin-Derivat
1,o
mMol/l Phenolkomponente 2 U/ml POD Reagenz 2: o,ol Mol/l H202-Lösung Bestimmungsansatz:
Meßstrahlung: Hg 546 nm; Schichtdicke der Küvette: 1 cm; Inkubationstemperatur:
Raumtemperatur.
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2,o ml des Reagenz 1 werden in die Küvette pipettiert, lo/ul Reagenz
2 (Probe) werden zugesetzt und gemischt. Die Extinktion wird über 70 Minuten verfolgt.
Pro Bestimmung wird ein Leerwert bestimmt. Hierbei wird Puffer statt der H2 O2-Lösung
zum Reagenz 1 zugesetzt.
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Die Ergebnisse sind in der nachstehend-n Tabelle zusammengefaßt. Die
Prozentangabe der Farbstabilität (60 Minuten bei Raumtemperatur) bezieht sich auf
die Abweichung hinsichtlich des Meßsignals, das durch H202 entsteht. Aus der Tabelle
ist ersichtlicn, daß Amax durch die neuen Verbindungen der Erfinduna nur unwesentlich
beeinflußt wird, ebenso der £-Wert. Eindeutig überlegen sind die neuen Verbindungen
der Erfindung den Vergleichsverbindungen hinsichtlich der Farbstabilität.
TABELLE
Phenolische Kupp- Vergleich E r f i n d u n g s g e m ä ß |
4-Amino- 4-Amino- 4-Amino- 1-(o-Äthyl- 1-(p-Acet- 1-(Amino-p-
1-(p-Diäthyl- |
antipy- antipy- antipy aminophenyl)- aminophenyl)- tolyl)-2,3-
aminophenyl)- |
rin rin (sul- rinamin 2,3-dimethyl- 2,3-dimethyl- dimethyl-4-
2,3-dimethyl- |
foniert 4-aminopyra- 4-aminopyra- aminopyra- 4-aminopyra- |
zolon-(5) zolon-(5) zolon-(5) zolon-(5) |
p-Chlorphenol |
# (cm²/µMol) 12 12 14 9 19 20 19 |
Farbstabilität + 5 % + 4 % + 1 % + 0 % + 0 % + 0 % + 1 % |
# max 500 502 505 503 502 503 |
2,4-Dichlorphenol |
# (cm²/µMol) 10 18 27 25 22 15 41 |
Farbstabilität + 2 % + 7 % + 1 % - 1 % + 0 % + 2 % + 1 % |
#max 505 507 508 507 508 502 |
Äthylhydroxy- |
toluidin (sul- |
foniert) |
#(cm²/µMol) 33 32 36 23 25 25 37 |
Farbstabilität + 16 % - 11 % - 2 % - 3 % - 7 % - 5 % - 4 % |
#max 550 546 550 548 546 550 546 |