KR20010009554A - 세포 사멸 관련 유전자의 검색 키트 - Google Patents

세포 사멸 관련 유전자의 검색 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 사멸을 연구함에 있어서 가장 중요한 부분인 세포 사멸 관련 유전자들을 용이하게 검색할 수 있는 방법 및 검색 키트에 관한 것이다. 본 발명에서는 인간 유전자 중 FADD의 특정 부위가 인간과 대장균에서 동시에 세포 사멸 기능을 발휘할 수 있다는 사실을 발견하고 이를 이용하여 검색 키트를 개발한 것이다. 즉 이 유전자의 발현은 키트 내의 대장균을 사멸시키게 되고, 검색하려는 새로운 유전자가 세포 사멸의 억제 효과를 갖는 유전자인 경우 대장균 세포 사멸 기능이 억제될 것이다. 따라서 본 발명에서는 개발된 유전자 운반체에 검색하려는 외부의 유전자를 추가로 삽입하여 FADD 유전자와 동시에 T7 전사효소를 통해 발현할 수 있도록 고안하였다. 여기에 삽입된 유전자가 FADD 세포 사멸 기능을 억제하게 되면 대장균의 성장이 회복되고 이를 배양하여 DNA를 추출한 후 삽입된 유전자의 서열을 밝히면 새로운 세포 사멸 억제 유전자를 발견하게 되는 것이다.

Description

세포 사멸 관련 유전자의 검색 키트{A kit for detecting apoptosis related gene}
본 발명은 세포 사멸을 연구함에 있어서 가장 중요한 부분인 세포 사멸 관련 유전자들을 용이하게 검색할 수 있는 방법 및 검색 키트에 관한 것이다. 본 발명에서는 인간 유전자 중 FADD의 특정 부위가 인간과 대장균에서 동시에 세포 사멸 기능을 발휘할 수 있다는 사실을 발견하고 이를 이용하여 검색 키트를 개발한 것이다.
세포의 사멸 과정은 생명과학의 주요 연구 분야이자 인간의 생로병사에 직접적으로 관련되어 있다. 따라서 세포의 사멸은 암, 각종 퇴행성 질환들과 밀접하게 연관되어 있으며 이러한 질병에 대한 대처 방안을 강구하기 위해 국내외적으로 최근 많은 연구가 집중되고 있다. 그러나 세포의 사멸 과정은 다른 중요한 생물학적 과정들과 복잡하게 얽혀있어 아직 그 연구가 용이하지 않으며 특히 인간을 포함하는 고등 생물에 대한 세포 사멸 연구는 유전학적 접근이 불가능함으로 인해 연구에 진척이 매우 느리다.
본 발명은 이러한 어려움을 극복하기 위해 인간의 세포 사멸 유전자중 대장균의 경우에도 적용될 수 있는 유전자 부위를 발견하여 이를 이용함으로써 대장균 내에서 인간의 세포 사멸에 관여하는 주요 유전자들을 손쉽게 선별해 낼 수 있도록 고안하였다.
도 1은 pCAND1의 구성 사진이다. 본 재조합 DNA는 pET3d vector에 FADD-DED 유전자는 NcoI과 BamH1을, pET28a의 폴리클로닝(polycloning)부위는 XbaI과 XhoI을 이용하여 각각 삽입하였다.
도 2의 A는 T7 전사효소를 가지고 있는 대장균 BL21(DE3)에 FADD-DED를 포함하는 재조합 유전자 운반체를 제조하여 발현한 결과이다.
B는 대장균의 사멸시킨 FADD-DED 유전자를 인간세포에서 발현할 수 있는 유전자 운반체인 pcDNA3에 삽입하여 인간 세포인 헤라 세포(HeLa cell)에서 발현시킨 결과이다.
도 3은 FADD-DED의 발현이 대장균의 사멸을 유도하는지를 확인하기 위해 다른 농도의 IPTG를 첨가하고 이것이 대장균의 성장에 어떠한 영향을 미치는 지 알아본 결과 첨가한 IPTG의 농도에 따라 세포의 성장이 더욱 억제되었다.
도 4는 실제로 본 발명에서 개발한 유전자 운반체가 다른 세포 사멸 관련 유전자를 검색하는 기능을 가지고 있는지 검토해 보기 위해 유전자 운반체에 인간의 세포에서 세포 사멸에 관계되어 있는 대표적인 유전자들을(FLICE, FAS, TRADD) 삽입하여 FADD-DED와 동시에 발현해 본 결과 발현된 모두의 유전자들이 FADD-DED의 세포 사멸 기능을 억제하였다.
따라서 본 발명의 목적은 본 키트를 이용하여 인간이나 고등 생물의 세포 사멸 유전자들을 용이하게 검색할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명품은 DNA로 제조된 유전자 운반체 (성분 A)와 이 DNA에 검색할 외부의 유전자를 삽입하여 증폭할 수 있는 대장균 DH5alpha 균주 (성분 B), 그리고 실제 세포 사멸 유전자를 검색할 수 있는 대장균 BL21(DE3) 균주 (성분 C), 이렇게 3가지의 구성으로 되어있다.
이를 상세히 설명하면 하기 키트로 구성된 것이다.
성분 A. 암피실린 내성, 두 개의 T7 전사효소 프로모터, 폴리클로닝 부위(polycloning site), p15A 복제 오리진(origin),FADD-DED를 함유하는 유전자 운반체 (참조: 도 1)
성분 B. 대장균 DH5alpha [supE44 DlacU169(f80lacZDM15)hsdR17recA1 end A1GyrA96thi-1relA1]
성분 C. 대장균 BL21(DE3) [hsdDgal(lacIts857ind1Sam7nin5lacUV5-T7gene1]
이하 본 발명의 키트 성분에 관해 더욱 상세히 설명한다.
우선 유전자 운반체에는 인간의 세포 사멸 유전자중 대장균의 세포도 사멸시킬 수 있는 유전자가 삽입되어 있으며 이 유전자는 대장균 파지인 T7의 전사효소에 의해서만 발현될 수 있도록 합성되어 있어 그 발현을 조절할 수 있다. 또 여기에 검색을 원하는 유전자를 용이하게 삽입할 수 있도록 수 가지의 DNA 제한효소의 작용 부위를 삽입하였다. 또 이 유전자가 대장균 세포 내에 유입되었을 때 검색할 수 있도록 암피실린 내성 유전자를 가지고 있다 (참조: 도 1).
본 발명에 대장균의 세포 사멸을 유도하기 위해 사용된 유전자는 인간 등의 고등생물의 세포 사멸을 유도하는 수용체인 Fas와 결합하는 FADD라고 하는 단백질을 발현할 수 있는 유전자중의 일부로서 본 발명을 위해 인간 세포와 대장균 세포를 동시에 사멸할 수 있는 부위를 발견하여 사용하였다 (참조: 도 2).
본 발명에서는 세포 사멸 부위를 FADD-DED로 명명하였으며, 이때 FADD-DED 유전자를 분리하여 이 T7 전사효소에 의해 발현될 수 있도록 유전자 운반체에 재조합하여 유전자는 5110개의 염기를 지니는 재조합 유전자 운반체로 제조하였다. 이 유전자 서열을 서열번호 1로 하고 서열목록에 개시하였다.
도 2의 A는 T7 전사효소를 가지고 있는 대장균 BL21(DE3)에 FADD-DED를 포함하는 재조합 유전자 운반체를 제조하여 발현한 결과를 나타낸 것이다. 따라서 FADD-DED를 발현시킨 경우에는 세포가 사멸하여 콜로니를 형성하지 못하였다.
그러나 FADD 유전자중 다른 부위나 전체 유전자를 발현한 경우에는 대장균에 아무 영향을 주지 못하였다. 또한 FADD-DED에 인위적으로 돌연변이를 일으킨 경우 세포 사멸 기능이 없어짐으로써 FADD의 세포 사멸 기능은 특정 부위에서만 특이하게 일어나는 것을 확인하였다.
B는 대장균의 사멸시킨 FADD-DED 유전자를 인간세포에서 발현할 수 있는 유전자 운반체인 pcDNA3에 삽입하여 인간 세포인 헤라 세포(HeLa cell)에서 발현시킨 결과이다. 대장균을 사멸시킨 FADD-DED가 인간 세포에서도 사멸 작용을 나타냄으로써 FADD-DED가 인간과 대장균에서 동시에 사멸 작용을 일으킴을 확인하였고 이를 이용하여 세포 사멸 검색 키트를 완성할 수 있게 된 것이다.
이 유전자의 발현이 실제로 대장균을 사멸시키는지를 다시 확인하기 위하여 이 유전자를 다른 농도의 IPTG를 액체 배지에 첨가하여 대장균의 성장에 미치는 영향을 분석하였다. 예상한대로 세포의 사멸은 FADD-DED의 발현정도에 따라 일어났으며 이는 FADD-DED의 발현이 사포 사멸의 원인임을 확인하였다 (참조: 도 3).
도 3은 FADD-DED의 발현이 대장균의 사멸을 유도하는지를 확인하기 위해 다른 농도의 IPTG를 첨가하고 이것이 대장균의 성장에 어떠한 영향을 미치는 지 알아본 결과 첨가한 IPTG의 농도에 따라 세포의 성장이 더욱 억제되었다.
이 유전자는 대장균에서 발현이 되면 대장균이 즉시 사멸함으로 DNA를 증폭하기 위해서는 이 유전자를 발현하지 못하는 대장균의 숙주 내에서 배양하여야 한다. 따라서 이를 조절하기 위해 프로모터로 대장균 파지인 T7의 전사효소에 의해 발현될 수 있도록 제조하였고 이 유전자는 T7 전사효소가 존재하지 않는 대장균 DH5a에서는 발현되지 않으므로 DNA를 증폭할 수 있다.
그러나 T7 전사효소가 존재하는 대장균 BL21(BL3)에서는 발현되어 대장균이 사멸된다. 또 이 유전자 운반체에는 또 하나의 T7 전사효소 조절자가 있어 새로운 유전자를 삽입하여 T7 전사효소에 의해 발현할 수 있게 제조하였다.
따라서 만약 외부에서 삽입된 유전자의 발현 단백질이 FADD 유전자의 세포 사멸 기능을 억제할 수 있는 기능이 있다면 FADD에 대한 세포 사멸 효과를 억제하게 되고 따라서 이러한 유전자를 같이 발현하는 대장균들은 성장하여 콜로니를 형성하게 되며 이를 배양하여 유전자 운반체에 삽입되어 있는 유전자의 서열을 밝힘으로써 세포 사멸 관련 유전자들을 용이하게 검색하는 것이다.
이러한 검색 키트의 유용성을 검정하기 위하여 실제로 인간의 대표적인 세포 사멸 관련 유전자들을 FADD-DED와 동시에 발현한 결과 이들이 FADD-DED의 세포 사멸 기능을 억제함을 보였으며 관련이 없는 다른 유전자는 효력이 없음을 보여 본 발명 키트가 세포 사멸 유전자들의 검색 키트로서 유용함을 입증하였다 (참조: 도 4).
도 4는 실제로 본 발명에서 개발한 유전자 운반체가 다른 세포 사멸 관련 유전자를 검색하는 기능을 가지고 있는지 검토해 보기 위해 유전자 운반체에 인간의 세포에서 세포 사멸에 관계되어 있는 대표적인 유전자들을(FLICE, FAS, TRADD) 삽입하여 FADD-DED와 동시에 발현해 본 결과 발현된 모두의 유전자들이 FADD-DED의 세포 사멸 기능을 억제하였다.
그러나 세포 사멸과 관계없는 다른 유전자를(QRS) 동시에 발현한 결과 FADD-DED의 세포 사멸 기능을 억제하지 못함으로 본 검색 키트가 세포 사멸 관련 유전자만 특이하게 검색할 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.
(실시예 1) FADD의 구조 도메인 확인
쥐과 FADD의 재조합은 구조 유전자를 포함하는 pET3d로부터 0.4mM IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactoside)에서 3시간 동안 37℃에서 대장균 BL21 (DE3)(Novagen)로 유발하였다. 배양된 세포를 얻어 50mM Tris-HCl(pH8.0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% 글리세롤(glycerol), 1 mM PMSF에서 초음파를 이용하여 분쇄하였다. 이 단백질은 세포 추출물에 녹아 있는 조각들을 30%까지 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 원심분리하여 모은 후 pH 4.0에서 밤새 투석하였고 좀더 정제된 단백질을 얻기 위해서 역상 HPLC(C8 Vydac column)를 실행하였다.
정제된 FADD 단백질은 15 ℃의 pH 8.0의 포스페이트 완충액에서 2시간 동안 효소 섭티리신(subtilisin)과 함께 넣어 분해하였다. 분해된 펩타이드를 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔(SDS-polyacrylamide gel)에 다시 녹이고 Millipore사의PVDF막으로 이동시켰다. N-말단의 아미노산 서열과 펩타이드의 분자량은 Procise 491 amino acid sequencer(ABI)와 MALDI-TOF mass spectroscopy(Hewett-Packard, HPG2025A)로 분석하였다.
(실시예 2) FADD 변이주의 제조
효소 섭티리신에 의해 분해된 FADD의 분해산물은 DD(Ala89-Ser183)과 DED(Met1-Thr88)임을 확인하였고 이를 코딩하는 DNA 조각은 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해 분리하였다. 이렇게 얻어진 DNA를 제한효소 NcoⅠ와 BamHⅠ를 이용하여 pET2d와 pET14b로 클로닝하였다. Asp19Ala, Phe25Ala, Asp74Ala의 변이주는 각각의 변이주의 PCR 프라이머를 이용한 PCR 돌연변이유발에 의해 배양하였다. 5'에서 3'의 FADD-DED의 프라이머는 각각의 변이주의 프라이머와 각각 PCR 반응에 쌍을 이루고있다. 변이된 유전자 부위의 동일한 영역를 포함하고 있는 두 PCR 조각의 결과물은 두번째 PCR에서 혼합하였다. 이 두 유전자 조각들은 FADD-DED의 모든 구조적 영역을 포함한 두번째 PCR을 하는 동안 결합되었다. 변이된 유전자는 NcoⅠ와 BamHⅠ로 자르고 pET3d의 같은 부위에 클로닝하였다. 이 변이주는 DNA 서열을 검사하여 확인하였다.
(실시예 3) 세포성장의 확인
FADD-DED를 코딩하는 DNA 조각을 BglⅡ와 BamHⅠ로 자르고 pET28a의 동일한 부위로 옮겼다. lacⅠ 유전자를 포함하고 있는 pET28a로부터 FADD-DED의 발현이 IPTG의 없는 배지에서는 강하게 성장이 억제되었다. 재조합 플라스미드를 포함한 대장균은 50 ㎍/㎖ 암피실린이 포함된 LB 배지에서 성장하였다. 서로 다른 농도의 IPLG를 첨가한 배지에서 FADD-DED의 발현의 유도와 시간적 간격을 두고 OD600에서 세포의 성장을 측정하였다.
포유류 세포에서의 FADD-DED의 효과는 헤라 세포(Hela cell)를 사용하여 검사하였다. FADD-DED의 구조적 유전자는 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에서 얻었다. 제한효소 부위를 인위적으로 설계한 프라이머를 이용한 PCR 생성물은 EcoRⅠ과 SalⅠ의 부위에서 자르고 EcoRⅠ과 XhoⅠ으로 자른 pcDNA3(Invitrogen)인 포유류 발현 유전자 운반체에 클로닝하였다. 만들어진 플라스미드는 GenePorter(Gene Therapy System)를 이용하여 헤라 세포에 감염시켰다. 클로닝된 동일한 유전자 운반체의 b-갈락토시다아제(b-galactosidase) 유전자는 감염시킨 세포를 확인하기 위해서 같이 감염시켰다. 이 세포는 감염 후 24시간 후에 0.2 % 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 2 % 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정시키고 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 b-D-갈락토사이드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl b-D-galactoside)로 3∼5 시간 염색하였다. 사멸한 세포는 감염시킨 세포 사이에서 형태학적으로 확인되었다. 각 감염을 3번 실시하여 적어도 500의 b-갈락토시다아제 양성 세포를 기록하였고 사멸 세포의 평균 퍼센트와 표준 오차도 확인하였다.
(실시예 4) FADD-DED와 다른 사멸과 사멸에 관련하는 도메인과의 동시 발현
FADD-DED의 구조 유전자와 T7 프로모터를 포함한 DNA는 pET3d-FADD-DED에서 BglⅡ와 HindⅢ의 부위에서 자른 후 pET23a의 같은 위치에 연결하였다. 쥐의 FADD-DED(Ala89에서 Ser183까지), 인간의 FLICE-DED2(Tyr101에서 Lys169까지), 인간의 FAS-DD(Gln244에서 Ile313까지), 인간의 TRADD-DD(Phe222에서 Glu287까지)를 코딩하고 있는 DNA 조각들을 그 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 분리하고 BglⅡ와 XhoⅠ부위를 사용하여 pET14b에 클로닝하였다. T7 프로모터와 FADD-DED의 DNA는 pET3a-FLICE-DED의 BglⅡ와 XhoⅠ부위에서 자르고 각각의 FADD-DED, FLICE-DED2, FAS-DD와 TRADD-DD를 포함하는 pET14b의 BglⅡ와 SalⅠ부위로 삽입하였다.
내부의 BglⅡ부위를 포함하는 FLICE-DED1(Leu7에서 Leu75까지)을 코딩하는 DNA로부터 다른 서브클로닝 절차를 사용하였다. FLICE-DED1 유전자는 pET3a-FLICE-DED1의 NdeⅠ와 XhoⅠ부위에서 자르고 pET23a의 같은 부위에 클로닝하였다. T7 프로모터와 FADD-DED의 HindⅢ-SalⅠ DNA는 pET3d-FADD-DED에서 얻었으며 이를 pET23a-FLICE-DED1의 HindⅢ와 XhoⅠ의 부위에 삽입하였다. pET28a(미간행, K.F.Lee)의 EcoRⅠ와 SalⅠ의 부위에 삽입하여 클로닝된 인간의 N-glutaminyl 합성효소의 N-말단의 펩타이드(Met-Glu236)의 유전자는 BglⅡ와 SalⅠ의 부위에서 자른다. 이 분리된 조각은 BglⅡ와 XhoⅠ부위가 잘린 pET14b에 삽입한다. 형성된 플라스미드를 BglⅡ와 HindⅢ로 다시 자른 후 이 분리된 조각을 pET23c의 BglⅡ와 HindⅢ부위로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 BglⅡ와 XhoⅠ부위로 자르고 pET3d-FADD-DED의 BglⅡ와 SalⅠ부위로 삽입하였다.
다시 요약하면 이 모든 조합은 T7 중합효소에 의하여 첨가된 단백질 도메인과 FADD-DED이 동시에 발현하기 위한 것이다. 이 플라스미드는 대장균 BL21(DE3)로 삽입되며 동시에 발현되어지는 효과는 OD600값으로 측정하였다.
본 발명의 효과는 인간의 세포 사멸 유전자중 대장균의 경우에도 적용될 수 있는 유전자 부위를 발견하여 이를 이용함으로써, 대장균 내에서 인간의 세포 사멸에 관여하는 주요 유전자들을 손쉽게 선별할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

Claims (3)

  1. DNA로 제조된 유전자 운반체 (성분 A)와 이 DNA에 검색할 외부의 유전자를 삽입하여 증폭할 수 있는 대장균 DH5a 균주 (성분 B), 그리고 실제 세포 사멸 유전자를 검색할 수 있는 대장균 BL21(DE3) 균주 (성분 C)로 구성된 세포 사멸 관련 유전자 검색 키트
  2. 제 1항에 있어서, 성분 A는 암피실린 내성, 두 개의 T7 전사효소 프로모터, 폴리클로닝 부위(polycloning site), p15A 복제 오리진(origin), FADD-DED를 함유하는 유전자 운반체이고; 성분 B는 대장균 DH5a [supE44 Dlac U169 (f80l acZDM15) hsdR17 recA1endA1GyrA96thi-1relA1]이고; 성분 C는 대장균 BL21(DE3) [hsdDgal (lacIts857ind1Sam7nin5lacUV5-T7gene1]임을 특징으로 하는 세포사멸 관련 유전자 검색 키트
  3. 제 2항에 있어서, 성분 A는 서열번호 1의 염기서열을 지님을 특징으로 하는 세포 사멸 관련 유전자 검색키트
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