JPS60248674A - 新規アミノアンチピリン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般式： 式 〔式中、ＲはＮ（Ｒ２）２基（ここで、それぞれのＲ２
は炭素原子数１〜６のアルキル基又は炭素原子ａ１〜乙
のアシル基を表わし、かつＲ２の１つは水素を表わして
もよい）を表わし、Ｒ１はＲと同じものを表わす（しか
しそれぞれのＲ２は水素でよい）か又は炭素原子数１〜
３のアルキル基又は水素原子を表わす〕の新規アミノア
ンチピリン化合物に関する。

Ｈ２Ｏ２はオキシダーゼが関与する多数の酵素反応の反
応生成物である。例えはグリセリンオキシダーゼによる
グリセリンの酸化又はコレステリンオキシダーゼによる
コレステリンの酸化のような反応は分析及びここでは特
に医学上の診断学において非常に重要である。

酵素的に生じたＨ２Ｏ２の公知測定法は滴定法、ボテン
シオメトリー、ポーラログラフ法及び比色定蓋法並びに
酵素カタラーゼ又はペルオキシダーゼを使用する酵素法
を基礎とする。ペルオキシダーゼを用いての酵素的測定
法においてはペルオキシダーゼの存在下にＨ２Ｏ２と反
応し、測光法により測定することのできる色素を形成す
る色原体を指示薬として使用する。Ｈ２Ｏ２−測定のた
めのこの種の公知の試薬はトリンダー（Ｔｒｉｎａｅｒ
　、　Ａｎｎ、　Ｃ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第６巻
（１９６９年）、第２４〜２７頁）による指示薬システ
ムを包含し、このシステムにお（・てはペルオキシダー
ゼの存在下にフェノールを色原体の４−アミノアンチピ
リンとＨ２Ｏ２の作用下に酸化的に結合させ、測光法に
より測定する。

フェノールのかわりに他のフェノール化合物を使用して
もよい。

前記のＨ２Ｏ２−測定にお（・て、色原体としての４−
アミノアンチピリンの欠点は形成される色素の安定性か
低いということである。試験システムにおいて試薬９値
に対して測定することが必要であるので、色素安定性の
外見上値かな改良も、例えばより長い睨み取り時間を可
能とすることにより大きな実施上の利点となる。

従って本発明の課題はＨ２Ｏ２測定の際に色原体として
４−アミノアンチピリンのかわりに使用することかでき
、かつフェノール性化合物と酸化的に結合して生じる色
素かより良い色安定性を示すような新規の化合物を作る
ことである。

この課題は４−アミノアンチピリンの誘導体である前記
の新規化合物により解決する。この化合物において置換
分Ｒ及びＲ１はそれぞれフェニル基中のすべての位置で
あってよい。容易に入手可能であるので、式中のＲ及び
Ｒ１がパラ位及び／又はオルト位にあるのが有利である
。

本発明による化合物の製造は自体公知法により行なうこ
とかできる。例えば硝酸２倍当爺を用いてアンチピリン
をニトロ化し、ジニトロアンチピリンを形成し、例えば
亜鉛粉末を用いてニトロ基を還元し相応するアミン基と
する。フェニル環のアミン基の水素を、アンチピリンの
４位のアミン基を例えばベンズアルデヒドとシッフの地
糸を形成することにより遮蔽した後、沃化アルキルのよ
うなアルキル化剤又は例えば無水酢酸のようなアシル化
剤でアルキル化もしくはアシル化する。本発明の誘導体
において、Ｒ又はＲ１がアルキル基を表わす場合、相応
してアルキル化したフェニルビラ・戸ロンかう出発し、
同様に製造するのが有利である。

フェノール系化合物及びＨ２Ｏ２及びペルオキシダーゼ
との酸化的結合の際、本発明の化合物により形成される
色素がより優ねた色安定性を有するので、本発明による
化合物は特にＨ２Ｏ２の酵素的測定のための方法及び試
薬に使用するために適している。この使用の際、４−ア
ミノアンチピリンと結合し、色素を形成するとどのでき
る常用のフェノール系化合物を使用することができる。

フェノール系化合物としてはｐ−クロルフェノールが有
利である）他の好適な化合物の例としてはフェノール自
体、他のフェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトー
ル、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミ
ン誘導体、アミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒ
ドロキシフェニル酢酸等である。この反応を緩衝溶液中
で実施する。緩衝剤及び−両値としてはペルオキシダー
ゼにとって公知の条件か好適である。６〜９０間の両値
が有利である。更に、Ｈ２Ｏ２形成酵素反応か前工程と
して行なわれる場合、緩衝剤及び−値の選択はこのＨ２
Ｏ２形成反応に関与する酵素の緩衝剤及びＰＨ値につい
ての必要条件により特に限定される。

この条件はすべて当業界の専門家にとって公知であるの
でここでは詳しく述べない。

ペルオキシダーゼ、本発明による化合物少なくとも１種
、フェノール系化合物少なくとも１種及び緩ｇ＃刑を基
礎とするＨ２Ｏ２の測定試薬は付加的に常用の浴剤、安
定化剤及び／又は界面活性剤を含有してよ（・。この際
、との試薬の生簀な成分の次の量比が特に好適であるこ
とが判明した： ベルオキシダーゼ　０．５〜１０Ｕｕ、ｉε、本発明に
よる化合物　０．０５〜２０ミリモル／！、フェノール
系化合物　０．５〜５０ミリモル／１０界面活性剤が存
在する場合、これを調剤済試薬俗液に関し０．００１〜
０．１ｇ／ｄの量で使用するのが有利である。

次に実施例につき、本発明を更に詳細に説明する。

例　１ Ａ、ジニトロアンチピリン ０２ Ｃ１１Ｈ１２Ｎ２０　Ｃ１１Ｈ１ＯＮ４０５試　薬： アンチピリン　５．９（−０，０２６８モル）６５％Ｈ
ＮＯ３３，７ｍＪ＝３−３８＃　（＝２ＸＯ−０６柾ル
）濃硫酸　６６ＷＬｅ 操　作： アンチピリン５ｇを濃Ｈ２ＳＯ４３０ｔｘｌ中に溶かし
くアンチピリンをＨ２ＳＯ，中に俗解させる際に、約４
０°Ｃまで温度上昇する）、濃ＨＮＯ３３，７ｍＡ及び
Ｈ２ＳＯ４６ｒｔｔｌから成る浴液を氷冷下に滴加する
（最高温度＋１０℃）。引き続きゆっくりと加温し、３
０分間沸騰水浴上に保持しく配合物はますます暗色とな
る）、冷却し、氷（約ＩＡ’）上に注ぐと赤色の沈殿が
生じるからこれを吸引濾過し、氷酢酸から再結晶させる
。

収量：　４．９　ｇ　融点：２７４〜２７６℃Ｂ、ジア
ミノアンチピリン 試桑ニ ジニトロアンチピリン　４ｎｙ　（”０．０１４４モ＃
）亜鉛末　８．９　（−０，１２３モル〕操　作： 濃ＨＣｌ５０１中にジニトロアンチピリン４ｇを冷却下
（最高２０℃）に浴かし、亜鉛末（約８ｇ）を溶液が無
色となるまで添加する。４０％ＮａＯＨ／　ＮａＯＨ−
錠でｐＨ７にすると、吸引濾過しにくい粘性の沈殿が析
出する（ＣＦＣｌ２でもはや多くは抽出されな（・）。

母液をｐＨ１１，５に調節し、ＣＨＣ／（３で抽出し、
これを濃縮する。試料をＨ２Ｏに浴かし、これはＤＣＰ
　／　ＦＢＣ１３で暗赤色を呈する。

収量：０．４，９．融点：２７７〜２８０°Ｃ例　２ Ａ、１−（ｐ−アミノフェニル）−２，３−ジメチル−
４−アミノ−ピラゾロン−５の４−ベンザル化合物（Ｉ
ｌｌの製法 ジアミノアンチピリンｔＩ１１．０９　ｇ（５ミリモル
）をＨ３ｏ１５ｍ中に浴かし、１　Ｎ　ＮａＯＨで−１
０に調節する。これにベンズアルデヒド０．５３ｄ（５
ミリモル）を加える。この混合物を２０時間室温で強力
に撹拌する。その後結晶性生成物を吸引濾過し、水及び
エーテルで後洗浄する。

収量＝８２％　−１１点：１９２〜１９６℃ＮＭＲ：　
−Ｃ−ＣＨ３（８，２−２−４ｐｐ、−ＮＣＨ３（ｓ、
３．１ｐｐｍ）、 力＝ルーＮＨ２（ｓ、５．３３ｐｐｍ）、−ツユ≧痣ペ
アー　（ｍ、７．６２ｐｐｍ）　、−ＣＨ＝　、　（Ｓ
、９．５７ｐｐｍ）、フエ二Ａ〜　（ｍ−６，８ｐｐｍ
）　。

得られた生成物ｔＵｔを更に精製することなしに次の反
応に使用する。

Ｂ、１−（ｐ−ジエチルアミノ−フェニル）−２，３−
ジメチル−４−アミノ−ピラゾロン−５の４−ベンずル
化合物 ジアミノアンチピリンの４−ベンずル化合物９．１８　
＆　（０，０３モル）を還流下にエチレングリコールジ
メチルエーテル２５０罰中に溶か１゜引き続き６０℃に
冷却する。その後、炭酸カリウム５６ｇ並びに沃化エチ
ル１４．６　ａｔ　＝　２８．０、Ｙ　（（：１．１８
モル）を加える。還流下に９時間煮沸し、その後炭酸カ
リウムから吸引濾過する。

この濾液を真空中で蒸発乾個する。

残分：１２．１６ｇ 残分をシリカゾルカラム上でクロマトグラフィーにかけ
る（エタノール）。クロマトグラフィーによりもつとも
純粋な７ラクシヨンをジエチルエーテルから結晶化させ
る。

収量：　３．１　ｇ　融点：１６５〜１６６°Ｃ分析Ｃ
２２Ｈ２７Ｎ４０　（分子量３６３）ＣＨＮ 計算値　７２．３　７．８　１５．３ 実測値　７１．３　７．１８　１５．１薄層クロマトグ
ラフィー所児：単一。

Ｃ，１−（ｐ−ジエチルアミノ−フェニル）−２，６−
シメチルー４−アミノ−ピラゾロン５ 工程２の生成物１．０ｇを塩酊４（２Ｎ）３５ｄ中に室
温で浴かし、引き続き２．５時間撹拌する。

行なわれるベンずル化合物−分解をクロマトグラフィー
により追跡する。ベンズアルデヒドの分離のためにはそ
れぞれクロロホルム６０鰹で６回攪拌し抽出を行なう。

その後酸性の水相を水酸化ナトリウム浴液（６６％ンで
ｐｉ−１１０，０とし、新たにクロロホルムで（それぞ
れ６０１で６回）抽出する。このクロロホルムを真空中
で留去する。

残分：Ｄ、８５５ｇ これを新たにシリカダル処理する（クロロホルム／エタ
ノール１：１）。

クロマトグラフィーにより単一な物質の収量は０．３５
６　、！ｉ’である。質量分析＝２７４゜例　６ Ａ、１−（ｐ−アセトアミノ−フェニル）−２，６−シ
メチル−４−アミノビラ・戸ロン−５の４−ベンずル化
合物 ジアミノアンチピリンのベンザル化合物１５．３，９　
（１／２０モル）を４５〜５０℃でジメチルホルムアミ
ド６０ｍｅ中に浴かす。室温で無水酢ｒｈ１０．２．＠
を加える。この隙温度は５０”Ｃに上昇し、自然に結晶
化する。２時間後にこの結晶を吸引濾過し、ジメチルホ
ルムアミドで洗浄する。この物質はクロマトグラフィー
により純粋である。

収量：　１４．６　＆ 融　点：２７９〜２８２°Ｃ 質量分析：６４８ Ｂ、１−（ｐ−アセトアミノ−フェニル）−２，３−ジ
メチル−４−アミノピラゾロン−５ＮＨ−Ａｃｅ　ｔｙ
ｌ 工程Ａの生成物１０．０．９を室温で塩ｆｉ＆（２Ｎ）
６５０祷中に浴かし、引き続き１０°Ｃに冷却する。こ
の際、ペンデル化合物の分割か起こる。

こねは１時間後に終了する。ベンズアルデヒドの除去の
ために、この酸性溶液をクロロホルムで抽出する。引き
続き、室温で水酸化ナトリウム溶液を用いて両値を１０
．０〜１１．０に調節し、このアルカリ性溶液をＮａＣ
ｌで飽和する。引き続き、新たにクロロホルム抽出を行
なう。このクロロホルムを真空中で留去する。

残分：　６．Ｉ　Ｆ これをエタノールろ６罰から再結晶する。

収量：　３．６．９ 融　点＝２１０°Ｃ（分解） 質量分析：２６０ クロマトグラフィーにより単一である。

例　４ １−（アミノ−ｐ−）リル）−２，３−ジメチル−４−
アミノ−ピラゾロン−５ 合成は次の反応式により行なわれる： Ａ、１−（ｐ−）リル）−２，３−ジメチル−ピラゾロ
ン−５ １−（ｐ−）リル）−６−メチル−ピラゾロン−５１８
゜８ｇを１１０〜１１５℃で部分的に浴融し、３０分か
けて硫酸ジメチル１０．５ｍ＃（０，１１モル）を滴加
する。その後、５時間１７０℃に加熱する。引き続き、
１００℃以下に冷却した後、水３５１を添加する。その
後、史に５時間還流下に加熱する。６０℃に冷却した後
、水酸化す）　ＩＪウム浴液（６６％）２５ｍｅの冷加
を行なう。ＰＨ値は１０．０〜１１．０である。

新たに９０〜９５°Ｃで５時間作拌する。その後、室温
に冷却し、クロロホルム（各１００ｙで４回）で抽出す
る。このクロロホルムを真空中で留去する。

残　分：　１　９．９　、！ｉ’ 融　点＝１６２〜１６４℃ 賀知：分析：２０２ 薄屑クロマトグラフィー所見：Ｊｆ７Ｕ−Ｂ、１−（ｐ
−）リル）−２，３−ジメチル−ピラゾロン−５のジニ
トロ化合物 工程Ａの生成物１０．７３．９を２５℃で硫酸（濃）６
０１中に溶解する。引き続き、硝酸（６５％）　８．０
５−並びに硫酸（濃）１２１からなるニトロ化混合物を
水冷下に２時間かけて滴加する。温度は５〜７℃である
のが良い。引き続き室温で６０分間、後攪拌を行ない、
更に６０分間１００℃に加熱する。

室温に冷却後、この溶液を氷０゜５ｋｇ上に注ぐ。

史に１時間後、結晶を吸引濾過する。氷酢酸２８０ｍ１
から、これを再結晶する。

収量：１１．５ｇ 融　点：２７４〜２７５℃ 質量分析＝２９２ Ｃ，１−（アミノ−１）−）リル）−２，３−ジメチル
−４−フ４フ４２１戸ロン−５工程Ｂの生成物１０．３
＆を室温で塩酸（濃）９ＳＷＬｅ中に浴かす。攪拌下に
５〜２５℃の間（水冷）で亜鉛末６０ｇを１．５時間か
けて溶液が脱色するまで加える。その後室温で炭酌ナト
リウム２０９並びに全体で苛性ソーダ４５９（Ｍ状物）
を添加する。…値は１０．０以上でなくてはならない。

濃い泥状物を４０°Ｃで真空箱中で乾燥させる。

乾燥した残分を粉末とし、引き続き、クロロホルムで６
時間抽出する。

残分：　７．４７　Ｎ 再結晶をエタノール２７．５ｍから行なう。

収　鴛：　４．０９ 融　点：１６５〜１６９℃ や算分析：２３２ 薄層クロマトグラフィー幼児：単一 ９１．１　５ １−（〇−エチルーアミノーフェニル）−２゜６−ジメ
チル４−アミノ−ピラゾロン−５合成を次式のように行
なう： Ａ、１−（ｏ−エチル−フェニル）−２，３−ジメチル
−ピラゾロン−５ ２位のメチル化は例４．Ａ、に記載したと同様にして行
なわれる。

配　合： １−（０−エチル−フェニル）−６−メチル−ピラゾロ
ン−５２０，２ｇ（０，１モル）、硫酸ジメチル１０゜
５ｍ（０，１１モル）。この物質は１７０℃（５時間）
に加熱すると固体となる。

俗解させるために必侠な水量は６０祷である。

クロロホルム抽出後の残分は２０．４　、Ｆである。

精製はシリカゲルカラム上で行なう。

収　量：　１　６．７．９ 融　点：６１〜６１．５℃ 賀箪分析：２１６ 薄層クロマトグラフィー所見：単− Ｂ、１−（ｏ−エチル−フェニル）−２，３−ジメチル
−ピラゾロン−５のジニトロ化合物このニトロ化は例４
、Ｂ、に記載されていると同様にＩ７て実施した。

配　合； １−（０−エチル−フェニル）−２，３−ジメチルビラ
を戸ロン−５１１，４７，９硫　ｒＲ（ｔｌｉｋ　）　
６０　ｗｔｔｔ残　分：　１４．７．９ 再結晶は氷酢酸から行なつｊこ（３９０ｍｌ）。

収量：１１．０７．９ 融　点：２６９〜２７２℃ ７Ｊ−賛分析：６０６ ｃ、１−（ｏ−エチル−アミノ−フェニル）＝２，６−
シメチルー４−アミノ−ビラ・戸ロン　５ ジニトロ化合物の還元は例４、Ｃ０に記載されていると
同様に実施した。

配　合ニ ジニトロ化合物　１０．Ｅｌ 塩酸　２３５ｍ１ 亜鉛末　３６．５　、Ｆ 炭酸ナトリウム　２０ｇ 苛性ソーダ（鱗秋物）　１００．９ クロロホルム残分：　７．７　ｇ クロロホルム／ジインプロピルエーテルカラの再沈殿。

そのためには残分６．ＯＩをクロロホルム１４０ｍｇ中
に浴かし、引き続きジイソゾロピルエーテル２００ｍＪ
で沈殿させる。

収　量：　５．３　＆ 融　点＝１７９〜１８１℃ 質量分析：２４６ 薄層クロマトグラフィー所見二単− 例　６（参考例） グリセリンオキシダーゼによるグリセリンの酸化におけ
るＨ２Ｏ２−形成の測定。

２ｆ４１Ｉの試薬を製造する： 試　薬１゜ トリエタノールアミン／ＨＣｌｌ−緩衝剤、Ｐ）１８．
ｏ　Ｏ，１モル／ｌイソトリデシルエーテル　６．６ミ
リモル／ｌもしくは２．！９／ｉｌコール酸ナトリウム
　４．７ミリモル／ｌもしくは２９／ｌｐ−クロルフェ
ノール　１０ミリモル／ｌアミノ置換　４−アミノアン
チピリン　０．５　ミリモル／ｌペルオキシダーゼ　１
０Ｕ／罰 試　薬２； グリセリンオキシダーゼ　５００　Ｕ／１ｔｔｌ測定を
実施するためには試薬１　２ｄ及び試薬２　０．２ｍｌ
をクベット中に測り入れる。吸光度Ｅｌを測光器上５４
６　ｎｍで測定する。引き続き、試料２０μノを添加し
、反応を開始する。

反応時間２０分後吸光度Ｅ２を読みとる。恒温保持温度
は２５℃である。

評価は、グリセリン標準溶液の測定吸光度差ムＥ　＝　
Ｅ２−　Ｅｌをグリセリン濃度に関連させた検量線を用
（・て行なわれる。

試験配合物中の濃度は次のようである。

トリエタノールアミン／ＨＣｌｌ−緩衝剤、ＦＪ−１８
，００，０９モジｔ イソトリデシルエーテル　１．８ｇ／ｌ　（３，２ミリ
モル／１１） コール酸ナトリウム　４．６ミリモル／ｌｐ−クロルフ
ェノール　９ミリモル／ｌアミノ置換４−アミノアンチ
ピリン　ｏ、４５ミリモル／ｌペルオキシダーゼ　９Ｕ
／鮮 グリセリンオキシダーゼ　４５Ｕ／ｍ１例　７（参考例
） 本発明による化合物５ａ類の色安定性を測定した。比較
化合物としては４−アミノアンチピリン及びスルホン化
４−アミノアンチピリンを使用した。

比較化合物及び新規化合物を用（・て、ｐ−クロルフェ
ノール、２．４−ジクロルフェノール及びエチルヒドロ
キシトルイジン（スルホン化）をフェノール性カップリ
ング成分として使用し、吸光度ε、生じた色素の安定性
及びλｍａｘを調べた。試験シスチンはＨ２ｏ２／ＰＯ
Ｄ／色成分がら成る。

試験操作： 次の試薬を使用した： 試　薬１ リン酸カリウ漬緩衝剤　ｐＨ８，ｏ　Ｏ，１モル／１４
−アミノアンチピリン誘導体　０．１ミリモル／ｌフェ
ノール成分　１．０ミリモル／１ ＰＯＤ　２Ｕ／ｍｌ 試　薬２ Ｈ２Ｏ２−浴液　０．０１モル／ｌ 測定操作： 測定光：　Ｈｇ　５４６　ｎｍ　；クベットの層厚：１
　ｃｍ　、’恒温保持温度：室温。

試薬１　２．０ｙｎｌをクベット中に測り取り、試薬２
（試料）１０μｌを添加し、混合する。吸光度を７０分
間の間追跡する。測定毎に９値を測定する。この際、Ｈ
２Ｏ２−溶液のかわりに緩衝剤を試薬１に添加する。

この結果を次の表に集めた。色安定性（室温で６０分）
のパーセント記載はＨ２Ｏ２により生じる測定シグナル
に関しての偏差に関する。この表からもわかるように、
λｍａｘは本発明の新規化合物によりほとんど影響を受
けす、かつε−値も同様である。色安定性に関しては本
発明の新規化合物は比較化合物に対し明らかに貴れてい
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： 〔式中、ＲはＮ（Ｒ２）２基（ここで、それぞれのＲ２
   は炭素原子数１〜６のアルキル基又は炭素原子数１〜乙
   のアシル基を表わし、がつＲ２の１つは水素を表わして
   もよい）を表わし、Ｒ１はＲと同じものを表わす（しか
   しそれぞれのＲ２は水素でよい）が又は炭素原子数１〜
   ３のアルキル基又は水素原子を表わす〕の新規アミノア
   ンチピリン化合物。