KR20010005917A

KR20010005917A - 경구적으로 활성인 여주의 분획, 이것의 활성 펩티드 및 당뇨병 치료에 있어서 이들의 사용

Info

Publication number: KR20010005917A
Application number: KR1019997008994A
Authority: KR
Inventors: 낵비쉬와이트; 메디셀라사티아나라야나; 샤르마소메쉬디.
Original assignee: 칼릭스 테라퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2001-01-15
Also published as: EP1005274A4; ATE403672T1; DE69839842D1; US6391854B1; US6852695B2; US6127338A; CA2285452A1; AU749792B2; ES2310006T3; AU6876598A; JP4156038B2; EP1005274A1; JP2002516608A; US20020193310A1; KR100509438B1; CN1255044A; EP1005274B1; WO1998043484A1

Abstract

MC6라 칭하는 여주의 수용성 추출물, 그것의 제조방법 및 고혈당 질환의 치료에 그것의 사용방법이 제공된다. 활성 MC6는 10kDal 미만의 분자량을 갖는 SDS-PAGE상에 단일띠로서 이동하는 것과 3개의 펩티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. MC6.1이라 칭하는 MC6의 펩티드 성분, 그것의 유사체 및 모사체도 또한 제공된다. 활성의 MC6, MC6.1, MC6.2 및 MC6.3은 경구투여후에도 저혈당활성을 나타낸다. 고혈당 질환, 특히 당뇨병을 치료하기 위한 활성약제의 사용방법도 제공하는데 활성약제는 바람직하게는 경구로 투여된다.

Description

경구적으로 활성인 여주의 분획, 이것의 활성 펩티드 및 당뇨병 치료에 있어서 이들의 사용{ORALLY ACTIVE FRACTION OF MOMORDICA CHARANTIA, ACTIVE PEPTIDES THEREOF, AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF DIABETES}

인슐린 비 의존성 당뇨병(NIDDM 또는 제 2형)은 미국에서 사망원인 제 4위를 차지하며, 전 세계 인구의 5 내지 7% 에서 발병하고, 서양국가에서 점차 증가하는 추세이다. 당뇨병에서는, 신체가 인슐린을 충분히 생산하지 못하거나 또는 생산한 인슐린이 효과가 없기 때문에, 결과적으로 혈중의 글루코스 레벨이 증가되고, 전문적으로는 고혈당증이라고 알려진 상태가 된다. 당뇨병은 모든 연령의 사람에게 발병할 수 있으나, 대부분의 당뇨병 환자들은 45세 이상이다. 이 질환은 유전되는 경향이 있고, 질환을 일으키는 위험인자는 과체중의 사람들에게서 증가한다.

당뇨병은 치료방법이 없는 만성질환이며, 몇몇의 다른 질병과 연관되어 있다. 당뇨병은 25-74세의 사람들의 시력상실의 주요원인이다. 총 당뇨병 환자의 10%에서 신장질환이 발생한다. 당뇨병은 외상으로 인하지 않은 하체절단의 가장 빈번한 원인이다. 다리 외상의 위험성은 보통 사람들보다 당뇨병 환자에게서 30배 정도로 높다. 당뇨병 환자는 2배 내지 4배로 심장질환이 더 많이 발생하고, 발작으로 고생하는 경우가 5배 정도로 더 많기 쉽다.

당뇨병의 원인은 아직 밝혀지지 않았으나, 유전적 요인과 환경적 요인 모두가 일정한 역할을 담당하는 것으로 보인다. 당뇨병에는 인슐린 의존성(제 1형) 및 인슐린 비의존성(제 2형)의 두 가지 형태가 있다. 제 1형 당뇨병은 아이들과 젊은이에게 종종 발생하는 자가면역질환이다. 제 1형 당뇨병을 유발시키는 자가항원(autoantigen)은 아직 알려지지 않았으며, 환자들은 생존을 위해서 매일 정맥내로 인슐린을 주사해야 한다.

제 2형 당뇨병은 신체가 충분한 양의 인슐린을 만들지 못하던지, 또는 생산된 인슐린을 적절하게 사용하지 못해서 초래된 대사 질환이며, 당뇨병의 가장 보편적인 형태로 간주된다. 인슐린 분비와 인슐린 내성이 가장 주요한 병인으로 간주되지만, 정확한 관련 유전적 인자는 알려지지 않고 있다. 당뇨병 환자는 통상 다음과 같은 하나 이상의 병인을 갖는다.

즉, 췌장에 의한 인슐린의 생산 감소; 간에 의한 글루코스의 과잉분비; 골격근에 의한 글루코스 유입의 손상; 글루코스 운반체의 이상(Glut-1, Glut-2); 인슐린 수용체의 탈감작; 및 다당류 대사분해의 이상이다.

현재 치료방법은 인슐린 정맥 주사 외에도 경구로 투여하는 4가지 부류의 저혈당제를 사용한다. 이들은 다음과 같이 요약된다:

부류	승인된 약품의 수	작용 기전	한계
술포닐우레아	4개(제 1세대)2개(제 2세대)	췌장에 작용해서 인슐린 분비를 촉진.	내성 발달
비구아나이드	단 1개(메트포르민)	간에 의한 글루코스 분비를 감소.또한 인슐린에 대한 감도를 증가시킴	간장 장애젖산중독
글루코시다제 억제제	단 1개(아카르보스)	음식물 소화를 방해글루코스 흡수를 저하	식후에만 적용 가능
티아졸리딘디온	단 1개(트로글리타존)	인슐린 내성을 감소	인슐린과 함께 투여심장 및 간 질환이 있는 환자는 사용금지.

표 1에서 명백한 바와 같이, 당뇨병 치료에 현재 사용되는 각각의 약제들은 일정한 단점을 갖는다. 따라서 당뇨병 치료용 신약의 동정 및 개발에 끊임없는 관심이 있다.

여주(MOMORDICA CHARANTIA)는 그 열매를 채소로 사용하는 열대식물이다. 포유동물 모델(Shibib et al., Biochem. J., 292, 267-270(1993); Ali et al., Planta Med. 59, 408-412 (1993); Akhtar 등의 Planta Med. 42., 205-212(1981)) 및 사람(Leatherdale et al., Br. Med. J. 282, 1823-1824(1981);Aslam 등의., Lancet, I. 607(1979))에서 여주의 저혈당 작용이 보고된 바가 있다. 그러나, 저혈당 성분 및 작용기전은 알려지지 않았다.

인슐린 유사 활성을 갖는 여주에서 얻은 11kDal 펩티드의 단리가 Khanna 등의 "식물 기원으로 부터 유래된 폴리펩티드-p의 저혈당 활성" 20th Annual Meeting of the American Society of Pharmacology, Purdue University, West Lafayette, July 29-August 3, 1979; Baldwa et al., Upsala J. Med. Sci. (1977) 82:39-41 및 U.S. Pat. No. 3,945,988 에 보고되었다. 이런 보고 전부에서는, 인슐린 유사 폴리펩티드는 경구가 아닌, 예를 들면 정맥이나 피하로 투여된다.

최근의 보고는 여주의 조(粗) 알콜 추출물이 간에서 글리코겐 합성을 자극해서 간의 혈장 글루코스 레벨을 부분적으로 감소시키는 것을 가리키지만, 이것이 인슐린 분비 약제로서 작용하는 것 같지는 않다(Sarkar et al., Pharmacol. Res., 33, 1-4(1996)).

본 발명의 분야는 당뇨병이다.

도 1a는 여주의 여러 수용성 분획의 SDS-20%-PAGE상의 겔 전기영동의 결과를 나타내고; 도 1b는 정제된 MC6 제제를 나타내고; 및 도 1c는 MC6의 HPLC의 결과를 나타낸다.

도 2a는 SD래트에서 시간에 따라서 혈장 글루코스 레벨에 대한 여주의 미정제 수성추출물 및 대조군의 효과를 나타내는 그래프 도시이고; 도 2b는 SD래트에서 시간에 따른 혈중 글루코스 레벨에 대해서 경구로 투여된 MC6의 효과를 나타내는 그래프 도시이다.

도 3a 및 b는 SZC로 유발된 당뇨병에 걸린 래트에서 혈중 글루코스 레벨에 대한 MC6의 효과를 도시하는 그래프를 제공한다.

도 4는 MC6의 경구투여가 혈청 인슐린 레벨을 증가시키지 않는 것을 증명하는 그래프 도시이다; 및

도 5는 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는데 있어서, MC6의 경구투여가 r-인슐린의 정맥투여와 같은 정도로 효과가 있음을 증명하는 그래프 도시이다.

도 6a 및 b는 각각 쿠마시 블루 및 은 염색을 사용해서 4-20%의 tris-글리신 구배 겔에서의 MC6.1의 SDS-PAGE분석 결과를 나타낸다.

도 7은 C18 RP-HPLC를 사용해서 MC 6.1의 정제로부터 얻은 결과를 도시하는 그래프를 제공한다.

도 8a 및 b는 MC6.1에 대한 등전점 분석의 결과를 제공한다.

도 9는 MC 6.1의 NMR분석의 결과를 제공한다.

도 10은 혈중 글루코스 레벨에 대한 MC6.1의 효과를 도시하는 그래프를 제공한다.

도 11은 정상 래트에서 경구로 투여한 글루코스 내성 시험에 있어서 MC6.1, 6.2 및 6.3의 저혈당 활성을 도시하는 그래프를 제공한다.

도 12는 당뇨병 래트에서 MC6.2의 글루코스을 저하시키는 능력을 도시하는 그래프를 제공한다.

도 13은 비만이 아닌 당뇨병 래트에서 MC6.2의 저혈당 효과를 도시하는 그래프이다.

특정 구체예의 상세한 설명

MC6이라 명명된 여주의 수용성 분획, MC6.1이라 명명된 이것의 활성 펩티드 성분, 및 이것의 펩티드 유도체인 MC6.2 및 MC6.3, 이들의 제조방법과 고혈당 질환에서의 치료에 사용하는 방법이 제공된다. MC6은 10kDal의 분자량을 갖고, SDS-PAGE상에서 단일 띠로 뭉쳐서 이동하는 세개의 펩티드로 이루어지는 것으로 특징지워지며, 재조합 인슐린 보다 작은 크기를 갖는다. MC6 및 MC 6.1은 저혈당 활성을 나타내며, 경구로 투여했을 때 활성이 있다. 본 발명을 더 상세히 설명하자면, MC6 및 MC6.1의 특성은 이것의 제조방법과 고혈당 질환의 치료, 특히 당뇨병 환자의 치료에 사용하는 방법에 의해서 더욱 상세히 설명될 것이다.

유도체인 MC6.2 및 MC6.3은 각각 18-아미노산 펩티드인 MC6.1의 11-아미노산 및 7-아미노산 펩티드 유도체이다.

본 발명을 상세히 기술하기 전에, 특정 구체예의 변형예들이 행해질 수 있으나 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되기 때문에, 본 발명은 이하에 기술된 본 발명의 특정한 구체예들에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 사용된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 것이지 한정하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 대신에, 본 발명의 범위는 첨부한 특허청구범위에 의해서 확립될 것이다.

본 명세서와 첨부한 특허청구범위에 사용하는 단수형태들은 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형태도 포함하는 것을 알아야한다. 다르게 정의되지 않는 한, 모든 본 명세서에 사용된 전문 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에게 보편적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 MC6은 여주라는 식물종의 수용성 분획 또는 추출물이다. MC6은 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 씨 등, 여주의 전 식물 등을 포함하는 여주의 하나이상의 조직이나 성분에서 유래될 수 있으나, MC6은 통상 여주 열매에서 유래되고, 바람직하게는 씨로부터 분리된 덜 익은 여주 열매에서 유래된다.

MC6은 SDS-20% PAGE상에서 단일 띠로 이동하는 것으로 특징지워지는데, 여기서 단일 띠의 분자량은 10kDal 미만이고, SDS 20%-PAGE 동안에 인가된 전기장의 강도는 100V이다.

상기 MC6은 재조합 인슐린 보다 더 작은 크기를 갖으므로 약 6kDal 미만이다. MC6은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 따른 세개의 피크로서 용리되는 것을 더욱 특징으로 하고, HPLC의 조건은 C8 또는 C18 칼럼 상의 역상이다. 이러한 조건 하에서 첫번째 피크가 11.33분에 용리되고 두번째 피크가 25.35분에 용리되고 세번째 피크는 34.67분에 용리된다.

본 발명의 MC6은 예컨대 단백질 등의 고분자량의 오염물질이 없는 제조물이고, 이 출원에서 사용되는 고분자량 오염물질은 약 50kDal을 초과하는 분자량을 갖는 분자들을 의미한다. 통상 상기 MC6은 10kDal을 초과하는 고분자량의 어떤 오염물질도 함유하지 않는다.

MC6은 포유동물에서 저혈당 활성을 나타낸다. 저혈당 활성이라 함은 MC6을 포유동물에게 투여하는 경우 그 포유동물의 혈중 글루코스 레벨이 감소하고, 이 때 혈중 글루코스 레벨의 감소량은 그 포유동물에게 투여된 MC6의 양에 비례하는 것을 의미한다. MC6은 경구적으로 투여되든지 또는 정맥내로 투여되든지 저혈당 활성을 나타내므로 경구적으로 활성이 있고 또는 경구적으로 생물학적 효능이 있는데, 이는 위장관을 통해 포유동물 안으로 전달됨에 의해 불활성화되지 않는다는 것을 의미한다.

상기 MC6은 여주 조직원으로부터 MC6 분리를 위해 제공되는 어떤 간편한 수단을 사용하여도 제조될 수 있다. 여주 조직으로부터 MC6를 얻는 한 수단으로서 먼저 예컨대 인산염 완충 식염수(PBS), 물 등의 용매의 존재하에 조직을 분해(maceration)함으로써 조직의 천연 현탁액을 제조하는데, 이때 분해는 블렌더 또는 다른 분리 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 그런 다음 그 결과된 현탁액의 미립 물질을 분리하고 액상으로부터 제거하는데 이 과정은 통상 약 10,000 내지 16,000 rpm의 속도로 원심분리하고 이어서, 상징액을 여과하는데 이 여과하는 것에 의해 달성될 수 있는 0.5 내지 0.10μ의 범위, 통상 약 0.45 내지 0.22μ의 구멍 크기를 갖는 필터를 통해 통상 행해질 수 있고 그 여과는 진공하에서 행해질 수 있다. 그 결과된 여과물을 MC6을 함유하는 초기의 여주 조직의 수용성 분획을 얻기 위해 30kDal 및 10kDal의 컷오프 멤브레인을 통해 연속적으로 통과시킨다. 여기서 이러한 멤브레인은 당업계에 공지된 것이고 대표적인 멤브레인으로 Amicon M.W. 컷오프 필터 등이 포함된다. 그 결과된 수용성 분획을 그대로 사용할 수도 있고 또는 냉동건조 등의 탈수를 포함하는, 후속 용도를 위한 더이상의 가공을 위해 사용될 수 있다. 그 결과된 수용성 분획은 또한 1 내지 5, 통상 2 내지 4℃에서 액체 형태로 벤조산 나트륨 등의 방부제의 존재하에 저장될 수 있다.

MC6.1은 SDS-PAGE 분석(4-20% tris-글리신 구배 겔)에서 단일 띠로서 이동하는 MC6의 특정 펩티드 구성성분으로 SDS-PAGE에 의해 측정된 분자량이 2.5kD 미만이다. MC6.1은 8.2의 등전점을 갖고 그 길이는 18 아미노산 잔기이고 MC6.1의 아미노산 서열을 하기와 같다.

K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G (SEQ ID NO:01)

MC6.1은 포유동물에서 저혈당 활성을 나타낸다. 본 발명의 MC6.1은 자연 환경으로부터 분리된 MC6.1인데 이는 예컨대 MC6에 존재하고, 분리된 또는 순수한 형태 등으로 존재한다.

또한 저혈당 활성을 나타내는 MC6.1의 펩티드 유사체 및 모사체를 제공한다. 그 MC6.1 유사체 및 모사체는 활성 모티프 서열로서 8개 이상의 아미노산, 통상 약 12개 이상의 아미노산, 더욱 일반적으로는 약 18 이상의 아미노산, 및 약 40의 아미노산, 더욱 일반적으로는 30 미만의 아미노산을 포함한다. 특정 펩티드들은 MC6.2로서 11 아미노산의 하기 서열을 갖는 MC6.1의 유도체이며

K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A (SEQ ID NO:02)

또한 7 아미노산의 하기 서열을 갖는 유도체이다.

K-T-N-M-K-H-M (SEQ ID NO:03)

약 세개까지의 치환 또는 결실이 그 서열에서 행해질 수 있는데 그 변화는 활성 모티프에서 아미노산 갯수의 약 20수% 이하, 통상 10수% 이하이다. 바람직하게는 이소루신, 루신, 발린 및 페닐알라닌의 큰 소수성 기 내의 치환; 세린 및 트레오닌 간의 치환; 글리신 및 알라닌 간의 치환; 아스파라긴 및 글루타민 간의 치환; 아스파르트산 및 글루탐산 간의 치환; 또는 리신, 아르기닌 및 히스티딘 간의 치환을 포함하는 당업계에서 공지된 보존적 치환이다. 천연 원료로부터의 정제에 더하여, MC6.1 뿐 아니라 MC6.2 및 MC6.3 등의 펩티드 유사체 및 모사체를 합성(예컨대 Beckman Model 990 펩티드 합성기 또는 다른 상업적 합성기를 사용) 등의 종래 기술에 따라 제조할 수 있다. 펩티드들은 재조합 방법(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조)에 의해 직접 제조할 수 있고 또는 융합 단백질로서 예컨대 특이적 결합 쌍의 하나인 단백질로 그 융합 단백질을 친화성 시약에 의해 정제하고 원하는 펩티드를 얻기 위해 통상 공학적으로 생산된 부위에서 단백질분해 절단하여 제조할 수 있다(예컨대 Driscoll et al. (1993) J. Mol. Bio. 232:342-350 참조).

올리고펩티드들(즉 MC6.1, MC6.1 유사체, MC6.1 모사체)을 확장하여, 예컨대 시스테인 또는 리신과 같은 편리한 링크 부위를 만들어 특정 수용체에의 결합 안정성을 증가시키고 부위 지향 작용을 제공하고 물리적 특성들(예컨대 용해도, 전하 등)을 변경시킴으로써 정제를 용이하게 하고 구조를 안정화시킬 수 있다. 올리고펩티드들을 비야생형 플랭킹 영역과 연결하여 융합 단백질로서 할 수 있는데 이 연결은 링크 기들에 의하거나 또는 시스테인(디술피드) 또는 펩티드 결합을 통한 공유결합에 의한 것이다. 올리고펩티드는 예컨대 말레이미도벤조산, 메틸디티오아세트산, 머캡토벤조산, S-피리딜 디티오프로피오네이트 등의 다양한 2기능성 약품을 통해 결합될 수 있다. 올리고펩티드들은 아미노산 사슬의 N- 또는 C-말단에서 하나의 아미노산에 연결될 수도 있고 또는 내부에 연결될 수도 있다. 예컨대 상기 펩티드들은 항체 생산을 촉진하기 위해 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 오브알부민 등의 면역유전자 단백질에 공유 결합 될 수 있다.

그렇지 않으면 상기 올리고펩티드들은 내부 또는 N- 또는 C-말단에서 사슬의 한 부분이 되기 위해 다른 펩티드들 또는 단백질들과 결합하여 발현될 수 있다. 다양한 발현 후 변형이 달성될 수도 있다. 예컨대 적절한 코딩 서열을 이용하여 파네실레이션(farnesylation) 또는 프레닐레이션(prenylation) 시켜 그 펩티드들이 한 말단에서 리피드 기에 결합하여 리포좀 등의 리피드 멤브레인 안으로 삽입될 수 있을 것이다.

상기 올리고펩티드들을 PEG화 할 수 있는데 폴리에틸렌옥시 기는 혈류에서 증가된 수명을 제공한다. 그 올리고펩티드들은 또한 IgG 이소타입의 Fc 등의 다른 단백질들과 결합하여 보체 결합을 향상시키거나 또는 리신(ricin), 아브린(abrin), 디프테리아 독 등의 독, 특히 A 사슬과 결합될 수도 있다. 그 올리고펩티드들은 부위 지향된 작용을 위해 항체와 결합될 수 있다. 결합 기술로서 예컨대 미국 특허 번호 3,817,837; 3,853,914; 3,850,752; 3,905,654; 4,156,081; 4,069,105 및 4,043,989를 참조하고 이것들은 인용문헌으로 여기에 포함된다.

본 발명의 MC6, MC6.1, MC6.2 및 MC6.3(그 유사체 및 모사체 포함)의 용도는 혈중 글루코스 레벨의 존재를 특징으로 하는 예컨대 제1형 및 제2형 둘다를 포함하는 당뇨병 등의 고혈당 질환 뿐만 아니라 비만, 증가된 콜레스테롤 신장 관련 질환 등의 다른 고혈당 관련 질환의 치료에서 찾을 수 있다. 용어 "치료(또는 처치)"는 MC6, MC6.1, MC6.2 및 MC6.3(그 유사체 및 모사체 포함)이 고혈당 질환을 갖는 개체에 투여되어 최소한 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는 것을 의미한다. MC6 및 상기 올리고펩티드로 고혈당 질환을 치료함에 있어서, 그 MC6 또는 올리고펩티드들을 혈중 글루코스 레벨을 허용 범위로 감소시키기에 충분한 양으로 개체에 투여하는데 이 때 허용 범위란 그 개체의 정상 평균 혈중 글루코스 레벨의 ±10%, 통상±8%, 더욱 일반적으로 ±5%를 의미한다.

다양한 개체들이 그들의 혈중 글루코스 레벨을 감소시키기 위해 본 발명에 따라 치료될 수 있는데 이러한 개체들은 포유동물이고 가축, 가치있는 또는 희귀한 동물들, 개 및 고양이 등의 애완동물들 및 인간을 포함한다.

특별한 관심사는 제 1형 및 제 2형 당뇨병 둘다를 포함하는 당뇨병 등의 인간의 고혈당 질환을 치료하는 방법으로, MC6, MC6.1, MC6.2 및 MC6.3(그 유사체 및 모방체 포함)을 고혈당 질환을 앓고 있는 인간에게 투여하여 적어도 인간의 혈중 글루코스 레벨을 감소시키고 그 혈중 글루코스 레벨을 인간의 대략 정상 혈중 글루코스 레벨 범위까지 감소시키는 것이다. 비록 활성 약제들이 상기 기술된 간편한 기술들 중 하나를 사용하여 인간에게 투여될 수 있으나 특별한 관심사는 활성 약제의 경구 투여이다.

분획 MC6 또는 MC6.1, MC6.2 및/또는 MC6.3 펩티드들을 이용하는 치료법을 위해, 활성 화합물들이 어떤 간편한 투여 기술을 이용하여 고혈당 질환으로 고생하는 개체에게 투여될 수 있는데, 이러한 기술에는 정맥내, 상피내, 근육내, 피하, 경구 등을 포함하고 경구 투여가 특별한 관심사이다. 개체에의 투여량은 반드시 투여되는 경로에 의해 결정될 것이지만 일반적으로 인간 체중 70kg당 약 50 내지 500mg, 일반적으로는 인간 체중 70kg당 약 100 내지 200mg의 범위이다. MC6을 이용하여 인간의 고혈당 질환을 치료함에 있어서 인간에게 투여되는 활성 분획 또는 화합물의 투여량은 일반적으로 인간 체중 70kg당 약 50 내지 500mg, 일반적으로 약 100 내지 200mg의 범위이다.

본 발명에 따르는 활성 분획 또는 화합물들을 사용함에 있어서, 그것들을 약제학적 조성물을 제조하기 위해 생리학적으로 허용되는 비히클(vehicle)과 조합될 수 있다. 약제학적 조성물을 제조하기 위해 그 활성 분획 또는 화합물과 조합된 생리학적으로 허용되는 비히클의 성질은 필수적으로 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 방법에 따라 결정될 것이다. 예시적인 비히클은 예컨대 주사용 멸균수, 식염수 등의 물을 포함한다. 특별한 관심사는 경구 투여에의 이용에 적합한 생리학적으로 허용되는 비히클이다. 그러한 베히클은 당업계에 공지되어 있고 예컨대 탈이온수 등의 물; 예컨대 인산염 완충된 식염수 등의 식염수, 정제 및 캅셀의 형태로 냉동 건조된 분말을 포함하고 그러한 형태는 다양한 충전제, 결합제 등을 포함한다. 약제학적 조성물에 존재하는 활성 약제의 양은 약제학적 조성물이 투여되는 방법의 관점에서 선택되고 당업자에 의해 경험적으로 결정된다.

MC6.2 및/또는 MC6.3 및 올리고펩티드 유사체 또는 모사체를 이용하는 치료법에 있어서, 경구적, 국소적 또는 예컨대 특정 부위에의 주사와 같이 비경구적으로 투여될 수 있는데, 예컨대 피하, 복강내, 혈관내, 비강내, 상피를 통하는 등에 의해 투여된다. 경구 투여를 위한 조제물은 MC6 사용에 적합한 상기 기재한 것들을 포함한다. 주사용 조제물은 물, 식염수, PBS, 수성 에탄올, 수성 에틸렌 글리콜 등의 생리학적으로 허용되는 매체를 포함한다. 사용할 수 있는 수용성 방부제는 소디움 바이술피트, 소디움 티오술페이트, 아스코르베이트, 염화 벤잘코늄, 클로로부탄올, 티메로살, 페닐머큐릭 보레이트, 파라벤, 벤질 알콜 및 페닐에탄올을 포함한다. 이 약제는 각각 약 0.001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 2 중량%의 양으로 존재할 수 있다. 사용할 수 있는 적당한 수용성 완충제는 인산, 시트르산, 붕산, 아세트산, 중탄산 및 탄산 나트륨과 같은 알칼리 또는 알칼리 토금속의 탄산염, 인산염, 중탄산염, 시트르산염, 붕산염, 아세트산염, 숙신산염 등이다. 카르복시메틸셀룰로스와 같은 첨가제는 담체로서 약 0.01 내지 약 5중량%의 양으로 사용될 수 있다. 제제는 수용체 활성을 조절하기 위해서 사용된 특정방법, 의도된 치료등과 같은 제제의 목적에 따라서 변할 수 있다. 제제는 패취, 캅셀, 리포좀, 지속성 코팅, 환제를 포함할 수 있고, 연속적인 투여를 위한 펌프로 제조될 수도 있다. 구체적인 용량은 공지된 방법에 따라서 경험적으로 결정될 수 있다(예를들면, Harrison의 Principles of Internal Medicine, 11th ed. Braunwald et al., ed, McGraw Hill Book Co., New York, 1987을 참조.)

일반적으로, 활성있는 분획 또는 펩티드, 이것의 유사체 및 모사체의 치료적 유효량은 개체 중량의 약 0.005-10mg/kg, 더 통상적으로는 약 0.01-1mg/kg이 될 것이다. 이런 용량은 원하는 저혈당 활성을 달성하기에 충분할 것이다. 투여는 투여되는 약물의 레벨에 따라 매일 간격으로 할 수도 있고; 통상 하루에 최대 1번, 또는 주 간격으로 덜 빈번하게 할 수도 있다. 투여되는 올리고펩티드의 양은 일반적으로 펩티드의 반감기에 따라 조절될 것이고, 펩티드가 연장된 반감기를 갖거나, 예를들어 콜라겐 매트릭스처럼 연장된 기간동안 펩티드를 보유하는 매트릭스에 도입된 미립자로 이루어지는 지속형 방출 조성물, 거의 일정한 속도로 연장된 기간에 걸쳐 펩티드를 연속적으로 주입하는 펌프의 사용과 같이 저장형으로 제공되는 경우에 낮은 범위의 용량을 사용 할 수 있다. Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery, in: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 1, CRC Press, Boca Raton, FL, 1987, pp39-90은 약물의 제어송달을 위한 인켑슐레이션을 기술하고, Di Colo(1992) Biomaterials 13:850-856은 소수성 중합체로부터의 약물의 제어 방출을 기술한다.

발명의 개요

여주의 수용성 분획(MC6) 및 이것의 제조방법과 고혈당증의 치료에 사용하는 방법이 제공된다. MC6은 SDS-PAGE 전기영동상에서 단일 띠로 이동하고, 10kDal 미만의 분자량을 가지며, 재조합 인슐린 보다 작은 크기를 갖고, 3개의 펩티드로 이루어지고, 고 분자량 단백질 오염이 없다는 것으로 특징지워진다. 또한, MC6의 특정한 펩티드 성분인 라벨된 MC6.1 그리고 MC6.1보다 짧은 길이를 갖고, 저혈당 활성을 보이며 경구로 투여되어 다양한 고혈당 질환을 치료할 수 있는 MC6.1의 펩티드 유도체인 MC6.2 및 MC6.3이 제공된다.

다음의 실시예는 예시로써 제공되며 제한으로써 제공되지 않는다.

실시예 1

A. 여주 추출물의 활성성분의 분리 및 정제

신선한 덜 익은 여주 열매를 씻어서 닦은 다음 씨를 제거하였다. 펄프를 인산염 완충 식염수(PBS)나 아니면 탈이온수 중에 배합하였다. 현탁액을 12,000×g에서 원심분리하고 진공하에 0.22:멸균필터 (Whatman으로부터 구입됨)를 통해 여과하였다. 청정한 상징액을 Amicon filtration으로부터 구입한 30 kD, 10 kD 및 3 kD 컷-오프 멤브레인을 통해 연속 통과시켰다. 0.45μ(제1단계), 0.22μ(제2단계) 및 10 kD (제3단계) 컷-오프 분획을 SDS-20% 폴리아크릴아미드 겔에 의해 분석하고 결과를 도 1a에 제공하였다. 제3단계 정제된 분획은 사람 인슐린보다 더 작은 크기의 단일 띠를 나타내었다. 겔 분석으로부터, 정제된 분획은 여러 고분자량의 단백질 띠들이 없는 것이 분명하다. MC6로 라벨을 붙인 10K 컷-오프 분획의 몇개의 배치를 도 1b에 나타낸 바와 같이 그램 양으로 정제하였다. 결과된 정제된 분획들을 동결건조하여 미결합수가 없는 MC6를 얻었다.

100 내지 500 mg의 동결건조된 MC6를 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)(C8 또는 C18 컬럼(분석용)을 사용하여 TFA/아세토니트릴 선형구배를 사용하는 역상 HPLC)를 시키고 결과를 도 1c에 제공하였다. HPLC 분석은 각각 17.35, 25.35 및 34.67분의 체류시간을 갖는 세개의 주 피크를 나타내었고 MC6는 세개의 펩티드로 이루어짐을 증명한다.

B. MC6의 저혈당 활성

정제된 분획의 저혈당효과를 원료인 조추출물 제제와 비교하였다. SD래트(평균 200그램 Charles River, MA에서 구입)를 3시간동안 단식시킨 후 기초 혈장글루코스 레벨을 측정하기위해 혈액 알리컷을 꼬리 정맥으로부터 수집하였다. 5㎖의 조 추출물 제제 또는 PBS중의 정제된 분획 MC6 (500:g) (상기 A부분에서 제조된 것) 1㎖를 각 래트에 경구 투여하였다. 콘트롤 동물은 같은 부피의 PBS를 받았다. 래트를 서리톨(복강내)(0.08㎍/㎖/kg, 프로판올롤(1.7㎍/분/kg))을 사용하여 마취시켰다. 각 래트의 경정맥을 카뉼레 삽입하고 글루코스를 5mM KCL과 140mM NaCl 용액으로 3시간동안 주입하였다(18㎎/분/kg체중). 혈액을 30, 60, 90, 150 및 180분에서 경동맥으로부터 수집하였다. 혈장 글루코스 레벨을 Kadish et al., Clin. Chem. (1968)14: 116에 기술된 확립된 열량측정법에 의해 추정하였다.

결과를 도 2a에 제공하였다. 결과는 조추출물을 제공받은 동물들은 모든 시점에서 혈중 글루코스 레벨의 상당한 감소가 있으며 효과는 60분에서 실질적으로 높음(상대적인 차이 거의 100%)을 증명한다. 병행하여, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 경구 제공된 PBS중의 MC6 (500:g)의 1㎖ 수성 정제분획은 조 추출물과 유사한 효과를 가지며 MC6의 분리된 폴리펩티드 풀이 조 추출물의 주 활성성분임을 제안한다.

C. 예방 및 처치방식에 대한 MC6의 효과

동물모델에서 당뇨병의 예방 및 처치 방식 둘다에서 정제된 분획의 효험을 증명하기 위해 다음 세트의 실험을 수행하였다. 스트렙토조토신 (40㎎/kg체중) (Sigma Chem.,MO로부터 구입)을 사용하여 수컷 SD래트(각각 200-225g)에서 당뇨병을 유발시켰다. 예방모델에서, 동물들은 제0일부터 매일 경구로 1㎖(500:g)의 정제된 분획 MC6을 받았다. 처치모델에서, 동물들은 제5일에 질병 개시시 경구로 1㎖(500:g)의 정제된 분획 MC6(500:g)을 받았다. 혈청 글루코스 레벨을 15일의 기간동안 매일 모니터하였다. 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 정제된 분획 MC6는 예방과 처치방식 둘다에서 매우 효과적이다(제10일에서 p＜0.001).

스트렙토조토신-유발 당뇨병의 예방방식에서 MC6의 효과는 제1형 자가면역 당뇨병을 치료하는데 MC6 사용의 적합성을 또한 강력히 지지한다.

D. 혈청 인슐린 레벨에 대한 MC6의 효과

C 부분에 기술된 실험으로부터 다른 날들에 동물들의 혈청 인슐린 레벨을 측정하여 저혈당효과의 동안에 전신적 인슐린의 조절에 있어서 MC6의 역할을 조사하였다. 혈청인슐린 레벨의 정량적 측정은 Hales ＆ Randle, Biochem. J. (1963) 88:137에 기술된 바와 같이 방사면역분석법(LINKO 분석)에 의해 수행되었다. 도 4는 이 분획의 경구 투여가 혈청 인슐린 수준을 향상시키는데 효과가 없었고, 이 분획의 효과는 췌장에 의한 인슐린 분비를 통해 중재되지 않음을 제안한다. 도 4에서, 당뇨병은 스트렙토조토신으로 유도되었다. 미처치된 군은 PBS만을 제공받았고; CZC군은 40㎎/kg SZC를 제공받았고; 예방군은 제1일부터 MC6를 경구로 제공받았고; 처치군은 제5일부터 MC6를 제공받았다. 인슐린을 표준RIA에 의해 측정하였다. 데이터는 세벌 측정의 평균을 나타낸다.

E. MC6의 경구 투여는 인슐린의 전신 주사와 동등하게 효과적이다.

다음실험에서, 경구 투여된 정제된 분획 MC6(500:g)을 SD래트중의 인슐린(150mU)의 정맥내 주사와 비교하였다. 동물들을 네 개의 군으로 나누고 3시간동안 단식시켰다. 1군은 PBS만을 받았고; 2군은 글루코스 주입 60분전에 MC60을 경구로 제공받았고; 3군은 150mU r-인슐린(Novo-Nordisk의 Humalin-R)을 받았고; 4군은 경정맥을 통해 글루코스 주입 60분후 1㎖ PBS중의 500:g MC6(정맥내)를 받았다. 모든 경우들에서, 글루코스 주입은 18mg/분/kg이었다. 혈액 샘플을 다른 시간 간격에서 경동맥으로부터 수집하고 정량적 혈장 글루코스 레벨을 열량측정법으로 측정하였다.

결과를 도 5에 제공하였다. 결과는 MC6의 경구투여가 120분 시간 기간에서 r-인슐린의 정맥내 주사에 필적할만함을 나타낸다. 더욱이 이 분획과 r-인슐린의 전신적 주사는 동일한 저혈당 프로파일을 나타내었다. 이들 결과는 정제된 분획이 경구적으로 및 전신적으로 효과적임을 증명한다.

F. MC6.1의 특성화

MC6.1은 분해된 띠의 가시화를 위해 코마씨 블루이나 아니면 은 염색을 사용하여 4 내지 20% tris-글리신 구배 겔 상에서 SDS-PAGE 분석에 의해 더 특성화되었다. 결과를 도 6a 및 6b에 제공하였다.

G. MC6.1의 더 이상의 정제

MC6.1을 C-18 RP HPLC에 의해 더 정제하고 분석하였다(구배 0.1% TFA 완충액 A; 0.1% TFA중의 60% AcN). 결과를 도 7에 제공한다.

H. MC6.1의 등전점

MC6.1의 등전점을 분석하였고 8.2임이 발견되었다. 결과를 도 8a 및 8b에 제공한다.

I. MC6.1의 NMR 분석

프로톤 NMR 분석을 MC6.1로 하였고 결과를 도 9에 제공한다.

J. MC6.1의 저혈당활성

MC6.1의 저혈당활성을 상기 실시예 B와 유사한 방법으로 분석하였다. 평균 220g 체중의 SD 수컷 래트를 사용하였다. 래트에게 500㎕중의 50㎕ MC6.1을 제공하였다. 콘트롤 래트는 PBS를 투여하였다. 결과를 도 10에 제공한다. 결과는 MC6.1이 경구투여후 저혈당활성을 나타냄을 증명한다.

실시예 2

도 11은 정상 래트에서 경구 글루코스 내성 시험에서 MC6.1과 그것의 유도체, MC6.2 및 6.3 유사체의 저혈당활성을 나타낸다. 모든 세개의 펩티드가 비히클 처리된 동물에 비하여 이 실험에서 혈중 글루코스를 낮추는데 효과적이었다.

MC6.2 (11-아미노산 펩티드)의 글루코스 저하능력을 당뇨병 래트에서 더 평가하였다. 40mg/kg 체중의 투여량의 스트렙토조토신을 평균 200g의 SD 래트에 주사하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 100-g/래트의 투여량으로(0.5mg/kg 체중) MC6.2로 당뇨병 래트(평균 혈중 글루코스 330mg/㎗)의 경구처치가 콘트롤군과 비교하여 상당히 혈중 글루코스 레벨을 낮추었다.

MC6.2 (11-아미노산 펩티드)의 저혈당 효과를 비비만형 당뇨병(NOD) 마우스에서의 처치방식으로 평가하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 매일 NOD 마우스에 MC6.2의 경구투여는 비히클 처치된 동물과 비교하여 혈중 글루코스 레벨에 대해 상당한 효과가 있었다.

이들 결과는 MC6.1의 N-말단 7-11 아미노산 잔기가 사람 당뇨병의 치료를 위한 치료 요법의 개발에 대해 유용한 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는 것이 중요하다는 것을 증명한다.

상기 결과 및 논의로부터 고혈당질환, 특히 당뇨병의 치료에 유용한 여주의 신규한 추출물과 특정 펩티드제가 제공됨이 분명하다. 본 발명의 활성 약제는 신체에 의해 생성된 인슐린의 양의 상향조절을 일으키지 않기 때문에, 그것들은 혈중 글루코스 레벨을 조절하기 위한 유용한 대안적 기전을 제공한다. 더 나아가서 MC6와 펩티드 MC6.1, 6.2 및 6.3은 경구 활성이기 때문에, 그것들은 정맥내와 같은 투여의 더 침입적이고 덜 편리한 수단에 의해 도입되어야 하는 당뇨병의 치료에 사용된 종래의 인슐린 제품보다 상당한 이점을 제공한다.

본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허출원은 각각의 개개 간행물 또는 특허출원이 특정적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 지적한 것처럼 여기에 참고로 포함된다. 어떤 간행물의 인용도 출원일 이전의 명세서에 대한 것이며, 본 발명이 이전 발명에 의해 이러한 간행물을 앞서는 것으로 되지 않음을 인정하는 것으로 생각되어서는 안된다.

전술한 발명은 이해를 명확히 할 목적으로 예시와 실시예로써 더 상세히 기술되었으나, 본 발명의 가르침에 비추어 첨부한 청구범위의 정신 또는 범위에서 벗어나지 않고 어떠한 변화 및 수정이 가해질 수 있음은 당업자에게 쉽게 명백하다.

Claims

수용성 조성물 MC6.
제 1 항에 있어서, SDS-20% PAGE상의 단일 띠를 이동시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 단일띠는 10kDal 미만의 분자량을 가지며, r-인슐린보다 더 작은 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 3개의 펩티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 저혈당활성을 나타내며 경구투여에 의해 활성인 것을 특징으로 하는 조성물.
세개의 펩티드로 이루어지며, 저혈당성을 나타내고 경구투여에 의해 활성인, SDS-20% PAGE상에서 10kDal 미만의 단일띠로서 이동하는 것을 특징으로 하는 수용성 조성물 MC6.
생리학적으로 허용되는 비히클중의 MC6로 이루어지는 약제학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 생리학적으로 허용되는 비히클은 경구로 허용되는 비히클인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 경구로 허용되는 비히클은 탈이온수 또는 인산염 완충식염수로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
개체의 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 개체에 MC6를 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 MC6는 생리학적으로 허용되는 비히클에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 투여는 경구 또는 정맥내인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 개체는 고혈당 질환에 걸린 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 고혈당 질환은 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
고혈당 질환을 가져오는 포유동물 개체의 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 개체에 MC6의 약제학적 조성물을 경구투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 포유동물 개체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 고혈당 질환은 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 및 제2형 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
당뇨병을 가져오는 고혈당증을 갖는 사람에서 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 개체에 MC6를 함유하는 약제학적 조성물을 경구투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 및 제2형 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
MC6.1, MC6.2, MC6.3 및 MC6.1, MC6.2 및 MC6.3의 유사체 또는 모사체로 구성되는 군으로부터 선택된 펩티드.
제 23 항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드 MC6.1.

K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G (SEQ ID NO:01)
제 23 항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드 MC6.2.

K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A (SEQ ID NO:02)
제 23 항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드 MC6.3.

K-T-N-M-K-H-M (SEQ ID NO:03)
생리학적으로 허용되는 비히클중의 MC6.1, MC6.2, MC6.3, 이것들의 유사체 또는 모사체 또는 그것들의 혼합물로 이루어지는 약제학적 조성물.
개체의 혈중 글루코스 레벨을 감소시키는 방법에 있어서, 제 27 항의 약제학적 조성물을 상기 개체에 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 투여는 경구 또는 정맥내인 것을 특징으로 하는 방법.
제 28 항에 있어서, 상기 개체는 고혈당 질환에 걸린 것을 특징으로 하는 방법.
제 30 항에 있어서, 상기 고혈당 질환은 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 또는 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.