CN100413884C - 从苦瓜中提取降血糖多肽的方法及其产物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从苦瓜中提取降血糖多肽的方法。此外，本发明还提供由本发明方法提取的降血糖多肽，含有所述提取物的降血糖组合物及其用于治疗糖尿病的用途。

Description

从苦瓜中提取降血糖多肽的方法及其产物和用途

技术领域

本发明提供一种从苦瓜中提取降血糖多肽的方法。此外，本发明还提供新的降血糖组合物，它含有所述的提取物，用于治疗糖尿病。

背景技术

目前，已经由动物胰脏合成胰岛素，或由大肠杆菌合成人胰岛素(EliLily，USA)，并作为商品出售。至今，还没有商品化地从植物中提取胰岛素/降血糖多肽。

从动物的胰脏分离胰岛素因以下原因而受到反对：

1.杀死10,000头动物，只能获得1磅纯胰岛素。

2.它不适合舌下给予。

3.如果胰脏被某些疾病传染，常可能被胰岛素所携带(如果是病毒)。

4.昂贵的人胰岛素可由大肠杆菌来合成。

因此，为了避免传统胰岛素提取方法中的以上及其他缺陷，科学家转而注意基于植物的产品。

苦瓜是广泛生长于亚洲的一种葫芦科多年生草本植物。这种草本植物多见于热带，例如印度、南非、菲律宾、中国和缅甸。西方国家的苦瓜在形态和感觉上与热带品种都不同。该植物的各部分，尤其是果实，已被广泛用于制备降血糖的药物组合物。

已知，其果实的提取物具有降血糖特性，常被推荐用于降低糖尿病患者的血糖水平。

在印度专利No.136565中，申请人曾揭示一种从苦瓜中提取多肽-p的方法。用乙醇分别萃取干燥且粉碎的苦瓜的果实和组织培养物，然后与冷乙醇和二乙醚混合。然后，加入微量的锌，18小时后形成针状结晶。果实和培养物分别粉碎，在水、乙醇中均质化，并加入浓硫酸将pH调至03以获得絮凝状沉淀。

该方法具有以下缺陷：

1.因为不可能得到大量的乙醇，而且其中有杂质，所以在提取过程中使用乙醇是不可行的。

2.使用果实和组织培养物作为原料会给处理带来问题，不经济，而且得率低。

另一印度专利，No.176040克服了该专利的缺陷。后一专利揭示了一种用己烷和二乙醚提取高效多肽-p的方法。虽然该方法因为去除了油份和皂甙配基等其他杂质而获得了良好的得率，提高了纯度和药效，但它有缺陷，其中包括：

1.因为存在着油份和皂甙配基，纯化多肽-p非常麻烦。

2.在提取中使用二乙醚不可行，因为它易燃而且成本高。

3.农药/杀虫剂/尿素等杂质的存在影响了多肽-p的纯度。

4.得率不理想。

美国专利No.5484889描述了一种用于治疗肿瘤和HIV感染的植物蛋白质。已从苦瓜种籽中获得了该蛋白质。需要指出的是，分离和纯化得到的该蛋白质是一种核糖体灭活蛋白质，因此被用于肿瘤治疗。所述该蛋白质的提取过程包括溶剂的使用和繁琐的层析和透析等过程。在该专利所述的过程中，得率和纯度很低，而且有杂质。所以，为了克服以上及其他缺陷，申请人设计了一种从该植物来源提取降血糖多肽的新的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供从苦瓜的种籽和果实中提取降血糖多肽的方法。

本发明的目的还在于提供由上述方法提取的降血糖多肽。

本发明的目的还在于用所得多肽制备新的降血糖组合物。

本发明的目的还在于提供用于治疗人和动物的降血糖组合物。

根据以上及其他目的，本发明提供了自苦瓜中提取降血糖多肽的方法，和采用本发明方法所得的降血糖多肽和新的降血糖组合物。

因此，本发明提供了一种从苦瓜种籽中提取蛋白质的方法，包括的步骤有：

i)在合适的研磨机中将干种籽研磨成细粉，

ii)用非极性溶剂混合物处理粉碎后的种籽，

iii)将残留物溶解在约20％的丙酮水溶液中，

iv)用氢氧化铵之类合适的有机缓冲液将pH上调至9.5，

v)用硫酸处理上清液，

vi)收集絮凝状多肽沉淀，通过选择性结晶分离多肽。

然后可用层析法分析所得的多肽。

实施例之一中，将苦瓜的种籽剖开，用水彻底清洗2-3次，使它基本不含杂质，经真空干燥，然后萃取蛋白质。

另一实施例中，所用的溶剂包含丙酮与己烷的1∶2混合物。

在分析中，用己烷丙酮萃取种籽所得产物的熔点(234℃)。

需要注意的是，苦瓜植株的多数部位都不同程度地含有降血糖多肽，而本发明是由干种籽进行提取。

用己烷(食品级)和丙酮，而不是早先专利176040所用的乙醚，处理干种籽。这一过程去除了不需要的油份、黄酮类和皂甙配基，因此多肽的得率高，纯度高，效力高。

在糖尿病中，葡萄糖不能作为能源被机体所用，于是高水平地滞留在血液中，最后随尿液排除。有时，由胰β细胞分泌的胰岛素不足，或未充分行使其功能。

糖尿病主要分为胰岛素依赖性糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖性糖尿病(II型糖尿病)。I型糖尿病所处的状态是：胰β细胞因遗传、病毒感染等原因而机能下降，因此，基本上不分泌胰岛素，主要突发于20-30多岁的人群。虽然尚不确定，但II型糖尿病多发于具有糖尿病家族史、肥胖、承受高压力等的40多岁的人群。在II型糖尿病中，胰岛的胰岛素分泌是充足的，但其胰岛素耐受性和葡萄糖的利用却与正常人不同，因此，尽管血中胰岛素过高，血糖仍不能恢复到正常水平。

糖尿病常伴有许多症状。典型的例如：多尿，多饮和贪食。即，因高血糖的渗透压作用，糖尿病患者随尿液排出葡萄糖和过多的水分，于是表现为多尿，继而因脱水而口渴，这包括过量饮水，并感到胃中空虚，于是过量进食。糖尿病患者不能有效的利用葡萄糖作为能源，转而利用机体所储存的蛋白质和脂肪，这一现象通过一恶性循环而导致体重下降。

然而，这一现象是只在糖尿病初期才看得到的急性症状。如果糖尿病因延误治疗而发展成了慢性的，则将导致慢性血管病之类的并发症。因此，诸如糖尿病性视网膜病(视力障碍，视觉缺失，视网膜出血)，糖尿病性肾病，糖尿病性外周神经病等糖尿病并发症全面降低人体的代谢和感觉功能。

已开发并试验了许多药物，它们能降低非胰岛素依赖性糖尿病的血糖。然而，其中大多数存在着或多或少的缺点，有些对大多数人有严重的副作用，或者所需剂量过高。而且，有些将血糖降得过低，因此只能偶尔在发作时使用，否则会危害健康，其他则可能有毒性。目前，还没有一种天然的抗糖尿病药物能高效地降低血糖但不会降低到安全水平以下，而且没有严重的副作用。

根据本发明，只用本发明的蛋白质，即可以一种简便的方法制得一种具有药物活性的降血糖制剂。要获得所需的功能，只需较少量的该治疗药物。

采用本发明蛋白质的草本植物组合物

从苦瓜中提取的蛋白质具有降血糖特性，因此含该蛋白质的组合物可用于治疗哺乳动物的糖尿病。从苦瓜中获得的该蛋白质呈无定形粉末的形式。该蛋白质激活无活性的胰岛素，因此，根据各患者病程长短，它能够恢复胰的活力。实际上，它可能最终治愈糖尿病。申请人进行了500多次实验，确认每次约12mg的单独剂量十分有效。因此，值得推荐的是，含所述蛋白质的组合物的单次剂型应含约12mg所述蛋白质。

可将含本发明蛋白质的降血糖组合物配制成各种形式，例如片剂、注射剂、食品。为了制备片剂，将约12mg蛋白质与药学上认可的适用载体混合。所述药学上认可的载体须具有足够高的纯度和足够低的毒性。可以制备成非立即吞咽的食品，例如饼干、口香糖等。在各种制剂中，所述蛋白质的含量都是约12mg。已发现，用本发明蛋白质做的咸饼干很受糖尿病患者的欢迎。

需要指出的是，本发明的降血糖组合物需在餐前10分钟服用，每日至少4次。最重要的是，所述片剂或降血糖组合物只能咀嚼而不能立即吞咽。

作为本发明特征之一，所述的降血糖组合物没有副作用。在使用时，对其他治疗手段的运用没有限制。

附图说明

可参照以下附图对本发明进行更详细的描述：

图1显示由本发明方法所得多肽中已鉴定的部分氨基酸。

图2显示凝胶电泳的彩色扫描结果。主峰代表按本发明方法从苦瓜中提取的降血糖多肽。具体实施方式

还可参照以下实施例对本发明进行更详细的描述。许多修改对本领域技术人员来说是显而易见的，应该包括在本发明范围之内。

实施例1(蛋白质制备实施例)

从苦瓜中提取蛋白质：从苦瓜的成熟果实中得到100g干种籽。手工将这些种籽剖开。然后，剖开的种籽用水彻底清洗3-4次，使它们基本上不含任何杂质。然后将剖开的种籽真空干燥，用研磨设备粉碎成细粉。也可使用任何其他常用设备。

然后用丙酮∶己烷1∶2的溶剂混合物处理细粉，将残留物溶解于20％丙酮。加入氢氧化铵/有机缓冲液，将pH调至9.5，获取上清液，用H₂SO₄调至pH3，以获取絮凝状沉淀，收集沉淀，用乙酸锌结晶。

将硅胶G(Kieselgel G nach Stahl；E.Merck)铺在(0.4-0.5mm厚)玻璃薄板(20×20cm)上，在100℃活化半小时。将含有分离到的物质的溶液点样在玻璃板边缘以上1cm处，在正丁醇∶水∶乙酸(12∶5∶2)的有机溶剂混合物中展开。展开后的玻璃板在室温下干燥，并喷涂以0.25％的茚三酮丙酮溶液。从200块未喷涂的板上回收与胰岛素对应的分离物的茚三酮阳性斑点(R＝0.19)连同硅胶G，用以氢氧化铵缓冲的50％乙醇萃取。将萃得物过滤并真空干燥。然后，称量所得的纯的无色晶体(3g/100g干重的种籽)。

测定了纯化合物的熔点(232-235℃)和mp(234℃)。胰岛素标准品的熔点据记录是233℃。

进行了圆盘电泳(10％SDS Biophore凝胶，在tris缓冲液中电泳，操作条件为pH6.1，3％乙酸，低槽(lower cell)；90V，每管2.5mA；溴酚蓝示踪染料)。注入分离物的结晶样品和含二硫苏糖醇(dithiotheltol)和EDTA的牛胰岛素，电泳7小时。从管中收集凝胶，染色(考马斯亮蓝R250在7％乙酸水溶液中配成的0.05％溶液)，并用10％乙酸洗涤。如图2所示，分离产物和牛胰岛素的电泳模式几乎完全相同。对所得多肽的免疫分析显示，在以牛胰岛素进行测试时，没有任何交叉反应性。

舌下服用分离物显示出明确的高降血糖活性。对500名糖尿病患者进行治疗(片剂1)时，没有发现药物副作用。即使用药长达2-4年，这些患者中也没有出现神经病、嗜睡和低血糖。同时，在一个月内，血糖水平就显著下降。结果见表1。

实施例2(从苦瓜中提取蛋白质)

从苦瓜的成熟果实中得到200g干种籽。手工将这些种籽剖开。然后，剖开的种籽用水彻底清洗3-4次，使它们基本上不含任何组织。然后将剖开的种籽真空干燥，用研磨设备粉碎成细粉。也可使用任何其他常用设备。

然后用丙酮∶己烷1∶2的溶剂混合物处理细粉。将硅胶G(Kieselgel G nach Stahl；E.Merck)铺在(0.4-0.5mm厚)玻璃薄板(20×20cm)上，在100℃活化半小时。将含有分离物质的溶液点样在玻璃板边缘以上1cm处，在正丁醇∶水∶乙酸(12∶5∶2)的有机溶剂混合物中展开。展开后的玻璃板在室温下干燥，并喷涂以0.25％的茚三酮丙酮溶液。从200块未喷涂的板上回收与胰岛素对应的分离物的茚三酮阳性斑点(R＝0.19)连同硅胶G，用以氢氧化铵缓冲的50％乙醇萃取。将萃得物过滤并真空干燥。然后，称量所得的纯的无色晶体(3g/100g干重的种籽)。

测定了纯化合物的熔点(232-235℃)和mp(234℃)。胰岛素标准品的熔点据记录是233℃。

进行了圆盘电泳(10％SDS Biophore凝胶，在tris缓冲液中电泳，操作条件为pH6.1，3％乙酸，低槽(lower cell)；90V，每管2.5mA；溴酚蓝示踪染料)。注入分离物的结晶样品和含二硫苏糖醇(dithiotheltol)和EDTA的牛胰岛素，电泳7小时。从管中收集凝胶，染色(考马斯亮蓝R250在7％乙酸水溶液中配成的0.05％溶液)，并用10％乙酸洗涤。如图2所示，分离产物和牛胰岛素的电泳模式几乎完全相同。所得多肽的免疫分析显示，在以牛胰岛素进行测试时，没有任何交叉反应性。

以下是病例研究的代表性实施例，其中的患者已服用了本发明的降血糖组合物。所有患者都患有糖尿病，但慢性程度各不相同。患者被建议食用基本不含淀粉并包括至少一份水果的优质食物。还建议患者在服用本发明组合物的同时进行锻炼。在治疗开始之前，大多数患者曾服用Diaonli/Glyciphate/格列苯脲(Glynase)/苯乙福明(DBI)/格列苯脲(优降糖Euglucon)/Dimicron或glyciphage与格列苯脲(Glynase)的组合物。

在一周至40天后，观察到患者的血糖水平逐渐恢复正常。每餐前10-15分钟舌下含服本发明组合物，每日4此，持续6个月至3年不等。血糖水平高于355的，在所述剂量的组合物之外还补充以2(1+1)或1(1/2+1/2)的格列苯脲(Diaonil)(早晨和傍晚)。15天后，完全停用格列苯脲(Diaonil)。

病例研究：

1.Vivek Muklerjee先生，18岁，主诉腿疼，过分口渴，尿频，视力模糊。检查发现，他的餐后(pp)血糖水平为425mg/dl，空腹血糖为209mg/dl。口服药物都效果不佳。患者接受建议服用本发明的降血糖组合物(每日4次，12mg/剂。每次都在餐前10分钟服用，不用其他液体或固体送服)和Diaonil(1+1+1)。这使得血糖水平显著下降。一个月后，Diaonil减量至半，再以后则完全停用，2个月后，餐后血糖水平出人意料地下降至114mg/dl。现在，患者只使用本发明组合物，血糖水平保持正常，没有副作用。

2.K.P.Mishra教授，71岁，慢性糖尿病，血糖水平为305mg/dl。他依赖于胰岛素(18单位/日)。该患者接受建议服用本发明的降血糖组合物4次。近两年里，他的血糖保持正常。

3.D.P.Gaur先生，60岁，患慢性糖尿病10年。虽然服用60单位胰岛素，仍发生了神经病变和嗜睡。还有高血压和高甘油三酯症状。该患者开始每日4次服用本发明制剂，同时，胰岛素减至Yμ。血糖水平降低了。胰岛素剂量逐渐减少，最后停用，现在，患者服用4剂次的本发明制剂，血糖水平保持正常，而且身体健康。

4.Rashmi Geha女士，46岁，有症状，经血检(血红蛋白质-苷化测试)证实为糖尿病(320mg/dl)。自开始服用本发明粉末后，其血糖水平保持正常。她从未使用过其他口服药物。

5.Banerjee先生，70岁，慢性糖尿病患者(15-20年)，并患有高血压，高甘油三酯和高胆固醇。他服用了3年本发明粉末，每日4剂次本发明制剂。这使得他的血糖水平保持正常，并使其血压和胆固醇水平得到控制。

表1：本发明方法提取的多肽对糖尿病患者血糖水平的作用

受试者数量	糖尿病病程(年)	餐后血糖水平(mg/dl)	多肽引起的平均血糖下降(mg/dl)(207天后)
				250	2-5	160-200	120-110
250	6-10	210-350	150-190
				100	11-15	355-450	250-270
5	15-20	460-500	282

Claims (8)

1. 一种自苦瓜中提取降血糖多肽的方法，包括：

i.研磨干的苦瓜种籽；

ii.用丙酮/己烷溶剂混合物处理粉碎后的种籽；

iii.将残留物溶于20％的丙酮水溶液中；

iv.用合适的有机缓冲液将pH上调至9.5；

v.用硫酸处理上清液将pH调节至3；和

vi.收集絮凝状多肽沉淀，通过选择性结晶分离该多肽。

2. 根据权利要求1所述的方法，步骤iv中的有机缓冲液是氢氧化铵缓冲液。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中是从苦瓜的干种籽中提取降血糖多肽。

4. 根据权利要求1所述的方法，包括将苦瓜的种籽剖开，用水彻底清洗2-3次使它基本不含杂质，并真空干燥，然后提取降血糖多肽。

5. 根据权利要求1所述的方法，其中所用的溶剂混合物含丙酮与己烷的1∶2混合物。

6. 一种用权利要求1所述方法自苦瓜中提取得到的降血糖多肽。

7. 一种降血糖组合物，包含权利要求6所述的降血糖多肽。

8. 权利要求6所述自苦瓜中提取的降血糖多肽用于制造治疗糖尿病的降血糖药物的用途。

Images