JP2002516608A - ニガウリの経口活性画分、その活性ペプチドおよび糖尿病治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 MC6と称するニガウリの水可溶性抽出物、その調製方法、および高血糖疾患の治療におけるその使用方法が提供される。活性なMC6はSDS-PAGEにて単一のバンドとして移動し、10kDalより小さな分子量を有し、３種のペプチドを含むことを特徴とする。また、MC6.1と称するMC6のペプチド成分およびそのアナログおよび疑似物も提供される。活性なMC6、MC6.1、MC6.2およびMC6.3は経口投与であっても血糖降下作用を示す。また、高血糖疾患、特に糖尿病を治療する活性薬剤の使用方法も提供され、そこでは、活性薬剤は経口投与されるのが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 ニガウリの経口活性画分、その活性ペプチドおよび 糖尿病治療におけるその使用 序 技術分野 本発明の分野は糖尿病である。発明の背景 インシュリン非依存性糖尿病(NIDDMまたはII型)は米国における第４位の主要 な死因であり、全世界人口の５から７％を襲っており、西欧諸国において罹患率 が増加している。糖尿病においては、身体は充分なインシュリンを作らないか、 または作られるインシュリンが効果的でなく、血糖値の上昇を生じさせ、高血糖 症として技術的に知られている状態を引き起こす。糖尿病はどの年代の人をも冒 し得るが、糖尿病の大多数は４５才以上である。この病気は家族に伝わる傾向が あり、糖尿病になる危険因子は肥満個体で増加する。 糖尿病は治癒しない慢性病であり他のいくつかの疾患とリンクしている。糖尿 病は25〜74歳の人々の失明の主要な原因である。糖尿病の全ての人の10％が腎疾 患を起こす。糖尿病は非外傷性下肢切断の最も頻度の高い原因である。糖尿病の 人については脚切除の危険性は30倍高い。糖尿病の人は２から４倍心臓疾患を起 こし易く、５倍発作(stroke)を起こしやすい。 糖尿病の原因は末だ謎であるが、遺伝および環境の両方が重要な役割を果たす ようである。糖尿病には２つの型がある：インシュリン依存性（Ｉ型）およびイ ンシュリン非依存性(II型)。Ｉ型糖尿病は子供および青少年にしばしば起こる自 己免疫疾患である。Ｉ型糖尿病の発症に関与する自己抗原は未だ知られておらず 、患者はその生命を維持するために毎日インシュリンi.v.を受けなければならな い。 II型糖尿病は身体が充分な量のインシュリンを作れない、または身体が実際 に作るインシュリンを適切に利用できないことから起こる代謝異常であって、糖 尿病の最も一般的な形態であると考えられる。インシュリン分泌およびインシュ リン抵抗性が主要な欠陥であると考えられているが、関係する正確な遺伝的要因 はまだ末知である。通常、糖尿病の患者は以下の１以上の欠陥を有している。そ れらは以下のものである：膵臓によるインシュリン生産低下；肝臓によるグルコ ースの分泌過多；骨格筋によるグルコース取込障害；グルコース輸送欠損(Glut- 1、Glut-4)；インシュリンレセプターの感受性低下；および、炭水化物の代謝分 解における欠損。 現行の治療はインシュリンi.v.以外に４種の経口血糖降下剤を使用する。それ らは以下に要約される： 上の表から明らかなように、糖尿病の治療に利用できる現行の薬剤のそれぞれ はある種の不利益を有している。従って、糖尿病の治療における使用のための新 規な薬剤の同定と開発に継続した関心がもたれている。 ニガウリ(M.charantia)はその果実が野菜として使用される熱帯植物である。 いくつかのグループがニガウリの血糖降下作用について、哺乳動物モデル（Shib ibら、Biochem．J.，292，267-270(1993);Aliら、Planta Med．59，408-412 (1993);Akhtarら、Planta Med．42，205-212(1981)）およびヒト（Leatherdale ら、Br．Med．J．282，1823-1824(1981);Aslamら、Lancet，I．607(1979)）に関 して報告している。しかしながら、血糖降下成分および作用機序は未知である。 ニガウリから得られた、インシュリン様活性を有する１１kDalペプチドの単離 が以下に報告されている：Khannaら、"Hypoglycemic Activity of Polypeptide- p from a Plant Source"第20回アメリカ薬理学会年会、Purdue大学、West Lafay ette，1979年７月29日〜8月３日；Baldwaら、Upsala J．Med．Sci．(1977)82:39 -41および米国特許第3,945,988号。これらすべの報告の中で、インシュリン様ポ リペプチドは非経口的に投与、すなわちi.v.または皮下投与されている。 最近の報告ではニガウリのアルコール粗抽出物が一部は肝臓におけるグリコー ゲン合成の刺激により血漿グルコース濃度を低下させることが示されており、こ れがインシュリン分泌薬剤として作用することはありそうもない(Sarkarら、Pha rmacol．Res.，33，1-4(1996))。 発明の要約 ニガウリの水可溶性画分(MC6)及びその調製方法及び高血糖症の治療における 使用が提供される。MC6は、分子量が10kDal未満であるSDS-PAGE電気泳動による 単一バンドとして移動すること、サイズが組換えインシュリンより小さいこと、 ３種のペプチドを含むこと、及び高分子量タンパク質混入物を含まないことを特 徴とする。また、低血糖活性を示しかつ種々の高血糖症を治療するために経口投 与されるMC6の個々のペプチド成分、標識したMC6.1、及び長さがMC6.1より短いM C6.1のペプチド誘導体、MC6.2及びMC6.3が提供される。 図面の簡単な説明 図1Aは、ニガウリの種々の水可溶性画分のSDS-20%-PAGEによるゲル電気泳動の 結果を示す図である。図1Bは、精製したMC6標品を示す図である。図1Cは、MC6の HPLCの結果を示す図である。 図2Aは、SDラットにおける経時血漿グルコースレベルに対するニガウリの末 精製水性抽出液及び対照の作用を示すグラフ図である。図2Bは、SDラットにおけ る経時血中グルコースレベルに対する経口投与したMC6の作用を示すグラフ図で ある。 図3A及び図3Bは、SZC誘導糖尿病に罹っているラットにおける血中グルコース レベルに対するMC6の作用を示すグラフ図である。 図４は、MC6を経口投与すると血清インシュリンレベルが上昇しないことを示 すグラフ図である。 図５は、MC6の経口投与が血中グルコースレベルを低下させるのにr-インシュ リンを静注投与するのと同様の効果があることを示すグラフ図である。 図6(a)及び図6(b)は、各々クーマシーブルー染色と銀染色を用いた4〜20％ト リスグリシン勾配ゲルにおけるMC6.1のSDS-PAGE分析の結果を示す図である。 図７は、C18 RP-HPLCを用いたMC6.1の精製から得られた結果を示すグラフ図で ある。 図8a及びbは、MC6.1の等電点分析の結果を示す図である。 図９は、MC6.1のNMR分析の結果を示す図である。 図10は、血中グルコースレベルに対するMC6.1の作用を示すグラフ図である。 図11は、正常ラットにおける経ログルコース負荷試験でのMC6.1、MC6.2及びMC 6.3の低血糖活性を示すグラフ図である。 図12は、糖尿病ラットにおけるMC6.2のグルコース低下能を示すグラフ図であ る。 図13は、非肥満糖尿病マウスにおけるMC6.2の低血糖効果を示すグラフ図であ る。 具体的な実施態様の説明 MC6と称するニガウリの水可溶性画分、MC6.1と称するその活性ペプチド成分、 およびそのペプチド誘導体MC6.2およびMC6.3、その調製方法、および高血糖疾患 の治療におけるそれらの使用が提供される。MC6はSDS-PAGE上で１０kDalの分子 量を有する単一のバンドとして一緒に移動し、組換えインシュリンよりも小さい サイズを有する３種のペプチドを含むことを特徴とする。MC6およびMC6.1 は血糖降下作用を示し、経口的に活性である。本発明のさらなる説明において、 MC6およびMC6.1の特徴が更に詳細に説明され、それと共にそれらの調製方法の説 明および高血糖疾患の治療におけるそれらの使用、特に糖尿病にかかった人の治 療における使用の説明がなされるであろう。 誘導体MC6.2およびMC6.3は、それぞれ18−a.a.ペプチドMC6.1の11-a.a.および ７−a.a.ペプチド誘導体である。 本発明を更に説明する前に、本発明は以下に記載される具体的な実施態様に限 定されるものではないことを理解しておけなければならない。なぜなら、具体的 な実施態様のバリエーションを行うことができ、それはなお添付の請求の範囲の 範囲内にあるからである。また使用される用語は具体的な実施態様を説明する目 的のものであって、限定を意図したものではないことは言うまでもない。そうで はなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって確定されるである。 本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形は特に文脈 がそうでないことを明確に意味しない限り、複数の参照を含むものである。特に 明確にしない限り、ここで用いる全ての技術用語および科学用語は本発明が属す る分野の通常の知識を有するが通常理解するのと同じ意味である。 本発明のMC6は植物種M.charantia（ニガウリ）の水可溶性画分または抽出物で ある。MC6は葉、茎、根、果実、種子その他を含み、植物体全体を含む、ニガウ リの１以上の組織または構成部分に由来しても良いが、MC6は通常ニガウリの果 実、好ましくは種子と分離した末熟なニガウリ果実に由来する。 MC6はSDS-20％PAGE上で単一バンドとして移動し、SDS-20％PAGEの際に電場の 強さが100Vのときその単一バンドの分子量が10kDalより小さいことを特徴とする 。MC6は組換えインシュリンよりも小さなサイズを有しており、従って、約６kDa lよりも小さい。MC6は、C8またはC18カラムの逆相条件で高性能液体クロマトグ ラフィー(HPLC)によって、３つのピークとして溶出されることによって更に特徴 づけられる。これらの条件下では、第１のピークは11.33分に溶出され、第２の ピークは25.35分で溶出され、第３のピークは34.67分で溶出される。 本発明のMC6は高分子量夾雑物、例えば、タンパク質を含まない調製物である 。ここで、本出願では高分子量夾雑物とは約50kDalを越える分子量を有する分子 を意味するために使用される。通常、MC6は10kDalを越える分子量を有するいか なる夾雑物も含まない。 MC6は哺乳動物において血糖降下作用を示す。血糖降下作用とはMC6を哺乳動物 に投与すると、哺乳動物の血中グルコース濃度が低下し、血中グルコース濃度の 低下量はその哺乳動物に投与されたMC6の量に比例する。MC6は経口投与されても 静脈内投与されても血糖降下作用を示し、従って、経口的に活性、または経口的 に生物有効的(bioavailable)であり、そのことは哺乳動物の消化管内を通過する ことによって不活性化されないことを意味する。 MC6はその供給源のニガウリ組織からMC6を分離するために提供されるどのよう な都合のよい手段を用いて調製されてもよい。ニガウリ組織からMC6を得るため の一つの方法は、例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、水その他のような溶媒存 在下で組織を細断することによって組織の粗懸濁液をまず作ることである。ここ で細断はブレンダーまたは他の細断手段によって行ってよい。次に、得られた懸 濁物の粒子状の物質は分離され、液体相から捨てさられる。このステップは遠心 、通常約10,000から16,000rpmの速度の遠心、続いて、その上清を濾過すること によっておこなってよい。この濾過は0.5から0.1μの範囲、通常は約0.45から0. 22μの孔サイズを有するフィルターを通して行われ、この濾過は真空下で行われ てよい。得られた濾液は次に順次30kDalおよび10kDalカットオフメンブレンに通 され(そのようなメンブレンはこの技術で知られており、アミコンM.W.カットオ フフィルターその他に代表される)、MC6を含む初期ニガウリ組織の水可溶性画分 が得られる。得られた水可溶性画分はそのまま使用されてもよく、また、続く使 用のために更に処理されてもよい。更なる処理は脱水処理、例えば、凍結乾燥そ の他を含むことがある。得られた水可溶性画分は、安息香酸ナトリウムその他の ような保存剤の存在下で１から5℃、通常２から4℃にて液体形態で保存すること もできる。 MC6.1はSDS-PAGE解析（4-20％トリスーグリシン勾配ゲル）において単一のバ ンドとして泳動されるMC6の特定のペプチド成分であり、SDS-PAGEによる測定で は2.5kDよりも小さな分子量を有する。MC6.1は8.2の等電点を有する。MC6.1は１ ８アミノ酸残基長であり、MC6.1のアミノ酸配列は以下の通りである： K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G（配列番号１） MC6.1は哺乳動物において血糖降下作用を示す。本発明のMC6.1はその天然の環 境、例えばMC6における環境から分離された、単離形態または純粋な形態その他 の形態のMC6.1である。 また、血圧降下作用を示すMC6.1のペプチドアナログおよび疑似物（mimetics ）も提供される。MC6.1アナログおよび疑似物は活性モチーフ配列として少なく とも８アミノ酸、通常少なくとも約12アミノ酸、より普通には少なくとも約18ア ミノ酸、かつ約40アミノ酸よりも少ない、通常は30よりも少ないアミノ酸を含む であろう。以下の配列を有する、MC6.1の11-a.a.誘導体、MC6.2はその具体的な ペプチドである： K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A（配列番号２） および、以下の配列を有する７-a.a.誘導体： K-T-N-M-K-H-M（配列番号３） 主題の配列中で約３つまでの置換または欠失を作成してもよく、その改変は約 活性モチーフ中のアミノ酸数の約２０％（数％）を越えず、通常約１０％（数％ ）を越えないことが理解されるであろう。この技術で知られているように、、大 きな疎水性グループ：イソロイシン、ロイシン、バリンおよびフェニルアラニン ；セリンとスレオニン；グリシンとアラニン；アスパラギンとグルタミン；アス パラギン酸とグルタミン酸；またはリジン、アルギニンおよびヒスチジン内の置 換を含む保存的置換が好ましい。 天然の供給源からの精製に加えて、MC6.1および、MC6.2およびMC6.3のような 、そのペプチドアナログおよび疑似物は合成（例えばMechman Model 990ペプチ ド合成機または他の商業的合成機を使用）のような従来技術によって調製しても よい。ペプチドは組換え法（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Man ual，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989参照）によって直接に作製し てもよく融合タンパク質、例えばアフィニティー試薬による精製を可能とす る特異的結合対の一つとの融合タンパク質として作製し、続いてタンパク質分解 性切断、通常望みのペプチドを生じるように操作した部位での切断によって作製 してよい(例えば、Driscollら、(1993)、J.Mol．Bio．232:342-350)。 オリゴペプチド（すなわち、MC6.1、MC6.1アナログ、MC6.1疑似物）は安定性 を増強する、特定のレセプターに結合させる、部位指向的作用を与える、精製の 容易化、物理的特性（例えば、溶解性、電荷等）を改変する、コンフォメーショ ンを安定化させる等のために都合のよいリンキング部位、例えば、システインま たはリジンを生じるように伸長されることもある。オリゴヌクレオチドは融合タ ンパクとして非野生型側方領域に結合されること、リンキング基またはシステイ ン残基（ジスルフィド）またはペプチド結合を介して共有結合的に結合されてよ い。このオリゴペプチドはマレインイミド安息香酸(maleimidobenzoic acid)、 メチルジチオ酢酸、メルカプト安息香酸、S-ピリジルジチオプロピオン酸、等の ような種々の二官能性試薬を介して結合してもよい。オリゴペプチドはアミノ酸 鎖のＮ−またはＣ−末端の単一アミノ酸に結合してもよく、内部に結合しても良 い。例えば、この主題のペプチドに対する抗体産生を容易にするためキーホール リンペットヘモシアニン、オボアルブミン等のような免疫原性ペプチドに主題の ペプチドが共有結合的に結合してもよい。 あるいは、主題のポリペプチドは他のペプチドまたはタンパク質と共に発現さ れ、内部あるいはＮ−またはＣ−末端において鎖の一部となっても良い。種々の 発現後修飾が行われてもよい。例えば、適切なコード配列を使用することにより 、ファルネシル化（farnesylation）またはプレニル化（prenylation）を与える ことがあり、それにより主題のペプチドは一端で脂質群に結合しリポソームのよ うな脂質膜に挿入され得るであろう。 主題のオリゴペプチドはPEG化(PEGylate)されてもよく、ポリエチレンオキシ 基は血流中で増強された寿命を与える。主題のオリゴペプチドは補体結合を増強 するためIgGアイソタイプのFcのような他のタンパク質と結合させ、またはリシ ン、アブリン、ジフテリア毒素その他のような毒素、特にＡ鎖と結合させてもよ い。このオリゴペプチドは部位指向性作用のために抗体に結合させてもよい。結 合技術に関しては、例えば、米国特許第3,817,837号；3,853,914号；3,850, 752号；3,905,654号；4,156,081号；4,069,105号；および4,043,989号を参照せ よ。これらは本明細書に含まれるものとする。 主題の発明のMC6、MC6.1、MC6.2およびMC6.3（およびそのアナログおよび疑似 物）は上昇した血中グルコース濃度の存在を特徴とする疾病、例えば、Ｉ型およ びII型糖尿病を含む糖尿病のような血糖上昇異常、および肥満、多コレステロー ル腎関連疾患その他のような高血糖に関連する他の疾患の治療に用途が見出せる 。「治療」とはMC6、MC6.1、MC6.2およびMC6.3（およびそのアナログおよび疑似 物）が高血糖疾患に苦しむ宿主の血中グルコース濃度を少なくとも低下させるた めに投与されることを意味する。MC6および主題のオリゴペプチドによる高血糖 疾患の治療において、MC6またはオリゴペプチドは宿主の血中グルコース濃度を 許容できる範囲まで低下させるに充分な量で宿主に投与される。ここで、許容で きる範囲とは宿主にとって正常な平均血中グルコース濃度の±10％、通常±８％ 、より普通には±５％を意味する。 主題の発明により、種々の宿主がその血中グルコース濃度を下げるために治療 されることがあり、そのような宿主は哺乳動物、および家畜、有用または希少動 物、イヌやネコのようなペットおよびヒトを含む。 特に関心があるのは、Ｉ型およびII型の両方を含む糖尿病のようなヒトの高血 糖疾患の治療法であり、そこではMC6、MC6.1、MC6.2、MC6.3およびそのアナログ および疑似物が高血糖疾患に苦しむヒトに血中グルコース濃度を少なくとも低下 させるために投与される。ここで、血中グルコース濃度はほぼヒトの正常な血中 グルコース濃度範囲にまで低下される。活性薬剤は上述したようなどのような都 合のよい技術を用いてヒトに投与してもよいが、特に関心があるのは活性薬剤の 経口投与である。 画分MC6またはMC6.1、6.2および／または6.3ペプチドによる治療のため、活性 化合物は高血糖疾患に苦しむ宿主に、どのような都合のよい投与技術を用いて投 与してもよく、そのような技術には、静脈投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投 与、経口投与その他が含まれ、経口経路投与が特に注目される。宿主にデリバリ ーされる用量は投与経路に必然的に依存するが、一般には約50〜500mg/70kgヒト 体重、通常は約100〜200mg/70kgヒト体重であろう。MC6によるヒトの高 血糖疾患の治療において、ヒトに投与すべき活性画分または化合物の用量は一般 には約50〜500、通常約100〜200mg/70kgヒト体重の範囲であろう。 主題の発明の活性画分あるいは化合物の使用において、それらは生理学的に許 容されるビヒクルと一緒にされて医薬組成物を生成することがある。医薬組成物 を生み出すために活性画分または化合物が一緒にされる生理学的に許容されるビ ヒクルの性質は、必然的にその医薬組成物が投与されようとしている方法に依存 する。ビヒクルの例としては、水、例えば注射用滅菌水、生理食塩水その他が含 まれる。特に関心があるのは、経口投与に使用するために適した、生理学的に許 容できるビヒクルである。そのようなビヒクルはこの技術で知られており、水、 例えば脱イオン水；生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水、錠剤またはカプ セル形態の凍結乾燥粉末(このような形態には種々の充填剤、バインダーその他 を含むことがある)、その他が含まれる。この医薬組成物中の活性成分の量はそ の医薬組成物が投与される方法の観点から選ばれ、当業者によって経験的に決定 されるであろう。 治療のため、MC6.2および／またはMC6.3、およびそのアナログまたは疑似物が 経口的、局所的または非経口的、例えば特定部位への注射、例えば、皮下的に、 腹腔内、脈管内、鼻内、経皮的その他で投与されてよい。経口投与のための剤形 には、MC6と共に使用するのに適した、上に掲げたものが含まれる。注射用の剤 形は水、生理食塩水、PBS、水性エタノール、水性エチレングリコール、その他 のような、生理学的に許容できるメディウムを含むであろう。使用され得る水可 溶性保存剤には、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸 塩、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、ホウ酸フェニル 水銀、パラオキシ安息香酸エステル類(parabens)、ベンジルアルコールおよびフ ェニルエタノールが含まれる。これらの薬剤は個々に約0.001から約５質量％、 好ましくは約0.01から約２％で存在してよい。使用され得る適切な水可溶性緩衝 剤は、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリ ウム、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸ナトリウムのような、アルカリまたはアル カリ土類カルボン酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩 、コハク酸塩その他である。カルボキシメチルセルロースのような添加剤が約 0.01から約５質量％の量で担体として使用されてよい。剤形はその製剤の目的、 レセプター活性を調節するために使用される特定のモード、意図する治療その他 に依存して変動するであろう。この剤形には、貼付剤、カプセル、リポソーム、 遅延性コーティング、丸剤が含まれ、あるいは連続投与のためポンプ内に製剤化 されることもある。具体的な用量は既知の方法に従って経験的に決定することが できる。例えば、Harriosn's Priciples of Internal Medicine,第11版、Braunw aldら編集、McGraw Hill Book．Co.，New York，1987を参照せよ。 一般には、活性画分またはペプチド、そのアナログおよび疑似物の治療上効果 的な用量は約0.005-10mg/kg宿主重量、より通常は約0.01-1mg/kg宿主重量の範囲 であろう。そのような用量は所望の血糖降下作用を達成するのに充分であろう。 投与は毎日のように頻繁でもよく；通常は１日に１〜数回を越えることなく、毎 週のごとく時たまに投与され、投与される薬剤の濃度に依存する。投与されるオ リゴペプチドの量は一般にそのペプチドの半減期に依存して調整されるであろう 。ペプチドが増強された半減期を有しているか、または、例えばペプチドを長期 間にわたって維持するマトリックス（例えばコラーゲンマトリックス）中に導入 された徐放性組成物含有粒子のようなデポ製剤(depot)として供給されている場 合、本質的に連続的速度で長期間にわたってペプチドを連続的に注入するポンプ の使用、その他の場合は、範囲内の低い部分の用量が使用されてよい。CRC Crit ical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,第１巻、CRC Press、Boca Raton，FL，1987,pp39-90のHeller，Biodegradabel Plymers in Controlled Dr ug Delivery には、制御薬剤デリバリーのためのカプセル形成が記載されており 、Di Colo（1992）Biomaterials 13:850-856には疎水性ポリマーからの制御薬剤 放出が記載されている。 以下の実施例は説明のために提示されるものであり、限定のためではない。 実施例１ A．ニガウリ(Momordica Charantia)抽出液の活性成分の単離と精製 新鮮で未熟な果実モモルディカ・チャランチアを洗い、ふき取り、種子を取り 除いた。果肉をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)か又は脱イオン水中でブレンドした。 懸濁液を12,000×gで遠心分離し、減圧下滅菌フィルター(ワットマンから入手): 0.22でろ過した。透明な上澄みをアミコンろ過から得られた30kD、10kD及び3kD カットオフメンブレンに順次通過させた。0.45μ(第１工程)、0.22μ(第２工程) 及び10kD(第３工程)区分の画分をSDS-20％ポリアクリルアミドゲルで分析し、結 果を図1Aに示す。第３工程の精製画分は、サイズがヒトインシュリンより小さい 単一バンドを示した。ゲル分析から、精製した画分が種々の高分子量タンパク質 バンドを含まないことは明らかである。MC6とラベルした10K区分の画分のグラム 量での数個のバッチを図1Bに示したように精製した。得られた精製画分を凍結乾 燥して結合していない水のないMC6を得た。 100〜500mgの凍結乾燥MC6を高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)(C8又はC18 カラムを用いてTFA/アセトニトリル直線勾配を用いた逆相HPLC(分析用))にかけ 、結果を図1Cに示す。HPLC分析から、３本の主要ピークが各々リテンション時間 17.35分、25.35分及び34.67分において示され、MC6が３種のペプチドを含むこと が証明された。 B．MC6の低血糖活性 精製した画分の低血糖作用を出発粗抽出標品と比較した。SDラット(平均200g チャールズリバー、マサチューセッツ州から入手)を３時間絶食し、基礎血漿グ ルコースレベルを測定するために尾静脈から血液アリコートを採取した。5mlの 粗抽出標品又はPBS(上記パートAで調製した)中1mlの精製画分MC6(500:g)を各ラ ットに経口投与した。対照ラットには同量のPBSを投与した。サリトール(静注)( 0.08μg/ml/kg、プロパノロール(1.7μg/分/kg))を用いてラットを麻酔した。各 ラットの頚静脈にカニューレを挿入し、グルコースを5mM KClと140mM NaClの溶 液として３時間注入した(18mg/分/kg体重)。30、60、90、150及び180分に頚動脈 から採血した。血漿グルコースレベルをKadishら，Clin．Chem．(1968)14:116に 記載された確定熱量測定法によって定量した。 結果を図2Aに示す。結果から、粗抽出液を投与したラットは全ての時点で血中 グルコースレベルが著しく低下し、その作用は60分でかなり大きい(相対差がほ ぼ100％)ことが証明される。同時に、図2Bに示されるように、経口投与したPBS 中MC6(500:g)の1mlの精製した水性画分は粗抽出液と同様の作用があり、MC6 の単離したポリペプチドプールが粗抽出液中の有効主成分であること意味する。 C．予防及び治療機序に対するMC6の作用 動物モデルにおいて糖尿病の予防機序と治療機序双方での精製画分の効力を示 すために次の実験セットを行った。雄SDラット(各200〜225g)においてストレプ トゾトシン(40mg/kg体重)(シグマChem.、ミズーリ州から入手)を用いて糖尿病を 誘導した。予防モデルにおいては、ラットに毎日の有効な０日に1ml(500:g)の精 製画分MC6を投与した。治療モデルにおいては、ラットに病気に罹患した５日目 に1mlの精製画分MC6(500:g)を経口投与した。血清グルコースレベルを15日間毎 日モニターした。図3A及び図3Bに示されるように、精製した画分MC6は、予防機 序及び治療機序双方に非常に効果的である(p<0.001、10日目)。 ストレプトゾトシン誘導糖尿病の予防機序におけるMC6の作用は、Ｉ型自己免 疫糖尿病を治療するのにMC6を用いるという適合性を強く支持するものである。 D．血清インシュリンレベルに対するMC6の作用 低血糖作用中の全身系インシュリンの調節におけるMC6の役割を調べるために パートCに記載された実験とは異なる日に動物の血清インシュリンレベルを測定 した。血清インシュリンレベルの定量的測定をHales & Randle，Biochem．J.(19 63)88:137に記載されるラジオイムノアッセイ(LINKOアッセイ)で行った。図４か ら、本画分の経口投与が血清インシュリンレベルを高めることに対して効果がな かったことがわかり、本画分の作用が膵臓によるインシュリン分泌によって仲介 されないことを意味する。図４においては、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病 を誘導した。末処理グループにはPBSのみ投与し、SZCグループには40mg/kgSZCを 投与し、予防グループには１日目からMC6を経口投与し、治療グループには５日 目からMC6を投与した。標準RIAによりインシュリンを測定した。データは、３回 の測定の平均を示した。 E．MC6の経口投与はインシュリンの全身系注射と同様に有効である 次の実験においては、SDラットにおいて経口投与した精製画分MC6(500:g)をイ ンシュリン(150mU)の静注と比較した。ラットを４つのグループに分け、３時間 絶食した。グループ１にはPBSのみ投与し、グループ２にはグルコース注入の60 分前にMC6を経口投与し、グループ３にはグルコースを頚静脈に注入した60 ループ４にはグルコースを頚静脈に注入した60分後に1mlのPBS中500:gのMC6を投 与した(静注)。全ての場合において、グルコース注入は18mg/分/kgであった。間 隔をおいた時間に頚動脈から血液試料を採取し、定量的血漿グルコースレベルを 熱量測定法で測定した。 結果を図５に示す。結果から、MC6の経口投与が120分間でr-インシュリンの静 注に匹敵することがわかる。更に、本画分とr-インシュリンの全身系注射は同じ 低血糖プロファイルを示した。これらの結果から、精製画分は経口及び全身系に 有効であることが証明される。 F．MC6.1の特徴付け 分割したバンドを目に見えるようにするためにクーマシーブルー染色か又は銀 染色を用いて4〜20％のトリスグリシン勾配ゲルによるSDS-PAGE分析でMC6.1の特 性解析をした。 G．MC6.1の更なる精製 MC6.1を更に精製し、C-18 RP HPLC(勾配0.1％TFA緩衝液A;0.1％TFA中60％AcN) により分析した。結果を図７に示す。 H．MC6.1の等電点 MC6.1の等電点を分析し、8.2であることがわかった。結果を図8a及び図8bに示 す。 I．MC6.1のNMR分析 MC6.1でプロトンNMR分析を行い、結果を図９に示す。 J．MC6.1の低血糖活性 MC6.1の低血糖活性を上記実施例Bと同様の方法で分析した。体重が平均220gの SD雄ラットを用いた。ラットに50μgのMC6.1を500μlとして投与した。対照ラッ トにPBSを投与した。結果を図10に示す。結果から、MC6.1が経口投与後に低血糖 活性を示すことが証明される。 実施例２ 図11は、正常ラットにおける経口グルコース負荷試験におけるMC6.1及びそ の誘導体、MC6.2及びMC6.3の低血糖活性を示すグラフである。３種のペプチドは 全て、本実験において賦形剤処理ラットに比べて血中グルコースを低下するのに 有効であった。 MC6.2(11アミノ酸ペプチド)のグルコース低下活性を糖尿病ラットにおいて更 に評価した。ストレプトゾトシンを40mg/kg体重の用量で平均200gのSDラットに 注射した。図12に示されるように、糖尿病ラット(血中グルコース平均330mg/dl) をMC6.2で100〜g/ラット(0.5mg/kg体重)の用量で経口治療すると対照グループに 比べて顕著に血中グルコースレベルが低下した。 非肥満糖尿病(NOD)マウスの治療機序においてMC6.2(11-アミノ酸ペプチド)の 低血糖作用を評価した。図13に示されるように、NODマウスに毎日MC6.2を経口投 与すると賦形剤処理ラットに比べて血中グルコースレベルに対する作用が顕著で ある。 これらの結果から、MC6.1のN末端7〜11アミノ酸残基はヒト糖尿病の治療の治 療法の開発に有効である血中グルコースレベルを低下させるのに重要であること が証明される。 上記の結果及び考察から、ニガウリの新規な抽出液及び個々のペプチド物質が 高血糖症、特に糖尿病の治療に有効であることを示すことは明らかである。本発 明の活性剤は、体内で生じたインシュリン量のアップレギュレーションを引き起 こさないので、血中グルコースレベルを調節する別の有効なメカニズムを与える 。更に、MC6及びペプチドMC6.1、MC6.2とMC6.3は経口的に活性であるので、侵襲 的で便利でない投与手段によって導入されなければならない糖尿病治療において 用いられてきた従来のインシュリン製剤より著しく有利である。 本明細書に引用した文献及び特許出願の記載は全て、各々の文献又は特許出願 が明確にかつ別個に含まれることを意味するかのように本願明細書に含まれるも のとする。文献の引用は、出願日以前に発表されたものであり、本発明が先行発 明に基づいてその文献に先行する権利を与えないことを認めるものとして解釈す べきではない。 理解を明らかにするために本発明を具体的な説明及び実施例によって詳述して きたが、後記の請求の範囲の真意又は範囲から逸脱することなくある種の変更や 修正が行なわれることは本発明の教示から当業者に容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 メディチャーラ サティアナアラヤナ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94087 サニーヴェイル ホールンベック アベニュー 1674 アパートメント 61 (72)発明者 シャーマ ソメッシュ ディー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94022 ロス アルトス ステュアート コート 44

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水可溶性組成物MC6 ２．SDS-20％ PAGE上で単一バンドとして移動することを特徴とする、請求項１ 記載の組成物。 ３．単一バンドが10kDal末満の分子量を有し、r-インシュリンよりも小さなサイ ズである、請求項２に記載の組成物。 ４．３種のペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。 ５．血糖降下作用を示し経口投与により活性である、請求項１に記載の組成物。 ６．SDS-20％ PAGEにて10kDal未満の単一バンドとして移動し、３種のペプチド を含み、血糖降下作用を示し、経口投与により活性であることを特徴とする、水 可溶性組成物MC6。 ７．生理学的に許容できるビヒクル中にMC6を含む医薬組成物。 ８．生理学的に許容できるビヒクルが経口的に許容できるビヒクルである、請求 項７に記載の医薬組成物。 ９．経口的に許容できるビヒクルが脱イオン水またはリン酸緩衝生理食塩水を含 む、請求項８に記載の医薬組成物。 10．宿主の血中グルコース濃度を低下させる方法であって、MC6を前記宿主に投 与することを含む前記方法。 11．MC6が生理学的に許容できるビヒクル中に存在している、請求項10に記載の 方法。 12．投与が経口的またはI.V.である、請求項10に記載の方法。 13．宿主が高血糖疾患にかかっている、請求項10に記載の方法。 14．高血糖疾患が糖尿病である、請求項13に記載の方法。 15．糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項14に記載の方法。 16．糖尿病がII型糖尿病である、請求項14に記載の方法、 17．高血糖疾患による哺乳動物宿主の血中グルコース濃度を低減する方法であっ て、前記宿主にMC6の医薬組成物を経口的に投与することを含む、前記方法。 18．哺乳動物宿主がヒトである、請求項17に記載の方法。 19．高血糖疾患が糖尿病である、請求項18に記載の方法。 20．糖尿病がＩ型糖尿病およびII型糖尿病からなる群より選ばれる、請求項19に 記載の方法。 21．糖尿病による高血糖症であるヒトの血中グルコース濃度を低下させる方法で あって、前記宿主にMC6を含む医薬組成物を経口的に投与することを含む、前記 方法。 22．糖尿病がＩ型糖尿病およびII型糖尿病からなる群より選ばれる、請求項21に 記載の方法。 23．MC6.1、MC6.2、MC6.3およびMC6.1、MC6.2およびMC6.3のアナログまたは疑似 物からなる群より選ばれるペプチド。 24．以下のアミノ酸配列を有する、請求項23に記載のペプチドMC6.1： K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G（配列番号１） 25．以下のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載のペプチドMC6.2： K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A（配列番号２） 26．以下のアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載のペプチドMC6.3： K-T-N-M-K-H-M（配列番号３） 27．ペプチドMC6.1、MC6.2、MC6.3、そのアナログおよび疑似物またはそれらの 混合物を生理学的に許容できるビヒクル中に含む医薬組成物。 28．宿主の血中グルコース濃度を低下させる方法であって、請求項27の医薬組成 物を前記宿主に投与することを含む、前記方法。 29．投与が経口的またはi.v.である、請求項28に記載の方法。 30．宿主が高血糖疾患にかかっている、請求項28に記載の方法。 31．高血糖疾患が糖尿病である、請求項30に記載の方法。 32．糖尿病がＩ型またはII型糖尿病である、請求項31に記載の方法。