DE60030563T2

DE60030563T2 - "death-effector"-domäne des säugetier-apoptose-mediators, fadd, die bakteriellen zelltod auslöst

Info

Publication number: DE60030563T2
Application number: DE60030563T
Authority: DE
Inventors: Sunghoon Jangangu Suwon KIM; Key-Sun Kim
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST; Imagene Co Ltd
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST; Imagene Co Ltd
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2020-07-12
Also published as: DE60030563D1; WO2001004153A1; ATE338769T1; AU5710000A; EP1198476B1; EP1198476A1; KR20010009554A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Todeseffektordomäne eines Säugetier-Apoptose-Vermittlers, FADD-DED mit SEQ ID NO: 3, die bakteriellen Zelltod auslöst.
Hintergrund der Erfindung
Man sieht Apoptose als einen aktiven, selbst-zerstörenden Prozess an, der in vielzelligen höheren Eukaryonten abläuft (Steller, 1995; Ameisen, 1996). Allerdings ist es auch berichtet worden, dass dieser Prozess in einzelligen eukaryontischen Organismen wie z.B. Trypanosomen (Protozoen), dem Schleimpilz Dictyostelium sowie dem frei lebenden Ciliaten Tetrahymena (Wheatley et al., 1993; Cornillon et al., 1994; Welburn et al., 1999) und sogar in prokaryontischen Organismen (Naito et al.,, 1995; Hochman, 1997) vorkommt.
Die Konservierung der Apoptose über verschiedene phylogenetische Stämme hinweg legt den Schluss nahe, dass sich dieser Prozess aus einem gemeinsamen Ursprung entwickelt haben könnte. Bax ist ein pro-apoptotisches Protein in Säugern. Die Expression dieses Faktors erzeugt reaktive Sauerstoffarten (ROS) und setzt das Membranpotenzial von Mitochondrien herab (Xiang et al., 1996).
Eine winzige Menge von menschlichem Bax löste in E. coli Zelltod aus, wobei die physiologischen Veränderungen jenen in menschlichen Zellen ähneln (Asoh et al., 1998; Ishibashi et al., 1998). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass zumindest einige Säugetier-Moleküle, die an der Apoptose beteiligt sind, die Lebensfähigkeit von Bakterienzellen auf eine Art und Weise beeinflussen können, die deren Funktionen in Säugerzellen ähnlich ist.
In der vorliegenden Erfindung verwendeten wir einen wohlbekannten Haupt-Säuger-Apoptose-Vermittler, FADD, um herauszufinden, ob dieses Molekül bakteriellen Zelltod verursacht und, falls dem so ist, was der Grund für den Tod ist. FADD besteht aus zwei funktionellen Domänen, die durch Deletionskartierung bestimmt wurden (Chinnaiyan et al., 1995). Dessen C-terminale Domäne wird „Death"-Domäne genannt und wird zur DD von FAS rekrutiert, welches durch Fas-Liganden oligomerisiert wird (Chinnaiyan et al., 1996). Die N-terminale Todeseffektordomäne (DED) von FADD verbindet sich dann mit der homologen Domäne von FLICE (Procaspase-8), wodurch die nachgeschaltete pro-apoptotische Kaskade ausgelöst wird (Cohen, 1997; Medema et al., 1997; Juo et al., 1998).
Die DED von FADD enthält sechs anti-parallele amphipathische α-Helices (Eberstadt et al., 1998) und weist insgesamt eine strukturelle Ähnlichkeit mit den DDs von FADD (Jeong et al., 1999) und FAS (Huang et al., 1996) auf. Eine Überexpression der FADD-DED alleine löst Zelltod bei Säugern aus, unabhängig von einem apoptotischen Signal durch Fas (Muzio et al., 1996; Medema et al., 1997).
Die Erfinder sind der Ansicht, dass pro-apoptotische Moleküle von Säugern bakteriellen Zelltod induzieren können, der dem Zelltod bei Säugern ähnelt. Falls dem so ist, kann eine Bakterienzelle ein nützliches System sein, um die Apoptose von Säugern zu untersuchen und Moleküle zu screenen, die mit der Apoptose zusammenhängen.
Als einen ersten Schritt, um diese Möglichkeit zu erkunden, bestimmen die Erfinder die strukturellen Domänen von FADD mittels proteolytischer Kartierung und testen, ob diese Domänen bakteriellen Zelltod auslösen können. Die Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Todeseffektordomäne des pro-apoptotischen Säugermoleküls FADD bakteriellen Zelltod induziert, indem sie die zellulären Spiegel von ROS erhöht.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Todeseffektordomäne, FADD-DED, bestehend aus der SEQ ID NO: 3, eines Säuger-Apoptose-Vermittlers bereitzustellen, wobei die FADD-DED bakteriellen Zelltod induziert.
Die Erfindung stellt auch einen Kit zum Screenen von Molekülen bereit, die mit Apoptose zusammenhängen, umfassend einen Expressionsvektor, der ein Polynucleotid umfasst, das ausschließlich die aus der SEQ ID NO: 3 bestehende FADD-DED des Säuger-Apoptose-Vermittlers, die bakteriellen Zelltod induziert, und den T7-Promotor codiert.
FADD ist ein pro-apoptotischer Vermittler bei Säugern, welcher aus der Nterminalen Todeseffektordomäne (DED) (SEQ ID NO: 3) und der C-terminalen „Death"-Domäne (DD) (SEQ ID NO: 4) besteht. Das N-terminale, 88 Reste lange Fragment des FADD von Mäusen ist als die stabile strukturelle Einheit von DED definiert, wie sie durch proteolytische Spaltung und Konformationsuntersuchungen bestimmt wird.
Diese Domäne löst bei Bakterien ebenso wie bei Säugern Zelltod aus, wohingegen die Volllänge-Version oder die DD von FADD dies nicht tun. Die Escherichia coli-Zellen, welche FADD-DED exprimieren, weisen eine gestreckte Zellmorphologie sowie erhöhte Mengen an chromosomaler DNA mit Einzelstrangbrüchen und Mutationen auf. Die Letalität von FADD-DED wird durch Co-Expression von Thioredoxin und Superoxid-Dismutase aufgehoben oder durch die Zugabe von Vitamin E als Reduktionsmittel und unter anaeroben Wachstumsbedingungen abgeschwächt.
Die Toxizität von FADD-DED wird durch verschiedene Oxidoreduktasen von E. coli genetisch unterdrückt. Alle diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Todeseffektordomäne der Säuger-FADD bakteriellen Zelltod auslöste, indem sie die zellulären Spiegel von reaktiven Sauerstoffarten (ROS) erhöht.
Obwohl DED und DD in der N- und C-terminalen Region von FADD liegen, sind deren genaue strukturellen Grenzen nicht präzise bestimmt worden. In der vorliegenden Erfindung setzen wir proteolytische Spaltung ein, um die strukturellen Einheiten für die DED und die DD von FADD abzugrenzen.
Die Subtilisin-Spaltung von FADD erzeugte zwei Proteolyse-resistente Peptidfragmente. Eines der entstandenen Peptide von Ala⁸⁹ bis Ser¹⁸³ bildete eine stabile Faltungseinheit von DD, deren Struktur vor kurzem geklärt wurde (Jeong et al., 1999).
Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die andere Domäne, welche von Met¹ bis Thr⁸⁸ reicht, eine strukturelle Einheit für DED sein dürfte. Obgleich diese Domäne ein wenig größer ist als die früher durch Deletionskartierung bestimmte Größe der Todeseffektordomäne (Chinnaiyan et al., 1996), bildet sie eine stabile α-helicale Konformation aus, wie durch eine CD-Untersuchung ermittelt wurde.
Punktmutationen der FADD-DED heben deren letale Wirkung auf, was darauf hindeutet, dass die strukturelle Unversehrtheit von FADD-DED wichtig für die letale Aktivität ist. Die menschliche FADD-DED besteht aus sechs antiparallelen Helices.
Die Substitutionsmutation an dem in der α2-Helix liegenden Phe²⁵ hebt deren letale Aktivität sowohl in E. coli als auch in Säugerzellen auf (Eberhardt et al., 1998). Dies legt nahe, dass dieselbe Proteinoberfläche von FADD-DED dazu verwendet werden könnte, die letale Aktivität auszulösen. Es ist zu erwarten, dass die anderen beiden Mutationen an Asp¹⁹ und Asp⁷⁴ ebenfalls die Interaktionsoberfläche beeinflussen, was noch nicht genau bekannt ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse scheint es, dass die Letalität der FADD-DED auf ihrer intrinsischen biologischen Aktivität beruht.
Die Expression von FADD-DED induziert eine Streckung der Zelle und Schäden an der DNA, was darauf hindeutet, dass der erhöhte Spiegel von ROS für diese Folgen verantwortlich ist. Um diese Möglichkeit zu bestätigen, setzen wir reduzierende Proteine und Reduktionsmittel oder anaerobe Bedingungen ein, um zu testen, ob diese Behandlungen die letale Wirkung von FADD-DED neutralisieren können. ROS können durch das Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System entfernt werden (Fernando et al., 1992; Das et al., 1997).
Thioredoxin ist ein Entgiftungsmittel gegen oxidativen Stress und ist an dem Verlauf des oxidativen Zelltods in Säugerzellen beteiligt (Spector et al., 1988; Fernando et al., 1992). Es hemmt den oxidativen Zelltod, indem es an ASK-1 („apoptosis signal regulating kinase 1”) bindet, einer Kinase, welche zum Zelltod führt. Thioredoxin wird durch die in einer normalen Zelle an NADPH gekoppelte Thioredoxin-Reduktase reduziert (Lennon und Willimas, 1996; Prinz et al., 1997; Takemoto et al., 1998). Ebenso schützt SOD vor oxidativen DNA-Schäden (Keyer et al., 1995).
Auch Vitamin E (Fuentes und Amabile-Cuevas, 1998) oder anaerobe Bedingungen schwächen die tödliche Wirkung von FADD-DED teilweise ab. Außerdem haben die meisten der E. coli-Gene, die die Letalität von FADD-DED unterdrückten, etwas mit dem Redoxpotenzial der Zelle zu tun. Alle diese Ergebnisse deuten stark auf eine Verwicklung von ROS in den durch FADD-DED ausgelösten Zelltod hin.
Alternativ kann FADD-DED den bakteriellen Zelltod über tödliche Wechselwirkungen mit lebensnotwendigen E. coli-Proteinen auslösen. Allerdings wird diese Möglichkeit aus den folgenden Gründen nicht unterstützt.
Erstens, falls die tödliche Wirkung von FADD-DED durch physikalische Wechselwirkungen mit E. coli-Proteinen blockiert wird, wären diese Proteine metabolisch nicht verwandt. Die ausgewählten Suppressoren konzentrieren sich jedoch zum größten Teil um Oxidations/Reduktions-Prozesse.
Zweitens, wir setzen das Hefe-„Two-Hybrid"- System (Gyuris et al., 1993) ein, um die E. coli-Proteine zu screenen, die möglicherweise mit FADD-DED interagieren. Auch nach dem Screenen von mehr als 20.000 Clonen wurden jedoch keine Proteine durch Selektion erhalten, die mit FADD-DED interagieren.
Drittens, da die eukaryontische DED homotypische Wechselwirkungen mit den homologen Domänen ausbilden kann (unveröffentlichte Daten) (Cohen, 1997; Medema et al., 1997; Juo et al., 1998), kann FADD-DED an die E. coli-Proteine binden, welche deren homologe Domäne enthalten. Es sind jedoch bisher keine E. coli-Proteine mit den homologen Domänen identifiziert worden (Aravind et al., 1999).
Auf der Grundlage dieser Beobachtungen ist eine zufällige letale Wechselwirkung zwischen FADD-DED und einem E. coli-Protein/E. coli-Proteinen unwahrscheinlich.
Wenn man dies alles zusammenfasst, lässt sich daraus schließen, dass die FADD-DED bakteriellen Zelltod dadurch induziert, dass sie den Spiegel von ROS durch einen bislang unbekannten Mechanismus erhöht. Da ROS sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Systemen als Todesvermittler fungiert, kann E. coli als ein einfaches System verwendet werden, um die molekularen Mechanismen des Zelltods zu untersuchen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine proteolytische Spaltung der gereinigten rekombinanten FADD der Maus und eine Konformationsanalyse von FADD-DED.
2 zeigt die Todeseffektordomäne von FADD, die bei Bakterien und Säugern Zelltod induziert.
3 zeigt den Zelltod von E. coli, der von der Expression von FADD-DED abhängig ist.
4 zeigt die morphologischen Veränderungen von E. coli, die durch FADD-DED induziert werden.
5 zeigt Schäden an den Chromosomen und die durch die Expression von FADD-DED in E. coli erhöhte Mutationsfrequenz.
6 zeigt die Auswirkung von Thioredoxin und SOD auf das Zellwachstum von E. coli, welche FADD-DED exprimieren.
7 zeigt die Auswirkung von Vitamin E auf die letale Wirkung von FADD-DED.
DIE BESTE ART UND WEISE, DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
1. Proteolytische und Konformations-Untersuchungen der Todeseffektordomäne von FADD
Eine Deletionsanalyse legt den Schluss nahe, dass DED und DD von FADD von Phe⁴ bis Leu⁷⁹ bzw. von Val¹⁰⁴ bis Val¹⁷⁷ reichen (Chinnaiyan et el., 1995). Es ist jedoch nicht bekannt, ob diese Domänen mit deren genauen strukturellen Einheiten übereinstimmen. Hier unterziehen wir Maus-FADD einer Subtilisin-Spaltung, um die strukturellen Domänen von FADD genau zu bestimmen. Die Peptide, die eine kompakte Konformation bilden, würden gegenüber einer Proteolyse mit Substilisin resistent sein.
Die durch Subtilisin gespaltenen Peptidfragmente von FADD werden durch Elektrophorese aufgetrennt, um deren N-terminale Aminosäuresequenzen und deren Molekulargewichte zu bestimmen. Die zwei Peptidfragmente bleiben nach 2 Stunden Spaltung intakt, was den Schluss nahe legt, dass diese Peptide stabile Faltungseinheiten ausbilden, welche gegenüber einer Proteolyse resistent sind (1A).
Wie in 1A gezeigt ist, wird die aufgereinigte Maus-FADD mit Subtilisin gespalten und von dem gespaltenen Protein wird nach 1 Stunde und nach 2 Stunden eine Probe entnommen. Die so erhaltenen Peptide werden durch SDS-Polyacryl amidgelelektrophorese aufgetrennt. Die zwei gegenüber der Subtilisin-Spaltung resistenten Peptide werden nach 2 Stunden Spaltung erzeugt.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen und die Molekulargewichte der Peptide werden durch einen Edman-Abbau bzw. durch Massenspektroskopie bestimmt. Es wurde ermittelt, dass die oberen und unteren Banden in dem Gel die Todeseffektordomäne (DED) von Met¹ bis Thr⁸⁸ bzw. die „Death"-Domäne (DD) von Ala⁸⁹ bis Ser¹⁸³ sind.
Diese Peptide werden durch HPLC isoliert und deren N-terminale Aminosäuresequenzen und Molekulargewichte werden bestimmt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die oberen und die unteren Banden in dem Gel die Peptide sind, welche die 95 C-terminalen Reste (die Reste Ala⁸⁹–Ser¹⁸³) bzw. die 88 N-terminalen Reste (die Reste Met¹–Thr⁸⁸) darstellen.
Wir haben bereits gezeigt, dass das C-terminale Peptid eine stabile Struktur von DD ausbildet (Jeong et al., 1999) und nahmen somit an, dass die Subtilisin-Spaltung die strukturellen Domänen von FADD gut abgrenzt. Wir ermitteln dann die Konformation der isolierten FADD-DED durch Circulardichroismus.
Das von 190 bis 260 nm erhaltene CD-Spektrum weist auf eine α-helicale Struktur hin (1B), was mit deren durch NMR bestimmten dreidimensionalen Struktur in Einklang steht (Eberstadt et al., 1998). Es wurde bestimmt, dass die Schmelztemperatur dieser Domäne bei ungefähr 60°C liegt. Auf der Grundlage der Ergebnisse der proteolytischen und der Konformationsanalyse scheint FADD-DED eine stabil gefaltete Struktur auszubilden.
Wie in 1B gezeigt ist, wird die Konformation der isolierten FADD-DED durch Circulardichroismus ermittelt. Das CD-Spektrum ist als molare Elliptizität der Reste gegenüber der Wellenlänge dargestellt.
2. Die N-terminale Todeseffektordomäne von FADD induziert bakteriellen Zelltod
Eine Überexpression des Volllänge-FADD oder der DED von FADD induziert Zelltod bei Säugern, wohingegen deren DD dies nicht tut (Chinnaiyan et al., 1995). Hier untersuchen wir, ob die Volllänge-Version und die proteolytisch ermittelten DED und DD von Maus-FADD die Lebensfähigkeit von E. coli beeinträchtigen.
Die cDNAs, welche die Volllänge-Version, die DED und die DD von FADD codieren, werden in den E. coli-Expressionsvektor cloniert, der einen T7-Promotor enthält. Alle diese Konstrukte beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht, wenn die Plasmide in E. coli DH5α gehalten werden, in denen die T7-Polymerase nicht vorhanden ist.
Die Erfinder führen diese Konstrukte dann in E. coli-BL21(DE3) ein, in welchen die T7-Polymerase durch IPTG-Induktion exprimiert wird. Es wurden keine Transformanten von E. coli-BL21(DE3) erhalten, welche pET3d-FADD-DED enthalten, wohingegen die Zellen vom selben Stamm, die pET3d-FADD enthalten, erzeugt werden (2A).
Wie in 2A gezeigt ist, werden die Plasmide, die die Volllänge-Version, die DED und die DD von FADD exprimieren, in E. coli-BL21(DE3) transformiert. Deren Auswirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Kolonienbildung auf LB-Platten ermittelt, welche Ampicillin enthalten. Drei Substitutionsmutanten werden erzeugt und auch auf deren Letalität untersucht.
Obwohl E. coli-BL21(DE3) die T7-Polymerase nicht exprimieren sollte, wenn kein IPTG hinzugefügt wird, kann es geringe Mengen von T7-Polymerase enthalten, welche auf eine „leaky"-Expression zurückzuführen sind. Wir sind der Ansicht, dass die Zellen, welche pET3d-FADD-DED enthalten, durch eine winzige Menge von FADD-DED getötet werden, welche durch eine geringe Menge von T7-Polymerase exprimiert wird.
Um festzustellen, ob die Toxizität von FADD-DED spezifisch von dessen struktureller Unversehrtheit abhängt, führen wir Substitutionsmutationen in FADD-DED ein und untersuchen deren Auswirkung auf die Letalität von FADD-DED. Phe²⁵ und Asp⁷⁴ liegen in den Helices 2 bzw. 6 und Asp¹⁹ liegt zwischen den Helices 1 und 2.
Alle diese Reste sind an der Oberfläche des Proteins gelegen und sind unter den DEDs und DDs verschiedener Todesmoleküle konserviert, was deren funktionelle Bedeutung impliziert (Eberstadt et al., 1998). Keine dieser Substitutionsmutanten induziert Zelltod (2A), obwohl sie stabil exprimiert werden, wie durch Immunblotting festgestellt wird. Des Weiteren hob auch eine Deletion der FADD-DED oder das Anfügen eines heterologen Peptid-Tags an diese Domäne die letale Aktivität auf.
Ihre extrem hohe Toxizität in winzigen Mengen sowie der Verlust der Toxizität durch verschiedene Mutationen sind ein starker Hinweis darauf, dass die letale Wirkung von FADD-DED deren native Konformation erfordert und mit deren intrinsischer biologischer Funktion zusammenhängt, aber nicht auf deren falsche Faltung zurückzuführen ist.
Wir untersuchen dann, ob FADD-DED auch bei Säugern Zelltod induzieren kann. Die HeLa-Zellen, welche mit pcDNA3-FADD-DED bzw. dem Vektor alleine transfiziert worden waren, zeigten etwa 45 % bzw. 15 % Zelltod (2B). Somit induziert FADD-DED, bestehend aus den 88 N-terminalen Aminosäuren, sowohl bei Bakterien als auch bei Säugern Zelltod.
Wie in 2B gezeigt ist, wird der Säugervektor pcDNA3, welcher das Gen enthält, das FADD-DED codiert, in HeLa-Zellen transfiziert und die apoptotischen Zellen werden gezählt, wie es in den experimentellen Methoden beschrieben ist.
3. Die Expression von FADD-DED induzierte eine morphologische Veränderung der Zellen
Da wir der Ansicht sind, dass die letale Wirkung von FADD-DED auf deren „leaky"-Expression zurückzuführen ist, wird das Strukturgen von FADD-DED in einen anderen Expressionsvektor (pET28a) überführt, welcher das lacI-Gen enthält, um die Expression der T7-Polymerase stärker zu kontrollieren. Wie erwartet, ist E. coli BL21(DE3), welches pET28a-FADD-DED enthält, auf LB-Platten in Abwesenheit von IPTG lebensfähig, nicht aber in Gegenwart von IPTG. E. coli-BL21(DE3), welches pET28a-FADD-DED enthält, lässt man in LB-Medium ohne IPTG wachsen.
Die Expression von FADD-DED wird dann mit verschiedenen Konzentrationen von IPTG induziert. Das Zellwachstum wird umso stärker gehemmt, je höher die Menge des zugegebenen IPTG ist (3A). Wir fügen dann 500 μM IPTG zu den E. coli-Zellen hinzu, welche pET28a und pET28a-FADD-DED enthalten und vergleichen die Anzahl lebensfähiger Zellen nach bestimmten Zeitabständen.
Wie in 3A gezeigt wird, lässt man E. coli-BL21(DE3), welche pET28a-FADD-DED enthalten, in LB-Medium wachsen, und die Expression von FADD-DED wird induziert, indem man die angegebenen Mengen an IPTG zugibt. Das Zellwachstum wird über den OD₆₀₀-Wert verfolgt.
Fast alle E. coli-Zellen, die pET28a-FADD-DED enthalten, verlieren die Lebensfähigkeit nach IPTG-Induktion, wohingegen jene, die pET28a allein enthalten, immer noch lebensfähig sind, obwohl die zwei E. coli-Stämme zum Zeitpunkt der IPTG-Induktion beide gleichermaßen lebensfähig sind (3B).
Wie in 3B gezeigt ist, lässt man E. coli-BL21(DE3), welche pET28a-FADD-DED enthalten, in LB-Medium in Gegenwart von 0,5 mM IPTG wachsen, und von den Zellen werden nach bestimmten Zeitabständen Proben entnommen und auf LB plattiert, um die lebensfähigen Zellen zu zählen.
Der zelluläre Spiegel von FADD-DED nimmt im Zeitverlauf nach der IPTG-Induktion zu (3C). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression von FADD-DED für den Zelltod von E. coli verantwortlich ist.
Wie in 3C gezeigt ist, wird die Expression von FADD-DED in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) induziert, welcher pET28a-FADD-DED enthält, und durch Immunblotting mit einem Anti-FADD-DED-Antikörper nachgewiesen.
Wir untersuchen dann, ob die Morphologie der E. coli-Zellen durch die Expression von FADD-DED verändert wird. Die Expression von Bax erzeugt reaktive Sauerstoffarten (ROS) und setzt das Membranpotenzial in Sängerzellen herab (Xiang et al., 1996) und hat auch ähnliche Auswirkungen in E. coli-Zellen(Asoh et al., 1998).
Die Produktion von ROS führt zu einer Streckung der E. coli-Zellen (Brandi^a et al., 1989). Falls FADD-DED eine Produktion von ROS in E. coli-Zellen induziert, ziehen wir in Erwägung, dass es eine ähnliche Auswirkung auf die Morphologie von E. coli hat wie Bax. Die Zellen werden nach und nach gestreckt und die Häufigkeit gestreckter Zellen nimmt im Laufe der Zeit nach der IPTG-Induktion zu (4). Im Gegensatz dazu zeigen die E. coli-Zellen, welche den Vektor allein enthalten, die normale Morphologie.
Wie in 4 gezeigt ist, wird die Expression von FADD-DED mit 0,5 mM IPTG induziert und die morphologische Veränderung durch Mikroskopie verfolgt.
Obwohl von einer ähnlichen morphologischen Veränderung durch andere toxische Agenzien berichtet wurde (Philips et al., 1967; Suzuki et al., 1967; Hrebenda et al., 1985; Brandi^b et al., 1989), sind wir der Ansicht, dass die Streckung der Zellen, basierend auf der funktionellen Analogie von FADD und Bax bei der Apoptose, auf die vermehrten ROS zurückzuführen ist.
4. DNA-Schäden und die Häufigkeit von Mutationen werden durch die Expression von FADD-DED erhöht
Die vermehrten ROS können auch Schäden an den Chromosomen und Mutationen erhöhen (Moody und Hassan, 1982; Ames und Gold, 1991). Die Schäden am Chromosom in den E. coli-Zellen, welche pET28a-FADD-DED und den Vektor allein enthalten, werden dadurch bestimmt, dass man die DNAs mit Einzelstrangbrüchen misst.
Das Chromosom wird mit Alkali denaturiert und die DNAs mit Einzelstrangbrüchen werden isoliert und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Menge an DNA mit Einzelstrangbrüchen wird durch Hybridisierung mit nach dem Zufallsprinzip ausgewählten genomischen E. coli-Fragmenten als Sonde bestimmt. Die DNA mit Einzelstrangbrüchen zeigt sich 210 Minuten nach der Induktion von FADD-DED, wohingegen in den Zellen, welche das Plasmid allein enthalten, fast keine DNA mit Einzelstrangbrüchen nachgewiesen wird (5A).
Wie in 5A gezeigt ist, wird die Expression von FADD-DED in den E. coli-BL21(DE3), welche pET28a-FADD-DED oder den Vektor allein enthalten, durch 0,5 mM IPTG induziert. Die chromosomalen DNAs mit Einzelstrangbrüchen werden von den Zellen zu den angegebenen Zeiten nach IPTG-Induktion abgetrennt und durch Southern-Blotting mit nach dem Zufallsprinzip ausgewählten genomischen E. coli-Fragmenten wie in den experimentellen Methoden beschrieben nachgewiesen.
Die durch FADD-DED induzierten DNA-Schäden werden auch dadurch bestimmt, dass man die Häufigkeit der Mutationen zwischen den E. coli-Zellen vergleicht, welche pET28a-FADD-DED und pET28a allein enthalten. Nachdem diese Zellen auf LB-Platten inkubiert worden sind, werden sie vereinigt und wieder auf LB-Platten mit und ohne Rifampicin ausplattiert, was als ein Mutationsmarker gewählt wird (Asoh et al., 1998). Die Rifampicin-resistenten Zellen werden aus den Zellen, welche pET28a-FADD-DED und pET28a enthalten, in einer Häufigkeit von ungefähr 3,2 × 10^–9 bzw. 4 × 10^–10 erzeugt (5B).
Wie in 5B gezeigt ist, werden die E. coli BL21(DE3)-Zellen, die pET28a-FADD-DED enthalten, auf LB-Platten inkubiert, bis sie Kolonien bilden. Sie werden dann vereinigt und auf LB-Platten mit und ohne Rifampicin ausplattiert (das Rifampicin wird als Mutationsmarker verwendet). Die Rifampicin-resistenten Kolonien werden gezählt und durch die Anzahl der auf der LB-Platte ohne Rifampicin gebildeten Kolonien dividiert.
Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass das Auftreten von Rifampicinresistenten Zellen schon durch die Expression einer winzigen Menge von FADD-DED etwa 10-fach erhöht wird.
5. Die letale Wirkung von FADD-DED wird durch Reduktionsmittel aufgehoben
Wir untersuchen dann, ob die Letalität von FADD-DED durch Proteine aufgehoben wird, welche ROS abfangen können. Thioredoxin ist ein Protein, welches das Redoxpotenzial der Zelle durch die Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen zwei im aktiven Zentrum gelegenen Cysteinen kontrollieren kann. Wir führen pET28a-FADD-DED in E. coli-BL21(DE3) ein, welche Thioredoxin überexprimieren, und die letale Wirkung von FADD-DED wird durch IPTG-Induktion untersucht.
Die E. coli-Zellen, die Thioredoxin überexprimieren, wachsen gut auf der IPTG-enthaltenden LB-Platte, wohingegen der gleiche Stamm ohne Thioredoxin dies nicht tut (6A).
Wie in 6A gezeigt ist, wird das Chioramphenicol-resistente Plasmid pETX, welches Thioredoxin exprimiert, in E. coli-BL21(DE3) und in AD494(DE3) (Novagen) transformiert, welches eine Thioredoxin-Reduktase-Defektmutante von BL21(DE3) ist. Das Plasmid pET28a-FADD-DED wird dann in jeden dieser beiden Stämme transformiert und die Transformanten werden auf LB-Platten inkubiert, welche die zur Selektion eingesetzten Antibiotika in Abwesenheit und in Gegenwart von IPTG enthalten. Das Plasmid, welches ein toxisches Peptid exprimiert, welches von dem Maus-Transkriptionsfaktor GATA-1 abgeleitet ist, wird auch in die gleichen Teststämme transformiert und dessen Expression wird ebenfalls durch IPTG induziert.
Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass die letale Wirkung von FADD-DED durch einen hohen Spiegel von Thioredoxin aufgehoben wird.
Um zu sehen, ob die reduzierte Form von Thioredoxin für diesen Abfang-Effekt wichtig ist, wird pET28a-FADD-DED in den E. coli-AD494(DE3)-Stamm transformiert, in welchem die Thioredoxinreduktase defekt ist. Da diesem Stamm die Thioredoxinreduktase fehlt, wird die reduzierte Form von Thioredoxin nicht erzeugt. Wie erwartet bildet diese Zelle keine Kolonie auf der IPTG enthaltenden LB-Platte, was darauf hinweist, dass das Reduktionspotenzial von Thioredoxin unentbehrlich für die Unterdrückung der letalen Aktivität von FADD-DED ist.
Wir untersuchen auch die letale Wirkung der von dem Maus-Transkriptionsfaktor GATA-1 abgeleiteten Domäne, um zu sehen, ob dieses Peptid ebenfalls ROS induziert (Trudel et al., 1996). Das aus einem Zinkfinger und basischen Aminosäuren bestehende Peptid bindet an den bakteriellen Replikationsursprung und übt so seine toxische Wirkung aus.
Die E. coli-Zellen, die dieses Peptid exprimieren, bilden keine Kolonien auf der IPTG enthaltenden Platte, wie früher berichtet worden ist. Die letale Wirkung dieses Peptids wird jedoch nicht durch die Co-expression von Thioredoxin neutralisiert (6A).
Dieses Ergebnis bedeutet, dass die Induktion von ROS spezifisch für FADD-DED ist. Um die Beteiligung des von FADD-DED induzierten ROS bei der Abtötung der Zellen weiter zu bestätigen, exprimieren wir auch FADD-DED in E. coli, welche die Superoxiddismutase (SOD) von Aquifex pyrophilus exprimieren (Lim et al., 1997). Die Expression dieses Enzyms unterdrückt ebenfalls die tödliche Wirkung von FADD-DED (6B).
Wie in 6B gezeigt ist, wird die Wirkung von SOD auf die Letalität von FADD-DED untersucht. Das FADD-DED-Gen wird in pACYC184 cloniert und mit und ohne pSOD (dem Plasmid, welches die Superoxiddismutase von Aquifex pyrophilus exprimiert) in E. coli-BL21(DE3) transformiert, und die Transformanten werden auf jeder der ausgewählten Platten ermittelt.
Um die Beteiligung des von FADD-DED induzierten ROS bei der Abtötung der Zellen weiter zu bestätigen, exprimieren wir auch FADD-DED in E. coli-BL21(DE3), welche Superoxiddismutase (SOD) überexprimieren (Lim et al., 1997). Die Überexpression dieses Enzyms unterdrückt ebenfalls die tödliche Wirkung von FADD-DED (6B).
6. Die Letalität von FADD-DED wird durch Verringerung des Sauerstoffgehalts abgeschwächt
Falls die durch FADD-DED vermehrten ROS der tatsächliche Grund für den Zelltod sind, würde die letale Wirkung von FADD-DED durch die Beseitigung der ROS oder durch die Verringerung des Sauerstoffgehalts abgeschwächt werden.
Um diese Möglichkeit zu erforschen, züchten wir zuerst FADD-DED exprimierende E. coli-BL21(DE3) in Gegenwart des Reduktionsmittels Vitamin E. Wir geben dann Vitamin E als ein Reduktionsmittel hinzu, nachdem FADD-DED in E. coli BL21(DE3) mit IPTG induziert worden ist, um zu sehen, ob diese Verbindung die toxische Wirkung von FADD-DED unterdrücken kann. Während diese Zellen in Abwesenheit von Vitamin E 1 Stunde nach der IPTG-Induktion das Wachstum einstellen, wird das Wachstum in Gegenwart von Vitamin E fortgesetzt (7A).
Wie in 7A gezeigt ist, werden die E. coli-BL21(DE3), welche pET28a-FADD-DED enthalten, in LB-Medium gezüchtet, welches Ampicillin enthält. Die Expression von FADD-DED wird durch Zugabe von 0,1 mM IPTG induziert und dann wird Vitamin E (0,1 und 1 mM) nach 1 Stunde zu dem Wachstumsmedium hinzugegeben. Das Zellwachstum wird über den OD₆₀₀-Wert verfolgt.
Dieselben Zellen werden unter teilweise anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Zellen wachsen nach der Induktion von FADD-DED weiter, obwohl das Wachstum verlangsamt ist (7B).
Wie in 7B gezeigt ist, werden dieselben Zellen ohne Schütteln in luftdicht verschlossenen Röhrchen gezüchtet, bis die OD₆₀₀ einen Wert von 0,5 erreichte. Das Zellwachstum wird dann zu bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von IPTG in einer Konzentration von 0,5 mM kontrolliert.
Alle diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass durch FADD-DED induzierte ROS für den Zelltod verantwortlich sind.
7. Genetische Unterdrückung der letalen Wirkung von FADD-DED
ROS scheinen ein allgemeiner Vermittler sowohl für den Zelltod bei Säugern als auch den bakteriellen Zelltod zu sein (Hochman, 1997; Storz und Imaly, 1999). Die Aktivierung von Fas vermehrt die ROS über die NADPH-Oxidase (Suzuki et al., 1998). FADD ist der unmittelbare nachgeschaltete Effektor von Fas und interagiert mit der homologen Domäne von FLICE (Pro-Caspase-8) (Cohen, 1997; Medema et al., 1997; Juo et al., 1998).
Die aktivierte Caspase-8 spaltet dann BID, welches sodann in die Mitochondrien verlagert wird und deren Membranpotenzial schädigt (Li et al., 1998). Diese Berichte stützen die Ansicht, dass ROS an dem durch FADD vermittelten Zelltod bei Säugern beteiligt sein könnte.
Die Ergebnisse dieser Experimente, welche wir durchgeführt haben, legen den Schluss nahe, dass durch FADD induzierte ROS auch für den bakteriellen Zelltod verantwortlich sind. Falls dies der Fall ist, können E. coli-Proteine, welche den zellulären Spiegel der ROS kontrollieren, vielleicht die letale Wirkung von FADD-DED unterdrücken.

Um diese Möglichkeit zu erforschen, co-exprimierten wir die E. coli-Genom bank mit FADD-DED, um durch Selektion die Gene zu erhalten, welche die Lebensfähigkeit der Zellen wieder herstellen können. Die Mehrheit der durch Selektion erhaltenen Gene codieren Proteine, welche im Metabolismus der Oxidation und Reduktion beteiligt sind, wie z.B. Cytochrom-O-Oxidase, Aldehyddehydrogenase A/Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, die Kette I der NADH-Dehydrogenase und ein offener Leserahmen, welcher ein Protein codiert, das homolog zur 2-Keto-3-desoxygluconat-oxidoreduktase von Bacillus subtilis ist (Tabelle 1). Tabelle 1 Die E. coli-Gene ausgewählt, um die Letalität von FADD-DED zu unterdrücken

Gene	Funktionen	Häufigk.
cyoB	Untereinheit I der Cytochrom O-UbiquinolOxidase	3
aldA/gapC	Aldehyddehydrogenase Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase	2
nuoK/J/I/H	NADH-Dehydrogenase I, K/J/I/H-Kette	1
ORF(62 min)	Homolog zur 2-Keto-3-desoxygluconatoxidoredukt von Bacillus subtilis	2
yeeS	radC- Familie	1

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, werden die E. coli-Gene mit FADD-DED coexprimiert, um diejenigen zu screenen, welche die Letalität von FADD-DED unterdrücken können. Die Plasmide, welche die E. coli-Gene enthalten, werden aus den lebensfähigen Zellen isoliert und die durch Selektion erhaltenen E. coli-Gene werden identifiziert. Häufigk. steht für die Anzahl identischer Clone, die durch Selektion erhalten worden sind.
Man erwartet, dass diese Oxidoreduktasen das zelluläre Redoxpotenzial modulieren, welches die toxische Wirkung der durch FADD-DED induzierten ROS abpuffern kann. Ein Protein der radC-Familie (yeeS) wird ebenfalls durch Selektion erhalten. Obwohl die Funktion dieses Proteins nicht vollständig geklärt ist, kann es an der Reparatur der durch ROS geschädigten DNA beteiligt sein (Felzenszwalb et al., 1987).
Außerdem werden auch ein paar Gene durch Selektion erhalten, die Proteine mit unbekannten Funktionen codieren. Obwohl die genauen Mechanismen für die unterdrückende Wirkung dieser Gene auf die letale Wirkung von FADD-DED weiterer Untersuchungen bedürfen, steht die Selektion dieser Suppressoren im Einklang mit der Beteiligung von ROS am bakteriellen Zelltod.
BEISPIELE
(Beispiel 1) Proteolyse und Circulardichroismus-Analyse von FADD-DED
Das rekombinante Maus-FADD wurde in E. coli-BL21(DE3) mit 0,4 mM IPTG bei 37°C für 3 Stunden von pET3d (Novagen) induziert, welches dessen Strukturgen enthält. Die Zellen wurden geerntet und durch Ultraschallbehandlung in 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % Glycerin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid aufgeschlossen. Die Proteine wurden gefällt, indem Ammoniumsulfat bis zu 30 % der löslichen Fraktion des Zellextrakts zugegeben wurde. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation aufgefangen und über Nacht bei pH 4,0 dialysiert und durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) weiter aufgereinigt, wobei eine Vydac-C₈-Säule verwendet wurde. Das gereinigte FADD-Protein wurde für 2 Stunden bei 15°C in Phosphatpuffer bei pH 8,0 mit Subtilisin gespaltet. Die gespaltenen Peptide wurden auf einem 15 %-SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran (MSI) transferiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz und das Molekulargewicht der Peptide wurden mit einem Procise491-Aminosäurensequenziergerät (ABI) und der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektroskopie (Hewlett-Packard, HPG 2025A) ermittelt. Die Konformation der isolierten FADD-DED wurde durch eine Circulardichroismus (CD)-Analyse bestimmt (JASCO 715). Durch Subtilisin-Spaltung erzeugte FADD-DED wurde wie vorstehend beschrieben isoliert und in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in 10 mM Natriumphosphat (pH 7,0) gelöst, und das CD-Spektrum wurde durch Scannen von 190 bis 260 nm bei 25°C erzeugt.
(Beispiel 2) Konstruktion von FADD-Mutanten
Die DNA-Fragmente, welche die proteolytisch bestimmte DED (Met¹–Thr⁸⁸) und DD (Ala⁸⁹–Ser¹⁸³) von FADD codieren, wurden durch PCR isoliert, wobei deren spezifische Primer verwendet wurden, und in pET3d bzw. pET14b cloniert, wobei die Nco I- und BamHI-Stellen verwendet wurden, die künstlich in die Primer konstruiert wurden. Die Asp¹⁹Ala-, Phe²⁵Ala- und Asp⁷⁴Ala-Mutanten wurden durch PCR-Mutagenese erzeugt, wobei die spezifischen mutagenen PCR-Primer verwendet wurden. Die Primer für die 5'- und 3'-Enden des Gens für FADD-DED wurden mit jedem der mutagenen Primer gepaart. Die zwei PCR-Fragmente, welche dieselbe Region der mutierten Stelle enthalten, wurden erhalten und für die zweite PCR wieder gemischt. Die zwei Fragmente wurden dann während der zweiten PCR miteinander kombiniert, um die vollständige Strukturregion für FADD-DED abzudecken. Die mutierten Gene für FADD-DED wurden dann mit NcoI- und BamHI geschnitten und in die gleichen Stellen von pET3d cloniert. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
(Beispiel 3) Bestimmung der Lebensfähigkeit und der Morphologie der Zellen
Das FADD-DED codierende DNA-Fragment wurde mit Bgl II und Hind III geschnitten und in die gleichen Stellen von pET28a transferiert. Da pET28a ein lacI-Gen enthält, ist die Expression von FADD-DED in der Abwesenheit von IPTG stärker unterdrückt. E. coli-BL21(DE3)-Zellen, die pET28a-FADD-DED beherbergten, ließ man in LB-Medium wachsen, das Ampicillin in einer Konzentration von 50 μg/ml enthielt. Die Expression von FADD-DED wurde induziert, indem verschiedene Konzentrationen von IPTG zugegeben wurden und das Zellwachstum wurde über den OD₆₀₀-Wert gemessen. Um die Zahl der lebensfähigen Zellen zu bestimmen, wurden von dem Kulturmedium zu bestimmten Zeitpunkten nach der Induktion von FADD-DED mit 0,5 mM IPTG Proben entnommen und die Zellproben wurden auf LB-Platten ausplattiert, die Ampicillin enthielten. Um die Morphologie der Zellen zu kontrollieren, wurden die Zellproben mit 1 % Kristallviolett angefärbt und unter dem Lichtmikroskop bei 1200-facher Vergrößerung begutachtet. Die Wirkung von FADD-DED auf Säugerzellen wurde mit HeLa-Zellen getestet. Das Strukturgen für FADD-DED wurde durch PCR mit den spezifischen Primern erhalten. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und Sal I geschnitten, welche in die Primer konstruiert worden waren, und in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) cloniert, der mit EcoRI und Xho I geschnitten worden war. Das so erhaltene Plasmid wurde dann in HeLa-Zellen transfiziert, wobei GenePorter (Gene Therapy Systems) verwendet wurde. Das β-Galactosidase-Gen, welches in denselben Vektor cloniert worden war, wurde co-transfiziert, um die transfizierten Zellen zu identifizieren. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion mit 0,2 % Glutaraldehyd und 2 % Formaldehyd fixiert und dann mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid für 3~5 Stunden angefärbt. Die apoptotischen Zellen unter den transfizierten Zellen wurden durch die apoptotische Morphologie bestimmt (Yang et al., 1997). Mindestens 500 β-Galactosidase-positive Zellen wurden für jede Transfektion im Dreifachansatz durchgesehen und die Prozent-Mittelwerte apoptotischer blauer Zellen und deren Standardabweichungen wurden bestimmt.
(Beispiel 4) Untersuchung der DNA mit Einzelstrangbrüchen
Die durch FADD-DED induzierte Verursachung von Einzelstrangbrüchen wurde wie früher beschrieben untersucht (Asoh et al., 1998). E. coli-BL21(DE3)-Zellen, die pET28a-FADD-DED oder pET28a-Vektor enthielten, wurden bei 37°C in LB-Medium gezüchtet, bis die OD₆₀₀ einen Wert von 0,8 erreichte. Die Expression von FADD-DED wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und mit 1 N NaOH lysiert. Die chromosomale DNA wurde mit Alkali denaturiert und die DNA mit Einzelstrangbrüchen wurde von der intakten DNA durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 1 Stunde getrennt. Die einzelsträngige DNA im Überstand wurde mit Ethanol gefällt und dann in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst. Die verunreinigende RNA wurde durch RNase A-Behandlung entfernt und die übrig bleibende DNA wurde wieder mit Isopropanol gefällt. Das Pellet wurde wieder in TE-Puffer gelöst und auf einem alkalischem 1 %-Agarosegel (50 mM NaOH, 1 mM EDTA) aufgetrennt. Die einzelsträngige DNA wurde dann auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Die transferierten DNAs auf der Membran wurden mit einer Digoxigenin-markierten Sonde hybridisiert, welche durch eine PCR mit nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Primern mit genomischer DNA von E. coli als Matrize hergestellt worden war.
(Beispiel 5) Bestimmung der Mutationshäufigkeit
Um zu sehen, ob die Expression von FADD-DED die Mutationsrate erhöht, wurde die Häufigkeit Rifampicin-resistenter Zellen ermittelt, wie früher beschrieben mit einer kleinen Änderung (Asoh et al., 1998). E. coli-BL21(DE3)-Zellen, die entweder pET28a-FADD-DED oder den Vektor allein enthielten, wurden für 16 Stunden auf LB-Platten inkubiert, welche Kanamycin enthielten. Die Kolonien auf jeder Platte wurden vereinigt und die 10 × 10¹⁰ Zellen wurden auf Kanamycin enthaltenden LB-Platten mit und ohne Rifampicin (50 μM) ausplattiert, welches als indikativer Marker ausgewählt wurde, um die spontane Mutationshäufigkeit zu kontrollieren. Die Kolonien auf jeder Platte wurden ausgezählt, um die Häufigkeit der Rifampicin-resistenten Zellen zu ermitteln.
(Beispiel 6) Immunblotting von FADD-DED
FADD-DED exprimierende E. coli-BL21(DE3)-Zellen wurden lysiert und die Proteine wurden durch eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt. Die Proteine im Gel wurden auf eine PVDF-Membran (Millipore) transferiert und FADD-DED wurde durch Immunblotting mit einem gegen das menschliche FADD gerichteten Maus-Antikörper (Pharmingen) gebunden. Der Antikörperkomplex wurde dann mit einem verbesserten Chemilumineszenz-System (Amersham Pharmacia Biotech) nachgewiesen.
(Beispiel 7) Co-Expression von Thioredoxin oder SOD mit FADD-DED
Das Thioredoxin-Gen von E. coli wurde mittels PCR mit den spezifischen Primern isoliert und in die BamHI-Stelle von pACYC184 cloniert, um pETX herzustellen (K.-S. Kim, unveröffentlicht). Dieses rekombinante Plasmid wurde in E. coli- BL21(DE3) und ADA494(DE3) (∆ ara-leu7967, ∆ lacX74, ∆ phoApvull phoR ∆ malF3, F' [lac+(lacIq)pro]trxB::kan(DE3)) transformiert, welches eine Defektmutante der von BL21(DE3) abgeleiteten Thioredoxinreduktase ist. Die Transformanten wurden auf LB-Platten selektiert, die Chloramphenicol enthielten. In jede der transformierten Zellen wurde pET28a-FADD-DED eingeführt und die Transformanten wurden auf LB-Platten selektiert, die Chloramphenicol und Ampicillin enthielten. Die Expression von FADD-DED wurde dann auf LB-Platten induziert, welche 0,5 mM IPTG enthielten. Um die tödliche Wirkung von FADD-DED mit einem anderen toxischen Peptid zu vergleichen, wurde auch ein anderes Plasmid, pGATA (gekauft von CPC Inc., USA), welches ein von dem Maus-Transkriptionsfaktor GATA-1 abgeleitetes toxisches Peptid exprimiert, in die gleichen Teststämme transformiert. Das Gen, welches die Fe-Superoxiddismutase (SOD) von Aquifex pyrophilus codiert, wurde in die Nco I- und BamHI-Stellen von pET3c cloniert, um pSOD herzustellen (Lim et al., 1997). Das in Bgl II/Hind III clonierte FADD-DED-Gen wurde aus pET3d ausgeschnitten und in pACYC184 cloniert. Die Expression von FADD-DED von pACYC184-FADD-DED wurde ebenfalls durch IPTG in E. coli induziert.
(Beispiel 8) Zellwachstum in Gegenwart von Vitamin E oder unter anaeroben Bedingungen
Die pET28a-FADD-DED-enthaltenden E. coli-BL21(DE3) wurden in LB-Medium gezüchtet, welches Ampicillin enthielt, und 0,5 mM IPTG wurde hinzugegeben, um FADD-DED zu induzieren. Vitamin E wurde 1 Stunde nach IPTG-Induktion hinzugefügt und das Zellwachstum wurde über den OD₆₀₀-Wert kontrolliert. Die gleichen Zellen wurden in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen verteilt, die vollständig mit LB-Medium gefüllt waren, und ohne Schütteln in Kultur gehalten, bis die OD₆₀₀ einen Wert von 0,5 erreichte. Dann, nachdem IPTG in einer Konzentration von 0,5 mM hinzugefügt worden war, wurde das Zellwachstum kontrolliert.
(Beispiel 9) Genetische Unterdrückung von FADD-DED mit E. coli-Genen
Das E. coli-Chromosom wurde mit BamHI gespalten und die 3~5 kb großen genomischen Fragmente wurden in die BamHI-Stelle von pBR322 ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α transformiert und die Transformanten wurden vereinigt, um die Plasmide zu isolieren. Die Plasmide wurden in E. coli-BL21(DE3) retransformiert. Dann wurde pACYC184-FADD-DED zusätzlich in die Zellen transformiert, welche pBR322 enthielten, die jedes der E. coli-Gene enthielten. Die Transformanten, die Kolonien bildeten, wurden auf LB-Platten selektiert, die Ampicillin und Chloramphenicol enthielten (jeweils 30 μg/ml). Die Plasmide wurden aus den lebensfähigen Zellen isoliert, um die in pBR322 clonierten E. coli-Gene zu bestimmen.
LITERATURVERZEICHNIS

1. Ameisen, J.C. (1996) The origin of programmed cell death. Science 272: 1278–1279.
2. Ames, B. N., and Gold, L. S. (1991) Endogenous mutagens and the causes of aging and cancer. Mutat Res 250: 3–16
3. Aravind, L, Dixit, V. M., and Koonin, E.V. (1999) The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci 24: 47–53
4. Asoh, S., Nishimaki, K., Nanbu-Wakao, R., and Ohta, S. (1998) A trace amount of the human pro-apoptotic factor Bax induces bacterial death accompanied by damage of DNA. J Biol Chem 273: 11384–11391
5. Brandi, G^a., Fiorani, M., Pierotti, C., Albano, A., Cattabeni, F., and Cantoni, O. (1989) Morphological changes in Escherichia coli cells exposed to low or high concentrations of hydrogen Peroxide. Microbiol Immunol 33: 991–1000
6. Brandi, G^b., Schiavano, G. F., Albano, A., Cattabeni, F., and Cantoni, O. (1989) The effect of K₂CrO₇ on the growth and morphology of Escherichia coli. Biol Trac Elem Res 21: 271–275
7. Chinnaiyan, A. M., O'Rourke, K., Tewari, M., and Dixit,V. M. (1995) FADD, a novel death domain-containing Protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis. Cell 81: 505–512
8. Chinnaiyan, A. M., Tepper, C. G., Seldin, M. F., O'Rourke K, Kischkel, F. C., Hellbardt, S., Krammer, P. H., Peter, M. E., and Dixit, V. M. (1996) FADD/MORT1 is a common mediator of CD95 (Fas/APO-1) and tumor necrosis factor receptor-induced apoptosis J Biol Chem 271: 4961–4965
9. Cohen, G. M. (1997) Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J 326: 1–16
10. Cornillon, S., Foa, C., Davoust, J., Buonavista, N., Gross, J. D., and Golstein, P. (1994) Programmed cell death in Dictyostelium. J Cell Sci 107: 2691–2704.
11. Das, K. C., Lewis-Molock, Y., and White, C. W. (1997) Elevation of manganese superoxide dismutase gene expression by thioredoxin. Am J Respir Cell Mol Biol 17: 713–726
12. Eberstadt, M., Huang, B., Chef, Z., Meadows, R. P., Ng, S. C., Zheng, L., Lenardo, M. J., and Fesik, S. W. (1998) NMR structure and mutagenesis of the FADD (Mort1) death-effector domain Nature 392: 941–945
13. Felzenszwalb, I., da Silva, S. R., and Alcantara Gomes, R. (1987) Effect of hydrogen peroxidase on Escherichia coli radC. Braz J Med Biol Res 20: 869–871
14. Fernando; M. R., Nanri, H., Yoshitake, S., Nagata-Kuno, K., Minakami, S. (1992) Thioredoxin regenerates proteins inactivated by oxidative stress in endothelial cells. Eur J Biochem 209: 917–922
15. Fuentes, A. M., and Amabile-Cuevas, C. F. (1998) Antioxidant vitamins C and E affect the superoxide-mediated induction of the soxRS regulon of Escherichia coli. Microbiology 144: 1731–1736
16. Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H., and Brent, R. (1993) Cdi1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75: 791–803
17. Hochman, A. (1997) Programmed cell death in prokaryotes. Crit Rev Microbiol 23: 207–214
18. Hrebenda, L., Hrebenda, B., and Brozostek, K. (1985) Influence of penicillin and nalidixic acid on growth and cell division of Escherichia coli K-12 Acta Microbiol Pol 34: 19–24
19. Huang, B., Eberstadt, M., Olejniczak, F. T., Meadows, R. P., and Fesik, S. W. (1996) NMR structure and mutagenesis of the FAS (APO-1/CD95) death domain. Nature 384: 638–641
20. Ishibashi, Y., Nishimaki, K., Asoh, S., Nanbu-Wakao, R., Yamada, T., and Ohta, S. (1998) Pore formation domain of human pro-apoptotic bax induces mammalian apoptosis well as bacterial death without antagonizing anti-apoptotic factors. Biochem Biophys Res Commun 243: 609–616
21. Jeong, E. J., Bang, S., Lee., T. H., Park, Y. I., Sim, W. S., arid Kim, K. S. (1999) The solution structure of FADD death domain. Structural basis of death domain interactions of Fas and Fadd. J Biol Chem 274: 16337–16342.
22, Juo, P., Kuo, C. J., Yuan, J., and Blenis, J. (1998) Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Fas-induced apoptotic cascade. Curr Biol 8: 1001–1008.
23. Keyer, K., Gort, A. S., and Imlay, J. A. (1995) Superoxide and the production of oxidative DNA damage. J Bacteriol 177: 6782–6790
24. Lennon, B. W., and Williams, C. H. Jr. (1996) Enzyme-monitored turnover of Escherichia coli thioredoxin reductase: insights for catalysis. Biochemistry 35: 4704–4712.
25. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., and Yuan, J. (1998) Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94: 491–501
26. Lim, J. H., Yu, Y. G., Choi, I. G., Ryu, J. R., Ahn, B. Y., Kim, S. H., and Han, Y. S. (1997) Cloning and expression of superoxide dismutase from Aquifex pyrophilus, a hyperthermophilic bacterium. FEBS Lett 406: 142–146
27. Medema, J. P., Scaffidi, C., Kischkel, F. C., Shevchenko, A., Mann, M., Krammer, P. H., and Peter, M. E (1997) FLICE is activated by association with the CD95 death-inducing signaling complex (DISC). EMBO J 16: 2794–2804
28. Moody, C. S., and Hassar, H. M. (1982) Mutagenicity of oxygen free radicals. Proc Natl Acad Sci USA 79: 2855–2859
29. Muzio, M., Chinnaiyan, A. M., Kischkel, F. C., O'Rourke, K., Shevchenko, A., Ni. J., Scaffidi, C., Bretz, J. D., Zhang, M., Gentz, R., Mann, M., Krammer, P. H., Peter, M. E, and Dixit, V. M. (1996) FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the CD95 (Fas/APO-1) death-inducing signaling complex. Cell 85: 817–82
30. Naito, T., Kusano, K., and Kobayashi, L (1995) Selfish behavior of restriction-modification systems. Science 267: 897–899
31. Phillips, S. L., Person, S., and Jagger, J. (1967) Division delay induced in Escherichia coli by near-ultraviolet radiation. J Bacteriol 94: 165–170
32. Prinz, W. A., Aslund, F., Holmgren, A., and Beckwith, J. (1997) The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. J Biol Chem 272: 15661–15667
33. Spector, A., Yan, G. Z., Huang, R R., McDermott, M. J., Gascoyne, P. R., and Pigiet, V. (1988) The effect of H₂O₂ upon thioredoxin-enriched lens epithelial cells. J Biol Chem 263: 4984–4990
34. Steller, H. (1995) Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267: 1445–1449
35. Storz, G., and Imlay, J. A. (1999) Oxidative stress. Curr Opinion Microbiol 2: 188–194
36. Suzuki, H., Pangborn, J., and Kilgore, W. W. (1967) Filamentous cells of Escherichia coli formed in the presence of mitomycin. J Bacteriol 93: 683–688
37. Suzuki, Y., Ono, Y., and Hirabayashi, Y. (1998) Rapid and specific reactive oxygen species generation via NADPH oxidase activation during Fas-mediated apoptosis. FEBS Lett 425: 209–212
38. Takemoto, T., Zhang, Q. M., and Yonei, S. (1998) Different mechanisms of thioredoxin in its reduced and oxidized forms in defense against hydrogen peroxide in Escherichia coli. Free Radic Biol Mcd 24: 556–562
39. Trudel, P., Provost, S., Massie, B., Chartrand, P., and Wall, L. (1996) pGATA: a positive selection vector based on the toxicity of the transcription vector GATA-1 to bacteria. BioTechniques 20: 684–693
40. Welbum, S. C., Lillico, S., and Murphy, N. B. (1999) Programmed cell death in procyclic form Trypanosoma brucei rhodesiense – Identification of differentially expressed genes during con A induced death Mem Inst Oswaldo Cruz 94: 229–234
41. Wheatley, D. N., Christensen, S. T., Schousboe, P., and Rasmussen, L. (1993) Signaling in cell growth and death: adequate nutrition alone may not be sufficient for ciliates. Cell Biol Int 17: 817–823
42. Xiang, J., Chao, D. T., and Korsmeyer, S. J. (1996) BAX-induced cell death may not require interleukin 1 beta-converting enzyme-like proteases. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14559–14563
43. Yang, X., Khosravi-Far, R., Chang, H. Y., and Baltimore, D. (1997) Daxx, a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis. Cell 89: 1067–1076

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Todeseffektordomäne FADD-DED, bestehend aus SEQ ID NO: 3 eines Säuger-Apoptose-Vermittlers, wobei FADD-DED bakteriellen Zelltod induziert.
Kit zum Screenen der Moleküle, die mit Apoptose zusammenhängen, umfassend einen Expressionsvektor, der ein Polynucleotid umfasst, das ausschließlich die FADD-DED nach Anspruch 1 und einen T7-Promotor codiert.
Kit nach Anspruch 2, das zusätzlich E.coli umfasst, in welchen die T7-Polymerase nicht vorhanden ist, und E.coli, in welchen die T7-Polymerase durch IPTG-Induktion exprimiert wird.
Polynucleotid, das ausschließlich die FADD-DED nach Anspruch 1 codiert.
Vektor, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 4.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 5.